WO2014119969A1 - 보체 관련 질환의 예방 및 치료를 위한 c5 항체 및 방법 - Google Patents

보체 관련 질환의 예방 및 치료를 위한 c5 항체 및 방법 Download PDF

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정준호
김효리
이화경
양원준
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Definitions

  • the present invention relates to antibodies against C5, and to the prophylaxis and treatment of complement-related disorders using such antibodies.
  • the complement system is the first step in innate immunity, which not only plays a role in recognizing and destroying infectious agents most quickly, but also plays an important role in linking innate and acquired immunity through interactions with immune cells. Doing.
  • the complement system is activated through three pathways, the classical pathway, the alternative pathway, and the lectin pathway, followed by the various types of complement proteins.
  • Complement proteins effectively eliminate external infectious agents such as activating the secretion of inflammatory substances, interacting with immune cells to regulate the inflammatory response, and creating substances that can attack infectious agents.
  • Complementary system is complementary and complement regulatory protein because it prevents excessive increase in complement activity by various kinds of complement regulatory proteins, maintains homeostasis and plays a key role in various stages of inflammatory and immune responses. If not properly controlled it is known to cause a variety of diseases.
  • C5 is a single sequence of 1676 amino acids consisting of a signal sequence of 18 residues and an Arg-rich linker sequence (RPRR) located between the mature N-terminal beta chain ( ⁇ -chain) and the C-terminal alpha chain ( ⁇ -chain). It is expressed intracellularly as a pro-C5 peptide.
  • Mature C5 has a molecular weight of about 190 kDa and consists of two polypeptide chains ( ⁇ , 115 kDa and ⁇ , 75 kDa) linked by disulfide bonds.
  • the C5 convertase cleaves C5 between residues 74 and 75 of the alpha chain to release a 74 amino acid C5a peptide, and then a C5b fragment to be incorporated into the membrane attack complex (MAC).
  • MAC membrane attack complex
  • Anaphylatoxin C5a directly activates leukocytes and platelets and acts as a chemotactic factor of neutrophils.
  • C5b forms a membrane attack complex with C6, C7, C8, and C9 in the final stage of complement activity to induce cell hemolysis.
  • autoimmune diseases and complement related diseases When the complement system is overactivated, abnormal immune responses occur and normal cell damage occurs, so the abnormal activity of the complement system is associated with autoimmune diseases and complement related diseases. Hemocytic hemolysis is a complement-related disease caused by genetic defects in which blood cells are not protected from the attack of complement proteins. Intense immune and tissue destruction reactions in rheumatoid arthritis and transplantation are also associated with complement activity. In addition to the immune response due to complement activity, elution of substances such as VEGF occurs due to tissue damage, and neovascularization is formed. It has been reported to lead to degeneration and diabetic retinopathy.
  • composition comprising a complement inhibitor, a method of treating or preventing a complement-related disease, and a use thereof.
  • the present invention relates to complement C5-binding molecules (eg, C5-binding antibodies or antigen-binding fragments thereof), pharmaceutical compositions comprising such molecules, methods of making such molecules and compositions, methods of using these molecules and compositions, and such It provides the use of molecules and compositions.
  • complement C5-binding molecules eg, C5-binding antibodies or antigen-binding fragments thereof
  • pharmaceutical compositions comprising such molecules, methods of making such molecules and compositions, methods of using these molecules and compositions, and such It provides the use of molecules and compositions.
  • the present invention provides an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds a C5 protein.
  • the invention also includes a heavy chain variable region having at least 90%, 95%, 97%, 98% or at least 99% sequence identity to any one selected from SEQ ID NOs: 7, 17, 27, 37, 47 or 57 Nucleic acid comprising a nucleotide sequence encoding a polypeptide is provided.
  • the invention also provides for a nucleotide encoding a polypeptide comprising a light chain variable region having at least 90%, 95%, 97%, 98% or at least 99% sequence identity to SEQ ID NOs: 8, 18, 28, 38, 48 or 58
  • nucleic acids comprising sequences.
  • the present invention also provides a vector and a host cell comprising the nucleic acid.
  • the present invention also provides pharmaceutical compositions comprising one or more C5-binding molecules of the invention (eg, C5 binding antibodies or antigen binding fragments thereof).
  • C5-binding molecules of the invention eg, C5 binding antibodies or antigen binding fragments thereof.
  • the present invention also provides a method of treating or diagnosing a complement related disease using a C5 binding molecule.
  • the present invention also provides a C5 binding molecule; And it provides a kit for diagnosing complement-related diseases comprising a container.
  • the present invention also provides the use of a C5 binding molecule for the manufacture of a medicament for the treatment of complement related diseases.
  • the present invention also provides the use of C5 binding molecules for the treatment of complement related diseases.
  • the present invention provides an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds a C5 protein.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention inhibits complement activation through specific binding to the C5 protein, thereby preventing or treating complement-related diseases.
  • an “antibody” of the invention includes an intact antibody and any antigen binding portion or single chain thereof.
  • Naturally occurring “antibodies” are glycoproteins comprising at least two heavy chains (H) and two light chains (L), interconnected by disulfide bonds.
  • Each heavy chain consists of a heavy chain variable region (VH) and a heavy chain constant region (CH).
  • the heavy chain constant region consists of three domains of CH1, CH2 and CH3.
  • Each light chain consists of a light chain variable region (VL) and a light chain constant region (CL).
  • the light chain constant region consists of one domain CL.
  • the VH and VL regions can be further subdivided into hypervariable regions called complementarity determining regions (CDRs), interspersed with more conserved regions called framework regions (FR).
  • CDRs complementarity determining regions
  • Each VH and VL consists of three CDRs and four FRs, which are arranged in the following order from amino terminus to carboxy terminus: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
  • the variable regions of the heavy and light chains contain binding domains that interact with the antigen.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to the C5 protein of the invention specifically binds to the beta chain ( ⁇ -chain) of C5, more specifically to the MG4 domain of the C5-beta chain. More specifically, based on the amino acid sequence of the beta chain, the sequence of amino acid residues 332 to 398, preferably 332 to 378, more preferably 332 to 364, even more preferably 332 to 348 and / or 350 to 420, preferably 369-409, more preferably 379-398, even more preferably 386-392.
  • a bindable C5 protein wherein the amino acid sequence of human C5 protein is SEQ ID NO: 61, the amino acid sequence of the beta chain of human C5 protein is SEQ ID NO: 62 and the amino acid sequence of the MG4 domain of the beta chain of human C5 protein is SEQ ID NO: It is presented at 63.
  • Other species also have cross-reactivity between species such as rabbits, rats, and monkeys.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to a C5 protein of the invention comprises at least 1 ⁇ 10 7 M ⁇ 1 , 1 ⁇ 10 8 M ⁇ 1 , 1 ⁇ 10 9 M ⁇ 1 , 1 ⁇ Has an affinity constant (K A ) of 10 10 M ⁇ 1 , or 1 ⁇ 10 11 M ⁇ 1 .
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention is an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds the same epitope as the antibodies described in Tables 1-6, and at least 90%, 95%, 97%, Antibodies with 98% or at least 99% sequence identity and complement inhibitory activity are also within the scope of the present invention.
  • some modifications apparent in the constant regions of the heavy and light chains are included in the scope of the present invention in the range having the same pseudo complement inhibitory activity.
  • each of these antibodies can bind C5
  • the VH, VL, full length light chain and full length heavy chain sequences are “mixed and matched” to other C5 of the present invention.
  • -Binding antibodies can be generated.
  • the antibody may include an antibody comprising amino acids homologous to the antibodies described in Tables 1 to 6, including the above-mentioned antibodies; Having a heavy chain variable region comprising CDR1, CDR2 and CDR3 sequences, and a light chain variable region comprising CDR1, CDR2 and CDR3 sequences, wherein at least one of these CDR sequences is based on an antibody described herein or a conservative modification thereof
  • An antibody having a specific amino acid sequence and retaining the functional properties of the C5-binding antibody of the invention An antibody that binds to the same epitope as the antibodies described in Tables 1-6; All of the antibodies prepared using antibodies having one or more VH and / or VL sequences set forth herein as starting materials for engineering the modified antibody, and which have some altered properties from the starting antibody.
  • the antibody includes a modification of framework residues in VH and / or VL to improve the properties of the antibody.
  • the antibody may be a fully human antibody that specifically binds to the C 5 protein. It may have more reduced antigenicity when administered to human subjects as compared to chimeric antibodies and the like.
  • Human antibodies include heavy or light chain variable regions or full-length heavy or light chains that are products of or derived from specific germline sequences when the variable region or full-length chain of the antibody is obtained from a system using human germline immunoglobulin genes. Such systems include immunizing transgenic mice carrying a human immunoglobulin gene with an antigen of interest, or screening using a library of human immunoglobulin genes displayed on phage.
  • Human antibodies derived from or derived from human germline immunoglobulin sequences are identified by comparing the amino acid sequence of a human antibody to the amino acid sequence of a human germline immunoglobulin and selecting a human germline immunoglobulin sequence that is closest to the sequence of the human antibody. Can be.
  • the antibody may be a bispecific or multispecific antibody.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof of the invention may be a bispecific molecule that binds to two or more different binding sites or target molecules.
  • an antibody of the invention is a monoclonal antibody that specifically binds a C5 protein.
  • an antibody of the invention can be a human or humanized monoclonal antibody or chimeric antibody that specifically binds a C5 protein, and the antibody of the invention comprises a human heavy chain constant region and a human light chain constant region.
  • the antibody of the present invention may be a single chain antibody, the antibody of the present invention may be a Fab fragment, may be a single-chain variable fragment (scFv), may be IgG isotype.
  • Preferred IgG isotypes are IgG2, IgG4 and / or IgG2 / 4.
  • the IgG isotype of the invention is IgG2 / 4.
  • the IgG2 / 4 hybrid constant region may be a fusion of the CH1 and hinge regions of IgG2 and the CH2 and CH3 regions of IgG4.
  • Monoclonal antibodies can be produced by conventional monoclonal antibody methods, and the synthesized antibody genes can be expressed and purified by inserting into an antibody expression vector, preferably pcDNA, pCI, pCMV, pCEP4 and the like.
  • viral or carcinogenic transformation of B lymphocytes can be used and can be prepared based on the sequence of murine monoclonal antibodies prepared using the murine system.
  • standard molecular biology techniques can be used to obtain DNAs encoding heavy and light chain immunoglobulins from murine hybridomas and to contain non-murine immunoglobulin sequences.
  • human monoclonal antibodies against C5 can be prepared using transgenic or transchromosomal mice bearing portions of the human immune system that are not the mouse immune system.
  • the invention provides an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising a framework in which an amino acid is substituted with an antibody framework from each human VH or VL germline sequence.
  • an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to a C5 protein of the invention is SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 11, 12, 21, 22, 31, 32, 41, At least one complementarity determining (CDR) sequence having at least 95% sequence identity to 42, 51 or 52.
  • CDR complementarity determining
  • an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to a C5 protein of the invention may comprise SEQ ID NO: 1, 2, 3, 11, 12, 21, 22, 31, 32, 41, 42, 51 or 52; One or more heavy chain complementarity determining sequences that are identical.
  • an antibody or antigen binding fragment thereof that specifically binds a C5 protein of the invention comprises one or more light chain complementarity determining sequences identical to SEQ ID NO: 4, 5 or 6.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to a C5 protein of the invention comprises any one heavy chain CDR1, SEQ ID NO: 2, 12 selected from SEQ ID NO: 1, 11, 21, 31, 41 or 51 , Heavy chain CDR2 selected from 22, 32, 42 or 52, and / or any heavy chain CDR3 selected from SEQ ID NO: 3, 13, 23, 33, 43 or 53.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to the C5 protein of the invention comprises light chain CDR1 of SEQ ID NO: 4, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 5, and / or CDR3 of SEQ ID NO: 6.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to a C5 protein of the invention comprises any of the heavy chain variable regions selected from SEQ ID NOs: 7, 17, 27, 37, 47 or 57, or A heavy chain variable region having at least 90%, 95%, 97% or at least 99% sequence identity to any of the heavy chain variable regions selected from Nos. 7, 17, 27, 37, 47 or 57.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds a C5 protein of the present invention comprises a light chain variable region of SEQ ID NO: 8, or at least 90%, 95%, 97 in a light chain variable region of SEQ ID NO: 8 Light chain variable regions having% or at least 99% sequence identity.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds a C5 protein of the invention comprises any heavy chain selected from SEQ ID NO: 9, 19, 29, 39, 49 or 59, or SEQ ID NO: 9, A heavy chain variable region having at least 90%, 95%, 97% or at least 99% sequence identity to any heavy chain selected from 19, 29, 39, 49 or 59.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to a C5 protein of the invention comprises a light chain of SEQ ID NO: 10, or at least 90%, 95%, 97% or at least 99 to the light chain of SEQ ID NO: 10 Light chains with% sequence identity.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to the C5 protein of the invention comprises binding to an epitope in the beta chain of the C5 protein of SEQ ID NO: 62.
  • the invention also includes a heavy chain variable region having at least 90%, 95%, 97%, 98% or at least 99% sequence identity to any one selected from SEQ ID NOs: 7, 17, 27, 37, 47 or 57 Nucleic acid comprising a nucleotide sequence encoding a polypeptide is provided.
  • a nucleic acid comprising a nucleotide sequence encoding a polypeptide comprising a heavy chain variable region of the invention comprises the sequence of Table 7 below, or at least 90%, 95%, 97%, 98% or Have at least 99% sequence identity.
  • nucleic acids comprising a nucleotide sequence encoding a polypeptide comprising a light chain variable region having at least 90%, 95%, 97%, 98% or at least 99% sequence identity in SEQ ID NO: 8.
  • a nucleic acid comprising a nucleotide sequence encoding a polypeptide comprising a light chain variable region of the invention comprises the sequence of Table 8 below, or at least 90%, 95%, 97%, 98% or at least 99% Has sequence identity of
  • the present invention also provides a vector and a host cell comprising the nucleic acid.
  • the invention provides a host cell comprising (1) a recombinant DNA fragment encoding a heavy chain of an antibody of the invention, and (2) a second recombinant DNA fragment encoding a light chain of an antibody of the invention.
  • the invention provides host cells comprising recombinant DNA fragments encoding each of the heavy and light chains of an antibody of the invention.
  • the antibody or antigen binding fragment thereof is a human monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof.
  • Various expression vectors can be used to express polynucleotides encoding C5-binding antibodies, chains or binding fragments, and both viral-based and non-viral expression vectors can be used to generate antibodies in mammalian host cells.
  • Vectors such as pcDNA, pCI, pCMV, pCEP4 and host cells such as HEK293, CHO and CHO-DG44 can be used.
  • Host cells bearing and expressing C5-binding antibodies can be prokaryotic or eukaryotic.
  • E. Coli preferably E. coli ER2738. HB2151, BL21 and the like, and are prokaryotic hosts useful for cloning and expressing polynucleotides of the invention.
  • Other microbial hosts suitable for use include Bacillus, for example Bacillus subtilis, and other enteric bacteria, for example Salmonella, Serratia and various Pseudomonas species.
  • Other microorganisms such as yeast can be used to express the C5-binding polypeptides of the invention, and insect cells in combination with baculovirus vectors can also be used.
  • mammalian host cells are used to express and prepare C5-binding polypeptides of the invention.
  • it may be a hybridoma cell line expressing an endogenous immunoglobulin gene or a mammalian cell line carrying an exogenous expression vector.
  • any animal or human cell can secrete numerous immunoglobulins, including, for example, CHO cell lines, Cos cell lines, HeLa cells, myeloma cell lines, HEK cell lines, transformed B-cells and hybridomas.
  • Suitable host cell lines can be used, preferably HEK293, CHO, CHO-DG44.
  • the present invention also provides pharmaceutical compositions comprising one or more C5-binding molecules of the invention (eg, C5 binding antibodies or antigen binding fragments thereof).
  • C5-binding molecules of the invention eg, C5 binding antibodies or antigen binding fragments thereof.
  • Complement-related diseases include all diseases and pathological conditions in which the development of the disease is associated with abnormalities in the activation of the complement system, eg, complement deficiency.
  • Inflammatory and autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis (RA), degenerative arthritis, acute respiratory distress syndrome (ARDS), remote tissue damage after ischemia and reperfusion, complement activation during cardiopulmonary bypass, dermatitis, pemphigus, lupus erythematosus Nephritis, glomerulonephritis, glomerulonephritis, cardiopulmonary bypass, heart attack-induced coronary endothelial dysfunction, type II mesenchymal glomerulonephritis, acute renal failure, antiphospholipid syndrome, macular degeneration, endophthalmitis, neovascular disease, allogeneic Transplantation, acute rejection, hemodialysis, chronic obstructive pulmonary respiratory distress syndrome (COPD), asthma, nocturnal hemoglobuloglobuloglobuloglobulo
  • composition may further contain one or more other agents suitable for treating or preventing complement related diseases.
  • Pharmaceutical carriers enhance or stabilize the composition or facilitate the preparation of the composition.
  • Pharmaceutically acceptable carriers include physiologically compatible solvents, dispersion media, coatings, anti-bacterial and anti-fungal agents, isotonic and absorption delaying agents, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered by various methods known in the art.
  • the route and / or mode of administration depends on the desired result. It is preferred that the administration is intravenous, intramuscular, intraperitoneal or subcutaneous or in close proximity to the target site.
  • antibodies of the invention are formulated for intravitreal administration into the eye.
  • the active compounds ie antibodies, bispecific and multispecific molecules, may be coated with materials that protect the compound from the action of acids and other natural conditions that may inactivate the compound.
  • the composition must be sterile and fluid. Proper fluidity can be maintained, for example, by the use of coatings such as lecithin, by the maintenance of the required particle size in the case of dispersions, and by the use of surfactants. In many cases, it is desirable to include isotonic agents, for example, sugars, polyalcohols such as mannitol or sorbitol, and sodium chloride in the composition. Prolonged absorption of the injectable compositions can be induced by including in the composition an agent that delays absorption, such as aluminum monostearate or gelatin.
  • compositions of the present invention can be prepared according to methods known in the art and commonly practiced. See, eg, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20th ed., 2000 and Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
  • the pharmaceutical composition is preferably prepared under GMP conditions.
  • therapeutically effective or potent doses of C5-binding antibodies are used in the pharmaceutical compositions of the present invention.
  • C5-binding antibodies are formulated in pharmaceutically acceptable dosage forms by conventional methods known to those skilled in the art. Dosage regimens are adjusted to provide the optimum desired response (eg, a therapeutic response).
  • the actual dosage level of the active ingredient in the pharmaceutical composition of the present invention may be varied such that an amount of active ingredient that is effective for achieving the desired therapeutic response for a particular patient, composition, and mode of administration, is not toxic to the patient.
  • the dosage level chosen is dependent on the various pharmacodynamic factors, e.g., the activity of the particular composition of the invention used, or esters, salts or amides thereof, the route of administration, the time of administration, the rate of release of the specific compound used, the duration of treatment, the specific Other drugs, compounds and / or substances used in combination with the composition, the age, sex, weight, condition, general health and previous medical history and other factors of the patient being treated.
  • the dosage range is from about 0.0001 to 100 mg, more generally 0.01 to 15 mg per kg body weight of the host.
  • Exemplary therapies involve systemic administration once every two weeks, or once per month, or once every three to six months.
  • the dosage ranges from about 0.0001 to about 10 mg.
  • Exemplary therapies involve systemic administration once every two weeks, or once per month, or once every three to six months.
  • the dosage is adjusted to achieve a plasma antibody concentration of 1 to 1000 ⁇ g / mL, and in some methods 25 to 500 ⁇ g / mL.
  • the antibody can be administered as a sustained release formulation when less frequent administration is desired. Dosage and frequency vary depending on the half-life of the antibody in the patient. In prophylactic use, relatively low doses are administered at relatively rare intervals over a long period of time.
  • the present invention also provides a method of treating or diagnosing complement related diseases using a C5 binding molecule.
  • Methods of treating complement related diseases using C5 binding molecules of the invention include administration of a therapeutically effective amount of an antibody or antigen binding fragment thereof or a composition comprising the same.
  • therapeutically effective amount refers to an amount of a C5 binding molecule of the invention or a composition comprising the same that is effective for the prevention or treatment of complement related diseases.
  • agents suitable for combination therapy with C5-binding antibodies include agents known in the art that can modulate the activity of the complement component. For example, phosphonate esters, polyanionic materials, sulfonyl fluorides, polynucleotides, fimaric acid, various anti-inflammatory agents, and the like. Combination therapy with one or more therapeutic agents and the like may be additive and may result in synergy.
  • the present invention includes diagnostic assays that determine C5 protein and / or nucleic acid expression and C5 protein function in biological samples (eg, blood, serum, cells, tissues) or from individuals suffering from or at risk of developing a complement related disease. do.
  • Antibodies of the invention can be used for the detection of complement cleavage products, for example, radioimmunoassays, ELISAs and radial diffusion assays.
  • diagnostic assays, prognostic assays, pharmacogenetics, and clinical trial monitoring can be used to prophylactically treat a subject by prognostic (predictive) purposes, and the present invention also relates to a disorder in which the subject is associated with dysregulation of complement pathway activity.
  • Prognostic (or predictive) tests are provided to determine whether the disorder is at risk of developing. For example, mutations in the C5 gene can be assayed in biological samples. By using such assays for prognostic or predictive purposes, one can prophylactically treat an individual prior to the onset of a disorder characterized or related to C5 protein, nucleic acid expression or activity.
  • the present invention also provides a C5 binding molecule; And it provides a kit for diagnosing complement-related diseases comprising a container.
  • the diagnostic kit of the present invention may comprise any one or more of the above-mentioned C5 binding molecules.
  • the container includes a solid carrier, and the C5 binding molecule can be attached to the solid carrier, which solid carrier can be porous or nonporous, planar or nonplanar.
  • the present invention also provides the use of a C5 binding molecule for the manufacture of a medicament for the treatment of complement related diseases.
  • the C5 binding molecule of the present invention for the manufacture of a medicament or a composition comprising the same may be mixed with an acceptable carrier and the like, and may be prepared in a complex formulation with other agents to have a synergistic action of the active ingredients.
  • the present invention also provides the use of C5 binding molecules.
  • C5 binding molecules for the treatment of complement related diseases of the present invention can be used for therapeutic purposes and are used to diagnose C5 protein and / or nucleic acid expression and also C5 protein function from an individual suffering from or at risk of developing a complement related disease. It can be used for.
  • C5 binding molecules of the invention are useful for the diagnosis, prevention and treatment of complement-related diseases.
  • 1 is a diagram showing the absorbance of 40 clones randomly selected after bio-panning using immune libraries of rabbits (A) and chickens (B) according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2 is a view showing the absorbance measurement results for human C5 of the five antibodies selected from the rabbit and chicken immune library and the control antibody Ekulizumab according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3 is a diagram showing the results obtained by securing a large number of clones having binding capacity to C5 from five variant sub-library.
  • Figure 4 is a view showing the result of comparing the binding capacity of the improved affinity clone prepared using the humanized clone HRA-06 clone according to an embodiment of the present invention as a template.
  • FIG. 5 is a diagram showing that the antibody prepared according to an embodiment of the present invention has a high complement-dependent cytotoxicity inhibitory activity in the complement-dependent cytotoxicity assay.
  • FIG. 6 is a diagram showing the high C5a production inhibitory ability of the antibody prepared according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 7 is a diagram showing the cross-sectional cross-reactivity of the monoclonal antibody prepared according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of size exclusion chromatography of antibodies prepared and purified according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 9 is a diagram showing that the antibody binds to the beta chain of C5 according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 10 is a diagram showing that the antibody binds to the MG4 domain of the beta chain of C5 according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 11 is a diagram showing that the antibody specifically binds to the MG4 domain in the variant Fc fusion protein sequentially removed one domain from the C-terminus of the beta chain according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 12 is a diagram showing that the antibody binds to the N-terminal 332-348th amino acid residue of the beta chain as confirmed by immunoblot in a sequential deletion variant of the MG4 domain.
  • Figure 13 is a diagram showing that the antibody binds to the amino acid residues of the 379-398th beta-chain N-terminal as confirmed by the ELISA according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 14 is a diagram showing that the antibody binds to the beta chain N-terminal 386-392 (MG4 domain sequence basis: 55-61 th amino acid sequence) th amino acid residue according to one embodiment of the present invention as confirmed by ELISA.
  • Single-chain Fv libraries were prepared using the primers of Table 9 (rabbit) and Table 10 (chicken) specific for the heavy and light chain variable regions of immunoglobulins.
  • the 10 (9 ⁇ V ⁇ and 1 ⁇ V ⁇ ) a combination of one or a combination of on was used for the encoding sequence amplification, for the chicken V ⁇ and V H of about scFv libraries VH of four primers and V L rabbit was used.
  • cDNA was mixed with 60 pmol of each primer, 10 ⁇ l of 10 X reaction buffer, 8 ⁇ l of 2.5 mM dNTP, 0.5 ⁇ l of Taq DNA polymerase and water to a final volume of 100 ul. It was. PCR reactions were carried out under the following conditions: 30 cycles 15 seconds 94 ° C., 30 seconds 56 ° C., and 90 seconds 72 ° C., followed by a final extension of 10 minutes 72 ° C. Amplified sections of about 350 bp were purified with QIAEX II Gel Extraction Kit (QIAGEN, Valencia, CA, USA) after loading and running on 1.5% agarose gel.
  • QIAEX II Gel Extraction Kit QIAGEN, Valencia, CA, USA
  • each PCR reaction contained 100 ng of purified V L and V H product, 60 pmol of each primer, 10 ⁇ l of 10 ⁇ reaction buffer, 8 ⁇ l of 2.5 mM dNTP and 0.5 ⁇ l of Taq DNA polymerase. performed with a mixture of ul. PCR reactions were carried out under the following conditions: 20 cycles 15 seconds 94 ° C., 30 seconds 56 ° C., and 2 minutes 72 ° C., followed by a final extension of 10 minutes 72 ° C. An about 700 bp scFV fragment was purified with QIAEX II Gel Extraction Kit (QIAGEN).
  • scFv fragments and pComb3XSS vectors were cleaved at 50 ° C. for 8 hours by Sfi I restriction enzymes (Roche Molecular Systems, Pleasanton, CA, USA). 700 ng of Sfi I-cleaved scFv was ligated with 1400 ng of pComb3X vector using T4 DNA ligase by incubation of the reaction at 16 ° C. for 12 hours, followed by ethanol precipitation. The ligated library was transformed by electoporation with E. coli ER2738. The cells were mixed in 3 ml Super Broth (SB) medium at 37 ° C.
  • SB Super Broth
  • Input and output phage titers were determined by plating phage infected bacteria on LB plates containing 50 ug / ml carbenicillin and incubating at 37 ° C. The next day phage was precipitated by addition of PEG-8000 and NaCl as in Example 1.
  • ELISA was performed using phage diplaying scFv on human C5 to analyze clones selected from biopanning.
  • 96-well plates were coated overnight at 4 ° C. with 100 ng of human C5 and blocked with PBS containing 3% BSA.
  • Each phage culture was mixed with the same amount of 6% BSA containing PBS and then added to human C5-coated 96-well plates and incubated at 37 ° C. for 2 hours. After incubation and washing was performed, the cells were incubated with HRP-bound anti-M13 antibody (Amersham, USA).
  • a of FIG. 1 represents an immune library of rabbits
  • B of FIG. 1 represents an immune library of chickens.
  • ELISA of anti-C5 scFv-Fc fusion protein against C5 was performed on five selected scFv clones to compare the binding ability with the control antibody, eculizumab.
  • the amount of antibody bound to C5 was determined using HRP-bound anti-human IgG, and the results are shown in FIG. 2.
  • CDRs Six antigen complementarity determining regions (CDRs) that make up the scFv antibody segment having binding and activation inhibitory activity against human complement C5 (light chain antigen complementarity determining regions [CDRL 1-3], heavy chain antigen complementarity determining regions 1-). 3 [CDRH1-3] portion was inserted between the eight frameworks of human germline kappa1 / IGHV3-23 / (FRL1-4, FRH1-4) to synthesize humanized anti-complement C5 scFv gene (HRA- 06, Genscript, Piscataway, NJ, USA).
  • the HRA-06 scFv gene was used as template DNA. Random codons were introduced into the five CDRs except for CDRH3 by PCR. Amplified scFv fragments were purified by QIAEX II Gel Extraction Kit (QIAGEN). ScFV and pComb3XSS vectors were cleaved with SfiI restriction enzyme (Roche Molecular Systems) and ethanol precipitated after ligation. The ligated library was transfected into E.
  • Example 3 coli ER2738 as in Example 1 and a phage library was prepared. Antigens were selected in the same manner as in Example 2 based on the prepared phage library. Finally, binding to C5 was confirmed by phage ELISA in the same manner as in Example 3.
  • eculizumab synthesized heavy and light chain genes based on the antibody sequences specified in the examination report of eculizumab (product name Soliris), which is registered with the Japanese Medical Device Management Agency (PMDA).
  • Transfection was performed on overexpressed recombinant protein.
  • 2 ug of mammalian expression vector and 4 ug of polyethylenimine / ml (PEI, Polysciences, Warrington, PA, USA) per ml of culture volume were mixed in 150 mM sodium chloride, equivalent to 1/10 of the culture volume. It was left for a minute.
  • HEK 293F cells (2 ⁇ 10 6 cells / ml) were added to the mixture and FreeStyle TM 293 expression culture containing 100 U / ml penicillin (Invitrogen) and 100 U / ml streptomycin (Invitrogen) for 5 days, 37 ° C., 7% CO 2 And incubated under agitation conditions of 135 rpm.
  • Supernatants of cell exclusion were collected and subjected to Protein A affinity gel chromatography for purification of IgG and Fc fusion proteins.
  • An enzyme-linked immunosorbent assay was performed to measure complement C5 binding ability of the antibody produced by the method of Example 5. The reaction was carried out by diluting and adding the antibody to a 96-well plate coated with C5. Absorbance was measured in the same manner as in Example 3 by using a horseradish peroxidase-labeled anti-human IgG antibody as a secondary antibody and coloring with ABTS (2,2'-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid] -diammonium salt) It was.
  • ABTS 2,2'-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid] -diammonium salt
  • the types of monoclonal antibodies used in the experiment were six affinity matured humanized anti-C5 antibodies (HRA-06-H2-1, HRA-06-H2-7, HRA-06-H2-18, HRA-06-H2-). 24, HRA-06-H1-9-H2-7, HRA-06-H1-9-H2-24) and the positive control antibody Eculizumab, the negative control antibody Palivizumab, and the experimental results are shown in FIG. .
  • RaJi a CD-20 expressing human Burkitt's lymphoma cell line
  • RPMI 1640 10% FBS (Invitrogen), 100 U / ml penicillin (Invitrogen) and 100 U / ml streptomycin (Invitrogen).
  • Target cells were mixed at a concentration of 1 ⁇ 10 6 cells / ml after washing.
  • Rituximab an anti-CD20 human IgG
  • CDC solution at a concentration of 3 ug / ml.
  • Equal volumes of target cells and sensitive antibodies were mixed to make a volume of 100 ul / well in 96-well plates and left for 5 minutes at room temperature.
  • the assay was started by adding human complement serum, with a final volume of 150 ul per well and final concentration of 4% serum. After 2 hours incubation, 15 ul Tetrazolium salt (WST-1, Takara Bio, Japan) was added and the plate was incubated for 2 more hours. Living cells were measured at 450 nm OD. The effect of anti-C5 antibodies was assessed by serum and pretreatment at 37 ° C. for 30 minutes prior to addition of the target cell and sensitive antibody mixtures. Palibizumab at the same concentration was used as an IgG control. The percentage of cell viability was calculated by the following formula.
  • the affinity matured humanized anti-C5 antibody prepared according to the present invention exhibited CDC inhibitory activity, and all of the antibodies showed high cell viability compared to eculizumab.
  • Immunoblot was performed to confirm that the monoclonal antibody binds to complement C5 of other species. Dilutions of human C5 protein and serum of human (Sigma), rhesus monkey, BALB / c mice, Wistar rats, and NZW rabbits were SDS-PAGE, respectively, and the separated proteins were transferred to nitrocellulose membranes. Immunoblot was performed using the anti-complement C5 antibody HRA-06-H2-1 prepared according to the present invention.
  • anti-complement C5 antibody showed binding to C5 of human (Sigma), rhesus monkey, Wistar rat, NZW rabbit.
  • Purified antibodies were subjected to size-exclusion chromatography (SEC) analysis using a Waters 2489 system (Waters Corporation, Milford, MA, USA) and a Zenix-C 300 column (Sepax Technologies, Inc., Newark, DE, USA). .
  • the mobile phase composition 150 mM sodium phosphate, pH 7.0
  • flow rate 1.0 mL / min
  • concentration of protein was determined by monitoring the absorbance of the column eluate at 280 nm.
  • the concentration of fractions was calculated by dividing each peak area by the sum of the peak areas.
  • FIG. 8A to 8D respectively show A) HRA-06-H2-1, B) HRA-06-H2-7, C) HRA-06-H2-18, D) HRA-06-H2-24, E) HRA-06-H1-9-H2-7 and F) HRA-06-H1-9-H2-24.
  • FIG. 9A confirms the binding using eculizumab as an antibody
  • FIG. 9B shows the result of using HRA-06-H2-1 according to the present invention as an antibody.
  • eculizumab binds to C5 (complementary protein) and binds to alpha chains in 2 lanes of Reducing.
  • the HRA-06-H2-1 antibody according to the present invention was bound to C5 (complete complement protein), it was confirmed that the binding to beta chain in 2 lanes that performed Reducing.
  • Sequential deletion variants of the beta chain and the six domains that make up the beta chain of C5 were amplified from cDNA. Primers were designed to be added to the SfiI restriction sites at the 5 'and 3' ends (Table 11). Sequential elimination variants of the beta chains were amplified by primer combinations as described in Table 12. The amplified PCR fragments were cleaved with SfiI and cloned into pCEP4 vectors modified to contain the hinge site and the CH2-CH3 domain of human IgG1 at the 3 ′ portion of the cloning site. These clones were transfected as described in Example 5 above and the Fc fusion protein was purified.
  • FIG. 10A shows a schematic diagram of the structure of the C5 beta chain and the prepared Fc fusion protein
  • FIG. 10B shows the immunoblot result.
  • the HRA-06-H2-1 antibody prepared according to the present invention binds to an Fc fusion protein having a MG4 domain.
  • FIG. 11A shows a schematic diagram of the structure of the C5 beta chain and the prepared Fc fusion protein
  • FIG. 11B shows the immunoblot result.
  • the HRA-06-H2-1 antibody binds only to the Fc fusion protein containing the MG4 domain.
  • FIG. 12A shows the MG4 domain and the Fc fusion protein prepared by sequential removal
  • FIG. 12B shows the results of immunoblot with HRA-06-H2-1 antibody.
  • FIG. 12 it was confirmed that no binding was performed to the variants in which the 332-348th sequence was removed from the N-terminus of the beta chain, and thus, the 332-348th amino acid residue in the MG4 domain of the beta chain. It was found that the sequence was a sequence with high antibody binding potential.
  • Human / mouse hybrid MG4 domain of C5 beta chain was prepared by overlap extension PCR. Primers were designed to add SfiI restriction sites at both the 5 'and 3' ends (Table 14). PCR fragments were cleaved with SfiI and cloned into SfiI cleaved pComb3X vector. These clones were transfected with E. coli ER 2738. Single colonies from each human / mouse MG4 hybrid were incubated at 600 nm until absorbance reached 1.0. Phage infection was performed by the addition of VCSM13 helper phage (10 11 pfu / ml) and incubated at 37 ° C. for 2 hours. Kanamycin (25 ug / ml) was added and the incubation was overnight at 37 ° C. with constant stirring. The bacteria were removed by centrifugation at 3000 g for 15 minutes.
  • Phage ELISA was performed as follows. HRA-06-H2-7, anti-C5 IgG2 / 4, was diluted in 0.1 M sodium bicarbonate buffer (pH 8.6) and 100 ng of the antibody was coated in 96-well plates overnight at 4 ° C. Each well was blocked by the addition of 5% skim milk in TBS containing 0.05% of 100 ul Tween 20 and incubated at 37 ° C. for 1 hour. Phage were diluted 2-fold in 6% BSA / PBS and diluted 50 ul phages were added to each well and incubated at 37 ° C. for 2 hours.
  • Plates were washed, 50 ul of diluted HRP-bound anti-M13 antibody (1: 5000) was added and incubated at 37 ° C. for 1 hour. After washing the plate a 50 ul ABTS substrate solution was added to each well and the absorbance was measured at 405 nm.
  • FIG. 13A shows the human / mouse hybrid MG4 domain
  • FIG. 13B shows the ELISA results.
  • the HRA-06-H2-7 antibody bound when the amino acid residue sequence of 379-398 based on the beta chain sequence was a human sequence, showing the possibility of binding to that portion of the antibody. .
  • FIG. 14 is a result of confirming the sequence binding site in more detail.
  • FIG. 14A shows the human / mouse hybrid MG4 domain
  • FIG. 14B shows the ELISA results.
  • HRA-06-H2-7 antibody binds when the amino acid residue sequence of 386-392 (based on MG4 domain sequence: 55-61th amino acid sequence) based on the beta chain sequence is a human sequence This shows the possibility of binding to that part of the antibody.

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Abstract

본 발명은 C5에 대한 항체, 및 항체를 사용한 보체-관련 장애의 예방 및 치료방법을 제공한다. 본 발명의 C5에 대한 항체는 보체 활성화를 억제함으로써 보체-관련 장애의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

보체 관련 질환의 예방 및 치료를 위한 C5 항체 및 방법
본 발명은 C5에 대한 항체, 및 이러한 항체를 사용한 보체-관련 장애의 예방 및 치료에 관한 것이다.
보체계 (complement system) 는 선천성 면역의 첫 번째 단계를 담당하여, 감염원을 가장 빨리 인식하고 파괴하는 역할을 할 뿐만 아니라, 면역 세포들과의 상호작용을 통해 선천성 면역과 후천성 면역을 이어주는 중요한 역할을 담당하고 있다. 보체계는 고전경로, 대체경로, 렉틴경로라 불리는 세 가지 경로를 통하여 활성화되고, 뒤 이어 다양한 종류의 보체 단백질이 활성화된다. 보체 단백질들은 염증 물질의 분비를 활성화 시키고, 면역 세포들과 상호 작용을 하여 염증 반응을 조절하며, 감염원을 공격할 수 있는 물질을 만들어내는 등 외부 감염원을 효과적으로 제거한다. 보체계는 여러 종류의 보체 조절 단백질에 의하여 보체 활성이 지나치게 증가되는 것이 억제되고, 항상성을 유지하고 있으며, 염증반응과 면역반응의 다양한 단계에 걸쳐 핵심적인 역할을 담당하고 있기 때문에 보체 단백질과 보체 조절 단백질이 적절하게 조절되지 않을 경우 다양한 질환을 야기하는 것으로 알려져 있다.
고전경로, 대체경로, 렉틴경로에 의하여 보체계가 활성화되면 C5를 C5a 와 C5b 로 분해하는 C5 convertase 가 형성된다.
C5는 18개 잔기의 신호 서열 및 성숙 N-말단 베타쇄(β-chain)와 C-말단 알파쇄(α-chain) 사이에 위치하는 Arg-풍부 링커 서열 (RPRR)로 이루어진 1676개 아미노산의 단일 프로(pro)-C5 펩티드로서 세포내 발현된다. 성숙 C5는 약 190 kDa의 분자량을 가지며, 다이설피드 결합으로 연결된 2개의 폴리펩티드 쇄 (α, 115 kDa 및 β, 75 kDa)로 이루어진다. C5 전환효소는 C5를 알파쇄의 잔기 74 및 75 사이에서 절단하여 74개 아미노산의 C5a 펩티드, 및 이후에 막 공격 복합체 (MAC)로 혼입될 C5b 단편을 방출한다.
아나필라톡신인 C5a 는 백혈구와 혈소판을 직접적으로 활성화시키고, 호중구의 화학주성인자로 작용한다. C5b는 보체활성의 최종단계에서 C6, C7, C8, C9 과 함께 막 공격 복합체를 형성하여 세포용혈을 유발한다.
보체계가 과활성화 되면 비정상적인 면역반응이 나타나고, 정상세포의 손상이 발생하기 때문에 보체계의 비정상적인 활성은 자가면역질환, 보체관련질환 등과 연관되어있다. 혈구용혈질환은 유전적 결함에 의하여 혈구세포가 보체단백질의 공격으로부터 보호받지 못하여 발병하는 보체 관련 질환이다. 류마티스 관절염, 이식 등에서 나타나는 격렬한 면역반응과 조직파괴반응 또한 보체활성과 연관되어있고, 보체활성에 의하여 면역반응 뿐 아니라 조직손상에 의하여 VEGF와 같은 물질의 용출이 발생하여 신생혈관이 형성되고, 노인 황반 변성, 당뇨망막병증으로 이어지는 것으로 보고되어있다.
즉, 보체 시스템이 건강을 유지하는데 중요한 역할을 가지지만, 그것은 잠정적으로 질병을 일으키거나 질병에 기여하는 것이다. 따라서, 보체-관련 질환의 치료와 진단용으로 사용하기 위한 보체 시스템의 신규한 항체 등을 개발하는 것이 바람직하다.
보체 억제제를 포함하는 조성물, 보체-관련 질환을 치료 또는 예방하는 방법, 및 이의 용도를 제공하고자 한다.
본 발명은 보체 C5-결합 분자 (예를 들어, C5-결합 항체 또는 이의 항원 결합 단편), 이러한 분자를 포함하는 약학적 조성물, 이러한 분자 및 조성물의 제조 방법, 이러한 분자 및 조성물의 사용 방법 및 이러한 분자 및 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명은 C5 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 7, 17, 27, 37, 47 또는 57로부터 선택되는 어느 하나에 적어도 90％, 95％, 97％, 98％ 또는 적어도 99％의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 8, 18, 28, 38, 48 또는 58에 적어도 90％, 95％, 97％, 98％ 또는 적어도 99％의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주 세포를 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명의 1종 이상의 C5-결합 분자 (예를 들어, C5 결합 항체 또는 이의 항원 결합 단편)를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 C5 결합 분자를 사용한 보체 관련 질환의 치료 또는 진단 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 C5 결합 분자; 및 용기를 포함하는 보체 관련 질환의 진단용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 보체 관련 질환 치료용 약제의 제조를 위한 C5 결합 분자의 용도를 제공한다.
또한 본 발명은 보체 관련 질환 치료를 위한 C5 결합 분자의 용도를 제공한다.
본 발명은 C5 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 본원 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 C5 단백질에 특이적 결합을 통해서 보체 활성화를 억제함으로써, 보체 관련 질환의 예방 또는 치료가 가능하다.
본 발명의 “항체”는 온전한 항체 및 이의 임의의 항원 결합 부분 또는 단일쇄를 포함한다. 천연 발생 "항체"는 다이설피드 결합에 의해 상호 연결된, 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 당단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 중쇄 불변 영역(CH)으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3의 3개의 도메인으로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (VL) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인 CL로 이루어진다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)이라 불리는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는, 상보성 결정 영역 (CDR)이라 불리는 초가변 영역으로 보다 세분화될 수 있다. 각 VH 및 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어지며, 이것들은 아미노 말단에서부터 카르복시 말단까지 다음의 순서로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호 작용하는 결합 도메인을 함유한다.
일부 실시 양태에서, 본 발명의 C5 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 C5의 베타쇄(β-chain)에 특이적으로 결합하며, 보다 구체적으로 C5-베타 쇄의 MG4 도메인에 결합하며, 보다 더 구체적으로, 베타쇄의 아미노산 서열을 기준으로 332 내지 398, 바람직하게 332 내지 378, 보다 바람직하게 332 내지 364, 보다 더 바람직하게 332 내지 348의 아미노산 잔기의 서열 및/또는 350 내지 420, 바람직하게 369 내지 409, 보다 바람직하게 379 내지 398, 보다 더 바람직하게 386 내지 392의 아미노산 잔기의 서열에 결합한다. 예를 들어, 결합 가능한 C5 단백질로, 인간 C5 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 61, 인간 C5 단백질의 베타쇄의 아미노산 서열은 서열번호 62 및 인간 C5 단백질의 베타쇄의 MG4 도메인의 아미노산 서열은 서열번호 63에 제시되어 있다. 기타 종으로 토끼, 랫드, 원숭이 등과 종간 교차 반응성도 가진다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 C5 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 적어도 1×107M-1, 1×108M-1, 1×109M-1, 1×1010M-1, 또는 1×1011M-1 의 친화도 상수(KA)를 가진다.
일부 실시 양태에서 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기 표 1 내지 표 6에 기재된 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이며, 해당 서열에 적어도 90％, 95％, 97％, 98％ 또는 적어도 99％의 서열 동일성을 가지며 보체 억제 활성을 가지는 항체 역시 본 발명의 범주에 포함된다. 또한, 중쇄와 경쇄의 불변 영역에서 자명한 일부 변형의 경우, 동일 유사 보체 억제 활성을 가지는 범위에서 본 발명의 범주에 포함된다. 또한, 각각의 이들 항체는 C5에 결합할 수 있기 때문에, VH, VL, 전장 경쇄 및 전장 중쇄 서열 (아미노산 서열 및 상기 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열)은 "혼합 및 매치"되어 본 발명의 다른 C5-결합 항체를 생성할 수 있다.
표 1. C5 항체 (HRA-06-H2-1)
Figure PCTKR2014000920-appb-I000001
표 2. C5 항체 (HRA-06-H2-7)
Figure PCTKR2014000920-appb-I000002
표 3. C5 항체 (HRA-06-H2-18)
Figure PCTKR2014000920-appb-I000003
표 4. C5 항체 (HRA-06-H2-24)
Figure PCTKR2014000920-appb-I000004
표 5. C5 항체 (HRA-06-H1-9-H2-7)
Figure PCTKR2014000920-appb-I000005
표 6. C5 항체 (HRA-06-H1-9-H2-24)
Figure PCTKR2014000920-appb-I000006
본 발명에 있어서 항체는 상기 언급된 항체를 비롯하여, 표 1 내지 6에 기재된 항체와 상동성인 아미노산을 포함하는 항체; CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 가지고, 이들 CDR 서열 중 1개 이상은 본원에 기재된 항체 또는 이의 보존적 변형을 기초로 하는 특정 아미노산 서열을 가지며, 본 발명의 C5-결합 항체의 기능적 특성을 보유하는 항체; 표 1 내지 6에 기재된 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체; 변형된 항체를 조작하기 위한 출발 물질로서 본원에 제시된 1종 이상의 VH 및/또는 VL 서열을 갖는 항체를 사용하여 제조되고, 출발 항체로부터 일부 변경된 특성을 가지는 항체를 모두 포함한다.
또한 본 발명에 있어서 항체는 항체의 특성을 개선시키기 위해 VH 및/또는 VL 내의 프레임워크 잔기에 대해 변형이 이루어진 것을 포함한다.
또한, 본 발명에 있어서 항체는 C 5 단백질에 특이적으로 결합하는 완전 인간 항체일 수 있다. 이는 키메라 항체 등과 비교할 때, 인간 대상체에 투여되었을 때 더욱 감소된 항원성을 가질 수 있다. 인간 항체는 항체의 가변 영역 또는 전장 쇄가 인간 배선 면역글로불린 유전자를 사용한 시스템으로부터 수득된 경우에 특정 배선 서열의 생성물이거나 이로부터 유도된 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 또는 전장 중쇄 또는 경쇄를 포함한다. 이러한 시스템은 인간 면역글로불린 유전자를 보유하는 트랜스제닉 마우스를 관심 항원으로 면역화시키거나, 또는 파지에 디스플레이된 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리를 사용하여 스크리닝하는 것을 포함한다. 인간 배선 면역글로불린 서열의 생성물이거나 이로부터 유도된 인간 항체는 인간 항체의 아미노산 서열을 인간 배선 면역글로불린의 아미노산 서열과 비교하고, 인간 항체의 서열에 가장 근접한 서열인 인간 배선 면역글로불린 서열을 선별함으로써 확인할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서 항체는 이중특이적 또는 다중특이적 항체일 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 2개 이상의 상이한 결합 부위 또는 표적 분자에 결합하는 이중특이적 분자일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 C5 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체이다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 C5 단백질에 특이적으로 결합하는 인간 또는 인간화 단일클론 항체 또는 키메라 항체일 수 있으며, 본 발명의 항체는 인간 중쇄 불변 영역 및 인간 경쇄 불변 영역을 포함한다. 또한, 본 발명의 항체는 단일쇄 항체일 수 있으며, 본 발명의 항체는 Fab 단편일 수 있으며, scFv(Single-chain variable fragment)일 수 있으며, IgG 이소형일 수 있다. 바람직한 IgG 이소형은 IgG2, IgG4 및/또는 IgG2/4이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 IgG 이소형은 IgG2/4이다. IgG2/4 하이브리드 불변 영역은 IgG2 의 CH1과 hinge 부위와 IgG4의 CH2와 CH3 부위가 융합된 형태일 수 있다.
단일클론항체는 통상의 단일클론 항체 방법에 의해 생성될 수 있으며, 합성된 항체 유전자를 항체 발현용 벡터, 바람직하게는 pcDNA, pCI, pCMV, pCEP4 등에 삽입하여 발현 및 정제할 수 있다. 또한, B 림프구의 바이러스성 또는 발암성 형질 전환을 이용할 수 있으며, 뮤린 시스템을 이용하여 제조된 뮤린 단일클론 항체의 서열을 기초로 하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 표준 분자 생물학 기술을 이용하여, 중쇄 및 경쇄 면역글로불린을 코딩하는 DNA를 뮤린 하이브리도마로부터 얻고 이와 함께 비-뮤린 면역글로불린 서열을 함유하게 할 수 있다. 또한, C5에 대한 인간 단일클론 항체는 마우스 면역계가 아닌 인간 면역계의 일부를 보유하는 트랜스제닉 또는 트랜스염색체 마우스를 사용하여 제조할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 아미노산이 각각의 인간 VH 또는 VL 배선(germline) 서열로부터의 항체 프레임워크로 치환된 프레임워크를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
일부 실시양태에서 본 발명의 C5 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 11, 12, 21, 22, 31, 32, 41, 42, 51 또는 52에 95% 이상의 서열 동일성을 가지는 1개 이상의 상보성 결정 (CDR) 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서 본 발명의 C5 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 1, 2, 3, 11, 12, 21, 22, 31, 32, 41, 42, 51 또는 52와 동일한 1개 이상의 중쇄 상보성 결정 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서 본 발명의 C5 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 4, 5 또는 6과 동일한 1개 이상의 경쇄 상보성 결정 서열을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 본 발명의 C5 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 1, 11, 21, 31, 41 또는 51로부터 선택되는 어느 하나의 중쇄 CDR1, 서열번호 2, 12, 22, 32, 42 또는 52로부터 선택되는 어느 하나의 중쇄 CDR2, 및/또는 서열번호 3, 13, 23, 33, 43 또는 53으로부터 선택되는 어느 하나의 중쇄 CDR3을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 본 발명의 C5 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2, 및/또는 서열번호 6의 CDR3을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 본 발명의 C5 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 7, 17, 27, 37, 47 또는 57로부터 선택되는 어느 하나의 중쇄 가변 영역을 포함하거나, 서열번호 7, 17, 27, 37, 47 또는 57로부터 선택되는 어느 하나의 중쇄 가변 영역에 적어도 90%, 95%, 97% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가지는 중쇄 가변 영역를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 본 발명의 C5 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 8의 경쇄 가변 영역을 포함하거나, 서열번호 8의 경쇄 가변 영역에 적어도 90%, 95%, 97% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가지는 경쇄 가변 영역를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 본 발명의 C5 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 9, 19, 29, 39, 49 또는 59로부터 선택된 어느 하나의 중쇄를 포함하거나, 서열번호 9, 19, 29, 39, 49 또는 59로부터 선택된 어느 하나의 중쇄에 적어도 90%, 95%, 97% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가지는 중쇄 가변 영역를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 본 발명의 C5 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 10의 경쇄를 포함하거나, 서열번호 10의 경쇄에 적어도 90%, 95%, 97% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가지는 경쇄를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 본 발명의 C5 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 62의 C5 단백질의 베타쇄 내 에피토프에 결합하는 것을 포함한다. 구체적으로, C5 단백질의 베타쇄 아미노산 서열을 기준으로 332 내지 398, 바람직하게 332 내지 378, 보다 바람직하게 332 내지 364, 보다 더 바람직하게 332 내지 348의 아미노산 잔기의 서열 및/또는 350 내지 420, 바람직하게 369 내지 409, 보다 바람직하게 379 내지 398, 보다 더 바람직하게 386 내지 392의 아미노산 잔기의 서열에 상응하는 에피토프일 수 있다.
또한 본 발명은 서열번호 7, 17, 27, 37, 47 또는 57로부터 선택되는 어느 하나에 적어도 90％, 95％, 97％, 98％ 또는 적어도 99％의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.
일부 실시 양태에서, 본 발명의 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 하기 표 7의 서열을 포함하거나, 어느 하나에 적어도 90％, 95％, 97％, 98％ 또는 적어도 99％의 서열 동일성을 가진다.
표 7. 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
Figure PCTKR2014000920-appb-I000007
Figure PCTKR2014000920-appb-I000008
또한 본 발명은 서열번호 8에 적어도 90％, 95％, 97％, 98％ 또는 적어도 99％의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 일부 실시 양태에서, 본 발명의 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 하기 표 8의 서열을 포함하거나, 적어도 90％, 95％, 97％, 98％ 또는 적어도 99％의 서열 동일성을 가진다.
표 8. 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
Figure PCTKR2014000920-appb-I000009
또한 본 발명은 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주 세포를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 (1) 본 발명의 항체의 중쇄를 코딩하는 재조합 DNA 절편, 및 (2) 본 발명의 항체의 경쇄를 코딩하는 제2 재조합 DNA 절편을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체의 중쇄 및 경쇄 각각을 코딩하는 재조합 DNA 절편을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
C5-결합 항체, 쇄 또는 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키기 위해 다양한 발현 벡터가 사용될 수 있으며, 포유동물 숙주 세포에서 항체를 생성하기 위해 바이러스-기재 및 비-바이러스 발현 벡터 둘 다 사용될 수 있다. pcDNA, pCI, pCMV, pCEP4 등의 벡터와 HEK293, CHO, CHO-DG44 등의 숙주세포가 사용될 수 있다.
C5-결합 항체를 보유하고 발현하는 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. E.Coli, 바람직하게, E.coli ER2738. HB2151, BL21 등일 수 있으며, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 클로닝하고 발현시키는데 유용한 원핵 숙주들이다. 사용하기 적합한 다른 미생물 숙주는 바실러스, 예를 들어 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis), 및 다른 장내 박테리아, 예를 들어 살모넬라 (Salmonella), 세라티아(Serratia) 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 종을 포함한다. 본 발명의 C5-결합 폴리펩티드를 발현시키기 위해 다른 미생물, 예를 들어 효모가 사용될 수 있으며, 바큘로바이러스 벡터와 조합된 곤충 세포가 또한 사용될 수 있다.
일부 바람직한 실시양태에서, 포유동물 숙주 세포가 본 발명의 C5-결합 폴리펩티드를 발현시키고 제조하는데 사용된다. 예를 들어, 내인성 면역글로불린 유전자를 발현하는 하이브리도마 세포주 또는 외인성 발현 벡터를 보유하는 포유동물 세포주 일 수 있다. 또한, 임의의 동물 또는 인간 세포로, 예를 들어, CHO 세포주, Cos 세포주, HeLa 세포, 골수종 세포주, HEK 세포주, 형질전환된 B-세포 및 하이브리도마를 포함하여 면역글로불린을 분비할 수 있는 수많은 적합한 숙주 세포주가 사용될 수 있으며, 바람직하게는 HEK293, CHO, CHO-DG44가 사용될 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 1종 이상의 C5-결합 분자 (예를 들어, C5 결합 항체 또는 이의 항원 결합 단편)를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물은 보체 관련 질환에 유용하다. 보체 관련 질환이란질환의 발병이 보체 시스템의 활성화의 이상, 예를 들면 보체 결핍과 관련이 있는 모든 질환 및 병리적 상태를 포함한다. 예컨대 염증성 및 자가면역 질환, 예를 들어 류마티스성 관절염(RA), 퇴행성 관절염, 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 허혈 및 재관류 이후의 원거리 조직 손상, 심폐 우회술 동안 보체 활성화, 피부근염, 천포창, 낭창성 신염, 사구체신염, 사구체혈관염, 심폐 바이패스, 심장마비-유도된 관상동맥 내피 기능 이상, 제II형 막증식성 사구체신염, 급성 신부전증, 항인지질 증후군, 황반 변성증, 안내염, 신혈관 질환, 동종이식, 초급성 거부반응, 혈액투석, 만성 폐쇄성 폐 호흡곤란 증후군 (COPD), 천식, 야간 혈색소뇨증(PNH) 및 흡인성 폐렴을 포함하며, 이에 제한되지 않는다.
상기 조성물은 보체 관련 질환을 치료 또는 예방하기에 적합한 1종 이상의 다른 제제를 추가로 함유할 수 있다. 제약상 담체는 조성물을 향상시키거나 안정화시키거나, 또는 조성물의 제조를 용이하게 한다. 제약상 허용되는 담체는 생리적으로 상용가능한 용매, 분산 매질, 코팅제, 항-박테리아제 및 항-진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 투여할 수 있다. 투여 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라 달라진다. 투여가 정맥내, 근육내, 복막내 또는 피하이거나, 표적 부위에 근접하게 투여되는 것이 바람직하다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 안구 안으로 유리체내 투여될 수 있도록 제제화된다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물, 즉, 항체, 이중특이적 및 다중특이적 분자는 산의 작용 및 화합물을 불활성화시킬 수 있는 다른 천연 조건으로부터 화합물을 보호하는 물질로 코팅될 수 있다.
조성물은 멸균되고 유체여야 한다. 적당한 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅제의 사용에 의해, 분산액제의 경우에는 필요한 입도의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨 또는 소르비톨, 및 염화나트륨을 조성물 내에 포함시키는 것이 바람직하다. 주사가능한 조성물의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 또는 젤라틴을 조성물 중에 포함시켜 유도될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 당업계에 공지되고 통상적으로 실시되는 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20th ed., 2000] 및 [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., NewYork, 1978]을 참조한다. 약학적 조성물은 바람직하게는 GMP 조건하에 제조된다. 전형적으로, C5-결합 항체의 치료 유효 용량 또는 효능 용량이 본 발명의 약학적 조성물에 사용된다. C5-결합 항체는 당업자에게 공지된 통상의 방법에 의해 제약상 허용되는 투여 형태로 제제화된다. 투약법은 원하는 최적의 반응 (예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조정된다.
본 발명의 제약 조성물 중 활성 성분의 실제 투여량 수준은, 환자에게 독성이 아니면서 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 원하는 치료 반응을 달성하는데 효과적인 활성 성분의 양이 달성되도록 달라질 수 있다. 선택된 투여량 수준은 다양한 약력학 인자, 예를 들어 사용된 본 발명의 특정 조성물, 또는 이의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용된 특정 화합물의 배출 속도, 처치 기간, 사용된 특정 조성물과 조합되어 사용된 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료받는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강 및 이전의 의학적 병력 및 기타 인자에 따라 달라진다.
치료 투여량은 안전성 및 효능이 최적화되도록 적정할 필요가 있다. 항체를 전신 투여하는 경우, 투여량 범위는 숙주 체중 1 kg 당 약 0.0001 내지 100 mg, 더욱 일반적으로는 0.01 내지 15 mg의 범위이다. 예시적인 치료법은 2주 당 1회, 또는 1개월 당 1회, 또는 3개월 내지 6개월마다 1회의 전신 투여를 수반한다. 항체를 유리체내 투여하는 경우, 투여량은 약 0.0001 내지 약 10 mg의 범위이다. 예시적인 치료법은 2주 당 1회, 또는 1개월 당 1회, 또는 3개월 내지 6개월마다 1회의 전신 투여를 수반한다.
전신 투여의 일부 방법에서, 투여량은 1 내지 1000 ㎍/mL, 일부 방법에서는 25 내지 500 ㎍/mL의 혈장 항체 농도가 달성되도록 조정된다. 대안적으로, 빈도를 덜하게 하여 투여하는 것이 요구되는 경우에는 항체를 지속 방출 제제로서 투여할 수 있다. 투여량 및 빈도는 환자에서의 항체의 반감기에 따라서 달라진다. 예방적 용도에서는 상대적으로 낮은 투여량을 장기간에 걸쳐 상대적으로 드문 간격으로 투여한다.
또한 본 발명은 C5 결합 분자를 사용한 보체 관련 질환의 치료 또는 진단 방법을 제공한다.
본 발명의 C5 결합 분자를 사용한 보체 관련 질환의 치료 방법은 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 이를 포함하는 조성물의 치료학적으로 유효한 양의 투여를 포함한다. 본 발명에서 사용되는 “치료학적으로 유효한 양”이라는 용어는 보체 관련 질환의 예방 또는 치료에 유효한 본 발명의 C5 결합 분자 또는 이를 포함하는 조성물의 양을 나타낸다.
본 발명의 치료제로 C5 결합 분자 또는 이를 포함하는 조성물이 또다른 작용제와 함께 투여되는 경우, 이들 2가지 물질은 임의의 순서로 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. C5-결합 항체를 사용한 조합 치료에 적합한 작용제는 보체 성분의 활성을 조정할 수 있는 것으로 당업계에 공지된 작용제를 포함한다. 예를 들어, 포스포네이트 에스테르, 폴리음이온 물질, 술포닐 플루오라이드, 폴리뉴클레오티드, 피마르산 , 여러가지 항-염증제 등이 있다. 1 이상의 치료제 등과 조합 요법은 부가적일 수도 있고, 상승작용의 결과를 야기할 수도 있다.
본 발명은 생물학적 샘플 (예를 들어, 혈액, 혈청, 세포, 조직)에서 또는 보체 관련 질환을 앓고 있거나 발생할 위험이 있는 개체로부터 C5 단백질 및/또는 핵산 발현 및 C5 단백질 기능을 결정하는 진단 검정을 포함한다. 본 발명의 항체는 예를 들어 방사선면역검정, ELISA 및 방사상 확산 검정이 보체 분열 생성물의 검출에 이용가능하다. 또한, 진단 검정, 예후 검정, 약리유전학 및 임상 시험 모니터링을 예후 (예측) 목적으로 사용함으로써 개체를 예방적으로 치료하는데 사용할 수 있으며, 본 발명은 또한 개체가 보체 경로 활성의 조절이상과 관련이 있는 장애가 발병할 위험에 있는지의 여부를 결정하기 위한 예후 (또는 예측) 검정을 제공한다. 예를 들어, C5 유전자 내의 돌연변이를 생물학적 샘플에서 검정할 수 있다. 이러한 검정을 예후 또는 예측 목적으로 사용함으로써, C5 단백질, 핵산 발현 또는 활성을 특징으로 하거나 이와 관련이 있는 장애의 발병 전에 개체를 예방적으로 치료할 수 있다.
또한 본 발명은 C5 결합 분자; 및 용기를 포함하는 보체 관련 질환의 진단용 키트를 제공한다. 본 발명의 진단용 키트는 상기 언급된 C5 결합 분자의 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 용기는 고체 담체가 포함되며, C5 결합 분자는 고체 담체에 부착될 수 있고, 이와 같은 고체 담체는 다공성 또는 비다공성, 평면 또는 비평면일 수 있다.
또한 본 발명은 보체 관련 질환 치료용 약제의 제조를 위한 C5 결합 분자의 용도를 제공한다. 약제의 제조를 위한 본 발명의 C5 결합 분자 또는 이를 포함하는 조성물은 허용되는 담체 등을 혼합할 수 있으며, 다른 작용제들과 함께 복합 제제로 제조되어 활성 성분들의 상승 작용을 가질 수 있다.
또한 본 발명은 C5 결합 분자의 용도를 제공한다. 본 발명의 보체 관련 질환 치료를 위한 C5 결합 분자는 치료용 용도로 사용될 수 있으며, 보체 관련 질환을 앓고 있거나 발생할 위험이 있는 개체로부터 C5 단백질 및/또는 핵산 발현 및 또한 C5 단백질 기능을 결정하는 진단 검정의 용도로 사용될 수 있다.
본 발명의 용도, 조성물, 치료 방법에서 언급된 사항은 서로 모순되지 않는 한 동일하게 적용된다.
본 발명의 C5 결합 분자는 보체-관련 질환의 진단, 예방 및 치료에 유용하다.
도 1은 본 발명 일실시예에 따른 토끼(A) 및 닭(B)의 면역 라이브러리를 이용한 바이오 패닝(Bio-panning) 후, 무작위로 선별된 40개 클론의 흡광도를 나타내는 도이다.
도 2는 본 발명 일실시예에 따른 토끼 및 닭 면역 라이브러리로부터 선별된 5종의 항체와 대조 항체인 에쿨리주맙의 인간 C5에 대한 흡광도 측정 결과를 나타내는 도이다.
도 3은 C5에 대한 결합력을 가진 다수 클론을 5종의 변이체 서브 라이브러리로부터 확보한 결과를 나타내는 도이다.
도 4는 본 발명 일실시예에 따른 인간화 클론인 HRA-06 클론을 주형으로 사용하여 제작한 친화도가 향상된 클론의 결합능을 비교한 결과를 나타내는 도이다.
도 5는 본 발명 일실시예에 따라 제조된 항체가 보체 의존적 세포 독성 검정법에서 높은 보체 의존적 세포 독성 억제능을 가지는 것을 나타내는 도이다.
도 6은 본 발명 일실시예에 따라 제조된 항체가 C5a 생성 검정법에서 높은 C5a 생성 억제능을 보여주는 도이다.
도 7은 본 발명 일실시예에 따라 제조된 단일 클론 항체의 종간 교차 반응성을 나타내는 도이다.
도 8은 본 발명 일실시예에 따라 제조, 정제된 항체들의 크기 배제 크로마토그래피 결과를 나타내는 도이다.
도 9는 본 발명 일실시예에 따른 항체가 C5의 베타쇄에 결합함을 나타내는 도이다.
도 10은 본 발명 일실시예에 따른 항체가 C5의 베타쇄의 MG4 도메인에 결합함을 나타내는 도이다.
도 11은 본 발명 일실시예에 따른 항체가 베타쇄의 C-말단으로부터 1개 도메인씩 순차적으로 제거한 변이체 Fc 융합 단백질에서 MG4 도메인에 특이적으로 결합함을 확인해주는 도이다.
도 12는 본 발명 일실시예에 따른 항체가 MG4 도메인의 순차적 제거 변이체에서 immunoblot으로 확인한 바에 따라 베타쇄의 N-말단 332-348번째 아미노산 잔기에 결합 하는 것을 보여주는 도이다.
도 13은 본 발명 일실시예에 따른 항체가 ELISA로 확인한 바에 따라 베타쇄 N-말단의 379-398번째 아미노산 잔기에 결합하는 것을 보여주는 도이다.
도 14은 본 발명 일실시예에 따른 항체가 ELISA로 확인한 바에 따라 베타쇄 N-말단의 386-392(MG4 도메인 서열 기준: 55 -61 번째 아미노산 서열)번째 아미노산 잔기에 결합하는 것을 보여주는 도이다.
이하, 본 발명의 구성요소와 기술적 특징을 다음의 실시예들을 통하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 하기 실시예들은 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
본원에 기재된 다양한 실시예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물, 및 제조방법 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 실시예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 실시예" 또는 "실시예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 실시예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 실시예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현 "한 가지 실시예에서" 또는 "실시예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 실시예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 실시예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.
실시예 1. C5 면역 항체 라이브러리의 제작
인간 C5 단백질(Calbiochem) 5ug을 RIBI+MPL+TDM+CWS adjuvant(Sigma, St. Louis, Mo, USA)와 혼합하여 NZW 토끼와 닭 피하에 주사하고, 이를 2주 간격으로 토끼는 총 3회, 닭은 총 4회 수행하였다. 면역이 완료된 토끼로부터 지라 및 골수를 얻고 닭으로부터 지라, 비자 및 활액낭을 얻어, 이로부터 total RNA를 TRI 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA USA)을 사용하여 추출하고, 올리고-dT 프라이머 및 SuperScript™ III First-Strand Synthesis System (Invitrogen)을 사용하여 First strand cDNA를 합성하였다. 면역글로불린의 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역에 특이적인 하기 표 9(토끼) 및 표 10(닭)의 프라이머를 이용하여 단일쇄 Fv 라이브러리를 제작하였다. 토끼의 scFv 라이브러리에 대해서는 VH의 4 프라이머 및 VL의 10(9 × Vκ 및 1× Vλ) 조합이 코딩 서열 증폭을 위해 사용되었고, 닭에 대해서는 Vλ 및 VH에 대해 하나의 조합이 사용되었다.
표 9. 토끼 단일쇄 Fv 라이브러리의 Vκ, Vλ 및 VH 를 위한 프라이머
Figure PCTKR2014000920-appb-I000010
표 10. 닭 단일쇄 Fv 라이브러리의 Vλ 및 VH 를 위한 프라이머
Figure PCTKR2014000920-appb-I000011
각각의 반응에서, 1 ul의 cDNA는 각 프라이머의 60 pmol, 10 μl의 10 X 반응 버퍼, 8 μl의 2.5 mM dNTP, 0.5 μl의 Taq DNA 폴리머라이제 및 물과 혼합되었고 최종 부피를 100 ul로 하였다. PCR 반응은 하기 조건에 의해 수행되었다: 30 사이클 15 초 94 ℃, 30 초 56 ℃, 및 90 초 72 ℃, 이어서 최종 연장 10 분 72 ℃. 약 350 bp의 증폭된 절편은 1.5 % 아가로오스 젤에 로딩 및 러닝 후에 QIAEX II Gel Extraction Kit (QIAGEN, Valencia, CA, USA)로 정제되었다. 두 번 째 PCR에서, 첫 번째 VL 및 VH 생성물은 중복 연장 PCR(Overlap extension PCR)에 의해 무작위적으로 결합되었다. 각각의 PCR 반응은 100 ng 의 정제된 VL 및 VH 생성물, 60 pmol의 각각의 프라이머, 10μl의 10 X 반응 버퍼, 8 μl의 2.5 mM dNTP 및 0.5 μl의 Taq DNA 폴리머라이제를 포함하는 100 ul의 혼합물로 수행되었다. PCR 반응은 하기 조건에서 수행되었다: 20 사이클 15 초 94 ℃, 30 초 56 ℃, 및 2 분 72 ℃, 이어서 최종 연장 10 분 72 ℃. 약 700 bp의 scFV 절편은 QIAEX II Gel Extraction Kit (QIAGEN)로 정제되었다. scFv 절편 및 pComb3XSS 벡터는 Sfi I 제한 효소 (Roche Molecular Systems, Pleasanton, CA, USA)에 의해 8시간 동안 50 ℃에서 절단되었다. 700 ng의 SfiI-절단된 scFv는 16 ℃에서 12시간동안 반응물의 배양에 의해 T4 DNA 리가아제를 사용하여 1400 ng의 pComb3X 벡터로 라이게이션되고, 이어서 에탄올 침전하였다. 라이게이션된 라이브러리는 E. coli ER2738로 electoporation에 의해 형질전환하였다. 세포는 37 ℃, 3 ml Super Broth(SB) 배지에서 혼합되었으며, 1 시간 동안 250 rpm으로 교반하며 배양되었고, 그 후 10 ml SB 배지 및 3 ul의 100 mg/ml 카베니실린이 배양액에 첨가되었다. 라이브러리 크기는 50 ug/ml 카베니실린을 함유하는 Luria broth 플레이트에서 배양액의 0.1, 1 및 10 ul 플레이팅에 의해 결정되었다. 1시간 동안 배양 후, 4.5 ul의 100 mg/ml 카베니실린이 첨가되었고 추가로 1시간 더 배양되었다. 배양액에 2 ml의 VCSM13 헬퍼 파지(> 1011cfu/ml), 183ml의 SB 배지 및 92.5μl의 100 mg/ml 카베니실린이 더해지고, 37 ℃에서 2 시간 동안 250 rpm으로 교반하며 배양되었다. 카나마이신 (280 ul)이 더해지고, 37 ℃ 및 250 rpm에서 밤샘 교반되었다. 다음날, 배양액은 3000 g에서 15분간 원심분리되었다. 박테리아 펠렛은 phagemid DNA 제조를 위해 저장되었고 상층액은 깨끗한 원심분리 병에 옮겨졌다. 8 g 폴리에틸렌 글리콜-8000(PEG-8000, Sigma) 및 6 g 염화나트륨(Merk)이 더해지고, 상층액은 30분간 얼음에 저장되었다. 상층액은 15,000 g, 4 ℃에서 15분간 원심분리되었다. 파지 펠렛은 1 % BSA를 함유하는 TBS에서 섞어주었다.
실시예 2. 바이오 패닝(bio-panning)
3 ug의 인간 C5 항체를 16 시간 동안 상온에서 1X107 자성 비드(Dynabeads M270- Epoxy, Invitrogen)로 코팅하였다. 비드는 PBS로 세척되고 1시간 동안 상온에서 3% BSA를 함유하는 PBS로 블록킹되었다. 코팅된 비드를 세척한 후에, 2시간 동안 상온에서 Phage-displayed scFv와 함께 배양되었다. 비드는 결합되지 않은 phage를 제거하기 위해 0.5% TPBS로 세척되었다. 결합된 Phage는 100ul의 0.1M 글리신-HCl로 elute되었고 6 ul의 2M Tris-HCl (pH 9.0)로 중성화되었다. Elute된 파지는 E.coli ER2738에 감염되었고 밤샘 증폭을 위해 VCSM13 헬퍼 파지로 rescue되었다. Input 및 Output 파지 타이터는 카베니실린 50 ug/ml를 함유하는 LB 플레이트에서 파지가 감염된 박테리아를 플레이팅하여 37 ℃에서 배양에 의해 결정되었다. 다음날 파지는 실시예 1과 같이 PEG-8000 및 NaCl 첨가에 의해 침전되었다.
실시예 3. 파지 ELISA에 의한 scFv 선택
바이오 패닝으로부터 선택된 클론을 분석하기 위하여 인간 C5에 대하여 파지 diplaying scFv를 사용하여 ELISA를 수행하였다. 96-웰 플레이트는 100ng의 인간 C5 로 4 ℃에서 밤새 코팅되었고 3% BSA 함유 PBS로 블록킹되었다. 각각의 파지 배양액은 동일 양의 6% BSA 함유 PBS와 혼합된 후, 인간 C5-코팅 96-웰 플레이트에 첨가되었고, 37℃에서 2시간동안 배양되었다. 배양이 끝나고 세척을 수행한 후, HRP 결합된 항-M13 항체(Amersham, USA)로 배양되었다. 배양이 끝나고 세척을 수행한 후에 0.05 M 구연산 버퍼 내 2, 2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS, Amresco, OH, USA) 1ug/ml 및 0.1 % H2O2를 각각의 웰에 첨가하고 발색하여 405 nm에서 흡광도 측정을 수행하였다.
그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1의 A는 토끼의 면역라이브러리를 나타내며, 도 1의 B는 닭의 면역라이브러리를 나타낸다. 인간 C5 에 대하여 흡광도 0.6 이상을 나타내는 clone 의 유전자서열을 분석한 결과, 토끼 면역라이브러리로부터 2종, 닭 면역라이브러리로부터 3종의 서로 다른 서열을 가진 scFv 클론을 확보하였다.
또한, 선택된 5 종의 scFv 클론에 대하여 C5에 대한 항-C5 scFv-Fc 융합 단백질의 ELISA를 수행하여 대조 항체인 에쿨리주맙과 결합능을 비교하였다. 상기 방법과 동일하게 HRP-결합된 항-인간 IgG를 이용하여 C5에 결합하는 항체의 양을 결정하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 5 종의 선별된 scFv 클론 모두 에쿨리주맙보다 높은 흡광도를 나타내었다.
실시예 4. 친화도 성숙 및 인간화 항체의 제작
사람 보체 C5에 대하여 결합력과 활성화 억제능을 가진 scFv 항체 분절을 구성하는 6개 항원 상보성 결정 영역(CDR, complementarity determining region) (경쇄 항원 상보성 결정영역 [CDRL 1-3], 중쇄 항원 상보성 결정 영역 1-3 [CDRH1-3] 부분을 인간 배선(germline) kappa1/IGHV3-23/의 8개 프레임 워크 (FRL1-4, FRH1-4) 사이에 삽입하여, 인간화 항 보체 C5 scFv 유전자를 합성하였다(HRA-06, Genscript, Piscataway, NJ, USA).
변이체 서브 라이브러리를 생성하기 위하여, 동의 코돈(degenerate codons) NNK 또는 MNN(N=A, T, G 또는 C, K=G 또는 T, M=A 또는 C)을 함유하는 올리고뉴클레오티드가 사용되었다. HRA-06 scFv 유전자는 template DNA로 사용되었다. 무작위 코돈은 PCR에 의해 CDRH3만을 제외하고 5개의 CDR에 도입되었다. 증폭된 scFv 절편은 QIAEX II Gel Extraction Kit (QIAGEN)에 의해 정제되었다. ScFV 및 pComb3XSS 벡터는 SfiⅠ 제한 효소(Roche Molecular Systems) 로 절단되었고 라이게이션 후 에탄올 침전하였다. 라이게이션된 라이브러리는 실시예 1과 같이 E. coli ER2738에 형질 주입되었고 파지 라이브러리를 제작하였다. 제작된 파지 라이브러리를 기반으로 실시예 2와 동일한 방법으로 항원을 선별하였다. 마지막으로 실시예 3과 동일한 방법으로 C5에 대한 결합력을 파지 ELISA 로 확인하였다.
도 3에 나타낸 바와 같이, C5에 대한 결합력을 가진 다수 클론을 5종의 변이체 서브 라이브러리로부터 확보하였다.
실시예 5. 재조합 항 C5 항체 및 대조군 에쿨리주맙 항체의 제작
1. 전장 IgG 벡터 및 scFcv-Fc 벡터로 항-C5 항체의 서브-클로닝
HindⅢ(New England Biolabs) 및 XhoⅠ(New England Biolabs) 제한 효소에 의해 pCEP4 벡터(Invitrogen)로 IgG2 힌지(hinge) 및 IgG2/4 하이브리드 CH2-CH3을 코딩하는 유전자가 삽입되었다. 항-C5 scFv를 코딩하는 유전자는 두 SfiⅠ 제한 부위에 의해 Fc 영역의 5‘ 말단으로 서브클로닝되었다. 경쇄에 대하여, 인간 면역글로블린 Cκ 유전자는 포유류 발현 벡터로 서브클로닝되었다. 중쇄에 대하여, 인간 CH1 및 IgG2의 hinge부터 IgG2/4 하이브리드 CH2-CH3 영역까지 유전자는 포유류 발현 벡터로 서브클로닝되었다. 다양한 경쇄 및 중쇄는 전장 IgG 벡터로 서브클론되었다. 에쿨리주맙의 항체 서열은 일본 의약품 의료 기기 관리 기관 (PMDA)에 등록되어 있는 에쿨리주맙(제품명 Soliris)의 심사보고서에 명시된 항체서열을 근거로 하여 중쇄와 경쇄 유전자를 합성하였다.
2. 형질주입 및 단백질 정제
형질주입은 과발현 재조합 단백질에 대해 수행되었다. 배양 부피의 발현벡터 ml 당 2 ug의 포유류 발현 벡터와 4ug의 폴리에틸렌이민/ml(PEI, Polysciences, Warrington, PA, USA)는 배양 부피의 1/10에 해당하는 150mM 염화나트륨에 혼합되었고, 상온에서 15분간 방치하였다. 혼합물에 HEK 293F 세포(2X106 세포/ml)가 추가되었고 5일동안 100U/ml 페니실린(Invitrogen) 및 100U/ml 스트렙토마이신(Invitrogen)을 함유하는 FreeStyleTM 293 발현 배양액, 37℃, 7% CO2 및 135rpm의 교반 조건하에 배양되었다. 세포 배약액의 상층액은 수거되었고 IgG 및 Fc 융합 단백질의 정제를 위하여 단백질 A 친화도 젤 크로마토그래피의 대상이 되었다.
실시예 6. 단일 클론 항체의 결합능 측정
실시예 5의 방법으로 생산된 항체의 보체 C5 결합능을 측정하고자 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) 를 수행하였다. C5 를 코팅한 96-웰 플레이트에 항체를 농도별로 희석하고 첨가하여 반응을 시켰다. horseradish peroxidase가 표지된 항 사람 IgG 항체를 이차 항체로 사용하고 ABTS (2,2'-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt)로 발색하여 흡광도를 상기 실시예 3과 동일하게 측정하였다.
실험에 사용된 단클론 항체의 종류는 친화도 성숙된 인간화 항 C5 항체 6종 (HRA-06-H2-1, HRA-06-H2-7, HRA-06-H2-18, HRA-06-H2-24, HRA-06-H1-9-H2-7, HRA-06-H1-9-H2-24)과 양성대조군 항체 에쿨리주맙, 음성대조군 항체 팔리비주맙이며, 실험 결과는 도 3에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 항 보체 C5 항체는 모두 C5에 대하여 결합력을 보였으며, 친화도 성숙된 인간화 항 C5 항체 6종은 에쿨리주맙 대비 높은 흡광도를 나타내었다.
실시예 7 : 시험관 내 보체 의존적 세포 독성 검정
CD-20 발현 인간 Burkitt's 림프종 세포주인 RaJi는 10% FBS(Invitrogen), 100 U/ml 페니실린(Invitrogen) 및 100 U/ml 스트렙토마이신(Invitrogen)을 함유하는 RPMI 1640에서 유지되었다. 표적 세포는 세척후에 1X106 세포/ml의 농도로 섞였다. 항-CD20 인간 IgG인 리툭시맙(Roche)은 3 ug/ml의 농도로 CDC 용액에 희석되었다. 동일 부피의 표적 세포 및 민감성 항체는 96-웰 플레이트에 100ul/well의 부피를 만들도록 혼합되었고, 상온에서 5분간 방치되었다. 검정은 인간 보체 혈청 추가에 의해 시작되었고, 그 결과 각 웰당 150 ul의 최종 부피를 가졌으며 최종 농도는 4% 혈청이었다. 2시간 동안 배앙한 후에, 15 ul Tetrazolium 염(WST-1, Takara Bio, Japan)이 첨가되었고 플레이트는 2시간동안 더 배양되었다. 살아있는 세포는 450 nm의 OD에서 측정되었다. 항-C5 항체의 효과는 표적 세포 및 민감성 항체 혼합물 첨가전에 30분 동안 37℃에서 혈청과 선처리에 의해 평가되었다. 동일 농도의 팔리비주맙은 IgG 대조군으로 사용되었다. 세포 생존율의 퍼센트는 하기 식으로 계산되었다.
% 생존율=(테스트항체 - 배경)/(테스트항체없음 - 배경) X 100
그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따라 제조된 친화도 성숙된 인간화 항 C5 항체는 CDC 억제능을 나타내었으며, 항체 모두가 에쿨리주맙과 대비하여 높은 세포생존력을 나타내었다.
실시예 8 : 시험관내 C5a 생성양 측정
표적 세포, 민감성 항체 및 혈청의 2시간 배양 후, 세포는 원심분리에 의해 펠렛화되었고 상층액은 제조사의 매뉴얼에 따라 BD OpiEIATM Human C5a ELISA Kit Ⅱ(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 사용하여 샌드위치 ELISA에 의해 C5a 양에 대해 검정되었다.
그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따라 제조된 친화도 성숙된 인간화 항 C5 항체는 모두 C5a 생성 억제능을 나타내었으며, 친화도 성숙된 인간화 항 C5 항체 4종은 모두 에쿨리주맙과 대비하여 높은 억제력을 나타내었다.
실시예 9 : 단클론 항체의 종간교차반응성 측정
단클론 항체가 사람 외 다른 종의 보체 C5에 결합하는지 확인하기 위하여 immunoblot을 수행하였다. 사람 C5 단백질과 사람 (Sigma), rhesus 원숭이, BALB/c 마우스, Wistar 랫드, NZW 토끼의 혈청을 희석한 것을 각각 SDS-PAGE 하고, 분리된 단백질을 나이트로셀룰로오스 막으로 이동시켰다. 본 발명에 따라 제조된 항 보체 C5 항체 HRA-06-H2-1를 이용하여 immunoblot을 수행하였다.
그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 항 보체 C5 항체는 사람 (Sigma), rhesus 원숭이, Wistar 랫드, NZW 토끼의 C5에 결합력을 나타내었다.
실시예10 : Size-exclusion chromatography
정제한 항체를 Waters 2489 system(Waters Corporation, Milford, MA, USA) 과 Zenix-C 300 column (Sepax Technologies, Inc., Newark, DE, USA) 을 이용하여 size-exclusion chromatography (SEC) 분석을 수행하였다. 이동 상 조성물 (150 mM 인산 나트륨, pH 7.0) 및 유속(1.0 mL/분)이 유지되었으며, 단백질의 농도는 280 nm에서 컬럼 용출액의 흡광도를 모니터링하여 결정되었다. 분획의 농도는 피크 영역의 합에 의해 각각의 피크 영역을 나눔으로써 계산되었다.
그 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8의 A 내지 D는 각각 A) HRA-06-H2-1, B) HRA-06-H2-7, C) HRA-06-H2-18, D) HRA-06-H2-24, E) HRA-06-H1-9-H2-7 및 F) HRA-06-H1-9-H2-24를 나타낸다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 항 보체 C5 항체의 물리 화학적 특성은 응집이 거의 생기지 않는 것으로 확인되었다.
실시예11 : Epitope mapping
1. C5 베타쇄에 항체의 결합 확인
보체 C5 단백질의 reducing을 수행한 것과 수행하지 않은 것 각각을 SDS-PAGE 하고, 항 보체 C5 항체로 immunoblot함으로써, 베타쇄 결합 여부를 확인하고 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9의 A는 에쿨리주맙을 항체로 사용하여 결합을 확인한 것이며, 도 9의 B는 본 발명에 따른 HRA-06-H2-1을 항체로 사용한 결과이다. 알려진 바처럼 에쿨리주맙은 C5(보체 단백질 전체)에 결합하였으며, Reducing을 수행한 2 lane에서 알파쇄에 결합하는 것을 확인하였다. 한편, 본 발명에 따른 HRA-06-H2-1 항체는 C5(보체 단백질 전체)에 결합하였으며, Reducing을 수행한 2 lane에서 베타쇄에 결합하는 것을 확인하였다.
2. Fc 융합 단백질로 C5 베타쇄 변이 도메인의 제조 및 결합 부위 확인
베타쇄의 순차적 제거 변이체 및 C5의 베타쇄를 구성하는 여섯 개 도메인이 cDNA로부터 증폭되었다. 프라이머는 5‘ 및 3’ 말단에서 SfiⅠ 제한 위치에 첨가되도록 디자인되었다 (표 11). 베타쇄의 순차적 제거 변이체는 표 12에 기재된 바와 같은 프라이머 조합에 의해 증폭되었다. 증폭된 PCR 절편들은 SfiⅠ으로 절단되고 클로닝 위치의 3‘ 부분에서 인간 IgG1의 hinge 부위 및CH2-CH3 도메인을 함유하도록 변형된 pCEP4 벡터로 클로닝되었다. 이러한 클론들은 상기 실시예 5에 기재된 바와 같이 형질주입되고 Fc 융합 단백질은 정제되었다.
표 11. 베타쇄 도메인의 증폭을 위한 프라이머 서열
Figure PCTKR2014000920-appb-I000012
표 12. 베타쇄 도메인 및 베타쇄 제거 변이체 제조를 위한 프라이머 조합
Figure PCTKR2014000920-appb-I000013
각각의 도메인을 포함하는 단백질들에 대하여 각각 SDS-PAGE를 수행하고, 항 보체 C5 항체(HRA-06-H2-1)로 immunoblot을 수행하여, 그 결과를 도 10 및 도11에 나타내었다.
도 10의 A는 C5 베타쇄 및 제조된 Fc 융합 단백질의 구조를 모식도로 나타내고 있으며, 도 10의 B는 immunoblot 결과를 나타낸다. 도 10에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따라 제조된 HRA-06-H2-1 항체는 MG4 도메인을 가지는 Fc 융합 단백질에 대해 결합하는 것을 확인하였다.
도 11의 A는 C5 베타쇄 및 제조된 Fc 융합 단백질의 구조를 모식도로 나타내고 있으며, 도 11의 B는 immunoblot 결과를 나타낸다. 도 11에 나타낸 바와 같이, MG4 도메인을 포함하는 Fc 융합단백질에서만 HRA-06-H2-1 항체와 결합이 이루어지는 것을 확인하였다.
3. Fc 융합 단백질로 MG4 도메인의 제조 및 결합 부위 확인
베타쇄의 MG4 도메인과 MG4 도메인의 N-말단부터 순차적으로 제거한 5종의 변이체들을 클로닝하였다. 프라이머는 5‘ 및 3’ 말단 모두에 SfiⅠ 제한 위치가 첨가되도록 디자인되었다(표 13). 증폭된 PCR 절편들은 SfiⅠ으로 절단되고 클로닝 위치의 3‘ 부분에서 인간 IgG1의 hinge 부위 및 CH2-CH3 도메인을 함유하도록 변형된 pCEP4 벡터로 클로닝되었다. 이러한 클론들은 상기 실시예 5에 기재된 바와 같이 형질주입되고 Fc 융합 단백질은 정제되었다. 정제된 Fc 융합 단백질에 대하여 SDS-PAGE 후, immunoblot을 상기와 같이 수행하였다.
표 13. MG4 도메인의 증폭을 위한 프라이머 서열
Figure PCTKR2014000920-appb-I000014
그 결과를 도 12에 나타내었다. 도 12의 A는 MG4 도메인 및 순차적으로 제거되어 제조된 Fc 융합 단백질을 나타내며, 도 12의 B는 HRA-06-H2-1 항체로 immunoblot을 수행한 결과를 나타낸다. 도 12에 나타낸 바와 같이, 베타쇄의 N-말단으로부터 332-348번째 서열이 제거된 변이체들에 대해서, 결합이 이루어지지 않음을 확인할 수 있었는 바, 베타쇄의 MG4 도메인 내 332-348번째 아미노산 잔기 서열이 항체 결합 가능성이 높은 서열임을 알 수 있었다.
4. 인간/마우스 하이브리드 MG4 도메인으로부터 항체 결합 부위 확인
C5 베타쇄의 인간/마우스 하이브리드 MG4 도메인이 중복 연장 PCR에 의해 제조되었다. 프라이머는 5‘ 및 3’ 말단 모두에 SfiⅠ 제한 위치가 첨가되도록 디자인되었다(표 14). PCR 절편은 SfiⅠ으로 절단되었고 SfiⅠ 절단된 pComb3X 벡터로 클로닝되었다. 이러한 클론들은 E.coli ER 2738로 형질주입되었다. 각각의 인간/마우스 MG4 하이브리드로부터 단일 콜로니는 600 nm에서 흡광도가 1.0에 이를 때까지 배양되었다. 파지 감염은 VCSM13 헬퍼 파지(1011 pfu/ml)의 첨가에 의해 수행되었고 37 ℃에서 2시간동안 배양되었다. 카나마이신(25 ug/ml)는 첨가되었고 배양은 일정한 교반하에 37 ℃에서 밤샘으로 이루어졌다. 박테리아는 3000g에서 15분간 원심분리에 의해 제거되었다.
표 14. 인간/마우스 하이브리드 MG4 도메인의 증폭을 위한 프라이머 서열
Figure PCTKR2014000920-appb-I000015
Figure PCTKR2014000920-appb-I000016
파지 ELISA는 다음과 같이 수행되었다. 항-C5 IgG2/4인 HRA-06-H2-7은 0.1 M sodium bicarbonate buffer (pH 8.6)에서 희석되었고 항체 100 ng은 4 ℃에서 밤새 96-웰 플레이트에 코팅되었다. 각각의 웰은 100 ul의 트윈 20을 0.05 % 함유한 TBS 내 5 % 스킴 밀크 첨가에 의해 블록킹되었고 1시간 동안 37 ℃에서 배양되었다. 파지는 6% BSA/PBS에서 2배로 희석되었고 희석된 50 ul 파지는 각각에 웰에 첨가되었고 37 ℃에서 2시간동안 배양되었다. 플레이트는 세척되고, 50 ul의 희석된 HRP-결합된 항-M13 항체 (1:5000)가 첨가되었으며 1시간동안 37 ℃에서 배양되었다. 플레이트를 세척한 후에 50 ul ABTS 기질 용액이 각 웰에 첨가되었고 흡광도는 405 nm에서 측정되었다.
그 결과를 도 13 및 도 14에 나타내었다.
도 13의 A는 인간/마우스 하이브리드 MG4 도메인을 보여주고 있으며, 도 13의 B는 ELISA 결과를 나타낸다. 도 13에 나타낸 바와 같이, HRA-06-H2-7 항체는 베타쇄 서열을 기준으로 379 - 398의 아미노산 잔기 서열이 사람의 서열인 경우에 결합하였으며, 이는 항체의 해당 부분에 대한 결합 가능성을 보여준다.
도 14는 서열 결합 부위를 더 구체적으로 확인한 결과이다. 도 14의 A는 인간/마우스 하이브리드 MG4 도메인을 보여주고 있으며, 도 14의 B는 ELISA 결과를 나타낸다. 도 14에 나타낸 바와 같이, HRA-06-H2-7 항체는 베타쇄 서열을 기준으로 386 - 392의 아미노산 잔기 서열(MG4 도메인 서열 기준: 55-61 번째 아미노산 서열)이 사람의 서열인 경우에 결합하였으며, 이는 항체의 해당 부분에 대한 결합 가능성을 보여준다.

Claims (37)

  1. 보체 C5 단백질 베타쇄의 MG 4 도메인에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 보체 C5 단백질 베타쇄의 에피토프는 보체 C5 단백질 베타쇄의 332 내지 348번째 아미노산 잔기 서열 및/또는 386 내지 392번째 아미노산 잔기 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항에 있어서, 상기 보체 C5 단백질 베타쇄의 에피토프는 보체 C5 단백질 베타쇄의 332 내지 398번째 아미노산 잔기 서열 및/또는 350 내지 420번째 아미노산 잔기 서열에 포함되는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, 표 1 내지 6에 기재된 항체 중 어느 하나와 동일한 에피토프를 가지는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항에 있어서, 항체는 단일클론 항체인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제1항에 있어서, 항체는 인간 또는 인간화 항체인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제1항에 있어서, 항체는 IgG 이소형인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제1항에 있어서, 항체는 IgG2의 힌지(hinge)와 IgG4의 Fc의 융합단백질을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 11, 12, 21, 22, 31, 32, 41, 42, 51 또는 52에 95% 이상의 서열 동일성을 가지는 1개 이상의 상보성 결정 (CDR) 서열을 포함하는, 인간 C5 단백질에 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  10. 서열번호 1, 2, 3, 11, 12, 21, 22, 31, 32, 41, 42, 51 또는 52와 동일한 1개 이상의 중쇄 상보성 결정 서열을 포함하는, 인간 C5 단백질에 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  11. 서열번호 4, 5 또는 6과 동일한 1개 이상의 경쇄 상보성 결정 서열을 포함하는, 인간 C5 단백질에 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  12. 서열번호 1, 11, 21, 31, 41 및 51로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 CDR1, 서열번호 2, 12, 22, 32, 42 및 52로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 CDR2, 및 서열번호 3의 중쇄 CDR3을 포함하는, 인간 C5 단백질에 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  13. 제12항에 있어서, 서열번호 4, 5 및 6으로부터 선택되는 경쇄 CDR을 추가로 포함하는, 인간 C5 단백질에 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  14. 제13항에 있어서, 서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 중쇄 CDR3, 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2 및 서열번호 6의 경쇄 CDR3을 포함하는, 인간 C5 단백질에 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  15. 제13항에 있어서, 서열번호 11의 중쇄 CDR1, 서열번호 12의 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 중쇄 CDR3, 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2 및 서열번호 6의 경쇄 CDR3을 포함하는, 인간 C5 단백질에 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  16. 제13항에 있어서, 서열번호 21의 중쇄 CDR1, 서열번호 22의 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 중쇄 CDR3, 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2 및 서열번호 6의 경쇄 CDR3을 포함하는, 인간 C5 단백질에 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  17. 제13항에 있어서, 서열번호 31의 중쇄 CDR1, 서열번호 32의 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 중쇄 CDR3, 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2 및 서열번호 6의 경쇄 CDR3을 포함하는, 인간 C5 단백질에 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  18. 제13항에 있어서, 서열번호 41의 중쇄 CDR1, 서열번호 42의 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 중쇄 CDR3, 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2 및 서열번호 6의 경쇄 CDR3을 포함하는, 인간 C5 단백질에 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  19. 제13항에 있어서, 서열번호 51의 중쇄 CDR1, 서열번호 52의 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 중쇄 CDR3, 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2 및 서열번호 6의 경쇄 CDR3을 포함하는, 인간 C5 단백질에 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  20. 서열번호 7, 17, 27, 37, 47 또는 57에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 C5 단백질에 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  21. 서열번호 8에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 C5 단백질에 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  22. 서열번호 9, 19, 29, 39, 49 또는 59에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄를 포함하는, 인간 C5 단백질에 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  23. 서열번호 10에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄를 포함하는, 인간 C5 단백질에 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  24. 제20항에 있어서, 서열번호 8에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 추가로 포함하는, 인간 C5 단백질에 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  25. 제22항에 있어서, 서열번호 10에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄를 추가로 포함하는, 인간 C5 단백질에 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약학적 조성물.
  27. 서열번호 7, 17, 27, 37, 47 또는 57에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산.
  28. 서열번호 8에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산.
  29. 제27항 및/또는 제28항의 핵산을 포함하는 벡터.
  30. 제29항의 벡터를 포함하는 숙주세포.
  31. 보체 관련 질환의 치료가 필요한 대상체에게 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 치료학적으로 유효한 양을 투여하는 것을 포함하는, 보체 관련 질환의 치료 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 대상체는 인간인, 보체 관련 질환의 치료 방법.
  33. 제32항에 있어서, 보체 관련 질환은 류마티스성 관절염(RA), 퇴행성 관절염, 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 허혈 및 재관류 이후의 원거리 조직 손상, 심폐 우회술 동안 보체 활성화, 피부근염, 천포창, 낭창성 신염, 사구체신염, 사구체혈관염, 심폐 바이패스, 심장마비-유도된 관상동맥 내피 기능 이상, 제II형 막증식성 사구체신염, 급성 신부전증, 항인지질 증후군, 황반 변성증, 안내염, 신혈관 질환, 동종이식, 초급성 거부반응, 혈액투석, 만성 폐쇄성 폐 호흡곤란 증후군 (COPD), 천식, 야간 혈색소뇨증(PNH) 및 흡인성 폐렴으로부터 선택되는, 보체 관련 질환의 치료 방법.
  34. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 및 용기를 포함하는 보체 관련 질환의 진단용 키트.
  35. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 이용한 보체 관련 질환의 예측 및 진단 방법.
  36. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 이용한 보체 관련 질환 치료 용도.
  37. 보체 관련 질환 치료용 약제의 제조를 위한 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도.
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