BRPI0619657A2 - métodos de prevenção ou melhoria de doença ocular, uso de um inibidor de complemento, uso de um sirna especìfico para uma proteìna do sistema complemento e uso de um ácido nucleico que codifica um inibidor do sistema complemento - Google Patents

Abstract

MéTODOS DE PREVENçãO OU MELHORIA DE DOENçA OCULAR, USO DE UM INIBIDOR DE COMPLEMENTO, USO DE UM siRNA ESPECìFICO PARA UMA PROTEìNA DO SISTEMA COMPLEMENTO E USO DE UM áCIDO NUCLEICO QUE CODIFICA UM INIBIDOR DO SISTEMA COMPLEMENTO. A presente invenção refere-se ao tratamento de condições e doenças oculares por meio da administração de inibidor de processos de complemento, particularmente inibidor de processos alternativos. As doenças oculares incluem degeneração macular relativa à idade, retinopatia diabética e angiogenese ocular. Uma realização compreende a administração de anticorpo anti-Fator D na forma de anticorpo inteiro, fragmento de Fab ou anticorpo de domínio único. Outros inibidores de componentes de complemento que podem ser úteis no presente método incluem Fator H ou inibidores que bloqueiam a adição de properdin, fator B, fator Ba, fator Bb, C2, C2a, C3a, C5, C5a, C5b, C6, C7, 08, 09 ou C5b-9.

Description

"MÉTODOS DE PREVENÇÃO OU MELHORIA DE DOENÇA OCULAR, USO DE UM INIBIDOR DE COMPLEMENTO, USO DE UM siRNA ESPECÍFICO PARA UMA PROTEÍNA DO SISTEMA COMPLEMENTO E USO DE UM ÁCIDO NUCLEICO QUE CODIFICA UM INIBIDOR DO SISTEMA

COMPLEMENTO " Campo da Invenção A presente invenção refere-se à inibição do sistema complemento, particularmente Fator D, em pacientes que sofrem de condições e doenças oculares associadas à ativação de complemento, tais como degeneração macular relativa à idade e retinopatia diabética.

Antecedentes da Invenção Degeneração macular é uma expressão clínica que é utilizada para descrever uma família de doenças que são caracterizadas por perda progressiva da visão central associada a anormalidades da membrana de Bruch, coróide, retina neural e/ou epitélio de pigmento da retina. No centro da retina, encontra-se a mácula lútea, que possui cerca de 1/3 a Vz cm de diâmetro. A mácula fornece visão detalhada, particularmente no centro (a fóvea), pois os cones possuem densidade mais alta. Vasos sangüíneos, células de gânglios, células e camada nuclear interna e as camadas plexiformes são todas deslocadas para um lado (em vez de repousar sobre elas), de forma a oferecer à luz um trajeto mais direto para os cones. Sob a retina, encontra-se a coróide, coleção de vasos sangüíneos embutidos em tecido fibroso, e o epitélio pigmentado (PE), que se sobrepõe à camada de coróide. Os vasos sangüíneos coroidais fornecem nutrição para a retina (particularmente as suas células visuais). A coróide e o PE são encontrados na parte posterior do olho.

As células do epitélio de pigmento da retina (RPE), que compõem o PE, produzem, armazenam e transportam uma série de fatores que são responsáveis pela função normal e sobrevivência de fotorreceptores. Estas células multifuncionais transportam metabólitos para os fotorreceptores a partir do seu fornecimento de sangue, os coriocapilares do olho. Células RPE também funcionam como macrófagos, fagocitando as extremidades dos segmentos externos de bastonetes e cones, que são produzidos no curso normal de fisiologia celular. Diversos íons, proteínas e água movem-se entre as células RPE e o espaço interfotorreceptor e essas moléculas, por fim, efetuam o metabolismo e a viabilidade dos fotorreceptores.

Degeneração macular relativa à idade (AMD), a degeneração macular mais freqüente, é associada à perda progressiva de acuidade visual na parte central do campo visual, alterações da visão das cores e sensibilidade e adaptação ao escuro anormais. Duas manifestações clínicas principais de AMD foram descritas como a forma seca, ou atrófica, e a forma úmida, ou exsudativa. A forma seca é associada à morte das células atróficas da retina central ou mácula, que é necessária para a visão fina utilizada para atividades tais como leitura, dirigir ou reconhecimento de faces. Cerca de 10 a 20% desses pacientes com AMD progridem para a segunda forma de AMD, conhecida como AMD úmida.

AMD úmida (neovascular/exsudativa) é causada pelo crescimento anormal de vasos sangüíneos abaixo da retina sob a mácula e vazamento vascular, resultando em deslocamento da retina, hemorragia e formação de cicatrizes. Isso resulta em deterioração da visão ao longo de período de meses até anos. Os pacientes podem sofrer, entretanto, rápida perda de visão. Todos os casos de AMD úmida são originados de AMD seca avançada. A forma úmida representa 85% da cegueira devido a AMD. Em AMD úmida, à medida que os vasos sangüíneos deixam vazar fluido e sangue, forma-se tecido de cicatriz que destrói a retina central.

Os fatores de risco mais significativos para o desenvolvimento das duas formas são a idade e a deposição de Drusen, depósitos extracelulares anormais, atrás do epitélio do pigmento da retina. Drusen causa estiramento lateral da monocamada de RPE e deslocamento físico do RPE a partir do seu fornecimento vascular imediato, a coriocapilar. Este deslocamento cria uma barreira física que pode impedir a difusão de resíduos e metabólitos normais entre o coriocapilar e a retina. Drusen são os depósitos iniciais associados à AMD. A biogênese de drusen envolve a disfunção de RPE, dificuldades de ingestão de segmentos externos fotorreceptores e subseqüente acúmulo de fragmentos. Drusen contém ativadores de complementos, inibidores, fragmentos de complementos específicos de ativação e componentes de trajetos terminais, que incluem o complexo de ataque a membranas (MAC ou C5b- 9), o que sugere que a concentração focai destes materiais pode produzir potente estímulo quimiotático para leucócitos que atuam por meio de cascata de complemento (Killingsworth et al (2001), Exp. Eye Res. 73, 887-96). Estudos recentes implicaram inflamações locais e ativação da cascata de complemento na sua formação (Bok, D., Proc. Natl. Acad. Sei. (U. S. A.) 2005; 102: 7053-4; Hageman, G. S. et a!, Prog. Retin Eye Res. 2001; 20: 705-32; Anderson, D. H. etal, Am. J. Ophthalmol. 2002; 134: 411-31, Johnson, L. V. etal, Exp Eye Res. 2001; 73: 887-96).

AMD úmida é associada à neovascularização coroidal (CNV) e é um processo biológico complexo. A patogênese da formação de novos vasos coroidais é mal compreendida, mas fatores tais como inflamações, isquemia e produção local de fatores angiogênicos são considerados importantes. Embora tenha se sugerido que inflamações desempenham papel, o papel do complemento não foi explorado. Um estudo preliminar de CNV demonstrou ser causada por ativação de complemento em modelo de camundongo (Bora, P. S., J. Immunol. 2005; 174: 491-497).

O sistema de complemento é componente fundamental da imunidade inata contra infecções microbianas e compreende grupo de proteínas que normalmente estão presentes no soro em estado inativo. Estas proteínas são organizadas em três vias de ativação: as vias clássica, de lectina e alternativa (V. M. Holers, em Clinical Immunology: Principies and Practice, ed., R. R. Rich, Mosby Press; 1996, 363-391). Moléculas sobre a superfície de micróbios podem ativar estas vias, resultando na formação de complexos de protease conhecidos como C3-convertases. A via clássica é uma cascata dependente de cálcio e magnésio, que normalmente é ativada pela formação de complexos de antígeno e anticorpo. Ela pode também ser ativada de forma independente de anticorpos pela ligação de proteína C-reativa em complexo com ligante e por vários patógenos que incluem bactérias gram-negativas. A via alternativa é uma cascata dependente de magnésio que é ativada por meio de deposição e ativação de C3 sobre certas superfícies suscetíveis (tais como polissacarídeos de parede celular de leveduras e bactérias e certos materiais biopoliméricos).

A via alternativ a parti cipa da amplificação da atividade da via clássica e da via de lectina (Suankratay, C., ibid; Farries, T. C. et al, Moi Immunol. 27: 1155-1161 (1990)). A ativação do sistema complemento gera fragmentos biologicamente ativos de proteínas de complemento, tais como anafilatoxinas C3a, C4a e C5a e complexos de ataque a membrana C5b-9 (MAC), que mediam reações inflamatórias por meio do envolvimento de quimiotaxia de leucócitos, ativação de macrófagos, neutrófilos, plaquetas, células mastro e células endoteliais, maior permeabilidade vascular, citólise e lesões aos tecidos.

Fator D pode ser alvo apropriado para a inibição desta amplificação das vias de complemento, pois a sua concentração plasmática em seres humanos é muito baixa (1,8 μg/ml) e demonstrou-se que é a enzima limitadora para a ativação da via de complemento alternativa (Ρ. H. Lesavre e H. J. Müller-Eberhard, J. Exp. Med., 1978; 148: 1498-1510; J. E. Volanakis et al, New Eng. J. Med., 1985; 312: 395-401). Demonstrou-se que a inibição da ativação de complemento é eficaz no tratamento de várias indicações de doenças utilizando modelos animais e em estudos ex vivo, tais como eritematose do lúpus sistêmico e glomerulonefrite (Y. Wang et al, Proc. Nati Acad, Scl·, 1996, 93: 8563-8568).

Utilizando análise de polimorfismo de nucleotídeo isolado (SNP) de pacientes com AMD, concluiu-se que variante genética Fator H (Y402H) é altamente associada à maior incidência de AMD (Zareparsi, S., Branham Κ. E. H., Li, M. et al, Am. J. Hum. Genet. 2005; 77: 149-53; Haines1 J. L. et al, Sei. 2005; 208: 419-21). Pessoas que são homozigóticas ou heterozigóticas para esta mutação pontual de gene Fator H podem representar 50% dos casos de AMD. Fator H é o principal inibidor solúvel da via de complemento alternativa (Rodriguez de Córdoba, S. et al, MoL Immunol. 2004; 41: 355-67). Ele se liga a C3b e, desta forma, acelera a deterioração da via alternativa C3-convertase (C3bBb) e age como cofator para a desativação proteolítica mediada por Fator I de C3b. Estudos de manchas histoquímicas demonstram que existe distribuição similar de Fator H e MAC na interface entre RPE e coróide. Quantidades significativas de MAC depositado nesta interface encontrada em pacientes com AMD indicam que o haplotipo Fator H (Y402H) pode haver atenuado a função inibidora de complemento. Especula-se que Fator H (Y402H) pode possuir afinidade de ligação mais baixa para C3b. Portanto, ele não é tão eficaz quanto Fator H do tipo selvagem na inibição da ativação da via de complemento alternativa. Isso coloca células de coróides e RPE em risco sustentado para ataque de complemento mediado por vias alternativas.

Demonstrou-se que a falta de Fator H no plasma causa ativação descontrolada da via alternativa com consumo de C3 e, freqüentemente, outros componentes de complementos terminais tais como C5. Ao manter esta descoberta,os níveis plasmáticos de Fator H conhecidamente são reduzidos com o fumo, fator de risco conhecido para AMD (Esparza-Gordillo, J. et al, Immunogenetics, 2004; 56: 77-82).

Atualmente, não há terapia médica comprovada para AMD seca e nenhum tratamento é disponível para AMD seca avançada. Em casos selecionados de AMD úmida, método conhecido como fotocoagulação a laser pode ser eficaz para vedar vasos sangüíneos que sangram ou vazam. Infelizmente, fotocoagulação a laser normalmente não restaura a visão perdida, mas meramente retarda e, em alguns casos, evita perdas adicionais. Recentemente, demonstrou-se que terapia fotodinâmica é eficaz para suspender o crescimento anormal de vasos sangüíneos em cerca de um terço de pacientes com AMD úmida quando tratados precocemente. Em Terapia Fotodinâmica de Visdyne (PDT), um corante é injetado no olho do paciente, acumula-se na área de vazamento de vasos na retina e, quando exposta a laser de baixa potência, reage vedando os vasos com vazamentos. Além destes dois métodos a laser, existem várias terapias antiangiogênese voltadas para Fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) sendo desenvolvidas para o tratamento de AMD úmida. Apenas 10% dos pacientes tratados, entretanto, exibem melhoria da visão.

Em vista destes tratamentos inadequados para AMD úmida e da falta total de tratamentos disponíveis para AMD seca avançada, existe clara necessidade de desenvolvimento de novos tratamentos para esta séria doença. A presente invenção fornece abordagem inovadora para o tratamento desta séria doença.

Descrição Resumida da Invenção

A presente invenção refere-se a inibidores de complemento para o tratamento de condições ou doenças oculares, tais como degeneração macular relativa à idade (AMD), retinopatia diabética, angiogênese ocular (tal como neovascularização ocular que afeta tecido coroidal, da córnea ou da retina) e outras condições oculares que envolvem a ativação de complementos. O tratamento de AMD inclui as formas úmida e seca de AMD.

Os inibidores de complemento de acordo com a presente invenção incluem, mas sem limitar-se aos que inibem a via de complemento alternativa, tais como Fator D, properdina, Fator B, Fator Ba e Fator Bb, e a via de complemento clássica, tal como C3a, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9 e C5b- 9. A presente invenção também inclui o uso de inibidores de complementos em combinação com outros agentes, tais como agentes antiangiogênicos e agentes antiinflamatórios, tais como esteróides.

Outra realização da presente invenção refere-se ao uso de inibidores de C5aR e C3aR, tais como anticorpos e fragmentos derivados e construções de domínio único, bem como compostos de moléculas pequenas.

Outra realização da presente invenção refere-se ao uso de C R1 solúvel recombinante (TP10) e suas proteínas derivadas; uso de moléculas inibidoras de C3 (tais como compstatin, peptideomimético que liga e inibe a ativação de C3); siRNAs que bloqueiam a síntese de C3, C5, FD, fator P e fator B.

Estes inibidores podem ser, mas sem limitar-se a compostos químicos de moléculas pequenas, nucleotídeos, peptídeos, proteínas, peptideomiméticos e anticorpos.

Outra realização da presente invenção inclui o uso de Fator H humano purificado a partir de sangue humano ou fator H humano recombinante administrado a pacientes de forma intraocular ou por meio de qualquer outra via clinicamente eficaz.

Os anticorpos de acordo com a presente invenção incluem imunoglobulinas inteiras, scFv, Fab, Fab', Fv, F(ab')2 ou dAb. Anticorpos de domínio compreendem domínio VH ou domínio VL.

Uma realização da presente invenção é o uso de anticorpo monoclonal que se liga a Fator D e bloqueia a sua capacidade de ativação da via de complemento alternativa. Esses anticorpos são descritos em WO 01/70818 e US 20020081293, que são incorporadas ao presente como referência, tais como anticorpo monoclonal 166-32 produzido a partir do hibridoma depositado junto à ATCC e denominado HB12476. A presente invenção também inclui anticorpos que se ligam especificamente ao mesmo epítopo do anticorpo monoclonal 166-32. Anticorpos monoclonais de acordo com a presente invenção podem também incluir os anticorpos humanizados do pedido copendente n°_, que é incorporado ao presente como referência.

Uma realização da presente invenção é o uso de um anticorpo monoclonal que se liga ao componente de complemento C5a. Esses anticorpos incluem o anticorpo 137-26 produzido a partir do hibridoma depositado junto à ATCC e denominado PTA-3650 e qualquer anticorpo que se una especificamente ao mesmo epítopo de 137-26.

Segundo a presente invenção, o inibidor de sistema complemento pode ser administrado por meio de (a) administração parenteral; (b) implante de liberação prolongada biocompatível ou que pode sofrer bioerosão; (c) implante de bomba de infusão; ou (d) administração local, tal como administração subconjuntiva ou por meio de administração intravítrea. O inibidor de complemento pode também ser administrado por meio de administração parenteral selecionada a partir de administração oral, administração enteral e administração local. A administração local pode incluir solução de lavagem ocular, ungüento para os olhos, proteção para os olhos ou solução de colírio.

Além disso, o inibidor de complemento de acordo com a presente invenção pode ser administrado em combinação com composto imunomodulador ou imunossupressivo.

Outra realização da presente invenção refere-se à administração de construções de ácido nucleico que são capazes de expressar os inibidores do sistema complemento para terapia genética.

Outra realização da presente invenção inclui método de seleção de inibidores de complementos que são úteis no tratamento de AMD que compreende o uso de modelo de AMD em camundongos com deficiência de Ccl-2 ou Ccr-2 senescentes. Estes camundongos manifestam alterações histopatológicas similares encontradas em AMDs secas e úmidas humanas.

Estes camundongos podem ser tratados com inibidores de complemento ou Fator H por via intravítrea. Exame histológico pode ser realizado para determinar proteção contra o desenvolvimento de AMD em camundongos tratados com os agentes a serem testados.

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção não se limita à metodologia específica, protocolos, linhagens celulares, vetores ou reagentes descritos no presente porque eles podem variar. Além disso, a terminologia utilizada no presente destina-se ao propósito de descrever apenas realizações específicas e não se destina a limitar o escopo da presente invenção. Da forma utilizada no presente e nas reivindicações anexas, as formas no singular "um", "uma" e "o/a" incluem referência ao plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário; referência a "uma célula hospedeira", por exemplo, inclui uma série dessas células hospedeiras.

A menos que definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos e quaisquer acrônimos utilizados no presente possuem os mesmos significados comumente compreendidos pelos técnicos comuns no assunto, no campo da presente invenção. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos no presente possam ser utilizados na prática da presente invenção, os exemplos de métodos, dispositivos e materiais são descritos no presente.

Todas as patentes e publicações mencionadas no presente são incorporadas ao presente como referência até o ponto permitido por lei para fins de descrição e revelação das proteínas, enzimas, vetores, células hospedeiras e metodologias ali relatadas que poderão ser utilizadas com a presente invenção. Nada no presente deve ser considerado, entretanto, admissão de que a presente invenção não está propensa a antecipar essa descrição em virtude de invenção anterior.

DEFINICOES

A expressão "variante de seqüência de aminoácidos" designa polipeptídeos que contêm seqüências de aminoácidos que diferem, até certo ponto, de polipeptídeo de seqüência nativa. Normalmente, variantes de seqüências de aminoácidos possuirão pelo menos cerca de 70% de homologia, pelo menos cerca de 80% ou pelo menos cerca de 90% de homologia para o polipeptídeo nativo. As variantes de seqüências de aminoácidos possuem substituições, exclusões e/ou inserções em certas posições na seqüência de aminoácidos da seqüência de aminoácidos nativa.

A expressão "identidade" ou "homologia" é definida como o percentual de resíduos de aminoácidos na possível seqüência que são idênticos ao resíduo de seqüência correspondente com a qual é comparada, após alinhamento das seqüências e introdução de lacunas, se necessário para atingir o máximo de identidade percentual para a seqüência completa, sem considerar nenhuma substituição conservadora como parte da identidade de seqüências. Nem inserções, nem extensões N ou C-terminais deverão ser interpretadas como reduzindo a identidade ou a homologia. Métodos e programas de computador para o alinhamento são bem conhecidos na técnica. A identidade de seqüências pode ser facilmente calculada por meio de métodos conhecidos, que incluem, mas sem limitar-se aos descritos em Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nova lorque, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nova Iorque, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A. M. e Griffin1 H. G., eds., Humana Press, Nova Jérsei, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; e Sequence Analysis Primer, Gribskov1 M. e Devereux, J., eds., M. Stockton Press, Nova Iorque, 1991; e Carillo, 30 H. e Lipman, D., SIAM J., Applied Math., 48: 1073 (1988). Métodos de determinação da identidade são projetados para fornecer a maior coincidência entre as seqüências testadas. Métodos de programas de computador para determinar a identidade entre duas seqüências incluem, mas sem limitar-se ao pacote de programas GCG (Devereux, J. et al, Nucleic Acids Research 12 (1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN e FASTA (Atschul, S. F. et al, J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990). O programa BLASTX é disponível ao público por meio da NCBI e outras fontes (BLAST Manual, Altschul, S. et al, NCBI NLM NIH, Bethesda MD 20894, Altschul, S. et al, J. Moi Biol. 215: 403- 410 (1990)). O algoritmo Smith Waterman bem conhecido pode também ser utilizado para determinar a identidade.

O termo "anticorpo" é utilizado no presente no sentido mais amplo e cobre especificamente anticorpos monoclonais intactos, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (tais como anticorpos biespecíficos) formados a partir de pelo menos dois anticorpos intactos e fragmentos de anticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada.

A expressão "anticorpo monoclonal", da forma utilizada no presente, designa anticorpo obtido a partir de população de anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos, exceto por possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em quantidades menores. Ao contrário das preparações de anticorpos policlonais que incluem diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante sobre o antígeno. O adjetivo "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido a partir de população de anticorpos substancialmente homogênea e não deve ser considerado como exigindo a produção do anticorpo por meio de qualquer método específico. Os anticorpos monoclonais a serem utilizados de acordo com a presente invenção podem ser preparados, por exemplo, por meio do método de hibridoma descrito em primeiro lugar por Kohler etal, Nature, 256:495 (1975), ou podem ser fabricados por meio de métodos de DNA recombinante (vide, por exemplo, a Patente Norte-Americana n° 4.816.567). Os "anticorpos monoclonais" podem também ser isolados a partir de bibliotecas de anticorpos de fagos, utilizando as técnicas descritas, por exemplo, em Clackson etal, Nature, 352: 624-628 (1991) e Marks etal, J. Mol. Bioi, 222: 581-597 (1991).

Os anticorpos monoclonais do presente incluem especificamente anticorpos "quiméricos", em que uma parte da cadeia leve e/ou pesada é idêntica ou homóloga a seqüências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie específica ou pertencentes a uma classe ou subclasse específica de anticorpos, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo a seqüências correspondentes em anticorpos derivados de outras espécies ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos desses anticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada (Patente Norte-Americana n° 4.816.567; Morrison et al, Proc. Nati Acad. Sei. U. S. A., 81: 6851-6855 (1984)).

"Fragmentos de anticorpos" compreendem uma parte de anticorpo intacto, que compreende a sua região variável ou de ligação de antígenos. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem fragmentos de Fab, Fab', F(ab')2 e Fv; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpos de fita simples; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmento(s) de anticorpos.

Anticorpo "intacto" é aquele que compreende região variável de ligação de antígenos, bem como domínio constante de cadeia leve (Cl) e domínios constantes de cadeia pesada Ch1 , Ch2 e CH3. Os domínios constantes podem ser domínios constantes de seqüência nativa (tais como domínios constantes de seqüência nativa humana) ou sua variante de seqüência de aminoácidos. O anticorpo intacto pode conter uma ou mais funções efetoras.

"Funções efetoras" de anticorpo designam as atividades biológicas que podem ser atribuídas à região Fc (região Fc de seqüência nativa ou região Fc com variação de seqüência de aminoácidos) de um anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpos incluem ligação de C1q, citotoxicidade dependente de complemento, ligação de receptor Fc; citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC); fagocitose; e regulagem para baixo de receptores da superfície celular (tais como receptor de células B e BCR) etc.

Dependendo da seqüência de aminoácidos do domínio constante das suas cadeias pesadas, anticorpos intactos podem ser atribuídos a "classes" diferentes. Existem cinco classes principais de anticorpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM1 e várias delas podem ser adicionalmente divididas em subclasses (isotipos), tais como lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA e lgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de anticorpos são denominados α, δ, ε, γ e μ, respectivamente. As estruturas de subunidades e configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas.

"Citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos" (ADCC) designa reação mediada por células na qual células citotóxicas não específicas que expressam receptores de Fc (FcRs) (tais como células Matadoras Naturais (NK)1 neutrófilos e macrófagos) reconhecem anticorpo ligado sobre célula alvo e, em seguida, causam Iise da célula alvo. As células primárias para a mediação de ADCC, células NK, expressam unicamente FcyRIII1 enquanto monócitos expressam FcyRI1 FcyRII e FcyRIII. Expressão de FcR sobre células hematopoiéticas. Para determinar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse, pode-se realizar teste de ADCC in vitro, tal como descrito nas Patentes Norte-Americanas η° 5.500.362 ou 5.821.337. As células efetoras úteis para estes testes incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e células Matadoras Naturais (NK). Alternativa ou adicionalmente, a atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser determinada in vivo, tal como em modelo animal.

Vários desses modelos são disponíveis.

O termo "variável" indica o fato de que certas partes dos domínios variáveis diferem extensamente de seqüência entre os anticorpos e são utilizadas na ligação e especificidade de cada anticorpo específico para o seu antígeno específico. A capacidade de variação não é, entretanto, distribuída regularmente ao longo de todos os domínios variáveis de anticorpos. Ela é concentrada em três segmentos denominados regiões hipervariáveis, tanto nos domínios variáveis de cadeia leve quanto de cadeia pesada. Estas regiões hipervariáveis são também denominadas regiões de determinação de complementaridade ou CDRs. As partes mais altamente conservadas dos domínios variáveis são denominadas regiões de estrutura (FRs). Os domínios variáveis de cadeias leve e pesada nativas compreendem quatro FRs cada um, adotando em grande parte configuração de folha β, conectadas por três regiões hipervariáveis, que formam laços que conectam e, em alguns casos, fazem parte da estrutura de folha β. As regiões hipervariáveis de cada cadeia são mantidas juntas em boa proximidade pelas FRs e, com as regiões hipervariáveis da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação de antígenos de anticorpos (vide Kabat et al (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda MD).

A expressão "região hipervariável", quando utilizada no presente, designa os resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis pela ligação de antígenos. A região hipervariável compreende geralmente resíduos de aminoácidos de uma "região de determinação de complementaridade" ou "CDR" (tal como resíduos 24 a 34 (L1), 50 a 56 (L2) e 89 a 97 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 31 a 35 (H1), 50 a 65 (H2) e 95 a 102 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Kabat et a/, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda MD (1991)) e/ou os resíduos de "circuito hipervariável" (tais como os resíduos 26 a 32 (L1), 50 a 52 (L2) e 91 a 96 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 26 a 32 (H1), 53 a 55 (H2) e 96 a 101 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Chothia e Lesk (1987), J. Moi Biol., 196: 901-917 (1987)). Resíduos de "região de estrutura" ou "FR" são os de domínios variáveis diferentes dos resíduos de região hipervariável conforme definido no presente.

A digestão de anticorpos por papaína produz dois fragmentos de ligação de antígenos idênticos, denominados fragmentos "Fab", cada qual com um único sítio de ligação de antígenos, e um fragmento "Fc" residual, cujo nome reflete a sua capacidade de rápida cristalização. O tratamento com pepsina gera um fragmento de F(ab')2 que contém dois sítios de ligação de antígenos e ainda é capaz de reticular antígeno.

O fragmento Fab também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Os fragmentos de Fab' diferem de fragmentos de Fab pela adição de alguns resíduos no terminal carbóxi do domínio CH1 de cadeia pesada, que inclui uma ou mais cisteínas da região de articulação do anticorpo. Fab'-SH é a denominação do presente para Fab', em que o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes contém(êm) pelo menos um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpos F(ab')2 foram originalmente produzidos na forma de pares de fragmentos de Fab' que contêm cisteínas de articulação entre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpos também são conhecidos.

As "cadeias leves" de anticorpos de qualquer espécie vertebrada podem ser atribuídas a um dentre dois tipos claramente distintos, denominados capa (κ) e Iambda (λ), com base nas seqüências de aminoácidos dos seus domínios constantes.

"Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um sítio de reconhecimento e de ligação de antígenos completo. Esta região consiste de um dímero de um domínio variável de cadeia pesada e um de cadeia leve em associação firme e não covalente. É nesta configuração que as três regiões hipervariáveis de cada domínio variável interagem para definir um sítio de ligação de antígenos sobre a superfície do dímero Vh-Vl- Coletivamente, as seis regiões hipervariáveis conferem especificidade de ligação de antígenos ao anticorpo. Entretanto, mesmo um domínio variável isolado (ou a metade de um Fv que compreende apenas três regiões hipervariáveis específicas para um antígeno) possui a capacidade de reconhecer e ligar antígeno, embora em afinidade mais baixa que o sítio de ligação completo.

Fragmentos de anticorpos "Fv de fita simples" ou "scFv" compreendem os domínios Vh e Vl de anticorpo, em que esses domínios estão presentes em uma única cadeia de polipeptídeo. Preferencialmente, o polipeptídeo Fv compreende adicionalmente um Iigante de polipeptídeo entre os domínios Vh e Vl que permite que o scFv forme a estrutura desejada para ligação de antígenos. Para análise de scFv, vide Plückthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., Springer-Verlag, Nova Iorque, págs. 269-315 (1994). Fragmentos de scFv de anticorpo anti- ErbB2 são descritos em WO 93/16185; Patente Norte-Americana n° 5.571.894; e Patente Norte-Americana n° 5.587.458.

O termo "diacorpos" designa pequenos fragmentos de anticorpos com dois sítios de ligação de antígenos, que compreendem um domínio pesado variável (Vh) conectado a um domínio leve variável (Vl) na mesma cadeia de polipeptídeo (Vh - VL). Utilizando Iigante que é curto demais para permitir o pareamento entre os dois domínios sobre a mesma cadeia, os domínios são forçados a parear-se com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois sítios de ligação de antígenos. Os diacorpos são descritos mais completamente, por exemplo, em EP 404.097, WO 93/11161 e Hollinger et al (1993), Proc. Nati Acad. Sei. U. S. A. 90: 6444-6448.

"Anticorpo de domínio único" é sinônimo de "dAb" e designa polipeptídeo com região variável de imunoglobulina em que a ligação de antígenos é efetuada por um único domínio de região variável. "Anticorpo de domínio único", da forma utilizada no presente, inclui i) anticorpo que compreende domínio variável de cadeia pesada (VH) ou seu fragmento de ligação a antígenos, que forma sítio de ligação a antígenos independentemente de qualquer outro domínio variável; ii) anticorpo que compreende domínio variável de cadeia leve (VL) ou seu fragmento de ligação de antígenos, que forma sítio de ligação de antígenos independentemente de qualquer outro domínio variável; iii) anticorpo que compreende polipeptídeo de domínio VH ligado a outro polipeptídeo de domínio VH ou VL (tal como VH-VH ou VHx-VL), em que cada domínio V forma sítio de ligação de antígenos independentemente de qualquer outro domínio variável; e iv) anticorpo que compreende polipeptídeo de domínio VL ligado a outro polipeptídeo de domínio VL (VL-VL), em que cada domínio V forma sítio de ligação de antígenos independentemente de qualquer outro domínio variável. Da forma utilizada no presente, o domínio VL designa as formas capa e lambda das cadeias leves.

As formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo, de roedores) são anticorpos quiméricos que contêm seqüência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas nas quais os resíduos de região hipervariável são substituídos por resíduos de região hipervariável de espécie não humana tal como camundongo, rato, coelho ou primata não humano que possui a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, os resíduos de região de cadeia principal (FR) da imunoglobulina humana são encontrados no anticorpo humano nem no anticorpo não humano. Essas modificações são feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo.

Geralmente, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos dentre pelo menos um, tipicamente dois domínios variáveis, em que todos ou substancialmente todos os circuitos hipervariáveis correspondem aos de imunogiobuiina não humana e todas ou substancialmente todas as FRs são as de seqüência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado também compreenderá opcionalmente pelo menos uma parte de região constante de imunoglobulina (Fc)1 tipicamente a de imunoglobulina humana. Exemplos de tecnologia de humanização podem ser encontrados, por exemplo, em Queen et al, Patentes Norte-Americanas n° 5.585.089, 5.693.761, 5.693.762 e 6.180.370, que são incorporadas ao presente como referência.

Geração de anticorpos

Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser gerados por meio de qualquer método conhecido na técnica. Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem compreender anticorpos policlonais. Métodos de preparação de anticorpos policlonais são conhecidos dos técnicos no assunto (Harlow et al, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, segunda edição (1988), que é integralmente incorporado ao presente como referência).

Anticorpos podem ser gerados, por exemplo, por meio de administração de imunogene que compreende o antígeno de interesse a vários animais hospedeiros que incluem, mas sem limitar-se a coelhos, camundongos, ratos etc. para induzir a produção de soro que contém anticorpos policlonais específicos para o antígeno. A administração do imunogene pode utilizar uma ou mais injeções de agente imunizante e, se desejado, adjuvante. Vários adjuvantes podem ser utilizados para aumentar a reação imunológica, dependendo da espécie hospedeira, e incluem, mas sem limitar-se a Freund (completo e incompleto), géis minerais tais como hidróxido de alumínio, substâncias ativas na superfície tais como lisolecitina, polióis plurônicos, poliânions, peptídeos, emulsões em óleo, hemocianinas de conchas, dinitrofenol e adjuvantes humanos potencialmente úteis, tais como BCG (bacilo Calmette-Guerin) e Corynebacterium parvum. Exemplos adicionais de adjuvantes que podem ser empregados incluem o adjuvante MPL-TDM (monofosforil lipídio A, dicorinomicolato de trehalose sintético). Protocolos de imunização são bem conhecidos na técnica e podem ser realizados por meio de qualquer método que permita reação imunológica no animal hospedeiro selecionado. Adjuvantes também são bem conhecidos na técnica.

Tipicamente, o imunogene (com ou sem adjuvante) é injetado no mamífero por meio de diversas injeções subcutâneas ou intraperitoneais, por via intramuscular ou intravenosa. O imunogene pode incluir polipeptídeo antigênico, proteína de fusão ou suas variantes. Dependendo da natureza dos polipeptídeos (ou seja, percentual de hidrofobicidade, percentual de hidrofilicidade, estabilidade, carga líquida, ponto isoelétrico etc.), pode ser útil conjugar o imunogene a proteína conhecidamente imunogênica no mamífero sendo imunizado. Essa conjugação inclui conjugação química por meio de derivação de grupos funcionais químicos ativos para o imunogene e a proteína imunogênica a ser conjugada, de maneira a formar ligação covalente, ou por meio de metodologia com base em proteínas de fusão ou outros métodos conhecidos dos técnicos no assunto. Exemplos dessas proteínas imunogênicas incluem, mas sem limitar-se a hemocianina de conchas, ovoalbumina, albumina de soro, tiroglobulina bovina, inibidor de tripsina de soja e peptídeos auxiliares T promíscuos. Vários adjuvantes podem ser utilizados para aumentar a reação imunológica conforme descrito acima.

Os anticorpos úteis na presente invenção compreendem anticorpos monoclonais. Anticorpos monoclonais podem ser preparados utilizando tecnologia de hibridoma, tal como a descrita por Kohler e Milstein1 Nature, 256: 495 (1975), e pela Patente Norte-Americana n° 4.376.110 de Harlow et al, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press), segunda edição suplementar (1988), por Hammerling et al, Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas (Elsevier NY (1981)) ou outros métodos conhecidos dos técnicos no assunto. Outros exemplos de métodos que podem ser empregados para a produção de anticorpos monoclonais incluem, mas sem limitar- se ao método de hibridoma de células B humanas (Kosbor et al, 1983, Immunology Today 4: 72; Cole et al, 1983, Proc. NatL Acad. Sei. U. S. A. 80: 2026-2030) e o método de EBV-hibridoma (Cole et al, 1985, Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., págs. 77-96). Esses anticorpos podem ser de qualquer classe de imunoglobulina, incluindo IgG, IgM1 IgE, IgA, IgD e qualquer de suas subclasses. O hibridoma que produz os anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser cultivados in vitro ou in vivo.

Utilizando métodos de hibridoma típicos, hospedeiro tal como camundongo, camundongo humanizado, camundongo com sistema imunológico humano, hamster, coelho, camelo ou qualquer outro animal hospedeiro apropriado é tipicamente imunizado com imunogene para gerar linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que se ligarão especificamente ao antígeno de interesse. Alternativamente, linfócitos podem ser imunizados in vitro com o antígeno.

Geralmente, ao elaborar hibridomas que produzem anticorpos, linfócitos do sangue periféricos ("PBLs") são utilizados caso se deseje células de origem humana, ou são utilizadas células do baço ou células dos nódulos linfáticos caso se deseje fontes mamíferas não humanas. Os linfócitos são fundidos em seguida com linhagem de células imortalizadas utilizando agente de fusão apropriado, tal como polietileno glicol, para formar célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic Press (1986), págs. 59-103). Linhagens de células imortalizadas são normalmente células de mamíferos transformadas, particularmente células de mieloma de origem em roedores, bovinos ou humanos. Tipicamente, é empregada linhagem de células de mieloma de rato ou camundongo. As células de hibridoma podem ser cultivadas em meio de cultura apropriada que preferencialmente contém uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevivência das células imortalizadas não fundidas. Caso as células parentais não contenham a enzima hipoxantino guanino fosforibosil transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas incluirá tipicamente hipoxantina, aminopterina e timidina ("meio HAT"), substâncias que evitam o crescimento de células com deficiência de HGPRT.

Linhagens de células imortalizadas preferidas são as que se fundem eficientemente, sustentam expressão de alto nível estável de anticorpo pelas células produtoras de anticorpos selecionadas e são sensíveis a meio tal como meio HAT. Linhagens imortalizadas de maior preferência são linhagens de mieloma murino, que podem ser obtidas, por exemplo, por meio do Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego CA e da American Tyoe Culture Colection, Manassas VA. Linhagens de células de heteromieloma humano-de camundongos e mieloma humano podem também ser utilizadas para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al, Monoclonal Antibody Produetion Teehniques and Applications, Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque (1987), págs. 51-63).

O meio de cultura em que são cultivadas células de hibridoma é testado para determinar a produção de anticorpos monoclonais dirigidos contra o imunogene. A especificidade de ligação de anticorpos monoclonais produzidos pelas células de hibridoma é determinada por meio de imunoprecipitação ou de teste de ligação in vitro, tal como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunossorvente ligado por enzimas (ELISA). Estes métodos são conhecidos na técnica e encontram-se dentro do conhecimento dos técnicos no assunto. A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode ser determinada, por exemplo, por meio da análise Scatchard (Munson et al, Anal. Biochem. 107: 220 (1980)).

Após a identificação das células de hibridoma desejadas, os clones podem ser subclonados por meio de procedimentos de diluição limitadora e cultivados por meio de métodos padrão (Goding, acima). Meios de cultura apropriadas para este propósito incluem, por exemplo, Meio Eagle modificado da Dulbecco e RPMI-1640. Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones podem ser isolados ou purificados a partir do meio de cultura por procedimentos de purificação de imunoglobulina convencionais, tais como proteína A-sepharose, cromatografia de hidroxiapatita, cromatografia de exclusão de gel, eletroforese de gel, diálise ou cromatografia de afinidade.

Existe na técnica uma série de métodos de produção de anticorpos monoclonais e, portanto, a presente invenção não é limitada à sua produção exclusiva em hibridomas. Os anticorpos monoclonais podem ser elaborados, por exemplo, por meio de métodos de DNA recombinante, tais como os descritos na Patente Norte-Americana n° 4.816.567. Neste contexto, a expressão "anticorpo monoclonal" designa anticorpo derivado de clone eucariótico, de fago ou procariótico isolado. O DNA que codifica os anticorpos monoclonais de acordo com a presente invenção pode ser facilmente isolado e seqüenciado utilizando procedimentos convencionais (empregando, por exemplo, sondas de oligonucleotídeos que sejam capazes de ligar-se especificamente a genes que codificam as cadeias leve e pesada de anticorpos murinos, ou cadeias de fontes humanas, humanizadas ou outras). As células de hibridoma de acordo com a presente invenção servem de fonte preferida desse DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são transformados em seguida em células hospedeiras tais como células NSO, células COS de símios, células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células de mieloma que, de outra forma, não produzem proteína de imunoglobulina, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. O DNA pode também ser modificado, por exemplo, por meio de substituição da seqüência de codificação para domínios constantes de cadeia leve e pesada humana no lugar das seqüências murinas homólogas (Patente Norte-Americana n° 4.816.567; Morrison et al, acima) ou por meio de ligação covalente à seqüência de codificação de imunoglobulina da seqüência de codificação de polipeptídeo não de imunoglobulina, no todo ou em parte. Esse polipeptídeo não de imunoglobulina pode ser substituído pelos domínios constantes de anticorpo de acordo com a presente invenção, ou pode ser substituído pelos domínios variáveis de um sítio de combinação de antígenos de anticorpo de acordo com a presente invenção para criar anticorpo bivalente quimérico.

Os anticorpos podem ser anticorpos monovalentes. Métodos de preparação de anticorpos monovalentes são bem conhecidos na técnica. Um método envolve, por exemplo, a expressão recombinante de cadeia leve de imunoglobulina e cadeia pesada modificada. A cadeia pesada geralmente é truncada em qualquer ponto da região Fc1 de forma a evitar retícula de cadeias pesadas. Alternativamente, os resíduos de cisteína relevantes são substituídos com outro resíduo de aminoácido ou são excluídos para evitar retícula.

Fragmentos de anticorpos que reconhecem epítopos específicos podem ser gerados por meio de métodos conhecidos. Fragmentos de Fab e F(ab')2 de acordo com a presente invenção podem ser produzidos, por exemplo, por meio de divisão proteolítica de moléculas de imunoglobulina, utilizando enzimas tais como papaína (para produzir fragmentos de Fab) ou pepsina (para produzir fragmentos de F(ab')2. Fragmentos de F(ab')2 contêm a região variável, a região constante de cadeia leve e o domínio CH1 da cadeia pesada.

Para algumas utilizações, incluindo o uso in vivo de anticorpos em seres humanos e testes de detecção in vitro, pode ser preferível utilizar anticorpos quiméricos, humanizados ou humanos. Anticorpo quimérico é molécula na qual diferentes partes do anticorpo são derivadas de diferentes espécies animais, tais como anticorpos que contêm região variável derivada de anticorpo monoclonal murino e região constante de imunoglobulina. Métodos de produção de anticorpos quiméricos são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Morrison1 Science 229: 1202 (1985); Oi et ai, BioTechniques 4: 214 (1986); Gillies et ai (1989), J. immunoi. Methods 125: 191-202; Patentes Norte- Americanas n° 5.807.715, 4.816.567 e 4.816.397, que são integralmente incorporadas ao presente como referência.

Anticorpos humanizados são moléculas de anticorpos geradas em espécie não humana que ligam o antígeno desejado que contém uma ou mais regiões de determinação de complementaridade (CDRs) da espécie não humana e regiões de cadeia principal (FR) de molécula de imunoglobulina humana. Freqüentemente, resíduos de cadeia principal nas regiões de cadeia principal humanas serão substituídos com o resíduo correspondente do anticorpo doador de CDR para alterar, preferencialmente aprimorar a ligação de antígenos. Estas substituições de cadeia principal são identificadas por meio de métodos bem conhecidos na técnica, tais como por meio de modelagem das interações de resíduos de cadeia principal e CDR para identificar resíduos de cadeia principal importantes para ligação de antígenos e comparação de seqüências para identificar resíduos de cadeia principal incomuns em posições específicas (vide, por exemplo, Queen et ai, Patente Norte-Americana n° 5.585.089; Riechmann et al, Nature 332: 323 (1988), que são integralmente incorporados ao presente como referência). Anticorpos podem ser humanizados utilizando uma série de métodos conhecidos na técnica, que incluem, por exemplo, enxerto de CDR (EP 239.400, Publicação PCT n0 WO 91/09967 e Patentes Norte-Americanas n° 5.225.539, 5.530.101 e 5.585.089), formação de nova superfície ou folheamento (EP 592.106; EP 519.596; Padlan, Molecular Immunology 28 (4/5): 489-498 (1991); Studnicka et al, Protein Engineering 7 (6): 805-814 (1994); Roguska et al, PNAS 91: 969-973 (1994)) e troca de cadeias (Patente Norte-Americana n° 5.565.332).

Geralmente, anticorpo humanizado contém um ou mais resíduos de aminoácidos nele introduzidos a partir de fonte que não é humana. Estes resíduos de aminoácidos não humanos são freqüentemente denominados resíduos "importados", que são tipicamente tomados de domínio variável "importado". A humanização pode ser essencialmente realizada seguindo os métodos de Winter e colaboradores (Jones et al, Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann et al, Nature 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al, Science, 239: 1534-1536 (1988), por meio de substituição de CDRs ou seqüências de CDR de roedores pelas seqüências correspondentes de anticorpo humano. Conseqüentemente, esses anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos (Patente NorterAmericana n° 4.816.567), em que substancialmente menos de um domínio variável intacto foi substituído pela seqüência correspondente de espécie não humana. Na prática, anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos em que alguns resíduos de CDR e possivelmente alguns resíduos de FR são substituídos a partir de sítios análogos em anticorpos de roedores.

Anticorpos completamente humanos são particularmente desejáveis para tratamento terapêutico de pacientes humanos. Anticorpos humanos podem ser elaborados por meio de uma série de métodos conhecidos na técnica, que incluem métodos de exibição de fagos descritos acima utilizando bibliotecas de anticorpos derivadas de seqüências de imunoglobulina humana. Vide também Patentes Norte-Americanas n° 4.444.887 e 4.716.111; e Publicações PCT n0 WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 e WO 91/10741; cada uma das quais é integralmente incorporada ao presente como referência. Os métodos de Cole et al e Boerder et al também são disponíveis para a preparação de anticorpos monoclonais humanos (Cole et al, Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Alan R. Riss (1985); e Boerner et al, J. Immunol., 147 (1): 86-95 (1991)).

Anticorpos humanos podem também ser anticorpos de domínio único que contêm domínio VH ou VL que funciona independentemente de qualquer outro domínio variável. Estes anticorpos são tipicamente selecionados a partir de bibliotecas de anticorpos expressas em fago. Estes anticorpos e métodos de isolamento desses anticorpos são descritos nas Patentes Norte- Americanas n° 6.595.142 e 6.248.516; e nos Pedidos US 20040110941 e US 20030130496, todos os quais são incorporados ao presente como referência.

Anticorpos humanos podem também ser produzidos utilizando camundongos transgênicos que são incapazes de expressar imunoglobulinas endógenas funcionais, mas que podem expressar genes de imunoglobulina humana. Os complexos de genes de imunoglobulina de cadeia leve e pesada humanos podem ser introduzidos aleatoriamente, por exemplo, ou por meio de recombinação homóloga em células haste embrionárias de camundongos. Alternativamente, a região variável, região constante e região de diversidade humanas podem ser introduzidas em células haste embrionárias de camundongos além dos genes de cadeia leve e pesada humana. Os genes de imunoglobulina de cadeia leve e pesada humana podem ser tornados não funcionais separada ou simultaneamente com a introdução de sítios de imunoglobulina humana por meio de recombinação homóloga. Particularmente, a exclusão homozigótica da região JH evita a produção de anticorpos endógenos. As células haste embrionárias modificadas são expandidas e microinjetadas em blastocistos para produzir camundongos quiméricos. Os camundongos quiméricos são criados em seguida para produzir ninhada homozigótica que expressam anticorpos humanos. Os camundongos transgênicos são imunizados da forma normal com antígeno selecionado, tal como polipeptídeo de acordo com a presente invenção, no todo ou em parte. Anticorpos monoclonais dirigidos contra o antígeno podem ser obtidos a partir dos camundongos transgênicos imunizados utilizando tecnologia de hibridoma convencional. Os transgenes de imunoglobulina humana abrigados pelos camundongos transgênicos reajustam-se durante a diferenciação de células B e, em seguida, sofrem troca de classes e mutação somática. Desta forma, utilizando este método, é possível produzir anticorpos IgG, IgA, IgM e IgE terapeuticamente úteis. Para análise desta tecnologia de produção de anticorpos humanos, vide Lonberg e Huszar, Int. Rev. Immunol., 13: 65-93 (1995). Para discussão detalhada desta tecnologia de produção de anticorpos humanos e anticorpos monoclonais humanos e protocolos de produção desses anticorpos, vide, por exemplo, as publicações PCT n0 WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; Patente Européia n° 0.598.877; Patentes Norte-Americanas n° 5.413.923, 5.625.126, 5.633.425, 5.569.825, 5.661.016, 5.545.806, 5.814.318, 5.885.793, 5.916.771 e 5.939.598, que são integralmente incorporadas ao presente como referência. Além disso, empresas tais como Abgenix1 Inc. (Freemont CA), Genpharm (San Jose CA) e Medarex, Inc. (Princeton NJ) podem estar concentrando esforços para fornecer anticorpos humanos dirigidos contra antígeno selecionado utilizando tecnologia similar à descrita acima.

Além disso, MAbs humanos poderão ser elaborados por meio da imunização de camundongos transplantados com leucócitos do sangue periférico humanos, esplenócitos ou medulas ósseas (tais como métodos Trioma de XTL). Anticorpos completamente humanos que reconhecem epítopo selecionado podem ser gerados utilizando método denominado "seleção orientada". Nesta abordagem, anticorpo monoclonal não humano selecionado, tal como anticorpo de camundongo, é utilizado para orientar a seleção de anticorpo completamente humano que reconhece o mesmo epítopo (Jespers et aí, Bio/Technology 12: 899-903 (1988)).

Além disso, anticorpos para o polipeptídeos de acordo com a presente invenção podem, por sua vez, ser utilizados para gerar anticorpos antiidiotípicos que "imitam" polipeptídeos de acordo com a presente invenção empregando métodos bem conhecidos dos técnicos no assunto (vide, por exemplo, Greenspan & Bona, FASEB J. 7 (5): 437-444 (1989) e Nissinoff, J. Immunol. 147 (8): 2429-2438 (1991)). Anticorpos que se Iigame inibem competitivamente a multimerização de polipeptídeos e/ou a ligação de polipeptídeos de acordo com a presente invenção a Iigantes podem ser utilizados para gerar antiidiotipos que "imitam" o domínio de ligação e/ou multimerização de polipeptídeos e, conseqüentemente, ligam e neutralizam polipeptídeo e/ou seu ligante. Esses antiidiotipos neutralizantes ou fragmentos de Fab desses antiidiotipos podem ser utilizados em regimes terapêuticos para neutralizar Iigantes de polipeptídeos. Esses anticorpos antiidiotípicos podem ser utilizados para ligar polipeptídeo de acordo com a presente invenção e/ou para ligar os seus ligantes/receptores e, desta forma, bloquear a sua atividade biológica.

Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser anticorpos biespecíficos. Os anticorpos biespecíficos são anticorpos monoclonais, preferencialmente humanos ou humanizados, que possuem especificidades de ligação para pelo menos dois antígenos diferentes. Na presente invenção, uma das especificidades de ligação pode ser dirigida a Fator D, a outra pode ser para qualquer outro antígeno e, preferencialmente, para proteína da superfície celular, receptor, subunidade receptora, antígeno específico de tecido, proteína derivada de vírus, proteína envelope codificada de forma viral, proteína derivada de bactérias ou proteína da superfície bacteriana etc. Anticorpos biespecíficos podem também compreender dois ou mais anticorpos de domínio único.

Métodos de fabricação de anticorpos biespecíficos são bem conhecidos. Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorpos biespecíficos baseia-se na co-expressão de dois pares de cadeia leve e cadeia pesada de imunoglobulina, em que as duas cadeias pesadas possuem diferentes especificidades (Milstein e Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983). Devido à variedade aleatória de cadeias leve e pesada de imunoglobulina, estes hibridomas (quadromas) produzem mistura potencial de dez moléculas de anticorpos diferentes, das quais apenas uma possui a estrutura biespecífica correta. A purificação da molécula correta normalmente é realizada por meio de etapas de cromatografia de afinidade. Procedimentos similares são descritos em WO 93/08829, publicada em treze de maio de 1993, e em Traunecker et al, EMBOJ., 10: 3655-3659 (1991).

Domínios variáveis de anticorpos com as especificidades de ligação desejadas (sítios de combinação de anticorpo e antígeno) podem ser fundidos a seqüências de domínio constante de imunoglobulina. A fusão ocorre preferencialmente com domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina, que compreende pelo menos parte das regiões de articulação, CH2 e CH3. Ela pode conter a primeira região constante de cadeia pesada (CH1) que contém o sítio necessário para ligação de cadeias leves presente em pelo menos uma das fusões. DNAs que codificam as fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve de imunoglobulina, são inseridos em vetores de expressão separados e são cotransformados em organismo hospedeiro apropriado. Para detalhes adicionais da geração de anticorpos biespecíficos, vide, por exemplo, Suresh et al, Meth. in Enzym., 121:210 (1986).

Anticorpos heteroconjugados também são contemplados pela presente invenção. Anticorpos heteroconjugados são compostos de dois anticorpos ligados covalentemente. Esses anticorpos foram propostos, por exemplo, para dirigir células do sistema imunológico a células indesejadas (Patente Norte-Americana n° 4.676.980). Contempla-se que os anticorpos podem ser preparados in vitro utilizando métodos conhecidos em química de proteínas sintética, incluindo os que envolvem agentes reticulantes. Imunotoxinas podem ser construídas, por exemplo, utilizando reação de troca de dissuifeto ou por meio da formação de ligação de tioéster. Exemplos de reagentes apropriados com este propósito incluem iminotiolato e 4- mercaptobutirimidato de metila e os descritos, por exemplo, na Patente Norte- Americana n° 4.676.980. Além disso, pode-se gerar anticorpos de domínio único para IL-13. Exemplos desta tecnologia foram descritos em WO 94/25591 para anticorpos derivados de Ig de cadeia pesada de camelídeos, bem como em US 2003/0130496, que descreve o isolamento de anticorpos totalmente humanos de domínio único de bibliotecas de fagos.

Geração de anticorpos monoclonais (MABS)

Em realização da presente invenção, anticorpos monoclonais, tais como anti-Fator D, podem ser levantados por roedores imunizantes (tais como camundongos, ratos, hamsters e cobaias) com Fator D nativo purificado a partir de plasma ou urina humana, ou Fator D recombinante ou seus fragmentos expressos por sistemas eucarióticos ou procarióticos. Outros animais podem ser utilizados para imunização, tais como primatas não humanos, camundongos transgênicos que expressam imunoglobulinas humanas e camundongos com severas imunodeficiências combinadas (SCID) transplantados com linfócitos B humanos. Hibridomas podem ser gerados por meio de procedimentos convencionais, por fusão de linfócitos B dos animais imunizados com células de mieloma (tais como Sp2/0 e NSO), conforme descrito por G. Kõhler e C. Milstein (Nature, 1975: 256: 495-497).

Além disso, anticorpos monoclonais podem ser gerados por meio de seleção de bibliotecas de Fab ou Fv de cadeia única recombinantes a partir de linfócitos B humanos em sistemas de exibição de fagos. A especificidade dos MAbs para dado antígeno pode ser testada por meio de teste imunossorvente ligado por enzimas (ELISA), imunomanchas Western ou outros métodos imunoquímicos. A atividade inibidora dos anticorpos mediante ativação de complemento pode ser determinada por meio de testes hemolíticos utilizando glóbulos sangüíneos vermelhos (RBCs) de coelhos ou cobaias não sensibilizados para o processo alternativo e empregando RBCs de galinhas ou carneiros para o processo clássico. Os hibridomas nas cavidades positivas são clonados limitando-se a diluição. Os anticorpos são purificados para caracterização da especificidade ao antígeno, tal como Fator D, por meio dos testes bem conhecidos na técnica.

Pode-se também criar moléculas de ligação de cadeias de peptídeos isoladas nas quais as regiões Fv de cadeia leve e pesada são conectadas. Anticorpos de fita simples ("ScFv") e o método de sua construção são descritos na Patente Norte-Americana n° 4.946.778. Alternativamente, Fab pode ser construído e expresso por meios similares (M.J. Evans et al,J. Immunol. Meth. 1995; 184: 123-138). Todos os anticorpos total e parcialmente humanos são menos imunogênicos que MAbs totalmente murinos e os fragmentos e anticorpos de fita simples também são menos imunogênicos.

Todos esses tipos de anticorpos são portanto, menos propensos a evocar reação imunológica ou alérgica. Conseqüentemente, eles são mais apropriados para administração in vivo em seres humanos que anticorpos totalmente animais, especialmente quando for necessário administração repetida ou a longo prazo. Além disso, o menor tamanho do fragmento de anticorpo pode ajudar a aumentar a biodisponibilidade de tecidos, o que pode ser fundamental para melhor acúmulo da dosagem em indicações de doenças agudas.

Em realização preferida da presente invenção, Fab quimérico, que contém regiões variáveis de animais (camundongos) e regiões constantes humanas, é utilizado terapeuticamente. O Fab é preferido porque é menor que imunoglobulina completa e pode fornecer melhor permeação no tecido; como molécula monovalente, existe menos chance de formação de imunocomplexos e agregados; e pode ser produzido em sistema microbiano, que pode ser mais facilmente escalonado que sistema mamífero.

Aplicações dos inibidores do Sistema complemento

Os inibidores de complementos, tais como anticorpos e seus fragmentos de ligação, podem ser administrados a pacientes em formulação farmacêutica apropriada por meio de uma série de vias, que incluem, mas sem limitar-se a infusão intravenosa, infusão de mistura intravenosa e vias intraperitoneal, intradérmica, intramuscular, subcutânea, intranasal, intratraqueal, intraespinhal, intracraniana e oral. Essa administração permite a sua ligação a antígeno endógeno, tal como Fator D e, desta forma, inibe a geração de anafilatoxinas C3b, C3a e C5a, e C5b-9.

A dosagem preferida estimada desses anticorpos e moléculas é de 10 a 500 μg/ml de soro. A dose real pode ser determinada em testes clínicos seguindo metodologia convencional de determinação de dosagens ideais, ou seja, administrando-se várias dosagens e determinando-se qual é a mais eficaz.

Os inibidores de processos de complemento podem funcionar para inibir a ativação de complementos in vivo e/ou a via de complemento alternativa e manifestações inflamatórias que o acompanham, tal como recrutamento e ativação de macrófagos, neutrófilos, plaquetas e células mastro, edema e lesões aos tecidos. Estes inibidores podem ser utilizados para o tratamento de doenças ou condições que sejam mediadas por ativação excessiva ou descontrolada do sistema de complemento.

Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser monoespecíficos, biespecíficos, triespecíficos ou de maior multiespecificidade. Anticorpos multiespecíficos podem ser específicos para diferentes epítopos de antígeno selecionado ou podem ser específicos para o antígeno e para epítopo heterólogo, tal como polipeptídeo heterólogo ou material de suporte sólido. Vide, por exemplo, as publicações PCT n° WO 93/17715, WO 92/08802, WO 91/00360, WO 92/05793; Tutt et al, J. Immunol. 147: 60-69 (1991); Patentes Norte-Americanas n° 4.474.893, 4.714.681, 4.925.648, 5.573.920, 5.601.819; Kostelny et al, J. Immunol. 148: 1547-1553 (1992).

Anticorpos úteis na presente invenção podem ser descritos ou especificados em termos do(s) epítopo(s) ou parte(s) de componente de sistema complemento, tal como Fator D, que reconheçam ou unam especificamente. O(s) epítopo(s) ou parte(s) de polipeptídeo(s) pode(m) ser especificado(s) conforme descrito no presente, tal como por posições N- terminais ou C-terminais, por tamanho em resíduos de aminoácidos contíguos.

Os anticorpos úteis na presente invenção podem também ser descritos ou especificados em termos da sua reatividade cruzada. Anticorpos que ligam polipeptídeos de componentes de sistema complemento, que possuem pelo menos 95%, pelo menos 90%, pelo menos 85%, pelo menos 80%, pelo menos 75%, pelo menos 70%, pelo menos 65%, pelo menos 60%, pelo menos 55% e pelo menos 50% de identidade (conforme calculado utilizando métodos conhecidos na técnica e descritos no presente) para IL-13 também são incluídos na presente invenção. Anticorpos anti-Fator D podem também ligar-se com KD de menos de cerca de 10-7 M, menos de 10-6 M ou menos de cerca de 10-5 M a outras proteínas, tais como anticorpos Fator D de espécies diferentes daquela contra a qual o anticorpo anti-Fator D é dirigido. Vetores ε células hospedeiras Em outro aspecto, a presente invenção fornece construções de vetores que compreendem seqüência de nucleotídeos que codifica os anticorpos de acordo com a presente invenção e célula hospedeira que compreende esse vetor. Métodos padrão de clonagem e transformação podem ser utilizados na preparação de linhagens celulares que expressam os anticorpos de acordo com a presente invenção.

Vetores de expressão recombinante que contêm seqüência de nucleotídeos que codifica os anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser preparados utilizando métodos bem conhecidos. Os vetores de expressão incluem seqüência de nucleotídeos ligada operativamente a seqüências de nucleotídeos reguladoras de tradução ou transcrição tais como as derivadas de genes de insetos, vírus, micróbios e mamíferos. Exemplos de seqüências reguladoras incluem seqüências promotoras de transcrição, operadoras, amplificadoras, sítios de ligação de ribossomos de mRNA e/ou outras seqüências apropriadas que controlam o início e término de tradução e transcrição. Seqüências de nucleotídeos são "ligadas operativamente" quando a seqüência reguladora referir-se funcionalmente à seqüência de nucleotídeos para o polipeptídeo apropriado. Desta forma, seqüência de nucleotídeos promotora é ligada operativamente, por exemplo, à seqüência de cadeia pesada de anticorpos caso a seqüência de nucleotídeos promotora controle a transcrição da seqüência de nucleotídeos apropriada.

Além disso, seqüências que codificam peptídeos de sinal apropriados que não são associadas naturalmente às seqüências de cadeia leve e/ou pesada de anticorpos podem ser incorporadas a vetores de expressão. Seqüência de nucleotídeos para peptídeo de sinal (líder de secreção) pode ser fundida, por exemplo, em quadro à seqüência de polipeptídeos, de forma que o anticorpo seja secretado para o espaço periplasmático ou para o meio. Peptídeo de sinal que é funcional nas células hospedeiras pretendidas aumenta a secreção extracelular do anticorpo apropriado. O peptídeo de sinal pode ser dividido do polipeptídeo mediante secreção do anticorpo da célula. Exemplos desses sinais de secreção são bem conhecidos e incluem, por exemplo, os descritos em US 5.698.435, US 5.698.417 e US 6.204.023.

Células hospedeiras úteis na presente invenção incluem, mas sem limitar-se a microorganismos tais como bactérias (tais como E. coli, B. subtilis) transformadas com vetores de expressão de DNA de bacteriófagos recombinantes, DNA de plasmídeos ou DNA de cosmídeos que contêm seqüências de codificação de anticorpos; levedura (tal como Saccharomyces, Pichia) transformada com vetores de expressão de levedura recombinante que contêm seqüências de codificação de anticorpos; sistemas de células de insetos infectadas com vetores de expressão de vírus recombinantes (tais como bacilovírus) que contêm seqüências de codificação de anticorpos; sistemas de células vegetais infectadas com vetores de expressão de vírus recombinantes (tais como vírus mosaico da couve-flor, CaMV; vírus mosaico do fumo, TMV) ou transformados com vetores de expressão de plasmídeos recombinantes (tais como plasmídeo Ti) que contêm seqüências de codificação de anticorpos; ou sistemas de células de mamíferos (tais como células COS, CHO, BHK, 293, 3T3) que abrigam construções de expressão recombinante que contêm promotores derivados do genoma de células de mamíferos (tais como promotor de metalotioneína) ou de vírus de mamíferos (tais como o promotor posterior de adenovírus; o promotor 7.5K de vírus de vacina).

O vetor pode ser vetor de plasmídeo, vetor de fago de fita simples ou dupla ou vetor viral de DNA ou RNA de fita simples ou dupla. Esses vetores podem ser introduzidos em células na forma de polinucleotídeos por meio de métodos bem conhecidos para introdução de DNA e RNA nas células. Os vetores, no caso de vetores virais e fagos, podem também ser introduzidos nas células na forma de vírus embalado ou encapsulado por meio de métodos bem conhecidos para infecção e transdução. Vetores virais podem apresentar defeitos de reprodução ou ser competentes para reprodução. No último caso, a propagação viral geralmente ocorrerá apenas em células hospedeiras de complemento. Sistemas de tradução livres de células podem também ser empregados para produzir a proteína utilizando RNAs derivados das construções de DNA do presente. Esses vetores podem incluir a seqüência de nucleotídeos que codifica a região constante da molécula de anticorpo (vide, por exemplo, a Publicação PCT n0 WO 86/05807; Publicação PCT n0 WO 89/01036; e a Patente Norte-Americana n° 5.122.464) e o domínio variável do anticorpo pode ser clonado nesse vetor para expressão da cadeia leve ou pesada completa.

Procariotes úteis como células hospedeiras na presente invenção incluem organismos grama negativos ou grama positivos tais como E. coli e B. subtilis. Vetores de expressão para uso em células hospedeiras procarióticas geralmente compreendem um ou mais genes marcadores selecionáveis fenotípicos. Gene marcador selecionável fenotípico é, por exemplo, gene que codifica proteína que confere resistência a antibióticos ou que fornece necessidade autotrófica. Exemplos de vetores de expressão úteis para células hospedeiras procarióticas incluem os derivados de plasmídeos disponíveis comercialmente, tais como a série de vetores pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suécia), pGEM1 (Promega Biotec, Madison, Wisconsin, E. U. A.) e pET (Novagen, Madison, Wisconsin, E. U. A.) e pRSET (Invitrogen Corporation, Carlsbad, Califórnia, E. U. A.) (Studier, F. W., J. Moi Biol. 219: 37 (1991); Schoepfer, R., Gene 124: 83 (1993)). Seqüências promotoras comumente utilizadas para vetores de expressão de células hospedeiras procarióticas recombinantes incluem T7 (Rosenberg et al, Gene 56, 125-135 (1987)), β-lactamase (penicilinase), sistema promotor de lactose (Chang et al, Nature 275: 615 (1978); e Goeddel et al, Nature 281: 544 (1979)), sistema promotor de triptofano (trp) (Goeddel et al, NucL Acids Res, 8: 4057 (1980)) e promotor tac (Sambrook et al, 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY).

Leveduras úteis na presente invenção incluem as dos gêneros Saccharomyces, Pichia, Actinomycetes e Kluyveromyces. Vetores de leveduras freqüentemente conterão seqüência de origem de reprodução de plasmídeo de levedura 2μ, seqüência de reprodução autônoma (ARS), região promotora, seqüências de poliadenilação, seqüências de término de transcrição e gene marcador selecionável. Seqüências promotoras apropriadas para vetores de leveduras incluem, entre outros, promotores de metalotioneína, 3-fosfogIicerato quinase (Hitzeman et al, J. Bioi Chem. 255: 2073 (1980)) ou outras enzimas glicolíticas (Holland et al, Biochem. 17: 4900 (1978)), tais como enolase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, hexoquinase, piruvato descarboxilase, fosfofrutoquinase, glicose-6-fosfato isomerase, 3-fosfoglicerato mutase, piruvato quinase, triosefosfato isomerase, fosfoglicose isomerase e glicoquinase. Outros vetores e promotores apropriados para uso em expressão de levedura são adicionalmente descritos em Fleer et al, Gene, 107: 285-195 (1991). Outros promotores e vetores apropriados para levedura e protocolos de transformação de levedura são bem conhecidos na técnica. Protocolos de transformação de levedura são bem conhecidos. Um desses protocolos é descrito por Hinnen et al, Proe. Natl Acad. Sci., 75: 1929 (1978). O protocolo de Hinnen seleciona transformadores Trp+ em meio seletivo.

Sistemas de cultura de células hospedeiras de insetos ou mamíferos podem também ser empregados para expressar anticorpos recombinantes, tais como sistemas de bacilovírus para a produção de proteínas heterólogas. Em sistema de insetos, vírus polihedrose nuclear de Autographa californica (AcNPV) pode ser utilizado como vetor para expressar genes exógenos. O vírus cresce em células de Spodoptera frugiperda. A seqüência de codificação de anticorpos pode ser clonada individualmente em regiões não essenciais (tais como o gene poliedrina) do vírus e colocada sob controle de promotor AcNPV (tal como o promotor de poliedrina).

Pode-se utilizar NSO ou células de ovário de hamster chinês (CHO) para expressão em mamíferos dos anticorpos de acordo com a presente invenção. Seqüências de controle de transcrição e tradução para vetores de expressão de células hospedeiras de mamíferos podem ser extirpadas de genomas virais. Seqüências amplificadoras e seqüências promotoras comumente utilizadas são derivadas de vírus de polioma, adenovírus 2, vírus de símios 40 (SV40) e citomegalovírus (CMV) humano. Seqüências de DNA derivadas do genoma viral SV40 podem ser utilizadas para fornecer outros elementos genéticos para expressão de seqüência de genes estrutural em célula hospedeira de mamíferos, tal como origem SV40, promotor precoce e posterior, amplificador, sítios de divisão e poliadenilação. Promotores precoces e posteriores virais são particularmente úteis, pois ambos são facilmente obtidos a partir de genoma viral na forma de fragmento que pode também conter origem viral de reprodução. Exemplos de vetores de expressão para uso em células hospedeiras de mamíferos são disponíveis comercialmente.

Anticorpos codificadores de polinucleotídeos

A presente invenção fornece ainda polinucleotídeos ou ácidos nucleicos, tais como DNA, que compreendem seqüência de nucleotídeos que codifica anticorpo de acordo com a presente invenção e seus fragmentos. Exemplos de polinucleotídeos incluem os que codificam cadeias de anticorpos que compreendem uma ou mais das seqüências de aminoácidos descritas no presente. A presente invenção também engloba polinucleotídeos que se hibridizam sob condições de hibridização estringentes ou com estringência mais baixa em polinucleotídeos que codificam anticorpo de acordo com a presente invenção.

Os polinucleotídeos podem ser obtidos e a seqüência de nucleotídeos dos polinucleotídeos determinada por meio de qualquer método conhecido na técnica. Caso a seqüência de nucleotídeos do anticorpo seja conhecida, por exemplo, polinucleotídeo que codifica o anticorpo pode ser reunido a partir de oligonucleotídeos sintetizados quimicamente (tal como descrito em Kutmeier et al, BioTechniques 17: 242 (1994)), o que, resumidamente, envolve a síntese de oligonucleotídeos sobrepostos que contêm partes da seqüência que codifica o anticorpo, combinação e ligação desses oligonucleotídeos e, em seguida, amplificação dos oligonucleotídeos ligados por meio de PCR.

Alternativamente, polinucleotídeo que codifica anticorpo pode ser gerado a partir de ácido nucleico de fonte apropriada. Caso clone que contém ácido nucleico que codifica anticorpo específico não seja disponível, mas a seqüência da molécula de anticorpo seja conhecida, ácido nucleico que codifica a imunoglobulina pode ser quimicamente sintetizado ou obtido a partir de fonte apropriada (tal como biblioteca de cDNA de anticorpo ou biblioteca de cDNA gerada, ou ácido nucleico, preferencialmente poli A+ RNA, isolado a partir de qualquer tecido ou células que expressem o anticorpo, tais como células de hibridoma selecionadas para expressar anticorpo de acordo com a presente invenção) por meio de amplificação por PCR utilizando primers sintéticos que podem ser hibridizados nas extremidades 3' e 5' da seqüência ou por meio de clonagem utilizando sonda de oligonucleotídeos específica para a seqüência genética específica a ser identificada, tal como clone de cDNA de biblioteca de cDNA que codifica o anticorpo. Ácidos nucleicos amplificados gerados por meio de PCR podem ser clonados em seguida em vetores de clonagem reproduzíveis utilizando qualquer método bem conhecido na técnica. Após a determinação da seqüência de nucleotídeos e seqüência de aminoácidos correspondente do anticorpo, a seqüência de nucleotídeos do anticorpo pode ser manipulada utilizando métodos bem conhecidos na técnica de manipulação de seqüências de nucleotídeos, tais como métodos de DNA recombinante, mutagênese dirigida a sítio, PCR etc. (vide, por exemplo, os métodos descritos em Sambrook et al, 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory1 Cold Spring Harbor NY, e Ausubel et al, eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nova lorque, são ambos integralmente incorporados ao presente como referência), para gerar anticorpos que contêm seqüência de aminoácidos diferente, por exemplo, para criar substituições, exclusões e/ou inserções de aminoácidos.

Em realização específica, a seqüência de aminoácidos dos domínios variáveis de cadeia leve e/ou pesada pode ser inspecionada para identificar as seqüências das CDRs por meio de métodos bem conhecidos, tais como por meio de comparação com seqüências de aminoácidos conhecidas de outras regiões variáveis de cadeia leve e pesada para determinar as regiões de hipervariabilidade de seqüências. Utilizando métodos de DNA recombinante de rotina, uma ou mais das CDRs podem ser inseridas em regiões de cadeia principal, tais como regiões de cadeia principal humana para humanizar anticorpo não humano, conforme descrito acima. As regiões de cadeia principal podem ser regiões de cadeia principal de consenso ou de ocorrência natural e, preferencialmente, regiões de cadeia principal humana (vide, por exemplo, Chothia et al, J. Moi Bioi 278: 457-479 (1998) para listagem de regiões de cadeia principal humana). Preferencialmente, o polinucleotídeo gerado pela combinação das regiões de cadeia principal e CDRs codifica anticorpo que liga especificamente polipeptídeo de acordo com a presente invenção. Preferencialmente, conforme discutido acima, uma ou mais substituições de aminoácidos podem ser realizadas nas regiões de cadeia principal e, preferencialmente, as substituições de aminoácidos aumentam a ligação do anticorpo ao seu antígeno. Adicionalmente, esses métodos podem ser utilizados para realizar substituições ou exclusões de aminoácidos de um ou mais resíduos de cisteína de região variável que participam em ligação de dissulfeto intracadeias para gerar moléculas de anticorpos que não contêm uma ou mais uniões de dissulfeto intracadeias. Outras alterações para o polinucleotídeo são englobadas pela presente invenção e encontram-se dentro do conhecimento da técnica.

Além disso, podem ser utilizados métodos desenvolvidos para a produção de "anticorpos quiméricos" (Morrison et al, Proc. Natl. Acad. Sei. 81: 851-855 (1984); Neuberger et al, Nature 312: 604-608 (1984); Takeda et al, Nature 314: 452-454 (1985)) por meio de divisão de genes a partir de molécula de anticorpo de camundongo com especificidade de antígeno apropriada junto com genes de molécula de anticorpo humano com atividade biológica apropriada. Conforme descrito acima, anticorpo quimérico é molécula na qual diferentes partes são derivadas de diferentes espécies de animais, tais como as que contêm região variável derivada de MAb murino e região constante de imunoglobulina humana, como anticorpos humanizados.

Alternativamente, métodos descritos para a produção de anticorpos de fita simples (Patente Norte-Americana n° 4.946.778; Bird, Science 242: 423-42 (1988); Huston et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 85: 5879-5883 (1988); e Ward et al, Nature 334: 544-54 (1989)) podem ser adaptados para produzir anticorpos de fita simples. Anticorpos de fita simples são formados ligando-se os fragmentos de cadeia leve e pesada da região Fv por meio de ponte de aminoácidos, resultando em polipeptídeo de fita simples. Métodos de reunião de fragmentos de Fv funcionais em E. coli podem também ser utilizados (Skerra et al, Science 242: 1038-1041 (1988)). Métodos de produção de anticorpos Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser produzidos por meio de qualquer método conhecido na técnica para a síntese de anticorpos, particularmente por meio de síntese química ou, preferencialmente, por meio de métodos de expressão recombinante.

A expressão recombinante de anticorpo de acordo com a presente invenção, ou seu fragmento, derivado ou análogo (tal como cadeia leve ou pesada de anticorpo de acordo com a presente invenção ou anticorpo de fita simples de acordo com a presente invenção), exige a construção de vetor de expressão que contém polinucleotídeo que codifica o anticorpo ou fragmento do anticorpo. Após a obtenção de polinucleotídeo que codifica molécula de anticorpo, o vetor para a produção do anticorpo pode ser produzido por meio de tecnologia de DNA recombinante. É construído vetor de expressão que contém seqüências de codificação de anticorpos e sinais de controle de tradução e transcrição apropriados. Estes métodos incluem, por exemplo, métodos de DNA recombinante in vitro, métodos sintéticos e recombinação genética in vivo.

O vetor de expressão é transferido para célula hospedeira por meio de métodos convencionais e as células transfectadas são cultivadas em seguida por meio de métodos convencionais para produzir anticorpo de acordo com a presente invenção. Em um aspecto da presente invenção, vetores que codificam as cadeias leve e pesada podem ser coexpressos na célula hospedeira para expressão da molécula de imunoglobulina inteira, conforme detalhado abaixo.

Uma série de sistemas de vetores de expressão de hospedeiros pode ser utilizada para expressar as moléculas de anticorpos de acordo com a presente invenção conforme descrito acima. Esses sistemas de expressão de hospedeiros representam veículos por meio dos quais as seqüências de codificação de interesse podem ser produzidas e purificadas em seguida, mas também representam células que podem, quando transformadas ou transfectadas com as seqüências de codificação de nucleotídeos apropriadas, expressar molécula de anticorpo de acordo com a presente invenção in situ. Células bacterianas, tais como E. coli, e células eucarióticas são comumente utilizadas para a expressão de molécula de anticorpo recombinante, especialmente para a expressão de molécula de anticorpo recombinante inteira. Células de mamíferos tais como células de ovário de hamster chinês (CHO), por exemplo, em conjunto com vetor tal como o elemento promotor de gene precoce intermediário principal de citomegalovírus humano é sistema de expressão eficaz para anticorpos (Foecking et al, Gene 45: 101 (1986); Cockett et al, Bio/Technology 8: 2 (1990)).

Além disso, pode ser selecionada linhagem de células hospedeiras que modula a expressão das seqüências inseridas ou modifica e processa o produto genético na forma específica desejada. Essas modificações (tais como glicosilação) e processamento (tal como divisão) de produtos de proteínas podem ser importantes para a função da proteína. Diferentes células hospedeiras possuem mecanismos específicos e característicos para o processamento pós-tradução e modificação de proteínas e produtos genéticos. Linhagens celulares ou sistemas hospedeiros apropriados podem ser selecionados para garantir a modificação e o processamento corretos da proteína exógena expressa. Com este propósito, podem ser utilizadas células hospedeiras eucarióticas que possuem a maquinaria celular para processamento apropriado do transcrito primário, glicosilação e fosforilação do produto genético. Estas células de hospedeiros mamíferos incluem, mas sem limitar-se a células de mieloma, CHO, COS, 293 ou 3T3.

Para produção com alto rendimento a longo prazo de proteínas recombinantes, prefere-se expressão estável. Podem ser elaboradas, por exemplo, linhagens celulares que expressam de forma estável a molécula de anticorpo. Em vez de utilizar vetores de expressão que conterão origens virais de reprodução, células hospedeiras podem ser transformadas com DNA controlado por elementos de controle de expressão apropriados (tais como seqüências promotoras, aprimoradoras, términos de transcrição, sítios de poliadenilação etc.) e marcador selecionável. Após a introdução do DNA exógeno, pode-se permitir o crescimento de células elaboradas por um a dois dias em meios enriquecidos, que são alterados em seguida para meios seletivos. O marcador selecionável no plasmídeo recombinante confere resistência à seleção e permite que células integrem de forma estável o plasmídeo aos seus cromossomos e cresçam para formar focos que, por sua vez, podem ser clonados e expandidos em linhagens celulares. Este método pode ser convenientemente utilizado para elaborar linhagens celulares que expressam a molécula de anticorpo. Essas linhagens celulares elaboradas podem ser particularmente úteis na seleção e avaliação de compostos que interagem direta ou indiretamente com a molécula de anticorpo.

Pode-se utilizar uma série de sistemas de seleção, que incluem, mas sem limitar-se a timidino quinase do vírus simplex da herpes (Wigler et al, Cell 11: 223 (1977), hipoxantino-guanino fosforibosiltransferase (Szybalska & Szybalski, Proc. NatL Acad. Sci. U. S. A. 48: 202 (1992)) e genes de adenino fosforibosiltransferase (Lowy et aí, Cell 22: 817 (1980)) podem ser empregados em células tk, hgprt ou aprt, respectivamente. Além disso, pode-se utilizar resistência a antimetabólitos como a base de seleção para os genes a seguir: dhfr, que confere resistência a metotrexato (Wigler et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 77: 357 (1980); 0'Hare et al, Proc. Nati Acad. Sei. U. S. A. 78: 1527 (1981)); gpt, que confere resistência a ácido micofenólico (Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78: 2072 (1981)); neo, que confere resistência ao aminoglicosídeo G-418 (Wu e Wu, Biotherapy 3: 87-95 (1991); e hygro, que confere resistência a higromicin (Santerre et al, Gene 30: 147 (1984)). Métodos comumente conhecidos na técnica de tecnologia de DNA recombinante podem ser aplicados rotineiramente para selecionar o clone recombinante desejado e esses métodos são descritos, por exemplo, em Ausubel et al (eds.), Cuirent Pnotocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press NY (1990); e nos Capítulos 12 e 13, Dracopoli et al (eds.), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons NY (1994); Colberre-Garapin et al, J. Mol. BioL 150: 1 (1981), que são integralmente incorporados ao presente como referência.

Os níveis de expressão de moléculas de anticorpos podem ser aumentados por meio de amplificação de vetores (para análise, vide Bebbington e Hentschel, The Use of Vectors Based on Gene Amplification for the Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells (DNA Cloning, Vol. 3, Academic Press, Nova Iorque, 1987)). Quando marcador no sistema de vetores que expressa anticorpo for amplificável, o aumento do nível de inibidor presente na cultura de células hospedeiras aumentará a quantidade de cópias do gene marcador. Como a região amplificada é associada ao gene de anticorpo, a produção do anticorpo também aumentará (Crouse et al, Mol. Cell. Biol. 3: 257 (1983)).

A célula hospedeira pode ser cotransfectada com dois vetores de expressão de acordo com a presente invenção, em que o primeiro vetor codifica polipeptídeo derivado de cadeia pesada e o segundo vetor codifica polipeptídeo derivado de cadeia leve. Os dois vetores podem conter marcadores selecionáveis idênticos que permitem expressão igual de polipeptídeos de cadeia leve e pesada. Alternativamente, pode ser utilizado um único vetor que codifica e é capaz de expressar polipeptídeos de cadeia leve e pesada. Nessas situações, a cadeia leve deverá ser colocada antes da cadeia pesada para evitar excesso de cadeia pesada livre tóxica (Proudfoot, Nature 322: 52 (1986); Kohler, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 77: 2197 (1980)). As seqüências de codificação para as cadeias leve e pesada podem compreender cDNA ou DNA genômico.

Após a produção por animal, síntese química ou expressão recombinante da molécula de anticorpo de acordo com a presente invenção, ela pode ser purificada por meio de qualquer método conhecido na técnica para purificação de molécula de imunoglobulina, tal como por meio de cromatografia (por exemplo, troca de íons, afinidade, particularmente por afinidade para o antígeno específico após Proteína A e cromatografia de exclusão de tamanho), centrifugação, solubilidade diferencial ou por meio de qualquer outro método padrão para a purificação de proteínas. Além disso, os anticorpos de acordo com a presente invenção ou seus fragmentos podem ser fundidos a seqüências de polipeptídeos heterólogas descritas no presente ou conhecidas na técnica de outra forma, para facilitar a purificação.

A presente invenção engloba anticorpos fundidos de forma recombinante ou conjugados quimicamente (incluindo conjugações covalentes e não covalentes) a polipeptídeo. Anticorpos fundidos ou conjugados de acordo com a presente invenção podem ser utilizados para facilidade de purificação. Vide, por exemplo, Harbor et al, acima, e a Publicação PCT n0 WO 93/21232; EP 439.095; Naramura et al, Immunol. Lett. 39: 91-99 (1994); Patente Norte- Americana n° 5.474.981; Gillies et al, Proc. Nati Acad. Sei. 89: 1428-1432 (1992); Fell et al, J. Immunol. 146: 2446-2452 (1991), que são integralmente incorporados ao presente como referência.

Além disso, os anticorpos ou seus fragmentos de acordo com a presente invenção podem ser fundidos a seqüências marcadoras, tais como peptídeo para facilitar a purificação. Em realizações preferidas, a seqüência de aminoácidos marcadores é peptídeo hexa-histidina, tal como a marca fornecida em vetor pQE (QIAGEN Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth CA 91311), entre outros, muitos dos quais são disponíveis comercialmente. Conforme descrito em Gentz et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 86: 821-824 (1989), por exemplo, hexa-histidina fornece purificação conveniente da proteína de fusão. Outras marcas de peptídeos úteis para purificação incluem, mas sem limitar-se à marca "HA", que corresponde a epítopo derivado da proteína hemaglutinina de influenza (Wilson et al, Cell 37: 767 (1984)) e a marca "bandeira".

Usos EM DIAGNÓSTICO PARA ANTICORPOS

Os anticorpos de acordo com a presente invenção incluem derivados que são modificados, ou seja, pela ligação covalente de qualquer tipo de molécula ao anticorpo, de tal forma que a ligação covalente não interfira com a ligação ao antígeno. Por exemplo, mas não como forma de limitação, os derivados de anticorpos incluem anticorpos que tenham sido modificados, tal como por meio de biotinilação, HRP ou qualquer outra porção detectável.

Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser utilizados, por exemplo, mas sem limitar-se à detecção de Fator D, incluindo métodos de diagnóstico in vitro e in vivo. Os anticorpos apresentam uso, por exemplo, em imunotestes para medir qualitativa e quantitativamente os níveis de Fator D em amostras biológicas obtidas a partir dos olhos de pacientes que sofrem de condições ou doenças oculares. Imunotestes são tipicamente descritos, por exemplo, em Harlow et al, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, segunda edição, 1988) (integralmente incorporado ao presente como referência).

Conforme discutido em mais detalhes abaixo, os anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser utilizados isoladamente ou em combinação com outras composições. Os anticorpos podem ainda ser fundidos de forma recombinante a polipeptídeo heterólogo no terminal N ou C ou conjugados quimicamente (incluindo conjugações covalentes e não covalentes) a polipeptídeos ou outras composições. Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser fundidos de forma recombinante ou conjugados, por exemplo, a moléculas úteis como marcas em testes de detecção.

A presente invenção engloba ainda o uso de anticorpos ou seus fragmentos conjugados a agente de diagnóstico para a detecção dos níveis de componentes de processos de complemento no olho de indivíduo afetado. Os anticorpos podem ser utilizados em diagnóstico, por exemplo, para monitorar o desenvolvimento ou o progresso de condição ou doença ocular como parte de procedimento de teste clínico, por exemplo, para determinar a eficácia de dado regime de tratamento. A detecção pode ser facilitada por meio de acoplamento do anticorpo a substância detectável. Exemplos de substâncias detectáveis incluem várias enzimas, grupos protéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes, materiais bioluminescentes, materiais radioativos, metais emissores de pósitrons utilizando várias tomografias de emissão de pósitrons e íons de metais paramagnéticos não radioativos. A substância detectável pode ser acoplada ou conjugada diretamente ao anticorpo (ou seu fragmento) ou indiretamente, por meio de intermediário (tal como Iigante conhecido na técnica), utilizando métodos conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, a Patente Norte-Americana n° 4.741.900 para íons metálicos que podem ser conjugados a anticorpos para uso como diagnósticos de acordo com a presente invenção. Exemplos de enzimas apropriadas incluem peroxidase de rabanete silvestre, fosfatase alcalina, beta-galactosidase ou acetilcolinesterase; exemplos de complexos de grupos protéticos apropriados incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina; exemplos de materiais fluorescentes apropriados incluem umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloreto de dansila ou ficoeritrina; exemplo de material Iuminescente inclui luminol; exemplos de materiais bioluminescentes incluem luciferase, Iuciferina e aequorina; e exemplos de material radioativo apropriado incluem 1251, 1311, 1111n ou 99Tc. Anticorpos podem também ser ligados a suportes sólidos, que são particularmente úteis para imunotestes ou purificação do antígeno alvo. Esses suportes sólidos incluem, mas sem limitar-se a vidro, celulose, poliacrilamida, nylon, poliestireno, cloreto de polivinila ou polipropileno.

Anticorpos marcados, seus derivados e análogos, que se ligam especificamente a Fator D, podem ser utilizados para fins de diagnóstico para detectar, diagnosticar ou monitorar doenças, disfunções e/ou condições associadas à atividade e/ou expressão aberrante de Fator D. A presente invenção proporciona a detecção de expressão aberrante de Fator D, que compreende (a) teste da expressão de Fator D em células ou fluido do corpo de indivíduo que utiliza um ou mais anticorpos de acordo com a presente invenção específicos para Fator D e (b) comparação do nível de expressão genética com nível de expressão genética padrão, por meio do quê aumento ou redução do nível de expressão de Fator D testado em comparação com o nível de expressão padrão indica expressão aberrante.

Anticorpos podem ser utilizados para detectar a presença e/ou os níveis de Fator D em amostra, tais como fluido ocular. O método de detecção pode compreender o contato da amostra com anticorpo anti-Fator D e determinação da quantidade de anticorpo que é ligada à amostra.

A presente invenção fornece teste de diagnóstico para diagnosticar disfunção, que compreende (a) teste da expressão de Fator D em células ou fluido do corpo de indivíduo utilizando um ou mais anticorpos de acordo com a presente invenção e (b) comparação do nível de expressão genética com nível de expressão genética padrão, por meio do quê aumento ou redução do nível de expressão genética testado em comparação com o nível de expressão padrão indica disfunção específica.

Anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser utilizados para testar níveis de proteína em amostra biológica utilizando métodos imunoistológicos clássicos conhecidos dos técnicos no assunto (vide, por exemplo, Jalkanen et al, J. Cell. Biol. 101: 976-985 (1985); Jalkanen et al, J. Cell Biol. 105: 3087-3096 (1987)). Outros métodos com base em anticorpos úteis para a detecção da expressão de genes de proteínas incluem radioimunotestes, tais como o teste imunossorvente ligado por enzimas (ELISA) e o radioimunoteste (RIA). Marcas de teste de anticorpos apropriadas são conhecidas na técnica e incluem marcas de enzimas, tais como glicose oxidase; radioisótopos, tais como iodo (1251, 1211), carbono (14C), enxofre (35S), trítio (3H), índio (112ln) e tecnécio (99Tc); marcas luminescentes, tais como luminol; e marcas fluorescentes, tais como fluoresceína e rodamina, e biotina.

Um aspecto da presente invenção é a detecção e diagnóstico de doença ou disfunção associada a ativação de complemento nos olhos de paciente, preferencialmente mamífero e, de maior preferência, ser humano. Em uma realização, o diagnóstico compreende: a) tomada de amostra do olho de paciente; b) medição do nível de componentes de complementos, tais como C3a ou C3b ou C5a. Nível de fundo pode ser determinado por meio de vários métodos, que incluem a comparação da quantidade de molécula marcada detectada com valor padrão previamente determinado para sistema específico.

Em uma realização, o monitoramento da doença ou disfunção é conduzido por meio da repetição do método de diagnóstico da doença, por exemplo, um mês após o diagnóstico inicial, seis meses após o diagnóstico inicial, um ano após o diagnóstico inicial etc.

USOS TERAPÊUTICOS DE INIBIDORES DE PROCESSOS DE COMPLEMENTO

Inibidores de vias de complemento podem ser administrados a paciente que sofre de doença ocular tal como degeneração macular relativa à idade. Anticorpo, com ou sem porção terapêutica a ele conjugada, pode ser utilizado como produto terapêutico. A presente invenção refere-se ao uso de inibidores de vias de complemento, particularmente anticorpos, que compreende a administração dos mencionados inibidores a animais, mamíferos ou seres humanos para o tratamento de doença, disfunção ou condição ocuiar que envolva a ativação de processos de complemento. O animal ou paciente pode ser animal necessitado de tratamento específico, tal como animal que tenha sido diagnosticado com disfunção específica, como relativa a complemento. Anticorpos dirigidos contra Fator D são úteis para inibir a via de complemento alternativa e assim inibir condições ou disfunções relativas ao sistema complemento. Particularmente, a presente invenção refere-se ao tratamento de AMD, retinopatia diabética e neovascularização coroidal. Administrando-se dose terapeuticamente aceitável de anticorpo(s) de acordo com a presente invenção ou coquetel dos anticorpos do presente, ou em combinação com outras moléculas de fontes variáveis, os efeitos da ativação de componentes do sistema complemento podem ser reduzidos ou eliminados no mamífero tratado.

Os compostos terapêuticos de acordo com a presente invenção incluem, mas sem limitar-se a anticorpos de acordo com a presente invenção (incluindo seus fragmentos, análogos e derivados conforme descrito no presente) e ácidos nucleicos que codificam anticorpos de acordo com a presente invenção conforme descrito abaixo (incluindo seus fragmentos, análogos e derivados e anticorpos antiidiotípicos, conforme descrito no presente). Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser utilizados para tratar, inibir ou evitar doenças, disfunções ou condições associadas à atividade e/ou expressão aberrante do sistema complemento, particularmente a via alternativa e, particularmente, Fator D. O tratamento e/ou a prevenção de doenças, disfunções ou condições associadas à atividade e/ou expressão aberrante de Fator D inclui, mas sem limitar-se ao alívio de pelo menos um sintoma associado a essas doenças, disfunções ou condições. Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser fornecidos em composições farmaceuticamente aceitáveis, conforme conhecido na técnica ou descrito no presente.

A quantidade do anticorpo que será eficaz no tratamento, inibição e prevenção de doença ou disfunção associada à ativação e/ou expressão aberrante do sistema complemento pode ser determinada por meio de métodos clínicos padrão. O anticorpo pode ser administrado em regimes de tratamento consistentes com a doença, tais como uma única ou poucas doses ao longo de um a vários dias para melhorar estado doentio ou doses periódicas ao longo de extenso período para evitar condições ou doenças oculares.

Além disso, testes in vitro podem ser opcionalmente empregados para ajudar a identificar faixas de dosagem ideais. A dose precisa a ser empregada na formulação também dependerá da via de administração e da seriedade da doença ou disfunção e deverá ser decidida de acordo com o julgamento do médico e as circunstâncias de cada paciente. Doses eficazes podem ser extrapoladas a partir de curvas de reação à dosagem derivadas de sistemas de teste de modelos animais ou in vitro.

Para anticorpos, a dosagem administrada a pacientes é de tipicamente 0,1 mg/kg a 100 mg/kg de peso do corpo do paciente. Preferencialmente, a dosagem administrada a pacientes é de 0,1 mg/kg a 20 mg/kg do peso do corpo do paciente, de maior preferência de 1 mg/kg a 10 mg/kg do peso do corpo do paciente. Geralmente, anticorpos humanos possuem meia vida mais longa no corpo humano que anticorpos de outras espécies devido à reação imunológica aos polipeptídeos exógenos. Desta forma, dosagens mais baixas de anticorpos humanos e administração menos freqüente muitas vezes são possíveis. Além disso, a dosagem e a freqüência de administração de anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser reduzidas por meio do aumento da absorção e penetração nos tecidos (tal como no cérebro) dos anticorpos por meio de modificações tais como lipidação. Em aspecto preferido, o anticorpo é substancialmente purificado (tal como substancialmente livre de substâncias que limitem o seu efeito ou produzam efeitos colaterais indesejados.

Vários sistemas de fornecimento são conhecidos e podem ser utilizados para administrar anticorpo de acordo com a presente invenção, incluindo injeção, tal como encapsulação em lipossomos, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capazes de expressar o composto, endocitose mediada por receptor (vide, por exemplo, Wu et al, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432 (1987)), construção de ácido nucleico como parte de vetor retroviral ou outro vetor etc.

O anticorpo pode ser administrado ao mamífero de qualquer forma aceitável. Métodos de introdução incluem, mas sem limitar-se a vias intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, intranasal, epidural, inalatória e oral. Para o propósito da presente invenção, entretanto, a via de administração preferida é intraocular.

A administração pode ser sistêmica ou local. Além disso, pode ser desejável introduzir os anticorpos terapêuticos ou composições de acordo com a presente invenção no sistema nervoso central por meio de qualquer via apropriada, incluindo injeção intraventricular ou intratecal; injeção intraventricular pode ser facilitada por cateter intraventricular, por exemplo, fixado a reservatório, tal como reservatório Ommaya.

Em outra realização, o anticorpo pode ser fornecido em bolha, particularmente Iipossomo (vide Langer1 Science 249: 1527-1533 (1990); Treat et al, Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Câncer, Lopez- Berestein e Fidler (Eds.), Liss, Nova lorque, págs. 353-365 (1989); Lopez- Berestein, ibid., págs. 317-327; vide geralmente ibid).

Em ainda outra realização, o anticorpo pode ser fornecido em sistema de liberação controlada. Em uma realização, pode-se utilizar bomba (vide Langer, acima; Sefton1 CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201 (1987); Buchwald et al, Surgery 88: 507 (1980); Saudek et al, N. Engl. J. Med. 321: 574 (1989)). Em outra realização, podem ser utilizados materiais poliméricos (vide Medicai Applications of Controlled Release, Langer e Wise (eds.), CRC Press, Boca Raton FL (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen e Ball (eds.), Wiley, Nova Iorque (1984); Ranger e Peppas, J., Macromol Sei. Rev. Macromol. Chem. 23: 61 (1983); vide também Levy et al, Science 228: 190 (1985); During et al, Ann. Neuroi 25: 351 (1989); Howard et al, J. Neurosurg. 71: 105 (1989)). Em ainda outra realização, sistema de liberação controlada pode ser colocado nas proximidades do alvo terapêutico.

A presente invenção também fornece composições farmacêuticas úteis no método do presente. Estas composições compreendem quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo e veículo fisiologicamente aceitável. Em realização específica, a expressão "fisiologicamente aceitável" indica aprovado por agência reguladora de governo federal ou estadual ou relacionado na Farmacopéia dos Estados Unidos ou outra farmacopéia geralmente reconhecida para uso em animais, mais particularmente em seres humanos. O termo "veículo" designa diluente, adjuvante, excipiente ou veículo com o qual o produto terapêutico é administrado. Esses veículos fisiológicos podem ser líquidos estéreis, tais como água e óleos, incluindo os de petróleo, origem animal, vegetal ou sintética, tais como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e similares. Água é veículo preferido quando a composição farmacêutica é administrada por via intravenosa. Soluções salinas e soluções de glicerol e dextrose aquosas podem também ser empregadas como veículos líquidos, particularmente para soluções injetáveis. Excipientes farmacêuticos apropriados incluem amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, sílica gel, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite desnatado em pó, glicerol, propileno, glicol, água, etanol e similares. A composição, se desejado, pode também conter pequenas quantidades de agentes umectantes ou emulsificantes, ou agentes tamponadores do pH. Estas composições podem assumir a forma de soluções, suspensões, emulsões, pastilhas, pílulas, cápsulas, pós, formulações de liberação prolongada e similares. A composição pode ser formulada na forma de supositório, com aglutinantes e veículos tradicionais tais como triglicérides. A formulação oral pode incluir veículos padrão tais como graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sódio, celulose, carbonato de magnésio etc. Exemplos de veículos apropriados são descritos em Remingtorís Pharmaceutical Sciences de E. W. Martin. Estas composições conterão quantidade eficaz do anticorpo, preferencialmente em forma purificada, junto com quantidade apropriada de veículo, para fornecer a forma de administração apropriada ao paciente. A formulação deverá adequar-se ao modo de administração.

Em uma realização, a composição é formulada de acordo com procedimentos de rotina na forma de composição farmacêutica adaptada para administração intravenosa a seres humanos. Tipicamente, as composições para administração intravenosa são soluções em tampão aquoso isotônico estéril. Quando necessário, a composição pode também incluir agente solubilizante e anestésiço local, tal como lignocaína, para reduzir a dor no local da injeção. Geralmente, os ingredientes são fornecidos separadamente ou misturados entre si em forma de dosagem unitária, por exemplo, como pó liofilizado seco ou concentrado livre em água em recipiente hermeticamente fechado tal como ampola ou sachê indicando a quantidade de agente ativo. Quando a composição necessitar ser administrada por meio de infusão, ela pode ser aplicada com frasco de infusão que contém solução salina ou água em grau farmacêutico estéril. Quando a composição for administrada por meio de injeção, ampola de água estéril para injeção ou solução salina pode ser fornecida de forma que os ingredientes possam ser misturados antes da administração.

A presente invenção também fornece embalagem ou kit farmacêutico que compreende um ou mais recipientes cheios com um ou mais dos ingredientes das composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção. Opcionalmente associado a esse(s) recipiente(s), pode haver aviso na forma prescrita por agência governamental que regulamenta a fabricação, uso ou venda de produtos farmacêuticos ou biológicos, que reflita a aprovação pela agência da fabricação, uso ou venda para administração a seres humanos.

Além disso, os anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser conjugados a várias moléculas efetoras tais como polipeptídeos heterólogos, drogas, radionucleotídeos ou toxinas. Vide, por exemplo, as Patentes PCT n° WO 92/08495, WO 91/14438, WO 89/12624; Patente Norte- Americana n° 5.314.995; e EP 396.387. Anticorpo ou seu fragmento pode ser conjugado a porção terapêutica tal como citotoxina, por exemplo agente citostático ou citocida, agente terapêutico ou íon de metal radioativo, tal como emissores alfa como, por exemplo, 213Bi. Citotoxina ou agente citotóxico inclui qualquer agente que seja prejudicial às células. Exemplos incluem paclitaxol, citocalasin B, gramicidin D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposida, tenoposida, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, di- hidróxi antracin diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1- desidrotestosterona, glicocorticóides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, puromicina e seus análogos ou homólogos. Agentes terapêuticos incluem, mas sem limitar-se a antimetabólitos (tais como metotrexato, 6- mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina), agentes alquilantes (tais como mecloretamina, tiotepa clorambucil, melfalan, carmustina (BSNU) e Iomustina (CCNU), ciclotosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocin, mitomicin C e cis-diclorodiamina platina (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (tais como daunorubicin (anteriormente daunomicin) e doxorubicin), antibióticos (tais como dactinomicin (anteriormente actinomicin), bleomicin, mitramicin e antramicin (AMC)) e agentes antimitóticos (tais como vincristina e vinblastina).

Métodos de conjugação dessa porção terapêutica a anticorpos são bem conhecidos; vide, por exemplo, Arnon etal, Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Câncer Therapy, em Monoclonal Antibodies and Câncer Therapyt Reisfeld et al (eds.), págs. 243-56 (Alan R. Liss1 Inc., 1985); Hellstrom et al, Antibodies for Drug Delivery, em Controlled Drug Delivery (segunda edição), Robinson et al (eds.), págs. 623-53 (Mareei Dekker, Inc., 1987); Thorpe, Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Câncer Therapy: A Review, em Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinicai Applications, Pinchera et al (eds.), págs. 475-506 (1985); Analysis, Results and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Câncer Therapy, em Monoclonal Antibodies for Câncer Detection and Therapy, Baldwin et al (eds.), págs. 303-16 (Academic Press, 1985) e Thorpe et al, The Preparation and Cytotoxic Properties of Antibody-Toxin Conjugates, Immunol. Rev. 62: 119-58 (1982). Altern ativamente, anticorpo pode ser conjugado a segundo anticorpo para formar heteroconjugado de anticorpos (vide, por exemplo, Segai na Patente Norte-Americana n° 4.676.980).

Os conjugados de acordo com a presente invenção podem ser utilizados para modificar dada reação biológica, o agente terapêutico ou porção de droga não deve ser considerado limitado a agentes terapêuticos químicos clássicos. A porção de droga pode ser, por exemplo, proteína ou polipeptídeo que possui atividade biológica desejada. Essas proteínas podem incluir, por exemplo, toxina tal como abrina, rícino A, exotoxina de pseudomonas ou toxina de difteria; proteína tal como fator de necrose tumorosa, α-interferona, β- interferona, fator de crescimento dos nervos, fator de crescimento derivado de plaquetas, ativador de plasminogênio de tecidos, agente apoptótico, tal como TNF- α, TNF-β, AIM I (vide Publicação Internacional nº WO 97/33899), AIM II (vide Publicação Internacional n° WO 97/34911), Iigante Fas (Takahashi et al, Int. Immunol., 6: 1567-1574 (1994)), VEGI (vide Publicação Internacional nº WO 99/23105), agente trombótico ou agente antiangiogênico, tal como angiostatin ou endostatin; ou modificadores de reação biológica tais como linfoquinas, interleucina 1 ("IL-1"), interleucina 2 ("IL-2"), interleucina 6 ("IL-6"), fator estimulante de colônias de macrófagos de granulócitos ("GM-CSF"), fator estimulante de colônias de granulócitos ("G-CSF") ou outros fatores de crescimento.

Terapia genética com base em anticorpos

Em outro aspecto da presente invenção, ácidos nucleicos que compreendem seqüências que codificam anticorpos ou seus fragmentos de anticorpos são administrados para tratar, inibir ou evitar doença ou disfunção associada a expressão aberrante e/ou ativação do sistema complemento por meio de terapia genética. Terapia genética designa terapia realizada por meio da administração a paciente de ácido nucleico expresso ou que pode ser expresso. Nesta realização da presente invenção, os ácidos nucleicos produzem a sua proteína codificada que media efeito terapêutico. Qualquer dos métodos de terapia genética disponíveis pode ser utilizado de acordo com a presente invenção. Exemplos de métodos são descritos abaixo.

Para análises gerais dos métodos de terapia genética, vide Goldspiel et al, Clinicai Pharmacy 12: 488-505 (1993); Wu e Wu, Biotherapy 3: 87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. PharmacoL Toxicol. 32: 573-596 (1993); Mulligan, Science 260: 926-932 (1993); e Morgan e Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217 (1993); May, TIBTECH 11 (5): 155-215 (1993).

Em um aspecto, o composto compreende seqüências de ácidos nucleicos que codificam anticorpo, em que as mencionadas seqüências de ácidos nucleicos são parte de vetores de expressão que expressam o anticorpo ou seus fragmentos, proteínas quiméricas ou cadeias leve ou pesada em hospedeiro apropriado. Particularmente, essas seqüências de ácido nucleico possuem promotores ligados operativamente à região de codificação do anticorpo, em que o mencionado promotor é indutível ou constitutivo e, opcionalmente, específico de tecido.

Em outra realização específica, são utilizadas moléculas de ácido nucleico em que as seqüências de codificação de anticorpos e quaisquer outras seqüências desejadas são ladeadas por regiões que promovem recombinação homóloga em local desejado no genoma, de forma a fornecer expressão intracromossômica do anticorpo que codifica ácidos nucleicos (Koller e Smithies, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 86: 8932-8935 (1989); Zijlstra et al, Nature 342: 435-438 (1989). Em realizações específicas, a molécula de anticorpo expressa é anticorpo de fita simples; alternativamente, as seqüências de ácidos nucleicos incluem seqüências que codificam as cadeias leve e pesada do anticorpo, ou seus fragmentos.

O fornecimento dos ácidos nucleicos a paciente pode ser direto, caso em que o paciente é exposto diretamente ao ácido nucleico ou vetores que conduzem ácido nucleico, ou indiretamente, caso em que as células são transformadas em primeiro lugar com os ácidos nucleicos in vitro e transplantadas em seguida no paciente. Estas duas abordagens são conhecidas, respectivamente, como terapia genética in vivo ou ex vivo.

Em realização específica, as seqüências de ácido nucleico são administradas diretamente in vivo, em que é expresso para gerar o produto codificado. Isso pode ser realizado por meio de qualquer dentre numerosos métodos conhecidos na técnica, tais como por meio de sua construção como parte de vetor de expressão de ácido nucleico apropriado e sua administração de forma que se tornem intracelulares, por exemplo, por meio de infecção utilizando retrovirais defeituosos ou atenuados ou outros vetores virais (vide Patente Norte-Americana n° 4.980.286), por meio de injeção direta de DNA bruto ou de bombardeamento de micropartículas (tal como disparador de genes; Biolistic, DuPont), ou de revestimento com lipídios ou receptores da superfície celular ou agentes de transfecção, encapsulação em lipossomos, micropartículas ou microcápsulas, ou por meio de sua administração em ligação a peptídeo que conhecidamente entra no núcleo, por meio de sua administração em ligação a ligante sujeito a endocitose mediada por receptor (vide, por exemplo, Wu e Wu, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432 (1987)) (que pode ser utilizado para dirigir tipos de células que expressam especificamente os receptores) etc. Em outra realização, podem ser formados complexos de ligante e ácido nucleico em que o ligante compreende peptídeo viral fusogênico para romper endossomos, permitindo que o ácido nucleico evite a degradação lisossômica. Em ainda outra realização, o ácido nucleico pode ser dirigido in vivo para absorção e expressão específica de células direcionando receptor específico (vide, por exemplo, as Publicações PCT n0 WO 92/06180; WO 92/22635; WO 92/20316; WO 93/14188; WO 93/20221). Alternativamente, o ácido nucleico pode ser introduzido de forma intracelular e incorporado a DNA de célula hospedeira para expressão, por meio de recombinação homóloga (Koller e Smithies, Proc. Nati Acad. Sei. U. S. A. 86: 8932-8935 (1989); Zijlstra et ai, Nature 342: 435-438 (1989)).

Em realização específica, serão utilizados vetores virais que contêm seqüências de ácido nucleico que codificam anticorpo de acordo com a presente invenção. Pode-se utilizar, por exemplo, vetor retroviral (vide Miller et al, Meth. Enzymoi 217: 581-599 (1993)). Estes vetores retrovirais contêm os componentes necessários para a correta embalagem do genoma viral e integração no DNA da célula hospedeira. As seqüências de ácidos nucleicos que codificam o anticorpo a ser utilizado em terapia genética são clonadas em um ou mais vetores, o que facilita o fornecimento do gene para paciente. Mais detalhes sobre vetores retrovirais podem ser encontrados em Boesen et al, Biotherapy 6: 291-302 (1994), que descreve o uso de vetor retroviral para fornecer o gene mdrl para células haste hematopoiéticas, a fim de tornar as células haste mais resistentes a quimioterapia. Outras referências que ilustram o uso de vetores retrovirais em terapia genética são: Clowes et al, J. Clin. Invest. 93: 644-651 (1994); Kiem et al, Blood 83: 1467-1473 (1994); Salmons e Gunzberg1 Human Gene Therapy 4: 129-141 (1993); e Grossman e Wilson, Curr. Opin. Gen. and Dev. 3: 110-114 (1993).

Adenovírus pode também ser utilizado na presente invenção. Adenovírus são veículos especialmente atrativos na presente invenção para o fornecimento de anticorpos para epitélios respiratórios. Adenovírus naturalmente infectam epitélios respiratórios. Outros alvos para sistemas de fornecimento com base em adenovírus são o fígado, o sistema nervoso central, células endoteliais e músculos. Adenovírus apresentam a vantagem de serem capazes de infectar células não divisoras. Kozarsky e Wilson, Curr. Opin. Gen. Dev. 3: 499-503 (1993) apresentam análise de terapia genética com base em adenovírus. Bout et al, Human Gene Therapy 5: 3-10 (1994) demonstraram o uso de vetores de adenovírus para transferir genes para o epitélio respiratório de macacos rhesus. Outros casos do uso de adenovírus em terapia genética podem ser encontrados em Rosenfeld et al, Science 252: 431-434 (1991); Rosenfeld et al, Cell 68: 143-155 (1992); Mastrangeli et al, J. Clin. Invest. 91. 225-234 (1993); Publicação PCT n0 WO 94/12649; e Wang et al, Gene Therapy 2: 775-783 (1995). Vírus adeno-associado (AAV) também foi proposto para uso em terapia genética (Walsh et al, Proc. Soe. Exp. Biol. Med. 204: 289-300 (1993); Patentes Norte-Americanas n° 5.436.146, 6.632.670 e 6.642.051).

Outra abordagem para terapia genética envolve a transferência de gene para células em cultura de tecidos por meio de métodos tais como eletroporação, lipofecção, transfecção mediada por fosfato de cálcio ou infecção viral. Normalmente, o método de transferência inclui a transferência de marcador selecionável para as células. As células são colocadas em seguida sob seleção para isolar as células que absorveram e estão expressando o gene transferido. Estas células são fornecidas em seguida para paciente.

Nesta realização, o ácido nucleico é introduzido em célula antes da administração in vivo da célula recombinante resultante. Essa introdução pode ser conduzida por meio de qualquer método conhecido na técnica, incluindo, mas sem limitar-se a transfecção, eletroporação, microinjeção, infecção com vetor viral ou de bacteriófago que contenha as seqüências de ácido nucleico, fusão celular, transferência genética mediada por cromossomos, transferência genética mediada por microcélulas, fusão de esferoplastas etc. Numerosos métodos são conhecidos na técnica para a introdução de genes exógenos em células (vide, por exemplo, Loeffler e Behr, Meth. Enzymol. 217: 599-618 (1993); Cohen et al, Meth. EnzymoL 217: 618- 644 (1993); Cline, Pharmac. Ther. 29: 69-92m (1985)) e podem ser utilizados de acordo com a presente invenção, desde que as funções fisiológicas e de desenvolvimento necessárias das células receptoras não sejam prejudicadas. O método deverá proporcionar a transferência estável do ácido nucleico para a célula, de forma que o ácido nucleico possa ser expresso pela célula e, preferencialmente, herdável e expressável pela sua prole celular.

As células recombinantes resultantes podem ser fornecidas para paciente por meio de vários métodos conhecidos na técnica. Glóbulos sangüíneos recombinantes (tais como células progenitoras ou haste hematopoiéticas) são preferencialmente administrados de forma intravenosa. A quantidade de células idealizadas para uso depende do efeito desejado, estado do paciente etc. e pode ser determinada pelos técnicos no assunto.

Células em que ácido nucleico pode ser introduzido para fins de terapia genética englobam qualquer tipo de célula disponível desejado e incluem, mas sem limitar-se a células epiteliais, células endoteliais, queratinócitos, fibroblastos, células musculares, hepatócitos; células sangüíneas, tais como linfócitos T, linfócitos B, monócitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, megacariócitos, granulócitos; várias células haste ou progenitoras, particularmente células haste ou progenitoras hematopoiéticas, tais como obtidas a partir de medula óssea, sangue de cordão umbilical, sangue periférico, fígado de feto etc.

Em uma realização, a célula utilizada para terapia genética é autóloga para o paciente. Seqüências de ácido nucleico que codificam anticorpo de acordo com a presente invenção são introduzidas nas células, de forma que possam ser expressas pelas células ou sua prole e as células recombinantes são administradas em seguida in vivo para efeito terapêutico. Em realização específica, são utilizadas células haste ou progenitoras. Quaisquer células haste e/ou progenitoras que possam ser isoladas e mantidas in vitro podem ser potencialmente utilizadas de acordo com esta realização da presente invenção (vide, por exemplo, Publicação PCT n° WO 94/08598; Stemple e Anderson, Ce//71: 973-985 (1992); Rheinwald, Meth. Cell Bio. 21A: 229 (1980); e Pittelkow e Scott, Mayo Clinic Proc. 61: 771 (1986)).

Modulação da expressão de componente de sistema complemento por siRNA

Comprovou-se que siRNAs são úteis como ferramenta em estudos de modulação da expressão genética em que antagonistas tradicionais tais como moléculas pequenas ou anticorpos podem ser menos eficazes (Shi, Y., Trends in Genetics 19 (1): 9-12 (2003)). RNAs de fita dupla sintetizados in vitro que contêm de 21 a 23 nucleotídeos de comprimento podem agir como RNAs interferentes (iRNAs) e podem inibir especificamente a expressão genética (Fire, A., Trends in Genetics 391; 806-810 (1999)). Estes iRNAs agem mediando a degradação dos seus RNAs alvo. Como eles possuem menos de trinta nucleotídeos de comprimento, não acionam mecanismo de defesa antiviral celular. Esses mecanismos incluem a produção de interferon e desligamento geral da síntese de proteínas de células hospedeiras. Praticamente, siRNAs podem ser sintetizados e clonados em seguida em vetores de DNA. Esses vetores podem ser transfectados e forçados a expressar o siRNA em altos níveis. O alto nível de expressão de siRNA é utilizado para "knockdown" ou para reduzir significativamente a quantidade de proteína produzida em células e, desta forma, é útil em experimentos em que se acredita que a sobreexpressão de proteína esteja ligada a disfunção tal como câncer. siRNAs são antagonistas úteis para complementar proteínas de processo limitando a produção celular do antígeno e para inibir a ativação da cascata de complemento.

Peptideomiméticos ε moléculas pequenas

É bem conhecido dos técnicos no assunto que é possível substituir peptídeos com peptideomiméticos. Peptideomiméticos geralmente são preferíveis como agentes terapêuticos a peptídeos devido à sua maior biodisponibilidade e relativa falta de ataque de enzimas proteolíticas. Métodos de modelagem molecular podem ser utilizados para projetar peptideomimético que imite a estrutura dos peptídeos relativos a complemento descritos no presente. Conseqüentemente, a presente invenção também fornece peptideomiméticos e outros compostos de chumbo que podem ser identificados com base nos dados obtidos a partir da análise estrutural da proteína de sistema complemento. Fator D potencial análogo pode ser examinado utilizando modelagem por computador, empregando programa de docking tal como GRAM, DOCK ou AUTODOCK. Este procedimento pode incluir adequação por computador de potenciais análogos de Fator D. Programas de computador podem também ser empregados para estimar a atração, repulsa e ocultação estérica de análogo a potencial sítio de ligação. Geralmente, quanto mais firme a adequação (tal como mais baixa a ocultação estérica e/ou maior a força atrativa), mais potente será a droga potencial, pois estas propriedades são consistentes com constante de ligação mais firme. Além disso, quanto mais especificidade no projeto de droga potencial, mais provavelmente a droga não interferirá com outras propriedades do sistema de expressão. Isso minimizará potenciais efeitos colaterais devido a interações indesejadas com outras proteínas.

Inicialmente, potencial análogo de Fator D poderá ser obtido por meio de seleção de biblioteca de peptídeos aleatória produzida por bacteriófago recombinante, por exemplo, ou biblioteca química. Ligante análogo selecionado desta forma poderá ser sistematicamente modificado em seguida por programas de modelagem por computador até a identificação de um ou mais potenciais ligantes promissores.

Essa modelagem por computador permite a seleção de quantidade finita de modificações químicas racionais, ao contrário da quantidade incontável de modificações químicas essencialmente aleatórias que poderão ser realizadas, das quais qualquer uma poderá gerar droga útil. Portanto, utilizando a estrutura tridimensional descrita no presente e modelagem por computador, grande quantidade de compostos é rapidamente selecionada e poucos candidatos prováveis podem ser determinados sem a síntese trabalhosa e quantidades não discriminadas de compostos.

Após a identificação de potencial análogo de Fator D, ele pode ser selecionado a partir de biblioteca de substâncias disponíveis comercialmente por meio da maior parte das grandes indústrias químicas, incluindo a Merck, GlaxoWelcome, Bristol Meyers Squib, Monsanto/Searle, Eli Lilly, Novartis e Pharmacia UpJohn, ou, alternativamente, o ligante potencial é sintetizado a partir do zero. Conforme mencionado acima, a síntese a partir do zero de um ou mesmo de grupo relativamente pequeno de compostos específicos é razoável na técnica de projeto de drogas.

Alternativamente, com base nas estruturas moleculares das regiões variáveis dos anticorpos anti-Fator D1 poder-se-á utilizar projeto molecular racional e modelagem molecular para gerar e selecionar pequenas moléculas que imitem as estruturas moleculares da região de ligação dos anticorpos e inibir as atividades de Fator D. Estas moléculas pequenas podem ser peptídeos, peptideomiméticos, oligonucleotídeos ou compostos orgânicos.

Exemplo

Eficácia de Anticorpo em Neovascularizacão Coroidal (CNV) Induzida por Laser como Modelo de AMD Úmida

A eficácia de injeções intraoculares de anticorpo pode ser testada em modelo de CNV de lesão a laser conforme descrito anteriormente por Krzystolik, M. G. et al (Arch. Ophthalm. 2002; 120: 338-346). Este modelo pode ser utilizado para testar a eficácia de qualquer possível droga para a prevenção e/ou melhoria de AMD. Este modelo de CNV induzido por laser utiliza laser verde de argônio para induzir CNV na mácula de macacos. Existe boa correlação entre o número de lesões de CNV com vazamento angiográfico significativo.

Existem duas fases dos estudos: Fase 1, a fase de prevenção, envolve o início do tratamento com anticorpos antes da indução a laser do CNV e uma semana após a exposição ao laser para inibir a formação de CNV1 que tipicamente aparece duas a três semanas após lesão por laser. A Fase 2, a fase de tratamento, é iniciada no dia 42 (três semanas após a lesão por laser) quando lesões por CNV seriam esperadas nos olhos controle a partir da fase 1. A Fase 2 determina o efeito de tratamento sobre a atenuação da extensão e o vazamento das lesões de CNV existentes.

Dez macacos cynomolgus (Macaca fascicularis) são tipicamente utilizados em estudo deste tipo. Os macacos são anestesiados para todos os procedimentos com injeções intramusculares de, por exemplo, cloridrato de cetamina (20 mg/kg); maleato de acepromazina (0,125 mg/kg); e sulfato de atropina (0,125 mg/kg). Suplemento de anestesia de 5 a 6 mg/kg de cloridrato de cetamina pode ser administrado conforme o necessário. Além disso, cloridrato de proparacaína a 0,5% é tipicamente utilizado para anestesia local. Anestesia suplementar, com solução de pentobarbital sódio intravenosa (5 mg/kg), pode ser administrada antes da enucleação. Os animais sofrem eutanásia após o experimento.

Tratamento com anticorpos

O anticorpo a ser testado é administrado em tampão fisiológico sob concentração, por exemplo, de cerca de 10 μg/μl. O olho controle recebe injeção de veículo que consiste de todos os componentes, exceto o anticorpo a ser testado. Injeções intraoculares de, por exemplo, cerca de 50 μl por olho com anticorpo ou veículo são realizadas sobre cada olho, respectivamente, através do pars plana utilizando agulha de 30 gauge e seringa de tuberculina após a instilação de anestesia local e solução de 5% iodopovidona. O anticorpo é retirado de ampola por meio de filtro de 5 μm e nova agulha de 30 gauge (pontuda) é utilizada para a injeção intraocular. Após a injeção, ungüento oftálmico bactericida tal como bacitracin é instilado nos fórnices. Os locais de injeção são tipicamente variados para evitar trauma à esclera.

Na fase 1, o olho direito ou esquerdo de cada animal é atribuído aleatoriamente para receber injeções intraoculares de anticorpo em dose de, por exemplo, cerca de 500 μg (50 μl por olho) e esse olho é denominado o olho de prevenção. A dose utilizada pode ser determinada com base em estudo de segurança e toxicologia antes deste estudo de eficácia, ou por outros meios clinicamente apropriados. O outro olho é atribuído para receber injeções intraoculares de veículo e é denominado o olho controle. Os dois olhos de cada animal recebem tipicamente duas injeções intraoculares com o anticorpo a ser testado ou o veículo isoladamente nos dias 0 e 14 antes do tratamento a laser. No dia 21, todos os olhos sofrem fotocoagulação a laser verde de argônio para induzir lesões por CNV. No dia 28, uma semana após a indução a laser, o olho de prevenção recebe outra injeção de anticorpo e o olho controle recebe veículo. A fase 2 do estudo começa no dia 42 ou três semanas após a indução a laser, quando se espera o desenvolvimento de CNV. Após angiografia por fluoresceína no dia 42, os dois olhos de cada animal receberão injeções intraoculares de anticorpo em dose de, por exemplo, cerca de 500 μg (50 μΙ por olho) e isso é repetido no dia 56.

INDUCAO DE CNV EXPERIMENTAL

As membranas de CNV são induzidas na mácula de macacos cynomolgus com queimas a laser verde de argônio (Laser de Tintura de Argônio Coherent 920; Coherent Medicai Laser, Palo Alto CA), utilizando lâmpada dividida e lente de contato de fundo plano. Nove lesões são colocadas simetricamente na mácula de cada olho por cirurgião com máscara. As variáveis de laser incluem tamanho de mancha de 50 a 100 μηι, duração de 0,1 segundo e potência que varia de 350 a 700 mW. A potência utilizada é determinada pela capacidade do laser de produzir bolha e pequena hemorragia sob a potência selecionada. Caso nenhuma hemorragia seja observada, ponto de laser adicional será colocado ao lado do primeiro ponto seguindo o mesmo procedimento de laser. Fotografias coloridas e angiografia de fluoresceína são tipicamente utilizadas para detectar e medir a extensão e o vazamento do CNV. Qualquer método capaz de medir CNV induzido por laser e seus efeitos associados, entretanto, pode ser utilizado.

EXAMES OCULARES

Os olhos dos animais são verificados para determinar defeito aferente das pupilas relativo e dilatados em seguida com 2,5% cloridrato de fenilefrina e 0,8% tropicamida. Os dois olhos são examinados utilizando biomicroscopia de lâmpada dividida e oftalmoscopia indireta nos dias 0, 14, 28, 42 e 56 (antes da injeção de anticorpo); dias 1, 15, 29, 43 e 57 (após a injeção); dia 21 (antes do laser); dias 35 e 49 (dias intermediários); e dia 63 (enucleação e morte). fotografta colorida e angiografia fluorescente Fotografia de fundo é tipicamente realizada sobre todos os animais nos mesmos dias do exame ocular. Fotografias podem ser obtidas com câmera de fundo (Canon Fundus CF-60Z; Canon U. S. A. Inc., Lake Success NY) e filme de 35 mm, mas qualquer dispositivo de fotografia pode ser utilizado.

O Sistema de Angiografia Digital Imagenet (Topcon 501 A e sistema lmagenet; Topcon America Corp., Paramus NJ) pode ser utilizado para angiografia de fluoresceína. Fotografias livres de vermelho dos dois olhos são tipicamente obtidas, seguidas por angiografia de fluoresceína utilizando 0,1 ml/kg de peso do corpo de 10% sódio fluoresceína (Akorn, Inc., Abita Springs LA) em velocidade de 1 ml/s. Após a injeção de fluoresceína, rápida série de imagens é obtida no primeiro minuto do pólo posterior primeiro do olho direito e depois do olho esquerdo. Pares de imagens adicionais são tipicamente obtidos após cerca de um a dois e cinco minutos. Entre dois e cinco minutos, duas imagens dos campos periféricos intermediários (temporal e nasal) são tomadas de cada olho. Realiza-se angiografia de fluoresceína na linha base (dia 0) e dias 7, 14, 29, 42,49, 57 e 63.

Análise de dados oftálmicos Fotografias e angiogramas são avaliados para determinar a evidência de vazamento angiográfico, hemorragias ou quaisquer outras anormalidades. As hemorragias de fundo são avaliadas com base em sistema de avaliação com hemorragias da retina que envolve menos de três áreas de disco definidas como grau 1, hemorragias entre três e seis áreas de disco definidas como grau 2 e hemorragias de mais de seis áreas de disco definidas como grau 3. A associação de hemorragias com membranas de CNV ou o local de indução a laser também é determinada. Sangramento clinicamente significativo é definido como qualquer hemorragia de fundo maior ou igual à área de seis discos. Inflamação ocular também é determinada utilizando biomicroscopia de lâmpadas divididas. Células vítreas e câmara anterior são contadas com lâmpada dividida de 2 mm em alta ampliação e avaliadas utilizando o esquema da Academia Norte-Americana de Oftalmologia. As lesões por CNV são avaliadas por meio de análise de angiogramas de fluoresceína realizada nos dias 35, 42, 49, 56 e 63 por examinadores experimentados, tipicamente dois, que avaliam por opinião de consenso. As lesões de CNV são avaliadas de acordo com o esquema a seguir, utilizando angiográficos padronizados para comparação. Lesões de grau 1 não apresentam hiperfluorescência. Lesões de grau 2 exibem hiperfluorescência sem vazamento. Lesões de grau 3 exibem hiperfluorescência nas imagens iniciais ou de trânsito médio e vazamento posterior. Lesões de grau 4 exibem hiperfluorescência brilhante no trânsito e vazamento posterior além das áreas tratadas. Lesões de grau 4 são definidas como clinicamente significativas.

Análise estatística pode ser realizada utilizando os Dados de Painel Agregados à População com Equações de Estimativa Generalizada e a razão de taxa de incidência (IRR). A taxa de incidência normalmente é definida como o número de lesões de grau 4 que ocorrem durante dado intervalo dividido pelo número total de lesões induzidas. Na fase 1, o IRR designa a razão entre a taxa de incidência de lesões de grau 4 nos olhos de prevenção e a taxa de incidência em olhos controle. IRR 1 significa ausência de diferença entre taxas de incidência. Número muito menor que 1 indicará redução da incidência de lesões de grau 4 no grupo de prevenção contra o grupo controle. Na fase 2, a incidência de lesões de grau 4 nos olhos controle contra os olhos de tratamento é comparada. Isso significa que a incidência de lesões de grau 4 é comparada ao longo do tempo no conjunto de olhos que são atribuídos em primeiro lugar ao grupo controle mas, nos dias 42 e 56, são tratados com anticorpo e tornam-se olhos de tratamento. Seleção de agentes úteis no tratamento de AMD

O estudo e o tratamento de degeneração macular relativa à idade (AMD) podem ser realizados utilizando novo modelo animal que compreende camundongos com deficiência de proteína quimioatrativa de monócitos 1 (Ccl- 2; também conhecida como MCP-1) ou seu cognato receptor de quemoquina C-C 2 (Ccr-2) (Ambati1 J. et al, Nat. Med. 2003 nov., 9 (11): 1390-7. Epub 2003 Out 19). Estes camundongos desenvolvem características cardinais de AMD, que incluem acúmulo de Iipofuscin no epitélio pigmentado retinal (RPE) e drusen abaixo dele, atrofia fotorreceptora e neovascularização coroidal (CNV).

O tratamento destes camundongos com agente desejado pode permitir a determinação da eficácia desse agente por sua eficácia no tratamento de AMD.

Claims (49)

1. MÉTODO DE PREVENÇÃO OU MELHORIA DE DOENÇA OCULAR QUE ENVOLVE ATIVAÇÃO DE COMPLEMENTO, caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma quantidade efetiva de um inibidor de complemento a um paciente necessitado dessa administração.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a doença ocular é selecionada a partir do grupo que consiste de degeneração macular, retinopatia diabética e angiogênese ocular.

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o paciente necessita da inibição de neovascularização ocular que afeta o coróide, o epitélio pigmentado da retina, ou tecido da retina.

4. MÉTODO, de acordo a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o inibidor de complemento inibe a via de complemento alternativa.

5. MÉTODO, de acordo a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o inibidor de complemento é Fator H, ou seu peptídeo funcional ou seu peptideomimético.

6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o inibidor de complemento um anticorpo ou seu fragmento de ligação.

7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o inibidor de complemento é um fragmento de anticorpo que compreende Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fv de fita simples, diacorpo ou um anticorpo de domínio único.

8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o inibidor de complemento é um anticorpo monoclonal.

9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o inibidor de complemento é um anticorpo quimérico, um anticorpo multiespecífico, um anticorpo desimunizado, humanizado, primatizado ou humano.

10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou seu fragmento de ligação compreende uma unidade terapêutica.

11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6, 7 ou 9, caracterizado pelo fato de que o anticorpo liga-se especificamente a Fator D, properdina, Fator B, Fator Ba ou Fator Bb1 C2, C2a, C3a, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9 ou C5b-9.

12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo liga-se especificamente a Fator D.

13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal 166-32 produzido a partir do hibridoma depositado junto à ATCC e denominado HB12476.

14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o anticorpo liga-se especificamente ao mesmo epítopo do anticorpo monoclonal 166-32 produzido a partir do hibridoma depositado junto à ATCC e denominado HB 12476.

15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é anticorpo monoclonal humanizado derivado de -166-32 produzido a partir do hibridoma depositado junto à ATCC e denominado HB 12476.

16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo liga-se especificamente ao componente do complemento C5a.

17. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é 137-26 produzido a partir do hibridoma depositado junto à ATCC e denominado PTA-3650.

18. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o anticorpo liga-se ao mesmo epítopo que o anticorpo monoclonal 137-26 produzido a partir do hibridoma depositado junto à ATCC e denominado PTA-3650.

19. MÉTODO, de acordo a reivindicação 1, 6, 12 ou 16, caracterizado pelo fato de que o inibidor de complemento é administrado por meio de administração parenteral, administração intradérmica, administração intramuscular, administração intraperitoneal, administração intravenosa, administração subcutânea, administração intranasal, administração oral, administração enteral, administração tópica, administração intratecal, administração intraventricular, epidural, inalação, implante de liberação sustentada biocompatível ou que pode sofrer bioerosão ou implante de bomba de infusão.

20. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o inibidor de complemento é administrado localmente.

21. MÉTODO, de acordo a reivindicação 1, 6, 12 ou 16, caracterizado pelo fato de que o inibidor de complemento é administrado por meio de administração intraocular, administração intravitreal ou administração subconjuntival.

22. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, 6, 12 ou 16, caracterizado pelo fato de que o inibidor de complemento é administrado na forma de uma solução de lavagem dos olhos, ungüento para os olhos, proteção para os olhos ou solução de colírio.

23. MÉTODO, de acordo a reivindicação 1, 6, 12 ou 16, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a etapa de administração de um composto imunomodulador, um composto imunossupressivo, um composto antiinflamatório ou composto anti- angiogênico, ao mencionado paciente.

24. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 12, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente administrar ao paciente um fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) objetivando terapia anti-angiogênese.

25. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 12, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente administrar ao paciente um esteróide.

26. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6, 12 ou 16, caracterizado pelo fato de que a dose do inibidor de complemento administrada ao paciente está entre 0,1 mg/kg a 100 mg/kg.

27. MÉTODO DE PREVENÇÃO OU MELHORIA DE DOENÇA OCULAR QUE ENVOLVE ATIVAÇÃO DE COMPLEMENTO, caracterizado pelo fato de compreende administrar um siRNA específico para uma proteína do sistema complemento a um paciente que necessite esta administração.

28. MÉTODO DE PREVENÇÃO OU MELHORIA DE DOENÇA OCULAR QUE ENVOLVE ATIVAÇÃO DE COMPLEMENTO, caracterizado pelo fato de compreende administrar um ácido nucleico que codifica um inibidor do sistema complemento a um paciente que necessite esta administração.

29. USO DE UM INIBIDOR DE COMPLEMENTO, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para prevenção ou melhoria de doença ocular que envolve ativação de complemento.

30. USO, de acordo com a reivindicação 29, , caracterizado pelo fato de que a doença ocular é selecionada a partir do grupo que consiste de degeneração macular, retinopatia diabética e angiogênese ocular.

31. USO, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o medicamento inibe a neovascularização ocular que afeta o coróide, o epitélio pigmentado da retina, ou tecido da retina.

32. USO, de acordo a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o medicamento inibe a via de complemento alternativa.

33. USO, de acordo a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o inibidor de complemento é Fator H, ou seu peptídeo funcional ou seu peptideomimético.

34. USO, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o inibidor de complemento é um anticorpo ou seu fragmento de ligação.

35. USO, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o inibidor de complemento é um fragmento de anticorpo que compreende Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fv de fita simples, diacorpo ou um anticorpo de domínio único.

36. USO, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o inibidor de complemento é um anticorpo monoclonal.

37. USO, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o inibidor de complemento é um anticorpo quimérico, um anticorpo multiespecífico, um anticorpo desimunizado, humanizado, primatizado ou humano.

38. USO, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou seu fragmento de ligação compreende uma unidade terapêutica.

39. USO, de acordo com a reivindicação 34, 35 ou 37, caracterizado pelo fato de que o anticorpo liga-se especificamente a Fator D, properdina, Fator B, Fator Ba ou Fator Bb, C2, C2a, C3a, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9 ou C5b-9.

40. USO, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o anticorpo liga-se especificamente a Fator D.

41. USO, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal 166-32 produzido a partir do hibridoma depositado junto à ATCC e denominado HB12476.

42. USO1 de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o anticorpo liga-se especificamente ao mesmo epítopo do anticorpo monoclonal 166-32 produzido a partir do hibridoma depositado junto à ATCC e denominado HB 12476.

43. USO, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é anticorpo monoclonal humanizado derivado de 166-32 produzido a partir do hibridoma depositado junto à ATCC e denominado HB 12476.

44. USO, de acordo com a reivindicação 34 caracterizado pelo fato de que o anticorpo liga-se especificamente ao componente do complemento C5a.

45. USO, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é 137-26 produzido a partir do hibridoma depositado junto à ATCC e denominado PTA-3650.

46. USO, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que o anticorpo liga-se ao mesmo epítopo que o anticorpo monoclonal 137-26 produzido a partir do hibridoma depositado junto à ATCC e denominado PTA-3650.

47. USO, de acordo com a reivindicação 29, 34, 40 ou 44, caracterizado pelo fato de que o medicamento está na forma de uma solução de lavagem dos olhos, ungüento para os olhos, proteção para os olhos ou solução de colírio.

48. USO DE UM siRNA ESPECÍFICO PARA UMA PROTEÍNA DO SISTEMA COMPLEMENTO, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para prevenção ou melhoria de doença ocular que envolve ativação de complemento.

49. USO DE UM ÁCIDO NUCLEICO QUE CODIFICA UM INIBIDOR DO SISTEMA COMPLEMENTO, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para prevenção ou melhoria de doença ocular que envolve ativação de complemento.