CN115469106B

CN115469106B - 一种冻干细胞膜碎片复溶液、复溶方法及应用

Info

Publication number: CN115469106B
Application number: CN202211126653.5A
Authority: CN
Inventors: 庞伟; 杜欣军; 李萍; 杜婷; 康青
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2022-09-16
Filing date: 2022-09-16
Publication date: 2024-05-17
Anticipated expiration: 2042-09-16
Also published as: CN115469106A

Abstract

本发明公开了一种冻干细胞膜碎片复溶液、复溶方法及应用，所述复溶液包括11～15％vol的二甲基亚砜、100mmol/L的氯化钠和0.1～1.5％wt的叠氮钠，其复溶方法是用本申请提供的复溶液对冻干细胞膜碎片进行复溶得到复溶混合物，然后将复溶混合物进行旋转蒸发得到复溶浓缩液。经本申请提供的复溶液复溶后的细胞膜碎片，其膜表面抗原的抗原性得到很好的保护及提高，进而提高了抗原检测的灵敏度，及减少膜抗原的包被使用量，降低检测成本，可用于血液中相关抗体的标准化检测。

Description

一种冻干细胞膜碎片复溶液、复溶方法及应用

技术领域

本发明属于细胞冻干复溶技术领域，具体涉及一种冻干细胞膜碎片复溶液、复溶方法及应用。

背景技术

细胞冻干技术是一种细胞保存技术，主要步骤包括将组织细胞、血细胞等细胞在低温下冻结、真空下升华干燥并除去冰晶、升华结束后再解析干燥并除去部分结合水等。经冻干后的细胞可以在室温下避光长期贮存；当要使用时，可以加入复溶液复溶至冻干前状态。目前常用的复溶液包括无机复溶液(例如PB，PBS)，以及有机复溶液(例如HEPES、MOPS)和纯水。

在现有的血型反定型检测技术中，有利用红细胞膜碎片、基于酶联免疫反应进行检测的方法，其灵敏度高于利用凝集技术检测血型抗原抗体的方法，但存在红细胞膜碎片膜上抗原难以保存的问题。此外，红细胞膜碎片大多为现用现配，制备工艺复杂，会耗费大量的人力在抗原制备上；而将红细胞膜碎片放在低温条件下(4℃)保存，也只是短期保存，其保存天数也不足一周，即使是放在-20℃下保存，也无法避免随着保存天数增长抗原性下降的问题。针对现有红细胞膜碎片抗原难以保存的问题，现有技术有提出利用细胞冻干技术来保存红细胞膜碎片以延长保存时间的方法，但将经冻干技术长时间保存的红细胞膜碎片用常规试剂复溶后的抗原性难以满足血型检测的需求。

发明内容

本发明提供了一种冻干红细胞膜碎片复溶液及复溶方法，具体技术方案如下。

一方面，本发明提供了一种冻干细胞膜碎片复溶液，包括11～ 15％vol(体积百分比)的二甲基亚砜、100mmol/L的氯化钠和0.1～ 1.5％wt(重量/质量百分比)的叠氮钠。

优选的，所述冻干细胞膜碎片复溶液包括：15％vol的二甲基亚砜、 100mmol/L的氯化钠、0.1％wt的叠氮钠；或者，13％vol的二甲基亚砜、100mmol/L的氯化钠、0.2％wt的叠氮钠；或者，12％vol的二甲基亚砜、100mmol/L的氯化钠、1.5％wt的叠氮钠；或者，11％vol的二甲基亚砜、100mmol/L的氯化钠、1％wt的叠氮钠。

另一方面，本发明还提供了一种冻干细胞膜碎片的复溶方法，所述方法包括采用上述任一项所述的冻干细胞膜碎片复溶液对冻干细胞膜碎片进行复溶，得到复溶混合物，然后将复溶混合物进行旋转蒸发，得到复溶浓缩液，即完成复溶。

进一步的，所述冻干细胞膜碎片复溶液的使用体积与冻干前的新鲜细胞膜碎片体积相等。

进一步的，所述旋转蒸发在30～40℃下进行。

进一步的，所述复溶浓缩液的体积为所述复溶混合物体积的1/4 至1/2；优选的是，所述复溶浓缩液的体积为所述复溶混合物体积的 1/2。

进一步的，所述冻干细胞膜碎片在冻干前与细胞膜碎片保护液进行混合后再进行冻干，所述细胞膜碎片保护液包括10mM-20mM的葡萄糖、6mM-12mM的乳糖、121mM-141mM的海藻糖、29mM-39mM 的NaCl、4.3mM-5.3mM的KCl、0.115mM-0.125mM的KH₂PO₄和 0.6mM-1.2mM的Na₂HPO₄。

优选的，所述细胞膜碎片保护液包括20mM的葡萄糖、10mM的乳糖、140mM的海藻糖、39mM的NaCl、5.3mM的KCl、0.125mM 的KH₂PO₄和1.2mM的Na₂HPO₄。

由上述复溶方法复溶得到的红细胞膜碎片。

另一方面，本发明还提供了上述红细胞膜碎片在血型反定型检测中的应用。

进一步的，所述红细胞膜碎片用于Elisa平板或斑点杂交检测，所述红细胞膜碎片作为抗原原料被包被于硝酸纤维素膜。

有益技术效果

本发明提供的冻干细胞膜碎片复溶液及复溶方法，不但能够很好地保护了经冻干的细胞膜碎片表面血型抗原的抗原性，甚至还可以进一步提高其抗原性。此外，本发明提供的冻干细胞膜碎片复溶液及复溶方法还可以提高后续血型抗原/抗体检测的灵敏度，及减少膜上血型抗原作为原料包被到硝酸纤维素膜(NC膜)上的使用量，从而降低了血型检测的成本，具备可用于血液中相关抗体的标准化检测的潜力。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为不同复溶液复溶的红细胞膜碎片与新鲜红细胞膜碎片抗原性检测保存7天对比的结果；

图2为水复溶的红细胞膜碎片片与新鲜红细胞膜碎片抗原性检测保存7天对比的结果；

图3为40℃浓缩温度下将复溶混合物浓缩至不同体积的抗原性检测结果；

图4为不同浓缩温度下浓缩复溶混合物的抗原性检测结果；

(以上各图中横坐标显示标准品抗体的稀释倍数，纵坐标显示OD450 值)。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者装置不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者装置所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括该要素的过程、方法、物品或者装置中还存在另外的相同要素。

如在本说明书中使用的，术语“大约”，典型地表示为所述值的 +/-5％，更典型的是所述值的+/-4％，更典型的是所述值的+/-3％，更典型的是所述值的+/-2％，甚至更典型的是所述值的+/-1％，甚至更典型的是所述值的+/-0.5％。

在本说明书中，某些实施方式可能以一种处于某个范围的格式公开。应该理解，这种“处于某个范围”的描述仅仅是为了方便和简洁，且不应该被解释为对所公开范围的僵化限制。因此，范围的描述应该被认为是已经具体地公开了所有可能的子范围以及在此范围内的独立数字值。例如，范围的描述应该被看作已经具体地公开了子范围如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到 6等，以及此范围内的单独数字，例如1，2，3，4，5和6。无论该范围的广度如何，均适用以上规则。

本发明所述的“红细胞膜碎片”是指非完整状态的红细胞膜。红细胞膜碎片的制备方式，包括通过低渗或反复冻融等方式处理红细胞，使红细胞膜破碎；然后，通过离心将红细胞膜碎片与与其他成分 (如血红蛋白)分开，获得沉淀物形式的红细胞膜碎片。红细胞膜碎片的成分包括脂类和膜蛋白，例如各种血型抗原。

本发明所述的“新鲜红细胞膜碎片”是指新制备的红细胞膜碎片，例如制备后保存时间不超过1天的红细胞膜碎片。

本发明所述的“细胞膜碎片”是指通过与上述制备方式类似的方式或其他方式，制备的呈碎片形态的细胞膜，例如红细胞膜碎片、和其他细胞(例如免疫细胞)的膜碎片。

本发明所述的“复溶液”是指用于对冻干制品进行复溶并使所述冻干制品恢复至与冻干前状态相同或部分相同的溶液。

本发明所述的“抗原性”是指红细胞膜或红细胞膜碎片上的血型抗原与相应血型抗体发生特异性结合的能力：结合能力越强，抗原性就越高或越强；反之，如果结合能力减弱，那么抗原性就越低或越弱。

本发明所述的“灵敏度”是指用本发明的复溶液复溶的红细胞膜碎片可以有效检测到的抗体浓度。一般而言，能检测到抗体浓度范围的下限值越低，灵敏度就越高；反之，能检测到的抗体浓度范围的下限值越高，灵敏度就越低。

本发明提供的冻干细胞膜碎片复溶液包括11～15％vol的二甲基亚砜(DMSO)、100mmol/L的氯化钠(NaCl)和0.1～1.5％wt的叠氮钠(DDN)。

由于细胞膜的主要成分为磷脂(属于脂质)、蛋白质和糖类，因此细胞膜碎片被冻干后，成分仍以蛋白质和脂质为主(即细胞膜碎片和细胞膜碎片冻干制剂可以被视为脂溶性物质)。常规的复溶液一般为无机缓冲液，很难溶解细胞膜碎片这种脂溶性物质。在常规无机缓冲液类型的复溶液中，细胞膜碎片冻干制剂不能溶解并以胶体状存在，因此不能很好地发挥抗原性，从而导致后续包被在NC膜上时存在抗原丢失现象(换句话说，其包被浓度不能作为真正的使用浓度)。而本发明的复溶液整体上是一种脂溶性的复溶液，能够很好地溶解细胞膜碎片上的抗原，更利于将其包被在NC膜，且使用浓度等于真实包被浓度。

其中，DMSO的作用是改变细胞膜的通透性并维持渗透压，使细胞膜上的蛋白质和脂质从冻干的状态恢复到生物膜的状态并维持稳定；NaCl的作用是调节渗透压，通过特定的比例，使复溶液为细胞膜提供一个接近生物稳态的渗透压环境；DDN的作用也是维持渗透压。

可以理解的是，本发明的复溶液保护的是红细胞膜表面上的抗原，使其不容易从红细胞膜上脱落、分离、流失或发生改变失去其本身的抗原性。

优选的冻干细胞膜碎片复溶液包括15％vol的DMSO、100mmol/L 的NaCl和0.1％wt的DDN。

优选的冻干细胞膜碎片复溶液包括13％vol的DMSO、100mmol/L 的NaCl和0.2％wt的DDN。

优选的冻干细胞膜碎片复溶液包括12％vol的DMSO、100mmol/L 的NaCl和1.5％wt的DDN。

优选的冻干细胞膜碎片复溶液包括11％vol的DMSO、100mmol/L 的NaCl和1％wt的DDN。

将本发明提供的复溶液对冻干细胞膜碎片进行复溶，得到复溶混合物；然后将复溶混合物进行旋转蒸发，得到复溶浓缩液，即完成了对冻干细胞膜碎片的复溶。经本发明提供的复溶液复溶后的细胞膜碎片，其膜表面的抗原得到很好的保护及提高，进一步对旋转蒸发的温度和浓缩体积进行优化，可进一步提高抗原性检测的灵敏度。采用本发明提供的复溶液和复溶方法对冻干红细胞膜碎片进行复溶，复溶后的红细胞膜碎片用于血型反定型检测中，可以降低抗原作为原料的使用量，有利于血型反定型检测的标准化。

下述实施例使用的部分仪器和耗材如表1所示：

表1

实施例1

新鲜红细胞膜碎片的制备

红细胞膜碎片的制备过程如下：

1)将3mL抗凝混合全血(取自6-10个A型(或其他血型)血样)，加入装有10mL0.01mol/L PBS(pH7.2)的15mL离心管中，以 3000r/min离心5min，弃上清和上清下的白细胞、血小板层，获得约 1.5mL压积红细胞；

2)将压积红细胞用相当于其3倍体积的4℃预冷的0.01mol/L PBS(pH7.2)洗涤并离心3次(每次在4℃下，以5000r/min离心15min)，获得第一沉淀物；

3)以PBS与第一沉淀物的体积比为40:1的比例，将4℃预冷的 0.01mol/L PBS(pH7.2)加入至第一沉淀物中混合，4℃放置2h，再以 9000r/min离心20min，弃上清；

4)再重复步骤3)4次，直至无肉眼可见的红细胞，获得约800μL 第二沉淀物(即为携带膜抗原的红细胞膜碎片样品)。

通过上述制备过程制备得到的红细胞膜碎片，可用于膜抗原检测或冻干保存使用。

实施例2

冻干红细胞膜碎片的制备

将实施例1制备的新鲜红细胞膜碎片与冻干保护液按照体积比 1:10混合，分别加到容积为5mL的西林瓶中，使得每只西林瓶中液体含量为1mL。将西林瓶放入4摄氏度冰箱预冷30分钟后，再将西林瓶放入冻干机中，先按照10摄氏度/分钟的降温速率降到-70摄氏度，并在此温度下保持2小时以上使待冻干物冻结。然后，开始抽真空和一次干燥，使冻干机的隔板温度和压力分别保持在-50摄氏度和 2-4帕左右，持续时间为18小时。最后，进行二次干燥，使隔板温度和压力分别保持在20摄氏度和2-4帕左右，持续时间为10小时，制得冻干红细胞膜碎片。冻干红细胞膜碎片在常温保存。使用前，以等体积(与冻干前的新鲜红细胞膜碎片体积相同)复溶液对冻干红细胞膜碎片进行复溶。

按照下列组分和浓度，将所述冻干保护液使用注射用水配制：

1#冻干保护液:20mM的葡萄糖、10mM的乳糖、140mM的海藻糖、39mM的NaCl、5.3mM的KCl、0.125mM的KH₂PO₄、1.2mM 的Na₂HPO₄；

2#冻干保护液:10mM的葡萄糖、12mM的乳糖、141mM的海藻糖、31mM的NaCl、4.3mM的KCl、0.115mM的KH₂PO₄、1.1mM 的Na₂HPO₄；

3#冻干保护液:15mM的葡萄糖、10mM的乳糖、131mM的海藻糖、35mM的NaCl、5.0mM的KCl、0.115mM的KH₂PO₄、1.1mM 的Na₂HPO₄。

实施例3

复溶液的配制

按照表2中所示的组分和浓度，配制复溶液(用水溶解)

表2

实施例4

红细胞膜碎片的抗原性检测(复溶液复溶)

一、检测原理：

将待检测的红细胞膜碎片包被于酶标板上。加入标准品抗体，该抗体会和红细胞膜碎片上的膜抗原特异性结合。洗去游离成分后，加入辣根过氧化酶标记的二抗。膜抗原与标准品抗体、辣根过氧化酶标记的二抗结合，形成免疫复合物。洗去游离的成分后，加入显色液底物TMB；TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加入终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测OD值。红细胞膜碎片上特定抗原的抗原性与OD450值之间呈正比，通过与检测新鲜红细胞膜碎片包被的酶标板而获得的OD450值比较，来确定其他方式保存的红细胞膜碎片的抗原性变化。

上述待检测的红细胞膜碎片包括：

(1)实施例1制备的新鲜红细胞膜碎片；

(2)以等体积有机冻干复溶液(PIPES缓冲液或MOPS缓冲液或HEPES缓冲液)复溶的常温保存7天的实施例2(1#)制备的冻干红细胞膜碎片；

(3)以等体积无机冻干复溶液(TBS缓冲液或PB缓冲液或PBS 缓冲液)复溶的常温保存7天的实施例2(1#)制备的冻干红细胞膜碎片；

(4)以等体积实施例3配制的复溶液复溶的常温保存7天的实施例2(1#)制备的冻干红细胞膜碎片。

二、具体检测步骤如下：

包被：用包被缓冲液将100μL待检测的红细胞膜碎片稀释10000 倍，按100μL/孔加入酶标板中，4摄氏度包被过夜。

洗板：次日，弃酶标板的孔内液体，并将酶标板在纸巾上轻轻扣打以去除残留液体。然后，向酶标板中加入洗涤液(280-300μL/孔)，洗涤2-3次，每次3-5min。

封闭：按200-250μL/孔加入封闭液，室温封闭2小时后，弃去孔内封闭液。

标准品抗体处理：用洗涤液将标准品抗体进行稀释，稀释倍数为 24、25、26、27、28、29和210。

加样：以50μL/孔依次加入稀释的标准品抗体，室温孵育30min。

洗板：弃孔内液体，在纸巾上轻轻扣打以去除残留液体，加入洗涤液(280-300μL/孔)，洗涤2-3次，每次3-5min。

加酶标抗体：按50μL/孔加入新配制的酶标抗体，室温孵育30min。

洗板：弃孔内液体，在纸巾上轻轻扣打以吸去残留液体，加入洗涤液(280-300μL/孔)，洗涤2-3次，每次3-5min。

加底物液显色：按100μL/孔加入TMB底物溶液，室温避光反应 30min。

终止反应：于各反应孔中加入50μL的终止液。

结果判定：用酶标仪测OD值(以仅加入包被缓冲液的空白孔调零)。

三、实验结果：

图1显示了不同复溶液复溶的红细胞膜碎片抗原性的检测结果。由于本实验的原理是红细胞膜碎片上特定抗原的抗原性与OD450值之间呈正比，因此通过与检测新鲜红细胞膜碎片得到的OD450值比较，可以确定不同复溶液复溶的红细胞膜碎片的抗原性变化。为方便阐述，以下将新鲜红细胞膜碎片上抗原检测称为阴性对照组；将用其他无机溶剂或有机溶剂复溶后检测的组称为阳性对照组；将用本发明复溶液复溶后检测的组称为试验组。

从图1中可以看出：1)阴性对照组的OD值约在0.9～1.0的范围内，而本发明试验组的OD值大多数都在2.0及以上，最低约为1.9。随着稀释倍数的增加，阴性对照组的OD值在稀释倍数为128倍时归为0；而本发明试验组的OD值在稀释倍数128倍时，最低为0.5以上，在稀释倍数为1024倍时才归为0。经验证，本发明提供的冻干细胞膜碎片复溶液，不仅很好地保护了膜表面抗原的抗原性，而且还进一步提高了抗原性，灵敏度更高。2)阳性对照组采用了多种市面上常见的无机冻干复溶液。在稀释倍数为16倍时，只有用PB复溶的冻干红细胞膜碎片可以保持与阴性对照相当的抗原性，OD450值约在0.9～1.0的范围内，而用其他无机冻干复溶液复溶的冻干红细胞膜碎片的OD值均小于阴性对照，更是远远小于本发明的试验组(本发明试验组上的抗原OD值大多数都在2.0及以上，最低也有约1.9)。稀释倍数为32倍时，PB、PIPES和HEPES组的OD值大于阴性对照，但当稀释倍数为64倍时，PB组的OD值又小于了阴性对照，仅剩 PIPES组的OD值大于阴性对照。由此说明，目前常见的大多复溶液都达不到稳定保护冻干后红细胞膜碎片上抗原性的功效和目的。对此形成鲜明对比的是本发明试验组，稀释倍数128倍时最低也在0.5以上(而阳性对照组的各试剂在该稀释倍数下已经低于0.5，甚至在0.3 以下)，在稀释倍数为1024倍时才归为0。由此验证本发明提供的冻干细胞膜碎片复溶液相较于现有技术的复溶液能够更有效地保护红细胞膜上抗原的抗原性。

可预期地，采用本发明复溶液至少可以带来以下好处：降低检测样品抗原的用量；降低成本。

其中，复溶液1、复溶液2、复溶液3和复溶液4的成分同实施例3表格中的1#、2#、3#、4#。

实施例5

红细胞膜碎片抗原性检测(水复溶)

检测原理：同实施例4。

检测过程如下：

包被：用包被缓冲液将按实施例1和2描述制备的各100uL红细胞膜碎片稀释10000倍，按100uL/孔加入酶标板中，4摄氏度包被过夜；

洗板：次日弃孔内液体，在纸巾上轻轻扣打以吸去残留液体，加入洗涤液(280-300uL/孔)，洗涤2-3次，每次3-5min；

封闭：按200-250uL/孔加入封闭液，室温2小时，然后弃去孔内封闭液；

标准品抗体处理：用洗涤液将标准品抗体进行倍比稀释，稀释倍数为21，22，23，24，25，26，和27。

加样：按顺序以50uL/孔依次加入稀释好的标准品抗体，室温孵育30min。

洗板：弃孔内液体，在纸巾上轻轻扣打以吸去残留液体，加入洗涤液(280-300ul/孔)，洗涤2-3次，每次3-5min；

加酶标抗体：按50ul/孔加入新配制的酶标抗体，室温孵育30min。

加底物液显色：按100ul/孔加入TMB底物溶液，室温避光反应 30min。

终止反应：于各反应孔中加入50uL的终止液。

结果判定：用酶标仪器测OD值(以仅加入包被缓冲液的空白孔调零)。

实验结果：

新鲜红细胞膜碎片、4摄氏度保存7天的红细胞膜碎片、-20摄氏度保存7天的红细胞膜碎片、以及冻干后保存7天并用水复溶的红细胞膜碎片的抗原性检测结果(以OD值表示)列在图2中。

从图2可看出，以本发明提供的冻干保护液冻干保存一段时间并用水复溶后的红细胞膜碎片，在一定时间内具有与新鲜制备的红细胞膜碎片类似的抗原性。保存7天时，3种冻干保护液均使得红细胞膜碎片保持了与新鲜制备的红细胞膜碎片相当的抗原性。但相较于用本发明复溶液复溶的冻干红细胞膜碎片，用水复溶的冻干红细胞膜碎片的抗原性没有显示出比新鲜红细胞膜碎片上的抗原性更有优势。由此证明，本发明提供的复溶液对红细胞膜碎片上的抗原性能够有效维持和保护。

实施例6

冻干红细胞膜碎片复溶方式研究实验

为了减少复溶后的包括红细胞膜碎片的混合物的体积，发明人进行了浓缩研究，发现在一定条件下浓缩时，不仅减少了体积，还可以进一步提高抗原性检测的灵敏度。

实验对象：实施例2制备的冻干红细胞膜碎片，常温保存7天，以等体积复溶液(实施例3，2#)复溶获得的混合物作为浓缩和检测对象进行实验。

实验方法：(1)混合物浓缩至不同体积时，对抗原性的影响。

分别取上述混合物100mL加入旋转蒸发器中，在40摄氏度下进行真空旋转蒸发浓缩，浓缩至体积分别为原体积的约1/2/、1/4或 1/8时停止浓缩。取出浓缩液按实施例4中描述的方法进行抗原性检测，并与未浓缩之前的混合物的抗原性进行比较(通过改变包被液的稀释倍数使得每个孔的细胞膜碎片包被量与未浓缩混合物一致)。抗原性检测结果显示在图3中。当浓缩1/2时，抗原性明显增强，但继续浓缩时，抗原性无变化或有所减弱，此抗原性变化可能是由于 DMSO在浓缩过程中的浓度变化对血型抗原在混合物中的溶解性和/ 或三维形态的影响而造成的。出于抗原性方面的考虑，可以选择将复溶后的混合物浓缩至原体积的1/2-1/4。

(2)真空旋转蒸发温度对抗原性的影响。

分别取100mL上述混合物加入旋转蒸发器中，分别在30、40、 50和60摄氏度下进行真空旋转蒸发浓缩，浓缩至体积为原体积的约 1/2时停止浓缩。取出浓缩液，按实施例4中描述的方法进行抗原性检测，并与未浓缩之前的混合物的抗原性进行比较(通过改变包被液的稀释倍数，使得每个孔的细胞膜碎片包被量与未浓缩混合物一致)。抗原性检测结果显示在图4中。结果显示，旋转蒸发温度过高(50摄氏度以上)时，会显著影响红细胞膜碎片的抗原性。从缩短浓缩时间和抗原性方面综合考虑，可将旋转蒸发温度选择为30-40摄氏度。具体实验结果如下：

从图3看出：40℃时浓缩至原来体积的1/2，复溶后红细胞膜上抗原的抗原性是最好的，优于未进行浓缩组的体积。从OD450值来看，从稀释倍数16倍到稀释1024倍，1/2组能一直保持0.5以上的值；而未浓缩组在稀释倍数16倍时的OD值低于1/2组，在稀释1024 倍时归为0。而浓缩至原来体积的1/4组，在稀释倍数16倍到32倍时，能保持与未浓缩组相当的数值，从稀释倍数32倍以后，开始至 256倍，OD值都小于未浓缩组，而在稀释倍数512时又达到与未浓缩组持平，在稀释1024倍时归为0。总体来说，在40℃时浓缩至原来体积的1/2，复溶后红细胞膜上抗原的抗原性比未浓缩组更好。

从图4看出：同样浓缩至原来体积的1/2，30℃和40℃组的抗原OD值，从稀释倍数16倍开始到稀释1024倍都大于未浓缩组的抗原OD值。而50℃和60℃组的抗原OD值却从稀释16倍开始就远小于未浓缩组。这说明除了稀释倍数，温度对抗原性的影响也很大。这也验证了本发明的复溶方法对冻干后红细胞膜表面抗原的抗原性有很大的影响。

结论：

细胞膜的成分包括脂质、蛋白质和糖类，其中以蛋白质和脂质为主。常规的用于冻干制剂复溶的复溶液为水或无机复溶液。在复溶研究中，发明人发现常规的水或无机复溶液很难完全溶解细胞膜碎片这种脂溶性物质，冻干的细胞膜碎片与它们混合后形成的混合物，经常以胶状体的形式存在，在酶标板上包被后检测时不能充分表现出其中蛋白质的抗原性。另外，即使采用可购得的一些有机复溶液，发明人也发现复溶后的混合物的抗原性依然与直接用水或无机复溶液复溶得到的混合物的抗原性类似。因此，冻干膜碎片中的膜蛋白是否能在免疫检测中充分体现其抗原性可能不仅仅与冻干产物的溶解程度有关。

经发明人复溶冻干红细胞膜碎片的研究发现，采用本申请提供的复溶液复溶冻干红细胞膜碎片，可显著增加冻干红细胞膜碎片抗原的抗原性，进而提高检测的灵敏度。通过对复溶方法的优化，包括对旋转蒸发的温度和浓缩体积进行优化，可进一步提高抗原性。血液中抗体检测灵敏度的提高至少可以带来以下好处：降低抗原作为原料的用量；降低成本。

上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。

Claims

1.一种冻干细胞膜碎片复溶液，其特征在于，包括：

15％vol的二甲基亚砜、100mmol/L的氯化钠、0.1％wt的叠氮钠；

或者，13％vol的二甲基亚砜、100mmol/L的氯化钠、0.2％wt的叠氮钠；

或者，12％vol的二甲基亚砜、100mmol/L的氯化钠、1.5％wt的叠氮钠；

或者，11％vol的二甲基亚砜、100mmol/L的氯化钠、1％wt的叠氮钠。

2.一种冻干细胞膜碎片的复溶方法，其特征在于，所述方法包括：使用权利要求1所述的冻干细胞膜碎片复溶液对冻干细胞膜碎片进行复溶，得到复溶混合物；将所述复溶混合物进行旋转蒸发，得到复溶浓缩液，即完成复溶。

3.根据权利要求2所述的一种冻干细胞膜碎片的复溶方法，其特征在于，所述冻干细胞膜碎片复溶液的使用体积与冻干前的新鲜细胞膜碎片体积相等。

4.根据权利要求2所述的一种冻干细胞膜碎片的复溶方法，其特征在于，所述旋转蒸发在30～40℃下进行。

5.根据权利要求2所述的一种冻干细胞膜碎片的复溶方法，其特征在于，所述复溶浓缩液的体积为所述复溶混合物的体积的1/4至1/2。

6.根据权利要求5所述的一种冻干细胞膜碎片的复溶方法，其特征在于，所述复溶浓缩液的体积为所述复溶混合物的体积的1/2。

7.根据权利要求2所述的一种冻干细胞膜碎片的复溶方法，其特征在于，冻干前的所述冻干细胞膜碎片先与细胞膜碎片保护液进行混合后，再进行冻干，所述细胞膜碎片保护液包括10mM-20mM的葡萄糖、6mM-12mM的乳糖、121mM-141mM的海藻糖、29mM-39mM的NaCl、4.3mM-5.3mM的KCl、0.115mM-0.125mM的KH₂PO₄和0.6mM-1.2mM的Na₂HPO₄。

8.权利要求2-7任一项所述的复溶方法复溶得到的红细胞膜碎片。

9.权利要求8所述的红细胞膜碎片在血型反定型检测中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述红细胞膜碎片用于Elisa平板或斑点杂交检测，所述红细胞膜碎片作为抗原原料被包被于硝酸纤维素膜。