KR20180029267A - 항-c5 항체 및 그의 사용 방법 - Google Patents

항-c5 항체 및 그의 사용 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명의 목적은 항-C5 항체 및 그의 사용 방법을 제공하는 것이다. 본 발명은 항-C5 항체 및 그의 사용 방법을 제공한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 단리된 항-C5 항체는 산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화성으로 C5의 베타 쇄내의 에피토프에 결합한다. 본 발명은 또한 본 발명의 항-C5 항체를 암호화하는 단리된 핵산을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 또한 항체가 생산되도록 본 발명의 숙주 세포를 배양함을 포함하는 항체의 제조 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 동물을 C5의 베타 쇄의 MG1-MG2 도메인을 포함하는 폴리펩타이드에 대해 면역시킴을 포함하는 항-C5 항체의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 항-C5 항체를 약제로서 사용할 수 있다.

Description

항-C5 항체 및 그의 사용 방법{ANTI-C5 ANTIBODIES AND METHODS OF USE}
본 발명은 항-C5 항체 및 그의 사용 방법에 관한 것이다.
보체계는 면역 복합체의 클리어런스 및 감염성 병원체, 외래 항원, 바이러스-감염된 세포 및 종양 세포에 대한 면역 응답에 중심적인 역할을 한다. 약 25 내지 30개의 보체 단백질이 존재하며, 이들은 혈장 단백질 및 막 보인자의 복잡한 집합체로서 발견된다. 보체 성분은 일련의 복잡한 효소 절단 및 막 결합 사건에서의 상호작용에 의해 그의 면역 방어 기능을 성취한다. 생성되는 보체 캐스캐이드는 옵소닌, 면역조절 및 세포용해 기능을 갖는 생성물의 생성을 유도한다.
현재, 상기 보체계는 3개의 독특한 경로, 즉 고전 경로, 렉틴 경로, 및 부 경로를 통해 활성화될 수 있다. 이들 경로는 다수의 성분들을 공유하며, 상기 경로들의 초기 단계는 상이하지만, 표적 세포의 활성화 및 파괴에 원인이 되는 동일한 종말 보체 성분(C5 내지 C9)에 수렴하고 이를 공유한다.
상기 고전 경로는 통상적으로 항원-항체 복합체의 형성에 의해 활성화된다. 독립적으로, 상기 렉틴 경로의 활성화에서 첫 번째 단계는 만난-결합 렉틴(MBL), H-피콜린, M-피콜린, L-피콜린 및 C-형 렉틴 CL-11과 같은 특정한 렉틴들의 결합이다. 대조적으로, 상기 부 경로는 낮은 수준의 턴오버 활성화를 자발적으로 겪으며, 이는 외래 또는 다른 이상 표면(세균, 효모, 바이러스 감염된 세포, 또는 손상된 조직)상에서 쉽게 증폭될 수 있다. 이들 경로는 보체 성분 C3가 활성 프로테아제에 의해 절단되어 C3a 및 C3b를 제공하는 하나의 점에 수렴한다.
C3a는 아나필라톡신이다. C3b는 세균 및 다른 세포뿐만 아니라 특정한 바이러스 및 면역 복합체에 결합하고 이들을 순환으로부터 제거하기 위해 태그를 붙인다(옵소닌으로서 공지된 역할). C3b는 또한 다른 성분들과 복합체를 형성하여 C5 전환효소(C5를 C5a 및 C5b로 절단한다)를 형성한다.
C5는 대략 80 마이크로그램/㎖(0.4 마이크로M)로 정상 혈청 중에서 발견되는 190 kDa 단백질이다. C5는 글리코실화되며, 그의 질량의 약 1.5 내지 3%는 탄수화물에 기인한다. 성숙한 C5는, 75 kDa의 베타 쇄에 다이설파이드 결합된 115 kDa 알파 쇄의 이종이량체이다. C5는 1676 아미노산의 단쇄 전구체 단백질(프로-C5 전구체)로서 합성된다(예를 들어 PTL1 및 PTL2를 참조하시오). 상기 프로-C5 전구체는 절단되어 아미노 말단 단편으로서 베타 쇄 및 카복시 말단 단편으로서 알파 쇄를 제공한다. 상기 알파 쇄 및 베타 쇄 폴리펩타이드 단편은 다이설파이드 결합을 통해 서로 연결되고 상기 성숙한 C5 단백질을 구성한다.
성숙한 C5는 상기 보체 경로의 활성화 중에 C5a 및 C5b 단편으로 절단된다. C5a는 C5 전환효소에 의해 상기 알파 쇄의 처음 74개 아미노산을 포함하는 아미노 말단 단편으로서 C5의 알파 쇄로부터 절단된다. 성숙한 C5의 나머지 부분은 단편 C5b이며, 상기는 상기 베타 쇄에 다이설파이드 결합된 상기 알파 쇄의 나머지를 함유한다. 상기 11 kDa 질량의 C5a의 대략 20%는 탄수화물에 기인한다.
C5a는 또 다른 아나필라톡신이다. C5b는 C6, C7, C8 및 C9와 결합하여 표적 세포의 표면에서 막 침습 복합체(MAC, C5b-9, 종말 보체 복합체(TCC))를 형성한다. 충분한 수의 MAC가 표적 세포막에 삽입되면, MAC 기공이 형성되어 상기 표적 세포의 급속한 삼투압 용해를 매개한다.
상기에 언급한 바와 같이, C3a 및 C5a는 아나필라톡신이다. 이들은 비만세포 탈과립을 촉발할 수 있으며, 이는 히스타민 및 염증의 다른 매개체를 방출하여 평활근 수축, 혈관 투과성의 증가, 백혈구 활성화 및 다른 염증 현상, 예를 들어 세포과형성을 생성시키는 세포 증식을 생성시킨다. C5a는 또한 호중구, 호산구, 호염기구 및 단핵구와 같은 과립구를 보체 활성화 부위로 유인하는 작용을 하는 주화성 펩타이드로서 기능한다.
상기 C5a의 활성은, C5a로부터 카복시-말단 아르기닌을 제거하여 C5a-des-Arg 유도체를 형성시키는 혈장 효소 카복시펩티다제 N에 의해 조절된다. C5a-des-Arg는 변형되지 않은 C5a의 아나필락틱 활성 및 다형핵 주화 활성의 단지 1%만을 나타낸다.
적합하게 기능하는 보체계는 감염 미생물에 대해 확고한 방어를 제공하지만, 보체의 부적합한 조절 또는 활성화는 다양한 장애, 예를 들어 류마티스성 관절염(RA); 루푸스 신염; 허혈성-재관류 손상; 발작성 야간 헤모글로빈뇨증(PNH); 비정형 용혈성 요독증 증후군(aHUS); 조밀침착병(DDD); 황반변성(예를 들어 나이관련 황반변성(AMD)); 용혈, 상승된 간 효소, 및 저 혈소판(HELLP) 증후군; 혈전성 혈소판감소성 자반병(TTP); 자연 태아 소실; 막-면역 혈관염; 표피수포증; 습관성 유산; 다발성 경화증(MS); 외상성 뇌 손상; 및 심근경색, 심폐 우회술 및 혈액투석으로부터 발생하는 손상의 병인에 관련되었다(예를 들어 NPL1을 참조하시오). 따라서, 상기 보체 캐스캐이드의 과도하거나 통제되지 않는 활성화의 저해는 상기와 같은 장애가 있는 환자들에게 임상적 이익을 제공할 수 있다.
발작성 야간 헤모글로빈뇨증(PNH)은 드문 혈액 질환으로, 적혈구가 손상되며 따라서 정상 적혈구보다 더 급속하게 파괴된다. PNH는 X 염색체상에 위치한 PIG-A(포스파티딜이노시톨 글리칸 클래스 A) 유전자의 체세포 돌연변이를 갖는 조혈줄기세포의 클론 확대로부터 기인한다. PIG-A에서의 돌연변이는 다수 단백질의 세포 표면에의 고정에 필요한 분자인 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI)의 합성에 조기 차단을 유도한다. 결과적으로, PNH 혈액 세포는 보체-조절 단백질 CD55 및 CD59를 포함하는 GPI-고정된 단백질에서 결핍된다. 정상적인 상황하에서, 이들 보체-조절 단백질은 세포 표면상의 MAC의 형성을 차단하고, 이에 의해 적혈구 용해를 방지한다. 상기 GPI-고정된 단백질의 부재는 PNH에서 보체-매개된 용혈을 야기한다.
PNH는 용혈성 빈혈(적혈구 수의 감소), 헤모글로빈뇨증(뇨중 헤모글로빈 존재, 특히 수면 후에 현저함), 및 헤모글로빈혈증(혈류중 헤모글로빈 존재)을 특징으로 한다. PNH에 걸린 개인은, 본 명세서에서 어두운 색 뇨의 출현으로서 정의되는 발작을 갖는 것으로 공지되어 있다. 용혈성 빈혈은 보체 성분에 의한 적혈구의 혈관내 파괴에 기인한다. 다른 공지된 증상으로는 언어장애, 피로, 발기불능, 혈전증 및 재발성 복통이 있다.
에쿨리주맵은 보체 단백질 C5에 대한 인간화된 단클론 항체이며, 발작성 야간 헤모글로빈뇨증(PNH) 및 비정형 용혈성 요독증 증후군(aHUS)의 치료에 승인된 최초의 치료제이다(예를 들어 NPL2를 참조하시오). 에쿨리주맵은 C5 전환효소에 의한 C5의 C5a 및 C5b로의 절단을 저해하며, 이는 종말 보체 복합체 C5b-9의 생성을 방지한다. C5a 및 C5b-9는 모두 PNH 및 aHUS의 특징인 종말 보체-매개된 사건들을 야기한다(또한 PTL3, PTL4, PTL5 및 PTL6을 참조하시오).
여러 보고서가 항-C5 항체를 개시하였다. 예를 들어 WO 95/29697(PTL7)은 C5의 알파 쇄에는 결합하지만 C5a에는 결합하지 않고 C5의 활성화를 차단하는 항-C5 항체를 개시한 반면, WO 2002/30985(PTL8)는 C5a 형성을 저해하는 항-C5 단클론 항체를 개시하였다. 다른 한편으로, WO 2004/007553(PTL9)은 C5의 알파 쇄상의 C5 전환효소에 대한 단백질분해 부위를 인식하고 C5의 C5a 및 C5b로의 전환을 저해하는 항-C5 항체를 개시하였다. WO 2010/015608(PTL10)은 적어도 1 x 107 M-1의 친화성 상수를 갖는 항-C5 항체를 개시하였다.
항체(IgG)는 신생아형 Fc 수용체(FcRn)에 결합하며, 긴 혈장 체류 시간을 갖는다. IgG의 FcRn에의 결합은 전형적으로 산성 조건(예를 들어 pH 6.0) 하에서 관찰되며, 중성 조건(예를 들어 pH 7.4)하에서는 좀처럼 관찰되지 않는다. 전형적으로, IgG는 엔도사이토시스를 통해 세포내에 비특이적으로 통합되며, 엔도솜내 산성 조건하에서 엔도솜 FcRn에의 결합에 의해 세포 표면으로 복귀한다. 이어서, IgG는 혈장내 중성 조건하에서 FcRn으로부터 해리된다. FcRn에 결합하지 못한 IgG는 리소솜 중에서 분해된다. 산성 조건하에서 IgG의 FcRn 결합 능력이 그의 Fc 영역내로의 돌연변이의 도입에 의해 제거되는 경우, 상기 IgG는 엔도솜으로부터 혈장으로 재순환되지 못하고, 이는 상기 IgG의 혈장 체류의 현저한 저하를 유도한다. 상기 IgG의 혈장 체류를 개선시키기 위해서, 산성 조건하에서 그의 FcRn 결합을 증대시키는 방법이 보고되었다. 상기 산성 조건하에서 IgG의 FcRn 결합이 그의 Fc 영역내로의 아미노산 치환의 도입에 의해 개선될 때, 상기 IgG는 엔도솜으로부터 혈장으로 보다 효율적으로 재순환되며, 이에 의해 개선된 혈장 체류가 나타난다. 한편으로, 중성 조건하에서 증대된 FcRn 결합을 갖는 IgG는 엔도솜내 산성 조건하에서 FcRn에의 그의 결합을 통해 세포 표면으로 복귀한 경우에 조차, 혈장내 중성 조건하에서 FcRn으로부터 해리되지 않으며, 결과적으로 그의 혈장 체류가 변경되지 않은 채로 남아있거나, 또는 오히려 악화된다(예를 들어 NPL3; NPL4; NPL5를 참조하시오).
최근에, pH-의존적인 방식으로 항원에 결합하는 항체가 보고되었다(예를 들어 PTL11 및 PTL12를 참조하시오). 이들 항체는 혈장 중성 조건하에서 항원에 강하게 결합하고 엔도솜 산성 조건하에서는 상기 항원으로부터 해리된다. 상기 항원으로부터 해리 후에, 상기 항체는 FcRn을 통해 혈장으로 재순환될 때 다시 한번 항원에 결합할 수 있게 된다. 따라서, 단일 항체 분자는 다수의 항원 분자들에 반복해서 결합할 수 있다. 일반적으로, 항원의 혈장 체류는 상기 언급한 FcRn-매개된 재순환 기전을 갖는 항체의 체류보다 훨씬 더 짧다. 따라서, 항원이 항체에 결합할 때, 상기 항원은 통상적으로 연장된 혈장 체류를 보여, 상기 항원의 혈장 농도의 증가를 생성시킨다. 다른 한편으로, pH-의존적인 방식으로 항원에 결합하는 상술한 항체는, 상기 FcRn-매개된 재순환 과정 동안 엔도솜 내 항원으로부터 해리되기 때문에 전형적인 항체보다 더 급속하게 혈장으로부터 항원을 제거함이 보고되었다. WO 2011/111007(PTL13)은 또한 C5에 대해 pH-의존적인 결합을 갖는 항체가 항원 녹다운을 연장시킬 수 있음을 보이는 컴퓨터 모델링 분석을 개시하였다.
선행기술문헌
특허 문헌
[PTL1] 미국특허 제 6,355,245 호
[PTL2] 미국특허 제 7,432,356 호
[PTL3] WO 2005/074607
[PTL4] WO 2007/106585
[PTL5] WO 2008/069889
[PTL6] WO 2010/054403
[PTL7] WO 95/29697
[PTL8] WO 2002/30985
[PTL9] WO 2004/007553
[PTL10] WO 2010/015608
[PTL11] WO 2009/125825
[PTL12] WO 2011/122011
[PTL13] WO 2011/111007
비특허 문헌
[NPL1] Holers et al., Immunol. Rev. 223:300-316 (2008)
[NPL2] Dmytrijuk et al., The Oncologist 13(9):993-1000 (2008)
[NPL3] Yeung et al., J Immunol. 182(12): 7663-7671 (2009)
[NPL4] Datta-Mannan et al., J Biol. Chem. 282(3):1709-1717 (2007)
[NPL5] Dall'Acqua et al., J. Immunol. 169(9):5171-5180 (2002)
본 발명은 항-C5 항체 및 그의 사용 방법을 제공한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 단리된 항-C5 항체는 C5의 베타 쇄내의 에피토프에 결합한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 단리된 항-C5 항체는 C5의 베타 쇄의 MG1-MG2 도메인내의 에피토프에 결합한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 단리된 항-C5 항체는 C5의 베타 쇄(서열번호 40)의 아미노산 33-124로 이루어지는 단편내의 에피토프에 결합한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 단리된 항-C5 항체는 아미노산 47-57, 70-76 및 107-110으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 단편을 포함하는 C5의 베타 쇄(서열번호 40)내의 에피토프에 결합한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 단리된 항-C5 항체는 서열번호 40의 Glu48, Asp51, His70, His72, Lys109 및 His110으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 아미노산 잔기를 포함하는 C5의 베타 쇄(서열번호 40)의 단편내의 에피토프에 결합한다. 추가의 실시태양에서, 상기 항체는 산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화성으로 C5에 결합한다. 추가의 실시태양에서, 상기 항체는 pH 5.8에서보다 pH 7.4에서 더 높은 친화성으로 C5에 결합한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명의 단리된 항-C5 항체는 표 2에 개시된 항체와 동일한 에피토프에 결합한다. 추가의 실시태양에서, 상기 항체는 pH 5.8에서보다 pH 7.4에서 더 높은 친화성으로, 표 2에 개시된 항체와 동일한 에피토프에 결합한다. 추가의 실시태양에서, 본 발명의 단리된 항-C5 항체는 표 7 또는 8에 개시된 항체와 동일한 에피토프에 결합한다. 추가의 실시태양에서, 상기 항체는 pH 5.8에서보다 pH 7.4에서 더 높은 친화성으로, 표 7 또는 8에 개시된 항체와 동일한 에피토프에 결합한다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명의 항-C5 항체는 C5와의 결합에 대해서 하기 중에서 선택된 VH 및 VL 쌍을 포함하는 항체와 경쟁한다: (a) 서열번호 1의 VH 및 서열번호 11의 VL; (b) 서열번호 5의 VH 및 서열번호 15의 VL; (c) 서열번호 4의 VH 및 서열번호 14의 VL; (d) 서열번호 6의 VH 및 서열번호 16의 VL; (e) 서열번호 2의 VH 및 서열번호 12의 VL; (f) 서열번호 3의 VH 및 서열번호 13의 VL; (g) 서열번호 9의 VH 및 서열번호 19의 VL; (h) 서열번호 7의 VH 및 서열번호 17의 VL; (i) 서열번호 8의 VH 및 서열번호 18의 VL; 및 (j) 서열번호 10의 VH 및 서열번호 20의 VL. 추가의 실시태양에서, 상기 항-C5 항체는 산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화성으로 C5에 결합한다. 추가의 실시태양에서, 상기 항-C5 항체는 pH 5.8에서보다 pH 7.4에서 더 높은 친화성으로 C5에 결합한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 단리된 항-C5 항체는 하기로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 특성을 갖는다: (a) 상기 항체는 C5(서열번호 39)의 아미노산 D51 및 K109와 접촉한다; (b) C5(서열번호 39)에 대한 상기 항체의 친화성은 서열번호 39의 E48A 치환으로 이루어지는 C5 돌연변이체에 대한 상기 항체의 친화성보다 크다; 또는 (c) 상기 항체는 pH 7.4에서 서열번호 39의 아미노산 서열로 이루어지는 C5 단백질에 결합하지만, pH 7.4에서 H72Y 치환을 갖는 서열번호 39의 아미노산 서열로 이루어지는 C5 단백질에는 결합하지 않는다. 추가의 실시태양에서, 상기 항체는 산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화성으로 C5에 결합한다. 추가의 실시태양에서, 상기 항체는 pH 5.8에서보다 pH 7.4에서 더 높은 친화성으로 C5에 결합한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 단리된 항-C5 항체는 C5의 활성화를 저해한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 단리된 항-C5 항체는 C5 변이체 R885H의 활성화를 저해한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 단리된 항-C5 항체는 단클론 항체이다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 단리된 항-C5 항체는 인간, 인간화된, 또는 키메릭 항체이다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 단리된 항-C5 항체는 C5에 결합하는 항체 단편이다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 단리된 항-C5 항체는 완전길이 IgG1 또는 IgG4 항체이다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 단리된 항-C5 항체는 (a) 아미노산 서열 DX1GYX2X3PTHAMX4X5 (여기에서 X1 은 G 또는 A이고, X2 는 V, Q 또는 D이고, X3 은 T 또는 Y이고, X4 는 Y 또는 H이고, X5 는 L 또는 Y이다)(서열번호 128)을 포함하는 HVR-H3, (b) 아미노산 서열 QX1TX2VGSSYGNX3 (여기에서 X1 는 S, C, N 또는 T이고, X2 는 F 또는 K이고, X3 은 A, T 또는 H이다)(서열번호 131)을 포함하는 HVR-L3, 및 (c) 아미노산 서열 X1IX2TGSGAX3YX4AX5WX6KG (여기에서 X1 는 C, A 또는 G이고, X2 는 Y 또는 F이고, X3 은 T, D 또는 E이고, X4 는 Y, K 또는 Q이고, X5 는 S, D 또는 E이고, X6 은 A 또는 V이다)(서열번호 127)을 포함하는 HVR-H2를 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 단리된 항-C5 항체는 (a) SSYYX1X2 (여기에서 X1 는 M 또는 V이고, X2 는 C 또는 A이다)(서열번호 126)을 포함하는 HVR-H1, (b) 아미노산 서열 X1IX2TGSGAX3YX4AX5WX6KG (여기에서 X1 은 C, A 또는 G이고, X2 는 Y 또는 F이고, X3 은 T, D 또는 E이고, X4 는 Y, K 또는 Q이고, X5 는 S, D 또는 E이고, X6 은 A 또는 V이다)(서열번호 127)을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 아미노산 서열 DX1GYX2X3PTHAMX4X5 (여기에서 X1 은 G 또는 A이고, X2 는 V, Q 또는 D이고, X3 은 T 또는 Y이고, X4 는 Y 또는 H이고, X5 는 L 또는 Y이다)(서열번호 128)을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 추가의 실시태양에서, 상기 항체는 (a) 아미노산 서열 X1ASQX2IX3SX4LA (여기에서 X1 은 Q 또는 R이고, X2 는 N, Q 또는 G이고, X3 은 G 또는 S이고, X4 는 D, K 또는 S이다)(서열번호 129)를 포함하는 HVR-L1; (b) 아미노산 서열 GASX1X2X3S (여기에서 X1 은 K, E 또는 T이고, X2 는 L 또는 T이고, X3 은 A, H, E 또는 Q이다)(서열번호 130)을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 아미노산 서열 QX1TX2VGSSYGNX3 (여기에서 X1 은 S, C, N 또는 T이고, X2 는 F 또는 K이고, X3 은 A, T 또는 H이다)(서열번호 131)을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 단리된 항-C5 항체는 (a) 아미노산 서열 X1ASQX2IX3SX4LA (여기에서 X1 은 Q 또는 R이고, X2 는 N, Q 또는 G이고, X3 은 G 또는 S이고, X4 는 D, K 또는 S이다)(서열번호 129)을 포함하는 HVR-L1; (b) 아미노산 서열 GASX1X2X3S (여기에서 X1 은 K, E 또는 T이고, X2 는 L 또는 T이고, X3 은 A, H, E 또는 Q이다)(서열번호 130)을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 아미노산 서열 QX1TX2VGSSYGNX3 (여기에서 X1 은 S, C, N 또는 T이고, X2 는 F 또는 K이고, X3 은 A, T 또는 H이다)(서열번호 131)을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 단리된 항-C5 항체는 서열번호 132-134 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 프레임워크 FR1; 서열번호 135-136 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 FR2; 서열번호 137-139 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 FR3; 및 서열번호 140-141 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 FR4를 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 단리된 항-C5 항체는 서열번호 142-143 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 프레임워크 FR1; 서열번호 144-145 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 FR2; 서열번호 146-147 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 FR3; 및 서열번호 148의 아미노산 서열을 포함하는 FR4를 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 단리된 항-C5 항체는 (a) 서열번호 10, 106-110 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 상동성 (sequence identity)을 갖는 VH 서열; (b) 서열번호 20, 111-113 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 상동성을 갖는 VL 서열; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 서열 및 (b)에서와 같은 VL 서열을 포함한다. 추가의 실시태양에서, 상기 항체는 서열번호 10, 106-110 중 어느 하나의 VH 서열을 포함한다. 추가의 실시태양에서, 상기 항체는 서열번호 20, 111-113 중 어느 하나의 VL 서열을 포함한다.
본 발명은 서열번호 10, 106-110 중 어느 하나의 VH 서열 및 서열번호 20, 111-113 중 어느 하나의 VL 서열을 포함하는 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 항-C5 항체를 암호화(encoding)하는 단리된 핵산을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 또한 항체를 생산하도록 본 발명의 숙주 세포를 배양함을 포함하는 항체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 항-C5 항체의 제조 방법을 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 동물을 C5의 베타 쇄의 MG1-MG2 도메인(서열번호 43)을 포함하는 폴리펩타이드에 대해 면역시킴을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 동물을 C5의 베타 쇄(서열번호 40)의 33 내지 124번 위치의 아미노산에 상응하는 영역을 포함하는 폴리펩타이드에 대해 면역시킴을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 동물을 C5의 베타 쇄(서열번호 40)의 아미노산 47-57, 70-76 및 107-110 중에서 선택된 적어도 하나의 단편을 포함하는 폴리펩타이드에 대해 면역시킴을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 동물을 Glu48, Asp51, His70, His72, Lys109 및 His110 중에서 선택된 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 C5의 베타 쇄(서열번호 40)의 단편을 포함하는 폴리펩타이드에 대해 면역시킴을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 항-C5 항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 제형 (pharmaceutical formulation)을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 하기에 관한 것이다:
[1] C5에 결합하는 단리된 항체로, 상기 항체는 산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화성으로 C5의 베타 쇄내의 에피토프에 결합한다.
[2] [1]의 항체에서, 상기 항체는 하기로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 특성을 갖는다:
(a) 상기 항체는 C5(서열번호 39)의 아미노산 D51 및 K109와 접촉한다;
(b) C5(서열번호 39)에 대한 상기 항체의 친화성은 서열번호 39의 E48A 치환으로 이루어지는 C5 돌연변이체에 대한 상기 항체의 친화성보다 크다; 및
(c) 상기 항체는 pH 7.4에서 서열번호 39의 아미노산 서열로 이루어지는 C5 단백질에 결합하지만, pH 7.4에서 H72Y 치환을 갖는 서열번호 39의 아미노산 서열로 이루어지는 C5 단백질에는 결합하지 않는다.
[3] [1]의 항체에서, 상기 항체는 C5와의 결합에 대해서 하기 중에서 선택된 VH 및 VL 쌍을 포함하는 항체와 경쟁한다:
(a) 서열번호 1의 VH 및 서열번호 11의 VL;
(b) 서열번호 5의 VH 및 서열번호 15의 VL;
(c) 서열번호 4의 VH 및 서열번호 14의 VL;
(d) 서열번호 6의 VH 및 서열번호 16의 VL;
(e) 서열번호 2의 VH 및 서열번호 12의 VL;
(f) 서열번호 3의 VH 및 서열번호 13의 VL;
(g) 서열번호 9의 VH 및 서열번호 19의 VL;
(h) 서열번호 7의 VH 및 서열번호 17의 VL;
(i) 서열번호 8의 VH 및 서열번호 18의 VL; 및
(j) 서열번호 10의 VH 및 서열번호 20의 VL.
[4] [1] 내지 [3] 중 어느 하나의 항체에서, 상기 항체는 C5의 베타 쇄의 MG1-MG2 도메인내의 에피토프에 결합한다.
[5] [1] 내지 [4] 중 어느 하나의 항체에서, 상기 항체는 C5의 베타 쇄(서열번호 40)의 아미노산 33-124로 이루어지는 단편내의 에피토프에 결합한다.
[6] [1] 내지 [5] 중 어느 하나의 항체에서, 상기 항체는 아미노산 47-57, 70-76 및 107-110으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 단편을 포함하는 C5의 베타 쇄(서열번호 40)내의 에피토프에 결합한다.
[7] [1] 내지 [6] 중 어느 하나의 항체에서, 상기 항체는 Glu48, Asp51, His70, His72, Lys109 및 His110으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 C5의 베타 쇄(서열번호 40)의 단편내의 에피토프에 결합한다.
[8] [1] 내지 [7] 중 어느 하나의 항체에서, 상기 항체는 표 2, 7 또는 8에 개시된 항체와 동일한 항체에 결합한다.
[9] [1] 내지 [8] 중 어느 하나의 항체에서, 상기 항체는 C5의 활성화를 저해한다.
[10] [1] 내지 [9] 중 어느 하나의 항체에서, 상기 항체는 C5 변이체 R885H의 활성화를 저해한다.
[11] [1] 내지 [10] 중 어느 하나의 항체에서, 상기 항체는 단클론 항체이다.
[12] [1] 내지 [11] 중 어느 하나의 항체에서, 상기 항체는 인간, 인간화된 또는 키메릭 항체이다.
[13] [1] 내지 [12] 중 어느 하나의 항체에서, 상기 항체는 C5에 결합하는 항체 단편이다.
[14] [1] 내지 [13] 중 어느 하나의 항체에서, 상기 항체는 (a) 아미노산 서열 DX1GYX2X3PTHAMX4X5 (여기에서 X1 은 G 또는 A이고, X2 는 V, Q 또는 D이고, X3 은 T 또는 Y이고, X4 는 Y 또는 H이고, X5 는 L 또는 Y이다)(서열번호 128)을 포함하는 HVR-H3, (b) 아미노산 서열 QX1TX2VGSSYGNX3 (여기에서 X1 는 S, C, N 또는 T이고, X2 는 F 또는 K이고, X3 은 A, T 또는 H이다)(서열번호 131)을 포함하는 HVR-L3, 및 (c) 아미노산 서열 X1IX2TGSGAX3YX4AX5WX6KG (여기에서 X1 는 C, A 또는 G이고, X2 는 Y 또는 F이고, X3 은 T, D 또는 E이고, X4 는 Y, K 또는 Q이고, X5 는 S, D 또는 E이고, X6 은 A 또는 V이다)(서열번호 127)을 포함하는 HVR-H2를 포함한다.
[15] [1] 내지 [13] 중 어느 하나의 항체에서, 상기 항체는 (a) SSYYX1X2 (여기에서 X1 는 M 또는 V이고, X2 는 C 또는 A이다)(서열번호 126)을 포함하는 HVR-H1, (b) 아미노산 서열 X1IX2TGSGAX3YX4AX5WX6KG (여기에서 X1 은 C, A 또는 G이고, X2 는 Y 또는 F이고, X3 은 T, D 또는 E이고, X4 는 Y, K 또는 Q이고, X5 는 S, D 또는 E이고, X6 은 A 또는 V이다)(서열번호 127)을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 아미노산 서열 DX1GYX2X3PTHAMX4X5 (여기에서 X1 은 G 또는 A이고, X2 는 V, Q 또는 D이고, X3 은 T 또는 Y이고, X4 는 Y 또는 H이고, X5 는 L 또는 Y이다)(서열번호 128)을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
[16] [15]의 항체에서, 상기 항체는 (a) 아미노산 서열 X1ASQX2IX3SX4LA (여기에서 X1 은 Q 또는 R이고, X2 는 N, Q 또는 G이고, X3 은 G 또는 S이고, X4 는 D, K 또는 S이다)(서열번호 129)를 포함하는 HVR-L1; (b) 아미노산 서열 GASX1X2X3S (여기에서 X1 은 K, E 또는 T이고, X2 는 L 또는 T이고, X3 은 A, H, E 또는 Q이다)(서열번호 130)을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 아미노산 서열 QX1TX2VGSSYGNX3 (여기에서 X1 은 S, C, N 또는 T이고, X2 는 F 또는 K이고, X3 은 A, T 또는 H이다)(서열번호 131)을 포함하는 HVR-L3을 추가로 포함한다.
[17] [1] 내지 [13] 중 어느 하나의 항체에서, 상기 항체는 (a) 아미노산 서열 X1ASQX2IX3SX4LA (여기에서 X1 은 Q 또는 R이고, X2 는 N, Q 또는 G이고, X3 은 G 또는 S이고, X4 는 D, K 또는 S이다)(서열번호 129)을 포함하는 HVR-L1; (b) 아미노산 서열 GASX1X2X3S (여기에서 X1 은 K, E 또는 T이고, X2 는 L 또는 T이고, X3 은 A, H, E 또는 Q이다)(서열번호 130)을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 아미노산 서열 QX1TX2VGSSYGNX3 (여기에서 X1 은 S, C, N 또는 T이고, X2 는 F 또는 K이고, X3 은 A, T 또는 H이다)(서열번호 131)을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
[18] [15]의 항체에서, 상기 항체는 서열번호 132-134 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 프레임워크 FR1; 서열번호 135-136 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 FR2; 서열번호 137-139 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 FR3; 및 서열번호 140-141 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 FR4를 추가로 포함한다.
[19] [17]의 항체에서, 상기 항체는 서열번호 142-143 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 프레임워크 FR1; 서열번호 144-145 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 FR2; 서열번호 146-147 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 FR3; 및 서열번호 148의 아미노산 서열을 포함하는 FR4를 추가로 포함한다.
[20] [1] 내지 [13] 중 어느 하나의 항체에서, 상기 항체는 (a) 서열번호 10, 106-110 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 상동성 (sequence identity)을 갖는 VH 서열; (b) 서열번호 20, 111-113 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 상동성을 갖는 VL 서열; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 서열 및 (b)에서와 같은 VL 서열을 포함한다.
[21] [20]의 항체에서, 상기 항체는 서열번호 10, 106-110 중 어느 하나의 VH 서열을 포함한다.
[22] [20]의 항체에서, 상기 항체는 서열번호 20, 111-113 중 어느 하나의 VL 서열을 포함한다.
[23] 서열번호 10, 106-110 중 어느 하나의 VH 서열 및 서열번호 20, 111-113 중 어느 하나의 VL 서열을 포함하는 항체.
[24] [1] 내지 [23] 중 어느 하나의 항체에서, 상기 항체는 완전길이 IgG1 또는 IgG4 항체이다.
[25] [1] 내지 [24] 중 어느 하나의 항체를 암호화(encoding)하는 단리된 핵산.
[26] [25]의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
[27] 항체를 생산하도록 [26]의 숙주 세포를 배양함을 포함하는 항체의 제조 방법.
[28] 동물을 폴리펩타이드에 대해 면역시킴을 포함하는 항-C5 항체의 제조 방법으로, 상기 폴리펩타이드는 C5의 베타 쇄의 MG1-MG2 도메인(서열번호 43)을 포함한다.
[29] 동물을 폴리펩타이드에 대해 면역시킴을 포함하는 항-C5 항체의 제조 방법으로, 상기 폴리펩타이드는 C5의 베타 쇄(서열번호 40)의 33 내지 124번 위치의 아미노산에 상응하는 영역을 포함한다.
[30] 동물을 폴리펩타이드에 대해 면역시킴을 포함하는 항-C5 항체의 제조 방법으로, 상기 폴리펩타이드는 C5의 베타 쇄(서열번호 40)의 아미노산 47-57, 70-76 및 107-110 중에서 선택된 적어도 하나의 단편을 포함한다.
[31] 동물을 폴리펩타이드에 대해 면역시킴을 포함하는 항-C5 항체의 제조 방법으로, 상기 폴리펩타이드는 Glu48, Asp51, His70, His72, Lys109 및 His110 중에서 선택된 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 C5의 베타 쇄(서열번호 40)의 단편을 포함한다.
[32] [1] 내지 [24] 중 어느 하나의 항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 제형 (pharmaceutical formulation).
[도 1] 도 1은 실시예 2.2에 개시된 바와 같은, 항-C5 항체의 에피토프 비닝(binning)을 예시한다. 동일한 에피토프 빈으로 분류된 항체들은 굵은선 상자안에 있다.
[도 2a] 도 2a는 실시예 3.2에 개시된 바와 같은, pH-의존성을 평가하기 위한 pH 7.4(실선) 및 pH 5.8(파선)에서의 항-C5 항체의 BIACORE(등록상표) 센서그램을 예시한다. 실시예 2.2에 개시된 바와 같이, CFA0305, CFA0307, CFA0366, CFA0501, CFA0538, 및 CFA0599는 에피토프 C로 분류된 항체들이다.
[도 2b] 도 2b는 실시예 3.2에 개시된 바와 같은, pH-의존성을 평가하기 위한 pH 7.4(실선) 및 pH 5.8(파선)에서의 항-C5 항체의 BIACORE(등록상표) 센서그램을 예시한다. 실시예 2.2에 개시된 바와 같이, CFA0666, CFA0672 및 CFA0675는 에피토프 C로 분류된 항체들이고, CFA0330 및 CFA0341은 에피토프 B로 분류된 항체들이다. 305LO5는 실시예 2.3에 개시된 바와 같은, CFA0305의 인간화된 항체이다.
[도 3] 도 3은 실시예 4.1에 개시된 바와 같은, GST-태그에 융합된 C5 베타-쇄-유래된 단편(서열번호 40의 아미노산 19-180, 161-340, 321-500 및 481-660)에 대한 웨스턴 블럿 분석을 예시한다. CFA0305, CFA0307, CFA0366, CFA0501, CFA0538, CFA0599, CFA0666, CFA0672 및 CFA0675는 에피토프 C로 분류된 항체들이다. 항-GST 항체는 양성 대조용이다. 상기 GST-융합된 C5 단편(46-49 kDa)의 위치는 화살표로 표시된다.
[도 4] 도 4는 실시예 4.3에 개시된 바와 같은, C5 베타-쇄의 MG1-MG2 도메인에 대한 항-C5 항체의 BIACORE(등록상표) 센서그램을 예시한다. 상부 패널은 CFA0305(실선), CFA0307(파선), CFA0366(1점쇄선) 및 에쿨리주맵(점선)의 결과를 도시한다. 중간 패널은 CFA0501(실선), CFA0599(파선), CFA0538(1점쇄선) 및 에쿨리주맵(점선)의 결과를 도시한다. 하부 패널은 CFA0666(실선), CFA0672(파선), CFA0675(1점쇄선) 및 에쿨리주맵(점선)의 결과를 도시한다. CFA0305, CFA0307, CFA0366, CFA0501, CFA0538, CFA0599, CFA0666, CFA0672 및 CFA0675는 에피토프 C로 분류된 항체들이다. 에쿨리주맵은 대조용 항-C5 항체이다.
[도 5a] 도 5a는 실시예 4.4에 개시된 바와 같은, GST-태그에 융합된 MG1-MG2 도메인-유래된 펩타이드 단편(서열번호 40의 아미노산 33-124, 45-124, 52-124, 33-111, 33-108 및 45-111)에 대한 웨스턴 블럿 분석을 예시한다. 항-GST 항체는 반응을 위한 항체로서 사용된다. 상기 GST-융합된 C5 단편(35-37 kDa)의 위치는 화살표로 표시된다.
[도 5b] 도 5b는 실시예 4.4에 개시된 바와 같은, GST-태그에 융합된 MG1-MG2 도메인-유래된 펩타이드 단편(서열번호 40의 아미노산 33-124, 45-124, 52-124, 33-111, 33-108 및 45-111)에 대한 웨스턴 블럿 분석을 예시한다. CFA0305는 반응을 위한 항체로서 사용된다.
[도 5c] 도 5c는 실시예 4.4에 개시된 바와 같은, C5 베타-쇄-유래된 단편에 대한 항-C5 항체의 결합 반응을 요약한다. 에피토프 C로 분류된 항-C5 항체들(CFA0305, CFA0307, CFA0366, CFA0501, CFA0538, CFA0599, CFA0666, CFA0672 및 CFA0675)이 결합하는 단편들을 회색으로 도시하고 이들이 결합하지 않는 단편들은 백색으로 도시한다.
[도 6] 도 6은 실시예 4.5에 개시된 바와 같은, 베타-쇄의 E48, D51 및 K109가 알라닌으로 치환된 C5 점 돌연변이체(각각 E48A, D51A 및 K109A)에 대한 웨스턴 블럿 분석을 예시한다. 좌측 패널에서, 에쿨리주맵(항-C5 항체, 알파-쇄 결합제)은 반응을 위한 항체로서 사용되며 C5의 알파-쇄(대략 113 kDa)의 위치는 화살표로 표시된다. 우측 패널에서, CFA0305(에피토프 C로서 분류됨, 베타-쇄 결합제)는 반응을 위한 항체로서 사용되며 C5의 베타-쇄(대략 74 kDa)의 위치는 화살촉으로 표시된다.
[도 7] 도 7은 실시예 4.6에 개시된 바와 같은, 에쿨리주맵-F760G4(상부 패널) 또는 305LO5(하부 패널)와 C5 돌연변이체와의 상호작용을 나타내는 BIACORE(등록상표) 센서그램을 나타낸다. 센서그램은 에쿨리주맵-F760G4 또는 305LO5로 고정화된 센서 표면상에, 각각 C5-wt(굵은 실선), C5-E48A(짧은 파선), C5-D51A(긴 파선), 및 C5-K109A(가는 실선)의 주입에 의해 획득되었다. 에쿨리주맵은 대조용 항-C5 항체이다. 305LO5는 실시예 2.3에 개시된 바와 같은, CFA0305(에피토프 C로 분류됨)의 인간화된 항체이다.
[도 8] 도 8은 실시예 4.7에 개시된 바와 같은, pH-의존성을 평가하기 위한 305LO5와 C5 His 돌연변이체와의 상호작용을 나타내는 BIACORE(등록상표) 센서그램을 나타낸다. 센서그램은 305LO5로 고정화된 센서 표면상에, 각각 C5-wt(굵은 실선), C5-H70Y(긴 파선), C5-H72Y(짧은 파선), C5-H110Y(점선), 및 C5-H70Y+H110Y(가는 실선)의 주입에 의해 획득되었다. 상기 항체/항원 복합체를 pH-의존적 상호작용을 평가하기 위해서 pH 7.4에서 해리시킨 다음, pH 5.8에서 추가로 해리시켰다(화살표로 가리킴).
[도 9a] 도 9a는 실시예 5.1에 개시된 바와 같은, 항-C5 항체에 의한 보체-활성화된 리포솜 용해의 저해를 예시한다. 실시예 2.2에 개시된 바와 같은, 에피토프 C로 분류된 CFA0305, CFA0307, CFA0366, CFA0501, CFA0538, CFA0599, CFA0666, CFA0672 및 CFA0675의 결과를 도시한다.
[도 9b] 도 9b는 실시예 5.1에 개시된 바와 같은, 항-C5 항체에 의한 보체-활성화된 리포솜 용해의 저해를 예시한다. 실시예 2.2에 개시된 바와 같은, 에피토프 B로 분류된 항체 CFA0330 및 CFA0341의 결과를 도시한다.
[도 10a] 도 10a는 실시예 5.2에 개시된 바와 같은, 항-C5 항체에 의한 C5a 생성의 저해를 예시한다. C5a 농도를 도 9a에 개시된 리포솜 용해 분석 동안 수득된 상등액 중에서 정량분석하였다.
[도 10b] 도 10b는 실시예 5.2에 개시된 바와 같은, 항-C5 항체에 의한 C5a 생성의 저해를 예시한다. C5a 농도를 도 9b에 개시된 리포솜 용해 분석 동안 수득된 상등액 중에서 정량분석하였다.
[도 11] 도 11은 실시예 5.3에 개시된 바와 같은, 항-C5 항체에 의한 보체-활성화된 용혈의 저해를 예시한다. 보체는 고전경로를 통해 활성화되었다.
[도 12] 도 12는 실시예 5.4에 개시된 바와 같은, 항-C5 항체에 의한 보체-활성화된 용혈의 저해를 예시한다. 보체는 부 경로를 통해 활성화되었다.
[도 13] 도 13은 실시예 8.1에 개시된 바와 같은, 항-C5 항체에 의한 보체-활성화된 리포솜 용해의 저해를 예시한다. 항체 305LO15-SG422, 305LO16-SG422, 305LO18-SG422, 305LO19-SG422, 305LO20-SG422, 및 305LO20-SG115의 결과를 도시한다.
[도 14] 도 14는 실시예 8.1에 개시된 바와 같은, 항-C5 항체에 의한 보체-활성화된 리포솜 용해의 저해를 예시한다. 항체 305LO15-SG115 및 305LO23-SG429의 결과를 도시한다.
[도 15] 도 15는 실시예 8.1에 개시된 바와 같은, 항-C5 항체에 의한 보체-활성화된 리포솜 용해의 저해를 예시한다. 항체 305LO22-SG115, 305LO22-SG422, 305LO23-SG115, 및 305LO23-SG422의 결과를 도시한다.
[도 16] 도 16은 실시예 8.2에 개시된 바와 같은, 항-C5 항체에 의한 C5a 생성의 저해를 예시한다. C5a 농도를 도 13에 개시된 리포솜 용해 분석 동안 수득된 상등액 중에서 정량분석하였다.
[도 17] 도 17은 실시예 8.2에 개시된 바와 같은, 항-C5 항체에 의한 C5a 생성의 저해를 예시한다. C5a 농도를 도 14에 개시된 리포솜 용해 분석 동안 수득된 상등액 중에서 정량분석하였다.
[도 18] 도 18은 실시예 8.3에 개시된 바와 같은, 항-C5 항체에 의한 원숭이 혈장에서의 보체 활성의 저해를 예시한다. 항-C5 항체를 키노몰구스 원숭이에게 투여하고, 상기 원숭이의 혈장 중 보체 활성을 용혈 분석에서 측정하였다.
[도 19] 도 19는 실시예 8.4에 개시된 바와 같은, 항-C5 항체(에쿨리주맵)에 의한 야생형 C5(WT) 및 C5 변이체(V145I, R449G, V802I, R885H, R928Q, D966Y, S1310N, 및 E1437D)의 생물학적 활성의 저해를 예시한다.
[도 20] 도 20은 실시예 8.4에 개시된 바와 같은, 항-C5 항체(305 변이체)에 의한 야생형 C5(WT) 및 C5 변이체(V145I, R449G, V802I, R885H, R928Q, D966Y, S1310N, 및 E1437D)의 생물학적 활성의 저해를 예시한다.
[도 21] 도 21은 실시예 8.5에 개시된 바와 같은, 항-C5 항체(BNJ441 및 305 변이체)에 의한 보체-활성화된 리포솜 용해의 저해를 예시한다.
[도 22] 도 22a 및 22b는 실시예 9.6에 개시된 바와 같은, 인간 C5(hC5)-MG1 도메인에 결합된 305 Fab의 결정 구조를 예시한다. 도 22a는 비대칭 유닛을 예시한다. MG1은 표면 표현으로 나타내고 305 Fab는 리본으로서 도시한다(짙은 회색: 중쇄, 밝은 회색: 경쇄). 도 22b는 겹쳐진 분자 1 및 2를 예시한다(짙은 회색: 분자 1, 밝은 회색: 분자 2).
[도 23a] 도 23a는 실시예 9.6에 개시된 바와 같은, MG1 도메인상의 305 Fab 접촉 영역의 에피토프를 예시한다. 도 23a는 MG1 아미노산 서열에서의 에피토프 맵핑을 예시한다(짙은 회색: 3.0 옹스트롬보다 가까움, 밝은 회색: 4.5 옹스트롬보다 가까움).
[도 23b] 도 23b는 실시예 9.6에 개시된 바와 같은, MG1 도메인상의 305 Fab 접촉 영역의 에피토프를 예시한다. 도 23b는 결정 구조에서의 에피토프 맵핑을 예시한다(짙은 회색 구: 3.0 옹스트롬보다 가까움, 밝은 회색 막대: 4.5 옹스트롬보다 가까움).
[도 24a] 도 24a는 실시예 9.7에 개시된 바와 같은, E48, D51 및 K109(막대 표현)와 305 Fab(표면 표현)와의 상호작용의 근접도를 예시한다.
[도 24b] 도 24b는 실시예 9.7에 개시된 바와 같은, E48과 그의 환경간의 상호작용을 예시한다(짙은 회색 점선: Fab와의 수소 결합, 밝은 회색 점선: 수-매개된 수소 결합).
[도 24c] 도 24c는 실시예 9.7에 개시된 바와 같은, D51과 그의 환경간의 상호작용을 예시한다(짙은 회색 점선: Fab와의 수소 결합).
[도 24d] 도 24d는 실시예 9.7에 개시된 바와 같은, K109와 그의 환경간의 상호작용을 예시한다(짙은 회색 점선: Fab와의 수소 결합, 밝은 회색 점선: H-CDR3_D95와의 염 가교).
[도 25a] 도 25a는 도 24a와 동일한 배향으로, 실시예 9.8에 개시된 바와 같은, H70, H72 및 H110(막대 표현)과 305 Fab(표면 표현)와의 상호작용의 근접도를 예시한다.
[도 25b] 도 25b는 실시예 9.8에 개시된 바와 같은, H70과 그의 환경간의 상호작용을 예시한다. 히스티딘 잔기는 막대 및 망 표현으로 나타낸다. 수소 결합은 점선에 의해 표시한다.
[도 25c] 도 25c는 실시예 9.8에 개시된 바와 같은, H72와 그의 환경간의 상호작용을 예시한다. 히스티딘 잔기는 막대 및 망 표현으로 나타낸다. 수소 결합은 점선에 의해 표시한다.
[도 25d] 도 25d는 실시예 9.8에 개시된 바와 같은, H110과 그의 환경간의 상호작용을 예시한다. 히스티딘 잔기는 막대 및 망 표현으로 나타낸다. H110과 H-CDR3_H100c간의 거리는 점선에 의해 나타낸다.
본 명세서에 개시되거나 참조된 기법 및 과정들은 당해 분야의 숙련가들에 의해 일반적으로 충분히 이해되며 통상적인 방법, 예를 들어 하기 문헌들에 개시된 광범위하게 사용되는 방법을 사용하여 통상적으로 사용된다: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003)); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); 및 Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993).
I. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 기술과학 용어들은 본 발명이 속하는 분야의 통상적인 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 문헌[Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994)], 및 문헌[March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992)]은 당해 분야의 숙련가에게 본 출원에 사용된 용어들 중 다수에 대한 일반적인 지침을 제공한다. 특허 출원 및 공보를 포함하여, 본 명세서에 인용된 모든 참고문헌들은 내용 전체가 참고로 인용된다.
본 명세서를 해석하기 위해서, 하기의 정의들을 적용할 것이며, 적합한 경우, 단수로 사용된 용어들은 또한 복수를 포함할 것이고 이와 역도 마찬가지일 것이다. 본 명세서에 사용된 용어는 단지 특정한 실시태양들을 개시하기 위한 것이며 제한을 의도하지 않음은 물론이다. 하기에 제시된 임의의 정의가 본 발명에 참고로 인용된 임의의 문서와 모순이 되는 경우, 하기에 제시된 정의가 우선할 것이다.
본 명세서의 목적에 대해서 "수용체 인간 프레임워크"는 하기에 정의되는 바와 같은, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크로부터 유래된 경쇄 가변 도메인(VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인(VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크"로부터 유래된" 수용체 인간 프레임워크는 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 아미노산 서열 변화를 함유할 수도 있다. 일부 실시태양에서, 아미노산 변화의 수는 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 6 이하, 5 이하, 4 이하, 3 이하 또는 2이하이다. 일부 실시태양에서, 상기 VL 수용체 인간 프레임워크는 VL 인간 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 공통 프레임워크 서열과 서열이 일치한다.
"친화성"은 분자의 단일 결합 부위(예를 들어 항체)와 그의 결합짝(예를 들어 항원)간의 비공유 상호작용의 총합의 강도를 지칭한다. 달리 지시되지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "결합 친화성"은 결합쌍의 구성원들(예를 들어 항체와 항원)간의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화성을 지칭한다. 분자 X의 그의 짝 Y에 대한 친화성을 일반적으로 해리 상수(Kd)에 의해 나타낼 수 있다. 친화성을 당해 분야에 공지된 통상적인 방법, 예를 들어 본 명세서에 개시된 것들에 의해 측정할 수 있다. 결합 친화성을 측정하기 위한 구체적인 예시적이고 전형적인 실시태양들을 하기에 개시한다.
"친화성 성숙" 항체는 하나 이상의 변경을 갖지 않는 모 항체에 비해 하나 이상의 고가변 영역(HVR) 중에 상기와 같은 변경을 갖는 항체를 지칭하며, 상기와 같은 변경은 항원에 대한 상기 항체의 친화성을 개선시킨다.
"항-C5 항체" 및 "C5에 결합하는 항체"란 용어들은 상기 항체가 C5를 표적화함에 있어서 진단 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화성으로 C5에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 하나의 실시태양에서, 항-C5 항체의 관련되지 않은, 비-C5 단백질에의 결합 정도는, 예를 들어 방사성면역분석(RIA)에 의해 측정시 C5에 대한 상기 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 몇몇 실시태양에서, C5에 결합하는 항체는 ≤1 마이크로 M, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.1 nM, ≤0.01 nM, ≤0.001 nM(예를 들어 10-8 M 이하, 예를 들어 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수(Kd)를 갖는다. 몇몇 실시태양에서, 항-C5 항체는 상이한 종들로부터의 C5 간에 보존된 C5의 에피토프에 결합한다.
본 명세서에서 "항체"란 용어는 가장 광범위한 의미로 사용되며 다양한 항체 구조물들, 예를 들어 비제한적으로 단클론 항체, 다클론 항체, 다중특이성 항체(예를 들어 이중특이성 항체), 및 목적하는 항원-결합 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함한다.
"항체 단편"은 완전 항체가 결합하는 항원에 결합하는 상기 완전 항체의 일부를 포함하는, 완전 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 비제한적으로 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 다이아바디; 선형 항체; 단쇄 항체 분자(예를 들어 scFv); 및 항체 단편들로부터 형성된 다중특이성 항체를 포함한다.
참조 항체와 "동일한 에피토프에 결합하는 항체"는 경쟁 분석에서 상기 참조 항체의 그의 항원에의 결합을 차단하는 항체를 지칭하고/하거나, 환언하면 상기 참조 항체는 경쟁 분석에서 상기 항체의 그의 항원에의 결합을 차단한다. 예시적인 경쟁 분석을 본 명세서에 제공한다.
"키메릭" 항체란 용어는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 공급원 또는 종으로부터 유래하는 반면 상기 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지는 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래하는 항체를 지칭한다.
항체의 "클래스"는 상기 항체의 중쇄에 의해 소유되는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 항체의 5개의 주요 클래스: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하며, 이들 중 다수는 서브클래스(아이소타입), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 세분될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 클래스들에 상응하는 중쇄 불변 도메인들을 각각 알파, 델타, 입실론, 감마 및 뮤라 칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "세포독성제"란 용어는 세포 기능을 저해 또는 방지하고/하거나 세포사 또는 파괴를 야기하는 물질을 지칭한다. 세포독성제는 비제한적으로 방사성 동위원소(예를 들어 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소); 화학요법제 또는 약물(예를 들어 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈카 알칼로이드(빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 삽입제); 성장 저해제; 효소 및 그의 단편, 예를 들어 핵산분해효소; 항생제; 독소, 예를 들어 소분자 독소 또는 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소(그의 단편 및/또는 변이체 포함); 및 하기에 개시된 다양한 항종양 또는 항암제를 포함한다.
"효과기 기능"은 항체의 Fc 영역에 기인하는 생물학적 활성들을 지칭하며, 항체 아이소타입에 따라 변한다. 항체 효과기 기능의 예는 C1q 결합 및 보체 의존적 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존적 세포-매개된 세포독성(ADCC); 포식작용; 세포표면 수용체(예를 들어 B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화를 포함한다.
작용제, 예를 들어 약학 제형의 "유효량"은 필요한 용량에서 필요한 기간동안 목적하는 치료학적 또는 예방학적 결과를 성취하기에 유효한 양을 지칭한다.
"에피토프"란 용어는 항체에 의해 결합될 수 있는 임의의 결정기를 포함한다. 에피토프는 항원을 표적화하는 항체에 의해 결합되는 상기 항원의 영역이며, 상기 항체와 직접 접촉하는 특정한 아미노산을 포함한다. 에피토프 결정기는 아미노산, 당측쇄, 포스포릴 또는 설포닐기와 같은 화학적으로 활성인 표면 분자군을 포함할 수 있으며, 특이적인 3차원 구조 특성 및/또는 특정한 전하 특성을 가질 수 있다. 일반적으로, 특정 표적 항원에 특이적인 항체들은 단백질 및/또는 거대분자의 복잡한 혼합물 중의 표적 항원상의 에피토프를 우선적으로 인식할 것이다.
본 명세서에서 "Fc 영역"이란 용어는 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 한정하는데 사용된다. 상기 용어는 천연서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226 또는 Pro230으로부터 상기 중쇄의 카복시-말단까지 연장된다. 그러나, 상기 Fc 영역의 C-말단 리신(Lys447)은 존재할 수도, 존재하지 않을 수도 있다. 본 명세서에 달리 명시하지 않는 한, 상기 Fc 영역 또는 불변 영역 중의 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 개시된 바와 같은 EU 넘버링 시스템(또한 EU 지수라 칭한다)에 따른다.
"프레임워크" 또는 "FR"은 고가변 영역(HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3 및 FR4로 이루어진다. 상응하게, 상기 HVR 및 FR 서열들은 일반적으로 VH(또는 VL) 중에 하기의 순서로 존재한다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
"완전길이 항체", "완전 항체", 및 "전체 항체"란 용어는 본 명세서에서 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭하는데 호환적으로 사용된다.
"숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"이란 용어들은 호환적으로 사용되며 외인성 핵산이 도입된 세포(상기와 같은 세포의 자손 포함)를 지칭한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"(1차 형질전환 세포 및 계대수에 상관 없이 상기 세포로부터 유래된 자손을 포함한다)를 포함한다. 자손은 핵산 함량이 모 세포와 완전히 일치하지 않을 수도 있고, 돌연변이를 포함할 수도 있다. 최초로 형질전환된 세포 중에서 선별되거나 선택된 바와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손을 본 발명에 포함시킨다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산되거나 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-암호화 서열을 사용하는 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 것이다. 인간 항체에 대한 상기 정의는 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체를 명확히 제외한다.
"인간 공통 프레임워크"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택시 가장 공통적으로 존재하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 하위그룹으로부터이다. 일반적으로, 상기 서열의 하위그룹은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3]에서와 같은 하위그룹이다. 하나의 실시태양에서, VL의 경우, 하위그룹은 상기 문헌[Kabat et al.]에서와 같은 하위그룹 카파 I이다 하나의 실시태양에서, VH의 경우, 하위그룹은 상기 문헌[Kabat et al.]에서와 같은 하위그룹 III이다.
"인간화된" 항체는 비-인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메릭 항체를 지칭한다. 몇몇 실시태양에서, 인간화된 항체는 적어도 하나 및 전형적으로 2개의, 실질적으로 모든 가변 도메인을 포함할 것이며, 여기에서 상기 HVR(예를 들어 CDR)의 전부 또는 실질적으로 전부는 비-인간 항체의 것들에 상응하고, 상기 FR의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 항체의 것들에 상응한다. 인간화된 항체는 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 임의로 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어 비-인간 항체의 "인간화된 형태"는 인간화를 겪은 항체를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "고가변 영역" 또는 "HVR"이란 용어는 서열이 고가변성이고("상보성 결정 영역" 또는 "CDR")/이거나 구조적으로 한정된 고리("고가변 고리")를 형성하고/하거나 항원-접촉 잔기("항원 접촉부")를 함유하는 항체 가변 도메인의 각각의 영역들을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR: VH 중에 3개(H1, H2, H3) 및 VL 중에 3개(L1, L2, L3)를 포함한다. 본 명세서에서 예시적인 HVR은 (a) 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), 및 96-101 (H3)에서 발생하는 고가변 고리(Chothia, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)); (b) 아미노산 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2), 및 95-102 (H3)에서 발생하는 CDR(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, NIH, Bethesda, MD (1991)); (c) 아미노산 잔기 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2), 및 93-101 (H3)에서 발생하는 항원 접촉부(MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)); 및 (d) HVR 아미노산 잔기 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3), 및 94-102 (H3)을 포함하는 (a), (b), 및/또는 (c)의 조합을 포함한다.
달리 지시되지 않는 한, HVR 잔기 및 가변 도메인 중의 다른 잔기들(예를 들어 FR 잔기)을 본 명세서에서 상기 카밧(Kabat) 등에 따라 넘버링한다.
"면역접합체"는 하나 이상의 이종 분자(들)(비제한적으로 세포독성제를 포함한다)에 접합된 항체이다.
"개인" 또는 "피실험자"는 포유동물이다. 포유동물은 비제한적으로 가축(예를 들어 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예를 들어 인간 및 비-인간 영장류, 예를 들어 원숭이), 토끼, 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트)를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 개인 또는 피실험자는 인간이다.
"단리된" 항체는 그의 천연 환경의 성분으로부터 분리된 것이다. 일부 실시태양에서, 항체를, 예를 들어 전기영동(예를 들어 SDS-PAGE, 등전점분리법(IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피(예를 들어 이온 교환 또는 역상 HPLC) 방법에 의해 측정시 95% 또는 99% 초과 순도로 정제시킨다. 항체 순도 평가 방법에 대한 리뷰를 위해서, 예를 들어 문헌[Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)]을 참조하시오.
"단리된" 핵산은 그의 천연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은 핵산 분자를 통상적으로 함유하는 세포 중에 함유된 핵산 분자를 포함하지만, 상기 핵산 분자는 염색체 외에 존재하거나 그의 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.
"항-C5 항체를 암호화하는 단리된 핵산"은 항체 중쇄 및 경쇄(또는 그의 단편)를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 지칭하며, 상기와 같은 핵산 분자(들)는 단일 벡터 또는 별도의 벡터 중에 포함되고, 상기와 같은 핵산 분자(들)는 숙주 세포 중의 하나 이상의 위치에 존재한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "단클론 항체"란 용어는 실질적으로 균일한 항체의 집단으로부터 획득된 항체를 지칭한다, 즉 상기 집단을 차지하는 개별적인 항체들은 동일하고/하거나, 예를 들어 천연 돌연변이를 함유하거나 또는 단클론 항체 제제의 제조 중 발생하는 가능한 변이 항체(상기와 같은 변이체들은 일반적으로 소량으로 존재한다)를 제외하고 동일한 에피토프에 결합한다. 다클론 항체 제제(전형적으로 상이한 결정기(에피토프)에 대해 상이한 항체를 포함한다)와 대조적으로, 단클론 항체 제제의 각각의 단클론 항체는 항원상의 단일 결정기에 대한 것이다. 따라서, "단클론"이란 수식어는 항체의 실질적으로 균일한 집단으로부터 획득되는 항체의 특성을 가리키며 임의의 특정한 방법에 의해 상기 항체를 제조하는데 요구되는 것으로서 해석해서는 안 된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단클론 항체는 다양한 기법들, 예를 들어 비제한적으로 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유하는 트랜스제닉 동물을 사용하는 방법에 의해 제조될 수 있으며, 상기와 같은 방법 및 다른 예시적인 단클론 항체의 제조 방법들은 본 명세서에 개시되어 있다.
"네이키드 항체"는 이종 부분(예를 들어 세포독성 부분) 또는 방사성 표지에 접합되지 않은 항체를 지칭한다. 상기 네이키드 항체는 약학 제형 중에 존재할 수 있다.
"천연 항체"는 다양한 구조를 갖는 천연 면역글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들어, 천연 IgG 항체는 다이설파이드-결합된 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 구성된, 약 150,000 달톤의 이종사량체성 당단백질이다. N-에서부터 C-말단까지, 각각의 중쇄는 가변 영역(VH)(또한 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인이라 칭한다)에 이어서 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-에서부터 C-말단까지, 각각의 경쇄는 가변 영역(VL)(또한 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인이라 칭한다)에 이어서 불변 경쇄(CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 근거로, 카파(카파) 및 람다(람다)라 칭하는 2가지 유형 중 하나에 속할 수 있다.
"첨부문서"란 용어는 치료 용품의 상업적인 패키지에 상업적으로 포함되며, 상기와 같은 치료 용품의 용도에 관한 적응증, 용법, 용량, 투여방법, 병용요법, 금기 및/또는 경고에 관한 정보를 함유하는 설명서를 지칭하는데 사용된다.
참조 폴리펩타이드 서열에 대한 "아미노산 서열 상동성 (sequence identity) 퍼센트(%)"는 최대의 서열 상동성 퍼센트를 성취하기 위해서, 서열들을 정렬시키고 필요한 경우 틈을 도입시킨 후에, 상기 서열 상동성의 부분으로서 어떠한 보존적 치환도 고려하지 않고서, 상기 참조 폴리펩타이드 서열 중의 아미노산 잔기와 일치하는 후보 서열 중의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 상동성 퍼센트의 측정을 위한 정렬은 당해 분야의 기술내의 다양한 방식으로, 공개적으로 입수할 수 있는 소프트웨어, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 성취될 수 있다. 당해 분야의 숙련가들은 비교되는 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대의 정렬을 성취하는데 필요한 임의의 연산을 포함하여, 서열들을 정렬시키기에 적합한 매개변수들을 결정할 수 있다. 그러나, 본 발명의 목적을 위해서 아미노산 서열 상동성% 값을 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성시킨다. 상기 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크 인코포레이티드(Genentech, Inc.)에 의해 저술되었으며 소스 코드는 미국 저작권청(미국 워싱톤 D.C. 20559 소재)에 사용자용 서류와 함께 제출되었고, 미국 저작권 등록번호는 TXU510087이다. 상기 ALIGN-2 프로그램을 미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코 소재의 제넨테크 인코포레이티드로부터 공개적으로 입수하거나, 또는 상기 소스 코드와 함께 편집할 수 있다. 상기 ALIGN-2 프로그램을 디지털 UNIX V4.0D를 포함한 UNIX 수행 시스템상에서 사용하기 위해 편집해야 한다. 모든 서열 비교 매개변수들을 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정하며 변화시키지 않는다.
ALIGN-2를 아미노산 서열 비교에 사용하는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 A의 주어진 아미노산 서열 B에의, 상기 서열과의 또는 상기 서열에 대한 아미노산 서열 상동성%(이는 달리 주어진 아미노산 서열 B에의, 상기 서열과의 또는 상기 서열에 대한 일정한 아미노산 서열 상동성%를 갖거나 또는 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있다)는 하기와 같이 계산된다: 100 × 분률 X/Y(여기에서 X는 A 및 B의 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에서 상기 프로그램에 의해 동일하게 일치하는 것으로 계산된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B 중의 아미노산 잔기의 총수이다). 상기 아미노산 서열 A의 길이가 상기 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 상동성%는 A에 대한 B의 아미노산 서열 상동성%와 동일하지 않음을 알 것이다. 구체적으로 달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 아미노산 서열 상동성% 값은 상기 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 앞 단락에 개시된 바와 같이 획득된다.
"약학 제형"이란 용어는, 상기 중에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 유효하도록 하는 형태로 존재하고 상기 제형이 투여되는 피실험자에게 허용 가능하지 않게 독성인 추가적인 성분은 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
"약학적으로 허용 가능한 담체"는 활성 성분 이외에, 피실험자에게 무독성인 약학 제형 중의 성분을 지칭한다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 비제한적으로 완충제, 부형제, 안정제 또는 보존제를 포함한다.
본 발명에 사용되는 바와 같은 "C5"란 용어는 영장류(예를 들어 인간 및 원숭이) 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 포함한 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 C5를 포함한다. 달리 지시되지 않는 한, "C5"란 용어는 서열번호 39에 나타낸 아미노산 서열을 갖고 서열번호 40에 나타낸 베타 쇄 서열을 함유하는 인간 C5 단백질을 지칭한다. 상기 용어는 "완전길이"의, 가공되지 않은 C5뿐만 아니라 세포중의 가공으로부터 생성되는 임의의 형태의 C5를 포함한다. 상기 용어는 또한 C5의 천연 변이체, 예를 들어 이어맞추기 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 예시적인 인간 C5의 아미노산 서열을 서열번호 39("야생형" 또는 "WT" C5)에 나타낸다. 인간 C5의 예시적인 베타 쇄의 아미노산 서열을 서열번호 40에 나타낸다. 인간 C5의 베타 쇄의 예시적인 MG1, MG2 및 MG1-MG2 도메인의 아미노산 서열을 각각 서열번호 41, 42 및 43에 나타낸다. 예시적인 키노몰구스 원숭이 및 쥐 C5의 아미노산 서열을 각각 서열번호 44 및 105에 나타낸다. 서열번호 39, 40, 43, 44 및 105의 아미노산 잔기 1-19는, 세포 중에서 가공 중에 제거되고 따라서 상응하는 예시적인 아미노산 서열로부터 누락되는 신호 서열에 상응한다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "치료"(및 그의 문법적 파생어, 예를 들어 "치료하다" 또는 "치료하는")는 치료되는 개인의 자연 경과를 변경시키고자 하는 임상적 중재를 지칭하며, 예방을 위해서 또는 임상 병리 과정 동안 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 비제한적으로 질병의 발생 또는 재발 방지, 증상의 경감, 질병의 임의의 직접적인 또는 간접적인 병리 결과의 감소, 전이 예방, 질병 진행률의 감소, 질병 상태의 개선 또는 완화, 및 진정 또는 개선된 예후를 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 항체를 사용하여 질병의 발생을 지연시키거나 또는 질병의 진행을 늦춘다.
"가변 영역" 또는 "가변 도메인"이란 용어는 항체의 항원에 대한 결합에 관련된 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 이때 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역(FR) 및 3개의 고가변 영역(HVR)을 포함한다(예를 들어 문헌[Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)]을 참조하시오). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 더욱 또한, 특정 항원에 결합하는 항체를 각각 상보성 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 선별하기 위해 상기 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리시킬 수 있다. 예를 들어 문헌[Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)]을 참조하시오.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "벡터"란 용어는 연결된 또 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자기-복제 핵산 구조로서 벡터뿐만 아니라 상기 벡터가 도입된 숙주 세포의 게놈내에 통합된 벡터를 포함한다. 몇몇 벡터는 이들이 작동적으로 연결되는 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 상기와 같은 벡터를 본 명세서에서 "발현 벡터"라 칭한다.
II. 조성물 및 방법
하나의 태양에서, 본 발명은, 부분적으로, 항-C5 항체 및 그의 용도를 기본으로 한다. 몇몇 실시태양에서, C5에 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 예를 들어 질병의 진단 또는 치료에 유용하다.
A. 예시적인 항-C5 항체
하나의 태양에서, 본 발명은 C5에 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 항-C5 항체는 C5의 베타 쇄내의 에피토프에 결합한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 항-C5 항체는 C5의 베타 쇄의 MG1-MG2 도메인내의 에피토프에 결합한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 항-C5 항체는 C5의 베타 쇄의 아미노산 19-180으로 이루어지는 단편내의 에피토프에 결합한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 항-C5 항체는 C5의 베타 쇄의 MG1 도메인(서열번호 40의 아미노산 20-124(서열번호 41))내의 에피토프에 결합한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 항-C5 항체는 C5의 베타 쇄(서열번호 40)의 아미노산 33-124로 이루어지는 단편내의 에피토프에 결합한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 항체는 C5의 베타 쇄의 아미노산 33-124로 이루어지는 단편보다 짧은 단편, 예를 들어 C5의 베타 쇄(서열번호 40)의 아미노산 45-124, 52-124, 33-111, 33-108 또는 45-111로 이루어지는 단편에는 결합하지 않는다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 pH-의존적 결합 특성을 나타내는 항-C5 항체를 제공한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "pH-의존적 결합"이란 표현은 항체가 "중성 pH에서의 결합에 비해 산성 pH에서 C5에 대해 감소된 결합"을 나타냄을 의미한다(본 개시의 목적을 위해서, 상기 두 표현은 모두 호환적으로 사용될 수 있다). 예를 들어, "pH-의존적 결합 특성을 갖는" 항체는 산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화성으로 C5에 결합하는 항체를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 항체는 산성 pH에서보다 중성 pH에서 적어도 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000배, 또는 그 이상 더 큰 친화성으로 C5에 결합한다. 추가의 실시태양에서, 상기 항체는 pH 5.8에서보다 pH 7.4에서 더 큰 친화성으로 C5에 결합한다. 추가의 실시태양에서, 본 발명의 항체는 pH 5.8에서보다 pH 7.4에서 적어도 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000배, 또는 그 이상 더 큰 친화성으로 C5에 결합한다.
본 개시의 목적을 위해서 C5에 대한 항체의 "친화성"을 상기 항체의 KD에 의해 나타낸다. 항체의 KD는 항체-항원 상호작용의 평형 해리 상수를 지칭한다. 항원에의 항체 결합에 대해서 상기 KD 값이 클수록, 상기 특정 항원에 대한 그의 결합 친화성은 약해진다. 상응하게, 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화성"이란 표현(또는 "pH-의존적 결합"이란 동등한 표현)은 산성 pH에서 C5에의 항체 결합에 대한 KD가 중성 pH에서 C5에의 항체 결합에 대한 KD보다 더 큼을 의미한다. 예를 들어, 본 발명과 관련하여, 항체는, 산성 pH에서 C5에 대한 항체 결합의 KD가 중성 pH에서 C5에 대한 항체 결합의 KD보다 적어도 2배 더 큰 경우 산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 큰 친화성으로 C5에 결합하는 것으로 간주된다. 따라서, 본 발명은 중성 pH에서 C5에 결합하는 항체의 KD보다 적어도 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000배, 또는 그 이상 더 큰 KD로 산성 pH에서 C5에 결합하는 항체를 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 중성 pH에서 상기 항체의 KD 값은 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 10-12 M 이하일 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 산성 pH에서 상기 항체의 KD 값은 10-9 M, 10-8 M, 10-7 M, 10-6 M 이상일 수 있다.
추가의 실시태양에서 항체는 pH 5.8에서 C5에 대한 항체 결합의 KD가 pH 7.4에서 C5에 대한 항체 결합의 KD보다 적어도 2배 더 큰 경우 산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 큰 친화성으로 C5에 결합하는 것으로 간주된다. 일부 실시태양에서, 상기 제공된 항체는 pH 7.4에서 C5에 결합하는 항체의 KD보다 적어도 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000배, 또는 그 이상 더 큰 KD로 pH 5.8에서 C5에 결합한다. 또 다른 실시태양에서, pH 7.4에서 상기 항체의 KD 값은 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 10-12 M 이하일 수 있다. 또 다른 실시태양에서, pH 5.8에서 상기 항체의 KD 값은 10-9 M, 10-8 M, 10-7 M, 10-6 M 이상일 수 있다.
특정 항원에 대한 항체의 결합 성질을 또한 상기 항체의 kd에 의해 표현할 수 있다. 항체의 kd는 특정 항원에 대한 상기 항체의 해리속도 상수를 지칭하며 초의 역수(즉 초-1)에 의해 표현된다. kd 값의 증가는 항체의 그의 항원에 대한 보다 약한 결합을 의미한다. 따라서 본 발명은 중성 pH에서보다 산성 pH에서 더 큰 kd 값으로 C5에 결합하는 항체들을 포함한다. 본 발명은 중성 pH에서 C5에 결합하는 항체의 kd보다 적어도 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000배, 또는 그 이상 더 큰 kd로 산성 pH에서 C5에 결합하는 항체를 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 중성 pH에서 상기 항체의 kd 값은 10-2 ℓ/s, 10-3 ℓ/s, 10-4 ℓ/s, 10-5 ℓ/s, 10-6 ℓ/s 이하이다. 또 다른 실시태양에서, 산성 pH에서 상기 항체의 kd 값은 10-3 ℓ/s, 10-2 ℓ/s, 10-1 ℓ/s 이상이다. 본 발명은 또한 pH 7.4에서보다 pH 5.8에서 더 큰 kd 값으로 C5에 결합하는 항체를 포함한다. 본 발명은 pH 7.4에서 C5에 결합하는 항체의 kd보다 적어도 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000배, 또는 그 이상 더 큰 kd로 pH 5.8에서 C5에 결합하는 항체를 포함한다. 또 다른 실시태양에서, pH 7.4에서 상기 항체의 kd 값은 10-2 ℓ/s, 10-3 ℓ/s, 10-4 ℓ/s, 10-5 ℓ/s, 10-6 ℓ/s 이하일 수 있다. 또 다른 실시태양에서, pH 5.8에서 상기 항체의 kd 값은 10-3 ℓ/s, 10-2 ℓ/s, 10-1 ℓ/s 이상일 수 있다.
몇몇 경우에, "중성 pH에서의 결합에 비해 산성 pH에서 C5에 대해 감소된 결합"은 산성 pH에서 C5에 대한 항체 결합의 KD 값 대 중성 pH에서 C5에 대한 항체 결합의 KD 값의 비(또는 이와 역)에 의해 나타낸다. 예를 들어, 항체가 2 이상의 산성/중성 KD 비를 나타내는 경우, 본 발명의 목적을 위해서, 항체는 "중성 pH에서의 결합에 비해 산성 pH에서 C5에 대해 감소된 결합"을 나타내는 것으로서 간주될 수 있다. 몇몇 예시적인 실시태양에서, 본 발명의 항체에 대한 pH 5.8/pH 7.4 KD 비는 2 이상이다. 몇몇 예시적인 실시태양에서, 본 발명의 항체에 대한 산성/중성 KD 비는 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 이상일 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 중성 pH에서 상기 항체의 KD 값은 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 10-12 M 이하일 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 산성 pH에서 상기 항체의 KD 값은 10-9 M, 10-8 M, 10-7 M, 10-6 M 이상일 수 있다. 추가의 실시태양에서 항체가 2 이상의 pH 5.8/pH 7.4 KD 비를 나타내는 경우, 본 발명의 목적을 위해서, 항체는 "중성 pH에서의 결합에 비해 산성 pH에서 C5에 대해 감소된 결합"을 나타내는 것으로서 간주될 수 있다. 몇몇 예시적인 실시태양에서, 본 발명의 항체에 대한 pH 5.8/pH 7.4 KD 비는 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000, 또는 그 이상일 수 있다. 또 다른 실시태양에서, pH 7.4에서 상기 항체의 KD 값은 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 10-12 M 이하일 수 있다. 또 다른 실시태양에서, pH 5.8에서 상기 항체의 KD 값은 10-9 M, 10-8 M, 10-7 M, 10-6 M 이상일 수 있다.
몇몇 경우에, "중성 pH에서의 결합에 비해 산성 pH에서 C5에 대해 감소된 결합"은 산성 pH에서 C5에 대한 항체 결합의 kd 값 대 중성 pH에서 C5에 대한 항체 결합의 kd 값의 비(또는 이와 역)에 의해 나타낸다. 예를 들어, 항체가 2 이상의 산성/중성 kd 비를 나타내는 경우, 본 발명의 목적을 위해서, 항체는 "중성 pH에서의 결합에 비해 산성 pH에서 C5에 대해 감소된 결합"을 나타내는 것으로서 간주될 수 있다. 몇몇 예시적인 실시태양에서, 본 발명의 항체에 대한 pH 5.8/pH 7.4 kd 비는 2 이상이다. 몇몇 예시적인 실시태양에서, 본 발명의 항체에 대한 산성/중성 kd 비는 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 이상일 수 있다. 추가의 예시적인 실시태양에서, 본 발명의 항체에 대한 pH 5.8/pH 7.4 kd 비는 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000, 또는 그 이상일 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 중성 pH에서 상기 항체의 kd 값은 10-2 ℓ/s, 10-3 ℓ/s, 10-4 ℓ/s, 10-5 ℓ/s, 10-6 ℓ/s 이하일 수 있다. 추가의 실시태양에서, pH 7.4에서 상기 항체의 kd 값은 10-2 ℓ/s, 10-3 ℓ/s, 10-4 ℓ/s, 10-5 ℓ/s, 10-6 ℓ/s 이하일 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 산성 pH에서 상기 항체의 kd 값은 10-3 ℓ/s, 10-2 ℓ/s, 10-1 ℓ/s 이상일 수 있다. 추가의 실시태양에서, pH 5.8에서 상기 항체의 kd 값은 10-3 ℓ/s, 10-2 ℓ/s, 10-1 ℓ/s 이상일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "산성 pH"란 표현은 4.0 내지 6.5의 pH를 의미한다. "산성 pH"란 표현은 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 및 6.5 중 어느 하나의 pH 값을 포함한다. 특정한 태양에서, 상기 "산성 pH"는 5.8이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "중성 pH"란 표현은 6.7 내지 약 10.0의 pH를 의미한다. "중성 pH"란 표현은 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 및 10.0 중 어느 하나의 pH 값을 포함한다. 특정한 태양에서, 상기 "중성 pH"는 7.4이다.
본 명세서에서 표현되는 바와 같은, KD 값 및 kd 값을, 항체-항원 상호작용을 특성화하기 위해 표면 플라스몬 공명-기반 바이오센서를 사용하여 측정할 수 있다(예를 들어 본 명세서의 실시예 3을 참조하시오). KD 값 및 kd 값을 25 ℃ 또는 37 ℃에서 측정할 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명의 항-C5 항체는 MG1 도메인(서열번호 41)으로 이루어지는 C5의 베타 쇄내의 에피토프에 결합한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 항-C5 항체는 아미노산 47-57, 70-76 및 107-110으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 단편을 포함하는 C5의 베타 쇄(서열번호 40)내의 에피토프에 결합한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 항-C5 항체는 Thr47, Glu48, Ala49, Phe50, Asp51, Ala52, Thr53, Lys57, His70, Val71, His72, Ser74, Glu76, Val107, Ser108, Lys109, 및 His110로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 C5의 베타 쇄(서열번호 40)의 단편내의 에피토프에 결합한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 항-C5 항체는 Glu48, Asp51, His70, His72, Lys109 및 His110으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 C5의 베타 쇄(서열번호 40)의 단편내의 에피토프에 결합한다. 몇몇 실시태양에서, C5 돌연변이체에 대한 본 발명의 항-C5 항체의 결합은 야생형 C5에 대한 그의 결합에 비해 감소되며, 여기에서 상기 C5 돌연변이체는 Glu48, Asp51, His72 및 Lys109로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 위치에 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는다. 또 다른 실시태양에서, C5 돌연변이체에 대한 본 발명의 항-C5 항체의 pH-의존적 결합은 야생형 C5에 대한 그의 pH-의존적 결합에 비해 감소되며, 여기에서 상기 C5 돌연변이체는 His70, His72 및 His110으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 위치에 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는다. 추가의 실시태양에서, 상기 C5 돌연변이체에서, Glu48, Asp51 및 Lys109 중에서 선택된 위치의 아미노산은 알라닌으로 치환되고, His70, His72 및 His110 중에서 선택된 위치의 아미노산은 티로신에 의해 치환된다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명의 항-C5 항체는 C5와의 결합에 대해서 하기 중에서 선택된 VH 및 VL 쌍을 포함하는 항체와 경쟁한다: (a) 서열번호 1의 VH 및 서열번호 11의 VL; (b) 서열번호 22의 VH 및 서열번호 26의 VL; (c) 서열번호 21의 VH 및 서열번호 25의 VL; (d) 서열번호 5의 VH 및 서열번호 15의 VL; (e) 서열번호 4의 VH 및 서열번호 14의 VL; (f) 서열번호 6의 VH 및 서열번호 16의 VL; (g) 서열번호 2의 VH 및 서열번호 12의 VL; (h) 서열번호 3의 VH 및 서열번호 13의 VL; (i) 서열번호 9의 VH 및 서열번호 19의 VL; (j) 서열번호 7의 VH 및 서열번호 17의 VL; (k) 서열번호 8의 VH 및 서열번호 18의 VL; (l) 서열번호 23의 VH 및 서열번호 27의 VL; 및 (m) 서열번호 10의 VH 및 서열번호 20의 VL.
몇몇 실시태양에서, 본 발명의 항-C5 항체는 C5와 결합하고 서열번호 39의 아미노산 Asp51(D51)과 접촉한다. 추가의 실시태양에서, 본 발명의 항-C5 항체는 C5와 결합하고 서열번호 39의 아미노산 Lys109(K109)와 접촉한다. 추가의 실시태양에서, 본 발명의 항-C5 항체는 C5와 결합하고 서열번호 39의 아미노산 Asp51(D5) 및 아미노산 Lys109(K109)와 접촉한다.
몇몇 실시태양에서, C5 돌연변이체에 대한 본 발명의 항-C5 항체의 결합은 야생형 C5에 대한 그의 결합에 비해 감소되며, 여기에서 상기 C5 돌연변이체는 서열번호 39의 Glu48Ala(E48A) 치환을 갖는다. 또 다른 실시태양에서, C5 돌연변이체에 대한 본 발명의 항-C5 항체의 pH-의존적 결합은 야생형 C5에 대한 그의 pH-의존적 결합에 비해 감소되며, 여기에서 상기 C5 돌연변이체는 서열번호 39의 Glu48Ala(E48A) 치환을 갖는다.
추가의 실시태양에서, 항-C5 항체는 서열번호 39의 아미노산 서열로 이루어지는 C5 단백질에 결합하지만, H72Y 치환을 갖는 서열번호 39의 아미노산 서열로 이루어지는 C5 단백질에는 결합하지 않으며, 여기에서 상기 C5 단백질 및 H72Y 치환된 C5 단백질은 동일한 조건하에서 제조되고 선별된다. 추가의 실시태양에서, 상기 항-C5 항체는 pH 7.4에서 상기 서열번호 39의 아미노산 서열로 이루어지는 C5 단백질에 결합하지만, pH 7.4에서 상기 H72Y 치환된 C5 단백질에는 결합하지 않는다.
특정한 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, C5에 대한 항-C5 항체의 결합이, C5상의 아미노산 잔기가 또 다른 아미노산으로 치환될 때 감소(또는 거의 상실)되는 것으로 추측할 수 있으며, 이는 상기 C5상의 아미노산 잔기가 항-C5 항체와 C5간의 상호작용에 중요하며 상기 항체가 C5상의 아미노산 잔기 주위의 에피토프를 인식할 수 있음을 의미한다.
본 발명에서 서로 경쟁하거나 동일한 에피토프에 결합하는 항-C5 항체들의 그룹이 pH-의존적 결합 특성을 나타낼 수 있음을 발견하였다. 아미노산들 중에서, 대략 6.0 내지 6.5의 pKa 값을 갖는 히스티딘은 중성과 산성 pH 사이에서 상이한 양성자 해리 상태를 가질 수 있다. 따라서, C5상의 히스티딘 잔기는 항-C5 항체와 C5간의 pH-의존성 상호작용에 기여할 수 있다. 특정한 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 항-C5 항체는 C5상의 히스티딘 잔기 주변의 입체구조(pH에 따라 변한다)를 인식할 수 있는 것으로 추측할 수 있다. 상기 추측은 하기에 개시된 실험 결과들과 일치할 수 있다: 항-C5 항체의 pH-의존성은 C5상의 히스티딘 잔기가 또 다른 아미노산으로 치환될 때 감소한다(또는 거의 상실된다)(즉, pH-의존적 결합 특성을 갖는 항-C5 항체는 중성 pH에서 C5의 히스티딘 돌연변이체에 야생형 C5와 유사한 친화성으로 결합하는 반면, 같은 항체는 산성 pH에서 C5의 히스티딘 돌연변이체에 야생형 C5보다 더 높은 친화성으로 결합한다).
몇몇 실시태양에서, 본 발명의 항-C5 항체는 하나보다 많은 종으로부터의 C5에 결합한다. 추가의 실시태양에서, 상기 항-C5 항체는 인간 및 비-인간 동물로부터의 C5에 결합한다. 추가의 실시태양에서, 상기 항-C5 항체는 인간 및 원숭이(예를 들어 키노몰구스, 붉은털 원숭이, 마모셋, 침팬지, 또는 비비)로부터의 C5에 결합한다.
하나의 태양에서, 본 발명은 C5의 활성화를 저해하는 항-C5 항체를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, C5a 및 C5b를 형성하는 C5의 절단을 방지하고, 따라서 C5a와 관련된 아나필라톡식 활성의 발생을 방지할 뿐만 아니라 C5b와 관련된 C5b-9 막 침습 복합체(MAC)의 조립을 방지하는 항-C5 항체를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, C5 전환효소에 의한 C5의 C5a 및 C5b로의 전환을 차단하는 항-C5 항체를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, C5 전환효소의 C5상의 절단 부위에의 접근을 차단하는 항-C5 항체를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, C5의 활성화에 의해 야기된 용혈 활성을 차단하는 항-C5 항체를 제공한다. 추가의 실시태양에서, 본 발명의 항-C5 항체는 고전경로 및/또는 부 경로를 통해 C5의 활성화를 저해한다.
하나의 태양에서, 본 발명은 C5 변이체의 활성화를 저해하는 항-C5 항체를 제공한다. C5 변이체는 돌연변이, 다형 또는 대립유전자 변이와 같은 유전적 변이로 인한 C5의 유전적 변이체를 의미한다. 유전적 변이는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실, 치환 또는 삽입을 포함할 수 있다. C5 변이체는 C5 중의 하나 이상의 유전적 변이를 포함할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 상기 C5 변이체는 야생형 C5와 유사한 생물학적 활성을 갖는다. 상기와 같은 C5 변이체는 V145I, R449G, V802I, R885H, R928Q, D966Y, S1310N, 및 E1437D로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 변이를 포함할 수 있다. 본 명세서에서, 예를 들어 R885H는 885번 위치의 아르기닌이 히스티딘에 의해 치환된 유전적 변이를 의미한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 항-C5 항체는 야생형 C5 및 V145I, R449G, V802I, R885H, R928Q, D966Y, S1310N, 및 E1437D로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 C5 변이체 모두의 활성화를 저해한다.
하나의 태양에서, 본 발명은 (a) 서열번호 45-54 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 55-64 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 65-74 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 75-84 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 85-94 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 95-104 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 중에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 고가변 영역(HVR)을 포함하는 항-C5 항체를 제공한다.
하나의 태양에서, 본 발명은 (a) 서열번호 45-54 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 55-64 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 65-74 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 중에서 선택된 적어도 하나, 적어도 둘 또는 3개의 VH HVR 서열을 전부 포함하는 항체를 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 항체는 서열번호 65-74 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 항체는 서열번호 65-74 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 서열번호 95-104 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 추가의 실시태양에서, 상기 항체는 서열번호 65-74 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열번호 95-104 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 서열번호 55-64 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 추가의 실시태양에서, 상기 항체는 (a) 서열번호 45-54 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 55-64 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 65-74 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 (a) 서열번호 75-84 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 85-94 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 95-104 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 중에서 선택된 적어도 하나, 적어도 둘 또는 3개의 VL HVR 서열을 전부 포함하는 항체를 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 항체는 (a) 서열번호 75-84 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 85-94 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 95-104 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열번호 45-54 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (ii) 서열번호 55-64 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (iii) 서열번호 65-74 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 중에서 선택된 적어도 하나, 적어도 둘 또는 3개의 VH HVR 서열을 전부 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 75-84 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (ii) 서열번호 85-94 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (iii) 서열번호 95-104 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 중에서 선택된 적어도 하나, 적어도 둘 또는 3개의 VL HVR 서열을 전부 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 (a) 서열번호 45-54 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 55-64 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 65-74 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 75-84 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 85-94 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 95-104 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체를 제공한다.
하나의 태양에서, 본 발명은 (a) 서열번호 45, 54, 117, 126 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 55, 64, 118-120, 127 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 65, 74, 121, 128 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 75, 84, 122, 129 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 85, 94, 123-124, 130 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 95, 104, 125, 131 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 중에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-C5 항체를 제공한다.
하나의 태양에서, 본 발명은 (a) 서열번호 45, 54, 117, 126 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 55, 64, 118-120, 127 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 65, 74, 121, 128 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 중에서 선택된 적어도 하나, 적어도 둘 또는 3개의 VH HVR 서열을 전부 포함하는 항체를 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 항체는 서열번호 65, 74, 121, 128 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 항체는 서열번호 65, 74, 121, 128 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 서열번호 95, 104, 125, 131 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 추가의 실시태양에서, 상기 항체는 서열번호 65, 74, 121, 128 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열번호 95, 104, 125, 131 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 및 서열번호 55, 64, 118-120, 127 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 추가의 실시태양에서, 상기 항체는 (a) 서열번호 45, 54, 117, 126 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 55, 64, 118-120, 127 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 65, 74, 121, 128 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 (a) 서열번호 75, 84, 122, 129 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 85, 94, 123-124, 130 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 95, 104, 125, 131 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 중에서 선택된 적어도 하나, 적어도 둘 또는 3개의 VL HVR 서열을 전부 포함하는 항체를 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 항체는 (a) 서열번호 75, 84, 122, 129 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 85, 94, 123-124, 130 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 95, 104, 125, 131 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열번호 45, 54, 117, 126 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (ii) 서열번호 55, 64, 118-120, 127 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (iii) 서열번호 65, 74, 121, 128 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 중에서 선택된 적어도 하나, 적어도 둘 또는 3개의 VH HVR 서열 전부를 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 75, 84, 122, 129 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (ii) 서열번호 85, 94, 123-124, 130 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (iii) 서열번호 95, 104, 125, 131 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 중에서 선택된 적어도 하나, 적어도 둘 또는 3개의 VL HVR 서열 전부를 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 (a) 서열번호 45, 54, 117, 126 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 55, 64, 118-120, 127 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 65, 74, 121, 128 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 75, 84, 122, 129 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 85, 94, 123-124, 130 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 95, 104, 125, 131 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3를 포함하는 항체를 제공한다.
몇몇 실시태양에서, 상기에 제공된 바와 같은 항-C5 항체의 임의의 하나 이상의 아미노산은 하기의 HVR 위치들에서 치환된다: (a) HVR-H1(서열번호 45)에서 5 및 6번 위치; (b) HVR-H2(서열번호 55)에서 1, 3, 9, 11, 13 및 15번 위치; (c) HVR-H3(서열번호 65)에서 2, 5, 6, 12 및 13번 위치; (d) HVR-L1(서열번호 75)에서 1, 5, 7 및 9번 위치; (e) HVR-L2(서열번호 85)에서 4, 5 및 6번 위치; 및 (f) HVR-L3(서열번호 95)에서 2, 4 및 12번 위치.
몇몇 실시태양에서, 상기 치환은 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 보존적 치환이다. 몇몇 실시태양에서, 하기의 치환들 중 임의의 하나 이상이 임의의 조합으로 이루어질 수 있다: (a) HVR-H1(서열번호 45)에서, M5V 또는 C6A; (b) HVR-H2(서열번호 55)에서, C1A 또는 G, Y3F, T9D 또는 E, Y11K 또는 Q, S13D 또는 E, 또는 A15V; (c) HVR-H3(서열번호 65)에서, G2A, V5Q 또는 D, T6Y, Y12H, 또는 L13Y; (d) HVR-L1(서열번호 75)에서, Q1R, N5Q 또는 G, G7S, D9K 또는 S; (e) HVR-L2(서열번호 85)에서, K4T 또는 E, L5T, 또는 A6H, A6 E, 또는 A6Q; (f) HVR-L3(서열번호 95)에서, C2S, C2N, 또는 C2T, F4K; 또는 A12T 또는 A12H.
상기 치환의 모든 가능한 조합은 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3에 대해서 각각 서열번호 126, 127, 128, 129, 130, 및 131의 공통 서열에 의해 포함된다.
상기 실시태양들 중 어느 하나에서, 항-C5 항체는 인간화된다. 하나의 실시태양에서, 항-C5 항체는 상기 실시태양들 중 어느 하나에서와 같이 HVR을 포함하며, 수용체 인간 프레임워크, 예를 들어 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 추가로 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 항-C5 항체는 상기 실시태양들 중 어느 하나에서와 같이 HVR을 포함하며, FR 서열을 포함하는 VH 또는 VL을 추가로 포함하고, 여기에서 상기 FR 서열은 하기와 같다. 중쇄 가변 도메인의 경우, 상기 FR1은 서열번호 132-134 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, FR2는 서열번호 135-136 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, FR3은 서열번호 137-139 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, FR4는 서열번호 140-141 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 경쇄 가변 도메인의 경우, 상기 FR1은 서열번호 142-143 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, FR2는 서열번호 144-145 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, FR3은 서열번호 146-147 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, FR4는 서열번호 148의 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 태양에서, 항-C5 항체는 서열번호 1-10 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 상동성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성을 갖는 VH 서열은 참조서열에 대해 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-C5 항체는 C5에 결합하는 능력은 유지한다. 몇몇 실시태양에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 1-10 중 어느 하나에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 몇몇 실시태양에서, 치환, 삽입 또는 결실이 상기 HVR 밖의 영역(즉 FR 중)에서 발생한다. 임의로, 상기 항-C5 항체는 서열번호 1-10 중 어느 하나에 VH 서열을 포함하며, 상기 서열의 번역후 변형을 포함한다. 특정한 실시태양에서, 상기 VH는 하기 중에서 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다: (a) 서열번호 45-54 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 55-64 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 65-74 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3.
또 다른 태양에서, 서열번호 11-20 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 상동성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항-C5 항체를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성을 갖는 VL 서열은 참조서열에 대해 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-C5 항체는 C5에 결합하는 능력은 유지한다. 몇몇 실시태양에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 11-20 중 어느 하나에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 몇몇 실시태양에서, 치환, 삽입 또는 결실이 상기 HVR 밖의 영역(즉 FR 중)에서 발생한다. 임의로, 상기 항-C5 항체는 서열번호 11-20 중 어느 하나에 VL 서열을 포함하며, 상기 서열의 번역후 변형을 포함한다. 특정한 실시태양에서, 상기 VL은 하기 중에서 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다: (a) 서열번호 75-84 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 85-94 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 95-104 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.
또 다른 태양에서, 상기에 제공된 실시태양들 중 어느 하나에서와 같은 VH, 및 상기에 제공된 실시태양들 중 어느 하나에서와 같은 VL을 포함하는 항-C5 항체를 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 항체는 각각 서열번호 1-10 중 어느 하나 및 서열번호 11-20 중 어느 하나 중의 VH 및 VL 서열을 포함하며, 상기 서열들의 번역-후 변형을 포함한다.
또 다른 태양에서, 항-C5 항체는 서열번호 10, 106-110 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 상동성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성을 갖는 VH 서열은 참조서열에 대해 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-C5 항체는 C5에 결합하는 능력은 유지한다. 몇몇 실시태양에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 10, 106-110 중 어느 하나에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 몇몇 실시태양에서, 치환, 삽입 또는 결실이 상기 HVR 밖의 영역(즉 FR 중)에서 발생한다. 임의로, 상기 항-C5 항체는 서열번호 10, 106-110 중 어느 하나에 VH 서열을 포함하며, 상기 서열의 번역후 변형을 포함한다. 특정한 실시태양에서, 상기 VH는 하기 중에서 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다: (a) 서열번호 45, 54, 117, 126 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 55, 64, 118-120, 127 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 65, 74, 121, 128 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3.
또 다른 태양에서, 항-C5 항체는 서열번호 10, 106-110 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 상동성을 갖는 VH 서열을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성을 갖는 VH 서열은 참조서열에 대해 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-C5 항체는 C5에 결합하는 능력은 유지한다. 몇몇 실시태양에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 10, 106-110 중 어느 하나에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 몇몇 실시태양에서, 치환, 삽입 또는 결실이 상기 HVR 밖의 영역(즉 FR 중)에서 발생한다. 임의로, 상기 항-C5 항체는 서열번호 10, 106-110 중 어느 하나에 VH 서열을 포함하며, 상기 서열의 번역후 변형을 포함한다. 특정한 실시태양에서, 상기 VH는 하기 중에서 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다: (a) 서열번호 45, 54, 117, 126 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 55, 64, 118-120, 127 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 65, 74, 121, 128 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3.
또 다른 태양에서, 항-C5 항체는 서열번호 10의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 상동성을 갖는 VH 서열을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 VH 서열은 서열번호 10의 아미노산 서열이다. 몇몇 실시태양에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성을 갖는 VH 서열은 참조서열에 대해 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-C5 항체는 C5에 결합하는 능력은 유지한다. 몇몇 실시태양에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 10에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 몇몇 실시태양에서, 치환, 삽입 또는 결실이 상기 HVR 밖의 영역(즉 FR 중)에서 발생한다. 임의로, 상기 항-C5 항체는 서열번호 10 중의 VH 서열을 포함하며, 상기 서열의 번역후 변형을 포함한다. 특정한 실시태양에서, 상기 VH는 하기 중에서 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다: (a) 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3.
또 다른 태양에서, 항-C5 항체는 서열번호 106의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 상동성을 갖는 VH 서열을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 VH 서열은 서열번호 106의 아미노산 서열이다. 몇몇 실시태양에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성을 갖는 VH 서열은 참조서열에 대해 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-C5 항체는 C5에 결합하는 능력은 유지한다. 몇몇 실시태양에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 106에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 몇몇 실시태양에서, 치환, 삽입 또는 결실이 상기 HVR 밖의 영역(즉 FR 중)에서 발생한다. 임의로, 상기 항-C5 항체는 서열번호 106 중의 VH 서열을 포함하며, 상기 서열의 번역후 변형을 포함한다. 특정한 실시태양에서, 상기 VH는 하기 중에서 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다: (a) 서열번호 117의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3.
또 다른 태양에서, 항-C5 항체는 서열번호 107의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 상동성을 갖는 VH 서열을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 VH 서열은 서열번호 107의 아미노산 서열이다. 몇몇 실시태양에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성을 갖는 VH 서열은 참조서열에 대해 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-C5 항체는 C5에 결합하는 능력은 유지한다. 몇몇 실시태양에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 107에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 몇몇 실시태양에서, 치환, 삽입 또는 결실이 상기 HVR 밖의 영역(즉 FR 중)에서 발생한다. 임의로, 상기 항-C5 항체는 서열번호 107 중의 VH 서열을 포함하며, 상기 서열의 번역후 변형을 포함한다. 특정한 실시태양에서, 상기 VH는 하기 중에서 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다: (a) 서열번호 117의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 119의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3.
또 다른 태양에서, 항-C5 항체는 서열번호 108의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 상동성을 갖는 VH 서열을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 VH 서열은 서열번호 108의 아미노산 서열이다. 몇몇 실시태양에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성을 갖는 VH 서열은 참조서열에 대해 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-C5 항체는 C5에 결합하는 능력은 유지한다. 몇몇 실시태양에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 108에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 몇몇 실시태양에서, 치환, 삽입 또는 결실이 상기 HVR 밖의 영역(즉 FR 중)에서 발생한다. 임의로, 상기 항-C5 항체는 서열번호 108 중의 VH 서열을 포함하며, 상기 서열의 번역후 변형을 포함한다. 특정한 실시태양에서, 상기 VH는 하기 중에서 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다: (a) 서열번호 117의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3.
또 다른 태양에서, 항-C5 항체는 서열번호 109의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 상동성을 갖는 VH 서열을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 VH 서열은 서열번호 109의 아미노산 서열이다. 몇몇 실시태양에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성을 갖는 VH 서열은 참조서열에 대해 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-C5 항체는 C5에 결합하는 능력은 유지한다. 몇몇 실시태양에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 109에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 몇몇 실시태양에서, 치환, 삽입 또는 결실이 상기 HVR 밖의 영역(즉 FR 중)에서 발생한다. 임의로, 상기 항-C5 항체는 서열번호 109 중의 VH 서열을 포함하며, 상기 서열의 번역후 변형을 포함한다. 특정한 실시태양에서, 상기 VH는 하기 중에서 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다: (a) 서열번호 117의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3.
또 다른 태양에서, 항-C5 항체는 서열번호 110의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 상동성을 갖는 VH 서열을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 VH 서열은 서열번호 110의 아미노산 서열이다. 몇몇 실시태양에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성을 갖는 VH 서열은 참조서열에 대해 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-C5 항체는 C5에 결합하는 능력은 유지한다. 몇몇 실시태양에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 110에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 몇몇 실시태양에서, 치환, 삽입 또는 결실이 상기 HVR 밖의 영역(즉 FR 중)에서 발생한다. 임의로, 상기 항-C5 항체는 서열번호 110 중의 VH 서열을 포함하며, 상기 서열의 번역후 변형을 포함한다. 특정한 실시태양에서, 상기 VH는 하기 중에서 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다: (a) 서열번호 117의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 120의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3.
또 다른 태양에서, 서열번호 20, 111-113 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 상동성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항-C5 항체를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성을 갖는 VL 서열은 참조서열에 대해 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-C5 항체는 C5에 결합하는 능력은 유지한다. 몇몇 실시태양에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 20, 111-113 중 어느 하나에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 몇몇 실시태양에서, 치환, 삽입 또는 결실이 상기 HVR 밖의 영역(즉 FR 중)에서 발생한다. 임의로, 상기 항-C5 항체는 서열번호 20, 111-113 중 어느 하나 중의 VL 서열을 포함하며, 상기 서열의 번역후 변형을 포함한다. 특정한 실시태양에서, 상기 VL은 하기 중에서 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다: (a) 서열번호 75, 84, 122, 129 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 85, 94, 123-124, 130 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 95, 104, 125, 131 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.
또 다른 태양에서, 항-C5 항체는 서열번호 20의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 상동성을 갖는 VL을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 VL 서열은 서열번호 20의 아미노산 서열이다. 몇몇 실시태양에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성을 갖는 VL 서열은 참조서열에 대해 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-C5 항체는 C5에 결합하는 능력은 유지한다. 몇몇 실시태양에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 20에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 몇몇 실시태양에서, 치환, 삽입 또는 결실이 상기 HVR 밖의 영역(즉 FR 중)에서 발생한다. 임의로, 상기 항-C5 항체는 서열번호 20 중의 VL 서열을 포함하며, 상기 서열의 번역후 변형을 포함한다. 특정한 실시태양에서, 상기 VL은 하기 중에서 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다: (a) 서열번호 84의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 104의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.
또 다른 태양에서, 항-C5 항체는 서열번호 111의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 상동성을 갖는 VL을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 VL 서열은 서열번호 111의 아미노산 서열이다. 몇몇 실시태양에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성을 갖는 VL 서열은 참조서열에 대해 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-C5 항체는 C5에 결합하는 능력은 유지한다. 몇몇 실시태양에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 111에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 몇몇 실시태양에서, 치환, 삽입 또는 결실이 상기 HVR 밖의 영역(즉 FR 중)에서 발생한다. 임의로, 상기 항-C5 항체는 서열번호 111 중의 VL 서열을 포함하며, 상기 서열의 번역후 변형을 포함한다. 특정한 실시태양에서, 상기 VL은 하기 중에서 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다: (a) 서열번호 122의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 123의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.
또 다른 태양에서, 항-C5 항체는 서열번호 112의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 상동성을 갖는 VL을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 VL 서열은 서열번호 112의 아미노산 서열이다. 몇몇 실시태양에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성을 갖는 VL 서열은 참조서열에 대해 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-C5 항체는 C5에 결합하는 능력은 유지한다. 몇몇 실시태양에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 112에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 몇몇 실시태양에서, 치환, 삽입 또는 결실이 상기 HVR 밖의 영역(즉 FR 중)에서 발생한다. 임의로, 상기 항-C5 항체는 서열번호 112 중의 VL 서열을 포함하며, 상기 서열의 번역후 변형을 포함한다. 특정한 실시태양에서, 상기 VL은 하기 중에서 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다: (a) 서열번호 122의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 123의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.
또 다른 태양에서, 항-C5 항체는 서열번호 113의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 상동성을 갖는 VL을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 VL 서열은 서열번호 113의 아미노산 서열이다. 몇몇 실시태양에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성을 갖는 VL 서열은 참조서열에 대해 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-C5 항체는 C5에 결합하는 능력은 유지한다. 몇몇 실시태양에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 113에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 몇몇 실시태양에서, 치환, 삽입 또는 결실이 상기 HVR 밖의 영역(즉 FR 중)에서 발생한다. 임의로, 상기 항-C5 항체는 서열번호 113 중의 VL 서열을 포함하며, 상기 서열의 번역후 변형을 포함한다. 특정한 실시태양에서, 상기 VL은 하기 중에서 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다: (a) 서열번호 122의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 124의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.
또 다른 태양에서, 상기에 제공된 실시태양들 중 어느 하나에서와 같은 VH, 및 상기에 제공된 실시태양들 중 어느 하나에서와 같은 VL을 포함하는 항-C5 항체를 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 항체는 각각 서열번호 10, 106-110 중 어느 하나 및 서열번호 20, 111-113 중 어느 하나 중의 VH 및 VL 서열을 포함하며, 상기 서열들의 번역-후 변형을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 항체는 서열번호 10의 VH 서열 및 서열번호 20의 VL 서열을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 항체는 서열번호 106의 VH 서열 및 서열번호 111의 VL 서열을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 항체는 서열번호 107의 VH 서열 및 서열번호 111의 VL 서열을 포함한다. 추가의 실시태양에서, 상기 항체는 서열번호 108의 VH 서열 및 서열번호 111의 VL 서열을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 항체는 서열번호 109의 VH 서열 및 서열번호 111의 VL 서열을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 항체는 서열번호 109의 VH 서열 및 서열번호 112의 VL 서열을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 항체는 서열번호 109의 VH 서열 및 서열번호 113의 VL 서열을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 항체는 서열번호 110의 VH 서열 및 서열번호 113의 VL 서열을 포함한다.
하나의 태양에서, (a) 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 함유하는 VH 서열, 및 (a) 서열번호 84의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열번호 104의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 함유하는 VL 서열을 포함하는 항-C5 항체를 제공한다.
또 다른 태양에서, (a) 서열번호 117의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 함유하는 VH 서열, 및 (a) 서열번호 122의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열번호 123의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 함유하는 VL 서열을 포함하는 항-C5 항체를 제공한다.
또 다른 태양에서, (a) 서열번호 117의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 119의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 함유하는 VH 서열, 및 (a) 서열번호 122의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열번호 123의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 함유하는 VL 서열을 포함하는 항-C5 항체를 제공한다.
또 다른 태양에서, (a) 서열번호 117의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 함유하는 VH 서열, 및 (a) 서열번호 122의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열번호 124의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 함유하는 VL 서열을 포함하는 항-C5 항체를 제공한다.
또 다른 태양에서, (a) 서열번호 117의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 120의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 함유하는 VH 서열, 및 (a) 서열번호 122의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열번호 124의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 함유하는 VL 서열을 포함하는 항-C5 항체를 제공한다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명의 항-C5 항체는 상기에 제공된 실시태양들 중 어느 하나에서와 같은 VH 및 서열번호 33, 34, 35, 114, 115 및 116 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 항-C5 항체는 상기에 제공된 실시태양들 중 어느 하나에서와 같은 VL 및 서열번호 36, 37 및 38 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 명세서에 제공된 항-C5 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 예를 들어, 몇몇 실시태양에서, 표 2에 개시된 바와같은 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 하기 실시예에 의해 입증되는 바와 같이, 표 2에 개시된 모든 항-C5 항체들을 C5의 동일한 에피토프 빈으로 분류하며 이들은 pH-의존적 결합 특성을 나타낸다.
추가의 태양에서, 본 발명은 본 명세서에 제공된 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 추가의 태양에서, 본 발명은 표 7 또는 8에 개시된 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, C5의 베타 쇄(서열번호 40)의 아미노산 33-124로 이루어지는 단편내의 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 아미노산 45-57, 70-76 및 107-110으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 단편을 포함하는 C5의 베타 쇄(서열번호 40) 내의 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, Thr47, Glu48, Ala49, Phe50, Asp51, Ala52, Thr53, Lys57, His70, Val71, His72, Ser74, Glu76, Val107, Ser108, Lys109, 및 His110으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 C5의 베타 쇄(서열번호 40)의 단편 내의 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명의 항-C5 항체의 에피토프는 입체구조 에피토프이다.
본 발명의 추가의 태양에서, 상기 실시태양들 중 어느 하나에 따른 항-C5 항체는 키메릭, 인간화된 또는 인간 항체를 포함한 단클론 항체이다. 하나의 태양에서, 항-C5 항체는 항체 단편, 예를 들어 Fv, Fab, Fab', scFv, 다이아바디, 또는 F(ab')2 단편이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 항체는 완전길이 항체, 예를 들어 완전 IgG1 또는 IgG4 항체 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 다른 항체 클래스 또는 아이소타입이다.
추가의 태양에서, 상기 실시태양들 중 어느 하나에 따른 항-C5 항체는 하기 섹션 1 내지 7에 개시된 바와 같은 특징들 중 어느 하나를 단독으로 또는 함께 취할 수 있다:
1. 항체 친화성
몇몇 실시태양에서, 본 명세서에 제공된 항체는 ≤1 마이크로 M, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.1 nM, ≤0.01 nM, ≤0.001 nM(예를 들어 10-8 M 이하, 예를 들어 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수(Kd)를 갖는다.
하나의 실시태양에서, Kd는 방사성 표지된 항원 결합 분석(RIA)에 의해 측정된다. 하나의 실시태양에서, RIA를 관심 항체의 Fab 버전 및 그의 항원으로 수행한다. 예를 들어, 항원에 대한 Fab의 용액 중 결합 친화성을, 일련의 적정량의 표지되지 않은 항원의 존재하에서 최소 농도의 (125I)-표지된 항원으로 Fab를 평형화시키고, 이어서 결합된 항원을 항-Fab 항체-코팅된 플레이트로 포획함으로써 측정한다(예를 들어 문헌[Chen et al., J.Mol.Biol. 293:865-881(1999)]을 참조하시오). 상기 분석에 대한 조건을 확립시키기 위해서, MICROTITER(등록상표) 다중-웰 플레이트(써모 사이언티픽(Thermo Scientific))를 밤새 50 mM 나트륨 카보네이트(pH 9.6) 중의 5 마이크로그램/㎖의 포획용 항-Fab 항체(카펠 랩스(Cappel Labs))로 코팅하고, 후속으로 실온(대략 23 ℃)에서 2 내지 5시간 동안 PBS 중의 2%(w/v) 소 혈청 알부민으로 차단한다. 비-흡착성 플레이트(눙크(Nunc) #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM[125I]-항원을 관심 Fab의 일련의 희석물과 혼합한다(예를 들어 문헌[Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)]에서, 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 동일하다). 이어서 상기 관심 Fab를 밤새 배양하지만; 상기 배양을 평형에 도달하도록 보다 긴 기간(예를 들어 약 65 시간) 동안 계속할 수도 있다. 그 후에, 상기 혼합물을 실온에서 배양을 위해(예를 들어 1시간 동안) 포획 플레이트로 옮긴다. 이어서 상기 용액을 제거하고 상기 플레이트를 PBS 중의 0.1% 폴리솔베이트 20(트윈(TWEEN)-20(등록상표))으로 8회 세척한다. 상기 플레이트가 건조되었으면, 150 마이크로리터/웰의 섬광제(MICROSCINT-20(상표); 팩카드(Packard))를 가하고, 상기 플레이트를 10분 동안 TOPCOUNT(상표) 감마 카운터(팩카드)상에서 카운트한다. 최대 결합의 20% 이하를 제공하는 각 Fab의 농도들을 경쟁 결합 분석에 사용하기 위해 선택한다.
또 다른 실시태양에 따라, Kd를 BIACORE(등록상표) 표면 플라스몬 공명 분석을 사용하여 측정한다. 예를 들어, BIACORE(등록상표)-2000 또는 BIACORE(등록상표)-3000(BIACORE(등록상표) 인코포레이티드, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)을 사용하는 분석을 25 ℃에서 약 10 응답 단위(RU)로 고정화된 항원 CM5 칩으로 수행한다. 하나의 실시태양에서, 카복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, BIACORE(등록상표) 인코포레이티드)을 공급자의 설명서에 따라 N-에틸-N'-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS)로 활성화시킨다. 항원을, 대략 10 응답 단위(RU)의 단백질 결합을 성취하기 위해서, 5 마이크로리터/분의 유속으로 주입하기 전에 10 mM 나트륨 아세테이트(pH 4.8)로 5 마이크로그램/㎖(약 0.2 마이크로M) 로 희석한다. 항원의 주입 후에, 1 M 에탄올아민을 주입하여 반응하지 않은 그룹들을 차단한다. 동역학적 측정을 위해서, Fab의 2배의 일련의 희석물(0.78 nM 내지 500 nM)을 0.05% 폴리솔베이트 20(트윈-20(상표)) 계면활성제를 갖는 PBS(PBST) 중에서 대략 25 마이크로리터/분의 유속으로 25 ℃에서 주입한다. 결합속도(kon) 및 해리속도(koff)를 단순한 1대1 랭뮤어 결합 모델(BIACORE(등록상표) 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 사용하고, 동시에 결합 및 해리 센서그램을 피팅함으로써 계산한다. 상기 평형 해리 상수(Kd)를 koff/kon 비로서 계산한다. 예를 들어 문헌[Chen et al., J.Mol.Biol. 293:865-881(1999)]을 참조하시오. 상기 on-속도가 상기 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 106 M-1s-1을 초과하는 경우, 상기 on-속도를 분광계, 예를 들어 스톱-플로우 구비된 분광광도계(아비브 인스트루먼츠(Aviv Instruments)) 또는 교반 큐벳이 있는 8000-시리즈 SLM-AMINCO(상표) 분광광도계(써모스펙트로닉(ThermoSpectronic))에서 측정되는 바와 같이 증가하는 농도의 항원의 존재하에서 PBS(pH 7.2) 중의 20 nM 항-항원 항체(Fab 형태)의 25 ℃에서의 형광 방출 강도(여기 = 295 ㎚; 방출 = 340 ㎚, 16 ㎚ 통과대역)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 소광 기법을 사용함으로써 측정할 수 있다.
2. 항체 단편
몇몇 실시태양에서, 본 명세서에 제공된 항체는 항체 단편이다. 항체 단편은 비제한적으로 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv 및 scFv 단편, 및 하기에 개시하는 다른 단편들을 포함한다. 몇몇 항체 단편의 리뷰를 위해서, 문헌[Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134(2003)]을 참조하시오. scFv 단편의 리뷰를 위해서, 예를 들어 문헌[Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)]을 참조하시오; 또한 WO 93/16185; 및 미국특허 제 5,571,894 호 및 미국특허 제 5,587,458 호를 참조하시오. 구제 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편의 논의에 대해서 미국특허 제 5,869,046 호를 참조하시오.
다이아바디는 2가 또는 이중특이성일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 예를 들어 EP 404,097; WO 1993/01161; 문헌[Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]; 및 문헌[Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)]을 참조하시오. 트라이아바디 및 테트라바디가 또한 문헌[Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]에 개시되어 있다.
단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 몇몇 실시태양에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다(도만티스 인코포레이티드(Domantis, Inc.), 미국 매사추세츠주 월썸 소재; 예를 들어 미국특허 제 6,248,516 호를 참조하시오).
항체 단편을 본 명세서에 개시된 바와 같이 다양한 기법, 예를 들어 비제한적으로 완전 항체의 단백질 분해 절단뿐만 아니라 재조합 숙주 세포(예를 들어 이 콜라이 또는 파지)에 의한 생산에 의해 제조할 수 있다.
3. 키메릭 및 인간화된 항체
몇몇 실시태양에서, 본 명세서에 제공된 항체는 키메릭 항체이다. 몇몇 키메릭 항체들이 예를 들어 미국특허 제 4,816,567 호; 및 문헌[Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)]에 개시되어 있다. 일례로, 키메릭 항체는 비-인간 가변 영역(예를 들어 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 또는 비-인간 영장류, 예를 들어 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가의 예로, 키메릭 항체는 클래스 또는 서브클래스가 모 항체의 경우로부터 변화된 "클래스 스위치" 항체이다. 키메릭 항체는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 키메릭 항체는 인간화된 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 인간화되어, 모 비-인간 항체의 특이성 및 친화성은 유지하면서, 인간에 대한 면역원성을 감소시킨다. 일반적으로 인간화된 항체는 HVR, 예를 들어 CDR(또는 그의 부분)이 비-인간 항체로부터 유래되고 FR(또는 그의 부분)이 인간 항체 서열로부터 유래되는 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화된 항체는 임의로 또한 인간 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 일부 실시태양에서, 인간화된 항체 중의 일부 FR 잔기를, 예를 들어 항체 특이성 또는 친화성을 회복 또는 개선시키기 위해 비-인간 항체(예를 들어 상기 HVR 잔기가 유래되는 항체)로부터 상응하는 잔기로 치환시킨다.
인간화된 항체 및 그의 제조 방법은 예를 들어 문헌[Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)]에 리뷰되어 있고, 예를 들어 문헌[Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)]; 문헌[Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)]; 미국특허 제 5,821,337 호, 미국특허 제 7,527,791 호, 미국특허 제 6,982,321 호, 및 미국특허 제 7,087,409 호; 문헌[Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)](특이성 결정 영역(SDR) 그래프트화를 개시한다); 문헌[Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991)]("재표면화"를 개시한다); 문헌[Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005)]("FR 셔플링"을 개시한다); 및 문헌[Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005)] 및 문헌[Klimka et al., Br. J. Cancer 83:252-260 (2000)](FR 셔플링으로 "유도된 선택" 접근법을 개시한다)에 추가로 개시되어 있다.
인간화에 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 비제한적으로 "최적합" 방법(예를 들어 문헌[Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993)]을 참조하시오)을 사용하여 선택된 프레임워크 영역; 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정 하위그룹의 인간 항체의 공통 서열로부터 유래한 프레임워크 영역(예를 들어 문헌[Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992)]; 및 문헌[Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)]을 참조하시오); 인간 성숙(체세포 돌연변이된) 프레임워크 영역 또는 인간 생식세포계열 프레임워크 영역(예를 들어 문헌[Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)]을 참조하시오); 및 FR 라이브러리의 선별로부터 유래한 프레임워크 영역(예를 들어 문헌[Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997)] 및 문헌[Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)]을 참조하시오)을 포함한다.
4. 인간 항체
몇몇 실시태양에서, 본 명세서에 제공된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체를 당해 분야에 공지된 다양한 기법을 사용하여 생성시킬 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 문헌[van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharma. 5:368-74 (2001)] 및 문헌[Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)]에 개시되어 있다.
인간 항체를, 항원 공격에 응답하여 완전 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 갖는 완전 항체를 생산하도록 변형시킨 트랜스제닉 동물에서 면역원을 투여함으로써 제조할 수 있다. 상기와 같은 동물은 전형적으로 인간 면역글로불린 유전자좌의 일부 또는 전부를 함유하며, 상기 유전자좌는 내인성 면역글로불린 유전자좌를 치환하거나 또는 염색체 외부에 존재하거나 또는 상기 동물의 염색체내에 무작위로 통합된다. 상기와 같은 트랜스제닉 마우스에서, 상기 내인성 면역글로불린 유전자좌는 일반적으로 불활성화되었다. 트랜스제닉 동물로부터 인간 항체를 획득하기 위한 방법에 대한 리뷰를 위해서, 문헌[Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)]을 참조하시오. 또한 예를 들어 미국특허 제 6,075,181 호 및 미국특허 제 6,150,584 호(제노마우스(XENOMOUSE)(상표) 기술을 개시한다); 미국특허 제 5,770,429 호(HUMAB(등록상표) 기술을 개시한다); 미국특허 제 7,041,870 호(K-M 마우스(MOUSE)(등록상표) 기술을 개시한다); 및 미국특허 출원 공보 제 2007/0061900 호(벨로시마우스(VELOCIMOUSE)(등록상표) 기술을 개시한다)를 참조하시오. 상기와 같은 동물들에 의해 생산된 완전 항체로부터의 인간 가변 영역들을 예를 들어 상이한 인간 불변 영역과 조합하여 추가로 변형시킬 수도 있다.
인간 항체를 또한 하이브리도마-기반 방법에 의해 제조할 수 있다. 인간 단클론 항체의 제조를 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주들이 개시되었다(예를 들어 문헌[Kozbor, J. Immunol. 133:3001 (1984)]; 문헌[Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Dekker, Inc., New York, 1987)]; 및 문헌[Boerner et al., J. Immunol. 147:86 (1991)]을 참조하시오). 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 제조된 인간 항체가 또한 문헌[Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:3557-3562 (2006)]에 개시되어 있다. 추가의 방법은 예를 들어 미국특허 제 7,189,826 호(하이브리도마 세포주로부터 단클론 인간 IgM 항체의 제조를 개시함) 및 문헌[Ni, Xiandai Mianyixue 26(4):265-268 (2006)(인간-인간 하이브리도마를 개시함)에 개시된 것들을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술(트리오마 기술)이 또한 문헌[Vollmers, Histology and Histopathology 20(3):927-937 (2005)] 및 문헌[Vollmers, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27(3):185-191 (2005)]에 개시되어 있다.
인간 항체를 또한 인간-유래된 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리시킴으로써 생성시킬 수 있다. 이어서 상기와 같은 가변 도메인 서열을 목적하는 인간 불변 도메인과 조합할 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하기 위한 기법들을 하기에 개시한다.
5. 라이브러리-유래된 항체
본 발명의 항체를 목적하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대한 조합 라이브러리를 선별함으로써 단리시킬 수 있다. 예를 들어, 다양한 방법들이 파지 디스플레이 라이브러리의 생성 및 목적하는 결합 특성을 갖는 항체에 대한 상기와 같은 라이브러리의 선별에 대해서 당해 분야에 공지되어 있다. 상기와 같은 방법들은 예를 들어 문헌[Hoogenboom et al., Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)]에 리뷰되어 있고 예를 들어 하기 문헌들에 추가로 개시되어 있다: McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1992); Marks, Meth.Mol. Biol. 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004); Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132 (2004).
몇몇 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리들을 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 별도로 클로닝하고 무작위로 파지 라이브러리 중에서 재결합시키고, 이어서 문헌[Winter et al., Ann. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994)]에 개시된 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 선별할 수 있다. 파지는 전형적으로 항체 단편을 단쇄 Fv(scFv) 단편으로서 또는 Fab 단편으로서 제시한다. 면역된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 구성할 필요 없이 상기 면역원에 고-친화성 항체를 제공한다. 한편으로, 문헌[Griffiths et al., EMBO J, 12:725-734(1993)]에 개시된 바와 같이 나이브 레퍼토리를 임의의 면역화 없이 클로닝하여(예를 들어 인간으로부터) 광범위한 비-자기 및 또한 자기 항원에 항체의 단일 공급원을 제공할 수 있다. 최종적으로, 나이브 라이브러리를 또한 문헌[Hoogenboom, J. Mol. Biol. 227:381-388(1992)]에 개시된 바와 같이, 줄기 세포로부터 재배열되지 않은 V-유전자 분절을 클로닝하고 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용하여 고가변성 CDR3 영역을 암호화하고 시험관내에서 재배열을 수행함으로써 합성적으로 제조할 수도 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 개시하는 특허 공보는 예를 들어 미국특허 제 5,750,373 호, 및 미국특허 공보 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, 및 2009/0002360을 포함한다.
인간 항체 라이브러리로부터의 항체 또는 항체 단편을 본 명세서에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 간주한다
6. 다중특이성 항체
몇몇 실시태양에서, 본 명세서에 제공된 항체는 다중특이성 항체, 예를 들어 이중특이성 항체이다. 다중특이성 항체는 적어도 2개의 상이한 부위에 대해 결합 특이성을 갖는 단클론 항체이다. 몇몇 실시태양에서, 상기 결합 특이성들 중 하나는 C5에 대한 것이고 다른 하나는 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 몇몇 실시태양에서, 이중특이성 항체는 C5의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이성 항체를 또한, 세포독성제를 C5를 발현하는 세포에 국소화시키기 위해 사용할 수도 있다. 이중특이성 항체를 완전길이 항체 또는 항체 단편으로서 제조할 수 있다.
다중특이성 항체의 제조 기법은 비제한적으로 상이한 특이성들을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공-발현(문헌[Milstein and Cuello, Nature 305:537 (1983)], WO 93/08829, 및 문헌[Traunecker et al., EMBO J. 10:3655 (1991)]을 참조하시오), 및 "구멍에 손잡이" 공학(예를 들어 미국특허 제 5,731,168 호를 참조하시오)을 포함한다. 다중-특이성 항체를 또한 항체 Fc-이종이량체성 분자의 제조를 위한 정전 스티어링 효과의 조작(WO 2009/089004A1); 2개 이상 항체 또는 단편의 가교결합(예를 들어 미국특허 제 4,676,980 호, 및 문헌[Brennan et al., Science 229:81 (1985)]을 참조하시오); 이중특이성 항체의 제조를 위한 류신 지퍼의 사용(예를 들어 문헌[Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)]을 참조하시오); 이중특이성 항체 단편의 제조를 위한 "다이아바디" 기술의 사용(예를 들어 문헌[Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)]을 참조하시오); 및 단쇄 Fv(scFv) 이량체의 사용(예를 들어 문헌[Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)]을 참조하시오); 및 예를 들어 문헌[Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)]에 개시된 바와 같은 삼중특이성 항체의 제조를 포함한다.
"옥토퍼스 항체"를 포함하여, 3개 이상의 기능적 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체가 또한 본 명세서에 포함된다(예를 들어 US 2006/0025576을 참조하시오).
본 명세서의 항체 또는 단편은 또한 C5뿐만 아니라 또 다른, 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 작용 FAb" 또는 "DAF"를 포함한다(예를 들어 US 2008/0069820을 참조하시오).
7. 항체 변이체
몇몇 실시태양에서, 본 명세서에 제공된 항체의 아미노산 서열 변이체를 고려한다. 예를 들어, 상기 항체의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 성질들을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체를, 상기 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 적합한 변형을 도입시키거나 또는 펩타이드 합성에 의해 제조할 수 있다. 상기와 같은 변형은 예를 들어 상기 항체의 아미노산 서열로부터의 잔기의 결실 및/또는 상기 서열내로의 잔기의 삽입 및/또는 상기 서열 내에서의 잔기의 치환을 포함한다. 최종 구조물이 목적하는 특성, 예를 들어 항원-결합을 갖는 한, 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합을 수행하여 최종 구조물에 이를 수 있다.
a. 치환, 삽입 및 결실 변이체
몇몇 실시태양에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체를 제공한다. 치환적 변이도입에 중요한 부위는 HVR 및 FR을 포함한다. 보존적 치환을 "바람직한 치환"의 표제하에 표 1에 나타낸다. 보다 실질적인 변화들을 "예시적인 치환"의 표제하에 표 1에 제공하며, 아미노산 측쇄 클래스를 참조하여 하기에 추가로 개시한다. 아미노산 치환을 관심 항체에 도입시키고 생성물을 목적하는 활성, 예를 들어 유지된/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 선별할 수 있다.
Figure pat00001
아미노산들을 공통 측쇄 성질에 따라 분류할 수 있다: (1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) 산성: Asp, Glu; (4) 염기성: His, Lys, Arg; (5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및 (6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적인 치환은 이들 클래스 중 한 클래스의 구성원의, 또 다른 클래스에 대한 교환을 포함할 것이다.
치환 변이체 중 한 가지 유형은 모 항체(예를 들어 인간화된 또는 인간 항체)의 하나 이상의 고가변 영역 잔기의 치환을 수반한다. 일반적으로, 추가의 연구를 위해 선택된 상기 생성되는 변이체(들)는 모 항체에 비해 몇몇 생물학적 성질의 변형(예를 들어 개선)(예를 들어 증가된 친화성, 감소된 면역원성)을 갖고/갖거나 상기 모 항체의 몇몇 생물학적 성질을 실질적으로 유지할 것이다. 예시적인 치환 변이체는 친화성 성숙 항체이며, 이를 편의상 예를 들어 파지 디스플레이 기반 친화성 성숙화 기법, 예를 들어 본 명세서에 개시된 것들을 사용하여 제조할 수 있다. 간단히, 하나 이상의 HVR 잔기를 돌연변이시키고 상기 변이 항체를 파지상에 제시하고 특정한 생물학적 활성(예를 들어 결합 친화성)에 대해 선별한다.
변경(예를 들어 치환)을, 예를 들어 항체 친화성을 개선시키기 위해서 HVR에서 수행할 수 있다. 상기와 같은 변경을 HVR "핫스팟", 즉 체세포 성숙화 과정 중 높은 빈도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 암호화된 잔기(예를 들어 문헌[Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)]을 참조하시오), 및/또는 항원과 접촉하는 잔기에서 수행할 수 있으며, 이때 생성되는 변이체 VH 또는 VL을 결합 친화성에 대해 시험한다. 2차 라이브러리로부터의 구성 및 재선택에 의한 친화성 성숙화가 예를 들어 문헌[Hoogenboom et al., in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)]에 개시되었다. 친화성 성숙화의 일부 실시태양에서, 다양성을 임의의 다양한 방법들(예를 들어 실수유발 PCR, 쇄 셔플링, 또는 올리고뉴클레오타이드-지향 변이도입)에 의해 성숙화를 위해 선택된 가변 유전자내에 도입시킨다. 이어서 2차 라이브러리를 생성시킨다. 이어서 상기 라이브러리를 목적하는 친화성을 갖는 임의의 항체 변이체의 식별을 위해 선별한다. 다양성을 도입시키는 또 다른 방법은 다수의 HVR 잔기(예를 들어 한 번에 4 내지 6개 잔기)를 무작위화하는 HVR-지향 접근법을 수반한다. 항원 결합에 관련된 HVR 잔기를, 예를 들어 알라닌 주사 변이도입 또는 모델링을 사용하여 구체적으로 특정화할 수 있다. CDR-H3 및 CDR-L3가 특히 종종 표적화된다.
몇몇 실시태양에서, 치환, 삽입 또는 결실을, 상기와 같은 변경이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한 하나 이상의 HVR 내에서 발생시킬 수 있다. 예를 들어 결합 친화성을 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경(예를 들어 본 명세서에 제공된 바와 같은 보존적 치환)을 HVR에서 수행할 수 있다. 상기와 같은 변경은 예를 들어 상기 HVR 중의 항원 접촉 잔기의 외부에서 있을 수 있다. 상기에 제공된 변형 VH 및 VL 서열의 몇몇 실시태양에서, 각각의 HVR은 변경되지 않거나, 또는 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
변이도입을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 동정에 유용한 방법을 문헌[Cunningham, Science 244:1081-1085 (1989)]에 개시된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 변이도입"이라 칭한다. 상기 방법에서, 하나의 잔기 또는 표적 잔기들의 그룹(예를 들어 하전된 잔기, 예를 들어 arg, asp, his, lys 및 glu)을 동정하고 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(예를 들어 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 치환시켜 항체와 항원과의 상호작용이 영향을 받는지를 결정한다. 추가의 치환을 아미노산 위치들에 도입시켜 초기 치환에 대한 기능적 감수성을 입증할 수 있다. 한편으로 또는 추가로, 항체와 항원간의 접촉점들을 동정하기 위해 항원-항체 복합체의 결정 구조. 상기와 같은 접촉 잔기 및 이웃하는 잔기들을 치환 후보로서 표적화하거나 제거할 수 있다. 변이체들을 이들이 목적하는 성질을 함유하는지를 결정하기 위해서 선별할 수도 있다.
아미노산 서열 삽입은 단일 또는 다수의 아미노산 잔기의 서열내 삽입뿐만 아니라 하나의 잔기 내지 100개 이상 잔기를 함유하는 폴리펩타이드 길이 범위의 아미노- 및/또는 카복시-말단 융합을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 N- 또는 C-말단의 효소(예를 들어 ADEPT에 대한), 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩타이드에의 융합을 포함한다.
b. 글리코실화 변이체
몇몇 실시태양에서, 본 명세서에 제공된 항체를 상기 항체가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 감소시키기 위해 변경시킨다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 부가 또는 결실을 편의상 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경시킴으로서 수행할 수 있다.
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 상기에 부착된 탄수화물을 변경시킬 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생산된 천연 항체는 전형적으로, N-결합에 의해 상기 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 일반적으로 부착되는 분지된, 2분기(biantennary) 올리고사카라이드를 포함한다. 예를 들어 문헌[Wright et al., TIBTECH 15:26-32(1997)]을 참조하시오. 상기 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물, 예를 들어 만노스, N-아세틸 글루코스아민(GlcNAc), 갈락토스 및 시알산뿐만 아니라 상기 2분기 올리고사카라이드 구조의 "줄기" 중의 GlcNAc에 부착된 퓨코스를 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명 항체 중의 올리고사카라이드의 변형을 일부 개선된 성질을 갖는 항체 변이체를 생성시키기 위해서 수행할 수 있다.
하나의 실시태양에서, Fc 영역에 부착된(직접 또는 간접적으로) 퓨코스가 없는 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체를 제공한다. 예를 들어, 상기와 같은 항체 중의 퓨코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 상기 퓨코스의 양을 예를 들어 WO 2008/077546에 개시된 바와 같이, MALDI-TOF 질량 분석에 의해 측정시 Asn297에 부착된 모든 당구조체(예를 들어 복합체, 하이브리드 및 고 만노스 구조체)의 합에 대한, Asn297에서 당쇄내의 퓨코스의 평균량을 계산함으로써 측정한다. Asn297은 상기 Fc 영역 중의 약 297번 위치에 위치한 아스파라진 잔기를 지칭하나(Fc 영역 잔기의 Eu 넘버링); Asn297은 또한 항체 중의 부수적인 서열 변화로 인해 297번 위치의 상류 또는 하류 약 +/-3 아미노산, 즉 294 내지 300번 사이의 아미노산에 위치할 수 있다. 상기와 같은 퓨코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어 미국특허 공보 2003/0157108(Presta, L.); US 2004/0093621(쿄와 하코 코교 캄파니 리미티드(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd))을 참조하시오. "탈퓨코실화된" 또는 "퓨코스-결핍된" 항체 변이체에 관한 간행물들의 예는 하기를 포함한다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; Okazaki et al., J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87:614 (2004). 탈퓨코실화된 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예는 단백질 퓨코실화 결손 Lec13 CHO 세포(Ripka et al., Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); US 2003/0157108, Presta, L; 및 WO 2004/056312, Adams et al., 특히 실시예 11), 및 녹아웃 세포주, 예를 들어 알파-1,6-퓨코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포(예를 들어 문헌[Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87:614 (2004)]; 문헌[Kanda et al., Biotechnol. Bioeng. 94(4):680-688 (2006)]; 및 WO2003/085107을 참조하시오)를 포함한다.
예를 들어 항체의 Fc 영역에 부착된 2분기 올리고사카라이드가 GlcNAc에 의해 양분된, 양분된 올리고사카라이드를 갖는 항체 변이체를 추가로 제공한다. 상기와 같은 항체 변이체는 감소된 퓨코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 상기와 같은 항체 변이체의 예는 예를 들어 WO 2003/011878(Jean-Mairet et al.); 미국특허 제 6,602,684 호(Umana et al.); 및 US 2005/0123546(Umana et al.)에 개시되어 있다. 상기 Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드 중의 적어도 하나의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체가 또한 제공된다. 상기와 같은 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 상기와 같은 항체 변이체는 예를 들어 WO 1997/30087(Patel et al.); WO 1998/58964(Raju, S.); 및 WO 1999/22764 (Raju, S.)에 개시되어 있다.
c. Fc 영역 변이체
몇몇 실시태양에서, 하나 이상의 아미노산 변형을 본 명세서에 제공된 항체의 Fc 영역에 도입시켜 Fc 영역 변이체를 생성시킬 수 있다. 상기 Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에 아미노산 변형(예를 들어 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열(예를 들어 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명은 생체내에서 항체의 반감기가 중요하지만 몇몇 효과기 기능(예를 들어 보체 및 ADCC)은 불필요하거나 유해한 용도에 바람직한 후보로 만드는 일부(전부는 아닌) 효과기 기능을 갖는 항체 변이체를 고려한다. 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 분석을 수행하여 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인할 수 있다. 예를 들어, 항체가 Fc 감마 R 결합은 없지만(따라서 ADCC 활성이 없는 듯하다) FcRn 결합 능력은 확실히 유지시키기 위해서 Fc 수용체(FcR) 결합 분석을 수행할 수 있다. ADCC를 매개하는 1차 세포, NK 세포는 Fc 감마 RIII만을 발현하는 반면, 단핵세포는 Fc 감마 RI, Fc 감마 RII 및 Fc 감마 RIII을 발현한다. 조혈세포상의 FcR 발현은 문헌[Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492(1991)]의 464 페이지의 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 분석의 비제한적인 예는 미국특허 제 5,500,362 호(예를 들어 문헌[Hellstrom et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)] 및 문헌[Hellstrom et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)]을 참조하시오); 미국특허 제 5,821,337 호(문헌[Bruggemann et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)]을 참조하시오)에 개시되어 있다. 한편으로, 비-상사성 분석 방법을 사용할 수도 있다(예를 들어 유식 세포측정을 위한 ACTI(상표) 비-방사성 세포독성 분석(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); 및 사이토톡스(CytoTox) 96(등록상표) 비-방사성 세포독성 분석(프로메가(Promega), 미국 위스콘신주 매디슨 소재)). 상기와 같은 분석에 유용한 효과기 세포는 말초 혈액 단핵세포(PBMC) 및 천연 살해(NK) 세포를 포함한다. 한편으로 또는 추가로, 관심 분자의 ADCC 활성을 생체내에서, 예를 들어 문헌[Clynes et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다. C1q 결합 분석을 또한 항체가 C1q에 결합할 수 없고 따라서 CDC 활성이 없음을 확인하기 위해서 수행할 수 있다. 예를 들어 WO 2006/029879 및 WO 2005/100402의 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조하시오. 보체 활성화를 평가하기 위해서, CDC 분석을 수행할 수도 있다(예를 들어 문헌[Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]; 문헌[Cragg et al., Blood 101:1045-1052 (2003)]; 및 문헌[Cragg et al., Blood 103:2738-2743 (2004)]을 참조하시오). FcRn 결합 및 생체내 클리어런스/반감기 측정을 또한 당해 분야에 공지된 방법들을 사용하여 수행할 수 있다(예를 들어 문헌[Petkova et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)]을 참조하시오.
감소된 효과기 기능을 갖는 항체는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것들을 포함한다(미국특허 제 6,737,056 호). 상기와 같은 Fc 돌연변이체는 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함하며, 잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는 소위 "DANA" Fc 돌연변이체를 포함한다(미국특허 제 7,332,581 호).
FcR에 대한 개선되거나 감소된 결합을 갖는 몇몇 항체 변이체들이 개시되어 있다(예를 들어 미국특허 제 6,737,056 호; WO 2004/056312, 및 문헌[Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001)]을 참조하시오).
몇몇 실시태양에서, 항체 변이체는 ADCC를 개선시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 Fc 영역의 298, 333 및/또는 334번 위치의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다(잔기의 EU 넘버링).
일부 실시태양에서, 예를 들어 미국특허 제 6,194,551 호, WO 1999/51642, 및 문헌[Idusogie et al., J. Immunol. 164:4178-4184 (2000)]에 개시된 바와 같이, Fc 영역 중에 변경된(즉 개선되거나 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존적 세포독성(CDC)을 생성시키는 변경을 수행한다.
증가된 반감기, 및 모체의 IgG의 태아로의 전달을 맡고 있는 신생아 Fc 수용체(FcRn)(Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994))에의 개선된 결합을 갖는 항체가 US2005/0014934(Hinton et al.)에 개시되어 있다. 상기 항체는 상기 Fc 영역의 FcRn에의 결합을 개선시키는 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 상기와 같은 Fc 변이체는 Fc 영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중 하나 이상의 치환, 예를 들어 Fc 영역 잔기 434의 치환을 갖는 것들을 포함한다(미국특허 제 7,371,826 호).
또한 Fc 영역 변이체의 다른 예들에 관한 문헌[Duncan, Nature 322:738-40 (1988)]; 미국특허 제 5,648,260 호; 미국특허 제 5,624,821 호; 및 WO 1994/29351을 참조하시오.
d. 시스테인 조작된 항체 변이체
몇몇 실시태양에서, 항체의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된 시스테인 조작된 항체, 예를 들어 "티오MAb"를 생성시키는 것이 바람직할 수 있다. 특정 실시태양에서, 상기 치환된 잔기는 상기 항체의 이용 가능한 부위에 존재한다. 상기 잔기를 시스테인으로 치환시킴으로써, 반응성 티올기가 상기 항체의 이용 가능한 부위에 위치하며 이를 본 명세서에 추가로 개시되는 바와 같이, 상기 항체를 다른 부분, 예를 들어 약물 부분 또는 링커-약물 부분에 접합시키는데 사용하여 면역접합체를 생성시킬 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 하기의 잔기들 중 임의의 하나 이상을 시스테인으로 치환시킬 수도 있다: 경쇄의 V205(카밧 넘버링); 중쇄의 A118(EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400(EU 넘버링). 시스테인 조작된 항체를 예를 들어 미국특허 제 7,521,541 호에 개시된 바와 같이 생성시킬 수도 있다.
e. 항체 유도체
몇몇 실시태양에서, 본 명세서에 제공된 항체를 당해 분야에 공지되고 쉽게 입수할 수 있는 추가의 비단백질성 부분을 함유하도록 추가로 변형시킬 수 있다. 상기 항체의 유도체화에 적합한 부분은 비제한적으로 수용성 중합체를 포함한다. 수용성 중합체의 비제한적인 예는 비제한적으로 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-다이옥솔란, 폴리-1,3,6-트라이옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산(단독중합체 또는 무작위 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올(예를 들어 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드가 그의 수중 안정성으로 인해 제조에 유리할 수 있다. 상기 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있으며 분지되거나 분지되지 않을 수도 있다. 항체에 부착되는 중합체의 수는 변할 수 있으며, 하나 초과의 중합체가 부착되는 경우, 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 상기 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 비제한적으로, 개선시키려는 항체의 특정한 성질 또는 기능, 항체 유도체가 한정된 조건하에서 치료법에 사용될 것인지의 여부 등을 포함한 고려사항들을 근거로 결정될 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 방사선에의 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 항체 및 비단백질성 부분의 접합체를 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 비단백질성 부분은 탄소 나노튜브이다(Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:11600-11605 (2005)). 상기 방사선은 임의의 파장을 가질 수 있으며, 비제한적으로 통상적인 세포에는 유해하지 않으나 상기 비단백질성 부분을 상기 항체-비단백질성 부분에 가까운 세포를 살해하는 온도로 가열하는 파장을 포함한다.
B. 재조합 방법 및 조성물
항체를 예를 들어 미국특허 제 4,816,567 호에 개시된 바와 같이, 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 제조할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 본 명세서에 개시된 항-C5 항체를 암호화하는 단리된 핵산을 제공한다. 상기와 같은 핵산은 항체(예를 들어 상기 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화할 수 있다. 추가의 실시태양에서, 상기와 같은 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터(예를 들어 발현 벡터)를 제공한다. 추가의 실시태양에서, 상기와 같은 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 하나의 상기와 같은 실시태양에서, 숙주 세포는 하기를 포함한다(예를 들어 하기로 형질전환되었다): (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제2 벡터. 하나의 실시태양에서, 상기 숙주 세포는 진핵생물, 예를 들어 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 림프양 세포(예를 들어 Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 하나의 실시태양에서, 항-C5 항체의 제조 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 상기에 제공된 바와 같은, 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 상기 항체의 발현에 적합한 조건하에서 배양하고, 임의로 상기 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 상기 항체를 회수함을 포함한다.
항-C5 항체의 재조합 생산을 위해서, 예를 들어 상기에 개시된 바와 같은, 항체를 암호화하는 핵산을 단리하고 이를 숙주 세포에서의 추가의 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터에 삽입한다. 상기와 같은 핵산은 통상적인 과정을 사용하여(예를 들어 상기 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 탐침을 사용함으로써) 쉽게 단리되고 서열분석될 수 있다.
항체-암호화 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본 명세서에 개시된 바와 같은 원핵생물 또는 진핵생물 세포를 포함한다. 예를 들어, 항체를, 특히 글리코실화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않은 경우, 세균에서 생성시킬 수 있다. 세균에서의 항체 단편 및 폴리펩타이드의 발현을 위해서, 예를 들어 미국특허 제 5,648,237 호, 미국특허 제 5,789,199 호, 및 미국특허 제 5,840,523 호를 참조하시오(또한 이 콜라이에서 항체 단편의 발현을 개시하는 문헌[Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254]을 참조하시오). 발현 후에, 상기 항체를 용해성 분획 중의 세균 세포 페이스트로부터 단리할 수 있으며 추가로 정제할 수 있다.
원핵생물 외에, 진핵 미생물, 예를 들어 섬유상 진균 또는 효모가 항체-암호화 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이며, "인간화되어" 부분적 또는 완전한 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체를 생성시키는 글리코실화 경로를 갖는 진균 및 효모 균주가 포함된다. 문헌[Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)], 및 문헌[Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)]을 참조하시오.
글리코실화된 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체(무척추 및 척추동물)로부터 유래한다. 무척추생물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 곤충 세포와 함께, 특히 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염에 사용될 수 있는 다수의 바큘로바이러스 균주가 동정되었다.
식물 세포 배양물을 또한 숙주로서 사용할 수 있다. 예를 들어 미국특허 제 5,959,177 호, 미국특허 제 6,040,498 호, 미국특허 제 6,420,548 호, 미국특허 제 7,125,978 호, 및 미국특허 제 6,417,429 호(트랜스제닉 식물에서 항체의 생산을 위한 플랜티바디스(PLANTIBODIES)(상표) 기술을 개시한다)를 참조하시오.
척추동물 세포를 또한 숙주로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 현탁액 중에서 증식시키기에 적합한 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40에 의해 형질된환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7); 인간 배아 신장 세포주(예를 들어 문헌[Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]에 개시된 바와 같은 293 또는 293 세포들); 아기 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 버팀세포(예를 들어 문헌[Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]에 개시된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포(CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76); 인간 경부암종 세포(HELA); 개 신장세포(MDCK; 버팔로 래트 간세포(BRL 3A); 인간 폐세포(W138); 인간 간세포(Hep G2); 마우스 유방 종양(MMT 060562); 예를 들어 문헌[Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]에 개시된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포를 포함하며, DHFR_ CHO 세포(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); 및 골수종 세포주, 예를 들어 Y0, NS0 및 Sp2/0를 포함한다. 항체 생산에 적합한 몇몇 포유동물 숙주 세포주의 리뷰를 위해서, 예를 들어 문헌[Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)]을 참조하시오.
다클론 항체를 바람직하게는 관련 항원 및 항원보강제의 수회 피하(sc) 또는 복강내(ip) 주사에 의해 동물에서 생산시킨다. 상기 관련 항원을, 면역시키려는 종의 면역원성인 단백질, 예를 들어 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린, 또는 대두 트립신 저해제에, 이작용성 또는 유도체화제, 예를 들어 말레이미도벤조일 설포숙신이미드 에스테르(시스테인 잔기를 통한 접합), N-하이드록시숙신이미드(리신 잔기를 통한), 글루타르알데하이드, 숙신산 무수물, SOCl2, 또는 R1N=C=NR(여기에서 R 및 R1은 상이한 알킬기이다)을 사용하여 접합시키는 것이 유용할 수 있다.
동물(대개는 비-인간 동물)을, 예를 들어 100 마이크로그램 또는 5 마이크로그램의 단백질 또는 접합체(각각 토끼 또는 마우스에 대해서)를 3 부피의 프로인트 완전 항원보강제와 조합하고 상기 용액을 다수의 부위에 피내 주사함으로써 항원, 면역원성 접합체 또는 유도체에 대해 면역시킨다. 1개월 후에 상기 동물을 프로인트 완전 항원보강제 중의 펩타이드 또는 접합체의 원래량의 1/5 내지 1/10을 피하 주사에 의해 다수의 부위에 추가 접종한다. 7 내지 14일 후에 상기 동물을 채혈하고, 혈청을 항체 역가에 대해서 분석한다. 역가 평탄역에 도달할 때까지 동물들을 추가접종한다. 바람직하게는, 상기 동물을, 동일 항원이지만, 상이한 단백질에 및/또는 상이한 가교결합 시약을 통해 접합된 접합체로 추가접종한다. 접합체를 또한 단백질 융합물로서 재조합 세포 배양물 중에서 제조할 수 있다. 또한, 면역 응답을 증강시키기 위해서 알룸과 같은 응집제를 적합하게 사용한다.
단클론 항체를 실질적으로 균일한 항체들의 집단으로부터 획득한다, 즉 상기 집단을 차지하는 개별 항체들은, 소량으로 존재할 수도 있는 가능한 천연 돌연변이 및/또는 번역-후 변형(예를 들어 이성체화, 아미드화)을 제외하고 동일하다. 따라서, "단클론"이란 수식어는 별개 항체의 혼합물이 아니라는 상기 항체의 특징을 가리킨다.
예를 들어, 상기 단클론 항체를 문헌[Kohler et al. Nature 256(5517):495-497 (1975)]에 최초로 개시된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 상기 하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 적합한 숙주 동물, 예를 들어 햄스터를 본 명세서에서 상기에 개시한 바와 같이 면역시켜, 면역에 사용된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하거나 또는 생산할 수 있는 림프구를 유도한다. 한편으로, 림프구를 시험관내에서 면역시킬 수도 있다.
상기 면역화제는 전형적으로 항원성 단백질 또는 그의 융합 변이체를 포함할 것이다. 일반적으로 말초 혈액 림프구(PBL)는 인간 기원의 세포가 요구되는 경우 사용되거나, 또는 비장 세포 또는 림프절 세포는 비-인간 포유동물 공급원이 요구되는 경우 사용된다. 이어서 상기 림프구를 적합한 융합제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 불멸화된 세포주와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성시킨다(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986), pp. 59-103).
불멸화된 세포주는 대개 형질전환된 포유동물 세포, 특히 설치류, 소 및 인간 기원의 골수종 세포이다. 대개, 래트 또는 마우스 골수종 세포주가 사용된다. 상기와 같이 제조된 하이브리도마 세포를, 바람직하게는 융합되지 않은 모 골수종 세포의 생육 또는 생존을 저해하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에 시딩하고 증식시킨다. 예를 들어, 상기 모 골수종 세포가 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(HGPRT 또는 HPRT) 효소가 없는 경우, 상기 하이브리도마용 배양 배지는 전형적으로 HGPRT-결핍 세포의 생육을 방지하는 물질인 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함할 것이다(HAT 배지).
바람직한 불멸화된 골수종 세포는, 효율적으로 융합하고 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 안정한 높은 수준 생산을 지지하며 HAT 배지와 같은 배지에 감수성인 것들이다. 이들 중에서 쥐 골수종 세포주, 예를 들어 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute Cell Distribution Center)(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)로부터 입수할 수 있는 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양으로부터 유도되는 것들 및 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(미국 버지니아주 마나사스 소재)으로부터 입수할 수 있는 SP-2 세포(및 그의 유도체, 예를 들어 X63-Ag8-653)가 바람직하다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 또한 인간 단클론 항체의 생산에 대해 개시되었다(Kozbor et al., J Immunol. 133(6):3001-3005 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York (1987), pp. 51-63).
하이브리도마 세포가 생육하는 배양 배지를 항원에 대한 단클론 항체의 생산에 대해서 분석한다. 바람직하게, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 단클론 항체의 결합 특이성을 면역침전에 의해서 또는 시험관내 결합 분석, 예를 들어 방사성면역분석(RIA) 또는 효소-결합된 면역흡수 분석(ELISA)에 의해서 측정한다. 상기와 같은 기법 및 분석은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 결합 친화성을 문헌[Munson, Anal Biochem. 107(1):220-239 (1980)]의 스캐차드(Scatchard) 분석에 의해 측정할 수 있다.
목적하는 특이성, 친화성 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 동정한 후에, 클론들을 제한 희석 과정에 의해 서브클로닝하고 표준 방법(상기 문헌[Goding])에 의해 증식시킬 수 있다. 상기 목적에 적합한 배양 배지는 예를 들어 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 상기 하이브리도마 세포를 포유동물 중의 종양으로서 생체내에서 증식시킬 수도 있다.
상기 서브클론에 의해 분비된 단클론 항체를 통상적인 면역글로불린 정제 과정, 예를 들어 단백질 A-세파로스, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 젤 전기영동, 투석, 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 배양 배지, 복수, 또는 혈청으로부터 적합하게 분리시킨다.
적합한 숙주 동물을 항원에 대해 면역시킴으로써 항체를 생성시킬 수도 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 항원은 완전길이 C5를 포함하는 폴리펩타이드이다. 하나의 실시태양에서, 상기 항원은 C5의 베타 쇄(서열번호 40)를 포함하는 폴리펩타이드이다. 하나의 실시태양에서, 상기 항원은 C5의 베타 쇄의 MG1-MG2 도메인(서열번호 43)을 포함하는 폴리펩타이드이다. 하나의 실시태양에서, 상기 항원은 C5의 베타 쇄의 MG1 도메인(서열번호 41)을 포함하는 폴리펩타이드이다. 하나의 실시태양에서, 상기 항원은 C5의 베타 쇄의 19 내지 180번 위치의 아미노산에 상응하는 영역을 포함하는 폴리펩타이드이다. 하나의 실시태양에서, 상기 항원은 C5의 베타 쇄의 33 내지 124번 위치의 아미노산에 상응하는 영역을 포함하는 폴리펩타이드이다. 하나의 실시태양에서, 상기 항원은 C5의 베타 쇄(서열번호 40)의 아미노산 47-57, 70-76 및 107-110 중에서 선택된 적어도 하나의 단편을 포함하는 폴리펩타이드이다. 하나의 실시태양에서, 상기 항원은 Thr47, Glu48, Ala49, Phe50, Asp51, Ala52, Thr53, Lys57, His70, Val71, His72, Ser74, Glu76, Val107, Ser108, Lys109, 및 His110으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 C5의 베타 쇄의 단편을 포함하는 폴리펩타이드이다. 하나의 실시태양에서, 상기 항원은 Glu48, Asp51, His70, His72, Lys109, 및 His110으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 C5의 베타 쇄의 단편을 포함하는 폴리펩타이드이다. 또한 본 발명은 동물을 상기 항원에 대해 면역시킴으로써 생산된 항체를 포함한다. 상기 항체는 상기 "예시적인 항-C5 항체"에 개시된 바와 같은 특징들 중 어느 하나를 단독으로 또는 함께 포함할 수 있다.
C. 분석
본 명세서에 제공된 항-C5 항체를 당해 분야에 공지된 다양한 분석들에 의해서 그의 물리/화학적 성질 및/또는 생물학적 활성에 대해서 동정하거나, 선별하거나 또는 특성화할 수 있다.
1. 결합 분석 및 다른 분석
하나의 태양에서, 본 발명의 항체를 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블럿, BIACORE(등록상표) 등과 같은 공지된 방법에 의해 그의 항원 결합 활성에 대해 시험한다.
또 다른 태양에서, 경쟁 분석을 사용하여 본 명세서에 개시된 항-C5 항체와 C5에의 결합에 대해 경쟁하는 항체를 동정할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 상기와 같은 경쟁 항체가 과잉으로 존재하는 경우, 상기는 C5에 대한 참조 항체의 결합을 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 또는 그 이상까지 차단한다(예를 들어 감소시킨다). 일부 예에서, 결합이 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상까지 저해된다. 몇몇 실시태양에서, 상기와 같은 경쟁 항체는 본 명세서에 개시된 항-C5 항체(예를 들어 표 2에 개시된 항-C5 항체)에 의해 결합된 동일한 에피토프(예를 들어 선형 또는 입체구조 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프의 상세한 예시적인 맵핑 방법이 문헌[Morris, "Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ) (1996)]에 제공된다.
예시적인 경쟁 분석에서, 고정화된 C5를, C5에 결합하는 제1 표지(참조) 항체, 및 상기 제1 항체와 C5에의 결합에 대해 경쟁하는 능력을 시험하고자 하는 표지되지 않은 제2 항체를 포함하는 용액 중에서 배양한다. 상기 제2 항체는 하이브리도마 상등액 중에 존재할 수있다. 대조용으로서, 고정화된 C5를 상기 제1 표지 항체는 포함하지만 상기 제2 비표지 항체는 포함하지 않는 용액 중에서 배양한다. 상기 제1 항체의 C5에의 결합을 허용하는 조건하에서 배양 후에, 과잉의 결합되지 않은 항체를 제거하고, 고정화된 C5와 결합된 표지의 양을 측정한다. 상기 고정화된 C5와 결합된 표지의 양이 대조용 샘플에 비해 시험 샘플 중에서 실질적으로 감소하는 경우, 이는 상기 제2 항체가 상기 제1 항체와 C5에의 결합에 대해 경쟁함을 암시한다. 문헌[Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) (1988)]을 참조하시오.
또 다른 예시적인 경쟁 분석에서, BIACORE(등록상표) 분석을 사용하여 제2(참조) 항-C5 항체에 의한 C5에의 결합과 경쟁하는 시험 항-C5 항체의 능력을 측정한다. BIACORE(등록상표) 기기(예를 들어 BIACORE(등록상표) 3000)를 제조사의 권장에 따라 조작하는 추가의 태양에서, C5 단백질을 당해 분야에 공지된 표준 기법을 사용하여 CM5 BIACORE(등록상표) 칩상에 포획시켜 C5-코팅된 표면을 생성시킨다. 전형적으로 C5의 200 내지 800 공명 단위가 상기 칩에 결합될 것이다(용이하게 측정 가능한 수준의 결합을 제공하지만 사용되는 시험 항체의 농도에 의해서 쉽게 포화되는 양). 서로에 대해 경쟁하는 능력에 대해서 평가되는 2개의 항체(즉 시험 및 참조 항체)를 1:1의 적합한 완충제 중의 결합 부위의 몰비로 혼합하여 시험 혼합물을 생성시킨다. 결합 부위를 기준으로 농도를 계산하는 경우, 시험 또는 참조 항체의 분자량은 상기 항체상의 C5-결합 부위의 수로 나누어진 상응하는 항체의 총 분자량으로 가정된다. 상기 시험 혼합물 중의 각 항체(즉 시험 및 참조 항체)의 농도는 상기 BIACORE(등록상표) 칩상에 포획된 C5 분자상의 상기 항체에 대한 결합 부위를 쉽게 포화시키기에 충분히 높아야 한다. 상기 혼합물 중에 상기 시험 및 참조 항체는 동일한 몰 농도(결합 기준으로), 전형적으로 1.00 내지 1.5 마이크로몰(결합 부위 기준으로)로 존재한다. 시험 항체만 및 참조 항체만 함유하는 별도의 용액을 또한 제조한다. 이들 용액 중 시험 항체 및 참조 항체는 상기 시험 혼합물에서와 동일한 완충제 중에 및 동일한 농도 및 조건하에 있어야 한다. 상기 시험 항체 및 참조 항체를 함유하는 시험 혼합물을 C5-코팅된 BIACORE(등록상표) 칩상에 통과시키고 전체 결합량을 기록한다. 이어서 상기 칩을, 상기 칩-결합된 C5를 손상시키지 않고 결합된 시험 또는 참조 항체를 제거하는 방식으로 처리한다. 전형적으로, 이는 상기 칩을 60초 동안 30 mM HCl로 처리함으로써 수행된다. 이어서 상기 시험 항체만의 용액을 상기 C5-코팅된 표면상에 통과시키고 결합량을 기록한다. 다시 상기 칩을 상기 칩-결합된 C5를 손상시키지 않으면서 상기 결합된 항체가 전부 제거되도록 처리한다. 이어서 상기 참조 항체만의 용액을 상기 C5-코팅된 표면상에 통과시키고 결합량을 기록한다. 이어서 상기 시험 항체 및 참조 항체의 혼합물의 최대 이론 결합을 계산하며, 이는 단독으로 상기 C5 표면상에 통과시의 각 항체(즉 시험 및 참조)의 결합의 합이다. 상기 혼합물의 실제 기록된 결합이 상기 이론적인 최대 미만인 경우, 시험 항체와 참조 항체는 서로 C5 결합에 대해 경쟁한다. 따라서, 일반적으로, 경쟁하는 시험 항-C5 항체는 상기 BIACORE(등록상표) 차단 분석에서, 상기 분석 동안 및 상기 참조 항-C5 항체의 존재하에서 기록된 결합이 상기 시험 항체 및 참조 항체 조합의 최대 이론 결합의 80% 내지 0.1%(예를 들어 80% 내지 4%), 특히 최대 이론 결합의 75% 내지 0.1%(예를 들어 75% 내지 4%), 및 보다 특히 최대 이론 결합(상기 정의된 바와 같은)의 70% 내지 0.1%(예를 들어 70% 내지 4%)이도록 C5에 결합하는 것이다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명의 항-C5 항체는 항체 CFA0341 및 CFA0330 중에서 선택된 VH 및 VL 쌍을 포함하는 항체와 C5 결합에 대해 경쟁한다. 일부 실시태양에서 항-C5 항체는 CFA0538, CFA0501, CFA0599, CFA0307, CFA0366, CFA0675, 및 CFA0672 중에서 선택된 항체와 C5 결합에 대해서 경쟁한다. 일부 실시태양에서 항-C5 항체는 항체 CFA0329와 C5 결합에 대해서 경쟁한다. 일부 실시태양에서, 항-C5 항체는 항체 CFA0666과 C5 결합에 대해서 경쟁한다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명의 항-C5 항체는 항체 CFA0305 또는 305LO5의 VH 및 VL 쌍을 포함하는 항체와 C5 결합에 대해서 경쟁한다.
추가의 실시태양에서, 상기 항-C5 항체는 산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화성으로 C5에 결합한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 항-C5 항체는 CFA0538, CFA0501, CFA0599, CFA0307, CFA0366, CFA0675, 및 CFA0672 중에서 선택된 VH 및 VL 쌍을 포함하는 항체와 C5 결합에 대해서 경쟁한다. 일부 실시태양에서 항-C5 항체는 항체 CFA0666과 C5 결합에 대해서 경쟁한다. 추가의 실시태양에서, 상기 항-C5 항체는 pH 5.8에서보다 pH 7.4에서 더 높은 친화성으로 C5에 결합한다.
추가의 실시태양에서, 상기 항-C5 항체는 산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화성으로 C5에 결합한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 항-C5 항체는 항체 CFA0305 또는 305LO5의 VH 및 VL 쌍을 포함하는 항체와 C5 결합에 대해서 경쟁한다. 추가의 실시태양에서, 상기 항-C5 항체는 pH 5.8에서보다 pH 7.4에서 더 높은 친화성으로 C5에 결합한다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명의 항-C5 항체는 서열번호 22의 VH 및 서열번호 26의 VL, 또는 서열번호 21의 VH 및 서열번호 25의 VL 중에서 선택된 VH 및 VL 쌍을 포함하는 항체와 C5 결합에 대해서 경쟁한다. 일부 실시태양에서, 항-C5 항체는 (a) 서열번호 5의 VH 및 서열번호 15의 VL; (b) 서열번호 4의 VH 및 서열번호 14의 VL; (c) 서열번호 6의 VH 및 서열번호 16의 VL; (d) 서열번호 2의 VH 및 서열번호 12의 VL; (e) 서열번호 3의 VH 및 서열번호 13의 VL; (f) 서열번호 1의 VH 및 서열번호 11의 VL; (g) 서열번호 9의 VH 및 서열번호 19의 VL; (h) 서열번호 7의 VH 및 서열번호 17의 VL; 및 (i) 서열번호 8의 VH 및 서열번호 18의 VL 중에서 선택된 VH 및 VL 쌍을 포함하는 항체와 C5 결합에 대해서 경쟁한다. 일부 실시태양에서, 항-C5 항체는 서열번호 23의 VH 및 서열번호 27의 VL을 포함하는 항체와 C5 결합에 대해서 경쟁한다. 일부 실시태양에서, 항-C5 항체는 서열번호 7의 VH 및 서열번호 17의 VL을 포함하는 항체와 C5 결합에 대해서 경쟁한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 항-C5 항체는 (a) 서열번호 1의 VH 및 서열번호 11의 VL; (b) 서열번호 22의 VH 서열번호 26의 VL; (c) 서열번호 21의 VH 및 서열번호 25의 VL; (d) 서열번호 5의 VH 및 서열번호 15의 VL; (e) 서열번호 4의 VH 및 서열번호 14의 VL; (f) 서열번호 6의 VH 및 서열번호 16의 VL; (g) 서열번호 2의 VH 및 서열번호 12의 VL; (h) 서열번호 3의 VH 및 서열번호 13의 VL; (i) 서열번호 9의 VH 및 서열번호 19의 VL; (j) 서열번호 7의 VH 및 서열번호 17의 VL; (k) 서열번호 8의 VH 및 서열번호 18의 VL; (l) 서열번호 23의 VH 및 서열번호 27의 VL; 및 (m) 서열번호 10의 VH 및 서열번호 20의 VL 중에서 선택된 VH 및 VL 쌍을 포함하는 항체와 C5 결합에 대해서 경쟁한다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명의 항-C5 항체는 (a) 서열번호 22의 VH 및 서열번호 26의 VL; (b) 서열번호 21의 VH 및 서열번호 25의 VL; (c) 서열번호 5의 VH 및 서열번호 15의 VL; (d) 서열번호 4의 VH 및 서열번호 14의 VL; (e) 서열번호 6의 VH 및 서열번호 16의 VL; (f) 서열번호 2의 VH 및 서열번호 12의 VL; (g) 서열번호 3의 VH 및 서열번호 13의 VL; (h) 서열번호 9의 VH 및 서열번호 19의 VL; (i) 서열번호 7의 VH 및 서열번호 17의 VL; (j) 서열번호 8의 VH 및 서열번호 18의 VL; (k) 서열번호 23의 VH 및 서열번호 27의 VL 중에서 선택된 VH 및 VL 쌍을 포함하는 항체와 C5 결합에 대해서 경쟁한다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명의 항-C5 항체는 서열번호 1의 VH 및 서열번호 11의 VL, 또는 서열번호 10의 VH 및 서열번호 20의 VL 중에서 선택된 VH 및 VL 쌍을 포함하는 항체와 C5 결합에 대해서 경쟁한다.
추가의 실시태양에서, 상기 항-C5 항체는 산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화성으로 C5에 결합한다. 몇몇 실시태양에서, 항-C5 항체는 산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화성으로 C5에 결합하며 (a) 서열번호 1의 VH 및 서열번호 11의 VL; (b) 서열번호 5의 VH 및 서열번호 15의 VL; (c) 서열번호 4의 VH 및 서열번호 14의 VL; (d) 서열번호 6의 VH 및 서열번호 16의 VL; (e) 서열번호 2의 VH 및 서열번호 12의 VL; (f) 서열번호 3의 VH 및 서열번호 13의 VL; (g) 서열번호 9의 VH 및 서열번호 19의 VL; (h) 서열번호 7의 VH 및 서열번호 17의 VL; (i) 서열번호 8의 VH 및 서열번호 18의 VL; 및 (j) 서열번호 10의 VH 및 서열번호 20의 VL 중에서 선택된 VH 및 VL 쌍을 포함하는 항체와 C5 결합에 대해서 경쟁한다. 추가의 실시태양에서, 상기 항-C5 항체는 pH 5.8에서보다 pH 7.4에서 더 높은 친화성으로 C5에 결합한다.
일부 실시태양에서, 항-C5 항체는 산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화성으로 C5에 결합하며 (a) 서열번호 5의 VH 및 서열번호 15의 VL; (b) 서열번호 4의 VH 및 서열번호 14의 VL; (c) 서열번호 6의 VH 및 서열번호 16의 VL; (d) 서열번호 2의 VH 및 서열번호 12의 VL; (e) 서열번호 3의 VH 및 서열번호 13의 VL; (f) 서열번호 1의 VH 및 서열번호 11의 VL; (g) 서열번호 9의 VH 및 서열번호 19의 VL; (h) 서열번호 7의 VH 및 서열번호 17의 VL; 및 (i) 서열번호 8의 VH 및 서열번호 18의 VL 중에서 선택된 VH 및 VL 쌍을 포함하는 항체와 C5 결합에 대해서 경쟁한다. 추가의 실시태양에서, 항-C5 항체는 pH 5.8에서보다 pH 7.4에서 더 높은 친화성으로 C5에 결합한다.
일부 실시태양에서, 상기 항-C5 항체는 산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화성으로 C5에 결합하며 서열번호 1의 VH 및 서열번호 11의 VL, 또는 서열번호 10의 VH 및 서열번호 20의 VL 중에서 선택된 VH 및 VL 쌍을 포함하는 항체와 C5 결합에 대해서 경쟁한다. 추가의 실시태양에서, 상기 항-C5 항체는 pH 5.8에서보다 pH 7.4에서 더 높은 친화성으로 C5에 결합한다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명의 항-C5 항체가 어떤 에피토프에 결합하는 지를 하기와 같이 결정할 수 있다: C5상의 아미노산(알라닌 제외)이 알라닌으로 치환된 C5 점 돌연변이체를 293 세포에서 발현시키고, 상기 C5 돌연변이체에 대한 항-C5 항체의 결합을 ELISA, 웨스턴 블럿 또는 BIACORE(등록상표)를 통해 시험하며; 여기에서 야생형 C5에 대한 결합에 비해 상기 C5 돌연변이체에 대한 상기 항-C5 항체의 결합의 실질적인 감소 또는 제거는 상기 항-C5 항체가 C5 상의 상기 아미노산을 포함하는 에피토프에 결합함을 암시한다. 몇몇 실시태양에서, 알라닌으로 치환되는 C5상의 아미노산은 C5의 베타 쇄(서열번호 40)의 Glu48, Asp51, His70, His72, Lys109 및 His110으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 추가의 실시태양에서, 알라닌으로 치환되는 C5상의 아미노산은 C5의 베타 쇄(서열번호 40)의 Asp51 또는 Lys109이다.
또 다른 실시태양에서, pH-의존적인 결합 특성을 갖는 항-C5 항체가 어떤 에피토프에 결합하는 지를 하기와 같이 결정할 수 있다: C5상의 히스티딘 잔기가 또 다른 아미노산(예를 들어 티로신)으로 치환된 C5 점 돌연변이체를 293 세포에서 발현시키고, 상기 C5 돌연변이체에 대한 항-C5 항체의 결합을 ELISA, 웨스턴 블럿 또는 BIACORE(등록상표)를 통해 시험하며; 여기에서 산성 pH에서 상기 C5 돌연변이체에의 결합에 비해 산성 pH에서 야생형 C5에 대한 상기 항-C5 항체의 결합의 실질적인 감소는 상기 항-C5 항체가 C5 상의 상기 히스티딘 잔기를 포함하는 에피토프에 결합함을 암시한다. 추가의 실시태양에서 중성 pH에서 야생형 C5에의 항-C5 항체의 결합은 중성 pH에서 상기 C5 돌연변이체에의 그의 결합에 비해 실질적으로 감소되지 않는다. 몇몇 실시태양에서, 또 다른 아미노산으로 치환되는 C5상의 히스티딘 잔기는 C5의 베타 쇄(서열번호 40)의 His70, His72 및 His110으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 추가의 실시태양에서, 상기 히스트딘 잔기 His70은 티로신으로 치환된다.
2. 활성 분석
하나의 태양에서, 생물학적 활성을 갖는 항-C5 항체의 동정을 위한 분석을 제공한다. 생물학적 활성은 예를 들어 C5 활성화의 저해, C5a 및 C5b를 형성시키는 C5의 절단의 방지, C5 전환효소의 C5상의 절단 부위로의 접근의 차단, C5의 활성화에 의해 야기된 용혈 활성의 차단 등을 포함할 수 있다. 생체내 및/또는 시험관내에서 상기와 같은 생물학적 활성을 갖는 항체를 또한 제공한다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명의 항체를 상기와 같은 생물학적 활성에 대해 시험한다.
몇몇 실시태양에서, 시험 항체가 C5의 C5a 및 C5b로의 절단을 저해하는 지를 예를 들어 문헌[Isenman et al., J Immunol. 124(1):326-331 (1980)]에 개시된 방법들에 의해 판정한다. 또 다른 실시태양에서, 이를 절단된 C5a 및/또는 C5b 단백질의 특이적 검출을 위한 방법, 예를 들어 ELISA 또는 웨스턴 블럿에 의해 판정한다. C5의 절단 산물(즉 C5a 및/또는 C5b)의 감소된 양이 상기 시험 항체의 존재하에서(또는 상기 항체와 접촉에 이어서) 검출되는 경우, 상기 시험 항체를 C5의 절단을 저해할 수 있는 항체로서 동정한다. 몇몇 실시태양에서, C5a의 농도 및/또는 생리학적 활성을 방법들, 예를 들어 주화성 분석, RIA, 또는 ELISA에 의해 측정할 수 있다(예를 들어 문헌[Ward and Zvaifler J. Clin. Invest. 50(3):606-616 (1971)]을 참조하시오).
몇몇 실시태양에서, 시험 항체가 C5로의 C5 전환효소의 접근을 차단하는 지를 상기 C5 전환효소와 C5간의 단백질 상호작용의 검출을 위한 방법, 예를 들어 ELISA 또는 BIACORE(등록상표)에 의해 판정한다. 상기 상호작용이 상기 시험 항체의 존재하에서(또는 상기 항체와 접촉에 이어서) 감소하는 경우, 상기 시험 항체를 C5로의 C5 전환효소의 접근을 차단할 수 있는 항체로서 동정한다.
몇몇 실시태양에서, C5 활성을 피실험자의 체액 중 세포-용해 능력의 함수로서 측정할 수 있다. 상기 C5의 세포-용해 능력, 또는 그의 감소를 당해 분야에 주지된 방법들, 예를 들어 통상적인 용혈 분석, 예를 들어 문헌[Kabat and Mayer (eds), Experimental Immunochemistry, 2nd Edition, 135-240, Springfield, IL, CC Thomas (1961), pages 135-139]에 개시된 용혈 분석, 또는 상기 분석의 통상적인 변형, 예를 들어 문헌[Hillmen et al., N. Engl. J. Med. 350(6): 552-559 (2004)]에 개시된 바와 같은 치킨 적혈구 용혈 방법에 의해 측정할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, C5 활성 또는 그의 저해를 CH50eq 분석을 사용하여 정량분석한다. 상기 CH50eq 분석은 혈청 중의 전체 고전적 보체 활성을 측정하기 위한 방법이다. 상기 시험은 세포용해 분석이며, 상기 고전적 보체 경로의 활성화 인자로서 항체-감작 적혈구, 및 50% 용해(CH50)를 제공하는데 필요한 양을 측정하기 위한 시험 혈청의 다양한 희석물을 사용한다. 상기 용혈의 백분율을 예를 들어 분광광도계를 사용하여 측정할 수 있다. 상기 CH50eq 분석은 종말 보체 복합체(TCC) 자체가 상기 측정된 용혈의 직접적인 원인이므로 상기 TCC 형성의 간접적인 척도를 제공한다. C5 활성화의 저해를 또한 실시예에 제시되고 예시된 방법들을 사용하여 검출 및/또는 측정할 수 있다. 이들 또는 다른 적합한 유형의 분석을 사용하여, C5의 활성화를 저해할 수 있는 후보 항체를 선별할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, C5 활성화의 저해는 하나의 분석에서 유사한 조건하에서의 음성 대조용의 효과에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 또는 40% 또는 그 이상의 C5의 활성화의 감소를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기는 적어도 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상까지의 C5 활성화의 저해를 지칭한다.
D. 면역접합체
본 발명은 또한 하나 이상의 세포독성제, 예를 들어 화학요법제 또는 약물, 성장 저해제, 독소(예를 들어 단백질 독소, 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 그의 단편), 또는 방사성 동위원소에 접합된 본 명세서의 항-C5 항체를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
하나의 실시태양에서, 면역접합체는 항체가 하나 이상의 약물, 예를 들어 비제한적으로 메이탄시노이드(미국특허 제 5,208,020 호, 미국특허 제 5,416,064 호 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1 참조); 아우리스타틴, 예를 들어 모노메틸아우리스타틴 약물 부분 DE 및 DF(MMAE 및 MMAF)(미국특허 제 5,635,483 호 및 미국특허 제 5,780,588 호 및 미국특허 제 7,498,298 호 참조); 돌라스타틴; 칼리키아미신 또는 그의 유도체(미국특허 제 5,712,374 호, 미국특허 제 5,714,586 호, 미국특허 제 5,739,116 호, 미국특허 제 5,767,285 호, 미국특허 제 5,770,701 호, 미국특허 제 5,770,710 호, 미국특허 제 5,773,001 호, 및 미국특허 제 5,877,296 호 참조; 문헌[Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993)]; 및 문헌[Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)] 참조); 안트라사이클린, 예를 들어 다우노마이신 또는 독소루비신(문헌[Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006)]; 문헌[Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006)]; 문헌[Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005)]; 문헌[Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000)]; 문헌[Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002)]; 문헌[King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002)]; 및 미국특허 제 6,630,579 호 참조); 메토트렉세이트; 빈데신; 탁산, 예를 들어 도세탁셀, 패클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁텔 및 오르타탁셀; 트라이코테센; 및 CC1065에 접합된 항체-약물 접합체(ADC)이다.
또 다른 실시태양에서, 면역접합체는 효소 활성 독소 또는 그의 단편, 예를 들어 비제한적으로 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄(슈도모나스 아에루기노사로부터), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알류리테스 포르디이 단백질, 다이안틴 단백질, 피토라카 아메리카나 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 여주 제해제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 저해제, 젤로닌, 미토젤린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트라이코테센에 접합된 본 명세서에 개시된 바와 같은 항체를 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 면역접합체는 방사성 원자에 접합되어 방사성 접합체를 형성하는 본 명세서에 개시된 바와 같은 항체를 포함한다. 다양한 방사성 동위원소들이 방사성 접합체의 제조에 사용될 수 있다. 예로서 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소가 있다. 상기 방사성 접합체가 검출에 사용되는 경우, 상기는 신티그래픽 연구용 방사성 원자, 예를 들어 tc99m 또는 I123, 또는 핵자기 공명(NMR) 영상화(또한 자기공명 영상화, mri로서 공지됨)용 스핀 표지, 예를 들어 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
항체 및 세포독성제의 접합체를 다양한 이작용성 단백질 커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜다이티오)프로피오네이트(SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC), 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 이작용성 유도체(예를 들어 다이메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르(예를 들어 다이숙신이미딜 수베레이트), 알데하이드(예를 들어 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물(예를 들어 비스(p-아지도벤조일)헥산다이아민), 비스-다이아조늄 유도체(예를 들어 비스-(p-다이아조늄벤조일)-에틸렌다이아민), 다이아이소시아네이트(예를 들어 톨루엔 2,6-다이아이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물(예를 들어 1,5-다이플루오로-2,4-다이나이트로벤젠)을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소를 문헌[in Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)]에 개시된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-아이소티오시아네이토벤질-3-메틸다이에틸렌 트라이아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 항체에 대한 방사성핵종의 접합을 위한 예시적인 킬레이트제이다. WO94/11026을 참조하시오. 상기 링커는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 촉진하는 "절단성 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정성 링커, 펩티다제-감수성 링커, 광불안정성 링커, 다이메틸 링커 또는 다이설파이드-함유 링커(Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992); 미국특허 제 5,208,020 호)가 사용될 수 있다.
본 명세서에서 면역접합체 또는 ADC는 비제한적으로 BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 및 설포-SMPB, 및 SVSB(숙신이미딜-(4-비닐설포)벤조에이트(피어스 바이오테크놀로지 인코포레이티드(Pierce Biotechnology, Inc.), 미국 일리노이주 록포드 소재)로부터 상업적으로 입수할 수 있다)를 포함한 가교결합제 시약으로 제조된 상기와 같은 접합체를 명시적으로 고려한다.
E. 진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
몇몇 실시태양에서, 본 명세서에 제공된 항-C5 항체들 중 어느 하나는 생물학적 샘플 중 C5의 존재를 검출하는데 유용하다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "검출"이란 용어는 정량적 또는 정성적 검출을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직, 예를 들어 혈청, 전혈, 혈장, 생검 샘플, 조직 샘플, 세포 현탁액, 타액, 객담, 구강액, 뇌척수액, 양막액, 복수, 모유, 초유, 유선분비물, 림프액, 소변, 땀, 누액, 위액, 활액, 복수, 안용 렌즈액 및 점액을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 진단 또는 검출 방법에 사용하기 위한 항-C5 항체를 제공한다. 추가의 태양에서, 생물학적 샘플 중 C5의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 방법은 상기 생물학적 샘플을 상기 항-C5 항체의 C5에의 결합을 허용하는 조건하에서 본 명세서에 개시된 바와 같은 항-C5 항체와 접촉시키고, 상기 항-C5 항체와 C5 사이에 복합체가 형성되는 지를 검출함을 포함한다. 상기와 같은 방법은 시험관내 또는 생체내일 수 있다. 하나의 실시태양에서, 항-C5 항체를, 예를 들어 C5가 환자의 선별을 위한 생물마커인 경우, 항-C5 항체에 의한 치료법에 적합한 피실험자를 선택하는데 사용한다.
몇몇 실시태양에서, 표지된 항-C5 항체를 제공한다. 표지는 비제한적으로 직접 검출되는 표지 또는 부분(예를 들어 형광성, 발색성, 고전자밀도, 화학발광성 및 방사성 표지)뿐만 아니라 간접적으로, 예를 들어 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해 검출되는 효소 또는 리간드와 같은 부분을 포함한다. 예시적인 표지는 비제한적으로 방사성 동위원소 32P, 14C, 125I, 3H 및 131I, 형광단, 예를 들어 희토 킬레이트 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루시페라제, 예를 들어 개똥벌레 루시페라제 및 세균 루시페라제(미국특허 제 4,737,456 호), 루시페린, 2,3-다이하이드로프탈라진디온, 양고추냉이 페록시다제(HRP), 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제, 예를 들어 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제, 헤테로사이클릭 옥시다제, 예를 들어 유리카제 및 잔틴 옥시다제, 과산화 수소를 사용하여 염료 전구체를 산화시키는 효소(예를 들어 HRP, 락토페록시다제, 또는 마이크로페록시다제)와 결합된, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 유리 라디칼 등을 포함한다.
F. 약학 제형
본 명세서에 개시된 바와 같은 항-C5 항체의 약학 제형을, 목적하는 순도를 갖는 상기와 같은 항체를 하나 이상의 임의의 약학적으로 허용 가능한 담체(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))와 혼합하여 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 제조한다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 사용되는 용량 및 농도에서 수용자에게 일반적으로 무독성이며, 비제한적으로 완충제, 예를 들어 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 산화방지제; 보존제(예를 들어 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩타이드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라진, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 모노사카라이드, 다이사카라이드, 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트제, 예를 들어 EDTA; 당, 예를 들어 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 염-형성 대이온, 예를 들어 나트륨; 금속 착체(예를 들어 Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 본 명세서에서 예시적인 약학적으로 허용 가능한 담체는 간질성 약물 분산제, 예를 들어 용해성 중성-활성 히아루로니다제 당단백질(sHASEGP), 예를 들어 인간 용해성 PH-20 히아루로니다제 당단백질, 예를 들어 rHuPH20(HYLENEX(등록상표), 박스터 인터내셔널 인코포레이티드(Baxter International, Inc.))을 추가로 포함한다. rHuPH20을 포함하여 몇몇 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법이 미국특허 공보 2005/0260186 및 2006/0104968에 개시되어 있다. 하나의 태양에서, sHASEGP는 하나 이상의 추가적인 글리코스아미노글리카나제, 예를 들어 콘드로이티나제와 병용된다.
예시적인 동결건조된 항체 제형이 미국특허 제 6,267,958 호에 개시되어 있다. 수성 항체 제형은 미국특허 제 6,171,586 호 및 WO 2006/044908에 개시된 것들(후자의 제형은 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다)을 포함한다.
본 명세서에서 제형은 또한 치료되는 특정 적응증에 필요한 경우 하나보다 많은 활성 성분, 바람직하게는 서로 불리한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 것들을 함유할 수 있다. 상기와 같은 활성 성분은 의도하는 목적에 유효한 양으로 함께 적합하게 존재한다.
활성 성분을 예를 들어 코아세르베이션 기법에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 미세캡슐, 예를 들어 각각 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어 리포솜, 알부민 미소구, 미세유화액, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 마크로유화액 중의 하이드록시메틸-셀룰로스 또는 젤라틴-미세캡슐 및 폴리-(메틸메트아크릴레이트) 미세캡슐 중에 포집할 수 있다. 상기와 같은 기법들은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
서방성 제제를 제조할 수 있다. 서방성 제제에 적합한 예는 상기 항체를 함유하는 고형 소수성 중합체의 반침투성 기질을 포함하며, 상기 기질은 성형품, 예를 들어 필름 또는 미세캡슐의 형태로 존재한다.
생체내 투여에 사용되는 제형은 일반적으로 무균성이다. 무균상태는 예를 들어 무균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 수행될 수 있다.
G. 치료 방법 및 조성물
본 명세서에 제공된 항-C5 항체들 중 어느 하나를 치료 방법에 사용할 수 있다.
하나의 태양에서, 약제로서 사용하기 위한 항-C5 항체를 제공한다. 추가의 태양에서, 질병의 치료에 사용하기 위한 항-C5 항체를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 치료 방법에 사용하기 위한 항-C5 항체를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명은 질병이 있는 개인에게 유효량의 상기 항-C5 항체를 투여함을 포함하는 상기 개인의 치료 방법에 사용하기 위한 항-C5 항체를 제공한다. 하나의 상기와 같은 실시태양에서, 상기 방법은 또한 상기 개인에게 유효량의 적어도 하나의 추가적인 치료제를 투여함을 포함한다. 상기 실시태양들 중 어느 하나에 따른 "개인"은 바람직하게는 인간이다.
추가의 태양에서, 본 발명은 약제의 제조 또는 조제에서 항-C5 항체의 용도를 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 약제는 질병 치료용이다. 추가의 실시태양에서, 상기 약제는 질병이 있는 개인에게 유효량의 상기 약제를 투여함을 포함하는 질병의 치료 방법에 사용하기 위한 것이다. 하나의 상기와 같은 실시태양에서, 상기 방법은 또한 상기 개인에게 유효량의 적어도 하나의 추가적인 치료제를 투여함을 포함한다. 상기 실시태양들 중 어느 하나에 따른 "개인"은 바람직하게는 인간이다.
추가의 태양에서, 본 발명은 질병의 치료 방법을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 방법은 상기와 같은 질병이 있는 개인에게 유효량의 항-C5 항체를 투여함을 포함한다. 하나의 상기와 같은 실시태양에서, 상기 방법은 또한 상기 개인에게 유효량의 적어도 하나의 추가적인 치료제를 투여함을 포함한다. 상기 실시태양들 중 어느 하나에 따른 "개인"은 바람직하게는 인간이다.
추가의 태양에서, 본 발명은 예를 들어 상기 치료 방법들 중 어느 하나에 사용하기 위한, 본 명세서에 제공된 항-C5 항체들 중 어느 하나를 포함하는 약학 제형을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 약학 제형은 본 명세서에 제공된 항-C5 항체들 중 어느 하나 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 약학 제형은 본 명세서에 제공된 항-C5 항체들 중 어느 하나 및 적어도 하나의 추가적인 치료제를 포함한다.
추가의 태양에서, 상기 약학 제형은 질병 치료용이다. 하나의 실시태양에서, 상기 약학 제형을 질병이 있는 개인에게 투여한다. 상기 실시태양들 중 어느 하나에 따른 "개인"은 바람직하게는 인간이다.
추가의 태양에서, 본 발명은 예를 들어 상기 치료 방법들 중 어느 하나에 사용하기 위한, 본 명세서에 제공된 항-C5 항체들 중 어느 하나를 약학적으로 허용 가능한 담체와 혼합함을 포함하는 약제 또는 약학 제형의 제조 방법을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 약제 또는 약학 제형의 제조 방법은 적어도 하나의 추가적인 치료제를 상기 약제 또는 약학 제형에 가함을 추가로 포함한다.
본 발명의 항체를 치료법에서 단독으로 또는 다른 작용제들과 함께 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체를 적어도 하나의 추가적인 치료제와 동시-투여할 수 있다.
상기에 나타낸 상기와 같은 병용 요법은 병용 투여(2개 이상의 치료제가 동일하거나 별도의 제형 중에 포함된다), 및 개별 투여(이 경우 본 발명의 항체의 투여는 상기 추가적인 치료제 또는 치료제들의 투여 전에, 상기 투여와 동시에, 및/또는 상기 투여에 이어서 발생할 수 있다)를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 항-C5 항체의 투여 및 추가적인 치료제의 투여는 서로 약 1개월 이내, 또는 약 1, 2 또는 3주 이내, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5 또는 6일 이내에 일어난다.
본 발명의 항체(및 임의의 추가적인 치료제)를 비경구, 폐내, 및 비내, 및 국소 치료를 원하는 경우 병변내 투여를 포함한 임의의 적합한 수단에 의해 투여할 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하 투여를 포함한다. 투여는 임의의 적합한 경로, 예를 들어 주사, 예를 들어 투여가 간단한지 만성적인지에 따라 정맥내 또는 피하 주사에 의할 수 있다. 비제한적으로, 다양한 시점들에 걸친 단일 또는 수회 투여, 일시 투여, 및 펄스 주입을 포함한 다양한 투여가 본 명세서에서 고려된다.
본 발명의 항체를 양호한 의료규범과 일치하는 방식으로 제형화하고, 투약하고 투여할 것이다. 이와 관련하여 고려되는 인자는 치료되는 특정 질환, 치료되는 특정 포유동물, 개인 환자의 임상적 상태, 질환의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄, 및 의료 종사자에게 공지된 다른 인자들을 포함한다. 상기 항체는 문제의 질환을 예방하거나 치료하는데 현재 사용되는 하나 이상의 작용제가 필요하지 않지만, 임의로 상기와 함께 제형화한다. 상기와 같은 다른 작용제의 유효량은 상기 제형 중에 존재하는 항체의 양, 질환 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 다른 인자들에 따라 다르다. 상기는 일반적으로 본 명세서에 개시된 바와 동일한 용량 및 투여 경로로, 또는 본 명세서에 개시된 용량의 약 1 내지 99%로, 또는 적합한 것으로 경험적으로/임상적으로 판단된 임의의 용량 및 임의의 경로에 의해 사용된다.
질병의 예방 또는 치료를 위해서, 본 발명의 항체의 적합한 용량(단독으로 사용되거나 또는 하나 이상의 다른 추가적인 치료제와 함께 사용될 때)은 치료되는 질병의 유형, 항체의 유형, 상기 질병의 중증도 및 과정, 상기 항체를 예방학적 또는 치료학적 용도로 투여할 것인지의 여부, 선행 요법, 환자의 임상 병력 및 상기 항체에 대한 응답, 및 주치의의 재량에 따라 변할 것이다. 상기 항체를 적합하게는 상기 환자에게 한 번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 투여한다. 상기 질병의 유형 및 중증도에 따라, 약 1 마이크로그램/㎏ 내지 15 ㎎/㎏(예를 들어 0.1 ㎎/㎏ 내지 10 ㎎/㎏)의 항체가, 예를 들어 1회 이상 개별 투여되든지 또는 연속 주입되든지 간에, 상기 환자에의 투여를 위한 초기 후보 용량일 수 있다. 하나의 전형적인 1일 용량은 상기에 언급된 인자들에 따라 약 1 마이크로그램/㎏ 내지 100 ㎎/㎏ 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸쳐 반복된 투여의 경우, 상기 조건에 따라 상기 치료를 목적하는 질병 증상의 억제가 발생할 때까지 지속할 것이다. 상기 항체의 하나의 예시적인 용량은 약 0.05 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏의 범위일 것이다. 따라서, 약 0.5 ㎎/㎏, 2.0 ㎎/㎏, 4.0 ㎎/㎏ 또는 10 ㎎/㎏의 1회 이상의 용량(또는 이들의 임의의 조합)을 상기 환자에게 투여할 수 있다. 상기와 같은 용량을 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 3주마다(예를 들어 상기 환자가 약 2 내지 약 20회, 또는 예를 들어 약 6회 용량의 상기 항체를 수용하도록) 투여할 수 있다. 초기에 보다 높은 부하 용량에 이어서 1회 이상의 보다 낮은 용량을 투여할 수 있다. 상기 요법의 경과를 통상적인 기법 및 분석에 의해 용이하게 모니터한다.
상기 제형들 또는 치료 방법들 중 어느 하나를 항-C5 항체 대신에 또는 상기 항체 외에 본 발명의 면역접합체를 사용하여 수행할 수도 있음을 이해한다.
H. 제품
본 발명의 또 다른 태양에서, 상술한 질환의 치료, 예방 및/도는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제품을 제공한다. 상기 제품은 용기 및 상기 용기상에 또는 상기 용기와 결합된 표지 또는 첨부문서를 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 주사기, IV 용액 주머니 등을 포함한다. 상기 용기를 다양한 물질, 예를 들어 유리 또는 플라스틱으로부터 형성시킬 수 있다. 상기 용기는 조성물을 단독으로 유지시키거나 또는 증상의 치료, 예방 및/또는 진단에 유효한 또 다른 조성물과 함께 유지시키며, 무균 입구를 가질 수 있다(예를 들어 상기 용기는 피하 주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 주머니 또는 바이알일 수 있다). 상기 조성물 중의 적어도 하나의 활성제는 본 발명의 항체이다. 상기 표지 또는 첨부문서는 상기 조성물이 선택 증상의 치료에 사용됨을 가리킨다. 더욱이, 상기 제품은 (a) 조성물을 함유하는 제1 용기(여기에서 상기 조성물은 본 발명의 항체를 포함한다); 및 (b) 조성물을 함유하는 제2 용기(여기에서 상기 조성물은 추가의 세포독성제 또는 달리 치료제를 포함한다)를 포함한다. 본 발명의 상기 실시태양에서 상기 제품은 상기 조성물을 특정 증상의 치료에 사용할 수 있음을 가리키는 첨부문서를 추가로 포함할 수 있다. 한편으로, 또는 추가로, 상기 제품은 약학적으로 허용 가능한 완충제, 예를 들어 주사용 제균수(BWFI), 포스페이트 완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2(또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상기는 상업적으로 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질, 예를 들어 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 추가로 포함할 수 있다.
상기 제품들 중 어느 하나는 항-C5 항체 대신에 또는 상기 항체 외에 본 발명의 면역접합체를 포함할 수 있음을 이해한다.
실시예
하기는 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예이다. 상기에 제공된 일반적인 개시에 비추어 다양한 다른 실시태양들을 실행할 수 있음을 이해한다.
실시예 1
C5의 제조
1.1. 재조합 인간 및 키노몰구스 원숭이 C5의 발현 및 정제
재조합 인간 C5(NCBI 진뱅크 수납 번호: NP_001726.2, 서열번호 39)를 프리스타일(FreeStyle)293-F 세포주(써모 피셔(Thermo Fisher), 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)를 사용하여 일시적으로 발현시켰다. 인간 C5를 발현하는 순화배지를 동 부피의 밀리Q 수로 희석하고, 이어서 Q-세파로스 FF 또는 Q-세파로스 HP 음이온 교환 컬럼(GE 헬쓰케어, 스웨덴 웁살라 소재)에 적용한 다음 NaCl 구배로 용출시켰다. 인간 C5를 함유하는 분획들을 모으고, 이어서 염 농도 및 pH를 각각 80 mM NaCl 및 pH 6.4로 조절하였다. 생성 샘플을 SP-세파로스 HP 양이온 교환 컬럼(GE 헬쓰케어, 스웨덴 웁살라 소재)에 적용하고 NaCl 구배로 용출시켰다. 인간 C5를 함유하는 분획들을 모으고 CHT 세라믹 하이드록시아파타이트 컬럼(바이오 래드 레보라토리즈(Bio-Rad Laboratories), 미국 캘리포니아주 허큘레스 소재)에 가하였다. 이어서 인간 C5 용출물을 슈퍼덱스(Superdex) 200 젤 여과 컬럼(GE 헬쓰케어, 스웨덴 웁살라 소재)에 적용하였다. 인간 C5를 함유하는 분획들을 모으고 -150 ℃에서 보관하였다.
재조합 키노몰구스 원숭이 C5(NCBI 진뱅크 수납 번호: XP_005580972, 서열번호 44)의 발현 및 정제를 인간 대응물과 동일한 방식으로 수행하였다.
1.2. 혈장으로부터 키노몰구스 원숭이 C5(키노C5)의 정제
키노몰구스 원숭이로부터 혈장 샘플을 SSL7-아가로스(인비보젠(Invivogen), 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)에 적용한 다음 100 mM Na아세테이트, pH 3.5로 용출시켰다. 키노C5를 함유하는 분획들을 즉시 중화시키고 펩타이드 M 아가로스(인비보젠, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)에 연결된 단백질 A HP 컬럼(GE 헬쓰케어, 스웨덴 웁살라 소재)에 가하였다. 이어서 상기 용출 분획을 슈퍼덱스 200 젤 여과 컬럼(GE 헬쓰케어, 스웨덴 웁살라 소재)에 적용하였다. 키노C5를 함유하는 분획들을 모으고 -80 ℃에서 보관하였다.
실시예 2
항-C5 항체의 제작
2.1 항체 선별
항-C5 항체를 하기와 같이 제조하고, 선택하고 분석하였다:
12 내지 16주 된 NZW 토끼를 인간 C5 및/또는 원숭이 C5(50 내지 100 마이크로그램/용량/토끼)로 피내 면역시켰다. 상기 용량을 2개월의 기간에 걸쳐 4-5회 반복하였다. 최종 면역화 1주일 후에, 비장 및 혈액을 상기 면역화된 토끼로부터 채취하였다. 항원-특이성 B-세포를 표지된 항원으로 염색하고, FCM 세포 분류기(FACSaria III, BD)로 분류하고, 96-웰 플레이트에 25,000 세포/웰의 EL4 세포(유럽 콜렉션 오브 셀 컬처) 및 20배 희석된 활성화된 토끼 T-세포 순화배지와 함께 1 세포/웰의 밀도로 도말하고, 7 내지 12일간 배양하였다. EL4 세포를 미토마이신 C(시그마, Cat No. M4287)로 2시간 동안 처리하고 미리 3회 세척하였다. 상기 활성화된 토끼 T-세포 순화배지는 피토헤마글루티닌-M(롯슈, Cat No. 11082132-001), 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(시그마, Cat No. P1585) 및 2% FBS를 함유하는 RPMI-1640 중에서 토끼 흉선세포를 배양함으로써 제조하였다. 배양 후에, B-세포 배양 상등액을 추가의 분석을 위해 채취하고 펠릿을 동결보존하였다.
ELISA 분석을 사용하여 B-세포 배양 상등액 중의 항체의 특이성을 시험하였다. 스트렙트아비딘(진스크립트(GeneScript), Cat No. Z02043)을 실온에서 1시간 동안 PBS 중의 50 nM로 384-웰 MAXISorp(눙크, Cat No. 164688)상에 코팅하였다. 이어서 플레이트를 5배 희석된 블로킹 원(Blocking One)(나칼라이 테스크(Nacalai Tesque), Cat No. 03953-95)으로 차단하였다. 인간 또는 원숭이 C5를 NHS-PEG4-비오틴(PIERCE, Cat No. 21329)으로 표지하고 상기 차단된 ELISA 플레이트에 가하고, 1시간 동안 배양하고 세척하였다. B-세포 배양 상등액을 상기 ELISA 플레이트에 가하고, 1시간 동안 배양하고 세척하였다. 결합을 염소 항-토끼 IgG-양고추냉이 페록시다제(BETHYL, Cat No. A120-111P)에 이어서 ABTS(KPL, Cat No. 50-66-06)를 첨가하여 검출하였다.
ELISA 분석을 사용하여 C5에 대한 항체의 pH-의존적인 결합을 평가하였다. 1 마이크로그램/㎖로 PBS(-)로 희석된 염소 항-토끼 IgG-Fc(BETHYL, Cat No. A120-111A)를 384-웰 MAXISorp(눙크, Cat No. 164688)에 가하고, 실온에서 1시간 동안 배양하고, 5배 희석된 블로킹 원(나칼라이 테스크, Cat No. 03953-95)으로 차단하였다. 배양 후에, 플레이트를 세척하고 B-세포 배양 상등액을 가하였다. 플레이트를 1시간 동안 배양하고, 세척하고, 500 pM의 비오틴화된 인간 또는 원숭이 C5를 가하고 1시간 동안 배양하였다. 배양 후에, 플레이트를 세척하고 pH 7.4 MES 완충제(20 mM MES, 150 mM NaCl 및 1.2 mM CaCl2) 또는 pH 5.8 MES 완충제(20 mM MES, 150 mM NaCl 및 1 mM EDTA)와 함께 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후에, 비오틴화된 C5의 결합을 스트렙트아비딘-양고추냉이 페록시다제 접합체(써모 사이언티픽, Cat No. 21132)에 이어서 ABTS(KPL, Cat No. 50-66-06)를 첨가하여 검출하였다.
옥텟 RED384 시스템(폴 라이프 사이언시즈(Pall Life Sciences))을 사용하여 C5에 대한 항체의 친화성 및 pH-의존적인 결합을 평가하였다. B-세포 배양 상등액 중에 분비된 항체를 단백질 A 바이오센서 팁(폴 라이프 사이언시즈)상에 로드하고 pH 7.4 MES 완충제 중의 50 nM의 인간 또는 원숭이 C5내에 침지시켜 결합 반응속도를 분석하였다. 해리 반응속도를 pH 7.4 MES 완충제 및 pH 5.8 MES 완충제 모두 중에서 분석하였다.
총 41,439개 B-세포주를 친화성에 대해 선별하고 인간 또는 원숭이 C5 및 677 세포주에 대한 pH-의존적 결합을 선택하고 CFA0001-0677 표시하였다. 상기 선택된 세포주의 RNA를 동결보존된 세포 펠릿으로부터 ZR-96 퀵-RNA 키트(자이모 리써치(ZYMO RESEARCH), Cat No. R1053)를 사용하여 정제하였다. 상기 선택된 세포주 중의 항체 중쇄 가변 영역을 암호화하는 DNA를 역전사 PCR에 의해 증폭시키고 F760G4(서열번호 33) 또는 F939G4(서열번호 34) 중쇄 불변 영역을 암호화하는 DNA와 재결합시켰다. 항체 경쇄 가변 영역을 암호화하는 DNA를 역전사 PCR에 의해 증폭시키고 k0MTC 경쇄 불변 영역(서열번호 36)을 암호화하는 DNA와 재결합시켰다. 별도로, 기존의 인간화된 항-C5 항체, 에쿨리주맵의 중쇄 및 경쇄 유전자(EcuH-G2G4, 서열번호 29 및 EcuL-k0, 서열번호 30)를 합성하였다. VH(EcuH, 서열번호 31)를 암호화하는 DNA를 변형된 인간 IgG4 CH(F760G4, 서열번호 33)를 암호화하는 DNA에 인프레임 융합시키고, VL(EcuL, 서열번호 32)을 암호화하는 DNA를 k0 경쇄 불변 영역(서열번호 37)을 암호화하는 DNA에 인프레임 융합시켰다. 각각의 상기 융합된 암호화 서열을 또한 발현 벡터내에 클로닝하였다. 상기 항체들을 프리스타일(상표) 293-F 세포(인비트로젠)에서 발현시키고 배양 상등액으로부터 정제시켜 기능 활성을 평가하였다. 상기 항체의 중화 활성을, 실시예 5.1에 개시된 바와같은 리포솜 용해 분석을 사용하여 보체 활성의 저해를 시험함으로써 평가하였다.
2.2. 샌드위치 ELISA에 의한 에피토프 결합
높은 친화성, pH 의존성 또는 중화 활성을 갖는 항-C5 항체를 추가의 분석을 위해 선택하였다. 샌드위치 ELISA 분석을 사용하여 상기 선택된 항체를 상기 C5 단백질의 동일한 또는 중복 에피토프에 결합하는 상이한 에피토프 빈으로 분류하였다. 표지되지 않은 포획 항체를 1 마이크로그램/㎖로 PBS(-)로 희석하고 384-웰 MAXISorp(눙크, Cat No. 164688)에 가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양하고, 5배 희석된 블로킹 원(나칼라이 테스크, Cat No. 03953-95)으로 차단하였다. 플레이트를 1시간 동안 배양하고, 세척하고 2 nM의 인간 C5를 가하고 1시간 동안 배양하였다. 배양 후에, 플레이트를 세척하고 표지된 검출 항체(1 마이크로그램/㎖, NHS-PEG4-비오틴에 의해 비오틴화된)를 가하였다. 1시간 배양 후에, 비오틴화된 항체의 결합을 스트렙트아비딘-양고추냉이 페록시다제 접합체(써모 사이언티픽, Cat No. 21132)에 이어서 ABTS(KPL, Cat No. 50-66-06)를 첨가하여 검출하였다.
모든 항-C5 항체를 포획 항체 및 검출 항체 모두로서 사용하고 포괄적으로 짝을 지었다. 도 1에 도시된 바와 같이, 상호 경쟁 항체를 7개의 에피토프 빈으로 분류하였다: CFA0668, CFA0334 및 CFA0319를 에피토프 A로 분류하고, CFA0647, CFA0589, CFA0341, CFA0639, CFA0635, CFA0330 및 CFA0318을 에피토프 B로 분류하고, CFA0538, CFA0501, CFA0599, CFA0307, CFA0366, CFA0305, CFA0675, CFA0666 및 CFA0672를 에피토프 C로 분류하고, 에쿨리주맵 및 CFA0322를 에피토프 D로 분류하고, CFA0329를 에피토프 E로 분류하고, CFA0359 및 CFA0217을 에피토프 F로 분류하고, CFA0579, CFA0328 및 CFA0272를 에피토프 G로 분류하였다. 도 1은 항-C5 키메릭 항체 중 일부의 에피토프 비닝을 도시한다. 에피토프 C로 분류된 VH 및 VL 항-C5 항체의 서열을 표 2에 나열한다.
Figure pat00002
2.3. 인간화 및 최적화
상기 항-C5 항체 중 일부의 가변 영역의 인간화를 상기 항체의 잠재적인 면역원성을 감소시키기 위해서 수행하였다. 상기 항-C5 토끼 항체의 상보성-결정 영역(CDR)을 통상적인 CDR 그래프트화 접근법(Nature 321:522-525(1986))을 사용하여 상동성 인간 항체 프레임워크(FR) 상에 그래프트화하였다. 상기 인간화된 VH 및 VL을 암호화하는 유전자를 합성하고 각각 변형된 인간 IgG4 CH(SG402, 서열번호 35) 및 인간 CL(SK1, 서열번호 38)과 결합시키고, 상기 결합된 서열들 각각을 발현 벡터내에 클로닝하였다.
다수의 돌연변이 및 돌연변이 조합들을 검사하여 리드 항체 중 일부의 결합 성질을 개선시키는 돌연변이 및 돌연변이 조합을 동정하였다. 이어서 다수의 돌연변이를 상기 인간화된 가변 영역에 도입시켜 중성 pH에서 C5에 대한 결합 친화성을 증대시키거나 산성 pH에서 C5에 대한 결합 친화성을 감소시켰다. 따라서, 상기 최적화된 변이체들 305LO5 (VH, 서열번호 10; VL, 서열번호 20; HVR-H1, 서열번호 54; HVR-H2, 서열번호 64; HVR-H3, 서열번호 74; HVR-L1, 서열번호 84; HVR-L2, 서열번호 94; 및 HVR-L3, 서열번호 104) 중 하나를 CFA0305로부터 제조하였다.
항체들을 중쇄 및 경쇄 발현 벡터의 혼합물로 동시-형질감염시킨 HEK293 세포에서 발현시키고 단백질 A에 의해 정제하였다.
실시예 3
항-C5 항체의 결합 특성화
3.1. 재조합 항체의 발현 및 정제
재조합 항체를 프리스타일293-F 세포주(써모 피셔, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)를 사용하여 일시적으로 발현시켰다. 항체를 발현하는 순화배지로부터의 정제를 단백질 A를 사용하는 통상적인 방법을 사용하여 수행하였다. 젤 여과를 필요에 따라 추가로 수행하였다.
3.2. pH 의존성의 평가
재조합 인간 C5에 대한 항-C5 항체의 반응속도 매개변수들을 BIACORE(등록상표) T200 기기(GE 헬쓰케어)를 사용하여 37 ℃에서 pH 7.4 및 pH 5.8에서 평가하였다. ProA/G(피어스(Pierce))를 GE 헬쓰케어에 의해 권장된 설정에 따라 아민 커플링 키트(GE 헬쓰케어)를 사용하여 CM4 센서칩상에 고정화시켰다. 항체 및 분석물을 각각의 실행 완충제 ACES pH 7.4 및 pH 5.8(20 mM ACES, 150 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 0.05% 트윈20, 0.005% NaN3)로 희석하였다. 각각의 항체를 ProA/G에 의해 상기 센서 표면상에 포획하였다. 항체 포획 수준은 전형적으로 60 내지 90 공명 단위(RU)였다. 이어서, 재조합 인간 C5를 10 및 20 nM 또는 20 및 40 nM의 농도로 주입한 다음 해리시켰다. 상기 표면을 25 mM NaOH로 재생시켰다. 상기 두 pH 조건에서 반응속도 매개변수를, BIACORE(등록상표) T200 평가 소프트웨어, 버전 2.0(GE 헬쓰케어)을 사용하여 1:1 결합 모델로 센서그램에 피팅함으로써 결정하였다. 모든 항체의 센서그램을 도 2a 및 2b에 도시한다. 상기 항체들의 결합속도(ka), 해리 속도(kd), 및 결합 친화성(KD)을 표 3에 나열한다. CFA0330(VH, 서열번호 21 및 VL, 서열번호 25) 및 CFA0341(VH, 서열번호 22 및 VL, 서열번호 26)을 제외한 모든 항체가 pH 7.4보다는 pH 5.8에서 비교적 더 빠른 해리속도를 나타내었다.
Figure pat00003
3.3. 교차 반응성 조사
인간 C5(hC5) 및 키노몰구스 원숭이 C5(키노C5)에 대한 항-C5 항체의 교차 반응성을 관찰하기 위해서, BIACORE(등록상표) 반응속도 분석을 수행하였다. 상기 분석 설정은 실시예 3.2에 개시된 바와 같았다. 재조합 키노C5를 2, 10 및 50 nM의 농도로 주입하였다. 반응속도 매개변수를 실시예 3.2에 개시된 바와 동일한 데이터 피팅에 의해 결정하였다. pH 7.4에서의 결합 반응속도 및 친화성을 표 4에 나열한다. 표 4에 나타낸 hC5에 대한 반응속도 매개변수는 실시예 3.2의 결과이다. CFA0672를 제외한 모든 항-C5 항체는 hC5 및 키노C5에 대해 필적하는 KD를 나타내었다. 키노C5에 대한 CFA0672의 KD는 hC5에 대한 경우보다 8배 더 약하였다.
Figure pat00004
실시예 4
항-C5 항체의 에피토프 맵핑
4.1. 항-C5 MAb의 C5 베타-쇄-유래된 펩타이드에의 결합
항-C5 단클론 항체(MAb)를 웨스턴 블럿 분석에서 C5 베타-쇄-유래된 펩타이드에의 결합에 대해서 시험하였다. GST-태그(pGEX-4T-1, GE 헬쓰케어 라이프 사이언시즈, 28-9545-49)에 융합된 C5 펩타이드: 19-180, 161-340, 321-500, 및 481-660를 이 콜라이(DH5알파, TOYOBO, DNA-903)에서 발현시켰다. 상기 이 콜라이 샘플을 37 ℃에서 5시간 동안 1 mM 아이소프로필 베타-D1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)와 배양 후에 수확하고, 20000 x g에서 1분간 원심분리시켜 펠릿을 수득하였다. 상기 펠릿을 샘플 완충액(2ME+)(와코(Wako), 191-13272)으로 현탁시키고, 에스턴 블럿 분석에 사용하였다. 각 펩타이드의 발현을 항-GST 항체(아브캠(Abcam), ab9085)로 확인하였다(도 3). 화살표는 GST-융합된 C5 펩타이드(46-49 kDa)를 가리킨다. 항-C5 MAb: CFA0305, CFA0307, CFA0366, CFA0501, CFA0538, CFA0599, CFA0666, CFA0672, 및 CFA0675는 C5의 19-180에 결합되었다(도 3).
4.2. 인간 C5의 MG1-MG2 도메인(1-225)의 발현 및 정제
인간 C5 베타-쇄의 재조합 MG1-MG2 도메인(서열번호 43)을 프리스타일293-F 세포주(써모 피셔, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)를 사용하여 일시적으로 발현시켰다. 상기 MG1-MG2 도메인을 발현하는 순화배지를 1/2 부피의 밀리Q 수로 희석하고, 이어서 Q-세파로스 FF 음이온 교환 컬럼(GE 헬쓰케어, 스웨덴 웁살라 소재)에 적용하였다. 상기 음이온 교환 컬럼으로부터 용출된 분획을 pH 5.0으로 조절하고 SP-세파로스 HP 양이온 교환 컬럼(GE 헬쓰케어, 스웨덴 웁살라 소재)에 적용하고 NaCl 구배로 용출시켰다. MG1-MG2 도메인을 함유하는 분획들을 상기 용출물로부터 채취하고 후속으로 1x PBS로 평형화시킨 슈퍼덱스 75 젤 여과 컬럼(GE 헬쓰케어, 스웨덴 웁살라 소재)에 가하였다. 이어서 상기 MG1-MG2 도메인을 함유하는 분획들을 모으고 -80 ℃에서 보관하였다.
4.3. MG1-MG2 도메인에의 결합 능력
상기 MG1-MG2 도메인에 대한 항-C5 항체의 결합 능력을, 측정을 오직 pH 7.4 조건하에서 수행함을 제외하고, 실시예 3.2에 개시된 바와 동일한 설정을 사용하여 측정하였다. 상기 MG1-MG2 도메인을 20 nM 및 40 nM의 농도로 주입하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, 에쿨리주맵-F760G4를 제외한 모든 항체는 결합 응답의 증가를 나타내었으며, 이는 이들 항체가 MG1-MG2 결합제임을 암시한다. 공지된 알파-쇄 결합제인 에쿨리주맵-F760G4는 MG1-MG2 도메인에 대한 결합을 나타내지 않았다.
4.4. 항-C5 MAb의 C5 MG1-MG2 도메인-유래된 펩타이드에의 결합
항-C5 MAb를 웨스턴 블럿 분석에서 MG1-MG2 도메인-유래된 펩타이드에의 결합에 대해 시험하였다. GST-태그에 융합된 C5 펩타이드: 33-124, 45-124, 52-124, 33-111, 33-108 및 45-111(서열번호 40)를 이 콜라이에서 발현시켰다. 상기 이 콜라이 샘플을 37 ℃에서 5시간 동안 1 mM IPTG와 함께 배양 후에 수확하고 20000 x g에서 1분 동안 원심분리시켜 펠릿을 수득하였다. 상기 펠릿을 샘플 완충액(2ME+)으로 현탁하고, 웨스턴 블럿 분석에 사용하였다. C5-유래된 펩타이드의 발현을 항-GST 항체로 확인하였다(도 5a). CFA0305는 오직 33-124의 펩타이드에만 결합하였다(도 5b). CFA0305는 대조용으로서 사용된 재조합 인간 C5(rhC5)(대략 70 kDa)의 베타-쇄에 결합하였다. 도 5c는 C5-유래된 펩타이드에 대한 항-C5 MAb의 반응을 요약한다.
4.5. 항-C5 MAb의 C5 돌연변이체에의 결합
상기 C5 베타-쇄 중의 3개의 아미노산 잔기: E48, D51 및 K109는 결정 구조 분석에 의해 C5와 항-C5-MAb간의 결합에 관련있는 것으로 예측되었기 때문에, 상기 항-C5 MAb를 웨스턴 블럿 분석에서 인간 C5 점 돌연변이체에의 결합에 대해 시험하였다. C5 점 돌연변이체(여기에서 E48, D51 및 K109 중 어느 하나가 알라닌으로 치환되었다)를 리포펙션에 의해 FS293 세포에서 발현시켰다. 배양 배지를 리포펙션 5일 후에 수확하고, 그 후에 웨스턴 블럿에 사용하였다. SDS-PAGE를 환원 조건하에서 수행하였다. 결과를 도 6에 나타낸다. 에쿨리주맵은 야생형(WT) C5의 알파-쇄 및 3개의 C5 점 돌연변이체에 결합한 반면, CFA0305는 WT C5의 베타 쇄에는 강하게, E48A C5 돌연변이체에는 약하게 결합하였으며, D51A 및 K109A C5 돌연변이체의 베타-쇄에는 결합하지 않았고, 이는 이들 3개 아미노산 잔기가 상기 항체/항원 상호작용에 관련있음을 암시한다. 표 5는 항 C5 MAb(CFA0305, CFA0307, CFA0366, CFA0501, CFA0538, CFA0599, CFA0666, CFA0672, 및 CFA0675)의 웨스턴 블럿 분석의 요약을 나타낸다. 상기 항-C5 MAb는 동일한 에피토프 C로 분류되나, 결합 패턴은 항체들간에 약간 상이하며, 이는 항-C5 MAb에 대한 C5의 결합 영역이 서로 가깝지만 동일하지는 않음을 암시한다.
Figure pat00005
4.6. 항-C5 항체와 C5 돌연변이체의 BIACORE(등록상표) 결합 분석
잔기 E48, G51 및 K109가 항체/항원 상호작용에 실제로 관련 있는지를 시험하기 위해서, BIACORE(등록상표) 결합 분석을 수행하였다. 3개의 C5 돌연변이체를 실시예 4.5에 개시된 바와 같이 제조하였다: E48A, G51A 및 K109A. FS293 세포에서 과발현된 돌연변이체 C5를 함유하는 배양 상등액 샘플을 40 마이크로그램/㎖의 돌연변이체 C5로 제조하였다. BIACORE(등록상표) 결합 분석을 위해서, 상기 샘플을 BIACORE(등록상표) 실행 완충제(ACES pH 7.4, 10 ㎎/㎖ BSA, 1 ㎎/㎖ 카복시메틸 덱스트란)로 4 마이크로그램/㎖의 돌연변이체 C5의 최종 샘플 농도로 10배 희석하였다.
상기 3개의 C5 돌연변이체와 항-C5 항체와의 상호작용을 37 ℃에서 실시예 3.2에 개시된 분석 조건을 사용하여 BIACORE(등록상표) T200 기기(GE 헬쓰케어)로 평가하였다. 10 ㎎/㎖ BSA, 1 ㎎/㎖ 카복시메틸 덱스트란을 함유하는 ACES pH 7.4 완충제를 실행 완충제로서 사용하였다. 에쿨리주맵-F760G4 및 305LO5를 단클론 마우스 항-인간 IgG, Fc 단편 특이성 항체(GE 헬쓰케어)에 의해 상이한 유동 셀상에 포획하였다. 유동 셀 1을 참조 표면으로서 사용하였다. 야생형 및 돌연변이 C5 단백질을 센서 표면상에 4 마이크로그램/㎖ 농도로 주입하여 상기 포획된 항체와 상호작용시켰다. 각 분석 주기의 끝에서, 상기 센서 표면을 3M MgCl2로 재생시켰다. 결과를 비아(Bia) 평가 소프트웨어, 버전 2.0(GE 헬쓰케어)으로 분석하였다. 참조 유동 셀(유동 셀 1) 및 실행 완충제의 블랭크 주입의 곡선을 상기 포획된 항체를 갖는 유동 셀의 곡선으로부터 차감하였다.
도 7에 도시된 바와 같이, 3개의 C5 돌연변이체가 모두 야생형 C5에 비해 유사한 결합 프로파일로 에쿨리주맵에 결합할 수 있었다. 305LO5의 경우, 3개의 돌연변이체가 모두 야생형 C5에 비해 305LO5에 대해 더 낮은 결합 응답을 나타내었다. D51A 및 K109A 돌연변이체는 305LO5에 의한 C5의 결합을 기준선 수준으로 감소시켰다.
4.7. 항-C5 항체와 C5간의 pH 의존적 상호작용에 기여하는 C5상의 His 잔기의 동정
결정 구조 분석은 인간 C5상의 3개의 히스티딘 잔기가 항체/항원 계면에 위치함을 밝혔다. 대략 6.0의 전형적인 pKa를 갖는 히스티딘 잔기는 pH 의존적 단백질-단백질 상호작용에 기여하는 것으로 공지되어 있다(Igawa et al., Biochim Biophys Acta 1844(11):1943-1950 (2014)). 상기 항체/항원 계면상의 His 잔기들 중 어느 것이 항-C5 항체와 C5간의 pH 의존적 상호작용에 기여하는지를 조사하기 위해서, BIACORE(등록상표) 결합 분석을 수행하였다. 단일 His 돌연변이를 갖는 3개의 인간 C5 돌연변이체(H70Y, H72Y 및 H110Y) 및 이중-His 돌연변이를 갖는 돌연변이체(H70Y + H110Y)를 하기와 같이 제조하였다: H70, H72 및 H110 중 어느 하나를 티로신으로 치환시킨 단일 His 돌연변이체 및 H70 및 H110을 모두 티로신에 의해 치환시킨 이중 His 돌연변이체를 리포펙션에 의해 FS293에서 발현시켰다. 상기 C5 His 돌연변이체의, pH-의존적 항-C5 항체인 305LO5에 대한 항원 결합 성질을 실시예 4.6에 개시된 바와 같이 변형된 BIACORE(등록상표) 분석에 의해 측정하였다. 간단히, pH 5.8에서 추가적인 해리 단계를 pH 7.4에서의 해리 단계 직후에 상기 BIACORE(등록상표) 분석에 통합시켜 pH 7.4에서 형성된 복합체로부터의 항체와 항원간의 pH-의존적 해리를 평가하였다. pH 5.8에서의 해리속도를, 스크러버(Scrubber) 2.0(바이오로직(BioLogic) 소프트웨어) 곡선 피팅 소프트웨어를 사용하여 처리 및 피팅 데이터에 의해 측정하였다.
도 8에 도시된 바와 같이, H70 또는 H110에서의 C5 단일 His 돌연변이 및 이중 His 돌연변이(H70+H110)는 중성 pH에서 305LO5에 대한 C5의 결합에 영향을 미치지 않았다. 한편으로, H72에서의 단일 His 돌연변이는 305LO5에 대한 C5의 결합에 현저한 손상을 나타내었다. 상기 C5 His 돌연변이체 및 C5-wt 단백질에 대한 pH 5.8에서의 해리속도를 표 6에 나타낸다. 표 6에 나타낸 바와 같이, C5-wt는 시험된 C5 항원들 중에서 pH 5.8에서 305LO5로부터 가장 빠른 해리를 나타내었다. H70에서의 단일 His 돌연변이는 C5-wt에 비해 pH 5.8에서 거의 2배 더 느린 해리속도를 나타내었고 H110에서의 단일 His 돌연변이는 pH 5.8에서 약간 더 느린 해리속도를 생성시켰다. H70 및 H110 모두에서의 이중 His 돌연변이는 C5-wt보다 거의 3배 더 느린 pH 5.8에서의 해리속도로 pH-의존적 결합에 더 큰 영향을 생성시켰다.
Figure pat00006
실시예 5
C5 활성화에 대한 항-C5 항체의 저해 활성
5.1. 항-C5 MAb에 의한 보체-활성화된 리포솜의 저해
상기 항-C5 MAb를 리포솜 용해 분석에 의해 보체 활성의 저해에 대해서 시험하였다. 30 마이크로리터의 정상 인간 혈청(6.7%)(바이오프레딕(Biopredic), SER018)을 96-웰 플레이트에서 20 마이크로리터의 희석된 MAb와 혼합하고 25 ℃에서 30분 동안 진탕기상에서 배양하였다. 다이니트로페닐에 대한 항체로 감작된 리포솜(오토키트(Autokit) CH50, 와코, 995-40801)을 각 웰로 옮기고 상기 플레이트를 25 ℃에서 2분 동안 진탕기상에 두었다. 50 마이크로리터의 기질 용액(오토키트 CH50)을 각 웰에 가하고 25 ℃에서 2분 동안 진탕에 의해 혼합하였다. 최종 혼합물을 37 ℃에서 40분 동안 배양하고 그 후에 상기 혼합물의 340 ㎚에서의 OD를 측정하였다. 리포솜 용해 퍼센트를 100 x [(ODMAb - OD혈청 및 리포솜 배경)]/[(ODMAb 부재 - OD혈청 및 리포솜 배경)]로서 정의하였다. 도 9a는 항-C5 Mab: CFA0305, 0307, 0366, 0501, 0538, 0599, 0666, 0672, 및 0675가 상기 리포솜 용해를 저해하였음을 도시한다. 2개의 비-pH-의존적 항체: CFA0330 및 0341이 또한 상기 용해를 저해하였다(도 9b).
5.2. 항-C5 MAb에 의한 C5a 생성의 저해
상기 항-C5 MAb를, 상기 항-C5 MAb가 C5의 C5a 및 C5b로의 절단을 저해함을 확인하기 위해서 리포솜 용해 동안 C5a 생성에 대해 시험하였다. 리포솜 용해 분석으로부터의 상등액 중의 C5a 수준을 C5a ELISA 키트(R&D 시스템스, DY2037)를 사용하여 정량분석하였다. 모든 MAb가 상등액 중의 C5a 생성을 용량-의존적으로 저해하였다(도 10a 및 10b).
5.3. 항-C5 Mab에 의한 보체-활성화된 용혈의 억제
상기 항-C5 MAb를 용혈 분석에서 고전적인 보체 활성의 저해에 대해 시험하였다. 치킨 적혈구(cRBC)(이노베이티브 리써치(Innovative research), IC05-0810)를 0.5 mM MgCl2 및 0.15 mM CaCl2(GVB++)를 함유하는 젤라틴/베로날-완충된 염수(보스톤 바이오프로덕츠(Boston BioProducts), IBB-300X)로 세척하고, 그 후에 4 ℃에서 15분 동안 1 마이크로그램/㎖의 항-치킨 RBC 항체(록랜드(Rockland 103-4139)로 감작시켰다. 이어서 상기 세포를 GVB++로 세척하고 동일한 완충제 중에 5 x 107 세포/㎖로 현탁시켰다. 별도의 환저 96-웰 미세시험 플레이트 중에, 50 마이크로리터의 정상 인간 혈청(20%)(바이오프레딕, SER019)을 50 마이크로리터의 희석된 Mab와 혼합하고 37 ℃에서 30분 동안 진탕기상에서 배양하였다. 이어서 상기 감작된 cRBC 현탁액 60 마이크로리터를 상기 혈청을 함유하는 웰에 가하고, 상기 항체 혼합물을 37 ℃에서 30분 동안 배양하였다. 상기 배양 후에, 상기 플레이트를 4 ℃에서 2분 동안 1000 x g에서 원심분리시켰다. 상등액(100 마이크로리터)을 415 ㎚에서의 OD(참조 파장 630 ㎚)의 측정을 위해 편평바닥 96-웰 미세시험 플레이트상의 웰로 옮겼다. 용혈 퍼센트를 100 x [(ODMAb - OD혈청 및 cRBC)]/[(ODMAb 부재 - OD혈청 및 cRBC 배경)]로서 정의하였다. 도 11은 항-C5 Mab: CFA0305 및 305LO5가 cRBC의 용혈을 저해하였음을 나타낸다.
5.4. 항-C5 MAb에 의한 부 보체 경로의 저해
부 경로에 대한 용혈 분석을 상기 고전적 경로 용혈 분석과 유사한 방식으로 수행하였다. 뉴질랜드 화이트 토끼(인비보스(InVivos))로부터 채혈한 혈액을 동일한 부피의 알세버(Alsever) 용액(시그마, A3551)과 혼합하고, 상기 혼합물을 토끼 RBC(rRBC)로서 사용하였다. rRBC를 2 mM MgCl2 및 10 mM EGTA가 보충된 GVB로 세척하고 동일한 완충제 중에서 7 x 108 세포/㎖로 현탁시켰다. 환저 96-웰 미세시험 플레이트에서, 40 마이크로리터의 정상 인간 혈청(25%)(바이오프레딕; SER019)을 40 마이크로리터의 희석된 Mab와 혼합하고 37 ℃에서 30분 동안 진탕기상에서 배양하였다. 이어서 상기 20 마이크로리터의 상기 rRBC 현탁액을 상기 혈청을 함유하는 웰에 가하고, 상기 항체 혼합물을 37 ℃에서 60분 동안 배양하였다. 상기 배양 후에, 상기 플레이트를 4 ℃에서 2분 동안 1000 x g에서 원심분리시켰다. 상등액(70 마이크로리터)을 415 ㎚에서의 OD(참조 파장 630 ㎚)의 측정을 위해 편평바닥 96-웰 미세시험 플레이트상의 웰로 옮겼다. 도 12는 항-C5 Mab: CFA0305 및 CFA0672가 rRBC의 용혈을 억제하였음을 나타내며, 이는 이들 항체가 상기 부 보체 경로를 저해함을 암시한다.
실시예 6
항-C5 단클론 항체(305 변이체)의 최적화
다수의 돌연변이를 상기 항 C5 항체 305LO5의 최적화된 가변 영역에 도입시켜 그의 성질을 추가로 개선시키고, 최적화된 가변 영역 305LO15, 305LO16, 305LO18, 305LO19, 305LO20, 305LO22, 및 305LO23을 생성시켰다. 상기 305 변이체의 VH 및 VL의 아미노산 서열을 각각 표 7 및 8에 나열한다. 상기 인간화된 VH를 암호화하는 유전자들을 변형된 인간 IgG1 CH 변이체 SG115(서열번호 114)와 조합하고, 변형된 인간 IgG4 CH 변이체 SG422(서열번호 115) 또는 SG429(서열번호 116)과 조합하였다. 상기 인간화된 VL을 암호화하는 유전자들을 인간 CL(SK1, 서열번호 38)과 조합하였다. 별도로, 인간화된 항-C5 항체, BNJ441을 암호화하는 중쇄 및 경쇄 유전자(BNJ441H, 서열번호 149; BNJ441L, 서열번호 150)를 합성하고 각각을 발현 벡터내에 클로닝하였다.
항체들을 중쇄 및 경쇄 발현 벡터의 조합으로 동시-형질감염시킨 HEK293 세포에서 발현시키고 단백질 A에 의해 정제시켰다.
Figure pat00007
Figure pat00008
실시예 7
항-C5 항체(305 변이체)의 결합 특성화
재조합 인간 C5에 대한 항-C5 항체의 반응속도 매개변수를 37 ℃에서 BIACORE(등록상표) T200 기기(GE 헬쓰케어)를 사용하여 3개의 상이한 조건에서 평가하였다: (1) 결합 및 해리가 모두 pH 7.4였고, (2) 결합 및 해리가 모두 pH 5.8이었고; (3) 결합이 pH 7.4이나 해리는 pH 5.8이었다. ProA/G(피어스)를 GE 헬쓰케어에 의한 권장 설정에 따라 아민 커플링 키트(GE 헬쓰케어)를 사용하여 CM1 센서칩상에 고정화시켰다. 조건(1) 및 (3)에 대한 항체 및 분석물을 ACES pH 7.4 완충제(20 mM ACES, 150 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 0.05% 트윈20, 0.005% NaN3) 중에서 희석하고 조건(2)의 경우 상기를 ACES pH 5.8 완충제(20 mM ACES, 150 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 0.05% 트윈20, 0.005% NaN3) 중에서 희석하였다. 각 항체를 ProA/G에 의해 상기 센서 표면상에 포획하였다. 항체 포획 수준은 전형적으로 60 내지 90 공명 단위(RU)였다. 이어서 재조합 인간 C5를 3배 연속 희석에 의해 제조된 3 내지 27 nM 또는 13.3 내지 120 nM로 주입한 다음 해리시켰다. 상기 표면을 25 mM NaOH로 재생시켰다. BIACORE(등록상표) T200 평가 소프트웨어, 버전 2.0(GE 헬쓰케어)를 사용하여, 조건(1) 및 (2)에서의 반응속도 매개변수를 1:1 결합 모델에 상기 센서그램을 피팅시켜 결정하고 조건(3)에서의 해리속도는 MCK 모델에 대한 1:1 해리에 상기 센서그램을 피팅시켜 결정하였다. 모든 항체의 pH 의존성을 조건(2) 및 (1)의 해리속도의 비로서 나타내었다.
결합속도(ka), 해리속도(kd), 결합 친화성(KD) 및 pH 의존성을 표 9에 나열한다. 모든 항체가 pH 7.4보다 pH 5.8에서 더 빠른 해리속도를 나타내었으며 이들의 pH 의존성은 대략 20배였다.
Figure pat00009
pH 7.4 및 pH 5.8에서 재조합 인간 C5에 대한 항-C5 항체(BNJ441, 에쿨리주맵, 및 305 변이체)의 결합 친화성을 BIACORE(등록상표) T200 기기(GE 헬쓰케어)를 사용하여 37 ℃에서 측정하여 항원결합시 pH의 영향을 평가하였다. 염소 항-인간 IgG(Fc) 다클론 항체(KPL #01-10-20)를 제조사의 권장 설정에 따라 아민 커플링 키트(GE 헬쓰케어)를 사용하여 CM4 센서칩상에 고정화시켰다. 항체 및 분석물을 ACES pH 7.4 완충제 또는 ACES pH 5.8 완충제(20 mM ACES, 150 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 0.05% 트윈20, 0.005% NaN3 함유) 중에서 희석하였다. 항체를 항-Fc 방법을 사용하여 상기 센서 표면상에 포획하였으며, 포획 수준은 전형적으로 50 내지 80 공명 단위(RU)였다. 재조합 인간 C5를 pH 7.4 분석 조건의 경우 27 nM에서 출발하거나, 또는 pH 5.8 분석 조건의 경우 135 nM에서 출발하는 3배 연속 희석에 의해 제조하였다. 상기 표면을 20 mM HCl, 0.01% 트윈 20을 사용하여 재생시켰다. 상기 데이터를 비아이밸류에이션(BiaEvaluation) 2.0 소프트웨어(GE 헬쓰케어)를 사용하여 처리하고 1:1 결합 모델에 피팅하였다.
pH 7.4 및 pH 5.8에서 재조합 인간 C5에 대한 BNJ441, 에쿨리주맵 및 305 변이체의 결합 친화성(KD)을 표 10에 나타낸다. 상기 305 변이체는, 단지 93의 (pH 5.8에서의 KD)/(pH 7.4에서의 KD)의 비만을 나타내는 BNJ441보다 8배 더 높은, 거의 800의 (pH 5.8에서의 KD)/(pH 7.4에서의 KD)의 비를 나타내었다.
Figure pat00010
실시예 8
C5 활성화에 대한 항-C5 항체(305 변이체)의 저해 활성
8.1. 항-C5 MAb에 의한 보체-활성화된 리포솜의 저해
상기 항-C5 MAb를 리포솜 용해 분석에 의해 보체 활성의 저해에 대해서 시험하였다. 30 마이크로리터의 정상 인간 혈청(6.7%)(바이오프레딕, SER019)을 96-웰 플레이트에서 20 마이크로리터의 희석된 MAb와 혼합하고 실온에서 30분 동안 진탕기상에서 배양하였다. 다이니트로페닐에 대한 항체로 감작된 리포솜 용액(오토키트 CH50, 와코, 995-40801)을 각 웰로 옮기고 상기 플레이트를 37 ℃에서 2분 동안 진탕기상에 두었다. 50 마이크로리터의 기질 용액(오토키트 CH50)을 각 웰에 가하고 37 ℃에서 2분 동안 진탕에 의해 혼합하였다. 최종 혼합물을 37 ℃에서 40분 동안 배양하고 그 후에 340 ㎚에서의 OD를 측정하였다. 리포솜 용해 퍼센트를 100 x [(ODMAb - OD혈청 및 리포솜 배경)]/[(ODMAb 부재 - OD혈청 및 리포솜 배경)]로서 정의하였다. 도 13은 항-C5 Mab: 305LO15-SG422, 305LO16-SG422, 305LO18-SG422, 305LO19-SG422, 305LO20-SG422, 및 305LO20-SG115가 상기 리포솜 용해를 저해하였음을 도시한다. Fc 변이체를 갖는 2개의 항체: 305LO15-SG115 및 305LO23-SG429가 또한 상기 용해를 저해하였다(도 14).
상기 항-C5 MAb를 재조합 인간 C5(서열번호 39)의 저해에 대해 시험하였다. 10 마이크로리터의 C5-결핍 인간 혈청(시그마, C1163)을 96-웰 플레이트 중의 20 마이크로리터의 희석된 MAb 및 20 마이크로리터의 재조합 C5(0.1 마이크로그램/㎖)와 혼합하였다. 리포솜(오토키트 CH50)을 각 웰로 옮기고 37 ℃에서 2분 동안 진탕기상에 두었다. 50 마이크로리터의 기질 용액(오토키트 CH50)을 각 웰에 가하고 37 ℃에서 2분 동안 진탕에 의해 혼합하였다. 최종 혼합물을 37 ℃에서 180분 동안 배양하고 그 후에 340 ㎚에서의 OD를 측정하였다. 리포솜 용해 퍼센트를 상기와 같이 정의하였다. 도 15는 항-C5 MAb: 305LO22-SG115, 305LO22-SG422, 305LO23-SG115, 및 305LO23-SG422가 리포솜 용해를 저해하였음을 도시한다.
8.2. 항-C5 MAb에 의한 C5a 생성의 저해
항-C5 MAb를, 항-C5 MAb가 C5의 C5a 및 C5b로의 절단을 저해함을 확인하기 위해서 리포솜 용해 동안 C5a 생성에 대해 시험하였다. 리포솜 용해 분석으로부터의 상등액 중의 C5a 수준을 C5a ELISA 키트(R&D 시스템스, DY2037)를 사용하여 정량분석하였다. 모든 MAb가 상등액 중의 C5a 생성을 용량-의존적인 방식으로 저해하였다(도 16 및 17).
8.3 키노몰구스 원숭이 혈장에서 보체 활성의 측정
항-C5 MAb를 키노몰구스 원숭이 혈장에서 보체 활성의 저해에 대해 시험하였다. 상기 항-C5 Mab를 상기 원숭이에게 내부 투여하고(20 ㎎/㎏), 혈장 샘플을 56일까지 주기적으로 채취하였다. 치킨 적혈구(cRBC)(이노베이티브 리써치, IC05-0810)를 0.5 mM MgCl2 및 0.15 mM CaCl2(GVB++)를 함유하는 젤라틴/베로날-완충된 염수(보스톤 바이오프로덕츠, IBB-300X)로 세척하고, 그 후에 4 ℃에서 15분 동안 1 마이크로그램/㎖의 항-치킨 RBC 항체(록랜드 103-4139)로 감작시켰다. 이어서 상기 세포를 GVB++로 세척하고 동일한 완충제 중에 1 x 108 세포/㎖로 현탁시켰다. 별도의 환저 96-웰 미세시험 플레이트 중에서, 원숭이 혈장을 37 ℃에서 20분 동안 감작된 cRBC와 배양하였다. 상기 배양 후에, 상기 플레이트를 4 ℃에서 2분 동안 1000 x g에서 원심분리시켰다. 상등액을 415 ㎚에서의 OD(참조 파장 630 ㎚)의 측정을 위해 편평바닥 96-웰 미세시험 플레이트상의 웰로 옮겼다. 용혈 퍼센트를 100 x [(OD투여 후 - OD혈장 및 cRBC 배경)]/[(OD투여 전 - OD혈장 및 cRBC 배경)]로서 정의하였다. 도 18은 항-C5 Mab: 305LO15-SG422, 305LO15-SG115, 305LO16-SG422, 305LO18-SG422, 305LO19-SG422, 305LO20-SG422, 305LO20-SG115, 및 305LO23-SG115가 혈장에서의 보체 활성을 저해하였음을 나타낸다.
8.4. 항-C5 MAb에 의한 C5 변이체의 생물학적 활성의 저해
항-C5 MAb를 재조합 인간 C5 변이체: V145I, R449G, V802I, R885H, R928Q, D966Y, S1310N, 및 E1437D의 억제에 대해 시험하였다. C5 중에 R885H 돌연변이를 갖는 PNH 환자는 에쿨리주맵에 대해 불량한 응답을 나타내는 것으로 보고되었다(예를 들어 문헌[Nishimura et al., New Engl. J. Med. 370:632-639 (2014)]을 참조하시오). 상기 인간 C5 변이체를 각각 FS293 세포에서 발현시키고, 상등액을 하기의 연구에 사용하였다. 10 마이크로리터의 C5-결핍 인간 혈청(시그마, C1163)을 96-웰 플레이트 중의 20 마이크로리터의 희석된 MAb 및 20 마이크로리터의 세포 배양 배지(2 내지 3 마이크로그램/㎖의 재조합 C5 변이체 함유)와 혼합하고 37 ℃에서 0.5시간 동안 진탕기상에서 배양하였다. 리포솜(오토키트 CH50)을 각 웰로 옮기고 37 ℃에서 2분 동안 진탕기상에 두었다. 50 마이크로리터의 기질 용액(오토키트 CH50)을 각 웰에 가하고 37 ℃에서 2분 동안 진탕에 의해 혼합하였다. 최종 혼합물을 37 ℃에서 90분 동안 배양하고, 그 후에 340 ㎚에서 OD를 측정하였다. 리포솜 용해 퍼센트를 상기와 같이 정의하였다. 도 19는 항-C5 MAb(에쿨리주맵)가 R885H C5 변이체를 저해하지 않았지만, 시험된 다른 변이체들은 저해하였음을 도시한다. 도 20은 상기 항-C5 MAb(305 변이체)가 시험된 C5의 모든 변이체를 저해하였음을 도시한다.
8.5. 항-C5 MAb에 의한 보체-활성화된 리포솜 용해의 저해
항-C5 MAb를 리포솜 용해 분석에 의해 보체 활성의 저해에 대해서 시험하였다. 30 마이크로리터의 정상 인간 혈청(6.7%)(바이오프레딕, SER019)을 96-웰 플레이트에서 20 마이크로리터의 희석된 MAb와 혼합하고 실온에서 30분 동안 진탕기상에서 배양하였다. 다이니트로페닐에 대한 항체로 감작된 리포솜 용액(오토키트 CH50, 와코, 995-40801)을 각 웰로 옮기고 25 ℃에서 2분 동안 진탕기상에 두었다. 50 마이크로리터의 기질 용액(오토키트 CH50)을 각 웰에 가하고 25 ℃에서 2분 동안 진탕에 의해 혼합하였다. 최종 혼합물을 37 ℃에서 45분 동안 배양하고 그 후에 340 ㎚에서의 OD를 측정하였다. 리포솜 용해 퍼센트를 100 x [(ODMAb - OD혈청 및 리포솜 배경)]/[(ODMAb 부재 - OD혈청 및 리포솜 배경)]로서 정의하였다. 도 21은 상기 항-C5 MAb, BNJ441 및 상기 305 변이체가 리포솜 용해를 저해하였으며, 상기 305 변이체는 BNJ441보다 더 강한 저해 활성을 가짐을 도시한다.
실시예 9
305 변이체 Fab 및 인간 C5-MG1 도메인 복합체의 X-선 결정 구조 분석
9.1. 인간 C5의 MG1 도메인(20-124)의 발현 및 정제
트롬빈 절단성 링커를 통해 GST-태그에 융합된 MG1 도메인(서열번호 39의 아미노산 잔기 20-124)(GST-MG1)을 pGEX-4T-1 벡터(GE 헬쓰케어)를 사용하여 이 콜라이 균주 BL21 DE3 pLysS(프로메가)에서 발현시켰다. 단백질 발현을 25 ℃에서 5시간 동안 0.1 mM 아이소프로필 베타-D-1 티오갈락토피라노사이드(IPTG)로 유도하였다. 세균 세포 펠릿을 리소나제(머크) 및 완전 프로테아제 억제제 칵테일(롯슈)이 보충된 버그버스터(Bugbuster)(머크)로 용해시킨 다음 제조사의 설명서에 따라 GSTrap 컬럼(GE 헬쓰케어)을 사용하여 용해성 분획으로부터 GST-MG1을 정제시켰다. 상기 GST 태그를 트롬빈(시그마)으로 절단하고, 생성되는 MG1 도메인을 슈퍼덱스 75 젤 여과 컬럼(GE 헬쓰케어)으로 추가 정제하였다. MG1 도메인을 함유하는 분획들을 모으고 -80 ℃에서 보관하였다.
9.2. 305 변이체의 Fab 단편의 제조
305로부터 최적화된 변이체들 중 하나의 Fab 단편을 파파인(롯슈 다이아그노스틱스(Roche Diagnostics), Cat No. 1047825)으로 제한 절단한 다음, Fc 단편의 제거를 위한 단백질 A 컬럼(MabSlect SuRe, GE 헬쓰케어), 양이온 교환 컬럼(HiTrap SP HP, GE 헬쓰케어) 및 젤 여과 컬럼(슈퍼덱스200 16/60, GE 헬쓰케어)상에 로딩하여 통상적인 방법에 의해 제조하였다. Fab 단편을 함유하는 분획들을 모으고 -80 ℃에서 보관하였다.
9.3. 305 변이체 Fab 및 인간 C5-MG1 도메인 복합체의 제조
정제된 재조합 인간 C5-MG1 도메인을 정제된 305 변이체 Fab 단편과 1:1 몰비로 혼합하였다. 상기 복합체를 25 mM HEPES pH 7.5, 100 mM NaCl로 평형화시킨 컬럼을 사용하여 젤 여과 크로마토그래피(슈퍼덱스200 10/300 증분, GE 헬쓰케어)에 의해 정제하였다.
9.4. 결정화
상기 정제된 복합체를 약 10 ㎎/㎖로 농축시키고, 결정화를 4 ℃에서 시딩 방법과 함께 시팅 드롭(sitting drop) 증기 확산 방법에 의해 수행하였다. 수용조 용액은 0.2M 마그네슘 포르메이트 데하이드레이트, 15.0% w/v 폴리에틸렌 글리콜 3350으로 이루어졌다. 이어서 수일내에 판상 결정이 수득되었다. 상기 결정을 0.2M 마그네슘 포르메이트 데하이드레이트, 25.0% w/v 폴리에틸렌 글리콜 3350 및 20% 글리세롤의 용액에 침지시켰다.
9.5. 데이터 수집 및 구조 결정
X-선 회절 데이터를 SPring-8에서 BL32XU에 의해 측정하였다. 상기 측정 중에, 상기 결정을 항상 -178 ℃에서 질소 스트림 중에 두어 동결된 상태를 유지시켰으며, 상기 결정을 한 번에 1.0도 회전시키면서 광선에 부착된 MX-225HS CCD 검출기(RAYONIX)를 사용하여 총 180개의 X-선 회절 상을 수집하였다. 세포 매개변수의 결정, 회절 스폿의 지수기입, 및 상기 회절 상으로부터 획득된 회절 데이터의 처리를 Xia2 프로그램(J. Appl. Cryst. 43:186-190 (2010), XDS 패키지(Acta. Cryst. D66:125-132 (2010)), 및 Scala(Acta. Cryst. D62:72-82 (2006)를 사용하여 수행하고, 최종적으로 2.11 옹스트롬 분해능까지의 회절 강도 데이터를 획득하였다. 상기 결정학적 데이터 통계치를 표 11에 나타낸다.
Figure pat00011
a:
Figure pat00012
(여기에서 Ij(hkl) 및 <I(hkl)>는 각각 측정치 j에 대한 강도 및 지수 hkl을 갖는 반사에 대한 평균 강도이다.)
b: R 인자 =
Figure pat00013
(여기에서 Fobs 및 Fcalc는 각각 관찰된 및 계산된 구조 인자 폭이다)
c: Rfree는 무작위로 확보한 반사의 5%로 계산된다.
상기 구조를 프로그램 Phaser(J. Appl. Cryst. 40:658-674 (2007))를 사용하여 분자 치환에 의해 측정하였다. 상기 Fab 도메인의 탐색 모델은 공개된 인간 IgG4 Fab 결정 구조(PDB 코드:1BBJ)로부터 유래하였으며, 상기 MG1 도메인의 탐색 모델은 공개된 인간 C5 결정 구조(PDB 코드: 3CU7, Nat.Immunol. 9:753-760 (2008))로부터 유래하였다. 모델을 쿠트(Coot) 프로그램(Acta Cryst. D66:486-501 (2010))으로 구성하고 프로그램 Refmac5(Acta Cryst. D67:355-367 (2011))으로 정밀화하였다. 25-2.11 옹스트롬으로부터의 회절 강도 데이터에 대한 결정학적 신뢰도 인자(R)는 20.42%이었으며, 이때 자유 R 값은 26.44%였다. 구조 정밀화 통계치를 표 11에 나타낸다.
9.6. 305 변이체 Fab 및 C5-MG1 도메인 복합체의 전체 구조
305로부터의 최적화된 변이체의 Fab 단편("305 Fab")은 인간 C5-MG1 도메인("MG1")에 1:1 비로 결합하였고, 상기 결정 구조의 비대칭 유닛은 도 22a에 묘사된 바와 같이 2개의 복합체, 분자 1 및 2를 함유하였다. 분자 1 및 2는 도 22b에 도시된 바와 같이, 모든 잔기 중의 C-알파 원자 위치와 함께 0.717 옹스트롬 RMSD로 잘 정렬될 수 있다. 하기에 논의된 도면들을 분자 1을 사용하여 작성하였다.
도 23a 및 23b에서, 상기 305 Fab 접촉 영역의 에피토프를 각각 MG1 아미노산 서열 및 결정 구조 중에 맵핑한다. 상기 에피토프는 상기 결정 구조에서 305 Fab의 임의의 부분으로부터 4.5 옹스트롬 거리 내에 위치한 하나 이상의 원자를 함유하는 MG1의 아미노산 잔기들을 포함한다. 또한, 3.0 옹스트롬 이내의 에피토프를 도 23a에서 강조한다.
9.7. E48, D51 및 K109의 상호작용
실시예 4.5 및 4.6에 개시된 바와 같이, 상기 305 항체 시리즈를 포함하는 항-C5 Mab를 3개의 인간 C5 점 돌연변이체, E48A, D51A 및 K109A에의 결합에 대해서 웨스턴 블럿 및 BIACORE(등록상표) 결합 분석에 의해 시험하였다. 상기 305 변이체는 WT C5에 강하게 결합한 반면, 상기 E48A C5 돌연변이체에는 단지 약하게 결합하였으며 D51A 및 K109A 돌연변이체에는 결합하지 않았다. 상기 305 Fab 및 MG1 복합체의 결정 구조는 도 24a에 도시된 바와 같이, 상기 3개의 아미노산 E48, D51 및 K109가 모두 상기 305 Fab로부터 3.0 옹스트롬 거리내에 있으며 상기 Fab와 다수의 수소 결합을 형성함을 밝혔다. 보다 상세한 조사시, MG1의 K109 잔기는 Fab의 중쇄의 계면에 형성된 홈 중에 묻혀있고 상기 Fab와, H-CDR3_G97, H-CDR3_Y100 및 H-CDR3_T100b와의 3개의 수소 결합에 의해서 및 H-CDR3_D95와의 염 가교에 의해서 긴밀히 상호작용한다(도 24d). D51은 MG1과 상기 305 Fab의 중쇄 사이에 위치하며 H-CDR1_Ser32 및 H-CDR2_Ser54와 2개의 수소 결합을 형성하여 공간을 채운다(도 24c). 이는 C5의 K109 및 D51이 모두 상기 305 항체 시리즈의 결합에 중요한 잔기임을 암시한다. 다른 한편으로, E48은 상기 표면에 더 가깝게 위치하고 상기 Fab와 단지 하나의 수소 결합만을 형성하는데, 이는 상기 항체 결합에 대한 그의 기여가 K109 및 E51의 경우보다 적을 것임을 암시한다(도 24b). 이러한 관계는 인간 C5 돌연변이체의 웨스턴 블럿 및 BIACORE(등록상표) 결합 분석(실시예 4.5 및 4.6)의 결과와 일치한다. 보충 사항: 상기 Fab 아미노산에 대한 잔기 넘버링은 카밧 넘버링 설계에 근거한다(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991).
9.8. 인간 C5 및 305 항체 시리즈의 H70, H72 및 H110의 상호작용
상기 결정 구조 분석은 인간 C5상의 3개의 히스티딘 잔기, 즉 H70, H72 및 H110이 도 23a 및 도 25a에 도시된 바와 같이, 상기 305 변이체 Fab의 에피토프 중에 포함됨을 밝혔다. 인간 C5 돌연변이체 H70Y, H72Y, H110Y 및 H70Y+H110Y를 사용하여 BIACORE(등록상표) 결합 분석을 수행하여 이들 히스티딘 잔기의 인간 C5 및 305 변이체 Fab간의 pH-의존적 단백질-단백질 상호작용에의 기여를 조사하였다(실시예 4.7). H72Y는 C5에 대한 상기 305 변이체 Fab의 결합의 완전한 상실을 생성시켰다. 상기 C5의 잔기는 도 25c에 도시된 바와 같이, 상기 305 Fab의 중쇄의 CDR2 고리 및 MG1의 고리(L73, S74 및 E76)에 의해 형성된 포켓 중에 위치하여 상기 공간을 치밀하게 채운다. 또한, 상기 C5의 H72 잔기는 H-CDR2_Y58과 수소 결합을 형성한다. 상기 H72Y 돌연변이는, 티로신의 보다 벌크한 측쇄를 수용하기에 충분한 공간이 존재하지 않기 때문에, 허용되지 않을 것으로 예상된다. 또한 H-CDR2_Y58과의 수소 결합이 유지될 수 없다. H70 및 H110의 pH 의존성에의 기여에 관하여, H70Y 및 H110Y 돌연변이는 pH 5.8에서 C5로부터 상기 305 변이체 Fab의 보다 느린 해리를 생성시켰다. H70은 MG1의 T53과 분자내 수소 결합을 형성하며, 이는 C5의 H70의 양성자화가 MG1의 상호작용 계면의 상응하는 부분에서의 입체구조 변화를 일으키는 경우 pH 5.8에서 파괴되는 것으로 여겨진다(도 25b). H110의 경우, 상기 C5 잔기의 양성자화는 상기 305 Fab의 전하 반발을 야기할 것으로 예상되며, 이는 이웃하는 히스티딘 잔기, H-CDR3_H100c의 양성자화에 의해 증대될 수 있다(도 25d).
상기 발명을 이해의 명확성을 위해서, 예시 및 실시예에 의해 일부 상세히 개시하였지만, 상기 설명 및 실시예를 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석해서는 안 된다. 본 명세서에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 내용은 전체가 참고로 명백히 인용된다.
SEQUENCE LISTING <110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA <120> ANTI-C5 ANTIBODIES AND METHODS OF USE <130> C1-A1412P <150> JP 2014-257647 <151> 2014-12-19 <160> 150 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 1 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser 1 5 10 15 Leu Ala Val Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Ser Ser Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Cys Ile Tyr Thr Gly Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu 65 70 75 80 Gln Met Thr Ser Leu Thr Val Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Ser Asp Gly Gly Tyr Val Thr Pro Thr His Ala Met Tyr Leu Trp Gly 100 105 110 Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 2 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Ile Asp Phe Ser Asn Phe Tyr 20 25 30 Tyr Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Asp Leu Ile 35 40 45 Ala Cys Ile Tyr Thr Val Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala 50 55 60 Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu 65 70 75 80 Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Leu His Ala Gly Ile Thr Asn Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 3 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 3 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser 1 5 10 15 Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ala Ala Gly Leu Asp Phe Ser Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Cys Ile Tyr Ala Gly Ser Ser Gly Ile Ile Tyr Tyr Ala Asn Trp 50 55 60 Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Pro Ser Ser Thr Thr Val Thr 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Thr Tyr Pro Thr Tyr Gly Asp Gly Gly His Ala Phe Asn Leu Trp 100 105 110 Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 4 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 4 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Tyr 20 25 30 Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Met Ile Tyr Gly Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met 65 70 75 80 Thr Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gln 85 90 95 Ile Tyr Ser Gly Asp Asn Asn Asp Asn Phe Trp Gly Pro Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 5 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 5 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu 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Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Val Gly 85 90 95 Ala Gly Asn Ile Phe Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 7 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 7 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Ala 20 25 30 Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Thr Ile Asp Thr Gly Asp Asn Ser Phe Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr 65 70 75 80 Ser Pro Thr Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asn Asp 85 90 95 Gly Ser Val Tyr Asn Leu Phe Asn Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 8 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr 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Leu Phe Asn Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 10 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 10 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ser His Ser Ser 20 25 30 Tyr Tyr Val Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Gly Ala Ile Tyr Thr Gly Ser Gly Ala Thr Tyr Lys Ala Ser Trp 50 55 60 Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Ser Asp Gly Gly Tyr Asp Tyr Pro Thr His Ala Met His Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 11 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 11 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile 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Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 24 Gln Glu Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Glu Gly 1 5 10 15 Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Gly 20 25 30 Asn Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Ala Cys Ile Tyr Gly Gly Ser Val Gly Gly Thr Asp Tyr Ala Ser 50 55 60 Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val 65 70 75 80 Thr Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe 85 90 95 Cys Ala Arg Met Glu Asp Gly Tyr Gly Tyr Gly Tyr Asp Thr Tyr Phe 100 105 110 Lys Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 25 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 25 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Ser Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp 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artificially synthesized sequence <400> 27 Asp Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys 65 70 75 80 Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Tyr Gly Phe Ser 85 90 95 Tyr Gly Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 28 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 28 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Thr Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr 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sequence <400> 55 Cys Ile Tyr Thr Gly Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys 1 5 10 15 Gly <210> 56 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 56 Cys Ile Tyr Thr Val Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys 1 5 10 15 Gly <210> 57 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 57 Cys Ile Tyr Ala Gly Ser Ser Gly Ile Ile Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala 1 5 10 15 Lys Gly <210> 58 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 58 Met Ile Tyr Gly Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 59 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 59 Met Ile Tyr Gly Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 60 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 60 Ile Ile Ser Phe Gly Gly Asp Ala Tyr 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<220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 72 Gly Ser Gly Leu 1 <210> 73 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 73 Asn Asp Gly Ser Val Tyr Asn Leu Phe Asn Leu 1 5 10 <210> 74 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 74 Asp Gly Gly Tyr Asp Tyr Pro Thr His Ala Met His Tyr 1 5 10 <210> 75 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 75 Gln Ala Ser Gln Asn Ile Gly Ser Asp Leu Ala 1 5 10 <210> 76 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 76 Gln Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Ser Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 77 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 77 Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Ser Ser Asp Tyr Leu Ser 1 5 10 <210> 78 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 78 Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Asn Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 79 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 79 Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Asn Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 80 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 80 Gln Ala Ser Glu Ser Ile Tyr Ser Ala Leu Ala 1 5 10 <210> 81 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 81 Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Ala Leu Ser 1 5 10 <210> 82 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 82 Gln Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Ser Leu Leu Ala 1 5 10 <210> 83 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 83 Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Ala Leu Ser 1 5 10 <210> 84 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 84 Gln 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sequence <400> 91 Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser 1 5 <210> 92 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 92 His Thr Ser Asp Leu Ala Ser 1 5 <210> 93 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 93 Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser 1 5 <210> 94 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 94 Gly Ala Ser Lys Thr His Ser 1 5 <210> 95 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 95 Gln Cys Thr Phe Val Gly Ser Ser Tyr Gly Asn Ala 1 5 10 <210> 96 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 96 Leu Gln Gly Tyr Ser Tyr Ser Asn Val Asp Asp Ala 1 5 10 <210> 97 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 97 Gln Gly Thr Tyr Tyr Ser Ser Gly Trp Tyr Phe Ala 1 5 10 <210> 98 <211> 12 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<210> 104 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 104 Gln Ser Thr Lys Val Gly Ser Ser Tyr Gly Asn His 1 5 10 <210> 105 <211> 1680 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 105 Met Gly Leu Trp Gly Ile Leu Cys Leu Leu Ile Phe Leu Asp Lys Thr 1 5 10 15 Trp Gly Gln Glu Gln Thr Tyr Val Ile Ser Ala Pro Lys Ile Leu Arg 20 25 30 Val Gly Ser Ser Glu Asn Val Val Ile Gln Val His Gly Tyr Thr Glu 35 40 45 Ala Phe Asp Ala Thr Leu Ser Leu Lys Ser Tyr Pro Asp Lys Lys Val 50 55 60 Thr Phe Ser Ser Gly Tyr Val Asn Leu Ser Pro Glu Asn Lys Phe Gln 65 70 75 80 Asn Ala Ala Leu Leu Thr Leu Gln Pro Asn Gln Val Pro Arg Glu Glu 85 90 95 Ser Pro Val Ser His Val Tyr Leu Glu Val Val Ser Lys His Phe Ser 100 105 110 Lys Ser Lys Lys Ile Pro Ile Thr Tyr Asn Asn Gly Ile Leu Phe Ile 115 120 125 His Thr Asp Lys Pro Val Tyr Thr Pro Asp Gln Ser Val Lys Ile Arg 130 135 140 Val Tyr Ser Leu Gly Asp Asp Leu Lys Pro Ala Lys Arg Glu Thr Val 145 150 155 160 Leu Thr Phe Ile Asp 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Lys Ala Glu Trp Ala Lys 1 5 10 15 Gly <210> 119 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 119 Ala Ile Phe Thr Gly Ser Gly Ala Glu Tyr Lys Ala Glu Trp Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 120 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 120 Gly Ile Phe Thr Gly Ser Gly Ala Thr Tyr Lys Ala Glu Trp Ala Lys 1 5 10 15 Gly <210> 121 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 121 Asp Ala Gly Tyr Asp Tyr Pro Thr His Ala Met His Tyr 1 5 10 <210> 122 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 122 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ser Leu Ala 1 5 10 <210> 123 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 123 Gly Ala Ser Glu Thr Glu Ser 1 5 <210> 124 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 124 Gly Ala Ser Thr Thr Gln Ser 1 5 <210> 125 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 125 Gln Asn Thr Lys Val Gly Ser Ser Tyr Gly Asn Thr 1 5 10 <210> 126 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is Met or Val <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa is Cys or Ala <400> 126 Ser Ser Tyr Tyr Xaa Xaa 1 5 <210> 127 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is Cys, Ala or Gly <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa is Tyr or Phe <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa is Thr, Asp or Glu <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa is Tyr, Lys or Gln <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa is Ser, Asp or Glu <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa is Ala or Val <400> 127 Xaa Ile Xaa Thr Gly Ser Gly Ala Xaa Tyr Xaa Ala Xaa Trp Xaa Lys 1 5 10 15 Gly <210> 128 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is Gly or Ala <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is Val, Gln or Asp <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa is Thr or Tyr <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa is Tyr or His <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa is Leu or Tyr <400> 128 Asp Xaa Gly Tyr Xaa Xaa Pro Thr His Ala Met Xaa Xaa 1 5 10 <210> 129 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is Gln or Arg <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is Asn, Gln or Gly <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa is Gly or Ser <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa is Asp, Lys or Ser <400> 129 Xaa Ala Ser Gln Xaa Ile Xaa Ser Xaa Leu Ala 1 5 10 <210> 130 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa is Lys, Glu or Thr <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is Leu or Thr <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa is Ala, His, Glu or Gln <400> 130 Gly Ala Ser Xaa Xaa Xaa Ser 1 5 <210> 131 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is Ser, Cys, Asn or Thr <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa is Phe or Lys <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa is Ala, Thr or His <400> 131 Gln Xaa Thr Xaa Val Gly Ser Ser Tyr Gly Asn Xaa 1 5 10 <210> 132 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 132 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ser His 20 25 30 <210> 133 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 133 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val His 20 25 30 <210> 134 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 134 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val His 20 25 30 <210> 135 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 135 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly 1 5 10 <210> 136 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 136 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 1 5 10 <210> 137 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 137 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr 1 5 10 15 Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Ser 20 25 30 <210> 138 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 138 Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr 1 5 10 15 Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Ser 20 25 30 <210> 139 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 139 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser 20 25 30 <210> 140 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 140 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 141 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 141 Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 142 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 142 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 143 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 143 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 144 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 144 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 145 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 145 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 146 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 146 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 147 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 147 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 148 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 148 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 149 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 149 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly His Ile Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly His Thr Glu Tyr Thr Glu Asn Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Phe Phe Gly Ser Ser Pro Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys 210 215 220 Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala 420 425 430 Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 150 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 150 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gly Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Ala 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Asn Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210

Claims (4)

  1. 동물을 폴리펩타이드에 대해 면역시킴을 포함하는 항-C5 항체의 제조 방법으로, 상기 폴리펩타이드가 C5의 베타 쇄의 MG1-MG2 도메인(서열번호 43)을 포함하는 방법.
  2. 동물을 폴리펩타이드에 대해 면역시킴을 포함하는 항-C5 항체의 제조 방법으로, 상기 폴리펩타이드가 C5의 베타 쇄(서열번호 40)의 33 내지 124번 위치의 아미노산에 상응하는 영역을 포함하는 방법.
  3. 동물을 폴리펩타이드에 대해 면역시킴을 포함하는 항-C5 항체의 제조 방법으로, 상기 폴리펩타이드가 C5의 베타 쇄(서열번호 40)의 아미노산 47-57, 70-76 및 107-110 중에서 선택된 적어도 하나의 단편을 포함하는 방법.
  4. 동물을 폴리펩타이드에 대해 면역시킴을 포함하는 항-C5 항체의 제조 방법으로, 상기 폴리펩타이드가 Glu48, Asp51, His70, His72, Lys109 및 His110 중에서 선택된 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 C5의 베타 쇄(서열번호 40)의 단편을 포함하는 방법.
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