JP2020529581A - アクティブｐｃｓｋ９アッセイの最適化 - Google Patents

Abstract

【課題】ＬＤＬレセプタに結合するために、サンプル中のアクティブＰＣＳＫ９の量を検出すること。【解決方法】ＬＤＬレセプタに結合するために、サンプル中のアクティブＰＣＳＫ９の量を検出する。アクティブＰＣＳＫ９は、ＬＤＬレセプタに結合していないＰＣＳＫ９であり、ＬＤＬレセプタに結合できる。ＬＤＬレセプタとＰＣＳＫ９抗体を使用して、ＰＣＳＫ９/ＬＤＬレセプタ複合体を識別、検出または定量化するステップを含むアッセイおよび方法を提供する。【選択図】図１

Description

本発明は、アクティブＰＣＳＫ９アッセイの最適化に関する。

アテローム性動脈硬化関連疾患の主な原因である高コレステロール血症（総コレステロールが高く、かつ低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）も高い症状）は、２０１４年からのＣＤＣレポートによれば、世界的に深刻な健康問題となっており、アメリカだけでも８５００万人以上の患者が存在する。血漿ＬＤＬレベルの主要な決定要因は、肝ＬＤＬレセプタである。この受容体の発現は、プロタンパク質転換酵素サブチリシン/ケキシン-9(ＰＣＳＫ９)によってコントロールされている。ＰＣＳＫ９は主に肝細胞によって合成され、血清に放出される。血清に入ると、ＰＣＳＫ９のＣ末端ドメインは、細胞表面のＬＤＬレセプタの上皮成長因子様リピートＡ（EGF-A）ドメインと結合する。結合によって生成されたＰＣＳＫ９/ＬＤＬレセプタ複合体はエンドソーム経路に入る。ＬＤＬレセプタとリポタンパク質粒子との結合の場合と異なり、ＬＤＬレセプタに対するＰＣＳＫ９の親和性は、エンドソームの酸性pHにより増加する。エンドソームにおけるＰＣＳＫ９の放出に失敗すると、受容体リサイクルが妨げられ、ＬＤＬレセプタはリソソーム内で分解される。

高コレステロール血症患者の治療の第一選択肢であるスタチンは、アテローム性動脈硬化を発症するリスクのある個人の生存率を改善するために使用されている。それにもかかわらず、患者の１６〜５３％は、スタチン治療をしてもＬＤＬコレステロールレベルの目標を達成できない（スタチン耐性）。これは主に、ＰＣＳＫ９タンパク質レベルの望ましくない増加が原因である。ＰＣＳＫ９レベルが増加すると、ＬＤＬレセプタタンパク質の分解速度も増加するからである。実際、ヒトおよび動物モデルでは、スタチン治療により血漿中のＰＣＳＫ９レベルが増加し、ＬＤＬレセプタの発現に対するスタチンの効果が部分的に減衰することが示されている。したがって、ＰＣＳＫ９は、一部の患者で報告されているスタチン耐性の原因であると考えられる。興味深いことに、ＰＣＳＫ９は、その多型性がスタチン耐性と関連している遺伝子の１つとして同定されている。

その結果として、そして、ＰＣＳＫ９の機能喪失（LOF）変異が低コレステロール血症、および心血管疾患のリスク低下と関連していることが発見されたことにより、（特にスタチンとの併用で）高コレステロール血症を治療するＰＣＳＫ９阻害剤の開発が開始された。現在、ＬＤＬレセプタのＰＣＳＫ９依存性劣化を防止することを最終的な目的とする2つの治療薬、Praluent（alirocumab）（https://www.praluent.com）およびRepatha（evolocumab）（https://www.repatha.com）が、高コレステロール血症患者の治療薬として、米国FDAによって承認されている。

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これらの治療薬やＰＣＳＫ９に対する他の医薬品および治療の効率を判断し、これらおよびスタチンなどの他の治療オプションに適格な患者を特定するには、サンプルのアクティブＰＣＳＫ９レベルを判断する必要がある。トータルＰＣＳＫ９レベルを決定する分析方法については2014年発行の「Arch Biochem Biophys」の545巻124-132ページに記載されている。ここで参照することにより、上記文献の全体が本明細書に組み込まれるものとする。

トータルＰＣＳＫ９レベルを決定する分析方法とは、サンプルに存在する全てのＰＣＳＫ９（アクティブＰＣＳＫ９および非アクティブＰＣＳＫ９）を検出する分析方法である。以下に説明する分析方法は、検体のアクティブＰＣＳＫ９レベルを決定するために使用することを目的としている。他の用途の中でも、アクティブなＰＣＳＫ９レベルを決定する分析方法が、ＰＣＳＫ９を阻害する薬剤が期待どおりに機能するかどうかを確認するため、および/またはこれらの薬剤および/または他の治療で治療すべき患者を決定するために使用される。

アクティブＰＣＳＫ９レベルの分析を行う構成を示す図である。 アクティブＰＣＳＫ９レベルの典型的な変化を示す図である。 ８０人のランダムな人間の血清サンプルにおけるトータルＰＣＳＫ９レベルをプットしたグラフである。 ８０人のランダムな人間の血清サンプルにおけるアクティブＰＣＳＫ９レベルをプロットしたグラフである。 ８０人のランダムな人間の血清サンプルにおけるトータルＰＣＳＫ９レベルに対するアクティブＰＣＳＫ９レベルの比をプロットしたグラフである。 人間の血清サンプルにおけるトータルＰＣＳＫ９レベルとアクティブＰＣＳＫ９レベルの相関を示すグラフである。

動作例以外、または特に指示のない限り、本明細書および特許請求の範囲で使用される成分の量、反応条件、時間などを表す全ての数字は、「約」という言葉を付加することができると理解されるべきである。

本発明の技術思想を決定する数値範囲およびパラメータは近似値であるが、それにもかかわらず、以下の実施例に示される数値は可能な限り正確に報告されている。ただし、いずれの数値にも、それぞれのテスト測定で見つかった標準偏差から必然的に生じるある程度の誤差が本質的に含まれている。

したがって、特に言及しない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、本発明によって得られる所望の特性に応じて変化し得る近似値である。各数値パラメータは、特許請求の範囲に対して均等論を適用することを制限するものではなく、報告された有効数字の数を考慮して、通常の近似法を適用することにより、少なくとも最低限の範囲として解釈されるべきである。

また、本明細書に列挙された数値範囲は、いずれも、そこに含まれる全ての下位範囲を含むことを意図していることを理解すべきである。例えば、「１〜１０」の範囲は、最小値１と最大値１０とを含みそれらの間の全ての値を含むこと、つまり、１以上１０以下であることを示す。

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される名詞は、明示的かつ明確に１つの指示対象に限定されない限り、複数の指示対象を含む。

本明細書の内容が容易に理解され、現実的な効果がもたらされるように、例示的な実施形態について添付の図面を参照して説明する。添付の図は、詳細な説明とともに、本明細書に組み込まれて明細書の一部を形成する。そして、実施形態をさらに例示し、様々な原理および利点を説明するのに役立つ。本明細書に提示される本発明の開示および様々な例はそれぞれ、本発明の範囲をそれらのみに限定するものではない。

以下の詳細な説明および特許請求の範囲で使用される以下の用語は以下に示される意味を有する。

「抗体」という用語は、本明細書では最も広い意味で使用され、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多価抗体および多重特異性抗体のほか、生物学的活性を示す全ての抗体断片を含む。

「アッセイ（assay）」と「テスト」という言葉は同じ意味である。イムノアッセイは分析の一種である。

「キャリア」は最も広い意味で使用され、ウェルプレート、96ウェルプレート、高親和性96ウェルプレート、ELISAプレート、高結合ELISAプレート、マイクロタイタープレートまたは他の同様のプレートを意味するが、これらに限定されない。ここで説明する方法を実行できるこの種のものであればよい。

「検知」および「検出」という用語は、定性的測定および定量的測定の少なくともいずれかを含む最も広い意味で使用される。

特に「検出」は、例えばＰＣＳＫ９またはＰＣＳＫ９/ＬＤＬ複合体を検出するために使用される方法（moiery）または技術を使用して実施できる。

「サンプル」は最も広い意味で使用される。「サンプル」は通常、血液、血漿、血清、細胞培養培地、またはそれらの組み合わせから選択される。

あるサンプルでＬＤＬレセプタに結合できるアクティブＰＣＳＫ９の量を検出するアッセイと方法が開発された。アクティブＰＣＳＫ９は、ＬＤＬレセプタに結合していないＰＣＳＫ９であり、ＬＤＬレセプタに結合できる。

この方法は、抗原抗体複合体が形成されるのに十分な時間および条件下で、ＰＣＳＫ９を含むまたは含むと予想されるサンプルを接触させ、次に抗原抗体複合体の形成を検出することを含む。ここでの条件は、アッセイの感度と有用性が最大になるように選択される。

本発明の一態様は、ＰＣＳＫ９/ＬＤＬレセプタ複合体を同定、検出または定量するためのＬＤＬレセプタおよびＰＣＳＫ９抗体の使用を伴う間接サンドイッチＥＬＩＳＡであるアッセイである。本発明の一態様では、ＰＣＳＫ９/ＬＤＬレセプタ複合体は、ＬＤＬレセプタを含む担体またはプレートにサンプルを加えることにより形成される。

アッセイおよび方法は、ＬＤＬレセプタをプレートに結合するためのＬＤＬレセプタ抗体の使用を含む。ＬＤＬレセプタは、組換えＬＤＬ（ｒＬＤＬ）受容体でもよい。アクティブＰＣＳＫ９がＬＤＬレセプタに結合した後、ＰＣＳＫ９/ＬＤＬレセプタ複合体は、ＰＣＳＫ９抗体を使用して検出される。ＰＣＳＫ９抗体は、検出剤を使用して間接的に検出される。ＰＣＳＫ９抗体は、ビオチン化ＰＣＳＫ９抗体でもよい。検出剤としては、ストレプトアビジン-HRP（西洋わさびペルオキシダーゼ）またはアビジン-HRPなどの検出剤を使用できる。

検出剤の追加に続いて、試薬検出剤が追加される。発色を止めるには、別の試薬を追加する。試薬検出剤は、発色基質を含んでもよい。発色基質は、テトラメチルベンジジン（TMB）または2,2'-アジノビス[3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸]-ジアンモニウム塩（ABTS）または別の発色基質でもよい。H₂O₂/TMBを試薬検出剤として使用できる。発色は別の試薬で止めることができる。発色を止めるために、硫酸または塩酸を使用できる。結果として生じる色の強度は、アクティブＰＣＳＫ９とＬＤＬレセプタの間に形成される複合体の数に正比例する。

本発明によるアッセイの概略図を図１に示す。

キャリアまたは高親和性96ウェルプレートなどのウェルプレートは、このアッセイまたは方法で使用できる。キャリアまたはウェルプレートを、バッファで希釈したラット抗ヒトＬＤＬレセプタ抗体などのＬＤＬレセプタ抗体を用いて、少なくとも数時間、好ましくは一晩、室温でコーティングする。一晩インキュベートした後、コーティング溶液を吸引し、洗浄液でウェルを複数回洗浄する。

ブロッキングはブロッキング溶液で行われる。ブロッキング溶液を加えた後、プレートを室温で1〜2時間、好ましくは1.5時間インキュベートする。次に、ウェルを洗浄する。アクティブＰＣＳＫ９の検出に使用されるウェルは、ブロッキング溶液で希釈されたＬＤＬレセプタとともにインキュベートされる。本発明の一態様では、５ｎｇ/ｍｌのＬＤＬレセプタまたは５ｎｇ/ｍｌのｒＬＤＬ（組換えＬＤＬ）受容体を使用することができる。コーティングとブロッキングの後、複合体標準液（in vitroで調製したＰＣＳＫ９/ＬＤＬレセプタ複合体）と患者の血液や血清などの希釈サンプル、または細胞培養培地サンプルをウェルに追加する。複合体の標準液に使用するウェルは、同量のブロッキング溶液とインキュベートする。

プレートを、例えば、ラップまたはプレートシーラーで覆い、室温で1時間インキュベートした後、洗浄バッファで洗浄する。その後、37℃で1時間インキュベーションを行い、サンプル中のＬＤＬレセプタとＰＣＳＫ９の間に複合体を形成させる。次に、ウェルを洗浄バッファで洗浄する。

コーティング抗体（ＬＤＬレセプタ抗体）に結合したＰＣＳＫ９/ＬＤＬレセプタ複合体の検出は、ＰＣＳＫ９抗体を使用して実行される。ブロッキングバッファで希釈されたＰＣＳＫ９抗体を加え、プレートを室温で１時間インキュベートする。ＰＣＳＫ９抗体はビオチン化されていてもよい。使用できるＰＣＳＫ９抗体としては、ヒツジ抗ヒトＰＣＳＫ９抗体が挙げられるがこれに限定されない。ＰＣＳＫ９抗体としては、ビオチン化ヒツジ抗ヒトＰＣＳＫ９抗体が挙げられるがこれに限定されない。本発明の一態様では、ＰＣＳＫ９抗体の濃度は１００ｎｇ/ｍＬである。

インキュベーション後、プレートを洗浄バッファで洗浄し、ブロッキングバッファで希釈した検出剤を加える。

検出剤としては、ストレプトアビジン-HRPおよびアビジン-HRPが挙げられるがこれに限定されない。検出剤をブロッキングバッファで希釈し（例えば２００倍に希釈し）、プレートに加える。そのプレートを室温で３０分間インキュベートする。インキュベーション後、プレートを洗浄バッファで洗浄する。試薬検出剤（基質溶液）をウェルに加え、室温において30分間暗所でインキュベートする。使用できる試薬検出剤としては、0.01％H₂O₂と0.2 g/Lテトラメチルベンジジンが挙げられる。１または２Ｎ硫酸または0.5m塩酸などの停止剤を添加して、反応を停止する。

アッセイまたはメソッドの全ての洗浄ステップで同じ洗浄バッファを使用する必要がある。本発明の一態様では、担体、ウェルまたはプレートが洗浄バッファを３回ずつ洗浄する。

本明細書および特許請求の範囲に記載されているアッセイおよび方法で使用できるバッファは、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）である。明細書および請求項に記載されているアッセイおよび方法で使用できる洗浄バッファは、PBS/0.05％Tween 20である。本明細書および特許請求の範囲に記載のアッセイおよび方法で使用できるブロッキング溶液/バッファは、PBS中の1％ウシ血清アルブミン（BSA）である。

添加される複合体標準液（ＰＣＳＫ９/ＬＤＬレセプタ複合体のin vitro）の数と濃度は、アッセイに基づいて決定される。本発明の一態様では、標準液はブロッキングバッファで希釈される。例えば、０〜４０ng/mLの範囲の濃度の８つの標準液を準備できる。次に、患者の血清や細胞培養培地のサンプルなどの希釈サンプルを対応するウェルに加える。本発明の一態様では、サンプルはＰＢＳのみを使用して希釈される。

得られた着色製品の光学密度は、450および540nmで読み取るための正しいフィルターを備えたプレートリーダーを使用して決定される。BMG Labtech PHERAstarTMプレートリーダーなどのプレートリーダーを使用できる。プレートの光学的不完全性の補正は、540nmでプレートを読み取ることにより実行され、これらの読み取り値は450nmの読み取り値から差し引かれた。このアッセイの典型的な標準曲線を図２に示す。このアッセイで使用されるＬＤＬレセプタ/ ＰＣＳＫ９複合体標準液の濃度は0〜40ng/mLであった。

アッセイは、濃度の全範囲にわたって比較的線形であった。R² = 0.9996。このグラフの式は、Y = 0.0928X + 0.0051である。Yは修正されたODに対応する。Xはサンプル濃度に対応する。

使用されるサンプルは、血液、血漿、血清、細胞培養培地、またはそれらの組み合わせから選択される。特定の実施形態では、サンプルは対象のサンプルであり、対象はヒトまたは非ヒトであり得る。非ヒトは好ましくは哺乳動物である。対象は患者であってもよい。

別の態様では、新たに開発されたアクティブＰＣＳＫ９アッセイ（ここで説明）と、以前に” Arch. Biochem. Biophys. 545:124-132, 2014”で説明されたトータルＰＣＳＫ９アッセイのバリエーションを使用して、サンプルを分析した。トータルＰＣＳＫ９アッセイでは、サンプルに存在する全てのＰＣＳＫ９（アクティブおよび非アクティブ）が検出される。これは、このアッセイではＰＣＳＫ９特異抗体がプレートにコーティングされているためである。

サンプル中のトータルＰＣＳＫ９タンパク質レベルを検出するために、サンドイッチ型ELISAを使用した。バッファ中のＰＣＳＫ９抗体でウェルプレートを室温でコーティングした。一晩インキュベートした後、コーティング溶液を吸引し、ウェルを洗浄バッファで洗浄した。ブロッキングは、室温で1時間、ブロッキングバッファで行った。その後、プレートを洗浄バッファで洗浄した。上述したＰＣＳＫ９/ＬＤＬ標準液とＰＣＳＫ９を含む希釈サンプルとをプレートに加え、プレートをカバーして、室温でインキュベートした。ウェルの内容物を捨て、プレートを洗浄バッファで洗浄した。コーティング抗体に結合したＰＣＳＫ９タンパク質の検出は、ブロッキングバッファで希釈した異なるＰＣＳＫ９抗体を使用して実施した。洗浄バッファで洗浄した後、ブロッキングバッファ中の検出剤をウェルに加えた。プレートを覆い、室温でインキュベートした。プレートを洗浄バッファで洗浄した。試薬検出剤を追加した。プレートにカバーをし、室温でインキュベートした。各ウェルに停止試薬を加えることにより、反応を停止させた。プレートをプレートリーダーで450および540nmで読み取り、光学密度を測定した。

アッセイまたはメソッドの全ての洗浄ステップで同じ洗浄バッファを使用する必要がある。本発明の一態様では、担体、ウェルまたはプレートを３回ずつ洗浄バッファで洗浄する。

本発明の別の態様では、サンプル中のトータルＰＣＳＫ９タンパク質レベルは、サンドイッチ型ＥＬＩＳＡを使用して検出される。ウェルプレートはＰＣＳＫ９抗体でコーティングされている。ＰＣＳＫ９抗体はバッファで希釈される。適切な希釈の例は（2μg/mL）である。ラット抗ヒトＰＣＳＫ９抗体を使用できる。プレートを室温で一晩インキュベートする。一晩インキュベートした後、コーティング溶液を吸引し、ウェルを洗浄バッファで３回洗浄する。ブロッキングは、室温で1.5時間、ブロッキングバッファで行う。その後、プレートを洗浄バッファで３回洗浄する。濃度が0〜20ng/mLのＰＣＳＫ９標準液とＰＣＳＫ９を含む希釈サンプルをプレートに加え、プレートを覆い、室温で１時間インキュベートする。ウェルの内容物は廃棄され、プレートは洗浄バッファで３回洗浄される。コーティング抗体に結合したＰＣＳＫ９タンパク質の検出は、異なるＰＣＳＫ９抗体（ＰＣＳＫ９検出抗体）を使用して実行される。抗体はビオチン化されていてもよい。使用できるＰＣＳＫ９抗体としては、ヒツジ抗ヒトＰＣＳＫ９抗体が挙げられるがこれに限定されない。ＰＣＳＫ９抗体としては、ビオチン化ヒツジ抗ヒトＰＣＳＫ９抗体が挙げられるがこれに限定されない。抗体をブロッキングバッファで、例えば（100ng/mL）の濃度に希釈する。プレートを室温で１時間インキュベートする。この後、プレートを洗浄バッファで３回洗浄し、ブロッキングバッファ中の検出剤、例えばストレプトアビジン-HRPまたはアビジン-HRPをウェルに加える。プレートを覆い、室温で２０分間インキュベートした。プレートを洗浄バッファで３回洗浄した後、室温で発色剤を含む試薬検出剤（基質溶液）でインキュベートする。各ウェルに停止試薬を加えて、反応を停止させた。プレートをプレートリーダーで450および540nmで読み取り、光学密度を測定した。

このアッセイまたは方法で使用できるバッファは、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）である。このアッセイまたは方法で使用できる洗浄バッファは、PBS/0.05％Tween 20である。使用できるブロッキング溶液/バッファは、PBS中の１％ウシ血清アルブミン（BSA）である。

検出剤としては、ストレプトアビジン-HRPおよびアビジン-HRPが挙げられるがこれに限定されない。

使用できる検出剤としては、0.01％H₂O₂と0.2 g/Lテトラメチルベンジジンが挙げられるがこれに限定されない。停止剤としては、1Nまたは2Nの硫酸または0.5Mの塩酸が挙げられるがこれに限定されない。

アクティブＰＣＳＫ９を検出するアッセイと比較してトータルＰＣＳＫ９を検出するアッセイを使用する場合、同じバッファ、洗浄バッファ、ブロッキングバッファ、検出剤、試薬検出剤、および停止試薬を使用する必要がある。

トータルＰＣＳＫ９アッセイとアクティブＰＣＳＫ９アッセイを使用してサンプルをテストする場合、両方のアッセイで同じＰＣＳＫ９検出抗体を使用することが好ましい。
同じＰＣＳＫ９抗体を使用すると、よりよい比較結果が得られる。

本発明の一実施形態では、ブロッキングバッファで初期ブロッキングを実施し、プレートを洗浄した後、プレートを４℃などの低温で最長2週間保存することができる。貯蔵のためにウェルの中に液体がある必要はない。本開示はさらに、サンプル中のＰＣＳＫ９を検出し、任意で定量化するために使用できるキットに関する。このキットは、ＬＤＬレセプタ抗体などのキャプチャ抗体と、ＰＣＳＫ９抗体などの検出抗体と、検出剤と、試薬検出剤と、バッファ、洗浄バッファ、ブロッキングバッファおよび停止溶液またはそれらの組合せから選択された構成要素を含むことができる。キットにはプレートまたはキャリアが含まれてもよい。キットにはＰＣＳＫ９標準液が含まれてもよい。キットには、使用説明書が含まれてもよい。

この出願に記載されているアクティブＰＣＳＫ９アッセイの臨床的使用は、単独で、または文献（Arch. Biochem. Biophys. 545:124-132, 2014）に記載されているトータルＰＣＳＫ９アッセイなどの他のアッセイと組み合わせて考えられている。本明細書に記載されているトータルＰＣＳＫ９アッセイを使用して、心血管疾患、スタチンに対する不耐性または耐性、および糖尿病に対する感受性を発症する可能性が高い患者を特定することができる。医師はこの種の情報を提供できる検査を利用して、患者にとってよりよい治療オプションを特定し、それにより副作用のリスクを減らすことができる。

これらのテストは、治療開始後の患者の進行を監視するために使用できる。これらのテストを使用して、PraluentやRepathaなどの承認済みＰＣＳＫ９阻害剤が患者に利益をもたらすかどうかを判断できる。これらの阻害剤は、さまざまな患者の高コレステロール血症を減らすのにスタチンよりも効率的であるように見えるが、そのコストは多くの患者が完全にアクセスすることを妨げる。ここで説明するアッセイは、例えば、高い費用や副作用が発生する前に、これらの新薬の恩恵を受ける患者を特定することもできる。
トータルＰＣＳＫ９アッセイとアクティブＰＣＳＫ９アッセイの組み合わせの別の潜在的な用途は、機能獲得（平均よりも大きい比率）および機能喪失（平均よりも低い比率）のＰＣＳＫ９変異を持つ患者を特定することである。これは、遺伝子検査に取って代わるか、補足する可能性がある。これらのテストを使用して、ＰＣＳＫ９のリン酸化、選択的スプライシング、またはフリン切断によるトータルＰＣＳＫ９レベルとアクティブＰＣＳＫ９レベルの差を決定できる。

以下の実施例は、本発明の様々な態様を例示することを意図しており、決して本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
《実施例》
〔詳細なアッセイの説明〕
（アクティブＰＣＳＫ９アッセイ）
消耗品のリストとそれらの準備方法：
・高結合ELISAプレート：Cat＃2592、Corning（Fisher Scientificからも入手可能）
・PBS（pH = 7.2から7.4）：（バッファ）は、指定された量の各化学物質を指定された量の脱イオン水に溶解する（最終濃度= 137 mM NaCl、2.7 mM KCl、8.1 mM Na₂HPO₄、1.5 mM KH2PO₄）。pHを確認し、指示された範囲内にない場合は調整する。 0.2μＭフィルターを使用して溶液をろ過する。

・ＬＤＬＲコーティング抗体：Cat＃MAB2148-500、R＆D SystemsまたはFisher Scientific。PBSでキャプチャ（コーティング）抗体を最終濃度500μg/mLに再構成する。例えば、500μgバイアルの場合、PBS 1mLを追加して、最終濃度500μg/mLにする。ボルテックスしない。チューブの底にある全てのものを収集するために、30秒間微量遠心する。20μLに分注し、-80°Cで保存する。10mLのPBS（最終濃度= 1μg/mL）に希釈した20μLの500μg/mLで１つのプレートをコーティングできる。
・洗浄バッファ：0.05％のTween 20を添加した500mLのPBSを調製する。室温で保管する。

・BSA（ELISAグレード）：Cat＃sc-2323、Santa Cruz Biotechnology、またはCat＃MP219989890、Fisher Scientific。 2mLのBSAを100mLのPBSに溶解して準備する。
・試薬希釈液（ブロッキングバッファも含む）：1％BSA in PBS。 4oCで保管する。3日以内に使用する。

・ｒＬＤＬＲ ＣＦ：（組換えＬＤＬレセプタタンパク質キャリアフリー）Cat＃2148-LD、R＆D SystemsまたはFisher Scientific。25μg/mLの最終濃度になるように、1mLのPBSで25μgバイアルを希釈する。ボルテックスしない。チューブの底にあるものを全て収集するために、30秒間反転して微量遠心分離して混合する。100μLに分注し、-80°Cで保存する。次に、PBSで2.5μg/mLに希釈する。この希釈を行うには、100μLのrＬＤＬＲ（25μg/mLストック）+ 900μLのPBSを加える。ボルテックスしない。転倒混和してから、100μLに分注し、-80℃で保存する。実験には、5ng/mLのrＬＤＬＲ CFを使用する。これは、25μLの2.5μg/mLストックを12.5mLの試薬希釈液で希釈することによって作成される。

・複合体標準液（in vitroで調製されたＰＣＳＫ９/ＬＤＬレセプタ複合体）：Cat＃842916 R＆D SystemsまたはFisher Scientific。510ng/mLの最終濃度になるように試薬希釈液で希釈する。例えば、135ngのバイアルの場合、265μLの試薬希釈液を追加する。ボルテックスしない。チューブの底に全てを収集するために、約３０秒間反転して微量遠心分離して混合する。140μLのアリコートに分割する。アリコートを使用する準備ができるまで、-80oCで保存する。標準セットを準備するには、2つの80μLアリコートが必要である。

・ＰＣＳＫ９検出抗体：Cat＃BAF3888、R＆D SystemsまたはFisher Scientific。試薬希釈液で検出抗体を最終濃度72μg/mLに再構成する。例えば、50μgのサンプルの場合、714μLの試薬希釈液を追加する。反転して混ぜる。再構成後、この抗体を15μLのアリコートに分け、-80oCで保存する。各バイアルは96ウェルプレートに十分である。

・ストレプトアビジン-ＨＲＰ：Part＃890803; R＆DシステムまたはFisher Scientific。使用から30分以内に、ストックバイアルの指示に従って、試薬希釈液中のストレプトアビジン-HRPの使用希釈液（プレートあたり）10mLを準備する（通常２００倍希釈）。２００倍希釈の10mLを準備するには、10mLの試薬希釈液で50μLのストレプトアビジン-HRP溶液を希釈する。

・基質溶液（試薬検出剤）（0.01％H₂O₂および0.2 g/LテトラメチルベンジジンまたはTMB）：Part＃34021、Thermo Scientific Pierce。プレートごとに5mLのColor Reagent A（過酸化水素）溶液と5mLのColor Reagent B（TMB）を混合して、基質溶液をプレートに追加して５分以内に準備する。待っている間にチューブをホイルで覆う。

・停止液：2N H₂SO₄または0.5M塩酸。

［実施例１］
手順：
１日目−ＬＤＬＲ特異抗体によるコーティング：
a）１枚のプレートをコーティングするのに十分なＬＤＬＲキャプチャ抗体を準備する。10mLのPBSで20μLのアリコートを希釈し、少なくとも６回反転させて混合する。ボルテックスしない。
b）100μLの希釈したキャプチャ抗体（コーティングの最終濃度= 1.0μg/mL）をELISAプレートの各ウェルに加える。プレートをラップで覆い、振とうしながら室温で一晩インキュベートする。

２日目-ブロッキング：
a）翌日、一晩のインキュベーションからプレートを取り出す。各ウェルを吸引し、洗浄バッファで合計３回洗浄する。注：洗浄するには、300μLの洗浄バッファを全てのウェルに加えてから、合計３回吸引する。
b）150μLの試薬希釈液（ブロッキングバッファまたはブロッキング溶液）（PBS/1％BSA）を各ウェルに加える。プレートをラップで覆い、室温で1.5時間振盪しながらインキュベートする。
c）洗浄ステップを３回繰り返す。
d）この時点で、プレートはラップで覆われた4°Cで保管するか（2週間以内に使用）、次のステップで使用できる。保存のためにウェルに液体を有する必要はない。

アクティブＰＣＳＫ９を検出するためにｒＬＤＬＲを加える：
a）標準液のみに使用するウェルに100μLの試薬希釈液を追加する。
サンプル中のアクティブＰＣＳＫ９の検出に使用するウェルに、100μLのrＬＤＬＲ（上記のように調製した5ng/mL溶液）を追加する。
b）プレートをラップで覆い、室温で1時間インキュベートする。
c）上記のように３回洗浄する。

サンプルの準備：上記のブロッキング手順を待つ間に、標準液とサンプルを準備できる。全てのサンプルを室温で準備する。

１．次のような標準液を調整する。

次の標準液を調整するのに必要な量をとる前に、各サンプルを（数回反転させて）よく混ぜる。以前のＬＤＬレセプタ/ＰＣＳＫ９複合体の調製により、検出されたＰＣＳＫ９の各分子がＬＤＬレセプタに結合することが保証される。

次のサンプルを準備する。サンプルを−80度の格納庫から取り出し、室温で溶かす。次のようにそれらを希釈する。

・ヒト血清サンプル：100倍に希釈する（990μLのPBS中で10μLのサンプル-10μLのアリコートを採取する前に数回反転させてよく混ぜる）。サンプルをプレートに追加する前に反転させてサンプルを数回混合する。残りの元のタンパク質サンプルを-80℃で保存する。必要に応じて、さらに希釈が行われる。

・ミディアムサンプル− 96ウェルプレート：４倍に希釈する（50μLのサンプルを150μLのPBSに希釈）。必要に応じて、さらに希釈が行われる。

・ミディアムサンプル− 6または12ウェルプレート：１０倍に希釈する（900μLのPBSで100μLのサンプル）。必要に応じて、さらに希釈が行われる。

・ミディアムサンプル−フラスコ：５０倍に希釈する（980μLのPBSで20μLのサンプル）。

（アッセイ）：プレートに添加する前に、全てのサンプルと溶液を室温にする必要がある。
1）プレートから不要なストリップを取り除き、ラップで覆われた4oCで保管する。
アッセイのテンプレートを準備する。
2）残りのストリップに、準備したテンプレートに従って、100μLの標準液とサンプルを2つずつ並べて追加する。一部の実験では、サンプルはシングレットまたはトリプリケートで実行されるため、サンプルのテンプレートを確立することが重要である。16サンプルの実験用のテンプレートの例を次に示す。

3）プレートをラップで覆い、37℃で1時間振とうしながらインキュベートする。
4）上記のようにプレートを３回洗浄する。
5）10mLの試薬希釈液で15μLの検出抗体のアリコートを希釈し、少なくとも６回反転させて混合する。
希釈した検出抗体（プレート内の最終濃度= 100ng/mL）の100μLを各ウェルに加える。
プレートをラップで覆い、室温で1時間インキュベートする。
6）プレートを洗浄バッファで３回洗浄する。
7）100μLの希釈ストレプトアビジン-HRP（上記の手順を参照）を各ウェルに追加する
プレートをラップで覆い、室温で30分間インキュベートする。
プレートをアルミホイルまたはアルミ製シーリングテープで覆い、光に直接さらされないようにする。
8）インキュベーション後、洗浄バッファで３回洗浄する。
9）100μLの基質溶液（試薬検出剤）（上記の指示を参照）を各ウェルに加える。
ラップとアルミホイルでプレートを覆い、室温で30分間インキュベートする。
このインキュベーションの終わりに青色が見られる。
10）インキュベーション後、50μLの停止液（2 N硫酸）を各ウェルに加える。
プレートを軽くたたいて、完全に混合する。
黄色が見えるはずである。
11）450および540nmでプレートを読み取る。
12）計算：
サンプルごとに、450nmの読み取り値（修正された読み取り値）から540nmの読み取り値を引く。各サンプルの重複修正値を平均する。サンプルごとに、全ての平均補正OD測定値（最終OD）から平均補正ブランク（標準曲線から、0ng/mL）を引く。この修正後、標準「0」の最終ODはゼロになる。散布図を使用して、標準の最終OD（y軸）対濃度（x軸）をプロットする。

線形であるグラフの領域を選択し、トレンドラインを追加する（フォーマットのトレンドラインセクションで[方程式を表示]および[チャートにR-2乗値を表示]を選択する）。
-方程式の形式は次のとおりである。
y（OD）=勾配* x（濃度）+切片。
-次のようにサンプルを計算する。
濃度=希釈係数*（最終OD-切片）/勾配。

［実施例２］
培地サンプル中のトータルＰＣＳＫ９タンパク質レベルを検出するために、R＆D SystemsのHuman ＰＣＳＫ９ DuoSet ELISA開発システムを使用してサンドイッチELISAを最適化した。高親和性96ウェルプレートを、室温でPBS中のラット抗ヒトＰＣＳＫ９抗体（2μg/mL）で一晩コーティングした。一晩インキュベートした後、コーティング溶液を吸引し、ウェルをPBS/0.05％Tween20で３回洗浄した。ブロッキングは、1％BSA/PBSで、室温で1.5時間行った。PBS/0.05％Tween20での洗浄を３回行った。ＰＣＳＫ９を含む8つのrＰＣＳＫ９標準液（濃度0から20ng/mL）および希釈培地サンプル（上記の処理済みウェルから保存）100μLをプレートに加え、ラップで覆い、1時間振とうしてインキュベートした。室温。内容物は廃棄し、プレートはPBS/0.05％Tween20で３回洗浄した。コーティング抗体に結合したＰＣＳＫ９タンパク質の検出は、穏やかに回転させながら室温で1時間、ブロッキングバッファで希釈したビオチン化ヒツジ抗ヒトＰＣＳＫ９抗体（100ng/mL）を用いて行った。PBS/0.05％Tween20で３回洗浄した後、ブロッキングバッファで２００倍に希釈した100μLのストレプトアビジン-HRPをウェルに加えた。プレートをアルミホイルで覆い、穏やかに回転させながら室温で20分間インキュベートした。３回洗浄した後、穏やかに回転させながら室温で100μLのELISA TMB基質と１５分間インキュベートし、プレートをアルミホイルで覆った。各ウェルに50μLの2M硫酸で反応を停止させた。プレートをプレートリーダーで450および540nmで読み取り、光学密度を測定した。

図３は、ランダムなヒト血清サンプルのトータルＰＣＳＫ９レベルを示している。トータルＰＣＳＫ９アッセイでは、中央値220ng/mL、平均235ng/mLのＰＣＳＫ９レベルが検出された。トータルＰＣＳＫ９レベルの範囲は108〜395ng/mLであった。

これらの人間のサンプル間の変動係数は30.76％であった。同じサンプルの繰り返し間の変動係数は5.78％であった。GrapPad Prism 7ソフトウェアを使用して、分析とグラフ作成を実施した。

図４は、アクティブＰＣＳＫ９アッセイを使用して分析した同じヒトサンプルのアクティブＰＣＳＫ９レベルを示している。アクティブＰＣＳＫ９アッセイでは、中央値179ng/mL、平均202ng/mLのＰＣＳＫ９レベルが検出された。アクティブなＰＣＳＫ９レベルの範囲は55-583ng/mLであった。これらの人間のサンプル間の変動係数は44.13％であった。同じサンプルの繰り返し間の変動係数は2.388％であった。GrapPad Prism 7ソフトウェアを使用して、分析とグラフ作成を実施した。

図５は、サンプルあたりのトータルＰＣＳＫ９に対するアクティブＰＣＳＫ９の比率を示している。図に含まれる値これらの計算では3と4が使用された。比率は、アクティブなＰＣＳＫ９の値を各サンプルのトータルＰＣＳＫ９の値で割ることによって計算された。アクティブ/トータルＰＣＳＫ９比の範囲は0.29-2.05であった。GrapPad Prism 7ソフトウェアを使用して、分析とグラフ作成を実施した。比率の中央値は0.82であったが、平均は0.90であった。これは、ヒト血清サンプルに存在するＰＣＳＫ９タンパク質の大部分（約90％）がアクティブであったことを示している。異なる比率間の変動係数は40.79％であった。このサンプル集団のトータルＰＣＳＫ９レベルとアクティブＰＣＳＫ９レベルの相関関係は僅かに正であり（図６）、R² = 0.1556であった。

Claims (16)

1. サンプル内のアクティブＰＣＳＫ９を検出する方法であって、
   ＬＤＬレセプタ抗体とＬＤＬレセプタによってコーティングされた担体に、ＰＣＳＫ９を含むサンプルを加えるステップと、
   ＰＣＳＫ９抗体を加えて、ＰＣＳＫ９/ＬＤＬレセプタ複合体を検出することにより、前記サンプル内のアクティブＰＣＳＫ９を検出するステップと、
   を含む検出方法。
2. アクティブＰＣＳＫ９を検出する方法であって、
   ＬＤＬレセプタ抗体によってプレートをコーティングするステップと、
   ＬＤＬレセプタを加えるステップと、
   ＰＣＳＫ９を含むサンプルを加えるステップと、
   ＰＣＳＫ９抗体を加えるステップと、
   ＰＣＳＫ９/ＬＤＬレセプタ複合体を検出するステップと、
   を含む検出方法。
3. 前記サンプルは、血液、血漿、血清、細胞培養培地またはそれらの組合せである請求項１または２に記載の検出方法。
4. ＰＣＳＫ９/ＬＤＬレセプタ複合体を、ビオチン化ＰＣＳＫ９抗体を用いて検出する請求項１、２または３に記載の検出方法。
5. 前記アクティブＰＣＳＫ９はストレプトアビジン-HRPおよびアビジンHRPから選択された検出剤を用いて検出される請求項１乃至４のいずれか１項に記載の検出方法。
6. 発色基質を含む試薬検出剤をさらに用いる請求項１乃至５のいずれか１項に記載の検出方法。
7. 前記発色基質は、2,2'-アジノビス[3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸]-ジアンモニウム塩（ABTS）またはテトラメチルベンジジン（TMB）である請求項６に記載の検出方法。
8. 前記試薬検出剤は、H₂O₂/TMBである請求項７に記載の検出方法。
9. サンプル内のアクティブＰＣＳＫ９を検出する方法であって、
   ＬＤＬレセプタとＬＤＬレセプタ抗体によってコーティングされた担体に、ＰＣＳＫ９を含むサンプルを加えるステップと、
   ＰＣＳＫ９抗体を加えるステップと、
   検出剤を加えるステップと、
   試薬検出剤を加えるステップと、
   ＰＣＳＫ９/ＬＤＬレセプタ複合体を検出することにより、前記サンプル内のアクティブＰＣＳＫ９を検出するステップと、
   を含む検出方法。
10. 抗原抗体複合体が形成されるのに十分な時間および条件の下で、ＰＣＳＫ９を有する対象から採取された生物学的サンプルに接触するステップと、
    抗原抗体複合体の形成を検出するステップとをさらに含む請求項１乃至９のいずれか１項に記載の検出方法。
11. トータルＰＣＳＫ９をアクティブＰＣＳＫ９と比較する方法であって、
    請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の検出方法でアクティブＰＣＳＫ９の量を判定するステップと、
    トータルＰＣＳＫ９の量を判定するステップとを含む比較方法。
12. サンプルのアクティブＰＣＳＫ９を検出するアッセイ。
13. アクティブＰＣＳＫ９とトータルＰＣＳＫ９とを検出するアッセイ。
14. サンプル中のアクティブＰＣＳＫ９を検出し定量化するキットであって、
    ＰＣＳＫ９抗体を含む検出抗体と、
    １つ以上のキャプチャ抗体と、
    検出剤と、
    試薬検出剤と、
    バッファと、
    洗浄バッファと、
    ブロッキングバッファと、
    停止溶液と、を含むキット。
15. １つ以上のプレート、担体、および使用説明書をさらに含む請求項１４に記載のキット。
16. トータルＰＣＳＫ９を検出する第２ＰＣＳＫ９抗体をさらに含む請求項１４または１５に記載のキット。

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