ES2899894T3 - Anticuerpos anti-C5 y métodos de uso - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo que se une a C5, en donde el anticuerpo se une a un epítopo dentro de un fragmento que consiste en los aminoácidos 19 a 180 de la cadena beta (SEQ ID NO: 40) de C5 con una mayor afinidad a pH neutro que a pH ácido, en donde His70 e His110 de dicha cadena beta contribuyen a la dependencia del pH, y en donde el anticuerpo compite por la unión a C5 con un anticuerpo que comprende un par VH y VL seleccionado de: (a) un VH de SEQ ID NO: 1 y un VL de SEQ ID NO: 11; (b) un VH de SEQ ID NO: 5 y un VL de SEQ ID NO: 15; (c) un VH de SEQ ID NO: 4 y un VL de SEQ ID NO: 14; (d) un VH de SEQ ID NO: 6 y un VL de SEQ ID NO: 16; (e) un VH de SEQ ID NO: 2 y un VL de SEQ ID NO: 12; (f) un VH de SEQ ID NO: 3 y un VL de SEQ ID NO: 13; (g) un VH de SEQ ID NO: 9 y un VL de SEQ ID NO: 19; (h) un VH de SEQ ID NO: 7 y un VL de SEQ ID NO: 17; (i) un VH de SEQ ID NO: 8 y un VL de SEQ ID NO: 18; y (j) un VH de SEQ ID NO: 10 y un VL de SEQ ID NO: 20.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti-C5 y métodos de uso
[Campo técnico]
La presente descripción se refiere, en general, a anticuerpos anti-C5 y a métodos de uso de los mismos. La presente invención se refiere a un anticuerpo que se une a C5, en donde el anticuerpo se une a un epítopo dentro de un fragmento que consiste en los aminoácidos 19 a 180 de la cadena beta (SEQ ID NO: 40) de C5 con una mayor afinidad a pH neutro que a pH ácido en donde His70 e His110 contribuyen a la dependencia del pH y en donde el anticuerpo compite por la unión a C5 con un anticuerpo que comprende un par VH y VL seleccionado de: (a) un VH de SEQ ID NO: 1 y un VL de SEQ ID NO: 11; (b) un VH de SEQ ID NO: 5 y un VL de SEQ ID NO: 15; (c) un VH de SEQ ID NO: 4 y un VL de SEQ ID NO: 14; (d) un VH de SEQ ID NO: 6 y un VL de SEQ ID NO: 16; (e) un VH de SEQ ID NO: 2 y un VL de SEQ ID NO: 12; (f) un VH de SEQ ID NO: 3 y un VL de SEQ ID NO: 13; (g) un VH de SEQ ID NO: 9 y un VL de SEQ ID NO: 19; (h) un VH de SEQ ID NO: 7 y un VL de SEQ ID NO: 17; (i) un VH de SEQ ID NO: 8 y un VL de SEQ ID NO: 18; y (j) un VH de SEQ ID NO: 10 y un VL de SEQ ID NO: 20.
[Antecedentes de la técnica]
El sistema del complemento desempeña un papel fundamental en la eliminación de complejos inmunitarios y en las respuestas inmunitarias a agentes infecciosos, antígenos extraños, células infectadas por virus y células tumorales. Existen aproximadamente 25-30 proteínas del complemento, que se encuentran como una colección compleja de proteínas plasmáticas y cofactores de membrana. Los componentes del complemento logran sus funciones defensivas inmunitarias al interaccionar en una serie de intrincados acontecimientos de escisiones enzimáticas y de unión a la membrana. Las cascadas del complemento resultantes conducen a la producción de productos con funciones opsónicas, inmunorreguladoras y líticas.
En la actualidad, está ampliamente aceptado que el sistema del complemento se puede activar mediante tres vías diferentes: la vía clásica, la vía de las lectinas y la vía alternativa. Estas vías comparten muchos componentes y, aunque difieren en sus etapas iniciales, convergen y comparten los mismos componentes del complemento terminales (C5 a C9) responsables de la activación y destrucción de las células diana.
La vía clásica normalmente se activa mediante la formación de complejos antígeno-anticuerpo. Independientemente, la primera etapa en la activación de la vía de las lectinas es la unión de lectinas específicas tal como la lectina de unión a manosa (MBL, por las siglas del inglés), H-ficolina, M-ficolina, L-ficolina y lectina de tipo C, CL-11. En cambio, la vía alternativa experimenta de manera espontánea un bajo nivel de activación de renovación, que se puede amplificar fácilmente sobre superficies exógenas u otras superficies anómalas (bacterias, levaduras, células infectadas por virus o tejido dañado). Estas vías convergen en un punto donde una proteasa activa escinde el componente C3 del complemento para producir C3a y C3b.
C3a es una anafilatoxina. C3b se une a células bacterianas y otras células, así como a determinados virus y complejos inmunitarios y los etiqueta para eliminarlos de la circulación (función conocida como opsonina). C3b también forma un complejo con otros componentes para formar convertasa C5, que escinde C5 en C5a y C5b.
C5 es una proteína de 190 kDa que se encuentra en suero normal a aproximadamente 80 pg/ml (0,4 pM). La C5 está glicosilada y aproximadamente el 1,5-3% de su masa se atribuye a los carbohidratos. La C5 madura es un heterodímero de cadena alfa de 115 kDa que está unido por disulfuro a la cadena beta de 75 kDa. La C5 se sintetiza como una proteína precursora de cadena sencilla (precursor pro-C5) de 1676 aminoácidos (véanse, por ejemplo, los documentos PTL1 y PTL2). El precursor pro-C5 se escinde para producir la cadena beta como un fragmento aminoterminal y la cadena alfa como un fragmento carboxilo terminal. Los fragmentos polipeptídicos de la cadena alfa y la cadena beta están conectados entre sí mediante un enlace disulfuro y constituyen la proteína C5 madura.
La C5 madura se escinde en los fragmentos C5a y C5b durante la activación de las vías del complemento. C5a se escinde de la cadena alfa de C5 mediante la convertasa C5 como un fragmento aminoterminal que comprende los primeros 74 aminoácidos de la cadena alfa. La porción restante de la C5 madura es el fragmento C5b, que contiene el resto de la cadena alfa unida por disulfuro a la cadena beta. Aproximadamente el 20 % de la masa de 11 kDa de C5a se atribuye a los carbohidratos.
C5a es otra anafilatoxina. C5b se combina con C6, C7, C8 y C9 para formar el complejo de ataque a la membrana (MAC, por sus siglas en inglés, C5b-9, complejo terminal del complemento (TCC, por sus siglas en inglés)) en la superficie de la célula diana. Cuando se inserta una cantidad suficiente de MAC en las membranas de las células diana, se forman poros de MAC que actúan como mediadores en la rápida lisis osmótica de las células diana.
Como se ha mencionado anteriormente, C3a y C5a son anafilatoxinas. Estas pueden desencadenar la desgranulación de los mastocitos, que liberan histamina y otros mediadores de la inflamación, dando como resultado la contracción del músculo liso, el aumento de la permeabilidad vascular, la activación de leucocitos y otros fenómenos inflamatorios, incluyendo la proliferación celular dando como resultado hipercelularidad. C5a también funciona como un péptido quimiotáctico que sirve para atraer granulocitos tal como neutrófilos, eosinófilos, basófilos y monocitos al sitio de activación del complemento.
La actividad de C5a está regulada por la enzima plasmática carboxipeptidasa N que elimina la arginina carboxiterminal de C5a formando el derivado C5a-des-Arg. C5a-des-Arg presenta solamente el 1 % de la actividad anafiláctica y la actividad quimiotáctica polimorfonuclear de C5a sin modificar.
Mientras que un sistema de complemento que funciona correctamente proporciona una defensa fuerte contra la infección por microbios, la regulación o activación inapropiadas del complemento se ha implicado en la patogénesis de una variedad de trastornos que incluyen, por ejemplo, artritis reumatoide (RA, por sus siglas en inglés); nefritis lúpica; lesión por isquemia-reperfusión; hemoglobinuria paroxística nocturna (PNH, por sus siglas en inglés); síndrome urémico hemolítico atípico (aHUS, por sus siglas en inglés); enfermedad por depósitos densos (DDD, por sus siglas en inglés); degeneración macular (por ejemplo, degeneración macular relacionada con la edad (AMD, por sus siglas en inglés)); síndrome de hemólisis, elevación de enzimas hepáticas y plaquetas bajas (HELLP, por sus siglas en inglés); púrpura trombocitopénica trombótica (TTP, por sus siglas en inglés); pérdida fetal espontánea; vasculitis pauciinmunitaria; epidermólisis ampollosa; pérdida fetal recurrente; esclerosis múltiple (MS, por sus siglas en inglés); lesión cerebral traumática; y lesiones resultantes de infarto de miocardio, derivación cardiopulmonar y hemodiálisis (véase, por ejemplo, el documento NPL1). Por lo tanto, la inhibición de activaciones excesivas o incontroladas de la cascada del complemento puede proporcionar beneficios clínicos a los pacientes con tales trastornos.
La hemoglobinuria paroxística nocturna (PNH) es un trastorno sanguíneo poco frecuente, en donde los glóbulos rojos se ven comprometidos y, por lo tanto, se destruyen más rápidamente que los glóbulos rojos normales. La PNH es el resultado de la expansión clonal de células madre hematopoyéticas con mutaciones somáticas en el gen PIG-A (fosfatidilinositol glicano de clase A) que se encuentra en el cromosoma X. Las mutaciones en PIG-A dan lugar a un bloqueo temprano en la síntesis de glicosilfosfatidilinositol (GPI, por sus siglas en inglés), una molécula que se requiere para el anclaje de muchas proteínas a las superficies celulares. En consecuencia, los glóbulos sanguíneos de la PNH son deficientes en proteínas ancladas a GPI, que incluyen las proteínas reguladoras del complemento CD55 y CD59. En circunstancias normales, estas proteínas reguladoras del complemento bloquean la formación de MAC en las superficies celulares, impidiendo, de este modo, la lisis de eritrocitos. La ausencia de proteínas ancladas a GPI provoca la hemólisis mediada por el complemento en la PNH
La PNH se caracteriza por anemia hemolítica (disminución del número de glóbulos rojos), hemoglobinuria (la presencia de hemoglobina en la orina, particularmente evidente después de dormir) y hemoglobinemia (la presencia de hemoglobina en el torrente sanguíneo). Se sabe que los individuos afectados por PNH tienen paroxismos, que, en el presente documento, se definen como manifestaciones de orina de color oscuro. La anemia hemolítica se debe a la destrucción intravascular de los glóbulos rojos por los componentes del complemento. Otros síntomas conocidos incluyen disfasia, cansancio, disfunción eréctil, trombosis y dolor abdominal recurrente.
Eculizumab es un anticuerpo monoclonal humanizado dirigido contra la proteína del complemento C5, y la primera terapia aprobada para el tratamiento de la hemoglobinuria paroxística nocturna (PNH) y para el síndrome urémico hemolítico atípico (aHUS) (véase, por ejemplo, el documento NPL2). Eculizumab inhibe la escisión de C5 en C5a y C5b por la convertasa C5, que impide la generación del complejo terminal del complemento C5b-9. Tanto C5a como C5b-9 causan los acontecimientos terminales mediados por el complemento que son característicos de la PNH y del aHUS (véanse también, los documentos PTL3, PTL4, PTL5 y PTL6).
En diversas publicaciones se han descrito anticuerpos anti-C5. Por ejemplo, en el documento WO 95/29697 (PTL7) se describió un anticuerpo anti-C5 que se une a la cadena alfa de C5, pero que no se une a C5a y bloquea la activación de C5, mientras que en el documento WO 2002/30985 (PTL8) se describió un anticuerpo monoclonal anti-C5 que inhibe la formación de C5a. Por otro lado, en el documento WO 2004/007553 (PTL9) se describió un anticuerpo anti-C5 que reconoce el sitio proteolítico para la convertasa C5 en la cadena alfa de C5 e inhibe la conversión de C5 en C5a y C5b. En el documento WO 2010/015608 (PTL10) se describió un anticuerpo anti-C5 que tiene una constante de afinidad de al menos 1 x 107 M-1.
Los anticuerpos (las IgG) se unen al receptor Fc neonatal (FcRn) y tienen tiempos de retención en plasma prolongados. La unión de las IgG al FcRn se observa normalmente en condiciones ácidas (por ejemplo, pH 6,0) y rara vez se observa en condiciones neutras (p. ej., pH 7,4). Normalmente, las IgG se incorporan de forma inespecífica en las células mediante endocitosis y regresan a las superficies celulares uniéndose al FcRn endosómico en condiciones ácidas en los endosomas. Después, las IgG se disocian del FcRn en condiciones neutras en plasma. Las IgG que no se han unido al FcRn se degradan en los lisosomas. Cuando la capacidad de unión al FcRn de una IgG en condiciones ácidas se elimina introduciendo mutaciones en su región Fc, la IgG no se recicla de los endosomas al plasma, dando lugar a un notable deterioro de la retención en plasma de la IgG. Para mejorar la retención en plasma de las IgG, se ha notificado un método que potencia su unión a FcRn en condiciones ácidas. Cuando la unión de una IgG al FcRn se mejora en condiciones ácidas introduciendo una sustitución de aminoácidos en su región Fc, la IgG se recicla de manera más eficaz desde los endosomas al plasma y, por lo tanto, muestra una retención en plasma mejorada. Mientras tanto, también se ha notificado que una IgG con unión potenciada al FcRn en condiciones neutras, no se disocia del FcRn en condiciones neutras en plasma, incluso cuando regresa a la superficie celular a través de su unión al FcRn en condiciones ácidas en los endosomas y, en consecuencia, su retención en plasma permanece inalterada, o más bien, empeora (véanse, por ejemplo, los documentos NPL3; NPL4; NPL5).
Recientemente, se han notificado anticuerpos que se unen a antígenos de una manera dependiente del pH (véanse, por ejemplo, los documentos PTL11 y PTL12). Estos anticuerpos se unen fuertemente a los antígenos en condiciones neutras del plasma y se disocian de los antígenos en condiciones ácidas del endosoma. Después de disociarse de los antígenos, los anticuerpos vuelven a ser capaces de unirse a antígenos cuando se reciclan al plasma a través del FcRn. Por tanto, una sola molécula de anticuerpo puede unirse reiteradamente a múltiples moléculas de antígeno. En general, la retención en plasma de un antígeno es mucho más corta que la de un anticuerpo que tiene el mecanismo de reciclado mediado por FcRn mencionado anteriormente. Por lo tanto, cuando un antígeno se une a un anticuerpo, el antígeno normalmente muestra una retención en plasma prolongada, dando como resultado un aumento de la concentración en plasma del antígeno. Por otro lado, se ha notificado que los anticuerpos descritos anteriormente, que se unen a los antígenos de una manera dependiente del pH, eliminan los antígenos del plasma más rápidamente que los anticuerpos habituales porque se disocian de los antígenos dentro de los endosomas durante el proceso de reciclado mediado por FcRn. En el documento WO 2011/111007 (PTL13) también se describe un análisis de modelado informático que muestra que un anticuerpo con unión dependiente del pH, dirigido contra C5, podría extender la atenuación génica del antígeno.
[Listado de citas]
[B ibliografía de patentes]
[PTL1] patente de los Estados Unidos n.° 6.355.245
[PTL2] patente de los Estados Unidos n.° 7.432.356
[PTL3] documento WO 2005/074607
[PTL4] documento WO 2007/106585
[PTL5] documento WO 2008/069889
[PTL6] documento WO 2010/054403
[PTL7] documento WO 95/29697
[PTL8] documento WO 2002/30985
[PTL9] documento WO 2004/007553
[PTL10] documento WO 2010/015608
[PTL11] documento WO 2009/125825
[PTL12] documento WO 2011/122011
[PTL13] documento WO 2011/111007
[B ibliografía no de patente]
[NPL1] Holers et al., Immunol. Rev. 223:300-316 (2008)
[NPL2] Dmytrijuk et al., The Oncologist 13(9):993-1000 (2008)
[NPL3] Yeung et al., J Immunol. 182(12): 7663-7671 (2009)
[NPL4] Datta-Mannan et al., J Biol. Chem. 282(3):1709-1717 (2007)
[NPL5] Dall'Acqua et al., J. Immunol. 169(9):5171-5180 (2002)
[Sumario de la invención]
La invención proporciona anticuerpos anti-C5 y se expone en el conjunto de reivindicaciones adjuntas.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 aislado de la presente invención se une a un epítopo dentro de un fragmento de los aminoácidos 19-180 de la cadena beta (SEQ ID NO: 40) de C5. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 aislado de la presente invención se une a un epítopo dentro del dominio MG1-MG2 de la cadena beta de C5. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 aislado de la presente invención se une a un epítopo dentro de un fragmento que consiste en los aminoácidos 33-124 de la cadena beta (SEQ ID NO: 40) de C5. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 aislado de la presente invención se une a un epítopo dentro de la cadena beta (SEQ ID NO: 40) de C5 que comprende al menos un fragmento seleccionado del grupo que consiste en los aminoácidos 47-57, 70-76 y 107-110. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 aislado de la presente invención se une a un epítopo dentro de un fragmento de la cadena beta (SEQ ID NO: 40) de C5 que comprende al menos un resto de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Glu48, Asp51, His70, His72, Lys109 e His110 de la SEQ ID NO: 40. En realizaciones adicionales, el anticuerpo se une a C5 con mayor afinidad a pH neutro que a pH ácido. En realizaciones adicionales, el anticuerpo se une a C5 con mayor afinidad a pH 7,4 que a pH 5,8. En otra realización, un anticuerpo anti-C5 aislado de la presente invención se une al mismo epítopo que un anticuerpo descrito en la tabla 2. En realizaciones adicionales, el anticuerpo se une al mismo epítopo que un anticuerpo descrito en la tabla 2 con una mayor afinidad a pH 7,4 que a pH 5,8. En una realización adicional, el anticuerpo anti-C5 de la presente invención se une al mismo epítopo que un anticuerpo descrito en las tablas 7 u 8. En realizaciones adicionales, el anticuerpo se une al mismo epítopo que un anticuerpo descrito en las tablas 7 u 8 con una mayor afinidad a pH 7,4 que a pH 5,8.
En el contexto de la presente invención, un anticuerpo anti-C5 de la presente invención compite por la unión a C5 con un anticuerpo que comprende un par VH y VL seleccionado de: (a) un VH de SEQ ID NO: 1 y un VL de SEQ ID NO: 11; (b) un VH de SEQ ID NO: 5 y un VL de SEQ ID NO: 15; (c) un VH de SEQ ID NO: 4 y un VL de SEQ ID NO: 14; (d) un VH de SEQ ID NO: 6 y un VL de SEQ ID NO: 16; (e) un VH de SEQ ID NO: 2 y un VL de SEQ ID NO: 12; (f) un VH de SEQ ID NO: 3 y un VL de SEQ ID NO: 13; (g) un VH de SEQ ID NO: 9 y un VL de SEQ ID NO: 19; (h) un VH de SEQ ID NO: 7 y un VL de SEQ ID NO: 17; (i) un VH de SEQ ID NO: 8 y un VL de SEQ ID NO: 18; y (j) un VH de SEQ ID NO: 10 y un VL de SEQ ID NO: 20. En realizaciones adicionales, el anticuerpo anti-C5 se une a C5 con una mayor afinidad a pH neutro que a pH ácido. En realizaciones adicionales, el anticuerpo anti-C5 se une a C5 con una mayor afinidad a pH 7,4 que a pH 5,8.
En algunas realizaciones, que están presentes con fines ilustrativos únicamente, un anticuerpo anti-C5 aislado de la presente divulgación tiene una característica seleccionada del grupo que consiste en: (a) el anticuerpo entra en contacto con los aminoácidos D51 y K109 de C5 (SEQ ID NO: 39); (b) la afinidad del anticuerpo por C5 (SEQ ID NO: 39) es mayor que la afinidad del anticuerpo por un mutante de C5 que consiste en una sustitución E48A de la SEQ ID NO: 39; o (c) el anticuerpo se une a una proteína C5 que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 39 a pH 7,4, pero no se une a una proteína C5 que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 39 con una sustitución H72Y a pH 7,4. En realizaciones adicionales, el anticuerpo se une a C5 con mayor afinidad a pH neutro que a pH ácido. En realizaciones adicionales, el anticuerpo se une a C5 con mayor afinidad a pH 7,4 que a pH 5,8.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 aislado de la presente invención inhibe la activación de C5. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 aislado de la presente invención inhibe la activación de la variante R885H de C5. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 aislado de la presente invención es un anticuerpo monoclonal. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 aislado de la presente invención es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 aislado de la presente invención es un fragmento de anticuerpo que se une a C5. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 aislado de la presente invención es un anticuerpo de IgG1 o IgG4 de longitud completa.
En algunas realizaciones, que están presentes con fines ilustrativos únicamente, un anticuerpo anti-C5 aislado de la presente divulgación comprende (a) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos DX1GYX2X3PTHAMX4X5, en donde X1 es G o A, X2 es V, Q o D, X3 es T o Y, X4 es Y o H, X5 es L o Y (SEQ ID NO: 128), (b) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos QX1TX2VGSSYGNX3, en donde X1 es S, C, N o T, X2 es F o K, X3 es A, T o H (SEQ ID NO: 131), y (c) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos X1IX2TGSGAX3YX4AX5WX6KG, en donde X1 es C, A o G, X2 es Y o F, X3 es T, D o E, X4 es Y, K o Q, X5 es S, D o E, X6 es A o V (SEQ ID NO: 127).
En algunas realizaciones, que están presentes con fines ilustrativos únicamente, un anticuerpo anti-C5 aislado de la presente divulgación comprende (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos SSYYX1X2, en donde X1 es M o V, X2 es C o A (SEQ ID NO: 126), (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos X1IX2TGSGAX3YX4AX5WX6KG, en donde X1 es C, A o G, X2 es Y o F, X3 es T, D o E, X4 es Y, K o Q, X5 es S, D o E, X6 es A o V (SEQ ID NO: 127), y (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos DX1GYX2X3PTHAMX4X5, en donde X1 es G o A, X2 es V, Q o D, X3 es T o Y, X4 es Y o H, X5 es L o Y (SEQ ID NO: 128) . En realizaciones adicionales, el anticuerpo comprende (a) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos X1ASQX2IX3SX4LA, en donde X1 es Q o R, X2 es N, Q o G, X3 es G o S, X4 es D, K o S (SEQ ID NO: 129) ; (b) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos GASX1X2X3S, en donde X1 es K, E o T, X2 es L o T, X3 es A, H, E o Q (SEQ ID NO: 130); y (c) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos QX1TX2VGSSYGNX3, en donde X1 es S, C, N o T, X2 es F o K, X3 es A, T o H (SEQ ID NO: 131).
En algunas realizaciones, que están presentes con fines ilustrativos únicamente, un anticuerpo anti-C5 aislado de la presente divulgación comprende (a) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos X1ASQX2IX3SX4LA, en donde X1 es Q o R, X2 es N, Q o G, X3 es G o S, X4 es D, K o S (SEQ ID NO: 129); (b) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos GASX1X2X3S, en donde X1 es K, E o T, X2 es L o T, X3 es A, H, E o Q (SEQ ID No : 130); y (c) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos QX1TX2VGSSYGNX3, en donde X1 es S, C, N o T, X2 es F o K, X3 es A, T o H (SEQ ID NO: 131).
En algunas realizaciones, que están presentes con fines ilustrativos únicamente, un anticuerpo anti-C5 aislado de la presente divulgación comprende un marco (framework) FR1 de dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 132-134; un FR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 135-136; un FR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 137-139; y un FR4 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las s Eq ID NO: 140-141. En algunas realizaciones, que están presentes con fines ilustrativos únicamente, un anticuerpo anti-C5 aislado de la presente divulgación comprende un marco FR1 de dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 142-143; un FR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 144-145; un FR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 146-147; y un FR4 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 148.
En algunas realizaciones, que están presentes con fines ilustrativos únicamente, un anticuerpo anti-C5 aislado de la presente divulgación comprende (a) una secuencia VH que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 10, 106-110; (b) una secuencia VL que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 20, 111­ 113; o (c) una secuencia VH como en (a) y una secuencia VL como en (b). En realizaciones adicionales, el anticuerpo comprende una secuencia VH de una cualquiera de las SEQ ID NO: 10, 106-110. En realizaciones adicionales, el anticuerpo comprende una secuencia VL de una cualquiera de las SEQ ID NO: 20, 111-113.
La divulgación proporciona, con fines ilustrativos únicamente, un anticuerpo que comprende una secuencia VH de una cualquiera de las Se Q ID NO: 10, 106-110 y una secuencia VL de una cualquiera de las SEQ ID NO: 20, 111-113.
La invención también proporciona ácidos nucleicos aislados que codifican un anticuerpo anti-C5 de la presente invención. La invención también proporciona células hospedadoras que comprenden un ácido nucleico de la presente invención. La invención también proporciona un método para producir un anticuerpo que comprende cultivar una célula hospedadora de la presente invención para que se produzca el anticuerpo.
La divulgación proporciona además, con fines ilustrativos únicamente, un método para producir un anticuerpo anti-C5. En algunas realizaciones, el método comprende inmunizar un animal contra un polipéptido que comprende el dominio MG1-MG2 (SEQ ID NO: 43) de la cadena beta de C5. En algunas realizaciones, el método comprende inmunizar un animal contra un polipéptido que comprende la región correspondiente a los aminoácidos en las posiciones 33 a 124 de la cadena beta (s Eq ID NO: 40) de C5. En algunas realizaciones, el método comprende inmunizar un animal contra un polipéptido que comprende al menos un fragmento seleccionado de los aminoácidos 47-57, 70-76 y 107-110 de la cadena beta (SEQ ID NO: 40) de C5. En algunas realizaciones, el método comprende inmunizar a un animal contra un polipéptido que comprende un fragmento de la cadena beta (SEQ ID NO: 40) de C5, que comprende al menos un aminoácido seleccionado de Glu48, Asp51, His70, His72, Lys 109 e His110.
La invención también proporciona una formulación farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-C5 de la presente invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
De manera específica, la presente invención se refiere a:
[1] Un anticuerpo que se une a C5, en donde el anticuerpo se une a un epítopo dentro de un fragmento que consiste en los aminoácidos 19 a 180 de la cadena beta (SEQ ID NO: 40) de C5 con una mayor afinidad a pH neutro que a pH ácido en donde His70 e His110 contribuyen a la dependencia del pH y en donde el anticuerpo compite por la unión a C5 con un anticuerpo que comprende un par VH y VL seleccionado de:
(a) un VH de SEQ ID NO: 1 y un VL de SEQ ID NO: 11;
(b) un VH de SEQ ID NO: 5 y un VL de SEQ ID NO: 15;
(c) un VH de SEQ ID NO: 4 y un VL de SEQ ID NO: 14;
(d) un VH de SEQ ID NO: 6 y un VL de SEQ ID NO: 16;
(e) un VH de SEQ ID NO: 2 y un VL de SEQ ID NO: 12;
(f) un VH de SEQ ID NO: 3 y un VL de SEQ ID NO: 13;
(g) un VH de SEQ ID NO: 9 y un VL de SEQ ID NO: 19;
(h) un VH de SEQ ID NO: 7 y un VL de SEQ ID NO: 17;
(i) un VH de SEQ ID NO: 8 y un VL de SEQ ID NO: 18; y
(j) un VH de SEQ ID NO: 10 y un VL de SEQ ID NO: 20.
[2] El anticuerpo de [1], en donde el anticuerpo se une a C5 con una mayor afinidad a pH 7,4 que a pH 5,8.
[3] El anticuerpo de [1] o [2], en donde el anticuerpo se une a un epítopo dentro de un fragmento que consiste en los aminoácidos 33 a 124 de la cadena beta (SEQ ID NO: 40) de C5.
[4] El anticuerpo de uno cualquiera de [1] a [3], en donde el anticuerpo se une a un epítopo dentro de la cadena beta (SEQ ID NO: 40) de C5 que comprende al menos un fragmento seleccionado del grupo que consiste en 47 a 57, 70 a 76 y 107 a 110.
[5] El anticuerpo de uno cualquiera de [1] a [4], en donde el anticuerpo se une a un epítopo dentro de la cadena beta (SEQ ID NO: 40) de C5 que comprende al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Glu48, Asp51, His70, His72, Lys109 e His110.
[6] El anticuerpo de uno cualquiera de [1] a [5], que inhibe la activación de C5 y/o la activación de la variante R885H de C5.
[7] El anticuerpo de uno cualquiera de [1] a [6], que es
(a) un anticuerpo monoclonal;
(b) un anticuerpo humano, humanizado o quimérico; y/o
(c) un fragmento de anticuerpo que se une a C5.
[8] El anticuerpo de uno cualquiera de [1] a [7], que es un anticuerpo de IgG1 o IgG4 de longitud completa.
[9] Un ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo de uno cualquiera de [1] a [8].
[10] Una célula hospedadora que comprende el ácido nucleico de [9].
[11] Un método para producir el anticuerpo de uno cualquiera de [1] a [8] que comprende cultivar la célula hospedadora de [10] de manera que se produzca el anticuerpo.
[12] Una formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo de uno cualquiera de [1] a [8] y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
[13] El anticuerpo de uno cualquiera de [1] a [8] para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en artritis reumatoide (RA); nefritis lúpica; lesión por isquemia-reperfusión; hemoglobinuria paroxística nocturna (PNH); síndrome urémico hemolítico atípico (aHUS),; enfermedad por depósitos densos (DDD); degeneración macular; síndrome de hemólisis, elevación de enzimas hepáticas y plaquetas bajas (HELLP); púrpura trombocitopénica trombótica (TTP, por sus siglas en inglés); pérdida fetal espontánea; vasculitis pauciinmunitaria; epidermólisis ampollosa; pérdida fetal recurrente; esclerosis múltiple (MS); lesión cerebral traumática; una lesión resultante de infarto de miocardio, derivación cardiopulmonar y hemodiálisis.
[Breve descripción de las figuras]
[Fig. 1]
La figura 1 ilustra la agrupación de epítopos de anticuerpos anti-C5, como se describe en el ejemplo 2.2. Los anticuerpos agrupados en el mismo grupo de epítopos están encuadrados con una línea gruesa.
[Fig. 2A]
La figura 2A ilustra sensogramas BIACORE (marca registrada) de anticuerpos anti-C5 a pH 7,4 (línea continua) y pH 5,8 (línea discontinua) para evaluar la dependencia del pH, como se describe en el ejemplo 3.2. CFA0305, CFA0307, CFA0366, CFA0501, CFA0538 y CFA0599 son anticuerpos agrupados en el epítopo C, como se describe en el ejemplo 2.2.
[Fig. 2B]
La figura 2B ilustra sensogramas BIACORE (marca registrada) de anticuerpos anti-C5 a pH 7,4 (línea continua) y pH 5,8 (línea discontinua) para evaluar la dependencia del pH, como se describe en el ejemplo 3.2. CFA0666, CFA0672 y CFA0675 son anticuerpos agrupados en el epítopo C, y CFA0330 y CFA0341 son anticuerpos agrupados en el epítopo B, como se describe en el ejemplo 2.2. 305LO5 es un anticuerpo humanizado de CFA0305, como se describe en el ejemplo 2.3.
[Fig. 3]
La figura 3 ilustra el análisis de transferencia Western contra fragmentos derivados de la cadena beta de C5 (aminoácidos 19-180, 161-340, 321-500 y 481-660 de la SEQ ID NO: 40) fusionados a la etiqueta GST, como se describe en el ejemplo 4.1. CFA0305, CFA0307, CFA0366, CFA0501, CFA0538, CFA0599, CFA0666, CFA0672 y CFA0675 son anticuerpos agrupados en el epítopo C. El anticuerpo anti-GST es un control positivo. La posición de los fragmentos de C5 fusionados con GST (46-49 kDa) está marcada con una flecha.
[Fig. 4]
La figura 4 ilustra sensogramas BIACORE (marca registrada) de anticuerpos anti-C5 hacia el dominio MG1-MG2 de la cadena beta de C5, como se describe en el ejemplo 4.3. El panel superior muestra los resultados de CFA0305 (línea continua), CFA0307 (línea discontinua), CFA0366 (línea de puntos y guiones) y eculizumab (línea de puntos). El panel central muestra los resultados de CFA0501 (línea continua), CFA0599 (línea discontinua), CFA0538 (línea de puntos y guiones) y eculizumab (línea de puntos). El panel inferior muestra los resultados de CFA0666 (línea continua), CFA0672 (línea discontinua), CFA0675 (línea de puntos y guiones) y eculizumab (línea de puntos). CFA0305, CFA0307, CFA0366, CFA0501, CFA0538, CFA0599, CFA0666, CFA0672 y CFA0675 son anticuerpos agrupados en el epítopo C. Eculizumab es un anticuerpo anti-C5 de control.
[Fig. 5A]
La figura 5A ilustra el análisis de transferencia Western contra fragmentos peptídicos derivados del dominio MG1-MG2 (aminoácidos 33-124, 45-124, 52-124, 33-111,33-108 y 45-111 de la SEQ ID NO: 40) fusionados a la etiqueta GST, como se describe en el ejemplo 4.4. El anticuerpo anti-GST se usa como anticuerpo para la reacción. La posición de los fragmentos C5 fusionados a GST (35-37 kDa) está marcada con una flecha.
[Fig. 5B]
La figura 5B ilustra el análisis de transferencia Western contra fragmentos peptídicos derivados del dominio MG1-MG2 (aminoácidos 33-124, 45-124, 52-124, 33-111,33-108 y 45-111 de la SEQ ID NO: 40) fusionados a la etiqueta GST, como se describe en el ejemplo
4.4. CFA0305 se utiliza como anticuerpo para la reacción.
[Fig. 5C]
La figura 5C resume las reacciones de unión de los anticuerpos anti-C5 a los fragmentos derivados de la cadena beta de C5, como se describe en el ejemplo 4.4. Los fragmentos a los que se agruparon los anticuerpos anti-C5 en el epítopo C (CFA0305, CFA0307, CFA0366, CFA0501, CFA0538, CFA0599, CFA0666, CFA0672 y CFA0675) se muestran en gris y los fragmentos a los que no se unen se muestran en blanco.
[Fig. 6]
La figura 6 ilustra el análisis de transferencia Western contra mutantes puntuales de C5 en los que E48, D51 y K109 de la cadena beta se sustituyen por alanina (E48A, D51A y K109A, respectivamente), como se describe en el ejemplo 4.5. En el panel de la izquierda, eculizumab (anticuerpo anti-C5, aglutinante de cadena alfa) se utiliza como anticuerpo para la reacción y la posición de la cadena alfa de C5 (aproximadamente 113 kDa) está marcada con una flecha. En el panel derecho, CFA0305 (agrupado en el epítopo C, aglutinante de cadena beta) se usa como anticuerpo para la reacción y la posición de la cadena beta de C5 (aproximadamente 74 kDa) está marcada con una punta de flecha.
[Fig. 7]
La figura 7 presenta sensogramas BIACORE (marca registrada) que muestran la interacción de eculizumab-F760G4 (panel superior) o 305LO5 (panel inferior) con mutantes de C5, como se describe en el ejemplo 4.6. Los sensogramas se obtuvieron mediante inyección de C5 de ts (curva continua gruesa), C5-E48A (curva de trazos cortos), C5-D51A (curva de trazos largos) y C5-K109A (curva continua delgada), respectivamente, sobre la superficie del sensor inmovilizada con eculizumab-F760G4 o 305LO5. Eculizumab es un anticuerpo anti-C5 de control. 305LO5 es un anticuerpo humanizado de CFA0305 (agrupado en el epítopo C), como se describe en el ejemplo 2.3.
[Fig. 8]
La figura 8 presenta sensogramas BIACORE (marca registrada) que muestran la interacción de 305LO5 con mutantes His de C5 para evaluar la dependencia del pH, como se describe en el ejemplo 4.7. Los sensogramas se obtuvieron mediante inyección de C5 de ts (curva continua gruesa), C5-H70Y (curva de trazos largos), C5-H72Y (curva de trazos cortos), C5-H110Y (curva de puntos) y C5-H70Y+H110Y (curva continua delgada), respectivamente, sobre la superficie del sensor inmovilizada con 305LO5. Se permitió que los complejos anticuerpo/antígeno se disociaran a pH 7,4, seguido de una disociación adicional a pH 5,8 (señalada con una flecha) para evaluar las interacciones dependientes del pH.
[Fig. 9A]
La figura 9A ilustra la inhibición de la lisis de liposomas activada por el complemento por anticuerpos anti-C5, como se describe en el ejemplo 5.1. Se muestran los resultados de CFA0305, CFA0307, CFA0366, CFA0501, CFA0538, CFA0599, CFA0666, CFA0672 y CFA0675 agrupados en el epítopo C, como se describe en el ejemplo 2.2. [Fig. 9B]
La figura 9B ilustra la inhibición de la lisis de liposomas activada por el complemento por anticuerpos anti-C5, como se describe en el ejemplo 5.1. Se muestran los resultados de los anticuerpos CFA0330 y CFA0341 agrupados en el epítopo B, como se describe en el ejemplo 2.2.
[Fig. 10A]
La figura 10A ilustra la inhibición de la generación de C5a por anticuerpos anti-C5, como se describe en el ejemplo 5.2. Las concentraciones de C5a se cuantificaron en los sobrenadantes obtenidos durante el ensayo de lisis de liposomas descrito en la figura 9A.
[Fig. 10B]
La figura 10B ilustra la inhibición de la generación de C5a por anticuerpos anti-C5, como se describe en el ejemplo 5.2. Las concentraciones de C5a se cuantificaron en los sobrenadantes obtenidos durante el ensayo de lisis de liposomas descrito en la figura 9B.
[Fig. 11]
La figura 11 ilustra la inhibición de la hemólisis activada por el complemento por anticuerpos anti-C5, como se describe en el ejemplo 5.3. Los complementos se activaron a través de la vía clásica.
[Fig. 12 ]
La figura 12 ilustra la inhibición de la hemólisis activada por el complemento por anticuerpos anti-C5, como se describe en el ejemplo 5.4. Los complementos se activaron a través de la vía alternativa.
[Fig. 13]
La figura 13 ilustra la inhibición de la lisis de liposomas activada por el complemento por anticuerpos anti-C5, como se describe en el ejemplo 8.1. Se muestran los resultados de los anticuerpos 305LO15-SG422, 305LO16-SG422, 305LO18-SG422, 305LO19-SG422, 305LO20-SG422 y 305LO20-SG115.
[Fig. 14]
La figura 14 ilustra la inhibición de la lisis de liposomas activada por el complemento por anticuerpos anti-C5, como se describe en el ejemplo 8.1. Se muestran los resultados de los anticuerpos 305LO15-SG115 y 305LO23-SG429.
[Fig. 15]
La figura 15 ilustra la inhibición de la lisis de liposomas activada por el complemento por anticuerpos anti-C5, como se describe en el ejemplo 8.1. Se muestran los resultados de los anticuerpos 305LO22-SG115, 305LO22-SG422, 305LO23-SG115 y 305LO23-SG422.
[Fig. 16 ]
La figura 16 ilustra la inhibición de la generación de C5a por anticuerpos anti-C5, como se describe en el ejemplo 8.2. Las concentraciones de C5a se cuantificaron en los sobrenadantes obtenidos durante el ensayo de lisis de liposomas descrito en la figura 13.
[Fig. 17]
La figura 17 ilustra la inhibición de la generación de C5a por anticuerpos anti-C5, como se describe en el ejemplo 8.2. Las concentraciones de C5a se cuantificaron en los sobrenadantes obtenidos durante el ensayo de lisis de liposomas descrito en la figura 14.
[Fig. 18]
La figura 18 ilustra la inhibición de la actividad del complemento en plasma de mono por anticuerpos anti-C5, como se describe en el ejemplo 8.3. Se administraron anticuerpos anti-C5 a monos cynomolgus y en un ensayo de hemólisis se midieron las actividades del complemento en el plasma de los monos.
[Fig. 19]
La figura 19 ilustra la inhibición de la actividad biológica de C5 de tipo silvestre (TS) y variantes de C5 (V145I, R449G, V802I, R885H, R928Q, D966Y, S1310N y E1437D) por un anticuerpo anti-C5 (eculizumab), como se describe en el ejemplo 8.4.
[Fig. 20]
La figura 20 ilustra la inhibición de la actividad biológica de C5 de tipo silvestre (TS) y variantes de C5 (V145I, R449G, V802I, R885H, R928Q, D966Y, S1310N y E1437D) por un anticuerpo anti-C5 (una variante 305), como se describe en el ejemplo 8.4.
[Fig. 21]
La figura 21 ilustra la inhibición de la lisis de liposomas activada por el complemento por anticuerpos anti-C5 (BNJ441 y una variante 305), como se describe en el ejemplo 8.5.
[Fig. 22]
Las figuras 22A y 22B ilustran la estructura cristalina del Fab de 305 unido al dominio (hC5)-MG1 de C5 humana, como se describe en el ejemplo 9.6. La figura 22A ilustra una unidad asimétrica. MG1 se muestra en la representación de la superficie y el Fab de 305 se muestra como cintas (gris oscuro: cadena pesada, gris claro: cadena ligera). La figura 22B ilustra las moléculas 1 y 2 superpuestas (gris oscuro: molécula 1, gris claro: molécula 2).
[Fig. 23A]
La figura 23A ilustra el epítopo de la región de contacto de Fab de 305 en el dominio MG1, como se describe en el ejemplo 9.6. La figura 23A ilustra el mapeo de epítopos en la secuencia de aminoácidos de MG1 (gris oscuro: más cerca de 3,0 angstrom, gris claro: más cerca de 4,5 angstrom).
[Fig. 23B]
La figura 23B ilustra el epítopo de la región de contacto de Fab de 305 en el dominio MG1, como se describe en el ejemplo 9.6. La figura 23B ilustra el mapeo de epítopos en la estructura cristalina (esferas de color gris oscuro: más cerca de 3,0 angstrom, barras de color gris claro: más cerca de 4,5 angstrom).
[Fig. 24A]
La figura 24A ilustra una vista en primer plano de las interacciones de E48, D51 y K109 (representación de barras con el Fab de 305 (representación de superficie), como se describe en el ejemplo 9.7.
[Fig. 24B]
La figura 24B ilustra las interacciones entre E48 y su entorno (línea de puntos gris oscuro: enlace de hidrógeno con el Fab, línea de puntos gris claro: enlace de hidrógeno mediado por agua), como se describe en el ejemplo 9.7.
[Fig. 24C]
La figura 24C ilustra las interacciones entre D51 y su entorno (línea de puntos de color gris oscuro: enlace de hidrógeno con el Fab), como se describe en el ejemplo 9.7.
[Fig. 24D]
La figura 24D ilustra las interacciones entre K109 y su entorno (línea de puntos gris oscuro: enlace de hidrógeno con el Fab, línea de puntos gris claro: puente salino con H-CDR3_D95), como se describe en el ejemplo 9.7. [Fig. 25A]
La figura 25A ilustra una vista en primer plano de las interacciones de H70, H72 y H110 (representación de barras con el Fab de 305 (representación de superficie), como se describe en el ejemplo 9.8, en la misma orientación que la figura 24A.
[Fig. 25B]
La figura 25B ilustra las interacciones entre H70 y su entorno, como se describe en el ejemplo 9.8. Este resto de histidina se indica en representación de barras y malla. El enlace de hidrógeno se indica con una línea de puntos.
[Fig. 25C]
La figura 25C ilustra las interacciones entre H72 y su entorno, como se describe en el ejemplo 9.8. Este resto de histidina se indica en representación de barras y malla. El enlace de hidrógeno se indica con una línea de puntos.
[Fig. 25D]
La figura 25D ilustra las interacciones entre H110 y su entorno, como se describe en el ejemplo 9.8. Este resto de histidina se indica en representación de barras y malla. La distancia entre H110 y H-CDR3_H100c se muestra con una línea de puntos.
[Descripción de las realizaciones]
Las técnicas y los procedimientos descritos o a los que se hace referencia en el presente documento, son generalmente bien entendidos y habitualmente empleados utilizando metodología convencional por los expertos en la materia, tales como, por ejemplo, las metodologías ampliamente utilizadas descritas en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3a Edición (2001), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003)); la serie Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames y G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow y Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (r .I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.l. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather y P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths y D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir y C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller y M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway y P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); "Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd y C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow y D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti y J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); y Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993).
I. Definiciones
A menos que se definan de otro modo, los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invención. Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2a ed., J. Wiley & Sons (Nueva York, Nueva York. 1994) y March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4a ed., John Wiley & Sons (Nueva York, Nueva York. 1992) proporcionan al experto en la materia una guía general para muchos de los términos utilizados en la presente solicitud.
Con el fin de interpretar la presente memoria descriptiva, se aplicarán las siguientes definiciones y siempre que sea adecuado, los términos utilizados en singular también incluirán el plural y viceversa. También debe entenderse que la terminología utilizada en el presente documento únicamente tiene el fin de describir realizaciones particulares y no se pretende que sea limitante. En el caso de que alguna definición establecida a continuación entre en conflicto con cualquier documento citado, prevalecerá la definición establecida a continuación.
Un "marco aceptor humano", a efectos del presente documento, es un marco que comprende la secuencia de aminoácidos de un marco de dominio variable de cadena ligera (VL) o un marco de dominio variable de cadena pesada (VH) procedente de un marco de inmunoglobulina humana o de un marco consenso humano, como se define a continuación. Un marco aceptor humano "procedente de" un marco de inmunoglobulina humana o de un marco consenso humano, puede comprender la misma secuencia de aminoácidos del mismo o puede contener cambios en la secuencia de aminoácidos. En algunas realizaciones, el número de cambios de aminoácidos es de 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos o 2 o menos. En algunas realizaciones, el marco aceptor humano de VL es idéntico en secuencia a la secuencia del marco de VL de inmunoglobulina humana o a la secuencia de marco consenso humana.
"Afinidad " se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un solo sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su compañero de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique lo contrario, como se usa en el presente documento, "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su compañero Y puede estar representada en general por la constante de disociación (Kd). La afinidad puede medirse mediante métodos habituales conocidos en la técnica, incluyendo aquellos descritos en el presente documento. A continuación se describen realizaciones ilustrativas y de ejemplo para medir la afinidad de unión.
Un anticuerpo "madurado por afinidad" se refiere a un anticuerpo con una o más alteraciones en una o más de las regiones hipervariables (HVR, por sus siglas en inglés), en comparación con un anticuerpo precursor que no posee dichas alteraciones, dando como resultado dichas alteraciones una mejora en la afinidad del anticuerpo por el antígeno.
Las expresiones "anticuerpo anti-C5" y "un anticuerpo que se une a C5" se refieren a un anticuerpo que puede unirse a C5 con suficiente afinidad de manera que el anticuerpo es útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico para el direccionamiento a C5. En una realización, el alcance de la unión de un anticuerpo anti-C5 a una proteína que no sea C5 no relacionada es menor de aproximadamente el 10 % de la unión del anticuerpo a C5 según se mide, por ejemplo, mediante radioinmunoensayo (RIA, por sus siglas en inglés). En determinadas realizaciones, un anticuerpo que se une a C5 tiene una constante de disociación (Kd) de <1 pM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM o < 0,001 nM (por ejemplo, 10-8M o menor, por ejemplo, de 10-8 M a 10-13M, por ejemplo, de 10-9M a 10-13M). En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 se une a un epítopo de C5 que está conservado entre C5 de diferentes especies.
El término "anticuerpo" se usa en el presente documento en el sentido más amplio y abarca diversas estructuras de anticuerpo, incluyendo anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo, siempre que muestren la actividad de unión a antígeno deseada.
Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo inalterado que comprende una porción de un anticuerpo inalterado que se une al antígeno al que se une el anticuerpo inalterado. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpos monocatenarios (por ejemplo, scFv); y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.
Un "anticuerpo que se une al mismo epítopo" que un anticuerpo de referencia, se refiere a un anticuerpo que bloquea la unión del anticuerpo de referencia a su antígeno en un ensayo de competición y/o, por el contrario, el anticuerpo de referencia bloquea la unión del anticuerpo a su antígeno en un ensayo de competición. En el presente documento se proporciona un ensayo de competición ilustrativo.
El término anticuerpo "quimérico" se refiere a un anticuerpo en el que una porción de la cadena ligera y/o pesada procede de una fuente o especie particular, mientras que el resto de la cadena pesada y/o ligera procede de una fuente o especie diferente.
La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante que tiene su cadena pesada. Hay cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM y varias de estas pueden dividirse adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG-i, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan alfa, delta, épsilon, gamma y mu, respectivamente.
La expresión "agente citotóxico", como se usa en el presente documento, se refiere a una sustancia que inhibe o impide una función celular y/o provoca la muerte o destrucción celular. Los agentes citotóxicos incluyen isótopos radiactivos (por ejemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radiactivos de Lu); agentes o fármacos quimioterapéuticos (por ejemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, etopósido), doxorrubicina, melfalán, mitomicina C, clorambucilo, daunorrubicina u otros agentes intercalantes); agentes inhibidores del crecimiento; enzimas y fragmentos de las mismas, tales como enzimas nucleolíticas; antibióticos; toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo sus fragmentos y/o variantes; y los diversos agentes antitumorales o anticancerosos divulgados más adelante.
"Funciones efectoras" se refieren a aquellas actividades biológicas que se pueden atribuir a la región Fc de un anticuerpo, que varían con el isotipo del anticuerpo. Ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente de complemento (CDC, por sus siglas en inglés); unión al receptor de Fc; citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC, por sus siglas en inglés); fagocitosis; disminución de receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos, B); y activación de linfocitos B.
Una "cantidad eficaz" de un agente, por ejemplo, una formulación farmacéutica, se refiere a una cantidad eficaz, a las dosis y durante los periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado.
El término "epítopo" incluye cualquier determinante capaz de unirse a un anticuerpo. Un epítopo es una región de un antígeno que está unida por un anticuerpo que se dirige a ese antígeno e incluye aminoácidos específicos que entran en contacto directamente con el anticuerpo. Los determinantes epitópicos pueden incluir agrupamientos de superficie químicamente activos de moléculas, tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcares, grupos fosforilo o sulfonilo y pueden tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características de carga específicas. Generalmente, los anticuerpos específicos para un antígeno diana particular reconocerán preferentemente un epítopo en el antígeno diana en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas.
La expresión "región Fc" en el presente documento se usa para definir una región carboxiterminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una porción de la región constante. La expresión incluye regiones Fc de secuencia natural y regiones Fc variantes. En una realización, una región Fc de cadena pesada de IgG humana se extiende desde Cys226 o desde Pro230, hasta el extremo carboxilo de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina del extremo C (Lys447) de la región Fc puede estar presente o no. A menos que se especifique lo contrario en el presente documento, la numeración de los restos de aminoácidos en la región Fc o en la región constante es de acuerdo con el sistema de numeración EU, también llamado índice EU, tal como se describe en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
"Marco" o "FR" se refiere a restos de dominio variable distintos de restos de la región hipervariable (HVR). La región FR de un dominio variable consiste generalmente en cuatro dominios FR: FR1, FR2, FR3 y FR4. Por consiguiente, las secuencias de HVR y FR aparecen generalmente en la siguiente secuencia en VH (o VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
Las expresiones "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo inalterado", y "anticuerpo completo" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a una estructura de anticuerpo natural o que tiene cadenas pesadas que contienen una región Fc como se define en el presente documento.
Las expresiones "célula hospedadora", "línea celular hospedadora", y "cultivo de células hospedadoras", se usan indistintamente y se refieren a células en las que se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluyendo la descendencia de dichas células. Las células hospedadoras incluyen "transformantes" y "células transformadas", que incluyen la célula primaria transformada y la descendencia derivada de esta, independientemente del número de pases. La descendencia puede no ser completamente idéntica en el contenido de ácidos nucleicos a una célula progenitora, sino que puede contener mutaciones. En el presente documento se incluye la descendencia mutante que tiene la misma función o actividad biológica detectada sistemáticamente o seleccionada en la célula transformada originalmente.
Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que se corresponde con la de un anticuerpo producido por un ser humano o una célula humana o que procede de una fuente no humana, que utiliza repertorios de anticuerpos humanos u otras secuencias codificantes de anticuerpo humanos. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende restos de unión a antígeno no humanos.
Un "marco consenso humano" es un marco que representa los restos de aminoácidos más comunes en una selección de secuencias marco de VL o VH de inmunoglobulina humana. Generalmente, la selección de secuencias de VL o VH de inmunoglobulina humana procede de un subgrupo de secuencias de dominio variable. Generalmente, el subgrupo de secuencias es un subgrupo como en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edición, NIH Publicación 91-3242, Bethesda MD (1991), volúmenes 1-3. En una realización, para la VL, el subgrupo es un subgrupo kappa I según Kabat et al., citado anteriormente. En una realización, para la VH, el subgrupo es un subgrupo III según Kabat et al., citado anteriormente.
Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende restos de aminoácido procedentes de HVR no humanas y restos de aminoácidos procedentes de FR humanas. En determinadas realizaciones, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en los que la totalidad o sustancialmente todas las HVR (por ejemplo, las c Dr ) corresponden a las de un anticuerpo no humano y la totalidad o sustancialmente todas las FR corresponden a las de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado puede comprender opcionalmente al menos una porción de una región constante de anticuerpo procedente de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que se ha sometido a humanización.
La expresión "región hipervariable" o "HVR", como se usa en el presente documento, se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en cuanto a su secuencia ("regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR") y/o de bucles estructuralmente definidos ("bucles hipervariables") y/o que contienen los restos de contacto con el antígeno ("contactos con antígeno"). Generalmente, los anticuerpos comprenden seis HVR: tres en la VH (HI, H2, H3) y tres en la VL (L1, L2, L3). Las HVR ilustrativas en el presente documento incluyen: (a) bucles hipervariables que aparecen en los restos de aminoácidos 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91­ 96 (L3), 26-32 (HI), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) (Chothia, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)); (b) CDR que aparecen en los restos de aminoácidos 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (HI), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, NIH, Bethesda, MD (1991));(c) contactos con antígeno que aparecen en los restos de aminoácidos 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (HI), 47-58 (H2) y 93-101 (H3) (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)); y (d) combinaciones de (a), (b) y/o (c), incluyendo los restos de aminoácidos de HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (HI), 26-35b (HI), 49-65 (H2), 93-102 (H3) y 94-102 (H3).
A menos que se indique lo contrario, en el presente documento, los restos de HVR y otros restos del dominio variable (por ejemplo, restos de FR) se numeran de acuerdo con Kabat et al., citado anteriormente.
Un "inmunoconjugado" es un anticuerpo conjugado a una o más moléculas heterólogas, incluyendo un agente citotóxico.
Un "individuo" o "sujeto" es un mamífero. Los mamíferos incluyen animales domésticos (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, seres humanos y primates no humanos tales como monos), conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). En determinadas realizaciones, el individuo o sujeto es un ser humano.
Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha separado de un componente de su entorno natural. En algunas realizaciones, un anticuerpo se purifica a una pureza mayor del 95 % o 99 %, determinada, por ejemplo, mediante métodos electroforéticos (por ejemplo, SDS-PAGE, isoelectroenfoque (IEF), electroforesis capilar) o cromatográficos (por ejemplo, intercambio iónico o HPLC de fase inversa). Para una revisión sobre métodos para evaluar la pureza de los anticuerpos, véase, por ejemplo, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).
Un ácido nucleico "aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico que se ha separado de un componente de su entorno natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico incluida en células que normalmente contienen la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente extracromosómicamente o en una ubicación cromosómica que es diferente a su ubicación cromosómica natural.
Un "ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-C5" se refiere a una o más moléculas de ácido nucleico que codifican cadenas pesadas y ligeras de anticuerpo (o fragmentos de las mismas), incluyéndose dichas una o más moléculas de ácido nucleico en un solo vector o en vectores distintos, y estando dichas una o más moléculas de ácido nucleico presentes en una o más ubicaciones en una célula hospedadora.
La expresión "anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, salvo por posibles variantes de anticuerpo, por ejemplo, que contienen mutaciones de origen natural o que surgen durante la producción de una preparación de anticuerpos monoclonales, estando presentes dichas variantes generalmente en escasas cantidades. A diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales, que normalmente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales está dirigido contra un solo determinante de un antígeno. Por tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo que se ha obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea y no debe interpretarse como que requiera la producción del anticuerpo por ningún método en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales para su uso de acuerdo con la presente invención, pueden prepararse mediante una variedad de técnicas, incluyendo el método del hibridoma, métodos de ADN recombinante, métodos de presentación en fagos y métodos que utilizan animales transgénicos que contienen la totalidad o parte de los locus de inmunoglobulinas humanas, describiéndose en el presente documento dichos métodos y otros métodos ilustrativos para preparar anticuerpos monoclonales.
Un "anticuerpo no marcado" se refiere a un anticuerpo que no está conjugado a una fracción heteróloga (por ejemplo, una fracción citotóxica) o a un radiomarcador. El anticuerpo no marcado puede estar presente en una formulación farmacéutica.
Los "anticuerpos naturales" se refieren a moléculas de inmunoglobulina de origen natural con diversas estructuras. Por ejemplo, los anticuerpos IgG naturales son glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 Dalton, compuestas por dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas que están unidas por enlaces disulfuro. Desde el extremo amino al extremo carboxilo, cada cadena pesada tiene una región variable (VH), también denominada dominio variable pesado o dominio variable de cadena pesada, seguida de tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3). Análogamente, desde el extremo amino al extremo carboxilo, cada cadena ligera tiene una región variable (VL), también denominada dominio variable ligero o dominio variable de cadena ligera, seguido por un dominio constante ligero (CL). La cadena ligera de un anticuerpo puede asignarse a uno de dos tipos, denominados kappa (kappa) y lambda (lambda), basándose en la secuencia de aminoácidos de su dominio constante.
El término "prospecto" se usa para referirse a las instrucciones habitualmente incluidas en los envases comerciales de productos terapéuticos, que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, terapia combinada, contraindicaciones y/o advertencias relativas al uso de dichos productos terapéuticos.
El "porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" respecto de la secuencia polipeptídica de referencia se define como el porcentaje de restos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los restos de aminoácidos en la secuencia polipeptídica de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia y sin considerar ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. La alineación para determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos puede realizarse de varias maneras que se encuentran dentro de las capacidades de la técnica, por ejemplo, usando programas informáticos, tales como BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNAS-AR), disponibles al público. Los expertos en la materia pueden determinar los parámetros adecuados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la alineación máxima a lo largo de la longitud completa de las secuencias que se estén comparando. Sin embargo, a efectos del presente documento, los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos se generan usando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 fue programado por Genentech, Inc. y el código fuente, junto con la documentación para usuarios, se han depositado en la oficina de derechos de autor de los Estados Unidos, Washington D.C., 20559, donde está registrada con el n.°de registro de derechos de autor de los Estados Unidos TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible al público en Genentech, Inc., South San Francisco, California o puede compilarse a partir del código fuente. El programa ALIGN-2 debe compilarse para su uso en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencia se establecen por el programa ALIGN-2 y no varían.
En situaciones en las que se emplea ALIGN-2 para establecer comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos A dada para, con o contra una secuencia de aminoácidos B dada (que puede citarse, como alternativa, como una secuencia de aminoácidos dada A que tiene o comprende un determinado % de identidad de secuencia de aminoácidos para, con o contra una secuencia de aminoácidos B dada) se calcula de la siguiente manera: 100 veces la fracción X/Y, donde X es el número de restos de aminoácidos puntuados como coincidencias idénticas por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en la alineación del programa de A y B y donde Y es el número total de restos de aminoácidos en B. Se apreciará que cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de A respecto de B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B respecto de A. A menos que se indique específicamente lo contrario, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usados en el presente documento se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente anterior usando el programa informático ALIGN-2.
La expresión "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que se encuentra en una forma tal que permite que sea eficaz la actividad biológica de un principio activo contenido en la misma y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se administraría la formulación.
Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente incluido en una formulación farmacéutica, distinto del principio activo, que no es tóxico para un sujeto, Un vehículo farmacéuticamente aceptable incluye un tampón, excipiente, estabilizante o conservante.
El término "C5", como se usa en el presente documento, abarca cualquier C5 natural de cualquier fuente de vertebrados, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, seres humanos y monos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). A menos que se indique lo contrario, el término "C5" se refiere a una proteína C5 humana que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 39 y que contiene la secuencia de la cadena beta mostrada en la SEQ ID NO: 40. El término abarca C5 sin procesar "de longitud completa", así como cualquier forma de C5 que sea el resultado de su procesamiento en la célula. El término también abarca variantes de C5 de origen natural, por ejemplo, variantes de corte y empalme o variantes alélicas. La secuencia de aminoácidos de una C5 humana ilustrativa se muestra en la SEQ ID NO: 39 (C5 de "tipo silvestre" o "TS"). La secuencia de aminoácidos de una cadena beta ilustrativa de C5 humana se muestra en la SEQ ID NO: 40. Las secuencias de aminoácidos de los dominios MG1, MG2 y MG1-MG2 ilustrativos de la cadena beta de C5 humana se muestran en las SEQ ID NO: 41, 42 y 43, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de C5 ilustrativas de mono cynomolgus y de murino, se muestran en las SEQ ID NO: 44 y 105, respectivamente. Los restos de aminoácidos 1-19 de las SEQ ID NO: 39, 40, 43, 44 y 105 corresponden a una secuencia señal que se elimina durante el procesamiento en la célula y, por tanto, falta en la secuencia de aminoácidos ilustrativa correspondiente.
Como se usa en el presente documento, "tratamiento" (y sus variaciones gramaticales, tales como "tratar" o "que trata") se refiere a la intervención clínica en un intento de alterar el curso natural del individuo que se esté tratando y puede realizarse tanto para la profilaxis como durante el curso de la patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen impedir la aparición o recurrencia de la enfermedad, el alivio de los síntomas, disminuir cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, impedir que se produzca metástasis, disminuir la velocidad de avance de la enfermedad, mejorar o paliar la patología y una remisión o un pronóstico mejorado. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención se usan para retrasar la aparición de una enfermedad o para ralentizar su avance.
La expresión "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que está implicada en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo natural tienen generalmente estructuras similares, comprendiendo cada dominio cuatro regiones marco (FR) y tres regiones hipervariables (HVR). (Véase, por ejemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, 6a ed., W.H. Freeman y Co., página 91 (2007).) Un solo dominio VH o VL puede ser suficiente para conferir especificidad de unión a antígeno. Asimismo, los anticuerpos que se unen a un antígeno en particular se pueden aislar utilizando un dominio VH o VL de un anticuerpo que se une al antígeno para explorar una biblioteca de dominios VL o VH complementarios, respectivamente. Véanse, por ejemplo, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).
El término "vector", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede propagar otro ácido nucleico al que está unido. El término incluye el vector en forma de una estructura de ácido nucleico autorreplicante, así como el vector incorporado en el genoma de una célula hospedadora en la que se ha introducido. Determinados vectores son capaces de dirigir la expresión de ácidos nucleicos a los que están operativamente unidos. En el presente documento dichos vectores se denominan "vectores de expresión".
II. COMPOSICIONES Y MÉTODOS
En un aspecto, la invención se basa, en parte, en anticuerpos anti-C5 y usos de los mismos. En determinadas realizaciones, se proporcionan anticuerpos que se unen a C5. Los anticuerpos de la invención son útiles, por ejemplo, para el diagnóstico o el tratamiento de una enfermedad.
A. Anticuerpos anti-C5 ilustrativos
En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos aislados que se unen a C5 como se define en las reivindicaciones adjuntas. En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-C5 se une a un epítopo dentro de la cadena beta de C5. En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-C5 se une a un epítopo dentro del dominio MG1-MG2 de la cadena beta de C5. En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-C5 de la presente invención se une a un epítopo dentro de un fragmento que consiste en los aminoácidos 19-180 de la cadena beta de C5. En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-C5 se une a un epítopo dentro del dominio MG1 (aminoácidos 20-124 de la SEQ ID NO: 40 (SEQ ID NO: 41)) de la cadena beta de C5. En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-C5 se une a un epítopo dentro de un fragmento que consiste en los aminoácidos 33-124 de la cadena beta de C5 (SEQ ID NO: 40). En otra realización, el anticuerpo no se une a un fragmento más corto que el fragmento que consiste en los aminoácidos 33­ 124 de la cadena beta de C5, por ejemplo, un fragmento que consiste en los aminoácidos 45-124, 52-124, 33-111, 33­ 108 o 45-111 de la cadena beta de C5 (SEQ ID NO: 40).
En otro aspecto, los anticuerpos anti-C5 de la presente invención presentan características de unión dependientes del pH. Como se usa en el presente documento, la expresión "unión dependiente del pH" significa que el anticuerpo presenta "unión a C5 reducida a pH ácido en comparación con su unión a pH neutro" (a efectos de la presente divulgación, ambas expresiones pueden usarse indistintamente). Por ejemplo, los anticuerpos "con características de unión dependientes del pH" incluyen anticuerpos que se unen a C5 con mayor afinidad a pH neutro que a pH ácido. En determinadas realizaciones, los anticuerpos de la presente invención se unen a C5 con al menos 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 o más veces mayor afinidad a pH neutro que a pH ácido. En algunas realizaciones, los anticuerpos se unen a C5 con mayor afinidad a pH 7,4 que a pH 5,8. En realizaciones adicionales, los anticuerpos de la presente invención se unen a C5 con al menos 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 o más veces mayor afinidad a pH 7,4 que a pH 5,8.
La "afinidad" de un anticuerpo por C5, a efectos de la presente divulgación, se expresa en términos de KD del anticuerpo. La KD de un anticuerpo se refiere a la constante de disociación en equilibrio de una interacción anticuerpoantígeno. Cuanto mayor sea el valor de KD para un anticuerpo que se une a su antígeno, más débil será su afinidad de unión por ese antígeno en particular. Por consiguiente, como se usa en el presente documento, la expresión "mayor afinidad a pH neutro que a pH ácido" (o la expresión equivalente "unión dependiente del pH") significa que la KD para la unión del anticuerpo a C5 a pH ácido es mayor que la KD para la unión del anticuerpo a C5 a pH neutro. Por ejemplo, en el contexto de la presente invención, se considera que un anticuerpo se une a C5 con mayor afinidad a pH neutro que a pH ácido si la Kd del anticuerpo que se une a C5 a pH ácido es al menos 2 veces mayor que la KD del anticuerpo que se une a C5 a pH neutro. Por tanto, la presente invención incluye anticuerpos que se unen a C5 a pH ácido con una KD que es al menos 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 o más veces mayor que la KD del anticuerpo que se une a C5 a pH neutro. En otra realización, el valor de KD del anticuerpo a pH neutro puede ser de 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 10-12 M o menor. En otra realización, el valor de KD del anticuerpo a pH ácido puede ser de 10-9 M, 10-8 M, 10-7 M, 10-6 M o mayor.
En realizaciones adicionales se considera que un anticuerpo se une a C5 con mayor afinidad a pH neutro que a pH ácido si la KD del anticuerpo que se une a C5 a pH 5,8 es al menos 2 veces mayor que la KD del anticuerpo que se une a C5 a pH 7,4. En algunas realizaciones, los anticuerpos proporcionados se unen a C5 a pH 5,8 con una KD que es al menos 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 o más veces mayor que la KD del anticuerpo que se une a C5 a pH 7,4. En otra realización, el valor de KD del anticuerpo a pH 7,4 puede ser de 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 10-12 M o menor. En otra realización, el valor de KD del anticuerpo a pH 5,8 puede ser de 10-9 M, 10-8 M, 10-7 M, 10-6 M, o mayor.
Las propiedades de unión de un anticuerpo para un antígeno en particular también pueden expresarse en términos de la kd del anticuerpo. La kd de un anticuerpo se refiere a la constante de velocidad de disociación del anticuerpo con respecto a un antígeno particular y se expresa en términos de segundos recíprocos (es decir, s-1). Un aumento en el valor de kd significa una unión más débil de un anticuerpo a su antígeno. Por tanto, la presente invención incluye anticuerpos que se unen a C5 con un valor kd más alto a pH ácido que a pH neutro. La presente invención incluye anticuerpos que se unen a C5 a pH ácido con una kd que es al menos 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 o más veces mayor que la kd del anticuerpo que se une a C5 a pH neutro. En otra realización, el valor de kd del anticuerpo a pH neutro puede ser de 10-21/s, Í0 '31/s, 10-41/s, 10-51/s, 10-61/s o menor. En otra realización, el valor de kd del anticuerpo a pH ácido puede ser de 10-31/s, 10-21/s, 10-1 1/s o mayor. La invención también incluye anticuerpos que se unen a C5 con un valor de kd más alto a pH 5,8 que a pH 7,4. La presente invención incluye anticuerpos que se unen a C5 a pH 5,8 con una kd de al menos 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 o más veces mayor que la kd del anticuerpo que se une a C5 a pH 7,4. En otra realización, el valor de kd del anticuerpo a pH 7,4 puede ser de 10-21/s, 10-31/s, 10-41/s, 10-51/s, 10-61/s o menor. En otra realización, el valor de kd del anticuerpo a pH 5,8 puede ser de 10-31/s, 10-21/s, 10-11/s, o mayor.
En determinados casos, una "unión a C5 reducida a pH ácido en comparación con su unión a pH neutro" se expresa en términos de la relación del valor de KD del anticuerpo que se une a C5 a pH ácido con respecto al valor de KD del anticuerpo que se une a C5 a pH neutro (o viceversa). Por ejemplo, se puede considerar que un anticuerpo presenta una "unión a C5 reducida a pH ácido en comparación con su unión a pH neutro", a efectos de la presente invención, si el anticuerpo presenta una relación de KD ácido/neutro de 2 o mayor. En determinadas realizaciones ilustrativas, la relación de KD pH 5,8/pH 7,4 de un anticuerpo de la presente invención es de 2 o mayor. En determinadas realizaciones ilustrativas, la relación de KD ácido/neutro de un anticuerpo de la presente invención puede ser de 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 o mayor. En otra realización, el valor de KD del anticuerpo a pH neutro puede ser de 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 10-12 M o menor. En otra realización, el valor de KD del anticuerpo a pH ácido puede ser de 10-9 M, 10-8 M, 10-7 M, 10-6 M o mayor. En otros casos, se puede considerar que un anticuerpo presenta una "unión a C5 reducida a pH ácido en comparación con su unión a pH neutro", a efectos de la presente invención, si el anticuerpo presenta una relación de KD pH 5,8/pH 7,4 de 2 o mayor. En determinadas realizaciones ilustrativas, la relación de KD pH 5,8/pH 7,4 de un anticuerpo de la presente invención puede ser de 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 o mayor. En otra realización, el valor de KD del anticuerpo a pH 7,4 puede ser de 10 7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 10-12 M o menor. En otra realización, el valor de KD del anticuerpo a pH 5,8 puede ser de 10-9 M, 10-8 M, 10-7 M, 10-6 M o mayor.
En determinados casos, una "unión a C5 reducida a pH ácido en comparación con su unión a pH neutro" se expresa en términos de la relación del valor de kd del anticuerpo que se une a C5 a pH ácido con respecto al valor de kd del anticuerpo que se une a C5 a pH neutro (o viceversa). Por ejemplo, se puede considerar que un anticuerpo presenta una "unión a C5 reducida a pH ácido en comparación con su unión a pH neutro", a efectos de la presente invención, si el anticuerpo presenta una relación de kd ácido/neutro de 2 o mayor. En determinadas realizaciones ilustrativas, la relación de kd pH 5,8/pH 7,4 de un anticuerpo de la presente invención es de 2 o mayor. En determinadas realizaciones ilustrativas, la relación de kd ácido/neutro de un anticuerpo de la presente invención puede ser de 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 o mayor. En realizaciones ilustrativas adicionales, la relación de kd pH 5,8/pH 7,4 para un anticuerpo de la presente invención puede ser de 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 o mayor. En otra realización, el valor de kd del anticuerpo a pH neutro puede ser de 10-21/s, 10-31/s, 10-41/s, 10-51/s, 10-61/s o menor. En una realización adicional, el valor de kd del anticuerpo a pH 7,4 puede ser de 10-21/s, 10-31/s, 10-41/s, 10-51/s, 10-61/s o menor. En otra realización, el valor de kd del anticuerpo a pH ácido puede ser de 10-31/s, 10-21/s, 10-11/s o mayor. En una realización adicional, el valor de kd del anticuerpo a pH 5,8 puede ser de 10-31/s, 10-21/s, 10-11/s o mayor.
Como se usa en el presente documento, la expresión "pH ácido" significa un pH de 4,0 a 6,5. La expresión "pH ácido" incluye valores de pH de uno cualquiera de 4,0, 4,1,4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4 y 6,5. En aspectos particulares, el "pH ácido" es de 5,8.
Como se usa en el presente documento, la expresión "pH neutro" significa un pH de 6,7 a aproximadamente 10,0. La expresión "pH neutro" incluye valores de pH de 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 y 10,0. En aspectos particulares, el "pH neutro" es de 7,4.
Los valores de KD y los de kd, como se expresan en el presente documento, pueden determinarse usando un biosensor basado en resonancia de plasmón superficial para caracterizar las interacciones anticuerpo-antígeno. (Véase, por ejemplo, el ejemplo 3 del presente documento). Los valores de KD y los valores de kd se pueden determinar a 25 °C o a 37 °C.
En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 de la presente invención se une a un epítopo dentro de la cadena beta de C5 que consiste en el dominio MG1 (SEQ ID NO: 41). En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 de la presente invención se une a un epítopo dentro de la cadena beta (SEQ ID NO: 40) de C5 que comprende al menos un fragmento seleccionado del grupo que consiste en los aminoácidos 47-57, 70-76 y 107-110. En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 de la presente invención se une a un epítopo dentro de un fragmento de la cadena beta (SEQ ID NO: 40) de C5 que comprende al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Thr47, Glu48, Ala49, Phe50, Asp51, Ala52, Thr53, Lys57, His70, Val71, His72, Ser74, Glu76, Val107, Ser108, Lys109 e His110. En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 de la presente invención se une a un epítopo dentro de un fragmento de la cadena beta (SEQ ID NO: 40) de C5 que comprende al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Glu48, Asp51, His70, His72, Lys109 e His110. En determinadas realizaciones, la unión de un anticuerpo anti-C5 de la presente invención a un mutante de C5 se reduce en comparación con su unión a C5 de tipo silvestre, en donde el mutante de C5 tiene al menos una sustitución de aminoácido en una posición seleccionada del grupo que consiste en Glu48, Asp51, His72 y Lys109. En otra realización, la unión dependiente del pH de un anticuerpo anti-C5 de la presente invención a un mutante de C5 se reduce en comparación con su unión dependiente del pH a C5 de tipo silvestre, en donde el mutante de C5 tiene al menos una sustitución de aminoácido en una posición seleccionada del grupo que consiste en His70, His72 e His110. En una realización adicional, un aminoácido en una posición seleccionada de Glu48, Asp51 y Lys109 se sustituye por alanina y un aminoácido en una posición seleccionada de His70, His72 e His110 se sustituye por tirosina en el mutante de C5.
En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 de la presente invención compite por la unión a C5 con un anticuerpo que comprende un par VH y VL seleccionado de: (a) un VH de SEQ ID NO: 1 y un VL de SEQ ID NO: 11; (b) un VH de SEQ ID NO: 5 y un VL de SEQ ID NO: 15; (c) un VH de SEQ ID NO: 4 y un VL de SEQ ID NO: 14; (d) un VH de SEQ ID NO: 6 y un VL de SEQ ID NO: 16; (e) un VH de SEQ ID NO: 2 y un VL de SEQ ID NO: 12; (f) un VH de SEQ ID NO: 3 y un VL de SEQ ID NO: 13; (g) un VH de SEQ ID NO: 9 y un VL de SEQ ID NO: 19; (h) un VH de SEQ ID NO: 7 y un VL de SEQ ID NO: 17; (i) un VH de SEQ ID NO: 8 y un VL de SEQ ID NO: 18; y (j) un VH de SEQ ID NO: 10 y un VL de SEQ ID NO: 20.
En determinadas realizaciones, que están presentes con fines ilustrativos únicamente, un anticuerpo anti-C5 de la presente divulgación se une a C5 y entra en contacto con el aminoácido Asp51 (D51) de la SEQ ID NO: 39. En realizaciones adicionales, un anticuerpo anti-C5 de la presente divulgación se une a C5 y entra en contacto con el aminoácido Lys109 (K109) de la SEQ ID NO: 39. En una realización adicional, un anticuerpo anti-C5 de la presente divulgación se une a C5 y entra en contacto con el aminoácido Asp51 (D51) y el aminoácido Lys109 (K109) de la SEQ ID NO: 39.
En determinadas realizaciones, que están presentes con fines ilustrativos únicamente, la unión de un anticuerpo anti-C5 de la presente divulgación a un mutante de C5 se reduce en comparación con su unión a C5 de tipo silvestre, en donde el mutante de C5 tiene una sustitución Glu48Ala (E48A) de la SEQ ID NO: 39. En otra realización, que está presente con fines ilustrativos únicamente, la unión dependiente del pH de un anticuerpo anti-C5 de la presente divulgación a un mutante de C5 se reduce en comparación con su unión dependiente del pH a C5 de tipo silvestre, en donde el mutante de C5 tiene una sustitución Glu48Ala (E48A) de la SEQ ID NO: 39.
En una realización adicional, que está presente con fines ilustrativos únicamente, un anticuerpo anti-C5 se une a una proteína C5 que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 39, pero no se une a una proteína C5 que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 39 con una sustitución H72Y, en donde la proteína C5 y la proteína C5 sustituida con H72Y se preparan y exploran en las mismas condiciones. En una realización adicional, el anticuerpo anti-C5 se une a una proteína C5 que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 39 a pH 7,4, pero no se une a la proteína C5 sustituida con H72Y a pH 7,4.
Sin limitarse a teoría concreta alguna, se puede especular que la unión de un anticuerpo anti-C5 a C5 se reduce (o casi se pierde) cuando un resto de aminoácido en C5 se sustituye por otro aminoácido, lo que significa que el resto de aminoácido en C5 es crítico para las interacciones entre el anticuerpo anti-C5 y C5, y que el anticuerpo puede reconocer un epítopo alrededor del resto de aminoácido en C5.
En la presente invención, se ha descubierto que un grupo de anticuerpos anti-C5 que compiten entre sí o que se unen al mismo epítopo, pueden presentar características de unión dependientes del pH. Entre los aminoácidos, la histidina, con un valor de pKa de aproximadamente 6,0 a 6,5, puede tener diferentes estados de disociación de protones entre pH neutro y ácido. Por lo tanto, un resto de histidina en C5 puede contribuir a las interacciones dependientes del pH entre un anticuerpo anti-C5 y C5. Sin limitarse a teoría concreta alguna, se puede especular que un anticuerpo anti-C5 puede reconocer una estructura conformacional alrededor de un resto de histidina en C5, que es variable dependiendo del pH. Esa especulación puede ser coherente con los resultados experimentales descritos a continuación: que la dependencia del pH de un anticuerpo anti-C5 se reduce (o casi se pierde) cuando un resto de histidina en C5 se sustituye por otro aminoácido (es decir, un anticuerpo anti-C5 con características de unión dependientes del pH se une a un mutante de histidina de C5 con afinidad similar al C5 de tipo silvestre a pH neutro, mientras que el mismo anticuerpo se une al mutante de histidina de C5 con mayor afinidad que la C5 de tipo silvestre a pH ácido).
En determinadas realizaciones, que están presentes con fines ilustrativos únicamente, un anticuerpo anti-C5 de la presente divulgación se une a C5 de más de una especie. En realizaciones adicionales, el anticuerpo anti-C5 se une a C5 de un animal humano y no humano. En realizaciones adicionales, el anticuerpo anti-C5 se une a C5 de seres humanos y monos (por ejemplo, cinomolgus, macaco rhesus, tití, chimpancé o babuino).
En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos anti-C5 que inhiben la activación de C5. En determinadas realizaciones, se proporcionan anticuerpos anti-C5 que impiden la escisión de C5 para formar C5a y C5b, impidiendo, de este modo, la generación de actividad anafiláctica asociada con C5a, además de impedir el ensamblaje del complejo de ataque a la membrana (MAC) C5b-9 asociado con C5b. En determinadas realizaciones, se proporcionan anticuerpos anti-C5 que bloquean la conversión de C5 en C5a y C5b por la convertasa C5. En determinadas realizaciones, se proporcionan anticuerpos anti-C5 que bloquean el acceso de la convertasa C5 al sitio de escisión en C5. En determinadas realizaciones, se proporcionan anticuerpos anti-C5 que bloquean la actividad hemolítica provocada por la activación de C5. En realizaciones adicionales, los anticuerpos anti-C5 de la presente invención inhiben la activación de C5 a través de la vía clásica y/o vía alternativa.
En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos anti-C5 que inhiben la activación de una variante de C5. Una variante de C5 significa una variante genética de C5 que se debe a una variación genética, tal como una mutación, un polimorfismo o una variación alélica. Una variación genética puede comprender una eliminación, sustitución o inserción de uno o más nucleótidos. Una variante de C5 puede comprender una o más variaciones genéticas en C5. En determinadas realizaciones, la variante de C5 tiene una actividad biológica similar a la de C5 de tipo silvestre. Dicha variante de C5 puede comprender al menos una variación seleccionada del grupo que consiste en V145I, R449G, V802I, R885H, R928Q, D966Y, S1310N y E1437D. En el presente documento, R885H, por ejemplo, significa una variación genética donde la arginina en la posición 885 se sustituye por histidina. En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 de la presente invención inhibe la activación tanto de C5 de tipo silvestre como de al menos una variante de C5 seleccionada del grupo que consiste en V145I, R449G, V802I, R885H, R928Q, D966Y, S1310N y E1437D.
Los siguientes aspectos/realizaciones divulgados en los párrafos [0098] a [0134] están presentes con fines ilustrativos únicamente.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-C5 que comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis regiones hipervariables (HVR) seleccionadas de (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 45-54; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 55-64; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 65-74; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 75-84; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 85­ 94; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 95-104.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias HVR de VH seleccionadas de (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 45-54; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 55-64; y (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 65-74. En una realización, el anticuerpo comprende una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 65-74. En otra realización, el anticuerpo comprende una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 65-74 y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 95-104. En una realización adicional, el anticuerpo comprende una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 65-74, una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 95-104, y una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 55-64. En una realización adicional, el anticuerpo comprende (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 45-54; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 55-64; y (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 65-74.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias HVR de VL seleccionadas de (a) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 75-84; (b) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 85-94; y (c) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 95-104. En una realización, el anticuerpo comprende (a) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 75-84; (b) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 85-94; y (c) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 95-104.
En otro aspecto, un anticuerpo de la invención comprende (a) un dominio VH que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias HVR de VH seleccionadas de (i) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 45-54, (ii) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 55-64, y (iii) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 65-74; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias HVR de VL seleccionadas de (i) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 75-84, (ii) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 85-94, y (c) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 95-104.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 45-54; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 55-64; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 65-74; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 75-84; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 85-94; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 95-104.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-C5 que comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR seleccionadas de (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 45, 54, 117, 126; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 55, 64, 118-120, 127; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 65, 74, 121, 128; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 75, 84, 122, 129; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 85, 94, 123-124, 130; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 95, 104, 125, 131.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias HVR de VH seleccionadas de (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 45, 54, 117, 126; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 55, 64, 118-120, 127; y (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 65, 74, 121, 128. En una realización, el anticuerpo comprende la HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 65, 74, 121, 128. En otra realización, el anticuerpo comprende una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 65, 74, 121, 128 y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 95, 104, 125, 131. En una realización adicional, el anticuerpo comprende una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 65, 74, 121, 128, una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 95, 104, 125, 131 y una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 55, 64, 118-120, 127. En una realización adicional, el anticuerpo comprende (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 45, 54, 117, 126; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 55, 64, 118-120, 127; y (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 65, 74, 121, 128.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias HVR de VL seleccionadas de (a) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 75, 84, 122, 129; (b) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 85, 94, 123-124, 130; y (c) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 95, 104, 125, 131. En una realización, el anticuerpo comprende (a) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 75, 84, 122, 129; (b) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 85, 94, 123-124, 130; y (c) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 95, 104, 125, 131.
En otro aspecto, un anticuerpo de la invención comprende (a) un dominio VH que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias HVR de VH seleccionadas de (i) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 45, 54, 117, 126, (ii) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 55, 64, 118-120, 127 y (iii) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 65, 74, 121, 128; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias HVR de VL seleccionadas de (i) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 75, 84, 122, 129, (ii) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 85, 94, 123-124, 130 y (c) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 95, 104, 125, 131.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 45, 54, 117, 126; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 55, 64, 118-120, 127; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 65, 74, 121, 128; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 75, 84, 122, 129; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 85, 94, 123-124, 130; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 95, 104, 125, 131.
En determinadas realizaciones, uno cualquiera o más aminoácidos de un anticuerpo anti-C5 como se proporciona anteriormente están sustituidos en las siguientes posiciones de HVR: (a) en HVR-H1 (SEQ ID NO: 45), en las posiciones 5 y 6; (b) en HVR-H2 (SEQ ID NO: 55), en las posiciones 1, 3, 9, 11, 13 y 15; (c) en HVR-H3 (SEQ ID NO: 65), en las posiciones 2, 5, 6, 12 y 13; (d) en HVR-L1 (SEQ ID NO: 75), en las posiciones 1, 5, 7 y 9; (e) en HVR-L2 (s Eq ID n O: 85), en las posiciones 4, 5 y 6; y (f) en h Vr -L3 (SEQ ID NO: 95), en las posiciones 2, 4 y 12.
En determinadas realizaciones, las sustituciones son sustituciones conservativas, como se proporciona en el presente documento. En determinadas realizaciones, se puede realizar una cualquiera o más de las siguientes sustituciones en cualquier combinación: (a) en HVR-H1 (SEQ ID NO: 45), M5V o C6A; (b) en HVR-H2 (SEQ ID NO: 55), CIA o G, Y3F, T9D o E, Y11K o Q, S13D o E o A15V; (c) en HVR-H3 (SEQ ID NO: 65), G2A, V5Q o D, T6Y, Y12H o L13Y; (d) en HVR-L1 (SEQ ID NO: 75), Q1R, N5Q o G, G7S, D9K o S; (e) en HVR-L2 (SEQ ID NO: 85), K4T o E, L5T o A6H, A6 E o A6Q; (f) en HVR-L3 (SEQ ID NO: 95) C2S, C2N o C2T, F4K; o A12T o A12H.
Todas las posibles combinaciones de las sustituciones anteriores están abarcadas por las secuencias consenso de las SEQ ID NO: 126, 127, 128, 129, 130 y 131 para HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3, respectivamente.
En cualquiera de las realizaciones anteriores, un anticuerpo anti-C5 está humanizado. En una realización, un anticuerpo anti-C5 comprende las HVR como en cualquiera de las realizaciones anteriores y además comprende un marco aceptor humano, por ejemplo, un marco de inmunoglobulina humano o un marco consenso humano. En otra realización, un anticuerpo anti-C5 comprende las HVR como en cualquiera de las realizaciones anteriores, y además comprende un VH o VL que comprende una secuencia de FR, en donde las secuencias de FR son las siguientes. Para el dominio variable de cadena pesada, la FR1 comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 132-134, la FR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 135­ 136, la FR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 137-139, la FR4 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 140-141. Para el dominio variable de cadena ligera, la FR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 142-143, la FR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 144-145, la FR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 146-147, FR4 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 148.
En otro aspecto, un anticuerpo anti-C5 comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada (VH) que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ NO: 1-10. En determinadas realizaciones, una secuencia VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad, contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas), inserciones o eliminaciones con respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-C5 que comprende esta secuencia conserva la capacidad de unirse a C5. En determinadas realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado y/o eliminado en una cualquiera de las SEQ ID NO: 1-10. En determinadas realizaciones, las sustituciones, inserciones o eliminaciones se producen fuera de las HVR (es decir, en los FR). Opcionalmente, el anticuerpo anti-C5 comprende la secuencia VH en una cualquiera de las SEQ ID NO: 1-10, incluyendo modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En una realización particular, el VH comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de: (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 45-54, (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 55-64, y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 65-74.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-C5, en donde el anticuerpo comprende un dominio variable de cadena ligera (VL) que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ NO: 11-20. En determinadas realizaciones, una secuencia VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad, contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas), inserciones o eliminaciones con respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-C5 que comprende esta secuencia conserva la capacidad de unirse a C5. En determinadas realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado y/o eliminado en una cualquiera de las SEQ ID NO: 11-20. En determinadas realizaciones, las sustituciones, inserciones o eliminaciones se producen fuera de las HVR (es decir, en los FR). Opcionalmente, el anticuerpo anti-C5 comprende la secuencia VL en una cualquiera de las SEQ ID NO: 11-20, incluyendo modificaciones posteriores a la traducción de esta secuencia. En una realización particular, el VL comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 75-84; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 85-94; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 95-104.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-C5, en donde el anticuerpo comprende un VH como en cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente y un VL como en cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente. En una realización, el anticuerpo comprende las secuencias VH y VL en una cualquiera de las SEQ ID NO: 1-10 y una cualquiera de las SEQ ID NO: 11-20, respectivamente, incluyendo modificaciones posteriores a la traducción de dichas secuencias.
En otro aspecto, un anticuerpo anti-C5 comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada (VH) que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ NO: 10, 106-110. En determinadas realizaciones, una secuencia VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad, contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas), inserciones o eliminaciones con respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-C5 que comprende esta secuencia conserva la capacidad de unirse a C5. En determinadas realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado y/o eliminado en una cualquiera de las SEQ ID NO: 10, 106-110. En determinadas realizaciones, las sustituciones, inserciones o eliminaciones se producen fuera de las HVR (es decir, en los FR). Opcionalmente, el anticuerpo anti-C5 comprende la secuencia VH en una cualquiera de las SEQ ID NO: 10, 106-110, incluyendo modificaciones posteriores a la traducción de esta secuencia. En una realización particular, el VH comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 45, 54, 117, 126, (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 55, 64, 118-120, 127 y (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 65, 74, 121, 128.
En otro aspecto, un anticuerpo anti-C5 comprende una secuencia VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ NO: 10, 106-110. En determinadas realizaciones, una secuencia VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad, contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas), inserciones o eliminaciones con respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-C5 que comprende esta secuencia conserva la capacidad de unirse a C5. En determinadas realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado y/o eliminado en una cualquiera de las SEQ ID NO: 10, 106-110. En determinadas realizaciones, las sustituciones, inserciones o eliminaciones se producen fuera de las HVR (es decir, en los FR). Opcionalmente, el anticuerpo anti-C5 comprende la secuencia VH en una cualquiera de las SEQ ID NO: 10, 106-110, incluyendo modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En una realización particular, el VH comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 45, 54, 117, 126, (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 55, 64, 118-120, 127 y (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 65, 74, 121, 128.
En otro aspecto, un anticuerpo anti-C5 comprende una secuencia VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10. En determinadas realizaciones, la secuencia VH es la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10. En determinadas realizaciones, una secuencia VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad, contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas), inserciones o eliminaciones con respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-C5 que comprende esta secuencia conserva la capacidad de unirse a C5. En determinadas realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado y/o eliminado en la SEQ ID NO: 10. En determinadas realizaciones, las sustituciones, inserciones o eliminaciones se producen fuera de las HVR (es decir, en los FR). Opcionalmente, el anticuerpo anti-C5 comprende la secuencia VH en la SEQ ID NO: 10 que incluye modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En una realización particular, el VH comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 54, (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 64 y (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 74.
En otro aspecto, un anticuerpo anti-C5 comprende una secuencia VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 106. En determinadas realizaciones, la secuencia VH es la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 106. En determinadas realizaciones, una secuencia VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad, contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas), inserciones o eliminaciones con respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-C5 que comprende esta secuencia conserva la capacidad de unirse a C5. En determinadas realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado y/o eliminado en la SEQ ID NO: 106. En determinadas realizaciones, las sustituciones, inserciones o eliminaciones se producen fuera de las HVR (es decir, en los FR). Opcionalmente, el anticuerpo anti-C5 comprende la secuencia VH en la SEQ ID NO: 106, incluyendo modificaciones posteriores a la traducción de esta secuencia. En una realización particular, el VH comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 117, (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 118 y (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 121.
En otro aspecto, un anticuerpo anti-C5 comprende una secuencia VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 107. En determinadas realizaciones, la secuencia VH es la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 107. En determinadas realizaciones, una secuencia VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad, contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas), inserciones o eliminaciones con respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-C5 que comprende esta secuencia conserva la capacidad de unirse a C5. En determinadas realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado y/o eliminado en la SEQ ID NO: 107. En determinadas realizaciones, las sustituciones, inserciones o eliminaciones se producen fuera de las HVR (es decir, en los FR). Opcionalmente, el anticuerpo anti-C5 comprende la secuencia VH en la SEQ ID NO: 107, incluyendo modificaciones posteriores a la traducción de esta secuencia. En una realización particular, el VH comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la s Eq ID NO: 117 (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 119, y (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 121.
En otro aspecto, un anticuerpo anti-C5 comprende una secuencia VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 108. En determinadas realizaciones, la secuencia VH es la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 108. En determinadas realizaciones, una secuencia VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad, contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas), inserciones o eliminaciones con respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-C5 que comprende esta secuencia conserva la capacidad de unirse a C5. En determinadas realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado y/o eliminado en la SEQ ID NO: 108. En determinadas realizaciones, las sustituciones, inserciones o eliminaciones se producen fuera de las HVR (es decir, en los FR). Opcionalmente, el anticuerpo anti-C5 comprende la secuencia VH en la SEQ ID NO: 108, incluyendo modificaciones posteriores a la traducción de esta secuencia. En una realización particular, el VH comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la s Eq ID NO: 117 (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 118, y (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 121.
En otro aspecto, un anticuerpo anti-C5 comprende una secuencia VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 109. En determinadas realizaciones, la secuencia VH es la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 109. En determinadas realizaciones, una secuencia VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad, contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas), inserciones o eliminaciones con respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-C5 que comprende esta secuencia conserva la capacidad de unirse a C5. En determinadas realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado y/o eliminado en la SEQ ID NO: 109. En determinadas realizaciones, las sustituciones, inserciones o eliminaciones se producen fuera de las HVR (es decir, en los FR). Opcionalmente, el anticuerpo anti-C5 comprende la secuencia VH en la SEQ ID NO: 109, incluyendo modificaciones posteriores a la traducción de esta secuencia. En una realización particular, el VH comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la s Eq ID NO: 117 (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 118, y (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 121.
En otro aspecto, un anticuerpo anti-C5 comprende una secuencia VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 110. En determinadas realizaciones, la secuencia VH es la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 110. En determinadas realizaciones, una secuencia VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad, contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas), inserciones o eliminaciones con respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-C5 que comprende esta secuencia conserva la capacidad de unirse a C5. En determinadas realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado y/o eliminado en la SEQ ID NO: 110. En determinadas realizaciones, las sustituciones, inserciones o eliminaciones se producen fuera de las HVR (es decir, en los FR). Opcionalmente, el anticuerpo anti-C5 comprende la secuencia VH en la SEQ ID NO: 110, incluyendo modificaciones posteriores a la traducción de esta secuencia. En una realización particular, el VH comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la s Eq ID NO: 117 (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 120, y (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 121.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-C5, en donde el anticuerpo comprende un dominio variable de cadena ligera (VL) que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ NO: 20, 111-113. En determinadas realizaciones, una secuencia VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad, contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas), inserciones o eliminaciones con respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-C5 que comprende esta secuencia conserva la capacidad de unirse a C5. En determinadas realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado y/o eliminado en una cualquiera de las SEQ ID NO: 20, 111-113. En determinadas realizaciones, las sustituciones, inserciones o eliminaciones se producen fuera de las HVR (es decir, en los FR). Opcionalmente, el anticuerpo anti-C5 comprende la secuencia Vl en una cualquiera de las SEQ ID NO: 20, 111-113, incluyendo modificaciones posteriores a la traducción de esta secuencia. En una realización particular, el VL comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de (a) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 75, 84, 122, 129; (b) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 85, 94, 123-124, 130; y (c) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 95, 104, 125, 131.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-C5, en donde el anticuerpo comprende un VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20. En determinadas realizaciones, la secuencia VL es la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20. En determinadas realizaciones, una secuencia VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad, contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas), inserciones o eliminaciones con respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-C5 que comprende esta secuencia conserva la capacidad de unirse a C5. En determinadas realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado y/o eliminado en la SEQ ID NO: 20. En determinadas realizaciones, las sustituciones, inserciones o eliminaciones se producen fuera de las HVR (es decir, en los FR). Opcionalmente, el anticuerpo anti-C5 comprende la secuencia VL en la SEQ ID NO: 20, incluyendo modificaciones posteriores a la traducción de esta secuencia. En una realización particular, el VL comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de (a) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 84; (b) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 94; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 104.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-C5, en donde el anticuerpo comprende un VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 111. En determinadas realizaciones, la secuencia VL es la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 111. En determinadas realizaciones, una secuencia VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad, contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas), inserciones o eliminaciones con respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-C5 que comprende esta secuencia conserva la capacidad de unirse a C5. En determinadas realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado y/o eliminado en la SEQ ID NO: 111. En determinadas realizaciones, las sustituciones, inserciones o eliminaciones se producen fuera de las HVR (es decir, en los FR). Opcionalmente, el anticuerpo anti-C5 comprende la secuencia VL en la SEQ ID NO: 111, incluyendo modificaciones posteriores a la traducción de esta secuencia. En una realización particular, el VL comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de (a) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 122; (b) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 123; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 125.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-C5, en donde el anticuerpo comprende un VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 112. En determinadas realizaciones, la secuencia VL es la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 112. En determinadas realizaciones, una secuencia VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad, contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas), inserciones o eliminaciones con respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-C5 que comprende esta secuencia conserva la capacidad de unirse a C5. En determinadas realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado y/o eliminado en la SEQ ID NO: 112. En determinadas realizaciones, las sustituciones, inserciones o eliminaciones se producen fuera de las HVR (es decir, en los FR). Opcionalmente, el anticuerpo anti-C5 comprende la secuencia VL en la SEQ ID NO: 112, incluyendo modificaciones posteriores a la traducción de esta secuencia. En una realización particular, el VL comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de (a) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 122; (b) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 123; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 125.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-C5, en donde el anticuerpo comprende un VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 113. En determinadas realizaciones, la secuencia VL es la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 113. En determinadas realizaciones, una secuencia VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad, contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas), inserciones o eliminaciones con respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-C5 que comprende esta secuencia conserva la capacidad de unirse a C5. En determinadas realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado y/o eliminado en la SEQ ID NO: 113. En determinadas realizaciones, las sustituciones, inserciones o eliminaciones se producen fuera de las HVR (es decir, en los FR). Opcionalmente, el anticuerpo anti-C5 comprende la secuencia VL en la SEQ ID NO: 113, incluyendo modificaciones posteriores a la traducción de esta secuencia. En una realización particular, el VL comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de (a) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 122; (b) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 124; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 125.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-C5 en donde el anticuerpo comprende un VH como en cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente y un VL como en cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente. En una realización, el anticuerpo comprende las secuencias VH y VL en una cualquiera de las SEQ ID NO: 10, 106-110 y una cualquiera de las SEQ ID NO: 20, 111-113, respectivamente, incluyendo modificaciones posteriores a la traducción de dichas secuencias. En una realización, el anticuerpo comprende una secuencia VH de SEQ ID NO: 10 y una secuencia VL de SEQ ID NO: 20. En una realización, el anticuerpo comprende una secuencia VH de SEQ ID NO: 106 y una secuencia VL de SEQ ID NO: 111. En otra realización, el anticuerpo comprende una secuencia VH de SEQ ID NO: 107 y una secuencia VL de SEQ ID NO: 111. En una realización adicional, el anticuerpo comprende una secuencia VH de SEQ ID NO: 108 y una secuencia VL de SEQ ID NO: 111. En otra realización, el anticuerpo comprende una secuencia VH de SEQ ID NO: 109 y una secuencia VL de SEQ ID NO: 111. En otra realización, el anticuerpo comprende una secuencia VH de SEQ ID NO: 109 y una secuencia VL de SEQ ID NO: 112. En otra realización, el anticuerpo comprende una secuencia VH de SEQ ID NO: 109 y una secuencia VL de SEQ ID NO: 113. En otra realización, el anticuerpo comprende una secuencia VH de SEQ ID NO: 110 y una secuencia VL de SEQ ID NO: 113.
En un aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-C5 en donde el anticuerpo comprende una secuencia VH que contiene (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 54, (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 64, y (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 74, y una secuencia VL que contiene (a) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 84; (b) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 94; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 104.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-C5 en donde el anticuerpo comprende una secuencia VH que contiene (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 117, (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 118, y (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 121, y una secuencia VL que contiene (a) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 122; (b) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 123; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 125.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-C5 en donde el anticuerpo comprende una secuencia VH que contiene (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 117, (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 119, y (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 121, y una secuencia VL que contiene (a) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 122; (b) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 123; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 125.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-C5 en donde el anticuerpo comprende una secuencia VH que contiene (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 117, (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 118, y (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 121, y una secuencia VL que contiene (a) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 122; (b) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 124; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 125.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-C5 en donde el anticuerpo comprende una secuencia VH que contiene (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 117, (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 120, y (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 121, y una secuencia VL que contiene (a) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 122; (b) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 124; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 125.
En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 de la presente invención comprende un VH como en una cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente y una región constante de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 33, 34, 35, 114, 115 y 116. En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 de la presente invención comprende un VL como en una cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente y una región constante de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 36, 37 y 38.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-C5 proporcionado en el presente documento. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, se proporciona un anticuerpo que se une al mismo epítopo que un anticuerpo descrito en la tabla 2. Como lo demuestran los ejemplos de trabajo a continuación, todos los anticuerpos anti-C5 descritos en la tabla 2 se agrupan en el mismo grupo de epítopos de C5 y presentan características de unión dependientes del pH.
En un aspecto adicional, la invención proporciona un anticuerpo que se une al mismo epítopo que un anticuerpo proporcionado en el presente documento. En un aspecto adicional, la invención proporciona un anticuerpo que se une al mismo epítopo que un anticuerpo descrito en las tablas 7 u 8. En determinadas realizaciones, se proporciona un anticuerpo que se une a un epítopo dentro de un fragmento que consiste en los aminoácidos 33-124 de la cadena beta de C5 (SEQ ID NO: 40). En determinadas realizaciones, se proporciona un anticuerpo que se une a un epítopo dentro de la cadena beta de C5 (SEQ ID NO: 40) que comprende al menos un fragmento seleccionado del grupo que consiste en los aminoácidos 47-57, 70-76 y 107-110. En determinadas realizaciones, se proporciona un anticuerpo que se une a un epítopo dentro de un fragmento de la cadena beta de C5 (SEQ ID NO: 40) que comprende al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Thr47, Glu48, Ala49, Phe50, Asp51, Ala52, Thr53, Lys57, His70, Val71, His72, Ser74, Glu76, Val107, Ser108, Lys109 e His110. En otra realización, un epítopo de un anticuerpo anti-C5 de la presente invención es un epítopo conformacional.
En un aspecto adicional de la invención, un anticuerpo anti-C5 de acuerdo con cualquiera de las anteriores realizaciones es un anticuerpo monoclonal, incluyendo un anticuerpo quimérico, humanizado o humano. En una realización, un anticuerpo anti-C5 es un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, un fragmento Fv, Fab, Fab', scFv, diacuerpo o F(ab')2. En otra realización, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa, por ejemplo, un anticuerpo de IgG1 o IgG4 inalterado u otra clase o isotipo de anticuerpo como se define en el presente documento.
En un aspecto adicional, un anticuerpo anti-C5 de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, que no están de acuerdo con la invención y están presentes con fines ilustrativos únicamente, puede incorporar cualquiera de las características, por separado o en combinación, como se describe en las secciones 1-7 a continuación:
1. Afinidad del anticuerpo
En determinadas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente documento tiene una constante de disociación (Kd) de < 1 pM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM o < 0,001 nM (por ejemplo, 10'8 M o menor, por ejemplo, de 10'8 M a 10'13 M, por ejemplo, de 10'9 M a 10'13 M).
En una realización, la Kd se mide mediante un ensayo de unión a antígeno radiomarcado (RIA). En una realización, se lleva a cabo un RIA con la versión Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno. Por ejemplo, la afinidad de unión en solución de los Fab por el antígeno se mide equilibrando Fab con una concentración mínima de antígeno marcado con (125l) en presencia de una serie de titulación de antígeno no marcado, capturando después el antígeno unido con una placa recubierta con anticuerpo anti-Fab (véase, por ejemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)). Para establecer las condiciones del ensayo, placas multipocillo MICROTITER(marca registrada) (Thermo Scientific) se recubren durante una noche con 5 pg/ml de un anticuerpo de captura anti-Fab (Cappel Labs) en carbonato de sodio 50 mM (pH 9,6) y posteriormente se bloquean con seroalbúmina bovina al 2 % (p/v) en PBS durante dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C). En una placa no adsorbente (Número de catálogo 269620), se mezclan [125l]-antígeno 100 pM o 26 pM con diluciones en serie de un Fab de interés (por ejemplo, coherente con la evaluación del anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)). Después, el Fab de interés se incuba durante una noche; sin embargo, la incubación puede continuar durante un periodo más largo (por ejemplo, aproximadamente 65 horas) para garantizar que se alcanza el equilibrio. Posteriormente, las mezclas se transfieren a la placa de captura para incubación a temperatura ambiente (por ejemplo, durante una hora). Después, la solución se retira y la placa se lava ocho veces con polisorbato 20 al 0,1 % (TWEEN-20 (marca registrada)) en PBS. Cuando las placas se han secado, se añaden 150 pl/pocillo de centelleante (MICROSCINT-20™; Packard) y se cuentan las placas en un contador gamma TOPCOUNT™ (Packard) durante diez minutos. Se eligen las concentraciones de cada Fab que proporcionan menos de o igual al 20 % de la unión máxima para su uso en ensayos de unión competitiva.
De acuerdo con otra realización, la Kd se mide usando un ensayo de resonancia de plasmón superficial BIACORE (marca registrada). Por ejemplo, un ensayo utilizando BIACORE (marca registrada)-2000 o BIACORE (marca registrada -3000 (BIACORE (marca registrada), Inc., Piscataway, NJ) se lleva a cabo a 25 °C con placas CM5 de antígeno inmovilizado a ~10 unidades de respuesta (UR). En una realización, las placas biosensoras de dextrano carboximetilado (CM5, BIACORE (marca registrada), Inc.) se activan con clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se diluye el antígeno con acetato de sodio 10 mM, pH 4,8, a 5 pg/ml (~0,2 pM) antes de la inyección a un caudal de 5 micro 1/minuto para conseguir aproximadamente 10 unidades de respuesta (UR) de proteína acoplada. Después de la inyección del antígeno, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos que no han reaccionado. Para las mediciones de cinética, se inyectan diluciones en serie de factor dos de Fab (0,78 nM a 500 nM) en PBS con tensioactivo de polisorbato 20 (TWEEN-20™) al 0,05 % (PBST) a 25 °C a un caudal de aproximadamente 25 micro 1/min. Las velocidades de asociación (kon) y las velocidades de disociación (koff) se calculan usando un modelo de unión de Langmuir de uno a uno (programa informático de evaluación BIACORE (marca registrada), versión 3.2) ajustando simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. La constante de disociación en equilibrio (Kd) se calcula como la relación koff/kon. Véase, por ejemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999). Si la velocidad de asociación supera 106M 'V mediante el ensayo de resonancia de plasmón superficial anterior, la velocidad de asociación puede determinarse usando una técnica de inactivación fluorescente que mide el aumento o la reducción de la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, paso de banda 16 nm) a 25 °C de un anticuerpo antiantigénico 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno medidas en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con detención de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-AMINCO™ serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada.
2. Fragmentos de anticuerpo
En determinadas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un fragmento de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv y scFv y otros fragmentos descritos más adelante. Para una revisión de determinados fragmentos de anticuerpo, véase Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003). Para una revisión de fragmentos scFv, véase, por ejemplo, Pluckthun, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., (Springer-Verlag, Nueva York), págs. 269-315 (1994); véase también el documento WO 93/16185; y las patentes de los Estados Unidos n.° 5.571.894 y 5.587.458. Para un análisis de los fragmentos Fab y F(ab')2 que comprenden restos de epítopo de unión a receptor de rescate y que tienen semivida in vivo aumentada, véase la patente de los Estados Unidos n.° 5.869.046.
Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno que pueden ser bivalentes o biespecíficos. Véanse, por ejemplo, los documentos EP 404097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993). Los triacuerpos y tetracuerpos también se describen en Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003).
Los anticuerpos de un solo dominio son fragmentos de anticuerpo que comprenden la totalidad o una porción del dominio variable de cadena pesada o la totalidad o una porción del dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo. En determinadas realizaciones, un anticuerpo de un solo dominio es un anticuerpo de un solo dominio humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos n.° 6.248.516).
Los fragmentos de anticuerpo se pueden preparar mediante diversas técnicas, incluyendo digestión proteolítica de un anticuerpo inalterado, así como la producción por células hospedadoras recombinantes (por ejemplo, E. coli o fago), como se describe en el presente documento.
3. Anticuerpos quiméricos y humanizados
En determinadas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo quimérico. Se describen ciertos anticuerpos quiméricos, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos n.° 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)). En un ejemplo, un anticuerpo quimérico comprende una región variable no humana (por ejemplo, una región variable procedente de un ratón, rata, hámster, conejo o primate no humano, tal como un mono) y una región constante humana. En un ejemplo adicional, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo "con la clase cambiada" en el que se ha cambiado la clase o subclase con respecto a la del anticuerpo precursor. Los anticuerpos quiméricos incluyen fragmentos de unión a antígeno de los mismos.
En determinadas realizaciones, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo humanizado. Normalmente, un anticuerpo no humano se humaniza para reducir la inmunogenicidad para seres humanos, a la vez que se conserva la especificidad y la afinidad del anticuerpo no humano precursor. Generalmente, un anticuerpo humanizado comprende uno o más dominios variables en los que las HVR, por ejemplo, las CDR, (o porciones de las mismas) proceden de un anticuerpo no humano y las FR (o porciones de las mismas) proceden de secuencias de anticuerpos humanos. Un anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una porción de una región constante humana. En algunas realizaciones, se sustituyen algunos restos de FR en un anticuerpo humanizado por restos correspondientes de un anticuerpo no humano (por ejemplo, el anticuerpo del que derivan los restos de la HVR), por ejemplo, para restaurar o mejorar la especificidad o afinidad del anticuerpo.
Los anticuerpos humanizados y los métodos para producirlos se revisan, por ejemplo, en Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008) y se describen adicionalmente, por ejemplo, en Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); patentes de los Estados Unidos n.° 5.821.337, 7.527.791, 6.982.321 y 7.087.409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (que describen el injerto de regiones determinantes de la especificidad (SDR, por las siglas del inglés)); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (que describe la "modificación de la superficie"); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (que describen el "reordenamiento de FR"); y Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) y Klimka et al., Br. J. Cancer 83:252-260 (2000) (que describen el enfoque de "selección guiada" para el reordenamiento de FR).
Las regiones marco humanas que pueden usarse para la humanización incluyen regiones marco seleccionadas usando el método de "mejor ajuste" (véase, por ejemplo, Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993)); regiones marco procedentes de la secuencia consenso de anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de cadena ligera o pesada (véanse, por ejemplo, Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992); y Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)); regiones marco humanas maduras (mutadas somáticamente) o regiones marco de línea germinal humana (véase, por ejemplo, Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); y regiones marco procedentes de la exploración de bibliotecas de FR (véanse, por ejemplo, Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) y Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)).
4. Anticuerpos humanos
En determinadas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo humano. Los anticuerpos humanos se pueden preparar usando varias técnicas conocidas en la materia. Se describen anticuerpos humanos, de manera general, en van Dijk y van de Winkel, Curr. Opin. Pharma. 5:368-74 (2001) y en Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008).
Pueden prepararse anticuerpos humanos administrando un inmunógeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir anticuerpos humanos inalterados o anticuerpos inalterados con regiones variables humanas en respuesta a la exposición a antígenos. Dichos animales normalmente contienen la totalidad o una porción de los locus de inmunoglobulina humanos, que sustituyen los locus endógenos de inmunoglobulina, o que están presentes extracromosómicamente o integrados de forma aleatoria en los cromosomas de los animales. En dichos ratones transgénicos, generalmente se han inactivado los locus de inmunoglobulina endógenos. Para una revisión de los métodos para obtener anticuerpos humanos procedentes de animales transgénicos, véase Lonberg, Nat. Biotech.
23:1117-1125 (2005). Véanse también, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos n.° 6.075.181 y 6.150.584, que describen la tecnología XENOMOUSE™; la patente de los Estados Unidos n.° 5.770.429 que describe la tecnología HUMAB (MARCA REGISTRADA); la patente de los Estados Unidos n.° 7.041.870 que describe la tecnología KM MOUSE (marca registrada), y la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos n.° US 2007/0061900, que describe la tecnología Ve Lo CI-MOUSE (MARCA REGISTRADA)). Las regiones variables humanas procedentes de anticuerpos inalterados generados por dichos animales pueden modificarse, además, por ejemplo, por combinación con una región constante humana diferente.
También pueden prepararse anticuerpos humanos mediante métodos basados en hibridoma. Se han descrito líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos. (Véanse, por ejemplo, Kozbor, J. Immunol. 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 51-63 (Dekker, Inc., Nueva York (1987); y Boerner et al., J. Immunol. 147:86 (1991).) También se describen anticuerpos humanos generados mediante la tecnología de hibridoma de linfocitos B humanos en Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:3557-3562 (2006). Los métodos adicionales incluyen los descritos, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos n.° 7.189.826 (que describe la producción de anticuerpos IgM humanos monoclonales de líneas celulares de hibridoma) y Ni, Xiandai Mianyixue 26(4):265-268 (2006) (que describen hibridomas de humano-humano). La tecnología de hibridoma humano (tecnología de Trioma) también se describe en Vollmers, Histology and Histopathology 20(3):927-937 (2005) y en Vollmers, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27(3): 185-191 (2005).
También pueden generarse anticuerpos humanos aislando secuencias de dominio variable de clon de Fv seleccionadas entre bibliotecas de presentación en fagos de origen humano. Posteriormente, pueden combinarse dichas secuencias de dominio variable con un dominio constante humano deseado. Más adelante se describen técnicas para seleccionar anticuerpos humanos de bibliotecas de anticuerpos.
5. Anticuerpos derivados de bibliotecas
Los anticuerpos de la invención pueden aislarse explorando bibliotecas combinatorias con respecto a anticuerpos con la actividad o actividades deseadas. Por ejemplo, en la técnica se conocen diversos métodos para generar bibliotecas de presentación en fagos y para explorar dichas bibliotecas con respecto a anticuerpos que poseen las características de unión deseadas. Dichos métodos se revisan, por ejemplo, en Hoogenboom et al., Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) y se describen adicionalmente, por ejemplo, en McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991); Marks etal., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1992); Marks, Meth.Mol. Biol. 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol.
338(2):299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004).
En determinados métodos de presentación en fagos, se clonan por separado repertorios de genes de VH y VL mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se recombinan aleatoriamente en fagotecas, que posteriormente pueden someterse a exploración con respecto a fagos de unión a antígeno como se describe en Winter et al., Ann. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994). Los fagos normalmente presentan fragmentos de anticuerpo, ya sea en forma de fragmentos Fv monocatenarios (scFv) o en forma de fragmentos Fab. Las bibliotecas de fuentes inmunizadas proporcionan anticuerpos de alta afinidad para el inmunógeno sin necesidad de construir hibridomas. Como alternativa, el repertorio sin exposición previa se puede clonar (por ejemplo, a partir de un ser humano) para proporcionar una única fuente de anticuerpos contra una amplia gama de antígenos no propios y también propios sin ninguna inmunización como se describe en Griffiths et al., EMBO J, 12:725-734 (1993). Finalmente, también pueden producirse sintéticamente bibliotecas sin exposición previa clonando segmentos génicos V no reordenados de células madre y usando cebadores para PCR que contienen secuencias aleatorias para codificar las regiones CDR3 sumamente variables y para lograr el reordenamiento in vitro, como lo describe Hoogenboom, J. Mol. Biol. 227:381-388 (1992). Las publicaciones de patente que describen fagotecas de anticuerpos humanos incluyen, por ejemplo: la patente de los Estados Unidos n.° 5.750.373 y las publicaciones de patente de los Estados Unidos n.° 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 y 2009/0002360.
En el presente documento, se considera que los anticuerpos o los fragmentos de anticuerpos aislados de bibliotecas de anticuerpos humanos, son anticuerpos humanos o fragmentos de anticuerpos humanos.
6. Anticuerpos multiespecíficos
En determinadas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo multiespecífico, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos multiespecíficos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión por al menos dos sitios diferentes. En determinadas realizaciones, una de las especificidades de unión es por C5 y la otra es por cualquier otro antígeno. En determinadas realizaciones, los anticuerpos biespecíficos se pueden unir a dos epítopos diferentes de C5. También se pueden usar anticuerpos biespecíficos para localizar agentes citotóxicos en células que expresan C5. Se pueden preparar anticuerpos biespecíficos como anticuerpos de longitud completa o como fragmentos de anticuerpo.
Las técnicas para preparar anticuerpos multiespecíficos incluyen la coexpresión recombinante de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina que tienen diferentes especificidades (véase Milstein y Cuello, Nature 305:537(1983)), el documento WO 93/08829 y Traunecker et al., EMBO J. 10:3655 (1991)), y la modificación por ingeniería de "botón en ojal" (véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos n.° 5.731.168). También pueden producirse anticuerpos multiespecíficos diseñando efectos de direccionamiento electrostático para producir moléculas heterodiméricas de Fc de anticuerpo (documento WO 2009/089004A1); reticulando dos o más anticuerpos o fragmentos (véanse, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos n.° 4.676.980 y Brennan et al., Science 229:81 (1985)); usando cremalleras de leucina para producir anticuerpos biespecíficos (véase, por ejemplo, Kostelny et al., J. Immunol. 148(5): 1547-1553 (1992)); usando la tecnología de "diacuerpo" para producir fragmentos de anticuerpo biespecíficos (véase, por ejemplo, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)); y el uso de dímeros de Fv monocatenario (scFv) (véase, por ejemplo, Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)); y preparando anticuerpos triespecíficos, como se describe, por ejemplo, en Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991).
Los anticuerpos genomodificados con tres o más sitios de unión a antígeno funcionales, que incluyen los "anticuerpos Octopus", también se incluyen en el presente documento (véase, por ejemplo, el documento US 2006/0025576).
El anticuerpo o fragmento del presente documento también incluye un "Fab de acción dual" o "DAF" (por sus siglas en inglés) que comprende un sitio de unión a antígeno que se une a C5, así como a otro antígeno diferente (véase, por ejemplo, el documento US 2008/0069820).
7. Variantes de anticuerpos
En determinadas realizaciones, se contemplan variantes de secuencias de aminoácidos de los anticuerpos proporcionados en el presente documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Pueden prepararse variantes de secuencias de aminoácidos de un anticuerpo introduciendo modificaciones adecuadas en la secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo o mediante síntesis peptídica. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, eliminaciones de y/o inserciones en y/o sustituciones de restos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Puede prepararse cualquier combinación de eliminación, inserción y sustitución para obtener la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas, por ejemplo, unión a antígeno.
a. Variantes de sustitución, inserción y eliminación
En determinadas realizaciones, se proporcionan variantes de anticuerpo que tienen una o más sustituciones de aminoácidos. Los sitios de interés para la mutagénesis de sustitución incluyen las HVR y las FR. En la tabla 1 se muestran sustituciones conservativas bajo el encabezado de "sustituciones preferidas". En la tabla 1, bajo el encabezado de "sustituciones ilustrativas", se proporcionan cambios más sustanciales, y como se describen más adelante en referencia a las clases de las cadenas laterales de aminoácidos. En un anticuerpo de interés pueden introducirse sustituciones de aminoácidos y los productos pueden explorarse para determinar una actividad deseada, por ejemplo, unión a antígeno conservada/mejorada, inmunogenicidad reducida o ADCC o CDC mejoradas.
T l 11
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Los aminoácidos pueden agruparse de acuerdo con las propiedades comunes de la cadena lateral: (1) hidrófobos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácidos: Asp, Glu; (4) básicos: His, Lys, Arg; (5) restos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro; y (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
Las sustituciones no conservativas implicarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase.
Un tipo de variante de sustitución implica sustituir uno o más restos de la región hipervariable de un anticuerpo precursor (por ejemplo, un anticuerpo humano o humanizado). Generalmente, las variantes resultantes seleccionadas para su estudio posterior tendrán modificaciones (por ejemplo, mejoras) en determinadas propiedades biológicas (por ejemplo, afinidad mejorada, inmunogenicidad reducida) con respecto al anticuerpo precursor y/o tendrán determinadas propiedades biológicas conservadas del anticuerpo precursor. Una variante de sustitución ilustrativa es un anticuerpo madurado por afinidad, que puede generarse de manera conveniente, por ejemplo, usando técnicas de maduración por afinidad basadas en presentación en fagos, tales como aquellas descritas en el presente documento. En resumen, se mutan uno o más restos de HVR y los anticuerpos variantes se presentan en fagos y se exploran para determinar una actividad biológica particular (por ejemplo, afinidad de unión).
Pueden efectuarse alteraciones (por ejemplo, sustituciones) en las HVR, por ejemplo, para mejorar la afinidad del anticuerpo. Dichas alteraciones pueden efectuarse en "puntos calientes" de HVR, es decir, restos codificados por codones que sufren mutación con elevada frecuencia durante el proceso de maduración somática (véase, por ejemplo, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)) y/o restos que entran en contacto con el antígeno, probándose la afinidad de unión de la VH o VL variante resultante. La maduración por afinidad mediante la construcción y reselección de bibliotecas secundarias se ha descrito, por ejemplo, en Hoogenboom et al., en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, Nueva Jersey, (2001).) En algunas realizaciones de maduración por afinidad, se introduce diversidad en los genes variables seleccionados para su maduración mediante cualquiera de diversos métodos (por ejemplo, PCR propensa a errores, reordenamiento de cadenas o mutagénesis dirigida por oligonucleótidos). Después, se crea una biblioteca secundaria. A continuación, la biblioteca se explora para identificar cualquier variante de anticuerpo con la afinidad deseada. Otro método para introducir diversidad implica estrategias dirigidas a las HVR, en las que se aleatorizan varios restos de HVR (por ejemplo, 4-6 restos a la vez). Los restos de HVR implicados en la unión al antígeno se pueden identificar de manera específica, por ejemplo, utilizando mutagénesis con barrido de alanina o modelización. Con frecuencia, se usan como diana, en particular, CDR-H3 y CDR-L3.
En determinadas realizaciones, pueden producirse sustituciones, inserciones o eliminaciones en una o más HVR siempre y cuando dichas alteraciones no reduzcan sustancialmente la capacidad del anticuerpo para unirse al antígeno. Por ejemplo, pueden efectuarse alteraciones conservativas (por ejemplo, sustituciones conservativas, tal como se proporcionan en el presente documento) que no reduzcan sustancialmente la afinidad de unión en las HVR. Dichas alteraciones pueden, por ejemplo, estar fuera de los restos de contacto con el antígeno en las HVR. En determinadas realizaciones de las secuencias variantes de VH y VL proporcionadas anteriormente, cada HVR bien está inalterada o bien no contiene más de una, dos o tres sustituciones de aminoácidos.
Un método útil para identificar restos o regiones de un anticuerpo que pueden seleccionarse como diana para la mutagénesis se denomina "mutagénesis por barrido de alanina" como describe Cunningham, Science 244:1081-1085 (1989). En este método, se identifica un resto o un grupo de restos diana (por ejemplo, restos cargados, tales como Arg, Asp, His, Lys y Glu) y se reemplaza por un aminoácido neutro o cargado negativamente (por ejemplo, alanina o polialanina) para determinar si se ve afectada la interacción del anticuerpo con el antígeno. Pueden introducirse sustituciones adicionales en las ubicaciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones iniciales. Como alternativa, o adicionalmente, puede usarse una estructura cristalina de un complejo antígenoanticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Dichos restos de contacto y restos próximos pueden seleccionarse como diana o eliminarse como candidatos para la sustitución. Las variantes se pueden explorar para determinar si contienen las propiedades deseadas.
Las inserciones en las secuencias de aminoácidos incluyen fusiones amino y/o carboxiterminales cuya longitud varía desde un resto hasta polipéptidos que contienen cien o más restos, así como inserciones intrasecuencia de restos de aminoácidos individuales o múltiples. Como ejemplo de inserción terminal se incluye un anticuerpo con un resto metionilo en el extremo N. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión al extremo N o C del anticuerpo a una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido que aumenta la semivida en suero del anticuerpo.
b. Variantes de glucosilación
En determinadas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente documento se altera para aumentar o reducir el alcance de glucosilación del anticuerpo. La adición o eliminación de sitios de glucosilación a un anticuerpo puede lograrse convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos, de tal forma que se crea o elimina uno o más sitios de glucosilación.
Cuando el anticuerpo comprende una región Fc, puede alterarse el carbohidrato unido a la misma. Los anticuerpos naturales producidos por células de mamífero comprenden normalmente un oligosacárido ramificado biantenario que está unido generalmente mediante un enlace N al Asn297 del dominio CH2 de la región Fc. Véanse, por ejemplo, Wright et al., TIBTECH 15:26-32 (1997). El oligosacárido puede incluir varios carbohidratos, por ejemplo, manosa, N-acetil glucosamina (GIcNAc), galactosa y ácido siálico, así como una fucosa unida a un GIcNAc en el "tallo" de la estructura del oligosacárido biantenario. En algunas realizaciones, para crear variantes de anticuerpo con determinadas propiedades mejoradas, pueden realizarse modificaciones del oligosacárido en un anticuerpo de la invención.
En una realización, se proporcionan variantes de anticuerpo que tienen una estructura de carbohidratos que carece de fucosa unida (directa o indirectamente) a una región Fc. Por ejemplo, la cantidad de fucosa en dicho anticuerpo puede ser del 1 % al 80 %, del 1 % al 65 %, del 5 % al 65 % o del 20 % al 40 %. La cantidad de fucosa se determina calculando la cantidad promedio de fucosa dentro de la cadena de azúcar en Asn297, con respecto a la suma de todas las glucoestructuras unidas a Asn 297 (por ejemplo, estructuras complejas, híbridas y con alto contenido de manosa) como se mide mediante espectrometría de masas MALDI-TOF, como se describe en el documento WO 2008/077546, por ejemplo. Asn297 se refiere al resto de asparagina ubicado aproximadamente en la posición 297 en la región Fc (numeración EU de los restos de la región Fc); sin embargo, Asn297 también puede estar ubicado a aproximadamente /- 3 aminoácidos cadena arriba o cadena abajo de la posición 297, es decir, entre las posiciones 294 y 300, debido a escasas variaciones de secuencia en los anticuerpos. Dichas variantes de fucosilación pueden tener mejorada la función ADCC. Véanse, por ejemplo, las publicaciones de patente de los Estados Unidos N.° US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Como ejemplos de publicaciones relacionadas con variantes de anticuerpo "desfucosiladas" o "deficientes en fucosa" se incluyen los documentos: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; Okazaki et al., J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87:614 (2004). Como ejemplos de líneas celulares capaces de producir anticuerpos desfucosilados se incluyen células Lec13 CHO deficientes en fucosilación de proteínas (Ripka et al., Arch. Biochem.
Biophys. 249:533-545 (1986); documento US 2003/0157108, Presta, L; y documento WO 2004/056312, Adams et al., especialmente en el ejemplo 11) y líneas celulares con supresión génica, tal como el gen de la alfa-1,6-fucosiltransferasa, FUT8, células CHO con supresión génica (véase, por ejemplo, Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87:614 (2004); Kanda et al., Biotechnol. Bioeng. 94(4):680-688 (2006); y el documento WO2003/085107).
Adicionalmente se proporcionan variantes de anticuerpo con oligosacáridos bisectados, por ejemplo, en las que un oligosacárido biantenario unido a la región Fc del anticuerpo se bisecciona mediante GIcNAc. Dichas variantes de anticuerpo pueden tener una fucosilación reducida y/o una función de ADCC mejorada. Se describen ejemplos de dichas variantes de anticuerpo, por ejemplo, en el documento WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); en la patente de los Estados Unidos n.° 6.602.684 (Umana et al.); y en el documento US 2005/0123546 (Umana et al.). También se proporcionan variantes de anticuerpo con al menos un resto de galactosa en el oligosacárido unido a la región Fc. Dichas variantes de anticuerpo pueden tener función de CDC mejorada. Dichas variantes de anticuerpo se describen, por ejemplo, en el documento WO 1997/30087 (Patel et al.); en el documento WO 1998/58964 (Raju, S.); y en el documento WO 1999/22764 (Raju, S.).
c. Variantes de la región Fc
En determinadas realizaciones, en la región Fc de un anticuerpo proporcionado en el presente documento, pueden introducirse una o más modificaciones de aminoácidos, generando de este modo una variante de la región Fc. La variante de la región Fc puede comprender una secuencia de región Fc humana (por ejemplo, una región Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana) que comprende una modificación de aminoácidos (por ejemplo, una sustitución) en una o más posiciones de aminoácidos.
En determinadas realizaciones, la invención contempla una variante de anticuerpo que tiene algunas, pero no todas, las funciones efectoras, lo que la convierte en un candidato deseable para aplicaciones en las que la semivida del anticuerpo in vivo es importante pero determinadas funciones efectoras (tales como el complemento y ADCC) son innecesarias o perjudiciales. Pueden llevarse a cabo ensayos de citotoxicidad in vitro y/o in vivo para confirmar la reducción/disminución de las actividades de CDC y/o ADCC. Por ejemplo, pueden llevarse a cabo ensayos de unión al receptor de Fc (FcR) para garantizar que el anticuerpo carece de actividad de unión a Fc gamma R (careciendo, por tanto, probablemente de actividad ADCC), pero conserva la capacidad de unión a FcRn. Para mediar en la ADCC, las células primarias, células NK, expresan solo Fc gamma RIll, mientras que los monocitos expresan Fc gamma RI, Fc gamma Rll y Fc gamma RIll. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991). Se describen ejemplos no limitantes de ensayos in vitro para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés en la patente de los Estados Unidos N.° 5.500.362 (véase, por ejemplo, Hellstrom et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) y Hellstrom et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); patente de los Estados Unidos N.° 5.821.337 (véase Bruggemann et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). Como alternativa, pueden emplearse métodos de ensayo no radiactivos (véase, por ejemplo, el ensayo de citotoxicidad no radiactivo ACTI™ para citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); y el ensayo de citotoxicidad no radiactiva CytoTox 96 (marca registrada) (Promega, Madison, Wl)). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC, peripheral blood mononuclear cells) y linfocitos citolíticos naturales (NK, Natural Killer). Como alternativa, o adicionalmente, la actividad ADCC de la molécula de interés puede evaluarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el divulgado en Clynes et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). Para confirmar que el anticuerpo es incapaz de unirse a C1q y, por tanto, carece de actividad CDC, pueden llevarse a cabo ensayos de unión a C1q. Véase, por ejemplo, el ensayo ELISA de unión a C1q y C3c en los documentos WO 2006/029879 y WO 2005/100402. Para evaluar la activación del complemento, se puede realizar un ensayo de CDC (véase, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg et al., Blood 101:1045-1052 (2003); y Cragg et al., Blood 103:2738-2743 (2004)). También pueden realizarse determinaciones de unión a FcRn y de eliminación/semivida in vivo usando métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Petkova et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)).
Los anticuerpos con función efectora reducida incluyen los que tienen una sustitución de uno o más de los restos 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 de la región Fc (patente de los Estados Unidos n.° 6.737.056). Dichos mutantes de Fc incluyen mutantes de Fc con sustituciones en dos o más de las posiciones de aminoácidos 265, 269, 270, 297 y 327, incluyendo el mutante de Fc denominado "DANA" con una sustitución de los restos 265 y 297 por alanina (patente de los Estados Unidos n.° 7.332.581).
Se describen determinadas variantes de anticuerpo con unión mejorada o reducida a FcR. (Véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos n.° 6.737.056; el documento WO 2004/056312 y Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001)).
En determinadas realizaciones, una variante de anticuerpo comprende una región Fc con una o más sustituciones de aminoácidos que mejoran la ADCC, por ejemplo, sustituciones en las posiciones 298, 333 y/o 334 de la región Fc (numeración EU de restos).
En algunas realizaciones, se realizan alteraciones en la región Fc que dan lugar a una unión alterada (es decir, tanto aumentada como disminuida) a C1q y/o a una citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), por ejemplo, tal como se describe en la patente de los Estados Unidos n.° 6.194.551, en el documento WO 1999/51642 y en Idusogie et al., J. Immunol. 164:4178-4184 (2000).
Los anticuerpos con semividas aumentadas y unión mejorada al receptor Fc neonatal (FcRn), que es responsable de la transferencia de las IgG maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), se describen en el documento US2005/0014934 (Hinton et al.). Dichos anticuerpos comprenden una región Fc con una o más sustituciones en la misma que mejoran la unión de la región Fc a FcRn. Dichas variantes de Fc incluyen aquellas que tienen sustituciones en uno o más de los restos de la región Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434, por ejemplo, la sustitución del resto 434 de la región Fc (patente de los Estados Unidos n.° 7.371.826).
Véase también Duncan, Nature 322:738-40 (1988); la patente de los Estados Unidos n.° 5.648.260; la patente de los Estados Unidos n.° 5.624.821; y el documento WO 1994/29351 en referencia a otros ejemplos de variantes de la región Fc.
d. Variantes de anticuerpo genomodificadas con cisteína
En determinadas realizaciones, puede ser deseable crear anticuerpos genomodificados con cisteína, por ejemplo, los "tioMAb", en los que uno o más restos de un anticuerpo se sustituyen por restos de cisteína. En realizaciones particulares, los restos sustituidos se producen en sitios accesibles del anticuerpo. Al sustituir esos restos por cisteína, los grupos de tiol reactivos se sitúan en sitios accesibles del anticuerpo y pueden usarse para conjugar el anticuerpo con otras fracciones, tales como fracciones de fármacos o fracciones de enlazador-fármaco, para crear un inmunoconjugado, como se describe adicionalmente en el presente documento. En determinadas realizaciones, uno cualquiera o más de los siguientes restos puede sustituirse por cisteína: V205 (numeración de Kabat) de la cadena ligera; A118 (numeración EU) de la cadena pesada; y S400 (numeración EU) de la región Fc de la cadena pesada. Pueden generarse anticuerpos genomodificados con cisteína como se describe, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos N.° 7.521.541.
e. Derivados de anticuerpo
En determinadas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente documento puede modificarse adicionalmente para que contenga fracciones adicionales no proteicas conocidas en la técnica y fácilmente disponibles. Las fracciones adecuadas para la derivatización del anticuerpo incluyen polímeros solubles en agua. Los ejemplos no limitantes de polímeros solubles en agua incluyen polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, poli-1, 3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros o copolímeros aleatorios) y dextrano o poli(n-vinilpirrolidona)polietilenglicol, homopolímeros de polipropilenglicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), alcohol polivinílico y mezclas de los mismos. El propionaldehído de polietilenglicol puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede tener cualquier peso molecular y puede estar o no ramificado. El número de polímeros unidos al anticuerpo puede variar y, si se une más de un polímero, pueden ser moléculas iguales o diferentes. En general, el número y/o tipo de polímeros usados para la derivatización, se puede determinar basándose en aspectos que incluyen las propiedades o funciones particulares del anticuerpo que se va a mejorar, si el derivado de anticuerpo se usará en una terapia en condiciones definidas, etc.
En otra realización, se proporcionan conjugados de un anticuerpo y una fracción no proteica que pueden calentarse selectivamente por exposición a radiación. En una realización, la fracción no proteica es un nanotubo de carbono (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:11600-11605 (2005)). La radiación puede ser de cualquier longitud de onda e incluye longitudes de onda que no dañan las células normales, pero que calientan la fracción no proteica a una temperatura a la que mueren las células próximas al anticuerpo-fracción no proteica.
B. Métodos y composiciones recombinantes
Los anticuerpos se pueden producir usando métodos y composiciones recombinantes, por ejemplo, tal como se describe en la patente de los Estados Unidos n.° 4.816.567. En una realización, se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-C5 descrito en el presente documento. Dicho ácido nucleico puede codificar una secuencia de aminoácidos que comprende la VL y/o una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo (por ejemplo, las cadenas ligeras y/o pesadas del anticuerpo). En una realización adicional, se proporcionan uno o más vectores (por ejemplo, vectores de expresión) que comprenden dicho ácido nucleico. En una realización adicional, se proporciona una célula hospedadora que comprende dicho ácido nucleico. En una de dichas realizaciones, una célula hospedadora comprende (por ejemplo, se ha transformado con): (1) un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VL del anticuerpo y una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo o (2) un primer vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VL del anticuerpo y un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo. En una realización, la célula hospedadora es eucariota, por ejemplo, una célula de ovario de hámster chino (CHO) o una célula linfoide (por ejemplo, células Y0, NS0 y Sp20). En una realización, se proporciona un método para preparar un anticuerpo anti-C5, en donde el método comprende cultivar una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo, como se proporciona anteriormente, en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo y opcionalmente, recuperar el anticuerpo de la célula hospedadora (o del medio de cultivo de la célula hospedadora).
Para la producción recombinante de un anticuerpo anti-C5, el ácido nucleico que codifica un anticuerpo, por ejemplo, tal como se describe anteriormente, se aísla e inserta en uno o más vectores para la clonación y/o expresión adicional en una célula hospedadora. Dicho ácido nucleico puede aislarse y secuenciarse fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo).
Las células hospedadoras adecuadas para la clonación o expresión de los vectores que codifican anticuerpos incluyen células procariotas o eucariotas descritas en el presente documento. Por ejemplo, los anticuerpos pueden producirse en bacterias, en particular cuando las funciones de glucosilación y efectora de Fc no son necesarias. Para la expresión de fragmentos de anticuerpo y polipéptidos en bacterias, véanse, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos N.° 5.648.237, 5.789.199 y 5.840.523. (Véase también Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), págs. 245-254, que describen la expresión de fragmentos de anticuerpo en E. coli.) Después de la expresión, el anticuerpo puede aislarse de la pasta de células bacterianas en una fracción soluble y puede purificarse adicionalmente.
Además de procariotas, los microbios eucariotas, tales como hongos filamentosos o levaduras, son hospedadores de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican anticuerpos, incluyendo cepas de hongos y levaduras cuyas vías de glucosilación se han "humanizado", lo que da como resultado la producción de un anticuerpo con un patrón de glucosilación parcial o completamente humano. Véanse Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004) y Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006).
Las células hospedadoras adecuadas para la expresión de anticuerpo glucosilado también proceden de organismos multicelulares (invertebrados y vertebrados). Como ejemplos de células de invertebrados se incluyen células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas baculovíricas que pueden usarse junto con células de insecto, especialmente para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.
También pueden utilizarse cultivos de células vegetales como hospedadores. Véanse, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos números 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978 y 6.417.429 (que describen la tecnología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas).
También pueden usarse como hospedadores células de vertebrado. Por ejemplo, pueden ser útiles líneas celulares de mamífero que están adaptadas para crecer en suspensión. Otros ejemplos de células de mamífero útiles son la línea CV1 de riñón de mono trasformada mediante SV40 (COS-7); la línea de riñón embrionario humano (293 o células 293 como se describen, por ejemplo, en Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de riñón de cría de hámster (BHK); células de Sertoli de ratón (células TM4 como se describe, por ejemplo, en Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1); células de riñón de mono verde africano (VERO-76); células de carcinoma de cuello de útero humano (HELA); células de riñón canino (MDCK; células de hígado de rata búfalo (BRL 3A); células de pulmón humano (W138); células de hígado humano (Hep G2); tumor de mama de ratón (MMT 060562); células TRI, como se describe, por ejemplo, en Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982); células Mr C 5; y células FS4. Otras líneas celulares de mamífero hospedadoras útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo células CHO DHFR' (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); y líneas celulares de mieloma, tales como Y0, NS0 y Sp2/0. Para una revisión de determinadas líneas celulares de mamífero hospedadoras adecuadas para la producción de anticuerpos, véase, por ejemplo, Yazaki y Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), págs. 255-268 (2003).
Los anticuerpos policlonales se producen preferentemente en animales mediante múltiples inyecciones subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno relevante con una proteína que es inmunogénica en la especie que se va a inmunizar, por ejemplo, hemocianina de lapa californiana, albúmina sérica, tiroglobulina de bovino, o un inhibidor de la tripsina de soja usando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de restos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de restos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCl2 o R1N=C=NR, en la que R y R1 son grupos alquilo diferentes.
Los animales (generalmente mamíferos no humanos) se inmunizan contra el antígeno, conjugados inmunogénicos, o derivados combinando, por ejemplo, 100 |jg o 5 |jg de la proteína o conjugado (de conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la solución por vía intradérmica en múltiples sitios. Un mes después se reforzó a los animales con 1/5 a 1/10 de la cantidad original del péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea en múltiples sitios. Siete a 14 días después los animales se sangran y el suero se evalúa para determinar el título de anticuerpos. Los animales se refuerzan hasta la meseta del título. Preferentemente, el animal se refuerza con el conjugado del mismo antígeno, pero se conjuga con una proteína diferente y/o a través de un reactivo de reticulación diferente. También pueden prepararse conjugados en un cultivo de células recombinantes como proteínas de fusión. Además, para potenciar la respuesta inmunitaria se usan, de forma adecuada, agentes de agregación tales como alumbre.
Se obtienen anticuerpos monoclonales a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones y/o modificaciones postraduccionales de origen natural (por ejemplo, isomerizaciones, amidaciones) que pueden estar presentes en escasas cantidades. Por tanto, el modificador "monoclonal" indica que el carácter del anticuerpo no es una mezcla de anticuerpos aislados.
Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales se pueden producir utilizando el método de hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al. Nature 256 (5517):495-497 (1975). En el método del hibridoma, un ratón u otro animal hospedador adecuado, tal como un hámster, se inmuniza como se describe anteriormente en el presente documento para estimular a los linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína usada para la inmunización. Como alternativa, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro.
El agente inmunizante incluirá normalmente la proteína antigénica o una variante de fusión de la misma. En general, si se desean células de origen humano se utilizan linfocitos de sangre periférica ("PBL") o si se desean fuentes de mamíferos no humanos se utilizan células esplénicas o células de ganglios linfáticos. Los linfocitos se fusionan después con una línea celular inmortalizada usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986), págs.
59-103).
Las líneas celulares inmortalizadas son habitualmente células de mamífero transformadas, particularmente células de mieloma de origen de roedor, bovino y humano. Habitualmente, se emplean líneas celulares de mieloma de rata o de ratón. Las células de hibridoma preparadas de este modo se siembran y dejan crecer en un medio de cultivo adecuado que contiene preferentemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma precursoras no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma precursoras carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT, por sus siglas en inglés), el medio de cultivo para los hibridomas normalmente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), cuyas sustancias impiden el crecimiento de células deficientes en HGPRT.
Las células de mieloma inmortalizadas preferidas son aquellas que se fusionan de manera eficaz, apoyan la producción estable de altos niveles de anticuerpo por las células productoras de anticuerpos seleccionadas y son sensibles a un medio tal como un medio HAT. Entre éstas, se prefieren las líneas de mieloma murino, tales como las procedentes de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles en Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, Estados Unidos y las células SP-2 (y derivados de las mismas, por ejemplo, X63-Ag8-653) disponibles en la American Type Culture Collection, Manassas, Virginia Estados Unidos. También se han descrito líneas de células de mieloma humano y heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor et al., J Immunol. 133(6):3001-3005 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., Nueva York (1987), págs. 51-63).
El medio de cultivo en el que se hacen crecer las células de hibridoma se analiza para determinar la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferentemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma se determina por inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). Dichas técnicas y ensayos se conocen en la técnica. Por ejemplo, la afinidad de unión puede determinarse mediante el análisis de Scatchard de Munson, Anal Biochem. 107(1):220-239 (1980).
Después de identificar las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones pueden subclonarse mediante procedimientos de dilución limitante y cultivarse mediante procedimientos convencionales (Goding, citado anteriormente). Los medios de cultivo adecuados para este fin incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden cultivarse in vivo como tumores en un mamífero.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, líquido ascítico o suero por procedimientos de purificación de inmunoglobulinas convencionales tales como, por ejemplo, proteína A-Sepharose, cromatografía con hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.
Los anticuerpos pueden producirse inmunizando un animal hospedador apropiado contra un antígeno. En una realización, que está presente con fines ilustrativos únicamente, el antígeno es un polipéptido que comprende una C5 de longitud completa. En una realización, el antígeno es un polipéptido que comprende la cadena beta (SEQ ID NO: 40) de C5. En una realización, que está presente con fines ilustrativos únicamente, el antígeno es un polipéptido que comprende el dominio MG1-MG2 (SEQ ID NO: 43) de la cadena beta de C5. En una realización, el antígeno es un polipéptido que comprende el dominio MG1 (SEQ ID NO: 41) de la cadena beta de C5. En una realización, el antígeno es un polipéptido que comprende la región correspondiente a los aminoácidos en las posiciones 19 a 180 de la cadena beta de C5. En una realización, el antígeno es un polipéptido que comprende la región correspondiente a los aminoácidos en las posiciones 33 a 124 de la cadena beta de C5. En una realización, el antígeno es un polipéptido que comprende al menos un fragmento seleccionado entre los aminoácidos 47-57, 70-76 y 107-110 de la cadena beta (SEQ ID NO: 40) de C5. En una realización, el antígeno es un polipéptido que comprende un fragmento de la cadena beta de C5 que comprende al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Thr47, Glu48, Ala49, Phe50, Asp51, Ala52, Thr53, Lys57, His70, VaI71, His72, Ser74, Glu76, VaI107, Ser108, Lys109 e His100. En una realización, el antígeno es un polipéptido que comprende un fragmento de la cadena beta de C5 que comprende al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Glu48, Asp51, His70, His72, Lys109 e His110. También se incluyen en la presente invención anticuerpos producidos mediante la inmunización DE un animal contra el antígeno. Los anticuerpos pueden incorporar cualquiera de las características, por separado o en combinación, como se describe anteriormente en "Anticuerpos anti-C5 ilustrativos".
Los siguientes aspectos/realizaciones divulgados en las secciones C. y D. no están de acuerdo con la invención y están presentes con fines ilustrativos únicamente.
C. Ensayos
Los anticuerpos anti-C5 proporcionados en el presente documento se pueden identificar, explorar o caracterizar para determinar sus propiedades fisicoquímicas y/o sus actividades biológicas mediante diversos ensayos conocidos en la técnica.
1. Ensayos de unión y otros ensayos
En un aspecto, se prueba un anticuerpo de la invención para determinar su actividad de unión a antígeno, por ejemplo, por métodos conocidos tales como ELISA, transferencia Western, BIACORE (marca registrada), etc.
En otro aspecto, pueden usarse ensayos de competición para identificar un anticuerpo que compite por unirse a C5 con un anticuerpo anti-C5 descrito en el presente documento. En determinadas realizaciones, cuando dicho un anticuerpo competitivo está presente en exceso, bloquea (por ejemplo, reduce) la unión de un anticuerpo de referencia a C5 en al menos un 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 % o más. En algunos casos, la unión se inhibe en al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o más. En determinadas realizaciones, dicho anticuerpo competidor se une al mismo epítopo (por ejemplo, un epítopo lineal o conformacional) que está unido por un anticuerpo anti-C5 descrito en el presente documento (por ejemplo, un anticuerpo anti-C5 descrito en la tabla 2). Métodos ilustrativos detallados para mapear un epítopo al que se une un anticuerpo se proporcionan en Morris, "Epitope Mapping Protocols", en Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ) (1996).
En un ensayo de competición ilustrativo, se incuba C5 inmovilizada en una solución que comprende un primer anticuerpo marcado que se une a C5 y un segundo anticuerpo no marcado que se está evaluando para determinar su capacidad para competir con el primer anticuerpo por la unión a C5. El segundo anticuerpo puede estar presente en un sobrenadante de hibridoma. Como control, se incuba C5 inmovilizada en una solución que comprende el primer anticuerpo marcado, pero no el segundo anticuerpo marcado. Después de la incubación en condiciones que permiten la unión del primer anticuerpo a C5, se retira el exceso de anticuerpo no unido y se mide la cantidad de marcador asociado con C5 inmovilizada. Si la cantidad de marcador asociado a C5 inmovilizada se encuentra sustancialmente reducida en la muestra de ensayo con respecto a la muestra del control, entonces, esto indica que el segundo anticuerpo está compitiendo con el primer anticuerpo por la unión a C5. Véanse, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual cáp.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) (1988).
En otro ensayo de competición ilustrativo, se utiliza un análisis BIACORE (marca registrada) para determinar la capacidad de un anticuerpo anti-C5 de prueba para competir con la unión a C5 por un segundo anticuerpo anti-C5 (referencia). En otro aspecto en el que un instrumento BIACORE (marca registrada) (por ejemplo, BIACORE (marca registrada) 3000) se maneja de acuerdo con las recomendaciones del fabricante, la proteína C5 se captura en un chip CM5 BIACORE (marca registrada) usando una técnica convencional conocida en la técnica para generar una superficie recubierta con C5. Normalmente, se acoplarían al chip 200-800 unidades de resonancia de C5 (una cantidad que proporciona niveles de unión fácilmente medibles pero que se saturan de manera fácil mediante las concentraciones de anticuerpo de prueba que se utilizan). Los dos anticuerpos (es decir, el anticuerpo de prueba y el de referencia) que se evaluarán para determinar su capacidad para competir entre sí se mezclan en una relación molar de 1:1 de sitios de unión en un tampón adecuado para crear una mezcla de prueba. Cuando se calculan las concentraciones basándose en el sitio de unión, se supone que el peso molecular de un anticuerpo de prueba o de referencia es el peso molecular total del anticuerpo correspondiente dividido por el número de sitios de unión a C5 en el anticuerpo. La concentración de cada anticuerpo (es decir, anticuerpo de prueba y de referencia) en la mezcla de prueba debe ser lo suficientemente alta como para saturar fácilmente los sitios de unión para ese anticuerpo en las moléculas C5 capturadas en el chip BIACORE (marca registrada). Los anticuerpos de prueba y de referencia en la mezcla tienen la misma concentración molar (basándose en la unión), normalmente entre 1,00 y 1,5 pM (basándose en el sitio de unión). También se preparan distintas soluciones que contienen el anticuerpo de prueba solo y el anticuerpo de referencia solo. El anticuerpo de prueba y el anticuerpo de referencia en estas soluciones deben estar en el mismo tampón y en la misma concentración y condiciones que en la mezcla de prueba. La mezcla de prueba que contiene el anticuerpo de prueba y el anticuerpo de referencia se pasa por el chip BIACORE (marca registrada) recubierto de C5 y se registra la cantidad total de unión. A continuación, el chip se trata de manera que se elimine el anticuerpo de prueba o de referencia unido sin dañar la C5 unida al chip. Normalmente, esto se realiza tratando el chip con HC1 30 mM durante 60 segundos. La solución de anticuerpo de prueba solo se pasa después sobre la superficie recubierta de C5 y se registra la cantidad de unión. El chip se trata de nuevo para eliminar todo el anticuerpo unido sin dañar la C5 unida al chip. La solución de anticuerpo de referencia solo se pasa después sobre la superficie recubierta con C5 y se registra la cantidad de unión. A continuación, se calcula la unión teórica máxima de la mezcla de anticuerpo de prueba y anticuerpo de referencia, y es la suma de la unión de cada anticuerpo (es decir, prueba y referencia) cuando se pasa sobre la superficie C5 sola. Si la unión registrada real de la mezcla es menor que este máximo teórico, entonces el anticuerpo de prueba y el anticuerpo de referencia compiten entre sí por la unión a C5. Por tanto, en general, un anticuerpo anti-C5 de prueba competitivo es uno que se unirá a C5 en el ensayo de bloqueo BIACORE (marca registrada) anterior de manera que durante el ensayo y en presencia del anticuerpo anti-C5 de referencia, la unión registrada esté entre 80 % y 0,1 % (por ejemplo, 80 %> a 4 %) de la unión teórica máxima, específicamente entre el 75 % y el 0,1 % (p. ej., del 75 % al 4 %) de la unión teórica máxima, y más específicamente entre el 70 % y el 0,1 % (por ejemplo, del 70 % al 4 %) de la unión teórica máxima (como se define anteriormente) del anticuerpo de prueba y el anticuerpo de referencia en combinación.
En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 de la presente invención compite por la unión a C5 con un anticuerpo que comprende un par VH y VL seleccionado del anticuerpo CFA0341 y CFA0330. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 compite por la unión a C5 con un anticuerpo seleccionado entre: CFA0538, CFA0501, CFA0599, CFA0307, CFA0366, CFA0675 y CFA0672. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 compite por la unión a C5 con el anticuerpo CFA0329. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 compite por la unión a C5 con el anticuerpo CFA0666.
En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 de la presente invención compite por la unión a C5 con un anticuerpo que comprende un par VH y VL del anticuerpo CFA0305 o 305LO5.
En realizaciones adicionales, el anticuerpo anti-C5 se une a C5 con una mayor afinidad a pH neutro que a pH ácido. En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 de la presente invención compite por la unión a C5 con un anticuerpo que comprende un par VH y VL seleccionado de: CFA0538, CFA0501, CFA0599, CFA0307, CFA0366, CFA0675 y CFA0672. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 compite por la unión a C5 con el anticuerpo CFA0666. En realizaciones adicionales, el anticuerpo anti-C5 se une a C5 con una mayor afinidad a pH 7,4 que a pH 5,8.
En realizaciones adicionales, el anticuerpo anti-C5 se une a C5 con una mayor afinidad a pH neutro que a pH ácido. En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 de la presente invención compite por la unión a C5 con un anticuerpo que comprende un par VH y VL del anticuerpo CFA0305 o 305LO5. En realizaciones adicionales, el anticuerpo anti-C5 se une a C5 con una mayor afinidad a pH 7,4 que a pH 5,8.
En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 de la presente invención compite por la unión a C5 con un anticuerpo que comprende un par VH y VL seleccionado de un VH de SEQ ID NO: 22 y un VL de SEQ ID NO: 26, o un VH de s Eq ID NO: 21 y un VL de SEQ ID NO: 25. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 compite por la unión a C5 con un anticuerpo que comprende un par VH y VL seleccionado de: (a) un VH de SEQ ID NO: 5 y un VL de SEQ ID NO: 15; (b) un VH de SEQ ID NO: 4 y un VL de SEQ ID NO: 14; (c) un VH de SEQ ID NO: 6 y un VL de SEQ ID NO: 16; (d) un VH de SEQ ID NO: 2 y un VL de SEQ ID NO: 12; (e) un VH de SEQ ID NO: 3 y un VL de SEQ ID NO: 13; (f) un VH de SEQ ID NO: 1 y un VL de SEQ ID NO: 11; (g) un VH de SEQ ID NO: 9 y un VL de SEQ ID NO: 19; (h) un VH de SEQ ID NO: 7 y un VL de SEQ ID NO: 17; y (i) un VH de SEQ ID NO: 8 y un VL de SEQ ID NO: 18. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 compite por la unión a C5 con un anticuerpo que comprende un VH de SEQ ID NO: 23 y un VL de SEQ ID NO: 27. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 compite por la unión a C5 con un anticuerpo que comprende un VH de SEQ ID NO: 7 y un VL de SEQ ID NO: 17.
En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 de la presente invención compite por la unión a C5 con un anticuerpo que comprende un par VH y VL seleccionado de: (a) un VH de SEQ ID NO: 1 y un VL de SEQ ID NO: 11; (b) un VH de SEQ ID NO: 22 y un VL de SEQ ID NO: 26; (c) un VH de SEQ ID NO: 21 y un VL de SEQ ID NO: 25; (d) un VH de SEQ ID NO: 5 y un VL de SEQ ID NO: 15; (e) un VH de SEQ ID NO: 4 y un VL de SEQ ID NO: 14; (f) un VH de SEQ ID NO: 6 y un VL de SEQ ID NO: 16; (g) un VH de SEQ ID NO: 2 y un VL de SEQ ID NO: 12; (h) un VH de SEQ ID NO: 3 y un VL de SEQ ID NO: 13; (i) un VH de SEQ ID NO: 9 y un VL de SEQ ID NO: 19; (j) un VH de SEQ ID NO: 7 y un VL de SEQ ID NO: 17; (k) un VH de SEQ ID NO: 8 y un VL de SEQ ID NO: 18; (I) un VH de SEQ ID NO: 23 y un VL de SEQ ID NO: 27; y (m) un VH de SEQ ID NO: 10 y un VL de SEQ ID NO: 20.
En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 de la presente invención compite por la unión a C5 con un anticuerpo que comprende un par VH y VL seleccionado de: (a) un VH de SEQ ID NO: 22 y un VL de SEQ ID NO: 26; (b) un VH de SEQ ID NO: 21 y un VL de SEQ ID NO: 25; (c) un VH de SEQ ID NO: 5 y un VL de SEQ ID NO: 15; (d) un VH de SEQ ID NO: 4 y un VL de SEQ ID NO: 14; (e) un VH de SEQ ID NO: 6 y un VL de SEQ ID NO: 16; (f) un VH de SEQ ID NO: 2 y un VL de SEQ ID NO: 12; (g) un VH de SEQ ID NO: 3 y un VL de SEQ ID NO: 13; (h) un VH de SEQ ID NO: 9 y un VL de SEQ ID NO: 19; (i) un VH de SEQ ID NO: 7 y un VL de SEQ ID NO: 17; (j) un VH de SEQ ID NO: 8 y un VL de SEQ ID NO: 18; (k) un VH de SEQ ID NO: 23 y un VL de SEQ ID NO: 27.
En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 de la presente invención compite por la unión a C5 con un anticuerpo que comprende un par VH y VL seleccionado de un VH de SEQ ID NO: 1 y un VL de SEQ ID NO: 11, o un VH de SEQ ID NO: 10 y un VL de SEQ ID NO: 20.
En realizaciones adicionales, el anticuerpo anti-C5 se une a C5 con una mayor afinidad a pH neutro que a pH ácido. En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-C5 se une a C5 con una mayor afinidad a pH neutro que a pH ácido y compite por la unión a C5 con un anticuerpo que comprende un par VH y VL seleccionado de: (a) un Vh de SEQ ID NO: 1 y un VL de SEQ ID NO: 11; (b) un VH de SEQ ID NO: 5 y un VL de SEQ ID NO: 15; (c) un VH de SEQ ID NO: 4 y un VL de SEQ ID NO: 14; (d) un VH de SEQ ID NO: 6 y un VL de SEQ ID NO: 16; (e) un VH de SEQ ID NO: 2 y un VL de SEQ ID NO: 12; (f) un VH de SEQ ID NO: 3 y un VL de SEQ ID NO: 13; (g) un VH de SEQ ID NO: 9 y un VL de SEQ ID NO: 19; (h) un VH de SEQ ID NO: 7 y un VL de SEQ ID NO: 17; (i) un VH de SEQ ID NO: 8 y un VL de SEQ ID NO: 18; y (j) un VH de SEQ ID NO: 10 y un VL de SEQ ID NO: 20. En realizaciones adicionales, el anticuerpo anti-C5 se une a C5 con una mayor afinidad a pH 7,4 que a pH 5,8.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-C5 se une a C5 con una mayor afinidad a pH neutro que a pH ácido y compite por la unión a C5 con un anticuerpo que comprende un par VH y VL seleccionado de: (a) un VH de SEQ ID NO: 5 y un VL de SEQ ID NO: 15; (b) un VH de SEQ ID NO: 4 y un VL de SEQ ID NO: 14; (c) un VH de SEQ ID NO: 6 y un VL de SEQ ID NO: 16; (d) un VH de SEQ ID NO: 2 y un VL de SEQ ID NO: 12; (e) un VH de SEQ ID NO: 3 y un VL de SEQ ID NO: 13; (f) un VH de SEQ ID NO: 1 y un VL de SEQ ID NO: 11; (g) un VH de SEQ ID NO: 9 y un VL de SEQ ID NO: 19; (h) un VH de SEQ ID NO: 7 y un VL de SEQ ID NO: 17; y (i) un VH de SEQ ID NO: 8 y un VL de SEQ ID NO: 18. En realizaciones adicionales, el anticuerpo anti-C5 se une a C5 con una mayor afinidad a pH 7,4 que a pH 5,8.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-C5 se une a C5 con una mayor afinidad a pH neutro que a pH ácido y compite por la unión a C5 con un anticuerpo que comprende un par VH y VL seleccionado de un VH de SEQ ID NO: 1 y un v L de SEQ ID NO: 11, o un VH de Se Q ID NO: 10 y un v L de Se Q ID NO: 20. En realizaciones adicionales, el anticuerpo anti-C5 se une a C5 con una mayor afinidad a pH 7,4 que a pH 5,8.
En determinadas realizaciones, si un anticuerpo anti-C5 de la presente invención se une a un determinado epítopo se puede determinar de la siguiente manera: los mutantes puntuales de C5 en los que un aminoácido (excepto la alanina) en C5 se sustituye por alanina se expresan en células 293, y se prueba la unión de un anticuerpo anti-C5 a los mutantes de C5 mediante ELISA, transferencia Western o BIACORE (marca registrada); en donde una reducción o eliminación sustancial de la unión del anticuerpo anti-C5 al mutante de C5 con respecto a su unión a C5 de tipo silvestre indica que el anticuerpo anti-C5 se une a un epítopo que comprende ese aminoácido en C5. En determinadas realizaciones, el aminoácido en C5 que se sustituirá por alanina se selecciona del grupo que consiste en Glu48, Asp51, His70, His72, Lys109 e His110 de la cadena beta de C5 (SEQ ID NO: 40). En realizaciones adicionales, el aminoácido en C5 que se sustituirá por alanina es Asp51 o Lys109 de la cadena beta de C5 (SEQ ID NO: 40).
En otra realización, si un anticuerpo anti-C5 con características de unión dependientes del pH se une a un determinado epítopo se puede determinar de la siguiente manera: los mutantes puntuales de C5 en los que se sustituye un resto de histidina en C5 por otro aminoácido (por ejemplo, tirosina) se expresan en células 293, y se prueba la unión de un anticuerpo anti-C5 a los mutantes de c 5 mediante ELISA, transferencia Western o BIACORE (marca registrada); en donde una reducción sustancial de la unión del anticuerpo anti-C5 a C5 de tipo silvestre a pH ácido con respecto a su unión al mutante de C5 a pH ácido, indica que el anticuerpo anti-C5 se une a un epítopo que comprende ese resto de histidina en C5. En realizaciones adicionales, la unión del anticuerpo anti-C5 a C5 de tipo silvestre a pH neutro no se reduce sustancialmente con respecto a su unión al mutante de C5 a pH neutro. En determinadas realizaciones, el resto de histidina en C5 que se sustituirá por otro aminoácido se selecciona del grupo que consiste en His70, His72 e His110 de la cadena beta de C5 (SEQ ID NO: 40). En una realización adicional, el resto de histidina His70 se sustituye por tirosina.
2. Ensayos de actividad
En un aspecto, se proporcionan ensayos para identificar anticuerpos anti-C5 que tienen actividad biológica. La actividad biológica puede incluir, por ejemplo, inhibir la activación de C5, impedir la escisión de C5 para formar C5a y C5b, bloquear el acceso de convertasa c 5 al sitio de escisión en C5, bloquear la actividad hemolítica causada por la activación de C5, etc. También se proporcionan anticuerpos que tienen dicha actividad biológica in vivo y/o in vitro.
En determinadas realizaciones, se prueba dicha actividad biológica en un anticuerpo de la invención.
En determinadas realizaciones, si un anticuerpo de prueba inhibe la escisión de C5 en C5a y C5b, se determina mediante los métodos descritos, por ejemplo, en Isenman et al., J Immunol. 124(1):326-331 (1980). En otra realización, esto se determina mediante métodos de detección específica de proteínas C5a y/o C5b escindidas, por ejemplo, ELISA o transferencias Western. Cuando se detecta una cantidad disminuida de un producto de escisión de C5 (es decir, C5a y/o C5b) en presencia de (o después del contacto con) el anticuerpo de prueba, el anticuerpo de prueba se identifica como un anticuerpo que puede inhibir la escisión de C5. En determinadas realizaciones, la concentración y/o la actividad fisiológica de C5a puede medirse mediante métodos, por ejemplo, ensayos de quimiotaxis, RIA o ELISA (véase, por ejemplo, Ward y Zvaifler J. Clin. Invest. 50(3):606-616 (1971)).
En determinadas realizaciones, si un anticuerpo de prueba bloquea el acceso de la convertasa C5 a C5 se determina mediante métodos para la detección de interacciones de proteínas entre la convertasa C5 y C5, por ejemplo, ELISA o BIACORE (marca registrada). Cuando las interacciones disminuyan en presencia (o después del contacto con) el anticuerpo de prueba, el anticuerpo de prueba se identifica como un anticuerpo que puede bloquear el acceso de la convertasa C5 a C5.
En determinadas realizaciones, la actividad de C5 se puede medir en función de su capacidad de lisis celular en los fluidos corporales de un sujeto. La capacidad de lisis celular, o una reducción de la misma, de C5 puede medirse mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, un ensayo hemolítico convencional, tal como el ensayo de hemólisis descrito por Kabat y Mayer (eds), Experimental Immunochemistry, 2a edición, 135-240, Springfield, iL, CC Thomas (1961), páginas 135-139, o una variación convencional de ese ensayo, tal como el método de hemólisis de eritrocitos de pollo como se describe en, por ejemplo, Hillmen et al., N. Engl. J. Med. 350(6): 552-559 (2004). En determinadas realizaciones, La actividad de C5, o la inhibición de la misma, se cuantifica usando un ensayo CH50eq. El ensayo CH50eq es un método para medir la actividad del complemento clásico total en suero. Esta prueba es un ensayo lítico, que utiliza eritrocitos sensibilizados con anticuerpos como el activador de la vía clásica del complemento y varias diluciones del suero de prueba para determinar la cantidad necesaria para generar un 50 % de lisis (CH50). Se puede determinar el porcentaje de hemólisis, por ejemplo, usando un espectrofotómetro. El ensayo CH50eq proporciona una medida indirecta de la formación del complejo terminal del complemento (TCC), ya que los propios TCC son directamente responsables de la hemólisis medida. La inhibición de la activación de C5 también puede detectarse y/o medirse utilizando los métodos expuestos y ejemplificados en los ejemplos de trabajo. Usando ensayos de estos u otros tipos adecuados, pueden explorarse anticuerpos candidatos capaces de inhibir la activación de C5. En determinadas realizaciones, la inhibición de la activación de C5 incluye al menos un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 % o 40 % de disminución o más en la activación de C5 en un ensayo en comparación con el efecto de un control negativo en condiciones similares. En algunas realizaciones, se refiere a la inhibición de la activación de C5 en al menos un 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % o más.
D. Inmunoconjugados
La invención también proporciona inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo anti-C5 proporcionado en el presente documento conjugado a uno o más agentes citotóxicos, tales como agentes o fármacos quimioterapéuticos, agentes inhibidores del crecimiento, toxinas (por ejemplo, toxinas proteicas, toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal o fragmentos de las mismas) o isótopos radiactivos.
En una realización, un inmunoconjugado es un conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC, por sus siglas en inglés) en el que se conjuga un anticuerpo a uno o más fármacos, incluyendo un maitansinoide (véanse, las patentes de los Estados Unidos números 5.208.020, 5.416.064 y la patente europea EP 0425 235 B1); una auristatina tal como las fracciones de fármaco monometilauristatina DE y DF (MMAE y MMAF) (véanse, las patentes de los Estados Unidos números 5.635.483, 5.780.588 y 7.498.298); una dolastatina; una caliqueamicina o un derivado de la misma (véanse, las patentes de los Estados Unidos números 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001 y 5.877.296; Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); y Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)); una antraciclina, tal como daunomicina o doxorrubicina (véanse Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002); y la patente de los Estados Unidos n.° 6.630.579); metotrexato; vindesina; un taxano, tal como docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel y ortataxel; un tricoteceno; y CC1065.
En otra realización, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo como se describe en el presente documento conjugado con una toxina enzimáticamente activa o un fragmento de la misma, incluyendo la cadena A de la difteria, fragmentos activos que no son fragmentos de unión de la toxina diftérica, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos.
En otra realización, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo como se describe en el presente documento conjugado con un átomo radiactivo para formar un radioconjugado. Se encuentra disponible una variedad de isótopos radiactivos para la producción de radioconjugados. Los ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu. Cuando el radioconjugado se usa para la detección, este puede comprender un átomo radiactivo para realizar estudios escintigráficos, por ejemplo, tc99m o 1123 o un marcador de espín para la obtención de imágenes por resonancia magnética nuclear (NMR, por sus siglas en inglés) (también conocida como obtención de imágenes por resonancia magnética, MRI, por sus siglas en inglés), tales como nuevamente, yodo-123, yodo-131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.
Pueden prepararse conjugados de un anticuerpo y un agente citotóxico usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil)-cidohexano-l-carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidioésteres (tales como dimetil adipimidato HCl), ésteres activos (tal como disuccinimidil suberato), aldehídos (tal como glutaraldehído), compuestos de bis-azido (tal como bis(p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tale como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tal como 2,6-diisocianato de tolueno) y compuestos de bis-fluorina activa (tal como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricina tal como se describe en Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietileno triaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono-14 es un agente quelante ilustrativo para la conjugación del radionucleótido con el anticuerpo. Véase el documento WO94/11026. El enlazador puede ser un "enlazador escindible" que facilita la liberación de un fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, puede usarse un enlazador lábil por ácido, enlazador sensible a peptidasa, enlazador fotolábil, enlazador de dimetilo o enlazador que contiene disulfuro (Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992); patente de los Estados Unidos n.° 5.208.020).
Los inmunoconjugados o ADC en el presente documento contemplan expresamente dichos conjugados preparados con reactivos reticulantes que incluyen BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SlA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SlAB, sulfo-SMCC y sulfo-SMPB y SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfona)benzoato) que se encuentran disponibles comercialmente (por ejemplo, de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., Estados Unidos).
Los siguientes aspectos/realizaciones divulgados en la sección E. no están de acuerdo con la invención y están presentes con fines ilustrativos únicamente.
E. Métodos y composiciones para diagnósticos y detección
En determinadas realizaciones, cualquiera de los anticuerpos anti-C5 proporcionados en el presente documento es útil para detectar la presencia de C5 en una muestra biológica. El término "detectar", como se usa en el presente documento, abarca la detección cuantitativa o cualitativa. En determinadas realizaciones, una muestra biológica comprende una célula o tejido, tal como suero, sangre completa, plasma, muestra de biopsia, muestra de tejido, suspensión celular, saliva, esputo, fluido oral, líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico, líquido ascítico, leche, calostro, secreción de glándulas mamarias, linfa, orina, sudor, fluido lagrimal, fluido gástrico, líquido sinovial, líquido peritoneal, líquido y moco del cristalino ocular.
En una realización, se proporciona un anticuerpo anti-C5 para su uso en un método de diagnóstico o detección. En un aspecto adicional, se proporciona un método para detectar la presencia de C5 en una muestra biológica. En determinadas realizaciones, el método comprende poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo anti-C5 como se describe en el presente documento en condiciones que permitan la unión del anticuerpo anti-C5 a C5 y detectar si se forma un complejo entre el anticuerpo anti-C5 y C5. Dicho método puede ser un método in vitro o in vivo. En una realización, se utiliza un anticuerpo anti-C5 para seleccionar sujetos elegibles para terapia con un anticuerpo anti-C5, por ejemplo, donde C5 es un biomarcador para la selección de pacientes.
En determinadas realizaciones, se proporcionan anticuerpos anti-C5 marcados. Los marcadores incluyen marcadores o fracciones que se detectan directamente (tal como marcadores fluorescentes, cromóforos, densos a electrones, quimioluminiscentes y radiactivos), así como fracciones, tales como enzimas o ligandos, que se detectan indirectamente, por ejemplo, mediante una reacción enzimática o interacción molecular. Los marcadores ilustrativos incluyen los radioisótopos 32P, 14C, 125l 3H y 131l, fluoróforos tales como quelatos de tierras raras o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, luciferasas, por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (patente de los Estados Unidos n.° 4.737.456), 2,3-dihidroftalacinadionas, peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido oxidasas, por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, oxidasas heterocíclicas tal como uricasa y xantina oxidasa, acopladas a una enzima que utiliza peróxido de hidrógeno para oxidar un colorante precursor tal como HRP, lactoperoxidasa o microperoxidasa, biotina/avidina, marcadores de espín, marcadores de bacteriófagos, radicales libres estables, y similares.
F. Formulaciones farmacéuticas
Las formulaciones farmacéuticas de un anticuerpo anti-C5 como se describe en el presente documento se preparan mezclando dicho anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos farmacéuticamente aceptables normalmente son no tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas e incluyen: tampones, tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos, tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanoI; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 restos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos, tales como polietilenglicol (PEG). Los vehículos farmacéuticamente aceptables ilustrativos en el presente documento incluyen además agentes para la dispersión intersticial de fármacos tales como glucoproteínas hialuronidasas neutras, -activas, solubles (sHASEGP), por ejemplo, glucoproteínas de hialuronidasa PH-20 solubles humanas, tal como rHuPH20 (HYLENEX (marca registrada), Baxter International, Inc.). En las publicaciones de los Estados Unidos números 2005/0260186 y 2006/0104968, se describen determinadas sHASEGP ilustrativas y métodos de uso, incluyendo rHuPH20. En un aspecto, una sHASEGP se combina con una o más glucosaminoglucanasas adicionales, tales como condroitinasas.
En la patente de los Estados Unidos n.° 6.267.958, se describen formulaciones ilustrativas de anticuerpos liofilizados. Las formulaciones de anticuerpos acuosas incluyen las descritas en la patente de los Estados Unidos n.° 6.171.586 y en el documento WO 2006/044908, incluyendo estas últimas formulaciones un tampón de histidina-acetato.
La formulación del presente documento también puede contener más de un principio activo, según sea necesario para la indicación particular que se esté tratando, preferentemente los que tienen actividades complementarias que no se afectan negativamente entre sí. Dichos principios activos están convenientemente presentes en combinación en cantidades que son eficaces para el fin previsto.
Los principios activos pueden atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli(metilmetacilato), respectivamente, en sistemas de suministro de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980).
Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices se presentan en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas.
Las formulaciones que se van a usar para la administración in vivo son, generalmente, estériles. La esterilidad puede lograrse fácilmente, por ejemplo, mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.
G. Métodos y composiciones terapéuticos
Cualquiera de los anticuerpos anti-C5 proporcionados en el presente documento se pueden usar en métodos terapéuticos.
En un aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-C5 para su uso como medicamento. En aspectos adicionales, se proporciona un anticuerpo anti-C5 para su uso en el tratamiento de una enfermedad. En determinadas realizaciones, se proporciona un anticuerpo anti-C5 para su uso en un método de tratamiento. En determinadas realizaciones, la invención proporciona un anticuerpo anti-C5 para su uso en un método de tratamiento de un individuo que tiene una enfermedad que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo anti-C5. En una de dichas realizaciones, el método comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores es preferentemente un ser humano.
En un aspecto adicional, la divulgación proporciona el uso de un anticuerpo anti-C5 en la fabricación o preparación de un medicamento. En una realización, el medicamento es para el tratamiento de una enfermedad. En una realización adicional, el medicamento es para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad que comprende administrar a un individuo que tenga una enfermedad una cantidad eficaz del medicamento. En una de dichas realizaciones, el método comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores es preferentemente un ser humano.
En un aspecto adicional, la divulgación proporciona un anticuerpo anti-C5 de acuerdo con la invención para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad. En una realización, que es para fines ilustrativos únicamente, el método comprende administrar a un individuo que padece dicha enfermedad una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-C5. En una de dichas realizaciones, el método comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional. Un "individuo" de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones anteriores puede ser un ser humano.
En un aspecto adicional, la invención proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los anticuerpos anti-C5 de la invención, por ejemplo, para su uso en cualquiera de los métodos terapéuticos anteriores. En una realización, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos anti-C5 proporcionados en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra realización, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos anti-C5 proporcionados en el presente documento y al menos un agente terapéutico adicional.
En un aspecto adicional, la formulación farmacéutica es para su uso en el tratamiento de una enfermedad. En una realización, la formulación farmacéutica se administra a un individuo que padece una enfermedad. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores es preferentemente un ser humano.
En un aspecto adicional, la divulgación proporciona métodos para preparar un medicamento o una formulación farmacéutica, que comprenden mezclar cualquiera de los anticuerpos anti-C5 proporcionados en el presente documento con un vehículo farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, para su uso en cualquiera de los métodos terapéuticos anteriores. En una realización, los métodos para preparar un medicamento o una formulación farmacéutica comprenden además añadir al menos un agente terapéutico adicional al medicamento o formulación farmacéutica.
Los anticuerpos de la invención pueden usarse o bien solos o en combinación con otros agentes en una terapia. Por ejemplo, un anticuerpo de la invención puede administrarse junto con al menos un agente terapéutico adicional.
Dichas terapias combinadas indicadas anteriormente, abarcan la administración combinada (donde se incluyen dos o más agentes terapéuticos en la misma formulación o en formulaciones distintas) y la administración por separado, en cuyo caso, la administración del anticuerpo de la invención puede producirse antes, de manera simultánea y/o después de, la administración del agente o los agentes terapéuticos adicionales. En una realización, la administración del anticuerpo anti-C5 y la administración de un agente terapéutico adicional se producen en aproximadamente un mes o en aproximadamente una, dos o tres semanas o en aproximadamente uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis días, entre sí.
Un anticuerpo de la invención (y cualquier agente terapéutico adicional) puede administrarse por cualquier medio adecuado, incluyendo parenteral, intrapulmonar e intranasal y, si se desea para un tratamiento local, administración intralesional. Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. La dosificación puede ser por cualquier vía adecuada, por ejemplo, mediante inyecciones, tales como inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es corta o crónica. En el presente documento se contemplan varias pautas posológicas que incluyen administraciones individuales o múltiples a lo largo de varios puntos temporales, administración en embolada e infusión pulsada.
Los anticuerpos de la invención podrían formularse, dosificarse y administrarse de una forma acorde con la buena práctica médica. Los factores a tener en cuenta en este contexto incluyen el trastorno particular que se va a tratar, el mamífero particular que se va a tratar, el estado clínico del paciente individual, la causa del trastorno, el lugar donde se va a suministrar el agente, el método de administración, la pauta de administración y otros factores conocidos por los profesionales sanitarios. Aunque no es necesario, el anticuerpo se formula opcionalmente con uno o más agentes usados en la actualidad para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo presente en la formulación, del tipo de trastorno o tratamiento y de otros factores analizados anteriormente. Estos se usan generalmente con las mismas dosis y por vías de administración como las descritas en el presente documento o de aproximadamente el 1 al 99 % de las dosis descritas en el presente documento o en cualquier dosis y por cualquier vía que se haya determinado empíricamente/clínicamente como adecuada.
Para la prevención o el tratamiento de la enfermedad, la dosis adecuada de un anticuerpo de la invención (cuando se usa solo o en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales diferentes) dependerá del tipo de enfermedad que se vaya a tratar, del tipo de anticuerpo, de la gravedad y de la evolución de la enfermedad, de si el anticuerpo se administra con fines preventivos o terapéuticos, de la terapia previa, de la historia clínica del paciente y de la respuesta al anticuerpo y del criterio del médico responsable. El anticuerpo se administra adecuadamente al paciente una vez o en una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y de la gravedad de la enfermedad, aproximadamente 1 pg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0,1 mg/kg-10 mg/kg) de anticuerpo puede ser una dosis candidata inicial para la administración al paciente, ya sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones distintas o mediante infusión continua. Una dosificación diaria habitual puede variar desde aproximadamente 1 pg/kg hasta 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, se continuará generalmente con el tratamiento hasta que se produzca una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Una dosis ilustrativa del anticuerpo se encontrará en el intervalo de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. Por tanto, pueden administrarse una o más dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas) al paciente. Dichas dosis pueden administrarse de manera intermitente, por ejemplo, cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de modo que el paciente recibe de aproximadamente dos a aproximadamente veinte o, por ejemplo, aproximadamente seis dosis del anticuerpo). Puede usarse una dosis inicial de carga más alta, seguida de una o más dosis más bajas. La evolución de esta terapia se controla fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales.
Se entiende que cualquiera de las formulaciones o métodos terapéuticos anteriores puede llevarse a cabo usando un inmunoconjugado de la divulgación en lugar de, o además de, un anticuerpo anti-C5.
H. Artículos de fabricación
La siguiente sección H. no está de acuerdo con la invención y está presente con fines ilustrativos únicamente. En otro aspecto de la divulgación, se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento, la prevención y/o el diagnóstico de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un envase y un marcador o un prospecto en el envase o asociado a este. Los envases adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringas, bolsas de solución IV, etc. Los envases pueden formarse a partir de una diversidad de materiales tales como vidrio o plástico. El envase contiene una composición que está sola o combinada con otra composición eficaz para tratar, prevenir y/o diagnosticar la afección y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el envase puede ser una bolsa con solución intravenosa o un vial que tenga un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo de la invención. La etiqueta o el prospecto indica que la composición se usa para tratar la afección de elección. Por otra parte, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer envase con una composición contenida en el mismo, en donde la composición comprende un anticuerpo de la invención; y (b) un segundo envase con una composición contenida en el mismo, en donde la composición comprende otro agente citotóxico o terapéutico. En esta realización de la invención, el artículo de fabricación puede comprender además un prospecto que indica que las composiciones pueden usarse para tratar una afección particular. Como alternativa, o adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo (o tercer) envase que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI, por sus siglas en inglés), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.
Se entiende que cualquiera de los artículos de fabricación anteriores puede incluir un inmunoconjugado de la divulgación en lugar de o además de un anticuerpo anti-C5.
[Ejemplos]
Lo siguiente son ejemplos de métodos y composiciones de la invención. Se entiende que pueden ponerse en práctica varias realizaciones diferentes, dada la descripción general proporcionada anteriormente.
[EJEMPLO 1]
Preparación de C5
I . 1. Expresión y purificación de C5 recombinante humana y de mono cynomolgus
La C5 recombinante humana (número de registro NCBI de GenBank: NP_001726.2, SEQ ID NO: 39) se expresó de forma transitoria utilizando la línea celular FreeStyle293-F (Thermo Fisher, Carlsbad, CA, Estados Unidos). Los medios acondicionados que expresan C5 humana se diluyeron con un mismo volumen de agua milliQ, después se aplicó a una columna de intercambio aniónico Q-sepharose FF o Q-sepharose HP (GE healthcare, Upsala, Suecia), seguido de elución con un gradiente de NaCl. Las fracciones que contenían la C5 humana se agruparon, después, se ajustó la concentración de sal y el pH a NaCl 80 mM y pH 6,4, respectivamente. La muestra resultante se aplicó a una columna de intercambio catiónico SP-sepharose Hp (GE healthcare, Uppsala, Suecia) y se eluyó con un gradiente de NaCl. Las fracciones que contenían C5 humana se agruparon y se sometieron a una columna de hidroxiapatita de cerámica CHT (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, Estados Unidos). A continuación, se aplicó eluido de C5 humana a una columna de filtración en gel Superdex 200 (GE Healthcare, Upsala, Suecia). Las fracciones que contenían C5 humana se agruparon y almacenaron a -150 °C.
La expresión y purificación de C5 recombinante de mono cynomolgus (número de registro NCBI de GenBank: XP_005580972, SEQ ID NO: 44) se realizó de la misma manera que la de la homóloga humana.
1.2. Purificación de C5 de mono cynomolgus (cynoC5) a partir de plasma
Se aplicó una muestra de plasma de mono cynomolgus a SSL7-agarosa (Invivogen, San Diego, CA, Estados Unidos) seguido de elución con acetato de sodio 100 mM, pH 3,5. Las fracciones que contenían cynoC5 se neutralizaron inmediatamente y se sometieron a una columna HP de proteína A (GE healthcare, Uppsala, Suecia) junto con un péptido M agarosa (Invivogen, San Diego, CA, Estados Unidos). La fracción de flujo continuo se aplicó después a una columna de filtración de gel Superdex 200 (GE Healthcare, Upsala, Suecia). Las fracciones que contenían cynoC5 se agruparon y almacenaron a -80 °C.
[EJEMPLO 2]
Generación de anticuerpos anti-C5
2.1. Exploración de anticuerpos
Se prepararon, seleccionaron y sometieron a ensayo anticuerpos anti-C5 de la siguiente manera:
Se inmunizaron por vía intradérmica conejos NZW de doce a dieciséis semanas de vida con C5 humana y/o C5 de mono (50-100 pg/dosis/conejo). Esta dosis se repitió 4-5 veces durante un período de 2 meses. Una semana después de la última inmunización, se extrajeron el bazo y la sangre de los conejos inmunizados. Los linfocitos B específicos de antígeno se tiñeron con antígeno marcado, se clasificaron con clasificador de células FCM (FACS aria Ill, BD), y se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de célula/pocillo junto con 25.000 células/pocillo de células EL4 (European Collection of Cell Cultures) y medio condicionado con linfocitos T de conejo activados diluido 20 veces y se cultivaron durante 7-12 días. Las células EL4 se trataron con mitomicina C (Sigma, número de catálogo M4287) durante 2 horas y se lavaron 3 veces antes. El medio condicionado con linfocitos T de conejo activados se preparó cultivando timocitos de conejo en RPMI-1640 que contenía fitohemaglutinina-M (Roche, número de catálogo 1 1082132-001), forbol 12-miristato 13-acetato (Sigma, número de catálogo P1585) y Fb S al 2 %. Después del cultivo, se recogieron los sobrenadantes del cultivo de linfocitos B para un análisis adicional y se criopreservaron los sedimentos.
Se utilizó un ensayo ELISA para probar la especificidad de los anticuerpos en un sobrenadante de cultivo de linfocitos B. Se recubrió estreptavidina (GeneScript, n.° de catálogo Z02043) sobre un MAXISorp de 384 pocillos (Nunc, número de catálogo 164688) a 50 nM en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, las placas se bloquearon con Blocking One (Nacalai Tesque, número de catálogo 03953-95) diluido 5 veces. La C5 humana o de mono se marcó con NHS-PEG4-Biotina (PIERCe , número de catálogo 21329) y se añadió a las placas de ELISA bloqueadas, se incubaron durante 1 hora y se lavaron. Se añadieron sobrenadantes de cultivo de linfocitos B a las placas de ELISA, se incubaron durante 1 hora y se lavaron. La unión se detectó mediante anticuerpo de cabra anti-IgG de conejoperoxidasa de rábano picante (BETHYL, número de catálogo A120-111P) seguida de la adición de ABTS (KPL, número de catálogo 50-66-06).
Se utilizó un ensayo ELISA para evaluar la unión de anticuerpos contra C5 dependiente del pH. Se añadió anticuerpo de cabra anti-IgG-Fc de conejo (BETHYL, número de catálogo A120-111A) diluido a 1 pg/ml con PBS(-) a un MAXISorp de 384 pocillos (Nunc, número de catálogo 164688), se incubó durante 1 hora. a temperatura ambiente y se bloqueó con Blocking One (Nacalai Tesque, número de catálogo 03953-95) diluido 5 veces. Después de la incubación, se lavaron las placas y se añadieron los sobrenadantes del cultivo de linfocitos B. Las placas se incubaron durante 1 hora, se lavaron y se añadieron 500 pM de C5 humana o de mono biotinilada y se incubaron durante 1 hora. Después de la incubación, las placas se lavaron e incubaron con tampón MES a pH 7,4 (MES 20 mM, NaCl 150 mM y CaCl2 1,2 mM) o tampón m Es a pH 5,8 (MES 20 mM, NaCl 150 mM y EDTA 1 mM) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de la incubación, la unión de C5 biotinilada se detectó mediante conjugado de estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (Thermo Scientific, número de catálogo 21132) seguido de la adición de ABTS (KPL, número de catálogo 50-66-06).
Se utilizó el sistema Octet RED384 (Pall Life Sciences) para evaluar la afinidad y la unión dependiente del pH de los anticuerpos contra C5. Los anticuerpos secretados en el sobrenadante del cultivo de linfocitos B se cargaron en una punta del biosensor de proteína A (Pall Life Sciences) y se sumergieron en 50 nM de C5 humana o de mono en tampón MES de pH 7,4 para analizar la cinética de asociación. La cinética de disociación se analizó tanto en tampón MES a pH 7,4 como en tampón MES a pH 5,8.
Se exploró un total de 41.439 líneas de linfocitos B para determinar la afinidad y la unión dependiente del pH a C5 humana o de mono y se seleccionaron 677 líneas y se denominaron CFA0001-0677. El ARN de las líneas seleccionadas se purificó a partir de sedimentos celulares crioconservados usando kits ZR-96 Quick-RNA (ZYMO RESEARCH, número de catálogo R1053). El ADN que codifica las regiones variables de cadena pesada de los anticuerpos en las líneas seleccionadas, se amplificó mediante PCR de transcripción inversa y se recombinó con el ADN que codifica la región constante de la cadena pesada de F760G4 (SEQ ID No : 33) o F939G4 (SEQ ID NO: 34). El ADN que codifica las regiones variables de cadena ligera de los anticuerpos se amplificó mediante PCR de transcripción inversa y se recombinó con el ADN que codifica la región constante de la cadena ligera de kOMTC (SEQ ID NO: 36). Por separado, se sintetizaron los genes de cadena pesada y ligera de un anticuerpo anti-C5 humanizado existente, eculizumab (EcuH-G2G4, SEQ ID NO: 29 y EcuL-kO, SEQ ID NO: 30). El ADN que codifica el VH (EcuH, SEQ ID NO: 31) se fusionó en marco con el ADN que codifica un CH de IgG4 humana modificada (F760G4, SEQ ID NO: 33), y el ADN que codifica el VL (EcuL, SEQ ID NO: 32) se fusionó en marco al ADN que codifica una región constante de cadena ligera de kO (SEQ ID NO: 37). Cada una de las secuencias codificantes fusionadas también se clonó en un vector de expresión. Los anticuerpos se expresaron en células FreeStyle™ 293-F (Invitrogen) y se purificaron del sobrenadante de cultivo para evaluar la actividad funcional. Las actividades neutralizantes de los anticuerpos se evaluaron probando la inhibición de la actividad del complemento usando un ensayo de lisis de liposomas como se describe en el ejemplo 5.1.
2.2. Agrupación de epítopos mediante ELISA sándwich
Se seleccionaron anticuerpos anti-C5 con alta afinidad, dependencia del pH o actividad neutralizante para un análisis adicional. Se utilizó un ensayo ELISA sándwich para agrupar los anticuerpos seleccionados en diferentes grupos de epítopos que se unen a los mismos epítopos o a epítopos solapantes de la proteína C5. Los anticuerpos de captura no marcados se diluyeron a 1 |jg/ml con PBS (-) y se añadieron a placas MAXISorp de 384 pocilios (Nunc, número de catálogo 164688). Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente y se bloquearon con Blocking One (Nacalai Tesque, número de catálogo 03953-95) diluido 5 veces. Las placas se incubaron durante 1 hora, se lavaron y se añadieron 2 nM de C5 humana y se incubaron durante 1 hora. Después de la incubación, las placas se lavaron y se añadieron anticuerpos de detección marcados (1 jg/m l, biotinilados con NHS-PEG4-Biotina). Después de 1 hora de incubación, la unión de los anticuerpos biotinilados se detectó mediante un conjugado de estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (Thermo Scientific, número de catálogo 21132) seguido de la adición de ABTs (KPL, número de catálogo 50-66-06).
Todos los anticuerpos anti-C5 se utilizaron como anticuerpo de captura y como anticuerpo de detección, y se emparejaron de forma exhaustiva. Como se muestra en la figura 1, los anticuerpos mutuamente competitivos se agruparon en 7 grupos de epítopos: CFA0668, CFA0334 y CFA0319 se agruparon en el epítopo A, CFA0647, CFA0589, CFA0341, CFA0639, CFA0635, CFA0330 y CFA0318 se agruparon en el epítopo B, CFA0538, CFA0501, CFA0599, CFA0307, CFA0366, CFA0305, CFA0675, CFA0666 y CFA0672 se agruparon en el epítopo C, eculizumab y CFA0322 se agruparon en el epítopo D, CFA0329 se agrupó en el epítopo E, CFA0359 y CFA0217 se agruparon en el epítopo F y CFA0579, CFA0328 y CFA0272 se agruparon en el epítopo G. La figura 1 muestra la agrupación de epítopos de algunos de los anticuerpos anti-C5 quiméricos. Las secuencias de los anticuerpos anti-C5 VH y VL agrupados en el epítopo C se enumeran en la tabla 2.
T l 21
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2.3. Humanización y optimización
Para reducir la posible inmunogenicidad de los anticuerpos, se realizó la humanización de la región variable de algunos de los anticuerpos anti-C5. Las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) del anticuerpo de conejo anti-C5 se injertaron en regiones marco (FR) de anticuerpos humanos homólogos utilizando un enfoque de injerto de CDR convencional (Nature 321:522-525 (1986)). Los genes que codifican VH y VL humanizados se sintetizaron y combinaron con un CH de IgG4 humana modificada (SG402, SEQ ID NO: 35) y un CL humano (SKI, SEQ ID NO: 38), respectivamente, y cada una de las secuencias combinadas se clonó en un vector de expresión.
Se examinaron varias mutaciones y combinaciones de mutaciones para identificar mutaciones y combinaciones de mutaciones que mejoraban las propiedades de unión de algunos de los anticuerpos principales. A continuación, se introdujeron múltiples mutaciones en las regiones variables humanizadas para mejorar la afinidad de unión a C5 a un pH neutro o para reducir la afinidad de unión a C5 a un pH ácido. Una de las variantes optimizadas, 305LO5 (VH, SEQ ID NO: 10; VL, SEQ ID NO: 20; HVR-H1, SEQ ID NO: 54; HVR-H2, SEQ ID NO: 64; HVR-H3, SEQ ID NO: 74; HVR-L1, SEQ ID NO: 84; HVR-L2, SEQ ID NO: 94; y HVR-L3, SEQ ID NO: 104), se generó por tanto a partir de CFA0305.
Los anticuerpos se expresaron en células HEK293 cotransfectadas con una mezcla de vectores de expresión de cadena pesada y ligera y se purificaron mediante proteína A.
[EJEMPLO 3]
Caracterización de la unión de los anticuerpos anti-C5
3.1. Expresión y purificación de anticuerpos recombinantes
Los anticuerpos recombinantes se expresaron de forma transitoria utilizando la línea celular FreeStyle293-F (Thermo Fisher, Carlsbad, CA, Estados Unidos). La purificación del medio condicionado que expresa anticuerpos se realizó usando un método convencional que utiliza proteína A. Se llevó a cabo adicionalmente una filtración en gel si era necesario.
3.2. Evaluación de la dependencia del pH
Los parámetros cinéticos de los anticuerpos anti-C5 contra la C5 humana recombinante se evaluaron a pH 7,4 y pH 5,8, a 37 °C utilizando el instrumento BIACORE (marca registrada) T200 (GE Healthcare). Se inmovilizó ProA/G (Pierce) en un chip sensor CM4 usando un kit de acoplamiento de amina (GE Healthcare) de acuerdo con los ajustes recomendados por GE Healthcare. Los anticuerpos y analitos se diluyeron en los correspondientes tampones de ejecución, ACES pH7.4 y pH5.8 (ACES 20 mM, NaCl 150 mM, CaCh 1,2 mM, Tween 20 al 0,05 %, N aN al 0,005 %). Cada anticuerpo se capturó en la superficie del sensor mediante ProA/G. Los niveles de captura de los anticuerpos fueron normalmente de 60 a 90 unidades de resonancia (UR). Después, se inyectó C5 humana recombinante a concentraciones de 10 y 20 nM o 20 y 40 nM seguido de disociación. La superficie se regeneró utilizando NaOH 25 mM. Los parámetros cinéticos en ambas condiciones de pH se determinaron ajustando los sensogramas con el modelo de unión 1:1 utilizando el programa informático de evaluación BIACORE (marca registrada) T200, versión 2.0 (GE Healthcare). En las figuras 2A y 2B se muestran los sensogramas de todos los anticuerpos. La velocidad de asociación (ka), la velocidad de disociación (kd) y la afinidad de unión (KD) de los anticuerpos se enumeran en la tabla 3. Todos los anticuerpos, excepto CFA0330 (VH, SEQ ID NO: 21 y VL, SEQ ID NO: 25) y CFA0341 (VH, SEQ ID NO: 22 y VL, SEQ ID NO: 26), mostraron una velocidad de disociación relativamente más rápida a pH 5,8 que a pH 7,4.
______________________________________[Tabla 31______________________________________ Parámetros cinéticos de anticuerpos anti-C5 en condiciones de pH 7,4 y pH 5,8 Nombre kd a pH kd a pH
anticue ka 7,4 KD ka
5,8 KD
CFA0305 3.82E+04 5.89E-04 1,54E-08 4.27E+04 1.83E-02 4.30E-07
CFA0307 3.24E+05 2.63E-03 8.13E-09 2.04E+05 3.34E-02 1.64E-07
CFA0366 1.04E+06 9.34E-03 8.99E-09 9.35E+05 7.03E-02 7,52E-08
CFA0501 4.74E+05 1.69E-03 3.56E-09 1.50E+05 2.62E-02 174E-07
CFA0538 4.73E+05 1.85E-03 3,91 E-09 1.22E+05 3,01 E-02 2,46E-07
CFA0599 4.74E+05 2,81 E-03 5.93E-09 4.54E+05 3.73E-02 8,21 E-08
CFA0666 3,65E+05 6.26E-04 1,71 E-09 2.82E+05 9.39E-03 3.33E-08
CFA0672 5.23E+05 1.83E-04 3,51 E-10 7,11E+04 9.78E-03 1,38E-07
CFA0675 3,83E+05 4.12E-04 1.08E-09 3.89E+05 6,61 E-03 1.70E-08
305-LO5 4.48E+05 2,11E-04 4,71 E-10 2.03E+06 2.85E-02 1,40E-08
CFA0330 1,66E+06 2.02E-04 1.22E-10 1.22E+06 2.24E-04 1,84E-10
CFA0341
Figure imgf000044_0001
6.28E+05 9.77E-05 1.55E-10 1.24E+06 7.39E-05 5,95E-11
3.3. Comprobación de reactividad cruzada
Para observar la reactividad cruzada de los anticuerpos anti-C5 contra C5 humana (hC5) y C5 de mono cynomolgus (cynoC5), se realizó el análisis cinético BIACORE (marca registrada). La configuración del ensayo fue la misma que la descrita en el ejemplo 3.2, se inyectó cynoC5 recombinante a concentraciones de 2, 10 y 50 nM. Los parámetros cinéticos se determinaron mediante el mismo ajuste de datos que se describe en el ejemplo 3.2. La cinética de unión y la afinidad a pH 7,4 se enumeran en la tabla 4. Los parámetros cinéticos contra hC5 presentados en la tabla 4 son los resultados del ejemplo 3.2. Todos los anticuerpos anti-C5, excepto CFA0672, mostraron una KD comparable hacia hC5 y cynoC5. La Kd de CFA0672 hacia cynoC5 fue 8 veces más débil que hacia hC5.
____________________________________ [Tabla 4]____________________________________ Cinética de unión y afinidad de los anticuerpos anti-C5 contra hC5 y cynoC5 a pH 7,4 Nombre l afinidad contra hC5 afinidad contra cynoCS
anticuer ka kd KD ka kd KD
CFA0305 3,82E+04 5.89E-04 1.54E-08 1.21E+04 6.70E-04 5.54E-09
CFA0307 3,24E+05 2.63E-03 8.13E-09 2.90E+05 2,23E-03 7.68E-09
CFA0366 1.04E+06 9.34E-03 8.99E-09 5.04E+05 9,04E-03 1,79E-08
CFA0501 4.74E+05 1.69E-03 3.56E-09 2.66E+05 1,56E-03 5.88E-09
CFA0538 4.73E+05 1.85E-03 3,91 E-09 3.05E+05 1,66E-03 5.44E-09
CFA0599 4.74E+05 2.81E-03 5.93E-09 5.42E+05 2,35E-03 4,33E-09
CFA0666 3.65E+05 6.26E-04 1,71 E-09 3.14E+05 4.93E-04 1,57E-09
CFA0672 5,23E+05 1.83E-04 3,51 E-10 6,41 E+05 1.85E-03 2,88E-09
CFA0675
Figure imgf000044_0002
3,83E+05 4.12E-04 1,08E-09 2.94E+05 3J8E-04 1,29E-09
[EJEMPLO 4]
Mapeo de epítopos de anticuerpos anti-C5
4.1. Unión de MAb anti-C5 a péptidos derivados de la cadena beta de C5
Se probaron anticuerpos monoclonales (MAb, por las siglas del inglés monoclonal antibodies) anti-C5 para determinar su unión a péptidos derivados de la cadena beta de C5 en análisis de transferencia Western. Los péptidos de C5: 19­ 180, 161-340, 321-500, y 481-660, fusionados a la etiqueta GST (pGEX-4T-1, GE Healthcare Life Sciences, 28-9545 49) se expresaron en E. coli (DH5alpha, TOYOBO, DNA-903). Las muestras de E. coli se recogieron después de la incubación con isopropil beta-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) 1 mM durante 5 horas a 37 °C y se centrifugaron a 20000 xg durante 1 min para obtener sedimentos. Los sedimentos se suspendieron con una solución tampón de muestra (2ME+) (Wako, 191-13272) y se utilizaron para el análisis de transferencia Western. La expresión de cada péptido se confirmó con anticuerpo anti-GST (Abcam, ab9085) (figura 3). La flecha indica péptidos de C5 fusionados con GST (46-49 kDa). Los mAb anti-C5: CFA0305, CFA0307, CFA0366, CFA0501, CFA0538, CFA0599, CFA0666, CFA0672 y CFA0675, se unieron a 19-180 de C5 (figura 3).
4.2. Expresión y purificación del dominio MG1-MG2 (1-225) de C5 humana
El dominio MG1-MG2 recombinante (SEQ ID NO: 43) de la cadena beta de C5 humana se expresó de forma transitoria utilizando la línea celular FreeStyle293-F (Thermo Fisher, Carlsbad, CA, Estados Unidos). Los medios condicionados que expresaban el dominio MG1-MG2 se diluyeron con 1/2 volumen de agua milliQ, seguido de la aplicación a una columna de intercambio aniónico Q-sepharose FF (GE healthcare, Upsala, Suecia). La fracción de flujo continuo de la columna de intercambio aniónico se ajustó a pH 5,0 y se aplicó a una columna de intercambio catiónico SP-sepharose HP (GE healthcare, Uppsala, Suecia) y se eluyó con un gradiente de NaCl. Las fracciones que contenían el dominio MG1-MG2 se recogieron del eluyente y posteriormente se sometieron a una columna de filtración en gel Superdex 75 (GE healthcare, Uppsala, Suecia) equilibrada con 1x PBS. Las fracciones que contenían el dominio MG1-MG2 se agruparon y almacenaron a -80 °C.
4.3. Capacidad de unión al dominio MG1-MG2
La capacidad de unión de los anticuerpos anti-C5 hacia el dominio MG1-MG2 se midió utilizando los mismos ajustes de ensayo que se describen en el ejemplo 3.2, excepto que las mediciones solo se realizaron en condiciones de pH 7.4. El dominio MG1-MG2 se inyectó a concentraciones de 20 nM y 40 nM. Como se muestra en la figura 4, todos los anticuerpos excepto eculizumab-F760G4 mostraron un aumento de la respuesta de unión, lo que indica que estos anticuerpos son aglutinantes de MG1-MG2. Eculizumab (F760G4); que es un aglutinante de cadena alfa conocido, no mostró unión al dominio MG1-MG2.
4.4. Unión de los MAb anti-C5 a péptidos derivados del dominio MG1-MG2 de C5
En un análisis de transferencia Western se probó la unión de los MAb anti-C5 a péptidos derivados del dominio MG1-MG2. Los péptidos de C5: 33-124, 45-124, 52-124, 33-111,33-108 y 45-111 (SEQ ID NO: 40), fusionados con etiqueta GST, se expresaron en E. coli. Las muestras de E. coli se recogieron después de la incubación con IPTG 1 mM durante 5 horas a 37 °C y se centrifugaron a 20000 xg durante 1 min para obtener sedimentos. Los sedimentos se suspendieron con la solución tampón de muestra (2ME+) y se usaron para análisis de transferencia Western. La expresión de péptidos derivados de C5 se confirmó con anticuerpo anti-GST (figura 5A). CFA0305 se unió solamente al péptido de 33-124 (figura 5B). CFA0305 se unió a la cadena beta de C5 humana recombinante (rhC5) (aproximadamente 70 kDa), que se utilizó como control. La figura 5C resume la reacción de los MAb anti-C5 a péptidos derivados de C5.
4.5. Unión de los MAb anti-C5 a mutantes de C5
Dado que se predijo que tres restos de aminoácidos en la cadena beta de C5: E48, D51 y K109, estaban implicados en la unión entre C5 y los MAb anti-C5 mediante el análisis de la estructura cristalina, se probó la unión de los MAb anti-C5 a mutantes puntuales de C5 humana en un análisis de transferencia Western. Los mutantes puntuales de C5, en los que cualquiera de E48, D51 y K109 estaba sustituido por alanina, se expresaron en células FS293 mediante lipofección. Los medios de cultivo se recogieron 5 días después de la lipofección y, posteriormente, se usaron para transferencia Western. La SDS-PAGE se realizó en condiciones reductoras. Los resultados se muestran en la figura 6. Eculizumab se unió a la cadena alfa de C5 de tipo silvestre (TS) y a tres mutantes puntuales de C5, mientras que CFA0305 se unió fuertemente a la cadena beta de C5 de TS, el mutante E48A de C5 lo hizo débilmente y no se unió a la cadena beta de los mutantes D51A y K109A de C5, lo que indica que estos 3 restos de aminoácidos están implicados en las interacciones anticuerpo/antígeno. La tabla 5 presenta un sumario del análisis de transferencia Western de los MAb anti-C5 (CFA0305, CFA0307, CFA0366, CFA0501, CFA0538, CFA0599, CFA0666, CFA0672 y CFA0675). Los MAb anti-C5 se agrupan en el mismo epítopo C, pero los patrones de unión son ligeramente diferentes entre los anticuerpos, lo que sugiere las regiones de unión de C5 a los MAb anti-C5 son parecidas pero no idénticas entre sí.
[Tabla 5]
Sumario de la reacción de los MAb anti-C5 a mutantes de C5
TS E48A D51A K109A
Eculizumab 4
CFA0305 + - -
CFA0307 + - - -
CFA0366 + - - -
CFA0501 + - -
(continuación)
Figure imgf000046_0002
T E4 A D 1A K1 A
Figure imgf000046_0001
4.6. Análisis de unión BIACORE (marca registrada) de anticuerpos anti-C5 con mutantes de C5
Para probar si los restos E48, G51 y K109 están realmente implicados en las interacciones anticuerpo/antígeno, se realizó el análisis de unión BIACORE (marca registrada). Se prepararon tres mutantes de C5: E48A, G51A y K109A, como se describe en el ejemplo 4.5. Se prepararon muestras de sobrenadante de cultivo que contenían el mutante de C5 sobreexpresado en células FS293 a 40 pg/ml del mutante de C5. Para el análisis de unión de BIACORE (marca registrada), la muestra se diluyó diez veces con tampón de ejecución de BIACORE (marca registrada) (ACES pH7,4, 10 mg/ml de BSA, 1 mg/ml de carboximetil dextrano) hasta una concentración de muestra final de 4 pg/ml del mutante de C5.
Las interacciones de los tres mutantes de C5 con anticuerpos anti-C5 se evaluaron a 37 °C con el instrumento BIACORE (marca registrada) T200 (GE Healthcare), usando la condición de ensayo descrita en el ejemplo 3.2. Se utilizó tampón ACES pH 7,4 que contenía 10 mg/ml de BSA, 1 mg/ml de carboximetil dextrano como tampón de ejecución. Eculizumab-F76OG4 y 305LO5 se capturaron en diferentes células de flujo mediante anticuerpo monoclonal de ratón anti-IgG humana, específico del fragmento Fc (GE Healthcare). La celda de flujo 1 se utilizó como superficie de referencia. Se inyectaron proteínas C5 de tipo silvestre y mutantes sobre la superficie del sensor a una concentración de 4 pg/ml para interactuar con los anticuerpos capturados. Al final de cada ciclo de análisis, la superficie del sensor se regeneró con MgCh 3 M. Los resultados se analizaron con el programa informático Bia Evaluation, versión 2.0 (GE Healthcare). Las curvas de la celda de flujo de referencia (celda de flujo 1) y las inyecciones en blanco de tampón de ejecución se restaron de las curvas de la celda de flujo con los anticuerpos capturados.
Como se muestra en la figura 7, los tres mutantes de C5 podrían unirse a eculizumab con un perfil de unión similar en comparación con la C5 de tipo silvestre. Para el 305LO5, los tres mutantes mostraron una respuesta de unión más baja a 305LO5 en comparación con la C5 de tipo silvestre. Los mutantes D51A y K109A redujeron la unión de C5 en 305LO5 al nivel inicial.
4.7. Identificación de restos de His en C5 que contribuyen a las interacciones dependientes del pH entre el anticuerpo anti-C5 y C5
El análisis de la estructura cristalina reveló que 3 restos de histidina en C5 humana se encuentran en la interfaz anticuerpo/antígeno. Se sabe que un resto de histidina con un pKa habitual de aproximadamente 6,0, contribuye a las interacciones proteína-proteína dependientes del pH (Igawa et al., Biochim Biophys Acta 1844(11):1943-1950 (2014)). Para investigar cuáles de los restos de His en la interfaz anticuerpo/antígeno contribuyen a las interacciones dependientes del pH entre el anticuerpo anti-C5 y C5, se realizó el análisis de unión BIACORE (marca registrada). Se prepararon tres mutantes de C5 humana con una sola mutación His (H70Y, H72Y y H110Y) y un mutante con una mutación doble His (H70Y H110Y) de la siguiente manera: se expresaron mutantes de una sola His en los que cualquiera de H70, H72 y H110 está sustituida por tirosina, y un mutante de doble His en el que tanto H70 como H110 están sustituidos por tirosina, en células FS293 mediante lipofección. Las propiedades de unión al antígeno de los mutantes His de C5 a 305LO5, un anticuerpo anti-C5 dependiente del pH, se determinaron mediante un ensayo BIACORE (marca registrada) modificado como se describe en el ejemplo 4.6. En resumen, se integró una fase de disociación adicional a pH 5,8 en el ensayo BIACORE (marca registrada) inmediatamente después de la fase de disociación a pH 7,4 para evaluar la disociación dependiente del pH entre el anticuerpo y el antígeno de los complejos formados a pH 7,4. La velocidad de disociación a pH 5,8 se determinó procesando y ajustando datos usando el programa informático de ajuste de curvas Scrubber 2.0 (BioLogic Software).
Como se muestra en la figura 8, la mutación de una sola His de C5 en H70 o H110 y la mutación doble de His (H70 H110) no afectaron la unión de C5 al 305LO5 a pH neutro. Mientras tanto, la mutación de una sola His en H72 mostró un deterioro significativo de la unión de C5 a 305LO5. En la tabla 6 se muestran las velocidades de disociación a pH 5,8 de los mutantes His de C5 y de la proteína C5 ts. Como se muestra en la tabla 6, la C5 ts mostró la disociación más rápida de 305LO5 a pH 5,8
_________________________________[T a b la 61________________________________ valor de la velocidad de disociación a PH 5,8 de los mutantes His de C5 que se unen a 305LOS__________________________________ Antigenos kd (1/s)
C 5 ts 1,1E-2
C 5 -H 70 Y 5.3 E -3
C 5 -H 110 Y 9.3 E -3
________________________ (continuación)_______________________
valor de la velocidad de disociación a PH 5,8 de los mutantes His de C5 que se unen a 305LQ5_________________________________
Antígenos kd (1/s)
C5-H70Y, H110Y_________3,9E-3______________________________
[EJEMPLO 5]
Actividad inhibidora de los anticuerpos anti-C5 sobre la activación de C5
5.1. Inhibición de la lisis de liposomas activada por el complemento mediante los MAb anti-C5
Los MAb anti-C5 se probaron para determinar la inhibición de la actividad del complemento mediante un ensayo de lisis de liposomas. Se mezclaron treinta microlitros de suero humano normal (6,7 %) (Biopredic, SER018) con 20 pl del MAb diluido en una placa de 96 pocillos y se incubaron en un agitador durante 30 min a 25 °C. Se transfirieron liposomas sensibilizados con los anticuerpos contra dinitrofenilo (Autokit CH50, Wako, 995-40801) a cada pocillo y la placa se colocó en un agitador durante 2 min a 25 °C. Se añadieron cincuenta microlitros de solución de sustrato (Autokit CH50) a cada pocillo y se mezcló agitando durante 2 min a 25 °C. La mezcla final se incubó a 37 °C durante 40 minutos y, posteriormente, se midió la DO a 340 nm de la mezcla. El porcentaje de lisis de los liposomas se definió como 100 X [(DOMAb - DOsuero y fondo de liposomas)]/[(DO sin MAb - DOfondo de suero y liposomas.)]. La figura 9A muestra que los Mab anti-C5: CFA0305, 0307, 0366, 0501, 0538, 0599, 0666, 0672 y 0675, inhibieron la lisis de los liposomas. Dos anticuerpos no dependientes del pH: CFA0330 y 0341, también inhibieron la lisis (figura 9B).
5.2. Inhibición de la generación de C5a mediante los MAb anti-C5
Los MAb anti-C5 se probaron para determinar la generación de C5a durante la lisis de liposomas para confirmar que los MAb anti-C5 inhiben la escisión de C5 en C5a y C5b. El nivel de C5a en los sobrenadantes del ensayo de lisis de liposomas se cuantificó usando un kit ELISA para C5a (R&D systems, DY2037). Todos los MAb inhibieron la generación de C5a en los sobrenadantes de manera dependiente de la dosis (figuras 10A y 10B).
5.3. Inhibición de la hemólisis activada por el complemento mediante los MAb anti-C5
Los MAb anti-C5 se probaron para determinar la inhibición de la actividad clásica del complemento en un ensayo hemolítico. Los glóbulos rojos de pollo (cRBC, por sus siglas en inglés) (Innovative research, IC05-0810) se lavaron con gelatina/solución salina tamponada con veronal que contenía MgCh 0,5 mM y CaCl20,15 mM (GVB++) (Boston BioProducts, IBB-300X), y posteriormente se sensibilizaron con anticuerpo anti-RCB de pollo (Rockland 103-4139) a 1 pg/ml durante 15 minutos a 4 °C. Las células se lavaron después con GVB++ y se suspendieron en el mismo tampón a 5 x 107 células/ml. En una placa de microensayo de fondo redondo de 96 pocillos distinta, se mezclaron 50 micro 1 de suero humano normal (20 %) (Biopredic, SER019) con 50 micro 1 de Mab diluido y se incubaron en un agitador a 37 °C durante 30 minutos. A continuación, a los pocillos que contenían el suero, se añadieron sesenta pl de suspensión de cRBC sensibilizados y la mezcla de anticuerpos se incubó a 37 °C durante 30 minutos. Después de la incubación, la placa se centrifugó a 1000 xg durante 2 minutos a 4 °C. Los sobrenadantes (100 micro 1) se transfirieron a pocillos en una placa de microensayo de fondo plano de 96 pocillos para medir la DO a 415 nm con una longitud de onda de referencia a 630 nm. El porcentaje de hemólisis se definió como 100 x [(DO MAb - DOsuero y crbc)]/[(DO sin MAb - DO fondo de suero y crbc)]. La figura 11 muestra que los MAb anti-C5: CFA0305 y 305LO5, inhibieron la hemólisis de los cRBC.
5.4. Inhibición de la vía alternativa del complemento mediante los MAb anti-C5
Se realizó un ensayo hemolítico para la vía alternativa de forma similar al ensayo hemolítico de la vía clásica. La sangre extraída de un conejo blanco de Nueva Zelanda (InVivos), se mezcló con el mismo volumen de solución de Alsever (Sigma, A3551) y la mezcla se usó como RBC de conejo (rRBC, por las siglas del inglés, glóbulos rojos de conejo). Los rRBC se lavaron con GVB complementado con MgCh 2 mM y EGTA 10 mM y se suspendieron en el mismo tampón a 7 x 108 células/ml. En una placa de microensayo de fondo redondo de 96 pocillos, se mezclaron 40 micro 1 de suero humano normal (25 %) (Biopredic, SER019) con 40 micro 1 de Mab diluido y se incubaron en un agitador a 37 °C durante 30 minutos. A continuación, se añadieron veinte microlitros de suspensión de rRBC a los pocillos que contenían el suero, y la mezcla de anticuerpos se incubó a 37 °C durante 60 minutos. Después de la incubación, la placa se centrifugó a 1000 xg durante 2 minutos a 4 °C. Los sobrenadantes (70 micro 1) se transfirieron a pocillos en una placa de microensayo de fondo plano de 96 pocillos para medir la DO a 415 nm con una longitud de onda de referencia a 630 nm. La figura 12 muestra que los MAb anti-C5: CFA0305 y CFA0672, inhibieron la hemólisis de los rRBC, lo que indica que estos anticuerpos inhiben las vías alternativas del complemento.
[EJEMPLO 6]
Optimización de anticuerpos monoclonales anti-C5 (variantes de 305)
Se introdujeron varias mutaciones en la región variable optimizada del anticuerpo anti-C5 305LO5 para mejorar aún más sus propiedades, y se generaron las regiones variables optimizadas 305LO15, 305LO16, 305LO18, 305LO19, 305LO20, 305LO22 y 305LO23. Las secuencias de aminoácidos de VH y VL de las variantes de 305 se enumeran en las tablas 7 y 8, respectivamente. Los genes que codifican el VH humanizado se combinaron con una variante de CH de IgG1 humana modificada SG115 (SEQ ID NO: 114) y variantes de CH de IgG4 CH humana modificada SG422 (SEQ ID NO: 115) o SG429 (SEQ ID No : 116). Los genes que codifican el VL humanizado se combinaron con un CL humano (SKI, SEQ ID NO: 38). Por separado, los genes de cadena pesada y ligera que codifican un anticuerpo anti-C5 humanizado, BNJ441 (BNJ441H, SEQ ID NO:149; BNJ441L, Se Q ID NO: 150), se sintetizaron y cada uno se clonó en un vector de expresión.
Los anticuerpos se expresaron en células HEK293 cotransfectadas con una combinación de vectores de expresión de cadena pesada y ligera y se purificaron mediante la proteína A.
Figure imgf000048_0002
T l
Figure imgf000048_0001
[EJEMPLO 7]
Caracterización de la unión de anticuerpos anti-C5 (variantes de 305)
Los parámetros cinéticos de los anticuerpos anti-C5 contra C5 humana recombinante se evaluaron a 37 °C usando el instrumento BIACORE (marca registrada) T200 (GE Healthcare) en tres condiciones diferentes; (1) tanto la asociación como la disociación estaban a pH 7,4, (2) tanto la asociación como la disociación estaban a pH 5,8, y (3) la asociación estaba a pH 7,4 pero la disociación estaba a pH 5,8. Se inmovilizó ProA/G (Pierce) en un chip sensor CM1 usando un kit de acoplamiento de amina (GE Healthcare) de acuerdo con los ajustes recomendados por GE Healthcare. Los anticuerpos y analitos para la condición (1) y (3) se diluyeron en tampón ACES pH7,4 (ACES 20 mM, NaCl 150 mM, CaCI2 1,2 mM, Tween 20 al 0,05 %, N aN al 0,005 %) y para la condición (2) se diluyeron en tampón ACES pH 5,8 (ACES 20 mM, NaCI 150 mM, CaCl21,2 mM, Tween 20 al 0,05 %, NaN3 al 0,005 %). Cada anticuerpo se capturó en la superficie del sensor mediante ProA/G. Los niveles de captura de los anticuerpos fueron normalmente de 60 a 90 unidades de resonancia (UR). Después, se inyectó C5 humana recombinante de 3 a 27 nM o 13,3 a 120 nM preparada mediante una dilución en serie de factor tres, seguido de disociación. La superficie se regeneró utilizando NaOH 25 mM. Los parámetros cinéticos en la condición (1) y (2) se determinaron ajustando los sensogramas con un modelo de unión 1:1 y la velocidad de disociación en la condición (3) se determinó ajustando los sensogramas con una disociación 1:1 para el modelo MCK usando el programa informático de evaluación BIACORE (marca registrada) T200, versión 2.0 (GE Healthcare). La dependencia del pH de todos los anticuerpos se mostró como la relación de la velocidad de disociación de la condición (2) y (1).
En la tabla 9 se indica la velocidad de asociación (ka), la velocidad de disociación (kd), la afinidad de unión (KD) y la dependencia del pH. Todos los anticuerpos mostraron una velocidad de disociación más rápida a pH 5,8 que a pH 7,4 y su dependencia del pH fue de alrededor de 20 veces.
[Tabla 9]
Parámetros cinéticos de las variantes de los anticuerpos anti-C5 en condiciones de pH 7,4 y pH 5,8
7,4 7,4 kd 5,8 5,8 kd 7,4 5,8 kd dependencia ka (1/Ms) (1/s) KD (M) ka (1/Ms) (1/s) KD (M) 1/s del pH L 015- 3.00E- 6.57E-
SG422 1.40E+06 4,19E-04 10 1.34E+05 8.79E-03 08 21,0
L 015- 2,70E- 8,72E-
SG115 1,31 E+06 3,54E-04 10 9.49E+04 8.27E-03 08 23,4
L 016- 3,21 E- 7,OSE­
SG422 1.28E+06 4,12E-04 10 1.09E+05 8.69E-03 OS 21,1
L018- 3,14E- 6,24E-
SG422 1.36E+06 4.26E-04 10 1,39E+05 8.65E-03 08 20,3
L019- 3,46E- 6,00E-
SG422 1,37E+06 4.76E-04 10 1,38E+05 8.30E-03 08 17,4
L020- 3,24E- OCIE­
SG115 1.44E+06 4.67E-04 10 1.41E+05 8.18E-03 OS 17,5
L020- 3,49E- 5,99E-
SG422 1,35E+06 4.70E-04 10 1,36E+05 8,15E-03 08 17,3
L022- 2,62E- 5,45E-
SG115 1.46E+06 3.82E-04 10 1.71E+05 9.30E-03 08 24,3
L023- 2,77E- GUIE­
SG115
Figure imgf000049_0001
1.53E+06 4.23E-04 10 1.33E+05 8.55E-03 OS
Figure imgf000049_0002
20,2
La afinidad de unión de los anticuerpos anti-C5 (BNJ441, eculizumab y una variante de 305) a C5 humana recombinante a pH 7,4 y pH 5,8 se determinaron a 37 °C usando un instrumento BIACORE (marca registrada) T200 (GE Healthcare) para evaluar el efecto del pH sobre la unión del antígeno. Se inmovilizó anticuerpo policlonal de cabra anti-IgG (Fc) humana (KPL n.° 01-10-20) en un chip sensor CM4 usando un kit de acoplamiento de amina (GE Healthcare) de acuerdo con los ajustes recomendados por el fabricante. Los anticuerpos y analitos se diluyeron en tampón ACES pH 7,4 o en tampón ACES pH 5,8 que contenía ACES 20 mM, NaCl 150 mM, CaCl 21,2 mM, Tween 20 al 0,05 % y NaN3 al 0,005 %. Los anticuerpos se capturaron en la superficie del sensor utilizando el método anti-Fc, los niveles de captura fueron normalmente de 50 a 80 unidades de resonancia (UR). La C5 humana recombinante se preparó mediante una dilución en serie de factor tres a partir de 27 nM para las condiciones de ensayo a pH 7,4, o de 135 nM para las condiciones de ensayo a pH 5,8. La superficie se regeneró utilizando HCl 20 mM, Tween 20 al 0,01 %. Los datos se procesaron y ajustaron con un modelo de unión 1:1 utilizando el programa informático BiaEvaluation 2.0 (GE Healthcare).
La afinidad de unión (KD) de BNJ441, eculizumab, y de la variante de 305 por la C5 humana recombinante a pH 7,4 y pH 5,8 se muestra en la tabla 10. La variante de 305 mostró una relación de (KD a pH 5,8)/(KD a pH 7,4) de casi 800, 8 veces más alta que BNJ441 que solo mostró una relación de (KD a pH 5,8)/(KD a pH 7,4) de 93.
[Tabla 10]
KD (M)
Anticuerpo relación de KD a pH 5,8/pH 7,4
pH 7,4 pH 5,8
Variante de
305LO5 1.66E-10 1.32E-07 795
Eculizumab 1.42E-10 2.64E-09 19
BNJ441 1.38E-09 1.28E-Q7 93
[EJEMPLO 8]
Actividad inhibidora de anticuerpos anti-C5 (variantes de 305) sobre la activación de C5
8.1. Inhibición de la lisis de liposomas activada por el complemento mediante los MAb anti-C5
Los MAb anti-C5 se probaron para determinar la inhibición de la actividad del complemento mediante un ensayo de lisis de liposomas. Se mezclaron treinta microlitros de suero humano normal (6,7 %) (Biopredic, SER019) con 20 j l de MAb diluido en una placa de 96 pocillos y se incubaron en un agitador durante 30 min a temperatura ambiente. La solución de liposomas sensibilizados con anticuerpos contra dinitrofenilo (Autokit CH50, Wako, 995-40801) se transfirió a cada pocillo y se colocó en un agitador durante 2 min a 37 °C. Se añadieron cincuenta microlitros de solución de sustrato (Autokit CH50) a cada pocillo y se mezcló agitando durante 2 min a 37 °C. La mezcla final se incubó a 37 °C durante 40 minutos y, posteriormente, se midió la DO a 340 nm. El porcentaje de lisis de los liposomas se definió como 100 X [(DOMAb - DO fondo de suero y liposomas.)]/[(DO sin MAb - DO fondo de suero y liposomas)]. La figura 13 muestra que los MAb anti-C5: 305LO15-SG422, 305LO16-SG422, 305LO18-SG422, 305LO19-SG422, 305LO20-SG422 y 305LO20-SG115, inhibieron la lisis de los liposomas. Dos anticuerpos con variantes de Fc: 305LO15-SG115 y 305LO23-SG429, también inhibieron la lisis de los liposomas (figura 14).
Los MAb anti-C5 se probaron para determinar la inhibición de C5 humana recombinante (SEQ ID NO: 39). Se mezclaron diez microlitros de suero humano deficiente en C5 (Sigma, C1163) con 20 j l de MAb diluido y 20 j l de C5 recombinante (0,1 jg/m l) en una placa de 96 pocillos y se incubaron en un agitador durante 1 hora. a 37 °C. Los liposomas (Autokit CH50) se transfirieron a cada pocillo y se colocaron en un agitador durante 2 minutos a 37 °C. Se añadieron cincuenta microlitros de solución de sustrato (Autokit CH50) a cada pocillo y se mezclaron agitando durante 2 minutos a 37 °C. La mezcla final se incubó a 37 °C durante 180 minutos y, posteriormente, se midió la DO a 340 nm. El porcentaje de lisis de los liposomas se definió como se ha indicado anteriormente. La figura 15 muestra que los MAb anti-C5: 305LO22-SG115, 305LO22-SG422, 305LO23-SG115 y 305LO23-SG422, inhibieron la lisis de los liposomas.
8.2. Inhibición de la generación de C5a mediante los MAb anti-C5
Los MAb anti-C5 se probaron para determinar la generación de C5a durante la lisis de liposomas para confirmar que los MAb anti-C5 inhiben la escisión de C5 en C5a y C5b. Los niveles de C5a en los sobrenadantes de un ensayo de lisis de liposomas se cuantificaron usando un kit ELISA para C5a (R&D systems, DY2037). Todos los MAb inhibieron la generación de C5a en los sobrenadantes de una manera dependiente de la dosis (figuras 16 y 17).
8.3. Medición de la actividad del complemento en plasma de monos cynomolgus
Los MAb anti-C5 se probaron para determinar la inhibición de la actividad del complemento en plasma de monos cynomolgus. Los Mab anti-C5 se administraron por vía intravenosa a los monos (20 mg/kg) y periódicamente se extrajeron muestras de plasma hasta el día 56. Los glóbulos rojos de pollo (cRBC, por sus siglas en inglés) (Innovative research, IC05-0810) se lavaron con gelatina/solución salina tamponada con veronal que contenía MgCh 0,5 mM y CaCl20,15 mM (GVB++) (Boston BioProducts, IBB-300X), y posteriormente se sensibilizaron con anticuerpo anti-RCB de pollo (Rockland 103-4139) a 1 jg/m l durante 15 minutos a 4 °C. Las células se lavaron después con GVB++ y se suspendieron en el mismo tampón a 1 x 108 células/ml. En una placa de microensayo de fondo redondo de 96 pocillos distinta, se incubó plasma de mono se incubó con los cRBC sensibilizados a 37 °C durante 20 minutos. Después de la incubación, la placa se centrifugó a 1000 xg durante 2 minutos a 4 °C. Los sobrenadantes se transfirieron a pocillos en placas de microensayo de fondo plano de 96 pocillos para medir la DO a 415 nm con una longitud de onda de referencia a 630 nm. El porcentaje de hemólisis se definió como 100 x [(DOpostadministración - DO fondo de plasma y crbc)]/ [(DO preadministración - DO fondo de plasma y crbc)]. La figura 18 muestra que los MAb anti-C5: 305LO15-SG422, 305LO15-SG115, 305LO16-SG422, 305LO18-SG422, 305LO19-SG422, 305LO20-SG422, 305LO20-SG115 y 305LO23-SG115, inhibieron la actividad del complemento en el plasma.
8.4. Inhibición de la actividad biológica de variantes de C5 mediante los MAb anti-C5
Los MAb anti-C5 se probaron para determinar la inhibición de variantes de C5 humana recombinante: V145I, R449G, V802I, R885H, R928q , D966Y, S1310N y E1437D. Se ha notificado que los pacientes con PNH, que tienen una mutación R885H en C5, muestran una mala respuesta a eculizumab (véase, por ejemplo, Nishimura et al., New Engl. J. Med. 370:632-639 (2014)). Cada una de las variantes de C5 humana, se expresó en células FS293 y los sobrenadantes se utilizaron para el siguiente estudio. Se mezclaron diez microlitros de suero humano deficiente en C5 (Sigma, C1163) con 20 j l de MAb diluidos y 20 j l de medio de cultivo celular que contenía una variante de C5 recombinante (2-3 jg/m l) en una placa de 96 pocillos y se incubaron en un agitador durante 0,5 horas. a 37 °C. Los liposomas (Autokit CH50) se transfirieron a cada pocillo y se colocaron en un agitador durante 2 minutos a 37 °C. Se añadieron cincuenta microlitros de solución de sustrato (Autokit CH50) a cada pocillo y se mezclaron agitando durante 2 minutos a 37 °C. La mezcla final se incubó a 37 °C durante 90 minutos y, posteriormente, se midió la DO a 340 nm. El porcentaje de lisis de los liposomas se definió como se ha indicado anteriormente. La figura 19 muestra que un MAb anti-C5 (eculizumab) no inhibió la variante R885H de C5, pero inhibió las otras variantes probadas. La figura 20 muestra que el MAb anti-C5 (una variante de 305) inhibió todas las variantes de C5 probadas.
8.5. Inhibición de la lisis de liposomas activada por el complemento mediante los MAb anti-C5
Los MAb anti-C5 se probaron para determinar la inhibición de la actividad del complemento mediante un ensayo de lisis de liposomas. Se mezclaron treinta microlitros de suero humano normal (6,7 %) (Biopredic, SER019) con 20 j l de MAb diluido en una placa de 96 pocillos y se incubaron en un agitador durante 30 min a temperatura ambiente. La solución de liposomas sensibilizados con anticuerpos contra dinitrofenilo (Autokit CH50, Wako, 995-40801) se transfirió a cada pocillo y se colocó en un agitador durante 2 min a 25 °C. Se añadieron cincuenta microlitros de solución de sustrato (Autokit CH50) a cada pocillo y se mezcló agitando durante 2 min a 25 °C. La mezcla final se incubó a 37 °C durante 45 minutos y, posteriormente, se midió la DO a 340 nm. El porcentaje de lisis de liposomas se definió como 100 X [(D°MAb - DOfondo de suero y liposomas)]/[(DO sin MAb - DOfondo de suero y liposomas.)]. La figura 21 muestra que los MAb anti-C5, BNJ441 y la variante de 305, inhibieron la lisis de los liposomas, y que la variante de 305 tiene una actividad inhibidora más fuerte que BNJ441.
[EJEMPLO 9]
Análisis de la estructura cristalina de rayos X de un Fab de variante de 305 y del complejo C5 humana-dominio MG1
9.1. Expresión y purificación del dominio MG1 (20-124) de C5 humana
El dominio MG1 (restos de aminoácidos 20-124 de la SEQ ID NO: 39) fusionado a una etiqueta GST mediante un enlazador escindible por trombina (GST-MG1) se expresó en la cepa de E. coli BL21 DE3 pLysS (Promega) usando un vector pGEX-4T-1 (GE healthcare). La expresión de proteínas se indujo con isopropil beta-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) 0,1 mM a 25 °C durante 5 horas. El sedimento de células bacterianas se lisó con Bugbuster (Merck) complementado con lisonasa (Merck) y cóctel inhibidor de proteasas completo (Roche), seguido de la purificación de GST-MG1 a partir de la fracción soluble utilizando una columna GSTrap (GE healthcare) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La etiqueta GST se escindió con trombina (Sigma) y el dominio MG1 resultante se purificó adicionalmente con una columna de filtración en gel Superdex 75 (GE healthcare). Las fracciones que contenían el dominio MG1 se agruparon y almacenaron a -80 °C.
9.2. Preparación del fragmento Fab de una variante de 305
Los fragmentos Fab de una de las variantes optimizadas de 305 se prepararon mediante el método convencional usando digestión limitada con papaína (Roche Diagnostics, número de catálogo 1047825), seguida de carga en una columna de proteína A (Mab-Slect SuRe, GE Healthcare) para eliminar fragmentos Fc, una columna de intercambio catiónico (HiTrap SP HP, GE Healthcare) y una columna de filtración en gel (Superdex200 16/60, GE Healthcare). Las fracciones que contenían el fragmento Fab se agruparon y almacenaron a -80 °C.
9.3. Preparación de un Fab de variante de 305 y complejo de C5 humana-dominio MG1
El C5 humana recombinante-dominio MG1 purificado se mezcló con un fragmento Fab de variante de 305 purificado en una relación molar 1:1. El complejo se purificó mediante cromatografía de filtración en gel (aumento de Superdex200 10/300, GE Healthcare) utilizando una columna equilibrada con HEPES 25 mM pH 7,5, NaCl 100 mM.
9.4. Cristalización
Los complejos purificados se concentraron hasta aproximadamente 10 mg/ml, y la cristalización se llevó a cabo mediante el método de difusión de vapor de gota sedente en combinación con el método de siembra a 4 °C. La solución de depósito consistía en formiato de magnesio deshidratado 0,2 M, 15.0 % p/v de polietilenglicol 3350. De este modo, en pocos días, se obtuvieron cristales en forma de placa. El cristal se sumergió en una solución de formiato de magnesio deshidratado 0,2 M, 25,0 % p/v de polietilenglicol 3350 y glicerol al 20 %.
9.5. Recopilación de datos y determinación de estructura
Los datos de difracción de rayos X se midieron mediante BL32XU en SPring-8. Durante la medición, el cristal se colocó constantemente en una corriente de nitrógeno a -178 °C para mantener un estado de congelación, y se recopiló un total de 180 imágenes de difracción de rayos X utilizando un detector CCD MX-225HS (RAYONIX) conectado a una línea de haz, mientras se giraba el cristal 1,0 grado a la vez. La determinación de los parámetros de celda, la indexación de los puntos de difracción y el procesamiento de los datos de difracción obtenidos de las imágenes de difracción, se realizaron utilizando el programa Xia2 (J. Appl. Cryst. 43:186-190 (2010), Paquete XDS (Acta. Cryst. D66:125-132 (2010)) y Scala (Acta. Cryst. D62:72-82 (2006)), y finalmente se obtuvieron los datos de intensidad de difracción hasta una resolución de 2,11 angstrom. En la tabla 11 se muestran las estadísticas de los datos de cristalografía.
[Tabla 111
Recopilación de datos de rayos X y estadísticas de refinado
Recogida de datos
Grupo espacial P1
Celda unitaria
a,b,c (A) 39,79, 55,10, 127,76 a.P.YD 89,18, 86,24, 78,20 Recogida de datos
Resolución (A) 49,49-2,11 Reflexiones totales 112.102
Reflexiones exclusivas 56.154
Integridad (cubierta de mayor resolución) (%) 92,1 (95,8)
Rmezda3 {cubierta de mayor resolución) (%) 7,2 (31,7)
Refinado
Resolución (A) 25,00-2,11 Reflexiones 53.398
R factorB (Rme c) (%) 20,42 (26,44) desviación rms del ideal
Longitudes de enlace (A) 0,0088
Ángulos de enlace (°) 1,3441
a; Rmezcia = £ hkí£_ 1 íf (hkl) -(I (hkl)) |/£ hklYj \ lj (hkl) |, dónde j (hkl) y (I (hkl)) son la intensidad de la medida j y la intensidad media de la reflexión con índices hkl, respectivamente.
b; factor R = ’Zhkl\Fca\c(hkl) \ - |Fobs (hkl) |/£/7/í/|Fobs (hkl) \, donde Fobs y Fcaic son las amplitudes del factor de estructura observadas y calculadas, respectivamente.
c; Riibre se calcula con el 5 % de la reflexión apartada aleatoriamente.
La estructura se determinó mediante sustitución molecular con el programa Phaser (J. Appl. Cryst. 40:658-674 (2007)). El modelo de búsqueda del dominio Fab procedía de la estructura cristalina del Fab de la IgG4 humana publicada (código PDB: 1BBJ), y el modelo de búsqueda del dominio MG1 procedía de la estructura cristalina de la c 5 humana publicada (código PDB: 3CU7, Nat.lmmunol. 9:753-760 (2008)). Se construyó un modelo con el programa Coot (Acta Cryst. D66:486-501 (2010)) y refinó con el programa Refmac5 (Acta Cryst. D67:355-367 (2011)). El factor de confiabilidad cristalográfica (R) de los datos de intensidad de difracción de 25-2,11 angstrom fue del 20,42 %, con un valor de R Libre del 26,44 %. En la tabla 11 se muestran las estadísticas de refinado de la estructura.
9.6. Estructura general de un Fab de variante de 305 y un complejo C5-dominio MG1
El fragmento Fab de una variante optimizada de 305 ("305 Fab") se unió al C5 humana-dominio MG1 ("MG1") en una proporción de 1:1, y la unidad asimétrica de la estructura cristalina contenía dos complejos, las moléculas 1 y 2, como se muestra en la figura 22A. Las moléculas 1 y 2 se pueden alinear bien a 0,717 angstrom RMSD con la posición del átomo de C-alfa en todos los restos, como se muestra en la figura 22B. Las figuras analizadas a continuación, se prepararon utilizando la molécula 1.
En las figuras 23A y 23B, el epítopo de la región de contacto de 305 Fab está mapeado en la secuencia de aminoácidos de MG1 y en la estructura cristalina, respectivamente. El epítopo incluye los restos de aminoácidos de MG1 que contienen uno o más átomos ubicados a una distancia de 4,5 angstrom de cualquier parte del 305 Fab en la estructura cristalina. Además, el epítopo dentro de 3,0 angstrom se resalta en la figura 23A.
9.7. Interacciones de E48, D51 y K109
Como se describe en los ejemplos 4.5 y 4.6, los MAb anti-C5 que incluyen la serie de anticuerpos 305 se probaron para determinar la unión a tres mutantes puntuales de C5 humana, E48A, D51A y K109A, mediante análisis de unión por transferencia Western y BIACORE (marca registrada). Mientras que las variantes de 305 se unieron fuertemente a C5 de TS, se unieron al mutante E48A de C5 solo débilmente y no se unieron a los mutantes D51A y K109A. La estructura cristalina del complejo 305 Fab y MG1 reveló que los tres aminoácidos E48, D51 y K109, están a una distancia de 3,0 angstrom a partir del 305 Fab, formando una serie de enlaces de hidrógeno con el Fab, como se muestra en la figura 24A. En un examen más detallado, el resto K109 de MG1 está enterrado en un surco formado en la interfaz de la cadena pesada del Fab e interactúa estrechamente con el Fab mediante tres enlaces de hidrógeno con H-CDR3_G97, H-CDR3_Y100 y H-CDR3_T100b, y por un puente salino con H-CDR3_D95 (figura 24D). D51 está ubicado entre MG1 y la cadena pesada del 305 Fab y forma dos enlaces de hidrógeno con H-CDR1_Ser32 y H-CDR2_Ser54 para llenar el espacio (figura 24C). Estos indican que tanto K109 como D51 de C5, son restos críticos para la unión de la serie de anticuerpos 305. Por otro lado, E48 se encuentra más cerca de la superficie y forma solo un enlace de hidrógeno con el Fab, sugiriendo que su contribución a la unión del anticuerpo sería menor que la de K109 y E51 (figura 24B). Estas relaciones son coherentes con los resultados de los análisis de unión por transferencia Western y BIACORE (marca registrada) de mutantes de C5 humana (ejemplos 4.5 y 4.6). Nota complementaria: la numeración de restos de los aminoácidos de Fab se basa en el esquema de numeración de Kabat. (Kabat et al.,

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo que se une a C5, en donde el anticuerpo se une a un epítopo dentro de un fragmento que consiste en los aminoácidos 19 a 180 de la cadena beta (SEQ ID NO: 40) de C5 con una mayor afinidad a pH neutro que a pH ácido, en donde His70 e His110 de dicha cadena beta contribuyen a la dependencia del pH, y en donde el anticuerpo compite por la unión a C5 con un anticuerpo que comprende un par VH y VL seleccionado de:
(a) un VH de SEQ ID NO: 1 y un VL de SEQ ID NO: 11;
(b) un VH de SEQ ID NO: 5 y un VL de SEQ ID NO: 15;
(c) un VH de SEQ ID NO: 4 y un VL de SEQ ID NO: 14;
(d) un VH de SEQ ID NO: 6 y un VL de SEQ ID NO: 16;
(e) un VH de SEQ ID NO: 2 y un VL de SEQ ID NO: 12;
(f) un VH de SEQ ID NO: 3 y un VL de SEQ ID NO: 13;
(g) un VH de SEQ ID NO: 9 y un VL de SEQ ID NO: 19;
(h) un VH de SEQ ID NO: 7 y un VL de SEQ ID NO: 17;
(i) un VH de SEQ ID NO: 8 y un VL de SEQ ID NO: 18; y
(j) un VH de SEQ ID NO: 10 y un VL de SEQ ID NO: 20.
2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo se une a C5 con una mayor afinidad a pH 7,4 que a pH 5,8.
3. El anticuerpo de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en donde el anticuerpo se une a un epítopo dentro de un fragmento que consiste en los aminoácidos 33 a 124 de la cadena beta (SEQ ID NO: 40) de C5.
4. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el anticuerpo se une a un epítopo dentro de la cadena beta (SEQ ID NO: 40) de C5 que comprende al menos un fragmento seleccionado del grupo que consiste en 47 a 57, 70 a 76 y 107 a 110.
5. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el anticuerpo se une a un epítopo dentro de la cadena beta (SEQ ID NO: 40) de C5 que comprende al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Glu48, Asp51, His70, His72, Lys109 e His110.
6. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que inhibe la activación de C5 y/o la activación de la variante R885h de C5.
7. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que es
(a) un anticuerpo monoclonal;
(b) un anticuerpo humano, humanizado o quimérico; y/o
(c) un fragmento de anticuerpo que se une a C5.
8. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que es un anticuerpo de IgG1 o IgG4 de longitud completa.
9. Un ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
10. Una célula hospedadora que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 9.
11. Un método para producir el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 10 para que se produzca el anticuerpo.
12. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
13. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en artritis reumatoide (RA); nefritis lúpica; lesión por isquemiareperfusión; hemoglobinuria paroxística nocturna (PNH); síndrome urémico hemolítico atípico (aHUS); enfermedad por depósitos densos (DDD); degeneración macular; síndrome de hemólisis, elevación de enzimas hepáticas y plaquetas bajas (HELLP); púrpura trombocitopénica trombótica (TTP); pérdida fetal espontánea; vasculitis pauciinmunitaria; epidermólisis ampollosa; pérdida fetal recurrente; esclerosis múltiple (MS); lesión cerebral traumática; una lesión resultante de infarto de miocardio, derivación cardiopulmonar y hemodiálisis.
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