PT2500030E - Uso de inibidores da via do complemento para tratar doenças oculares - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "Uso de inibidores da via do complemento para tratar doenças oculares"

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se à inibição da via do complemento, nomeadamente fator D, em doentes que padecem de condições relacionadas com o sistema ocular e doenças associadas com a ativação do complemento tal como degeneração macular relacionada com a idade, retinopatia diabética.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A degeneração da mácula é uma expressão clinica que é usada para descrever uma família de doenças que se caracterizam pela perda progressiva de visão central associada com anomalias da membrana de Bruch, do coróide, da retina neural e/ou do epitélio do pigmento da retina. No centro da retina situa-se a mácula lútea, que tem cerca de 1/3 a 1/2 cm de diâmetro. A mácula proporciona visão detalhada, nomeadamente no seu centro (a fóvea), porque os cones encontram-se em maior densidade. Os vasos sanguíneos, células ganglionares, camada e células nucleares internas e camadas plexiformes estão todos deslocados para um dos lados (em vez de se manterem por cima destas) , permitindo assim que a luz tenha um acesso mais direto aos cones. Debaixo da retina situa-se o coróide, um conjunto de vasos sanguíneos inseridos num tecido fibroso e o epitélio pigmentado (PE), que se sobrepõe à camada coróide. Os vasos sanguíneos do coróide proporcionam nutrição à retina (nomeadamente às suas células visuais) . 0 coróide e o PE encontram-se na parte posterior do olho.

As células do epitélio de pigmento da retina (RPE), que constituem o PE, produzem, armazenam e transportam vários fatores que são responsáveis pelo funcionamento normal e sobrevivência de fotorreceptores . Estas células multifuncionais transportam metabolitos para os fotorreceptores a partir do seu fornecimento de sangue, a lâmina coreocapilária do olho. As células RPE também funcionam como macrófagos, fagocitando as pontas dos segmentos exteriores dos bastonetes e cones, que são produzidos no decurso normal da fisiologia celular. Vários iões, proteínas e água movem-se entre as células RPE e o espaço inter-fotorreceptor e em última análise estas moléculas efetuam o metabolismo e a viabilidade dos fotorreceptores. A degeneração macular relacionada com a idade (AMD), a degeneração macular mais prevalecente, está associada com a perda progressiva de acuidade visual na parte central do campo visual, alterações na visão a cores e adaptação ao escuro anómala e sensibilidade. Descreveram-se duas principais manifestações clínicas de AMD como a forma seca ou atrófica e a forma húmida ou exsudativa. A forma seca está associada com a morte de células atróficas da retina central ou mácula, que é necessária para a visão fina usada em atividades tal como ler, guiar ou reconhecer caras. Cerca de 10-20% destes doentes de AMD seca progridem para a segunda forma de AMD conhecida como AMD húmida. A AMD húmida (neovascular/exsudativa) é causada por crescimento anómalo de vasos sanguíneos atrás da retina por baixo da mácula e derrame vascular, resultando em deslocamento da retina, hemorragia e formação de cicatriz. Tal resulta numa deterioração da visão ao longo de um período de meses a anos. Contudo, os doentes podem sofrer uma perda rápida de visão. Todos os casos de AMD húmida têm origem em AMD seca avançada. A forma húmida é responsável por 85% dos casos de cegueira devida a AMD. Na AMD húmida, à medida que os vasos sanguíneos perdem fluido e sangue, forma-se tecido de cicatrização que destrói a retina central.

Os fatores de risco mais significativos para o desenvolvimento de ambas as formas são a idade e a deposição de drusas, depósitos extracelulares anómalos, por trás do epitélio de pigmento da retina. As drusas provocam um estiramento lateral da monocamada de RPE e deslocamento físico da RPE do seu fornecimento vascular imediato, a lâmina coreocapilar. Este deslocamento cria uma barreira física que pode impedir a difusão normal de metabolitos e resíduos entre a lâmina coreocapilar e a retina. As drusas são os depósitos que funcionam como marcadores associados a AMD. A biogénese de drusas envolve disfunção de RPE, digestão deficiente dos segmentos exteriores dos fotorreceptores e subsequente acumulação de resíduos. As drusas contêm ativadores do complemento, inibidores do complemento, fragmentos de complemento específicos de ativação e componentes da via terminal, incluindo o complexo de ataque da membrana (MAC ou C5b-9) , o que sugere que a concentração focal destes materiais pode produzir um estímulo quimiotático potente para leucócitos atuando através de uma cascata de complemento (Killingsworth, et al., (2001) Exp Eye Res 73, 887-96) . Estudos recentes implicaram na sua formação a inflamação local e a ativação da cascata de complemento (Bok D. Proc Natl Acad Sei (USA). 2005; 102: 7053-4; Hageman GS, et al. Prog Retin Eye Res. 2001; 20: 705-32; Anderson DH, et al. Am J Ophthalmol. 2002; 134: 411-31. Johnson LV, et al. Exp Eye Res. 2001; 73: 887-96). A AMD húmida está associada com neovascularização coroidal (CNV) e é um processo biológico complexo. A patogénese da formação de novos vasos coroidais é pouco compreendida mas pensa-se que são importantes fatores tais como inflamação, isquemia e produção local de fatores angiogénicos. Apesar de se ter sugerido que a inflamação desempenha um papel, o papel do complemento ainda não foi explorado. Demonstrou-se num estudo preliminar que a CNV era causada por ativação do complemento num modelo de ratinho (Bora PS, J Immunol. 2005; 174: 491-497) . O sistema de complemento é uma componente crucial da imunidade inata contra infeção microbiana e compreende um grupo de proteínas que estão normalmente presentes no soro num estado inativo. Estas proteínas estão organizadas em três vias de ativação: as vias clássica, de lectina e alternativa (V.M. Holers, em Clinical Immunology: Principles and Practice, ed. R.R. Rich, Mosby Press; 1996, 363-391) . As moléculas à superfície de micróbios podem ativar estas vias resultando na formação de complexos de protéases conhecidos como C3-convertases. A via clássica é uma cascata dependente de cálcio/magnésio, que é normalmente ativada pela formação de complexos antigénio-anticorpo. Pode ser também ativada de uma forma independente de anticorpo por ligação de um dos complexos de proteína C-reativa com ligando e por muitos patogéneos incluindo bactérias gram-negativas. A via alternativa é uma cascata dependente de magnésio que é ativada por deposição e ativação de C3 em determinadas superfícies suscetíveis (e.g. polissacáridos da parede celular de leveduras e bactérias e determinados materiais de biopolímeros). A via alternativa participa na amplificação da atividade tanto da via clássica como da via de lectina (Suankratay, C., ibid; Farriers, T.C. et ai., Mol. Immunol. 27: 1155-1161 (1990)) . A ativação da via do complemento gera fragmentos biologicamente ativos de proteínas de complemento, e.g. anafilatoxinas C3a, C4a e C5a e complexos de ataque de membrana (MAC) C5b-9, que medeiam respostas inflamatórias através do envolvimento de quimiotaxia de leucócitos, ativação de macrófagos, neutrófilos, plaquetas, mastócitos e células endoteliais, aumento da permeabilidade vascular, citólise e lesão de tecidos. O fator D pode ser um alvo adequado para a inibição desta amplificação das vias do complemento porque a sua concentração plasmática em humanos é muito baixa (1,8 yg/ml) e demonstrou-se ser uma enzima limitante para ativação da via do complemento alternativa (P.H. Lesavre e H.J. Muller-Eberhard. J. Exp. Med., 1978; 148: 1498-1510; J.E. Volanakis et al., New Eng. J. Med., 1985; 312: 395-401). Demonstrou-se que a inibição da ativação do complemento era eficaz no tratamento de várias indicações de doenças usando modelos animais e estudos ex vivo, e.g. lúpus eritematoso sistémico e glomerulonefrite (Y. Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sei.; 1996, 93: 8563-8568). WO 99/42133 refere-se a inibidores de fator D, que se ligam a fator D e bloqueiam a atividade funcional do fator D na ativação do complemento. Os inibidores incluem moléculas de anticorpo, assim como homólogos, análogos e suas formas modificadas ou derivadas, incluindo fragmentos de imunoglobulinas tais como Fab, (Fab')2 e Fv, moléculas pequenas, incluindo péptidos, oligonucleótidos, peptidomiméticos e compostos orgânicos. Gerou-se um anticorpo monoclonal que se liga a fator D e bloqueia a sua capacidade de ativar o complemento e designou-se como 166-32. O hibridoma que produz este anticorpo foi depositado em American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, sob o número de acesso HB-12476.

Usando análise de polimorfismo de nucleótido único (SNP) de doentes de AMD, verificou-se que uma variante genética de fator Η (Y402H) estava estreitamente associada com aumento da incidência de AMD (Zareparsi S, Branham KEH, Li M, et ai. Am J Hum Genet. 2005; 77: 149-53; Haines JL, et al. Sei 2005; 208: 419-21). As pessoas que são homozigóticas ou heterozigóticas para esta mutação pontual do gene do fator H podem representar 50% dos casos de AMD. O fator H é o inibidor solúvel chave da via do complemento alternativa (Rodriguez de Cordoba S, et al. Mol Immunol 2004; 41: 355-67). Liga-se a C3b e assim acelera o decaimento da via alternativa de C3-convertase (C3bBb) e atua como um cofator para inativação proteolítica de C3b mediada por fator I. Estudos de coloração imuno-histoquímica mostram que há uma distribuição semelhante de fator H e MAC na interface RPE-coróide. As quantidades significativas de MAC depositadas nesta interface verificadas em doentes com AMD indicam que o haplotipo de fator Η (Y402H) pode ter função de inibição de complemento atenuada. Supõe-se que o fator Η (Y402H) possa ter uma afinidade de ligação mais baixa para C3b. Consequentemente, não é tão eficaz como o fator H de tipo selvagem na inibição da ativação da via do complemento alternativa. Isto põe o RPE e as células coroidais em risco permanente de ataque pelo complemento mediado pela via alternativa.

Demonstrou-se que a falta de fator H no plasma provoca ativação descontrolada da via alternativa com consumo de C3 e muitas vezes outras componentes do complemento terminal tal como C5. De acordo com esta revelação, sabe-se que os níveis plasmáticos de fator H decrescem em fumadores, um fator de risco conhecido para AMD (Esparza-Gordillo J, et al. Immunogenetics. 2004; 56: 77-82) .

Presentemente, não existe terapêutica médica comprovada para AMD seca e não há tratamentos disponíveis para AMD seca avançada. Em casos selecionados de AMD húmida, uma técnica conhecida como fotocoagulação a laser pode ser eficaz para selar vasos sanguíneos que derramam ou que sangram. Infelizmente, a fotocoagulação a laser habitualmente não restaura a visão perdida, mas apenas atrasa e em alguns casos evita maiores perdas. Recentemente, a terapia fotodinâmica demonstrou ser eficaz a parar crescimento anómalo de vasos sanguíneos em cerca de um terço de doentes de AMD húmida quando tratados precocemente. Na terapia fotodinâmica (PDT) Visdyne, injeta-se um corante no olho do doente, este acumula-se na área de derrame do vaso na retina e quando exposto a um laser de baixa potência, reage causando selagem dos vasos que derramam. Além destas duas técnicas de laser, existem várias terapias anti-angiogénicas dirigidas a fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) que estão a ser desenvolvidas para o tratamento de AMD húmida. Contudo, apenas 10% dos doentes tratados apresentam melhoria da visão.

Tendo em conta estes tratamentos desadequados para AMD húmida e a falta total de tratamentos disponíveis para AMD seca avançada, há uma clara necessidade para o desenvolvimento de novos tratamentos para esta doença grave. A nossa invenção proporciona uma nova abordagem para o tratamento desta doença grave.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a inibidores do complemento para uso num método para o tratamento de condições ou doenças relacionadas com o sistema ocular, tais como degeneração macular relacionada com a idade (AMD), retinopatia diabética, angiogénese ocular (tal como neovascularização ocular que afeta os tecidos coroidal, da córnea ou da retina) e outras condições oculares envolvendo ativação do complemento. O tratamento de AMD inclui tanto a forma seca como a forma húmida de AMD.

Os inibidores do complemento da presente invenção incluem, os que inibem a via do complemento alternativa, tais como fator D, properdina, fator B, fator Ba e fator Bb e a via do complemento clássica, tais como C3a, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9 e C5b-9, não se lhes limitando. A presente invenção também inclui o uso de inibidores do complemento em combinação com outros agentes, tais como agentes anti-angiogénicos e agentes anti-inflamatórios tais como esteroides.

Outra concretização da presente invenção refere-se ao uso de inibidores de C5aR e C3aR, tais como anticorpos e fragmentos derivados e construções de domínio único, assim como compostos de moléculas pequenas.

Outra concretização da presente invenção refere-se ao uso de CRI (TP10) solúvel recombinante e às suas proteínas derivadas; o uso de moléculas de inibição de C3 (tais como Compstatina, um peptidomimético que se liga e inibe ativação de C3); ARNsi que bloqueiam a síntese de C3, C5, FD, fator P, fator B.

Estes inibidores podem ser compostos químicos de moléculas pequenas, nucleótidos, péptidos, proteínas, peptidomiméticos e anticorpos, não se lhes limitando.

Outra concretização da presente invenção inclui o uso de fator H humano purificado de sangue humano ou fator H humano recombinante administrado a doentes intraocularmente ou por qualquer outra via clinicamente eficaz.

Os anticorpos da presente invenção incluem imunoglobulinas completas, scFv, Fab, Fab', Fv, F(ab')2 ou dAb. Os anticorpos de domínio compreendem quer um domínio VH, quer um domínio VL.

Uma concretização da presente invenção é o uso de um anticorpo monoclonal que se liga a fator D e bloqueia a sua capacidade de ativar a via do complemento alternativa. Descrevem-se tais anticorpos em WO 01/70818 e US 20020081293, tal como o anticorpo monoclonal 166-32 produzido a partir do hibridoma depositado em ATCC e designado como HB12476. A presente invenção também inclui anticorpos que se ligam especificamente ao mesmo epítopo do que o anticorpo monoclonal 166-32. Os anticorpos monoclonais da presente invenção podem também incluir os anticorpos humanizados do pedido copendente.

Uma concretização da presente invenção é o uso de um anticorpo monoclonal que se liga à componente de complemento C5a. Tais anticorpos incluem anticorpo 137-26 produzido a partir do hibridoma depositado em ATCC e designado como PTA-3650 e qualquer anticorpo que se ligue especificamente ao mesmo epítopo que 137-26.

De acordo com a presente invenção, o inibidor da via do complemento pode ser administrado através de (a) administração parentérica; (b) implante de libertação prolongada biocompatível ou suscetível a bioerosão; (c) implante de uma bomba de infusão; ou (d) administração local, tal como por administração subconjuntival ou por administração intravitreo. 0 inibidor do complemento pode também ser administrado por administração parentérica selecionada de administração oral, administração entérica e administração tópica. A administração tópica pode incluir uma solução de lavagem de olhos, uma pomada para os olhos, um protetor ocular ou uma solução de gotas para os olhos.

Além disso, o inibidor do complemento da presente invenção pode ser administrado em combinação com um composto imunomodulador ou imunossupressor.

Outra concretização da presente invenção refere-se à administração de construções de ácidos nucleicos que são capazes de expressar inibidores da via do complemento para terapia génica.

Outra concretização da presente invenção inclui um método para rastrear inibidores do complemento que são úteis no tratamento de AMD compreendendo o uso de um modelo de AMD em ratinhos senescentes deficientes em Ccl-2 ou Ccr-2. Estes ratinhos manifestam alterações histopatológicas semelhantes às verificadas em AMD seca e em AMD húmida humanas. Estes ratinhos podem ser tratados com inibidores do complemento ou fator H intravitreo. Pode efetuar-se uma análise histológica para determinar proteção contra desenvolvimento de AMD em ratinhos tratados com os agentes a testar.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Tal como aqui utilizado e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma" e "o/a" incluem as referências no plural salvo se o contexto indicar claramente o contrário, e.g., referência a "uma célula hospedeira" inclui uma pluralidade de tais células hospedeiras.

Salvo definição em contrário, todas as expressões técnicas e cientificas e quaisquer acrónimos aqui usados têm os mesmos significados que habitualmente lhes associa um perito na especialidade do campo da invenção. Embora se possam usar quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos na prática da presente invenção, descrevem-se aqui exemplos de métodos, dispositivos e materiais.

Contudo, nada aqui deve implicar uma admissão que a invenção não possa apresentar uma data anterior a tal divulgação em virtude de invenção anterior.

Definições A expressão "variante de sequência de aminoácidos" refere-se a polipéptidos com sequências de aminoácidos que diferem em alguma extensão de um polipéptido de sequência nativa. Habitualmente, as variantes de sequência de aminoácidos apresentarão pelo menos cerca de 70% de homologia ou pelo menos cerca de 80% ou pelo menos cerca de 90% de homologia com o polipéptido nativo. As variantes de sequência de aminoácidos apresentam substituições, deleções e/ou inserções em determinadas posições no interior da sequência de aminoácidos da sequência de aminoácidos nativa. A expressão "identidade" ou "homologia" é definida como a percentagem de resíduos de aminoácidos na sequência candidata que são idênticos ao resíduo de uma sequência correspondente com a qual é comparada, após alinhamento das sequências e introdução de falhas, caso necessário para se obter a máxima percentagem de identidade para a sequência completa e não considerando quaisquer substituições conservativas como parte da identidade de sequência. Não se deve considerar que nem as extensões nem as inserções quer do terminal N, quer do terminal C reduzam a identidade ou a homologia. São bem conhecidos na especialidade métodos e programas de computador para o alinhamento. A identidade de sequência pode ser facilmente calculada por métodos conhecidos, incluindo os descritos em (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, parte I, Griffin, A. M., e Griffin, H. G., ed., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; e Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. e Devereux, J., ed., M Stockton Press, New York, 1991; e Carillo, 30 H. e Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988), não se lhes limitando. Concebem-se métodos para determinar identidade para proporcionar a maior equivalência entre as sequências testadas. Os métodos de programas de computador para determinar identidade entre duas sequências incluem o pacote do utilitário GCG (Devereux, J., et ai., Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN e FASTA (Atschul, S. F, et ai., J Molec. Biol. 215: 403-410 (1990), não se lhes limitando. O programa BLAST X está disponível ao público a partir de NCBI e outras fontes (BLASTManual, Altschul, S., et al, NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). Pode também usar-se o bem conhecido algoritmo Smith Waterman para determinar identidade. A expressão "anticorpo" é aqui usada no seu sentido mais lato e abrange especificamente anticorpos monoclonais intactos, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (e.g. anticorpos biespecíficos) formados a partir de pelo menos dois anticorpos intactos e fragmentos de anticorpo, desde que estes apresentam a atividade biológica pretendida. A expressão "anticorpo monoclonal" tal como aqui usada refere-se a um anticorpo obtido a partir de um população substancialmente homogénea de anticorpos, i.e., os anticorpos individuais que constituem a população são idênticos exceto em possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em quantidades minoritárias. Contrariamente às preparações de anticorpos policlonais que incluem diferentes anticorpos dirigidos contra determinantes (epítopos) diferentes, cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante no antigénio. O modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo tal como é obtido de uma população substancialmente homogénea de anticorpos e não se deve considerar como sendo necessária a produção do anticorpo por qualquer método específico. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser produzidos pelo método de hibridoma inicialmente descrito por Kohler et al, Nature, 256:495 (1975) ou podem ser produzidos por métodos de ADN recombinante (consultar, e.g., patente U.S. n2 4 816 567). Os "anticorpos monoclonais" podem também ser isolados de bibliotecas de anticorpos de fagos usando as técnicas descritas em Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), por exemplo.

Os anticorpos monoclonais aqui incluem especificamente anticorpos "quiméricos" nos quais uma parte de uma cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga a sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie em particular ou pertencentes a uma classe ou subclasse especifica de anticorpos, enquanto o remanescente da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo às sequências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpo, assim como fragmentos de tais anticorpos, desde que apresentem a atividade biológica pretendida (patente U.S. n2 4 816 567; e Morrison et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81:6851-6855 (1984)).

Os "fragmentos de anticorpo" compreendem uma parte de um anticorpo intacto compreendendo a sua região de ligação de antigénio ou variável. Os exemplos de fragmentos de anticorpos incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo em cadeia simples; e anticorpos multiespecificos formados a partir de um ou mais fragmentos de anticorpos.

Um anticorpo "intacto" é aquele que compreende uma região variável de ligação de antigénio assim como um domínio constante de cadeia leve (Cl) e domínios constantes de cadeia pesada, ChI, Ch2 e Ch3. Os domínios constantes podem ser domínios constantes de sequência nativa (e.g. domínios constantes de sequência nativa humana) ou sua sequência de aminoácidos variantes. 0 anticorpo intacto pode ter uma ou mais funções efetoras.

As "funções efetoras" do anticorpo referem-se às atividades biológicas que se podem atribuir à região Fc (uma região Fc de sequência nativa ou região Fc de sequência de aminoácidos variantes) de um anticorpo. Os exemplos de funções efetoras de anticorpo incluem ligação de Cl q; citotoxicidade dependente do complemento, ligação de receptor de Fc; citotoxicidade mediada por células e dependente de anticorpo (ADCC); fagocitose; regulação negativa dos receptores de superfície celular (e.g receptor de células B, BCR), etc.

Dependendo da sequência de aminoácidos dos domínios constantes das suas cadeias pesadas, os anticorpos intactos podem classificados em diferentes "classes". Existem cinco principais classes de anticorpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM e várias destas podem ser adicionalmente divididas em "subclasses" (isotipos), e.g., IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de anticorpos denominam-se α, δ, ε, γ e μ, respetivamente. São bem conhecidas as estruturas de subunidade e as configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas. A "citotoxicidade mediada por células e dependente de anticorpo" (ADCC) refere-se a uma reação mediada por células na qual células citotóxicas não específicas que expressam receptores Fc (FcR) (e.g. células assassinas naturais (NK) , neutrófilos e macrófagos) reconhecem anticorpos ligados a uma célula alvo e subsequentemente provocam lise da célula alvo. As células primárias para mediar ADCC, células NK, expressam apenas FcyRIII, enquanto os monócitos expressam FcR de FcyRI, FcyRII e FcyRIII em células hematopoiéticas. Para avaliar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse, pode efetuar-se um ensaio de ADCC in vitro, tal como descrito em patente U.S. n2 5 500 362 ou 5 821 337. As células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e células assassinas naturais (NK) . Alternativa ou adicionalmente, pode avaliar-se a atividade ADCC da molécula de interesse in vivo, e.g., num modelo animal. Estão disponíveis vários de tais modelos. A expressão "variável" refere-se ao facto de determinadas partes dos domínios variáveis diferirem extensamente em termos de sequência entre anticorpos e usam-se na ligação e especificidade de cada anticorpo em particular para o seu antigénio específico. Contudo, a variabilidade não está uniformemente distribuída ao longo dos domínios variáveis dos anticorpos. Concentra-se em três segmentos denominados regiões hipervariáveis tanto nos domínios variáveis de cadeia leve como nos domínios variáveis de cadeia pesada. Estas regiões hipervariáveis também se denominam regiões determinantes da complementaridade ou CDR. As partes mais altamente conservadas dos domínios variáveis denominam-se regiões de esqueleto (FR).

Os domínios variáveis das cadeias pesada e leve nativas compreendem cada um quatro FR, adotando em grande medida uma configuração em folha β, ligadas por três regiões hipervariáveis, que formam ansas que ligam e em alguns casos fazem parte da estrutura em folha β. As regiões hipervariáveis em cada cadeia são mantidas ligadas entre si em grande proximidade pelas FR e com as regiões hipervariáveis da outra cadeia, contribuem para a formação do local de ligação do antigénio dos anticorpos (consultar Rabat et ai., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). A expressão "região hipervariável" quando aqui utilizada refere-se aos resíduos de aminoácido de um anticorpo que são responsáveis pela ligação de antigénio. A região hipervariável compreende geralmente resíduos de aminoácidos de uma "região determinante da complementaridade" ou "CDR" (e.g. resíduos 24-34 (Li), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no domínio variável da cadeia leve e 31-35 (Hl), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) no domínio variável da cadeia pesada; Rabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) e/ou os resíduos de uma "ansa hipervariável" (e.g. resíduos 2632 (LI), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 26-32 (Hl), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Chothia e Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)) . Os resíduos da "região de esqueleto" ou resíduos "FR" são os resíduos do domínio variável que não são resíduos da região hipervariável tal como aqui definida. A digestão com papaína de anticorpos produz dois fragmentos de ligação de antigénio idênticos, denominados fragmentos "Fab", cada um com um único local de ligação de antigénio e um fragmento "Fc" residual, cujo nome reflete a sua capacidade de cristalizar facilmente. O tratamento com pepsina proporciona um fragmento F(ab')2 que tem dois locais de ligação de antigénio e ainda é capaz de ligar antigénio por reticulação. O fragmento Fab também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH I) da cadeia pesada. Os fragmentos Fab' diferem dos fragmentos Fab pela adição de alguns resíduos no terminal carboxilo do domínio CHI da cadeia pesada incluindo uma ou mais cisteinas da região de dobra do anticorpo. Fab'-SH é a designação aqui para Fab' no qual o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes apresentam pelo menos um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpo F(ab')2 foram originalmente produzidos como pares de fragmentos Fab' que têm cisteinas de dobra entre eles. São também conhecidos outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpos.

As "cadeias leves" de anticorpos de qualquer espécie de vertebrado podem ser classificadas em um de dois tipos claramente distintos, denominados kapa (k) e lambda (À) , com base nas sequências de aminoácidos dos seus domínios constantes. "Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um local completo de reconhecimento de antigénio e de ligação de antigénio. Esta região consiste de um dímero de uma cadeia pesada e um domínio variável da cadeia leve em associação forte e não covalente. É nesta configuração que as três regiões hipervariáveis de cada domínio variável interagem para definir um local de ligação de antigénio à superfície do dímero Vh Vl . Coletivamente, as seis regiões hipervariáveis conferem ao anticorpo especificidade na ligação de antigénio. Contudo, mesmo apenas um único domínio variável (ou metade de um Fv compreendendo apenas três regiões hipervariáveis específicas para um antigénio) tem a capacidade de reconhecer e ligar antigénio, apesar de o fazer com uma afinidade menor do que o local de ligação completo.

Os fragmentos de anticorpo "Fv em cadeia simples" ou "scFv" compreendem os domínios Vh e Vl de anticorpo, em que esses domínios estão presentes numa única cadeia de polipéptido. Preferentemente, o polipéptido Fv compreende adicionalmente um ligante de polipéptido entre os domínios Vh e Vl que possibilita que o scFv forme a estrutura pretendida para ligação de antigénio. Para uma revisão de scFv consultar Pluckthun em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore ed., Springer-Verlag, New York, p. 269-315 (1994). Descrevem-se fragmentos de scFv de anticorpo anti-ErbB2 em W093/16185; patente U.S. n2 5 571 894; e patente U.S. n2 5 587 458. A expressão "diacorpos" refere-se a pequenos fragmentos de anticorpo com dois locais de ligação de antigénio, que compreendem um domínio pesado variável (Vh) ligado a um domínio leve variável (Vl) na mesma cadeia de polipéptido (Vh-Vl) . Por utilização de um ligante que é demasiado curto para permitir emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, forçam-se os domínios a emparelhar com os domínios complementares de outra cadeia e criam-se dois locais de ligação de antigénio. Descrevem-se diacorpos mais completamente em, por exemplo, EP 404 097; WO 93/11161; e Hollinger et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:6444-6448 (1993).

Um "anticorpo de domínio simples" é sinónimo de "dAb" e refere-se a um polipéptido de região variável de imunoglobulina em que a ligação de antigénio é efetuada por um único domínio de região variável. Um "anticorpo de domínio simples" tal como aqui usado, inclui i) um anticorpo compreendendo o domínio variável da cadeia pesada (VH) ou um seu fragmento de ligação de antigénio, que forma um local de ligação de antigénio independentemente de qualquer outro domínio variável, ii) um anticorpo compreendendo um domínio variável da cadeia leve (VL) ou um seu fragmento de ligação de antigénio, que forma um local de ligação de antigénio independentemente de qualquer outro domínio variável, iii) um anticorpo compreendendo um polipéptido de domínio VH ligado a outro polipéptido de domínio VH ou VL (e.g., VH-VH ou VHx-VL) , em que cada domínio V forma um local de ligação de antigénio independentemente de outro domínio variável e iv) um anticorpo compreendendo um polipéptido de domínio VL ligado a outro polipéptido de domínio VL (VL-VL), em que cada domínio V forma um local de ligação de antigénio independentemente de qualquer outro domínio variável. Tal como aqui usado, o domínio VL refere-se a ambas as formas kapa e lambda das cadeias leves.

As formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (e.g., de roedores) são anticorpos quiméricos que contêm sequências mínimas derivadas de imunoglobulinas não humanas. Os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas em que as regiões hipervariáveis são substituídas por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana, tal como ratinho, rato, coelho ou primata não humano com a especificidade, afinidade e capacidade pretendidas. Em alguns casos, substituem-se os resíduos da região de esqueleto (FR) da imunoglobulina humana por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não se encontram no anticorpo humano ou no anticorpo não humano. Fazem-se estas modificações para refinar adicionalmente o desempenho do anticorpo. De um modo geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um e tipicamente dois domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as ansas hipervariáveis correspondem às de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as FR são as de uma sequência de imunoglobulina humana. 0 anticorpo humanizado compreenderá também opcionalmente pelo menos uma parte de uma região constante (Fc) de imunoglobulina tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Podem encontrar-se exemplos de tecnologia de humanização em, e.g., Queen et ai. patente U.S. n2 5 585 089, 5 693 761; 5 693 762; e 6 180 370.

GERAÇÃO DE ANTICORPOS

Os anticorpos da presente invenção podem ser gerados por qualquer método adequado conhecido na especialidade. Os anticorpos da presente invenção podem compreender anticorpos policlonais. São conhecidos dos peritos métodos de preparar anticorpos policlonais (Harlow, et ai., Antibodies: a Laboratory Manual, (Cold spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. (1988) .

Por exemplo, podem gerar-se anticorpos por administração de um imunogénio compreendendo o antigénio de interesse a vários animais hospedeiros incluindo coelhos, ratinhos, ratos, etc., não se lhes limitando, para induzir a produção de soros contendo anticorpos policlonais específicos para o antigénio. A administração do imunogénio pode compreender uma ou mais injeções de um agente imunizante e caso pretendido, de um adjuvante. Podem usar-se vários adjuvantes para aumentar a resposta imunológica dependendo da espécie hospedeira e incluindo adjuvante (completo e incompleto) de Freund, géis minerais tais como hidróxido de alumínio, substâncias tensioativas tais como lisolecitina, polióis plurónicos, polianiões, péptidos, emulsões em óleo, hemocianinas de lapa gigante, dinitrofenol e adjuvantes humanos potencialmente úteis tais como BCG (Bacillus Calmette-Guérin) e Corynebacterium parvum, não se lhes limitando. Os exemplos adicionais de adjuvantes que podem ser utilizados incluem o adjuvante MPL-TDM (monofosforil-lípido A, tre-halose de dicorinomicolato sintética). Os protocolos de imunização são bem conhecidos na especialidade e podem ser efetuados por qualquer método que desencadeie uma resposta imunitária no animal hospedeiro selecionado. Os adjuvantes são também bem conhecidos na especialidade.

Tipicamente, injeta-se o imunogénio (com ou sem adjuvante) no mamífero por injeções múltiplas subcutâneas ou intraperitoneais ou intramuscularmente ou através da via IV. 0 imunogénio pode incluir um polipéptido antigénico, uma proteína de fusão ou suas variantes. Dependendo da natureza dos polipéptidos (i.e., percentagem de hidrofobicidade, percentagem de hidrofilicidade, estabilidade, carga global, ponto isoelétrico, etc.), pode ser útil conjugar um imunogénio com uma proteína que se sabe ser imunogénica para o mamífero a ser imunizado. Tal conjugação inclui quer conjugação química por derivatização de grupos funcionais quimicamente ativos tanto ao imunogénio como à proteína imunogénica a conjugar de modo a que se forme uma ligação covalente, quer através de metodologias baseadas em proteínas de fusão ou outros métodos conhecidos do perito na especialidade. Os exemplos de tais proteínas imunogénicas incluem hemocianina de lapa gigante, ovalbumina, albumina de soro, tiroglobulina bovina, inibidor de tripsina de soja e péptidos auxiliares T promíscuos, não se lhes limitando. Podem usar-se vários adjuvantes para aumentar a resposta imunológica tal como descrito anteriormente.

Os anticorpos úteis na presente invenção compreendem anticorpos monoclonais. Podem preparar-se anticorpos monoclonais usando tecnologias de hibridoma, tal como as descritas por Kohler e Milstein, Nature, 256:495 (1975) e patente U.S. n2 4 376 110 por Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold spring Harbor Laboratory Press, 2.sup.a ed. (1988) por Hammerling, et al. , Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas (Elsevier, N.Y., (1981)) ou outro métodos conhecidos do especialista. Outros exemplos de métodos que podem ser utilizados para produzir anticorpos monoclonais incluem a técnica de hibridoma de células B humanas (Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4:72; Cole et al. , 1983, Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 80:2026-2030) e a técnica de EBV-hibridoma (Cole et al. , 1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., p. 77-96), não se lhes limitando. Tais anticorpos podem ser de qualquer classe de imunoglobulina incluindo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD e qualquer de suas subclasses. O hibridoma que produz os anticorpos desta invenção pode ser cultivado in vitro ou in vivo.

Usando técnicas típicas de hibridoma, tipicamente imuniza-se com um imunogénio um hospedeiro tal como um ratinho, um ratinho humanizado, um ratinho com um sistema imunitário humano, hamster, coelho, camelo ou qualquer outro animal hospedeiro apropriado, para desencadear linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que se ligarão especificamente ao antigénio de interesse. Alternativamente podem imunizar-se linfócitos in vitro com o antigénio.

De um modo geral, ao se produzirem hibridomas que produzem anticorpos, usam-se quer linfócitos de sangue periférico ("PBL") caso se pretendam células de origem humana, quer células de baço ou células de gânglios linfáticos caso se pretendam fontes de mamífero não humano. Fundem-se então os linfócitos com uma linha celular imortalizada usando um agente de fusão adequado tal como polietilenoglicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986), p. 59-103). As linhas celulares imortalizadas são habitualmente células de mamífero transformadas, nomeadamente células de mieloma de origem de roedor, bovina ou humana. Tipicamente, usa-se uma linha celular de mieloma de rato ou de ratinho. Podem cultivar-se as células de hibridoma num meio de cultura adequado que contém preferentemente uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou sobrevivência das células imortalizadas não fundidas. Por exemplo, caso as células parentais sejam isentas da enzima hipoxantina guanina fosforribosiltransferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas incluirá tipicamente hipoxantina, aminopterina e timidina ("meio HAT"), substâncias que evitam o crescimento de células deficientes em HGPRT.

As linhas celulares imortalizadas preferidas são aquelas que apresentam fusão eficiente, suportam expressão estável de anticorpo a níveis elevados pelas células produtoras de anticorpo selecionadas e são sensíveis a um meio tal como meio HAT. As linhas celulares imortalizadas mais preferidas são linhas de mieloma murino que podem ser obtidas, por exemplo, de Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif, e de American Type Culture Collection, Manassas, Va. Também se podem usar linhas celulares de mieloma humano e de heteromieloma ratinho-humano para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) p. 51-63) . O meio de cultura no qual se cultivam células de hibridoma pode então ser ensaiado para a presença de anticorpos monoclonais dirigidos contra o imunogénio. Determina-se a especificidade de ligação dos anticorpos monoclonais produzidos pelas células de hibridoma por, e.g., imunoprecipitação ou por um ensaio de ligação in vitro, tal como um radioimunoensaio (RIA) ou um ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) . Tais técnicas são conhecidas na especialidade e encontram-se abrangidas pelas capacidades do perito. A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode ser determinada, por exemplo, por uma análise de Scatchard (Munson et al. , Anal. Biochem., 107:220 (1980)) .

Após identificação das células de hibridoma pretendidas, podem subclonar-se os clones por procedimentos de diluição limitativa e podem ser cultivados por métodos padrão (Goding, anteriormente). Os meios de cultura adequados para este objetivo incluem, por exemplo, meio de Eagle modificado da Dulbecco e RPMI-1640. Os anticorpos monoclonais excretados pelos subclones podem ser isolados ou purificados a partir do meio de cultura por procedimentos convencionais de purificação de imunoglobulina tal como, e.g., proteína A-sepharose, cromatografia de hidroxiapatite, cromatografia de exclusão de gel, eletroforese em gel, diálise ou cromatografia de afinidade.

Existem vários métodos na especialidade para a produção de anticorpos monoclonais e assim a invenção não está limitada à sua produção unicamente em hibridomas. Por exemplo, podem produzir-se os anticorpos monoclonais por métodos de ADN recombinante, tal como os descritos na patente U. S. n2 4 816 567. Neste contexto, a expressão "anticorpo monoclonal" refere- se a um anticorpo derivado de um único clone eucariótico, de fago ou procariótico. 0 ADN que codifica os anticorpos monoclonais da invenção pode ser facilmente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (e.g., por utilização de sondas de oligonucleótido que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam as cadeia pesadas e leves de anticorpos murinos ou tais cadeias de fontes humanas, humanizadas ou outras). As células de hibridoma da invenção servem como uma fonte preferida de tal ADN. Uma vez isolado, o ADN pode ser inserido em vetores de expressão que são então transformados para células hospedeiras tal como células NSO, células COS de simio, células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células de mieloma que não produzem de outro modo proteína imunoglobulina, para obter síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. 0 ADN também pode ser modificado, por exemplo, por substituição da sequência de codificação para os domínios constantes de cadeia pesada e leve humana em vez das sequências murinas homólogas (patente U.S. n2 4 816 567; Morrison et ai, anteriormente) ou por junção covalente à sequência de codificação de imunoglobulina da totalidade ou de parte da sequência de codificação de um polipéptido não imunoglobulina. Tal polipéptido não imunoglobulina pode substituir os domínios constantes de um anticorpo da invenção ou pode substituir os domínios variáveis de um local de combinação de antigénio de um anticorpo da invenção para criar um anticorpo bivalente quimérico.

Os anticorpos podem ser anticorpos monovalentes. Os métodos de preparar anticorpos monovalentes são bem conhecidos na especialidade. Por exemplo, um método envolve expressão recombinante de cadeia leve e de cadeia pesada modificada de imunoglobulina. A cadeia pesada é truncada geralmente em qualquer local da região Fc de modo a evitar reticulação da cadeia pesada. Alternativamente, os resíduos de cisteína relevantes são substituídos por outro resíduo de aminoácido ou são deletados de modo a evitar reticulação.

Usando técnicas conhecidas, podem gerar-se fragmentos de anticorpo que reconhecem epítopos específicos. Por exemplo, podem produzir-se fragmentos Fab e F (ab')2 da invenção por clivagem proteolítica de moléculas de imunoglobulina, usando enzimas tais como papaína (para produzir fragmentos Fab) ou pepsina (para produzir fragmentos F(ab')2) . Os fragmentos F(ab')2 contêm a região variável, a região constante da cadeia leve e o domínio CHI da cadeia pesada.

Para algumas utilizações, incluindo o uso in vivo de anticorpos em humanos e ensaios de deteção in vitro, pode ser preferível usar anticorpos quiméricos, humanizados ou humanos. Um anticorpo quimérico é uma molécula na qual diferentes partes do anticorpo são derivadas de diferentes espécies animais, tal como anticorpos com uma região variável derivada de um anticorpo monoclonal murino e uma região constante de imunoglobulina humana. Os métodos para produzir anticorpos quiméricos são conhecidos na especialidade. Consultar e.g., Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et ai., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et ai., (1989) J. Immunol. Methods 125:191-202; patentes U.S. n2 5 807 715; 4 816 567; e 4 816 397.

Os anticorpos humanizados são moléculas de anticorpo geradas numa espécie não humana que ligam o antigénio pretendido e que apresentam uma ou mais regiões determinantes da complementaridade (CDR) de uma espécie não humana e regiões de esqueleto (FR) de uma molécula de imunoglobulina humana. Muitas vezes, os resíduos de esqueleto em regiões de esqueleto humanas serão substituídos pelo resíduo correspondente da CDR do anticorpo dador para alterar, preferentemente melhorar, a ligação de antigénio. Estas substituições de esqueleto são identificadas por métodos bem conhecidos na especialidade, e.g., por modelação das interações entre os resíduos da CDR e do esqueleto para identificar resíduos de esqueleto importantes para ligação de antigénio e comparação de sequência para identificar resíduos de esqueleto não usuais em posições específicas. (Consultar, e.g., Queen et ai., patente U.S. n2 5 585 089; Riechmann et ai., Nature 332:323 (1988)). Os anticorpos podem ser humanizados usando várias técnicas conhecidas na especialidade incluindo, por exemplo, enxerto de CDR (EP 239 400; publicação PCT WO 91/09967; patentes U.S. n2 5 225 539; 5 530 101; e 5 585 089), recobrimento ou estabelecimento de uma nova superfície (EP 592 106; EP 519 596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et ai., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska et ai., PNAS 91:969-973 (1994)) e permuta de cadeia patente U.S. n2 5 565 332).

De um modo geral, um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácido em si introduzidos a partir de uma fonte que não é humana. Estes resíduos de aminoácido não humanos referem-se muitas vezes como resíduos "de importação", que são tipicamente retirados de um domínio variável "importado". A humanização pode ser essencialmente efetuada seguindo os métodos de Winter e colaboradores (Jones et al. , Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al. , Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al. , Science, 239:1534-1536 (1988), por substituição de CDR de roedores ou de sequências de CDR pelas sequências correspondentes de um anticorpo humano. Assim, tais anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos (patente U.S. n2 4 816 567), em que substancialmente menos do que um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos nos quais alguns resíduos CDR e possivelmente alguns resíduos FR são substituídos por sítios análogos em anticorpos de roedores.

Pretendem-se anticorpos completamente humanizados nomeadamente para tratamento terapêutico de doentes humanos. Os anticorpos humanos podem produzir-se por vários métodos conhecidos na especialidade incluindo métodos de disposição de fagos descritos anteriormente usando bibliotecas de anticorpos derivadas de sequências de imunoglobulinas humanas. Consultar igualmente, patentes U.S. n2 4 444 887 e 4 716 111; e publicações PCT WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 e WO 91/10741. As técnicas de Cole et al. e Boerder et al., estão também disponíveis para a preparação de anticorpos monoclonais humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Riss, (1985); e Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95, (1991)).

Os anticorpos humanos podem também ser anticorpos de domínio único com um domínio VH ou VL que funciona independentemente de qualquer outro domínio variável. Estes anticorpos são tipicamente selecionados de bibliotecas de anticorpos expressas em fagos. Descrevem-se estes anticorpos e métodos para isolar tais anticorpos na patente U.S. n2 6 595 142; 6 248 516; e pedidos US20040110941 e US20030130496 .

Podem também produzir-se anticorpos humanos usando ratinhos transgénicos que são incapazes de expressar imunoglobulinas endógenas funcionais, mas que podem expressar genes de imunoglobulina humana. Por exemplo, podem introduzir-se os complexos de genes das cadeias pesada e leve humanas de imunoglobulina de forma aleatória ou por recombinação homóloga em células estaminais embrionárias de ratinho. Alternativamente, podem introduzir-se a região variável, a região constante e a região de diversidade humanas em células estaminais embrionárias de ratinho além dos genes das cadeias pesada e leve humanas. Os genes das cadeias pesada e leve humanas de imunoglobulina podem tornar-se não funcionais independente ou simultaneamente com a introdução de locais de imunoglobulina humana por recombinação homóloga. Nomeadamente, a deleção homozigótica da região JH evita produção endógena de anticorpos. As células estaminais embrionárias modificadas são expandidas e aplicadas por microinjeção em blastócitos para produzir ratinhos quiméricos. Os ratinhos quiméricos são então criados para produzir uma descendência homozigótica que expressa anticorpos humanos. Imunizam-se os ratinhos transgénicos de forma normal com um antigénio selecionado, e.g., um polipéptido da invenção completo ou parte deste. Podem obter-se anticorpos monoclonais dirigidos contra o antigénio a partir de ratinhos transgénicos imunizados usando tecnologia de hibridoma convencional. Os transgenes de imunoglobulina humana presentes nos ratinhos transgénicos rearranjam-se durante a diferenciação de células B e subsequentemente sujeitam-se a permuta de classe e mutação somática. Assim, usando tal técnica, é possível produzir anticorpos IgG, IgA, IgM e IgE terapeuticamente úteis. Para uma revisão desta tecnologia para produzir anticorpos humanos, consultar Lonberg e Huszar, Int. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995). Para uma discussão detalhada desta tecnologia para produzir anticorpos humanos e anticorpos monoclonais humanos e protocolos para produzir tais anticorpos, consultar, e.g., publicações PCT WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; patente europeia n2 0 598 877; patentes U.S. n2 5 413 923; 5 625 126; 5 633 425; 5 569 825; 5 661 016; 5 545 806; 5 814 318; 5 885 793; 5 916 771; e 5 939 598. Além disso, podem contratar-se empresas tais como Abgenix, Inc. (Freemont, Calif.), Genpharm (San Jose, Calif) e Medarex, Inc. (Princeton, N.J.) para proporcionar anticorpos humanos dirigidos contra um antigénio selecionado usando tecnologia semelhante à anteriormente descrita.

Podem produzir-se também MAb humanos por imunização de ratinhos transplantados com leucócitos de sangue periférico humano, esplenócitos ou medulas ósseas (e.g., técnicas de trioma de XTL) . Podem produzir-se anticorpos completamente humanos que reconhecerão um epitopo selecionado usando uma técnica referida como "seleção guiada". Nesta abordagem usa-se um anticorpo monoclonal selecionado não humano, e.g., um anticorpo de ratinho, para guiar na seleção de um anticorpo completamente humano que reconhece o mesmo epitopo. (Jespers et ai., Bio/technology 12:899-903 (1988)).

Além disso, os anticorpos contra os polipéptidos da invenção podem ser por sua vez utilizados para gerar anticorpos anti-idiotipo que "mimetizam" os polipéptidos da invenção usando técnicas bem conhecidas dos peritos na especialidade. (Consultar, e.g., Greenspan & Bona, FASEB J. 7 (5) : 437-444; (1989) e Nissinoff, J. Immunol. 147(8):2429-2438 (1991)). Por exemplo, podem usar-se os anticorpos que se ligam e inibem competitivamente a multimerização de polipéptidos e/ou ligação de um polipéptido da invenção a um ligando para gerar anti-idiotipos que "mimetizam" a multimerização de polipéptidos e/ou domínio de ligação e consequentemente ligam-se e neutralizam um polipéptido e/ou o seu ligando. Tais anti-idiotipos neutralizantes ou fragmentos Fab de tais anti-idiotipos podem ser usados em regimes terapêuticos para neutralizar ligando de polipéptido. Por exemplo, podem usar-se tais anticorpos anti-idiotipos para ligar um polipéptido da invenção e/ou para ligar os seus ligandos/receptores e bloquear assim a sua atividade biológica.

Os anticorpos da presente invenção podem ser anticorpos biespecíficos. Os anticorpos biespecíficos são anticorpos monoclonais, preferentemente humanos ou humanizados, que têm especificidades de ligação para pelo menos dois antigénios diferentes. Na presente invenção, uma das especificidades de ligação pode ser dirigida contra fator D e a outra pode ser contra qualquer outro antigénio e de preferência contra uma proteína de superfície celular, receptor, subunidade de receptor, antigénio específico do tecido, proteína derivada de vírus, proteína de cápside codificada por vírus, proteína derivada de bactéria ou proteína de superfície bacteriana, etc. Os anticorpos biespecíficos podem também compreender dois ou mais anticorpos de domínio único.

Os métodos para produzir anticorpos biespecíficos são bem conhecidos. Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorpos biespecíficos baseia-se na coexpressão de dois pares de cadeia pesada/cadeia leve de imunoglobulina, em que as duas cadeias pesadas têm diferentes especificidades (Milstein e Cuello, Nature, 305:537-539 (1983). Devido à distribuição aleatória de cadeias leves e pesadas de imunoglobulina, estes hibridomas (quadromas) produzem misturas potenciais de dez diferentes moléculas de anticorpo, das quais apenas uma tem a estrutura biespecífica correta. A purificação da molécula correta é habitualmente obtida por etapas de cromatografia de afinidade. Revelam-se procedimentos semelhantes em WO 93/08829, publicada a 13 de maio de 1993 e em Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991) .

Os domínios variáveis de anticorpo com as especificidades de ligação pretendidas (locais de combinação anticorpo-antigénio) podem ser fundidos a sequências de domínio constante de imunoglobulinas. A fusão é de preferência com o domínio constante da cadeia pesada de imunoglobulina, compreendendo pelo menos uma parte das regiões de dobra, CH2 e CH3. Pode estar presente em pelo menos uma das fusões a primeira região constante da cadeia pesada (CHI) contendo o local necessário para a ligação da cadeia leve. Inserem-se os ADN que codificam as fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e caso pretendido, a cadeia leve de imunoglobulina, em vetores de expressão independentes e cotransforma-se para um organismo hospedeiro adequado. Para detalhes adicionais sobre a geração de anticorpos biespecíficos consultar, por exemplo Suresh et al. , Meth. In Enzymol, 121:210 (1986).

Os anticorpos heteroconjugados são também abrangidos pela presente invenção. Os anticorpos heteroconjugados são compostos por dois anticorpos ligados covalentemente. Tais anticorpos têm, por exemplo, sido propostos para dirigir células do sistema imunitário contra células não pretendidas (patente U.S. n2 4 676 980). Considera-se que se podem preparar anticorpos in vitro usando métodos conhecidos na química sintética de proteínas, incluindo os que envolvem agentes de reticulação. Por exemplo, podem construir-se imunotoxinas usando uma reação de permuta de dissulfureto ou por formação de uma ligação tioéster. Os exemplos de reagentes adequados para este objetivo incluem iminotiolato e metil-4-mercaptobutirimidato e os divulgados, por exemplo, na patente U.S. n2 4 676 980. Além disso, podem gerar-se anticorpos de domínio único contra IL-13. Os exemplos desta tecnologia têm sido descritos em W09425591 para anticorpos derivados da cadeia pesada de Ig de camelídeos, assim como em US20030130496 que descreve o isolamento de anticorpos de domínio único completamente humanizados de bibliotecas de fagos. GERAÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS (MAB)

Numa concretização da invenção, podem desenvolver-se anticorpos monoclonais, tais como anti-fator D, por imunização de roedores (e.g. ratinhos, ratos, hamsters e porquinhos-da-índia) quer com fator D nativo purificado de plasma ou urina humanas, quer com fator D recombinante ou os seus fragmentos expressos por sistemas eucarióticos ou procarióticos. Podem usar-se outros animais para imunização, e.g. primatas não humanos, ratinhos transgénicos que expressam imunoglobulinas humanos e ratinhos com imunodeficiência combinada grave (SCID) transplantados com linfócitos B humanos. Os hibridomas podem ser gerados por procedimentos convencionais por fusão de linfócitos B dos animais imunizados com células de mieloma (e.g. Sp2/0 e NSO), tal como descrito por G. Kõhler e C. Milstein (Nature, 1975: 256: 495-497).

Além disso, podem gerar-se anticorpos monoclonais por rastreio de bibliotecas de Fv ou Fab em cadeia simples recombinantes a partir de linfócitos B humanos em sistemas de disposição de fagos. A especificidade dos MAb contra um dado antigénio pode ser ensaiada por ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), imunotransferência "Western" ou outras técnicas imunoquímicas. A atividade de inibidor dos anticorpos por ativação do complemento pode ser avaliada por ensaios hemolíticos usando eritrócitos (RBC) não sensibilizados de coelho ou de porquinho-da-índia para a via alternativa e usando RBC sensibilizados de galinha ou de ovelha para a via clássica. Clonam-se os hibridomas nos poços positivos por diluição limitativa. Purificam-se os anticorpos para caracterização relativamente a especificidade contra o antigénio, tal como fator D, pelos ensaios bem conhecidos na especialidade.

Podem também criar-se moléculas de ligação de cadeia peptídica simples nas quais as regiões de Fv das cadeias pesada e leve estão ligadas. Descrevem-se anticorpos de cadeia simples ("ScFv") e o método da sua construção na patente U.S. n2 4 946 778. Alternativamente, pode construir-se e expressar-se Fab por meios semelhantes (M.J. Evans et al., J. Immunol. Meth., 1995; 184: 123-138). Todos os anticorpos completa e parcialmente humanos são menos imunogénicos do que os MAb murinos completos e os fragmentos e anticorpos de cadeia simples são também menos imunogénicos. É portanto menos provável que todos estes tipos de anticorpos desencadeiem uma resposta imunitária ou alérgica. Consequentemente, estes são mais adequados para administração in vivo em humanos do que anticorpos de animal completos, especialmente quando é necessária administração repetida ou a longo prazo. Além disso, o menor tamanho do fragmento de anticorpo pode ajudar a melhorar a biodisponibilidade no tecido, que pode ser crítico para melhor acumulação de dose em indicações de doença aguda.

Numa concretização preferida da invenção, usa-se terapeuticamente um Fab quimérico com regiões variáveis animais (de ratinho) e regiões constantes humanas. 0 Fab é preferido porque é mais pequeno que a imunoglobulina completa e pode proporcionar uma melhor permeação nos tecidos; como molécula monovalente, há uma menor probabilidade de se formarem imunocomplexos e agregados; e pode ser produzido num sistema microbiano, cuja escala pode ser mais facilmente aumentada do que num sistema de mamífero.

APLICAÇÃO DOS INIBIDORES DA VIA DO COMPLEMENTO

Os inibidores do complemento, tal como anticorpos e seus fragmentos de ligação, podem ser administrados a indivíduos numa formulação farmacêutica apropriada por uma variedade de vias de administração incluindo infusão intravenosa, injeção intravenosa de bolus e as vias intraperitoneal, intradérmica, intramuscular, subcutânea, intranasal, intratraqueal, intraespinal, intracraniana e oral, não se lhes limitando. Tal administração permite que se liguem a antigénio endógeno, tal como fator D e assim inibam a geração de anafilatoxinas C3b, C3a e C5a e C5b-9. A dosagem preferida estimada de tais anticorpos e moléculas é entre 10 e 500 pg/ml de soro. A dosagem pode ser determinada em ensaios clínicos seguindo a metodologia convencional para determinar dosagens ótimas, i.e., administrar várias dosagens e determinar qual é a mais eficaz.

Os inibidores da via do complemento podem funcionar para inibir in vivo a ativação do complemento e/ou a via do complemento alternativa e manifestações inflamatórias que a acompanham, tal como recrutamento e ativação de macrófagos, neutrófilos, plaquetas e mastócitos, edema e danos nos tecidos. Estes inibidores podem ser usados para tratamento de doenças ou condições que são mediadas por ativação excessiva ou descontrolada do sistema de complemento.

Os anticorpos da presente invenção podem ser monoespecíficos, biespecíficos, triespecíficos ou de maior multiespecificidade. Os anticorpos multiespecíficos podem ser específicos para diferentes epítopos de um antigénio escolhido ou podem ser específicos tanto para o antigénio como para um epítopo heterólogo, tal como um polipéptido heterólogo ou material de suporte sólido. Consultar, e.g., publicações PCT WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt, et al., J. Immunol. 147:60-69 (1991); patentes U.S. n2 4 474 893; 4 714 681; 4 925 648; 5 573 920; 5 601 819; Kostelny et al. , J. Immunol. 148:1547-1553 (1992).

Os anticorpos úteis na presente invenção podem ser descritos ou especificados em termos do(s) epítopo(s) ou parte (s) de uma componente da via do complemento, tal como fator D, que estes reconhecem ou aos quais se ligam especificamente. A (s) parte(s) do(s) epítopo (s) ou polipéptido podem ser especificadas tal como aqui descrito, e.g., pelas posições do terminal N e do terminal C, pelo tamanho em resíduos de aminoácido contíguos.

Os anticorpos úteis na presente invenção podem também ser descritos ou especificados em termos das suas reações cruzadas.

Estão também incluídos na presente invenção os anticorpos que ligam componentes polipeptídicas da via do complemento, que têm pelo menos 95%, pelo menos 90%, pelo menos 85%, pelo menos 80%, pelo menos 75%, pelo menos 70%, pelo menos 65%, pelo menos 60%, pelo menos 55% e pelo menos 50% de identidade (tal como calculado usando métodos conhecidos na especialidade e aqui descritos) com IL-13. Os anticorpos anti-fator D podem também ligar-se com uma KD inferior a cerca de 10-7 M, inferior a cerca de 10-6 M ou inferior a cerca de 10-5 M a outra proteínas, tal como anticorpos anti-fator D de espécies diferentes daquelas contra a qual se dirige o anticorpo anti-fator D.

VETORES E CÉLULAS HOSPEDEIRAS

Noutro aspeto, a presente invenção proporciona construções de vetores compreendendo uma sequência de nucleótido que codifica os anticorpos da presente invenção e uma célula hospedeira compreendendo tal vector. Podem usar-se técnicas padrão de clonagem e transformação na preparação de linhas celulares que expressam os anticorpos da presente invenção

Podem preparar-se vetores de expressão recombinantes contendo uma sequência de nucleótidos que codifica os anticorpos da presente invenção usando técnicas bem conhecidas. Os vetores de expressão incluem uma sequência de nucleótidos ligada operacionalmente a sequências de nucleótidos de transcrição ou tradução adequadas tal como as derivados de genes de mamíferos, micróbios, vírus ou insetos. Os exemplos de sequências de regulação incluem promotores de transcrição, operadores, facilitadores, locais de ligação ribossómico de ARNm e/ou outras sequências apropriadas que controlam iniciação e terminação de transcrição e tradução. As sequências de nucleótidos estão "ligadas operacionalmente" quando a sequência de regulação se relaciona funcionalmente com a sequência de nucleótidos para o polipéptido apropriado. Assim, uma sequência de nucleótidos de promotor está ligada operacionalmente, e.g., à sequência da cadeia pesada de anticorpo se a sequência de nucleótidos do promotor controlar a transcrição da sequência de nucleótidos apropriada.

Além disso, podem ser incorporadas em vetores de expressão sequências que codificam péptidos de sinalização apropriados que não estão naturalmente associados com as sequências de cadeia pesada e/ou leve de anticorpo. Por exemplo, pode fundir-se uma sequência de nucleótidos para um péptido de sinalização (líder de excreção) em quadro com a sequência de polipéptido de modo a que o anticorpo seja excretado para o espaço periplasmático ou para o meio. Um péptido de sinalização que é funcional nas células hospedeiras pretendidas aumenta a excreção extracelular do anticorpo apropriado. 0 péptido de sinalização pode ser clivado do polipéptido após excreção do anticorpo da célula. Os exemplos de tais sinais de excreção são bem conhecidos e incluem, e.g., os descritos em US5698435, US5698417 e US6204023.

As células hospedeiras úteis na presente invenção incluem microrganismos tais como bactérias (e.g., E. coli, B. subtilis) transformadas com vetores de expressão de ADN de bacteriófago recombinante, ADN plasmídico ou ADN cosmídico contendo sequências de codificação de anticorpo; leveduras (e.g., Saccharomyces, Pichia) transformadas com vetores de expressão de levedura recombinantes contendo sequências de codificação de anticorpo; sistemas de células de inseto infetadas com vetores de expressão de vírus recombinantes (e.g., Baculovirus) contendo sequências de codificação de anticorpo; sistemas de células de plantas infetadas com vetores de expressão de vírus recombinantes (e.g., vírus do mosaico da couve-flor, CaMV; vírus do mosaico do tabaco, TMV) ou transformadas com vetores de expressão plasmídicos recombinantes (e.g., plasmídeo Ti) contendo sequências de codificação de anticorpo; ou sistemas de células de mamífero (e.g., células COS, CHO, BHK, 293, 3T3) apresentando construções de expressão recombinantes contendo promotores derivados do genoma de células de mamífero (e.g., promotor de metalotioneína) ou de vírus de mamífero (e.g., o promotor tardio de adenovirus; o promotor 7.5K de vírus de vaccinia), não se lhes limitando. 0 vetor pode ser um vetor plasmídico, um vetor de fago em cadeia simples ou em cadeia dupla ou um vetor vírico de ADN ou ARN em cadeia simples ou em cadeia dupla. Tais vetores podem ser introduzidos em células como polinucleótidos por técnicas bem conhecidas para introduzir ADN e ARN em células. Os vetores, no caso de vetores de fago e de vírus podem também ser introduzidos em células como vírus empacotados ou encapsulados por técnicas bem conhecidas para infeção e transdução. Os vetores viricos podem ser competentes em replicação ou deficientes em replicação. Neste último caso, a propagação virica ocorrerá geralmente apenas em células hospedeiras de complementação. Podem também utilizar-se sistemas de tradução isentos de células para produzir a proteína usando ARN derivados das presentes construções de ADN. Tais vetores podem incluir então sequências de nucleótidos que codificam para a região constante da molécula de anticorpo (consultar, e.g., publicação PCT WO 86/05807; publicação PCT WO 89/01036; e patente U.S. n2 5 122 464) e pode clonar-se o domínio variável do anticorpo em tal vetor para expressão da cadeia pesada ou leve completa.

Os procariotas úteis como células hospedeiras na presente invenção incluem organismos gram negativos ou gram positivos tal como E. coli e B. subtilis. Os vetores de expressão para uso em células hospedeiras procarióticas compreendem geralmente um ou mais genes marcadores fenotípicos selecionáveis. Um gene marcador fenotípico selecionável é, por exemplo, um gene que codifica uma proteína que confere resistência a antibiótico ou que fornece um requisito autotrófico. Os exemplos de vetores de expressão úteis para células hospedeiras procarióticas incluem os derivados de plasmídeos disponíveis comercialmente tais como pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suécia), pGEMl (Promega Biotec, Madison, Wisconsin., USA) e as séries de vetores pET (Novagen, Madison, Wisconsin, USA) e pRSET (Invitrogen Corporation, Carlsbad, California, USA) (Studier, F.W., J. Mol. Biol. 219: 37 (1991); Schoepfer, R. Gene 124: 83 (1993)) . As sequências de promotor comummente utilizadas para vetores de expressão de células hospedeiras procarióticas incluem T7, (Rosenberg, et ai. Gene 56,125-135 (1987)), β-lactamase (penicilinase), sistema de promotor de lactose (Chang et ai., Nature 275:615, (1978); e Goeddel et ai., Nature 281:544, (1979)), sistema de promotor de triptofano (trp) (Goeddel et ai., Nucl. Acids Res. 8:4057, (1980)) e promotor tac (Sambrook et ai., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.).

As leveduras úteis na presente invenção incluem as dos géneros Saccharomyces, Pichia, Actinomycetes e Kluyveromyces. Os vetores de levedura conterão frequentemente uma sequência de uma origem de replicação do plasmídeo de levedura 2μ, uma sequência de replicação autónoma (ARS), uma região de promotor, sequências para poliadenilação, sequências para terminação de transcrição e um gene marcador selecionável. As sequências de promotor adequadas para vetores de levedura incluem, entre outros, promotores para metalotioneina, 3-fosfoglicerato cinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073, (1980)) ou outras enzimas glicoliticas (Holland et al., Biochem. 17:4900, (1978)) tal como enolase, gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase, hexocinase, piruvato descarboxilase, fosfofrutocinase, glucose-6-fosfato isomerase, 3-fosfoglicerato mutase, piruvato cinase, triosefosfato isomerase, fosfoglucose isomerase e glucocinase. Outros vetores e promotores adequados para uso em expressão de levedura são descritos adicionalmente em Fleer et al., Gene, 107:285-195 (1991) . Outros promotores e vetores adequados para leveduras e protocolos de transformação de leveduras são bem conhecidos na especialidade. Os protocolos de transformação de leveduras são bem conhecidos. Descreve-se um de tais protocolos em Hinnen et al. , Proc. Natl. Acad. Sei., 75:1929 (1978) . O protocolo de Hinnen seleciona para produtos de transformação Trp+ num meio seletivo.

Podem também utilizar-se sistemas de cultura de células hospedeiras de mamífero ou de inseto para expressar anticorpos recombinantes, e.g., sistemas de baculovírus para produção de proteínas heterólogas. Num sistema de inseto, pode usar-se vírus da poliedrose nuclear de Autographa californica (AcNPV) como um vetor para expressar genes heterólogas. O vírus desenvolve-se em células de Spodoptera frugiperda. A sequência de codificação do anticorpo pode ser clonada individualmente em regiões não essenciais (por exemplo o gene de poliedrina) do vírus e pode ser colocada sob o controlo de um promotor de AcNPV (por exemplo o promotor de poliedrina).

Podem usar-se células NS0 ou de ovário de hamster chinês (CHO) para expressão em mamífero dos anticorpos da presente invenção. Podem excisar-se de genomas víricos sequências de controlo de transcrição e de tradução para vetores de expressão de células hospedeiras de mamífero. As sequências de promotor e sequências de facilitador habitualmente usadas são derivadas de vírus de polioma, de adenovirus 2, de vírus de símio 40 (SV40) e de citomegalovírus humano (CMV). Podem usar-se sequências de ADN derivadas do genoma virico de SV40 para proporcionar outros elementos genéticos para expressão de uma sequência estrutural do gene numa célula hospedeira de mamífero, e.g., locais da origem de SV40, do promotor precoce e tardio, do facilitador, de splicing e de poliadenilação. Os promotores víricos precoce e tardio são particularmente úteis dado que ambos são fáceis de obter a partir de um genoma virico como um fragmento que pode também conter uma origem de replicação vírica. Estão disponíveis comercialmente exemplos de vetores de expressão para uso em células hospedeiras de mamífero.

POLINUCLEÓTIDOS QUE CODIFICAM ANTICORPOS A invenção proporciona adicionalmente polinucleótidos ou ácidos nucleicos, e.g., ADN, compreendendo uma sequência de nucleótidos que codifica um anticorpo da invenção e seus fragmentos. Os exemplos de polinucleótidos incluem os que codificam cadeias de anticorpos compreendendo uma ou mais das sequências de aminoácidos aqui descritas. A invenção também abrange polinucleótidos que hibridam em condições de hibridação rigorosas ou de baixo rigor com polinucleótidos que codificam um anticorpo da presente invenção.

Podem obter-se os polinucleótidos e pode determinar-se a sequência de nucleótidos dos polinucleótidos, por qualquer método conhecido na especialidade. Por exemplo, se a sequência de nucleótidos do anticorpo for conhecida, pode construir-se um polinucleótido que codifica o anticorpo a partir de oligonucleótidos sintetizados quimicamente (e.g., tal como descrito em Kutmeier et ai., BioTechniques 17:242 (1994)), o que envolve, sucintamente, a síntese de oligonucleótidos sobrepostos contendo partes da sequência que codifica o anticorpo, hibridação e ligação desses oligonucleótidos, seguido de amplificação por PCR dos oligonucleótidos ligados.

Alternativamente, pode gerar-se um polinucleótido que codifica um anticorpo a partir de ácido nucleico de uma fonte adequada. Caso não esteja disponível um clone contendo um ácido nucleico que codifica um anticorpo específico, mas a sequência da molécula anticorpo for conhecida, um ácido nucleico que codifica a imunoglobulina pode ser sintetizado quimicamente ou pode obter-se a partir de uma fonte adequada (e.g., uma biblioteca de ADNc de anticorpo ou uma biblioteca de ADNc gerada a partir de, ou ácido nucleico, preferentemente ARN poli A+, isolado a partir de, qualquer tecido ou células que expressem o anticorpo, tal como células de hibridoma selecionadas para expressar um anticorpo da invenção) por amplificação por PCR usando iniciadores sintéticos que hibridam com as extremidades 3' e 5' da sequência ou por clonagem usando uma sonda de oligonucleótido especifica para a sequência génica a identificar em particular, e.g., um clone de ADNc de uma biblioteca de ADNc que codifica o anticorpo. Podem então clonar-se os ácidos nucleicos amplificados gerados por PCR em vetores de clonagem replicáveis usando qualquer método bem conhecido na especialidade.

Após determinar a sequência de nucleótidos e a sequência de aminoácidos correspondente do anticorpo, pode manipular-se a sequência de nucleótidos do anticorpo usando métodos bem conhecidos na especialidade para a manipulação de sequências de nucleótidos, e.g., técnicas de ADN recombinante, mutagénese dirigida ao local, PCR, etc. (consultar, por exemplo, as técnicas descritas em Sambrook et ai., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. e Ausubel et al., ed., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY ), para gerar anticorpos com uma sequência de aminoácidos diferente, por exemplo para criar substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos.

Numa concretização especifica, a sequência de aminoácidos dos domínios variáveis das cadeias pesada e/ou leve pode ser inspecionada para identificar as sequências das CDR por métodos bem conhecidos, e.g., por comparação com sequências de aminoácidos conhecidas de outras regiões variáveis de cadeias pesada e leve para determinar as regiões de hipervariabilidade da sequência. Usando técnicas rotineiras de ADN recombinante, podem inserir-se uma ou mais das CDR no interior das regiões de esqueleto, e.g., em regiões de esqueleto humano para humanizar um anticorpo não humano, tal como descrito anteriormente. As regiões de esqueleto podem ser de ocorrência natural ou regiões de esqueleto consensuais e preferentemente regiões de esqueleto humanas (consultar, e.g., Chothia et al. , J. Mol. Biol. 278: 457-479 (1998) para uma listagem de regiões de esqueleto humanas). Preferentemente, o polinucleótido gerado pela combinação das regiões de esqueleto e das CDR codifica um anticorpo que se liga especificamente a um polipéptido da invenção. Preferentemente, tal como discutido anteriormente, podem efetuar-se uma ou mais substituições de aminoácidos no interior das regiões de esqueleto e preferentemente, as substituições de aminoácidos melhoram a ligação do anticorpo ao seu antigénio. Adicionalmente, tais métodos podem usar-se para fazer substituições ou deleções de aminoácidos de um ou mais resíduos de cisteína de regiões variáveis que participam numa ligação dissulfureto intracadeia para gerar moléculas de anticorpo isentas de uma ou mais ligações dissulfureto intracadeia. Abrangem-se outras alterações ao polinucleótido pela presente invenção e que se encontram abrangidas pela perícia na especialidade.

Além disso, podem usar-se técnicas desenvolvidas para a produção de "anticorpos quiméricos" (Morrison et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. 81:851-855 (1984); Neuberger et al. , Nature 312:604-608 (1984); Takeda et al. , Nature 314:452-454 (1985)) pelo splicing de genes de uma molécula de anticorpo de ratinho com especificidade de antigénio apropriada conjuntamente com genes de uma molécula de anticorpo humano com atividade biológica apropriada. Tal como descrito anteriormente, um anticorpo quimérico é uma molécula na qual diferentes partes são derivadas de diferentes espécies animais, tal como os que apresentam uma região variável derivada de um MAb murino e uma região constante de uma imunoglobulina humana, e.g., anticorpos humanizados.

Alternativamente, podem adaptar-se técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia simples (patente U.S. n- 4 946 778; Bird, Science 242:423-42 (1988); Huston et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879-5883 (1988); e Ward et al., Nature 334:544-54 (1989)) para produzir anticorpos de cadeia simples. Formam-se anticorpos de cadeia simples por ligação dos fragmentos de cadeia pesada e leve da região Fv através de uma ponte de aminoácidos, resultando num polipéptido em cadeia simples. Podem também usar-se técnicas para montagem de fragmentos de Fv funcionais em E. coli (Skerra et al., Science 242 :1038-1041 (1988)) .

METÓDOS DE PRODUZIR ANTICORPOS

Os anticorpos da invenção podem ser produzidos por qualquer método conhecido na especialidade para a síntese de anticorpos, nomeadamente por síntese química ou preferentemente por técnicas de expressão recombinante. A expressão recombinante de um anticorpo da invenção ou seu fragmento, derivado ou análogo (e.g., uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo da invenção ou um anticorpo em cadeia simples da invenção), necessita da construção de um vetor de expressão contendo um polinucleótido que codifica o anticorpo ou um fragmento do anticorpo. Uma vez obtido um polinucleótido que codifica uma molécula de anticorpo, pode produzir-se um vetor para a produção do anticorpo por tecnologia de ADN recombinante. Constrói-se um vetor de expressão contendo sequências de codificação de anticorpo e sinais de controlo de transcrição e tradução adequados. Estes métodos incluem, por exemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas e recombinação genética in vivo.

Transfere-se o vetor de expressão para uma célula hospedeira por técnicas convencionais e as células transfetadas são então cultivadas por técnicas convencionais para produzir um anticorpo da invenção. Num aspeto da invenção, podem coexpressar-se vetores que codificam tanto a cadeia pesada como a cadeia leve na célula hospedeira para expressão da molécula de imunoglobulina completa, tal como detalhado seguidamente.

Podem utilizar-se vários sistemas de vetores de expressão-hospedeiro para expressar as moléculas de anticorpo da invenção, tal como descritas anteriormente. Tais sistemas de expressão-hospedeiro representam veículos pelos quais se podem produzir as sequências de codificação de interesse e subsequentemente podem ser purificadas, mas também representam células que, quando transformadas ou transfetadas com as sequências de codificação de nucleótidos adequadas, podem expressar uma molécula de anticorpo da invenção in situ. As células bacterianas, tais como E. coli, e as células eucarióticas são usadas vulgarmente para a expressão de uma molécula de anticorpo recombinante, especialmente para a expressão de moléculas de anticorpo recombinantes completas. Por exemplo, as células de mamífero, tais como células de ovário de hamster chinês (CHO), conjuntamente com um vetor tal como um elemento promotor de gene precoce intermediário major de citomegalovirus humano é um sistema de expressão eficaz para anticorpos (Foecking et ai., Gene 45:101 (1986); Cockett et ai., Bio/Technology 8:2 (1990)).

Adicionalmente, pode selecionar-se uma estirpe de células hospedeiras que modula a expressão das sequências inseridas, ou que modifica e processa o produto génico da forma especifica pretendida. Tais modificações (e.g., glicosilação) e processamento (e.g., clivagem) dos produtos protéicos podem ser importantes para a função da proteína. As diferentes células hospedeiras têm mecanismos característicos e específicos para o processamento e modificação pós-tradução de proteínas e produtos génicos. Podem selecionar-se linhas celulares ou sistemas hospedeiros adequados para assegurar a modificação e processamento corretos da proteína heteróloga expressa. Para este fim, podem usar-se células hospedeiras eucarióticas que possuem a maquinaria celular para processamento adequado do produto de transcrição primário, glicosilação e fosforilação do produto génico. Tais células hospedeiras de mamífero incluem células CHO, COS, 293, 3T3 ou de mieloma, não se lhes limitando.

Para a produção a longo prazo e de elevado rendimento de proteínas recombinantes, prefere-se expressão estável. Por exemplo, podem conceber-se racionalmente linhas celulares que expressam estavelmente a molécula de anticorpo. Em vez de usar vetores de expressão que contêm origens de replicação víricas, as células hospedeiras podem ser transformadas com ADN controlado por elementos de controlo de expressão adequados (e.g., sequências de promotor, facilitador, terminadores de transcrição, locais de poliadenilação, etc.) e um marcador selecionável. Após a introdução do ADN heterólogo, podem deixar-se as células concebidas racionalmente crescer durante 1-2 dias num meio enriquecido e seguidamente mudam-se para um meio seletivo. O marcador selecionável no plasmídeo recombinante confere resistência à seleção e permite que as células integrem estavelmente o plasmídeo nos seus cromossomas e cresçam para formar focos, que por seu lado podem ser clonados e expandidos em linhas celulares. Este método pode ser usado vantajosamente para conceber racionalmente linhas celulares que expressam as moléculas de anticorpo. Tais linhas celulares concebidas racionalmente podem ser particularmente úteis no rastreio e avaliação de compostos que interatuam direta ou indiretamente com a molécula de anticorpo.

Podem usar-se vários sistemas de seleção, incluindo os genes de timidina cinase de vírus herpes simplex (Wigler et ai., Cell 11:223 (1977)), hipoxantina-guanina fosforribosiltransferase (Szybalska e Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 48:202 (1992)) e adenina fosforribosiltransferase (Lowy et al., Cell 22:817 (1980)), não se lhes limitando, em células tk, hgprt ou aprt, respetivamente. Igualmente, pode usar-se resistência a antimetabolito como a base de seleção para os seguintes genes: dhfr, que confere resistência a metotrexato (Wigler et al. , Proc. Natl. Acad. Sei.. USA 77:357 (1980); 0'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:1527 (1981)); gpt, que confere resistência a ácido micofenólico (Mulligan e Berg, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:2072 (1981)); neo, que confere resistência ao aminoglicosídeo G-418 (Wu e Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991)); e hygro, que confere resistência a higromicina (Santerre et al., Gene 30:147 (1984)) . Podem ser aplicados rotineiramente métodos vulgarmente conhecidos na especialidade de tecnologia de ADN recombinante para selecionar o clone recombinante pretendido e tais métodos são descritos, por exemplo, em Ausubel et al. (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); e nos capítulos 12 e 13, Dracopoli et al. (ed) , Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1 (1981).

Os níveis de expressão de uma molécula de anticorpo podem ser aumentados por amplificação de vetor (para uma revisão, consultar Bebbington e Hentschel, "The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells" (DNA Cloning, Vol.3. Academic Press, New York, 1987)) . Quando o marcador no sistema de vetor que expressa anticorpo é amplificável, o aumento do nível de inibidor presente na cultura da célula hospedeira aumentará o número de cópias do gene marcador. Dado que a região amplificada está associada com o gene de anticorpo, a produção do anticorpo também aumentará (Crouse et al. , Mol. Cell. Biol. 3:257 (1983)). A célula hospedeira pode ser cotransfetada com dois vetores de expressão da invenção, em que o primeiro vetor codifica um polipéptido derivado de cadeia pesada e o segundo vetor codifica um polipéptido derivado de cadeia leve. Os dois vetores podem conter marcadores selecionáveis idênticos que permitem expressão igual dos polipéptidos de cadeia pesada e leve. Alternativamente, pode usar-se um único vetor que codifica e é capaz de expressar ambos os polipéptidos de cadeia pesada e leve. Em tais situações, a cadeia leve deve ser colocada antes da cadeia pesada para evitar um excesso tóxico de cadeia pesada livre (Proudfoot, Nature 322:52 (1986); Kohler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197 (1980)). As sequências de codificação para as cadeias pesada e leve podem compreender ADNc ou ADN genómico.

Uma vez produzida uma molécula de anticorpo da invenção por um animal, sintetizada quimicamente ou expressa recombinantemente, esta pode ser purificada por qualquer método conhecido na especialidade para purificação de uma molécula de imunoglobulina, por exemplo, por cromatografia (e.g., cromatografia de permuta iónica, de afinidade, nomeadamente por afinidade para o antigénio específico após proteína A e de exclusão de tamanho), centrifugação, solubilidade diferencial ou por qualquer outra técnica padrão para a purificação de proteínas. Além disso, os anticorpos da presente invenção ou seus fragmentos podem ser fundidos a sequências de polipéptido heterólogas aqui descritas ou de outra forma conhecidas na especialidade, para facilitar a purificação. A presente invenção abrange anticorpos fundidos recombinantemente ou conjugados quimicamente (incluindo tanto conjugação covalente, como não covalente) a um polipéptido. Podem usar-se anticorpos fundidos ou conjugados da presente invenção para facilitar a purificação. Consultar e.g., Harbor et al., anteriormente e publicação PCT WO 93/21232; EP 439 095; Naramura et al. , Immunol. Lett. 39:91-99 (1994); patente U.S. N2 5 474 981; Gillies et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 89:1428-1432 (1992); Fell et al., J. Immunol. 146:2446-2452 (1991).

Adicionalmente, os anticorpos ou seus fragmentos da presente invenção podem ser fundidos a sequências marcadoras, tais como um péptido, para facilitar a purificação. Em concretizações preferidas, a sequência de aminoácidos marcadora é um péptido hexa-histidina, tal como o marcador proporcionado num vetor pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif., 91311), entre outros, muitos dos quais estão disponíveis comercialmente. Tal como descrito em Gentz et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:821-824 (1989), por exemplo, hexa-histidina proporciona purificação conveniente da proteína de fusão. Outros marcadores peptídicos úteis para purificação incluem o marcador "HA", que corresponde a um epítopo derivado da proteína hemaglutinina de influenza (Wilson et ai., Cell 37:767 (1984)) e o marcador "flag", não se lhes limitando.

USOS DE DIAGNÓSTICO PARA ANTICORPOS

Os anticorpos da invenção incluem derivados que são modificados, i.e., por ligação covalente de qualquer tipo de molécula ao anticorpo, tal como ligação covalente que não interfere com a ligação ao antigénio. Por exemplo, não limitativo, os derivados de anticorpo incluem anticorpos que foram modificados, e.g., por biotinilação, HRP ou qualquer outra parte detetável.

Os anticorpos da presente invenção podem ser usados, por exemplo, para detetar fator D, não se lhe limitando, incluindo tanto métodos de diagnóstico in vitro, como in vivo. Por exemplo, os anticorpos têm utilidade em imunoensaios para medir qualitativa e quantitativamente os níveis de fator D em amostras biológicas obtidas dos olhos de indivíduos que sofrem de condições ou doenças oculares. Tipicamente, descrevem-se imunoensaios em, e.g., Harlow et ai., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988) .

Tal como discutido mais detalhadamente seguidamente, os anticorpos da presente invenção podem ser usados quer sozinhos, quer em combinação com outras composições. Os anticorpos podem ser adicionalmente fundidos recombinantemente a um polipéptido heterólogo no terminal N ou C ou conjugados quimicamente (incluindo conjugações covalentes e não covalentes) a polipéptidos ou outras composições. Por exemplo, os anticorpos da presente invenção podem ser fundidos recombinantemente ou conjugados a moléculas úteis como marcadores em ensaios de deteção. A presente invenção abrange adicionalmente o uso de anticorpos ou seus fragmentos conjugados a um agente de diagnóstico para a deteção dos níveis de componentes da via do complemento no olho de um indivíduo afetado. Os anticorpos podem ser usados em diagnóstico para, por exemplo, monitorizar o desenvolvimento ou progressão de uma condição ou doença ocular como parte de um procedimento de ensaio clínico, e.g., para determinar a eficácia de um determinado regime de tratamento. A deteção pode ser facilitada por acoplamento do anticorpo a uma substância detetável. Os exemplos de substâncias detetavéis incluem várias enzimas, grupos prostéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes, materiais bioluminescentes, materiais radioativos, metais emissores de positrão usando várias tomografias de emissão de positrão e iões metálicos paramagnéticos não radioativos. A substância detetável pode ser acoplada ou conjugada quer diretamente ao anticorpo (ou seu fragmento) ou indiretamente, através de um intermediário (tal como, por exemplo, um ligante conhecido na especialidade) usando técnicas conhecidas na especialidade. Consultar, por exemplo, patente U.S. N2 4 741 900 para iões metálicos que podem ser conjugados a anticorpos para uso em diagnóstico de acordo com a presente invenção. Os exemplos de enzimas adequadas incluem peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, beta-galactosidase ou acetilcolinesterase; os exemplos de complexos de grupo protético adequados incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina; os exemplos de materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloreto de dansilo ou ficoeritrina; um exemplo de um material luminescente inclui luminol; os exemplos de materiais bioluminescentes incluem luciferase, luciferina e aquorina; e exemplos de materiais radioativos adequados incluem 1251, 1311, lllln ou 99Tc.

Os anticorpos também podem ser ligados a suportes sólidos, que são especialmente úteis para imunoensaios ou purificação do antigénio alvo. Tais suportes sólidos incluem vidro, celulose, poliacrilamida, nylon, polistireno, policloreto de vinilo ou polipropileno, não se lhes limitando.

Podem usar-se anticorpos marcados e seus derivados e análogos, que se ligam especificamente a fator D para objetivos de diagnóstico para detetar, diagnosticar ou monitorizar doenças, distúrbios e/ou condições associadas a expressão e/ou atividade aberrante de fator D. A invenção proporciona deteção de expressão aberrante de fator D, compreendendo (a) ensaiar a expressão de fator D em células ou fluido corporal de um indivíduo usando um ou mais anticorpos da presente invenção específicos para fator D e (b) comparar o nível de expressão génica com um nível de expressão génica padrão, em que um aumento ou diminuição do nível de expressão de fator D no ensaio comparativamente ao nível de expressão padrão é indicativo de expressão aberrante.

Os anticorpos podem ser usados para detetar a presença e/ou níveis de fator D numa amostra, e.g., fluido ocular. 0 método de deteção pode compreender pôr a amostra em contacto com um anticorpo anti-fator D e determinar a quantidade de anticorpo que está ligado à amostra. A invenção proporciona um ensaio de diagnóstico para diagnosticar uma doença, compreendendo (a) ensaiar a expressão de fator D em células ou fluido corporal de um indivíduo usando um ou mais anticorpos da presente invenção e (b) comparar o nível de expressão génica com um nível de expressão génica padrão, em que um aumento ou diminuição do nível de expressão génica no ensaio comparativamente ao nível de expressão padrão é indicativo de uma doença específica.

Os anticorpos da invenção podem ser usados para ensaiar os níveis de proteína numa amostra biológica usando métodos imuno-histológicos clássicos conhecidos dos peritos na especialidade (e.g., consultar Jalkanen, et ai., J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985); Jalkanen, et ai., J. Cell. Biol. 105:3087-3096 (1987)). Outros métodos baseados em anticorpo úteis para detetar a expressão génica de proteína incluem imunoensaios, tal como o ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) e o radioimunoensaio (RIA) . Os marcadores de ensaio de anticorpo adequados são conhecidos na especialidade e incluem marcadores enzimáticos, tais como glucose oxidase; radioisótopos, tais como iodo (1251, 1211), carbono (14C), enxofre (35S), trítio (3H), índio (112ln) e tecnécio (99Tc); marcadores luminescentes, tal como luminol; e marcadores fluorescentes, tais como fluoresceína e rodamina, e biotina.

Um aspeto da invenção é a deteção e diagnóstico de uma doença ou distúrbio associado a ativação de complemento nos olhos de um indivíduo, de preferência um mamífero e com a maior preferência um humano. Numa concretização, o diagnóstico compreende: a) obter uma amostra do olho de um doente; b) medir o nível de componentes de complemento, tais como C3a ou C3b ou C5a. Pode determinar-se o nível de base por vários métodos incluindo comparar a quantidade de molécula marcada detetada com um valor padrão determinado anteriormente para um determinado sistema.

Numa concretização, a monitorização da doença ou distúrbio é efetuada por repetição do método para diagnóstico da doença ou distúrbio, por exemplo, um mês após o diagnóstico inicial, seis meses após o diagnóstico inicial, um ano após o diagnóstico inicial, etc.

USOS TERAPÊUTICOS DE INIBIDORES DE VIA DE COMPLEMENTO

Os inibidores da via de complemento podem ser administrados a um indivíduo que sofre de uma doença ocular tal como degeneração macular relacionada com a idade. Pode usar-se como um agente terapêutico, um anticorpo, com ou sem uma parte terapêutica a ele conjugado. A presente invenção é dirigida ao uso de inibidores da via do complemento, nomeadamente anticorpos, compreendendo a administração dos referidos inibidores a um animal, um mamífero ou um humano, para tratar uma doença, distúrbio ou condição ocular, envolvendo a ativação da via do complemento. 0 animal ou indivíduo pode ser um animal com necessidade de um determinado tratamento, tal como um animal a quem foi diagnosticada uma doença específica, e.g., uma doença relacionada com o complemento. Os anticorpos dirigidos contra fator D são úteis para inibir a via do complemento alternativa e assim inibir doenças ou condições relacionadas com a via do complemento. Em particular, a presente invenção refere-se ao tratamento de AMD, retinopatia diabética e neovascularização coroidal. Por exemplo, por administração de uma dose terapeuticamente aceitável de um anticorpo, ou anticorpos, da presente invenção, ou de uma mistura dos presentes anticorpos, ou em combinação com outras moléculas de várias fontes, os efeitos de ativação de componentes de via do complemento podem ser reduzidos ou eliminados no mamífero tratado.

Os compostos terapêuticos da invenção incluem anticorpos da invenção (incluindo seus fragmentos, análogos e derivados tal como aqui descrito) e ácidos nucleicos que codificam anticorpos da invenção, tal como descrito anteriormente (incluindo seus fragmentos, análogos e derivados e anticorpos anti-idiotípicos, tal como aqui descritos), não se lhes limitando. Os anticorpos da invenção podem ser usados para tratar, inibir ou prevenir doenças, distúrbios ou condições associadas a expressão e/ou atividade aberrante da via do complemento, nomeadamente da via alternativa e particularmente factor D. 0 tratamento e/ou prevenção de doenças, distúrbios ou condições associadas a expressão e/ou atividade aberrante de fator D inclui aliviar pelo menos um dos sintomas associados a estas doenças, distúrbios ou condições, não se lhes limitando. Os anticorpos da invenção podem ser proporcionados em composições farmaceuticamente aceitáveis tal como conhecido na especialidade ou tal como aqui descrito. A quantidade do anticorpo que será eficaz no tratamento, inibição e prevenção de uma doença ou distúrbio associado a expressão e/ou ativação aberrante da via do complemento pode ser determinada por técnicas clínicas padrão. 0 anticorpo pode ser administrado em regimes de tratamento consistentes com a doença, e.g., uma única dose ou um número pequeno de doses ao longo de um ou vários dias para melhorar um estado de doença ou doses periódicas ao longo de um período de tempo extenso para evitar doenças ou condições oculares.

Adicionalmente, podem utilizar-se opcionalmente ensaios in vitro para ajudar a identificar as gamas de dosagem ótimas. A dose exata a utilizar na formulação também dependerá da via de administração e da gravidade da doença ou distúrbio e deve ser decidida de acordo com o critério do médico assistente e das circunstâncias de cada doente. As doses eficazes podem ser extrapoladas de curvas dose-resposta derivadas de sistemas de ensaio de modelos in vitro ou animais.

Para anticorpos, a dosagem administrada a um doente é tipicamente 0,1 mg/kg a 100 mg/kg do peso corporal do doente. De preferência, a dosagem administrada a um doente está entre 0,1 mg/kg e 20 mg/kg do peso corporal do doente, com maior preferência 1 mg/kg a 10 mg/kg do peso corporal do doente. Em geral, os anticorpos humanos têm uma semivida maior no interior do corpo humano do que anticorpos de outras espécies, devido à resposta imunitária aos polipéptidos heterólogos. Assim, é frequentemente possível usar dosagens inferiores e administração menos frequente de anticorpos humanos. Adicionalmente, a dosagem e frequência de administração de anticorpos da invenção pode ser reduzida melhorando a absorção e a penetração nos tecidos (e.g., no cérebro) dos anticorpos por modificações, tal como, por exemplo, lipidação. Num aspeto preferido, o anticorpo está purificado substancialmente (e.g., substancialmente isento de substâncias que limitam o seu efeito ou que produzem efeitos secundários indesejáveis). São conhecidos vários sistemas de entrega e podem ser usados para administrar um anticorpo da presente invenção, incluindo injeção, e.g., encapsulação em lipossomas, micropartícuias, microcápsulas, células recombinantes capazes de expressar o composto, endocitose mediada por receptor (consultar, e.g., Wu et ai., J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)), construção de um ácido nucleico como parte de um vetor retrovírico ou outro, etc. O anticorpo pode ser administrado a um mamífero de qualquer forma aceitável. Os métodos de introdução incluem as vias intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, intranasal, epidural, inalação e oral, não se lhes limitando. No entanto, para o objetivo da presente invenção, a via de administração preferida é intraocular. A administração pode ser sistémica ou local. Adicionalmente, pode ser desejável introduzir os anticorpos ou composições terapêuticas da invenção no sistema nervoso central por qualquer via adequada, incluindo injeção intraventricular e intratecal; a injeção intraventricular pode ser facilitada por um cateter intraventricular, por exemplo, ligado a um reservatório, tal como um reservatório Ommaya.

Noutra concretização, o anticorpo pode ser entregue numa vesícula, em particular num lipossoma (consultar Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat et al., em Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein e Fidler (ed.), Liss, New York, p. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., p. 317-327; consultar geralmente ibid.).

Ainda noutra concretização, o anticorpo pode ser entregue num sistema de libertação controlada. Numa concretização, pode usar-se uma bomba (consultar Langer, anteriormente; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)). Noutra concretização, podem usar-se materiais poliméricos (consultar Medicai Applications of Controlled Release, Langer e Wise (ed.), CRC Pres., Boca Raton, Fia. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen e Ball (ed.), Wiley, New York (1984); Ranger e Peppas, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983); consultar também Levy et al., Science 228:190 (1985); During et al., Ann. Neurol. 25:351 (1989); Howard et al., J. Neurosurg. 71:105 (1989)) . Ainda noutra concretização, pode colocar-se um sistema de libertação controlada próximo do alvo terapêutico. A presente invenção também proporciona composições farmacêuticas úteis no presente método. Tais composições compreendem uma guantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo e um transportador fisiologicamente aceitável. Numa concretização específica, a expressão "fisiologicamente aceitável" significa aprovada por uma agência de regulamentação do governo federal ou estadual ou listada na farmacopeia dos EUA ou outra farmacopeia geralmente reconhecida para uso em animais e mais especificamente em humanos. A expressão "transportador" refere-se a um diluente, adjuvante, excipiente ou veículo com o gual se administra o agente terapêutico. Tais transportadores fisiológicos podem ser líguido estéreis, tais como água e óleos, incluindo os de origem de petróleo, animal, vegetal ou sintética, tal como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de sésamo e semelhantes. Prefere-se a água como transportador quando a composição farmacêutica é administrada intravenosamente. Podem também usar-se soluções salinas e soluções aquosas de dextrose e de glicerol como transportadores líquidos, nomeadamente para soluções injetáveis. Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, sílica-gel, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite em pó magro, glicerol, propilenoglicol, água, etanol e semelhantes. Caso se pretenda, a composição pode também conter quantidades pequenas de agentes de molhagem e emulsionantes ou agentes de tamponamento de pH. Estas composições podem ter a forma de soluções suspensões, emulsões, comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, formulações de libertação prolongada e semelhantes. A composição pode ser formulada como um supositório, com aglutinantes e transportadores tradicionais, tais como triglicéridos. As formulações orais podem incluir transportadores padrão, tais como manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sódio, celulose, carbonato de magnésio, etc., de grau farmacêutico. Descrevem-se exemplos de transportadores adequados em "Remington'' s Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martin. Tais composições conterão uma quantidade eficaz do anticorpo, de preferência na forma purificada, conjuntamente com uma quantidade adequada de transportador de modo a proporcionar a forma para administração adequada ao doente. A formulação deve ser adequada ao modo de administração.

Numa concretização, a composição é formulada de acordo com procedimentos de rotina, como uma composição farmacêutica adaptada para administração intravenosa a seres humanos. Tipicamente, as composições para administração intravenosa são soluções em tampão aquoso isotónico estéril. Quando necessário, a composição pode também incluir um agente de solubilização e um anestésico local, tal como lidocaína para aliviar a dor no local da injeção. Em geral, os ingredientes são fornecidos quer separadamente, quer misturados conjuntamente numa forma de dosagem unitária, por exemplo, como um pó seco liofilizado ou de concentrado isento de água num recipiente selado hermeticamente, tal como uma ampola ou saqueta, indicando a quantidade de agente ativo. Quando a composição é para ser administrada por infusão, pode ser administrada com um frasco de infusão contendo água ou soro fisiológico de grau farmacêutico estéril. Quando a composição é administrada por injeção, pode proporcionar-se uma ampola de água para injeção ou soro fisiológico estéril, de modo a que os ingredientes possam ser misturados antes de administração. A invenção também proporciona um pacote ou kit farmacêutico compreendendo um ou mais recipientes cheios com um ou mais dos ingredientes das composições farmacêuticas da invenção. Opcionalmente pode estar associado a tal (is) recipiente(s) uma nota com a forma prescrita por uma agência governamental que regula o fabrico, uso ou venda de produtos farmacêuticos ou biológicos, em que a nota refere a aprovação pela agência de fabrico, uso ou venda para administração humana.

Adicionalmente, os anticorpos da presente invenção podem ser conjugados a várias moléculas efetoras, tais como polipéptidos heterólogos, fármacos, radionucleótidos ou toxinas. Consultar, e.g., publicações PCT WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; patente U.S. N2 5 314 995; e EP 396 387. Um anticorpo ou seu fragmento podem ser conjugados a uma parte terapêutica tal como uma citotoxina, e.g., um agente citostático ou citocida, um agente terapêutico ou um ião metálico radioativo, e.g., emissores alfa tais como, por exemplo, 213Bi. Uma citotoxina ou agente citotóxico inclui qualquer agente que é prejudicial para as células. Os exemplos incluem paclitaxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etidio, emetina, mitomicina, etoposideo, tenoposídeo, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, di-hidroxiantracinadiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-desidrotestosterona, glucocorticóides, procaina, tetracaina, lidocaina, propranolol e puromicina e seus análogos ou homólogos. Os agentes terapêuticos incluem antimetabolitos (e.g., metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo descarbazina), agente alquilantes (e.g., mecloretamina, tioepa clorambucil, melfalano, carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU), ciclofosfamida, bussulfano, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C e cis-diclorodiaminaplatina (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (e.g., daunorrubicina (anteriormente daunomicina) e doxorrubicina), antibióticos (e.g., dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina e antramicina (AMC)) e agentes anti-mitóticos (e.g., vincristina e vinblastina), não se lhes limitando.

As técnicas para conjugar tal parte terapêutica a anticorpos são bem conhecidas, consultar, e.g., Arnon et ai., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy" em Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (ed.), p. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery" em Controlled Drug Delivery (2a Ed.), Robinson et al. (ed.), p. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review" em Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (ed.), p. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy" em Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (ed.), p. 303-16 (Academic Press 1985) e Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. 62:119-58 (1982). Alternativamente, pode conjugar-se um anticorpo a um segundo anticorpo para formar um heteroconjugado de anticorpo. (Consultar, e.g., Segai em patente U.S. N2 4 676 980).

Os conjugados da invenção podem ser usados para modificar uma determinada resposta biológica, o agente terapêutico ou parte de fármaco não deve ser entendido como limitado aos agentes terapêuticos químicos clássicos. Por exemplo, a parte de fármaco pode ser uma proteína ou polipéptido possuindo uma atividade biológica pretendida. Tais proteínas podem incluir, por exemplo, uma toxina tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas ou toxina de difteria; uma proteína tal como fator de necrose de tumor, interferão a, interferão β, fator de crescimento de nervos, fator de crescimento derivado de plaquetas, ativador de plasminogénio de tecido, um agente apoptótico, e.g., TNF-a, TNF-β, AIM I (consultar, publicação internacional N2 WO 97/33899), AIM II (consultar, publicação internacional N2 WO 97/34911), ligando Fas (Takahashi et al., Int. Immunol., 6:1567-1574 (1994)), VEGI (consultar, publicação internacional N2 WO 99/23105), um agente trombótico ou um agente anti-angiogénico, e.g., angiostatina ou endostatina; ou modificadores da resposta biológica tais como, por exemplo, linfocinas, interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), fator de estimulação de colónias de macrófago granulócito ("GM-CSF"), fator de estimulação de colónias de granulócito ("G-CSF") ou outros fatores de crescimento.

TERAPIA GENICA BASEADA EM ANTICORPO

Num outro aspeto da invenção, administram-se ácidos nucleicos compreendendo sequências que codificam anticorpos, ou seus fragmentos de ligação, para tratar, inibir ou prevenir uma doença ou distúrbio associado a expressão e/ou ativação aberrante da via do complemento através de terapia génica. A terapia génica refere-se a terapia efetuada pela administração a um indivíduo de um ácido nucleico expresso ou que pode ser expresso. Nesta concretização da invenção, os ácidos nucleicos produzem as suas proteínas codificadas que medeiam um efeito terapêutico. Pode usar-se qualquer dos métodos disponíveis para terapia génica de acordo com a presente invenção. Descrevem-se seguidamente exemplos de métodos.

Para revisões gerais dos métodos de terapia génica consultar Goldspiel et ai., Clinical Pharmacy 12:488-505 (1993); Wu e Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann.

Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); e Morgan e Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993); May, TIBTECH 11(5):155-215 (1993).

Num aspeto, o composto compreende sequências de ácido nucleico que codificam um anticorpo, em que as referidas sequências de ácido nucleico fazem parte de vetores de expressão que expressam o anticorpo ou fragmentos ou proteínas quiméricas ou suas cadeias pesadas ou leves num hospedeiro adequado. Em particular, tais sequências de ácido nucleico têm promotores ligados operacionalmente à região de codificação do anticorpo, em que o referido promotor é indutível ou constitutivo e, opcionalmente, específico de tecido.

Noutra concretização particular, são usadas moléculas de ácido nucleico nas quais as sequências de codificação de anticorpo e quaisquer outras sequências pretendidas estão flanqueadas por regiões que promovem recombinação homóloga num local pretendido no genoma, proporcionando assim expressão intracromossómica dos ácidos nucleicos que codificam o anticorpo (Roller e Smithies, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:8932-8935 (1989); Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989) . Em concretizações específicas, a molécula de anticorpo expressa é um anticorpo em cadeia simples; alternativamente, as sequências de ácido nucleico incluem sequências de codificação tanto da cadeia pesada, como da cadeia leve, ou seus fragmentos, do anticorpo. A entrega de ácidos nucleicos a um doente pode ser direta, na qual o doente é exposto diretamente ao ácido nucleico ou vetores contendo o ácido nucleico, ou indiretamente, caso em que primeiramente transformam-se células com os ácidos nucleicos in vitro, seguidamente transplantam-se para o doente. Estas duas abordagens são denominadas, respetivamente terapia génica in vivo ou ex vivo.

Numa concretização específica, as sequências de ácido nucleico são administradas diretamente in vivo, onde são expressas para produzir o produto codificado. Tal pode ser conseguido por qualquer de numerosos métodos conhecidos na especialidade, e.g., construindo-os como parte de um vetor de expressão adequado e administrando-os de modo a que se tornem intracelulares, e.g., por infeção usando retrovirus deficientes ou atenuados ou outros vetores víricos (consultar patente U.S. N2 4 980 286) , ou por injeção direta de ADN nu ou pela utilização de bombardeamento de micropartículas (e.g., uma pistola de genes; Biolistic, Dupont), ou revestimento com lípidos ou receptores de superfície celular ou agentes de transfeção, encapsulação em lipossomas, micropartículas ou microcápsulas, ou pela sua administração numa ligação a um péptido que se sabe que entra no núcleo, pela sua administração numa ligação a um ligando sujeito a endocitose mediada por receptor (consultar, e.g., Wu e Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)) (que pode ser usado para ter como alvo tipos de células que expressam especificamente os receptores), etc. Noutra concretização, podem formar-se complexos de ácido nucleico-ligando nos quais o ligando compreende um péptido vírico fusogénico que quebra endossomas, permitindo que o ácido nucleico evite degradação por lisossoma. Ainda noutra concretização, o ácido nucleico pode ser dirigido a um alvo in vivo para absorção e expressão específica de célula, dirigindo a um alvo de um receptor específico (consultar, e.g., publicações PCT WO 92/06180; WO 92/22635; WO92/20316; W093/14188, WO 93/20221).

Alternativamente, o ácido nucleico pode ser introduzido intracelularmente e incorporado no interior do ADN da célula hospedeira para expressão, por recombinação homóloga (Roller e Smithies, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:8932-8935 (1989); Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989)).

Numa concretização específica, usam-se vetores víricos que contêm sequências de ácido nucleico que codificam um anticorpo da invenção. Por exemplo, pode usar-se um vetor retrovírico (consultar Miller et al. , Meth. Enzymol. 217:581-599 (1993)). Estes vetores retrovíricos contêm os componentes necessários para o empacotamento correto do genoma vírico e integração no ADN da célula hospedeira. As sequências de ácido nucleico que codificam o anticorpo a ser usado em terapia génica são clonadas para um ou mais vetores, o que facilita a entrega do gene a um doente. Podem encontrar-se mais detalhes sobre vetores retrovíricos em Boesen et al. , Biotherapy 6:291-302 (1994), que descreve o uso de um vetor retrovírico para entregar o gene mdrl a células estaminais hematopoiéticas de modo a tornar as células estaminais mais resistentes a quimioterapia. Outras referências que ilustram o uso de vetores retrovíricos em terapia génica são: Clowes et al., J. Clin. Invest. 93:644-651 (1994); Riem et al., Blood 83:1467-1473 (1994); Salmons e Gunzberg, Human Gene Therapy 4:129-141 (1993); e Grossman e Wilson, Curr. Opin. Gen. and Dev. 3:110-114 (1993).

Podem também usar-se adenovirus na presente invenção. Os adenovirus são veículos especialmente interessantes na presente invenção para entrega de anticorpos a epitélio respiratório. Os adenovirus infetam naturalmente o epitélio respiratório. Outros alvos para sistemas de entrega baseados em adenovirus são o fígado, o sistema nervoso central, células endoteliais e músculo. Os adenovirus têm a vantagem de serem capazes de infetar células que não estão em divisão. Rozarsky e Wilson, Curr. Opin. Gen. Dev. 3:499-503 (1993) apresentam uma revisão sobre terapia génica baseada em adenovirus. Bout et al., Human Gene Therapy 5:3-10 (1994) demonstraram o uso de vetores adenovíricos para transferir genes para o epitélio respiratório de macacos Rhesus. Podem encontrar-se outros casos de uso de adenovirus em terapia génica em Rosenfeld et al., Science 252:431-434 (1991); Rosenfeld et al., Cell 68:143-155 (1992); Mastrangeli et al., J. Clin. Invest. 91:225-234 (1993); publicação PCT W094/12649; e Wang et al., Gene Therapy 2:775-783 (1995). Também se propuseram vírus adeno-associados (AAV) para uso em terapia génica (Walsh et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300 (1993); patentes U.S. N2 5 436 146; 6 632 670; 6 642 051) .

Outra abordagem para terapia génica envolve a transferência de um gene para células em cultura de tecidos por métodos tais como eletroporação, lipofeção, transfeção mediada por fosfato de cálcio ou infeção vírica. Usualmente, o método de transferência inclui a transferência de um marcador selecionável para as células. As células são então colocadas sob seleção para isolar as células que absorveram e que expressam o gene transferido. Essas células são então entregues a um doente.

Nesta concretização, o ácido nucleico é introduzido numa célula antes de administração in vivo da célula recombinante resultante. Tal introdução pode ser efetuada por qualquer método conhecido na especialidade, incluindo transfeção, eletroporação, microinjeção, infeção com um vetor vírico ou de bacteriofago contendo as sequências de ácido nucleico, fusão celular, transferência de gene mediada por cromossoma, transferência de gene mediada por microcélula, fusão de esferoplasto, etc., não se lhes limitando. São conhecidas na especialidade numerosas técnicas para a introdução de genes heterólogos em células (consultar, e.g., Loeffler e Behr, Meth. Enzymol. 217:599-618 (1993); Cohen et al. , Meth. Enzymol. 217:618-644 (1993); Cline, Pharmac. Ther. 29:69-92m (1985) e podem ser usados de acordo com a presente invenção, desde que não se prejudiquem as funções de desenvolvimento e fisiológicas necessárias das células recebedoras. A técnica deve proporcionar transferência estável do ácido nucleico para a célula, de modo que o ácido nucleico seja expressável pela célula e de preferência possa ser herdado e expressável pela descendência da célula.

As células recombinantes resultantes podem ser entregues a um doente por vários métodos conhecidos na especialidade. As células sanguíneas recombinantes (e.g., células estaminais ou progenitoras hematopoiéticas) são de preferência administradas intravenosamente. A quantidade de células que se pretendem usar depende do efeito pretendido, estado do doente, etc. e pode ser determinada por um perito na especialidade.

As células nas quais se pode introduzir um ácido nucleico para objetivos de terapia génica abrangem qualquer tipo de célula pretendido e disponível e incluem células epiteliais, células endoteliais, queratinócitos, fibroblastos, células musculares, hepatócitos; células sanguíneas tais como linfócitos T, linfócitos B, monócitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, megacariócitos, granulócitos; várias células estaminais ou progenitoras, em particular células estaminais ou progenitoras hematopoiéticas, e.g., tal como obtidas da medula óssea, sangue do cordão umbilical, sangue periférico, fígado fetal, etc., não se lhes limitando.

Numa concretização, a célula usada para terapia génica é autóloga ao doente. As sequências de ácido nucleico que codificam um anticorpo da presente invenção são introduzidas nas células de modo a que sejam expressáveis pelas células ou pela sua descendência e as células recombinantes são então administradas in vivo para efeito terapêutico. Numa concretização específica, usam-se células estaminais ou progenitoras. Quaisquer células estaminais e/ou progenitoras que possam ser isoladas e mantidas in vitro podem ser usadas potencialmente de acordo com esta concretização da presente invenção (consultar e.g. publicação PCT WO 94/08598; Stemple e Anderson, Cell 71:973-985 (1992); Rheinwald, Meth. Cell Bio. 21A:229 (1980); e Pittelkow e Scott, Mayo Clinic Proc. 61:771 (1986)) .

MODULAÇÃO DA EXPRESSÃO DE COMPONENTES DA VIA DO COMPLEMENTO POR ARNSI

Os ARNsi provaram ser úteis como uma ferramenta em estudos de modulação de expressão génica quando os antagonistas tradicionais, tais como moléculas pequenas ou anticorpos, podem ser menos eficazes. (Shi Y., Trends in Genetics 19(1) :9-12 (2003)) . Os ARN em cadeia dupla, sintetizados in vitro que têm entre 21 e 23 nucleótidos de comprimento podem atuar como ARN de interferência (ARNi) e podem inibir especificamente a expressão génica (Fire A., Trends in Genetics 391; 806-810

(1999)) . Estes ARNi atuam mediando a degradação dos seus ARN alvo. Dado que têm menos de 30 nucleótidos de comprimento, não desencadeiam um mecanismo de defesa celular antivírico. Tais mecanismos incluem produção de interferão e uma interrupção generalizada da síntese proteica da célula hospedeira. Na prática, podem sintetizar-se ARNsi e seguidamente clonarem-se para vetores de ADN. Tais vetores podem ser transfetados e forçados a expressar o ARNsi em níveis elevados. O elevado nível de expressão de ARNsi é usado para anular ("knockdown") ou reduzir significativamente a quantidade de proteína produzida numa célula e portanto é útil em experiências em que se pensa que a sobrexpressão de uma proteína está ligada a uma doença como cancro. Os ARNsi são antagonistas úteis de proteínas da via do complemento, por limitação da produção celular do antigénio e inibição da ativação da cascata de complemento.

PEPTIDOMIMÉTICOS E MOLÉCULAS PEQUENAS É bem conhecido dos peritos na especialidade que é possível substituir péptidos por peptidomiméticos. Os peptidomiméticos são geralmente preferíveis como agentes terapêuticos relativamente aos péptidos devido à sua melhor biodisponibilidade e ausência relativa de ataque por enzimas proteolíticas. Podem usar-se técnicas de modelação molecular para conceber peptidomiméticos que mimetizam a estrutura dos péptidos relacionados com complemento aqui divulgados. Assim, a presente invenção também proporciona peptidomiméticos e outros compostos líder que podem ser identificados com base em dados obtidos da análise estrutural da proteína da via do complemento. Pode analisar-se um análogo de fator D potencial através do uso de modelação computacional usando um programa de acoplamento, tal como GRAM, DOCK ou AUTODOCK. Este procedimento pode incluir ajuste por computador de potenciais análogos de fator D. Também se podem usar programas de computador para estimar a atração, repulsão e repulsão estérica de um análogo para um potencial local de ligação. Em geral, quanto mais perfeito o ajuste (e.g., menor repulsão estérica e/ou maior força de atração) mais potente será o potencial fármaco, dado que estas propriedades são consistentes com uma constante de ligação maior. Além disso, quanto maior a especificidade na conceção de um potencial fármaco maior a probabilidade do fármaco não interferir com outras propriedades do sistema de expressão. Tal minimizará os efeitos secundários potenciais devidos a interações indesejáveis com outras proteínas.

Inicialmente, pode obter-se um potencial análogo de fator D por rastreio de uma biblioteca de péptidos aleatória produzida por um bacteriofago recombinante, por exemplo, ou uma biblioteca química. Um ligando análogo selecionado desta forma poderia então ser modificado sistematicamente por programas de modelação computacional até se identificarem um ou mais potenciais ligandos promissores.

Tal modelação computacional permite a seleção de um número finito de modificações químicas racionais, contrariamente ao elevado número de modificações químicas essencialmente aleatórias que poderiam ser feitas e das quais qualquer uma poderia levar a um fármaco útil. Assim, através do uso da estrutura tridimensional aqui divulgada e de modelação computacional, rastreia-se um elevado número de compostos rapidamente e podem determinar-se alguns candidatos prováveis sem a laboriosa síntese de um elevado número de compostos.

Uma vez identificado um potencial análogo de fator D, este pode ser selecionado a partir de uma biblioteca de produtos químicos disponível comercialmente da maior parte das maiores empresas químicas incluindo Merck, GlaxoWelcome, Bristol Meyers Squib, Monsanto/Searle, Eli Lilly, Novartis e Pharmacia Upjohn, ou alternativamente o potencial ligando é sintetizado pela primeira vez. Tal como mencionado anteriormente, a síntese pela primeira vez de um ou mesmo de um grupo relativamente pequeno de compostos específicos é razoável na especialidade de conceção de fármacos.

Alternativamente, com base nas estruturas moleculares das regiões variáveis dos anticorpos anti-fator D, pode usar-se modelação molecular e conceção molecular racional para gerar e rastrear moléculas pequenas que mimetizam as estruturas moleculares da região de ligação dos anticorpos e inibem as atividades de fator D. Estas moléculas pequenas podem ser péptidos, peptidomiméticos, oligonucleótidos ou compostos orgânicas.

EXEMPLO

Eficácia de anticorpo em neovascularização coroidal (CNV) induzida por laser como um modelo de AMD húmido A eficácia de injeções intraoculares de um anticorpo pode ser ensaiada num modelo de CNV por lesão com laser, tal como descrito anteriormente por Krzystolik MG et ai. (Arch Ophthalm. 2002; 120:338-346). Este modelo pode ser usado para ensaiar a eficácia de qualquer fármaco candidato para a prevenção e/ou melhoria de AMD. Este modelo de CNV induzida por laser usa um laser verde de árgon para induzir CNV na mácula de macaco. Existe uma boa correlação entre o número de lesões CNV com derrame angiográfico significativo.

Existem duas fases nos estudos: fase 1, a fase da prevenção, envolve o inicio do tratamento com anticorpo antes de indução de CNV com laser e 1 semana após exposição ao laser para inibir a formação de CNV, que tipicamente aparece 2 a 3 semanas após lesão com laser. A fase 2, a fase de tratamento, inicia-se no dia 42 (3 semanas após lesão com laser) quando seria de esperar lesões CNV nos olhos de controlo da fase 1. A fase 2 avalia o efeito de tratamento na atenuação da extensão e derrame das lesões CNV existentes.

Usam-se tipicamente dez macacos cinomolgos (Macaca fascicularis) num estudo deste tipo. Anestesiam-se os macacos para todos os procedimentos com injeções intramusculares de, e.g., cloridrato de cetamina (20 mg/kg); maleato de acepromazina (0,125 mg/kg); e sulfato de atropina (0,125 mg/kg). Caso necessário, pode administrar-se anestesia suplementar de 5 a 6 mg/kg de cloridrato de cetamina. Além disso, usa-se tipicamente cloridrato de proparacaina a 0,5% para anestesia tópica. Pode administrar-se anestesia suplementar, com solução intravenosa de pentobarbital de sódio (5 mg/kg), antes de enucleação. Os animais são eutanizados após a experiência.

TRATAMENTO COM ANTICORPO O anticorpo a ser ensaiado é administrado num tampão fisiológico a uma concentração de cerca de e.g., 10 pg/pL. No olho de controlo injeta-se um veiculo que consiste de todos os componentes excepto o anticorpo a ser ensaiado. Aplicam-se injeções intraoculares de cerca de, e.g., 50 pL por olho com anticorpo ou veiculo em cada olho, respetivamente, através da pars plana usando uma agulha de calibre 30 e uma seringa de tuberculina após instilar anestesia tópica e solução de iodopovidona a 5%. Retira-se o anticorpo de um frasquinho através de um filtro de 5 pm e usa-se uma nova agulha de calibre 30 (fina) para a injeção intraocular. Após a injeção, instila-se uma pomada oftálmica bacteriocida, tal como bacitracina no fórnix. Tipicamente variam-se os locais de injeção para evitar traumatismo da esclera.

Na fase 1, atribui-se aleatoriamente o olho direito ou esquerdo de cada animal para receber injeções intraoculares de anticorpo a uma dose de cerca de, e.g., 500 pg (50 pL por olho) e este olho é denominado o olho de prevenção. A dose usada pode ser determinada com base num estudo de segurança e toxicologia anterior a este estudo de eficácia ou por outros meios clinicamente adequados. O outro olho é designado para receber injeções intraoculares de veiculo e é denominado olho de controlo. Ambos os olhos de cada animal recebem tipicamente duas injeções intraoculares com o anticorpo a ser ensaiado ou apenas veiculo nos dias 0 e 14 antes de tratamento com laser. No dia 21, todos os olhos são sujeitos a f otocoagulação com laser verde de árgon para induzir lesões CNV. No dia 28, uma semana após indução com laser, o olho de prevenção recebe outra injeção de anticorpo e o olho de controlo recebe veiculo. A fase 2 do estudo inicia-se no dia 42 ou 3 semanas após indução com laser, numa altura em que se espera que se tenha desenvolvido CNV. Após angiografia com fluoresceina no dia 42, ambos os olhos de cada animal receberão injeções intraoculares de anticorpo a uma dose de cerca de, e.g., 500 pg (50 pL por olho) e isto repete-se no dia 56.

INDUÇÃO DE CNV EXPERIMENTAL

Induzem-se membranas CNV na mácula de macacos cinomolgos com queimaduras com laser verde de árgon (Coherent Argon Dye Laser 920; Coherent Medical Laser, Palo Alto, Calif) usando uma lâmpada de fenda e uma lente de contacto plano fundus. Colocam-se simetricamente nove lesões na mácula de cada olho por um cirurgião com máscara. As variáveis do laser incluem um tamanho de local de 50 a 100 pm, duração de 0,1 segundos e potência na gama de 350 a 7 00 mW. A potência usada é determinada pela capacidade do laser produzir uma vesícula e uma pequena hemorragia à potência selecionada. Caso não se verifique qualquer hemorragia, coloca-se um ponto de laser adicional adjacente ao primeiro ponto, após o mesmo procedimento de laser. Usam-se tipicamente fotografias a cores e angiografia com fluoresceína para detetar e medir a extensão e derrame da CNV. No entanto, pode usar-se qualquer método capaz de medir CNV induzida por laser e os seus efeitos associados.

EXAMES OCULARES

Os olhos dos animais são analisados para defeito aferente relativo da pupila e seguidamente dilatados com cloridrato de fenilefrina a 2,5% e tropicamida a 0,8%. Ambos os olhos são examinados usando biomicroscopia com lâmpada de fenda e oftalmoscopia indireta nos dias 0, 14, 28, 42 e 56 (antes de injeção de anticorpo); dias 1, 15, 29, 43 e 57 (após injeção); dia 21 (antes de laser); dias 35 e 49 (dias intermédios); e dia 63 (enucleação e morte).

FOTOGRAFIA A CORES E ANGIOGRAFIA COM FLUORESCEÍNA

Efetua-se tipicamente fotografia de fundus em todos os animais nos mesmos dias de exame ocular. As fotografias podem ser obtidas com uma câmara de fundus (Canon Fundus CF-60Z; Canon USA Inc, Lake Success, NY) e película de 35 mm, mas pode usar-se qualquer dispositivo de fotografia.

Pode usar-se o sistema de angiografia digital Imagenet (sistema Topcon 501 A and Imagenet; Topcon America Corp, Paramus, NJ) para angiografia com fluoresceína. Obtêm-se tipicamente fotografias de ambos os olhos sem vermelho após angiografia com fluoresceína usando 0,1 mL/kg de peso corporal de fluoresceína de sódio a 10% (Akorn Inc, Abita Springs, La) a uma taxa de 1 mL/s. Após a injeção de fluoresceína, obtém-se uma série de imagens rápidas no primeiro minuto do polo posterior, primeiramente do olho direito e seguidamente do olho esquerdo. Obtêm-se tipicamente pares de imagens adicionais aproximadamente 1 a 2 e a 5 minutos. Entre 2 e 5 minutos, obtêm-se duas imagens dos campos médio-periféricos (temporal e nasal) de cada olho. Efetua-se angiografia com fluoresceína na linha de base (dia 0) e nos dias 7, 14, 29, 42, 49, 57 e 63.

ANÁLISE DOS DADOS OFTÁLMICOS

Avaliam-se as fotografias e angiogramas para evidências de derrame angiográfico, hemorragias ou quaisquer outras anomalias. As hemorragias do fundus são classificadas com base num sistema de classificação com hemorragias da retina que envolvem menos do que 3 áreas de disco definidas como grau 1, hemorragias entre 3 e 6 áreas de disco definidas como grau 2 e hemorragias de mais de 6 áreas de disco definidas como grau 3. A associação de hemorragias a membranas CNV ou no local de indução com laser é também avaliada. Define-se derrame significativo clinicamente como qualquer hemorragia de fundus superior ou igual a uma área de 6 discos. A inflamação ocular também é avaliada usando biomicroscopia com lâmpada de fenda. Contam-se as células da câmara anterior e do vítreo com uma lâmpada de fenda de 2 mm com elevada ampliação e classificam-se usado o esquema de American Academy of Ophthalmology. As lesões CNV são classificadas por revisão dos angiogramas com fluoresceína efetuados nos dias 35, 42, 49, 56 e 63 por analistas experientes, tipicamente dois, que classificam por opinião consensual. As lesões CNV são classificadas de acordo com o seguinte esquema, usando angiografias padronizadas para comparação. As lesões de grau 1 não apresentam qualquer hiperfluorescência. As lesões de grau 2 apresentam hiperfluorescência sem derrame. As lesões de grau 3 apresentam hiperfluorescência nas imagens de trânsito inicial ou intermédio e derrame tardio. As lesões de grau 4 apresentam hiperfluorescência brilhante no trânsito e derrame tardio para além das áreas tratadas. As lesões de grau 4 são definidas como clinicamente significativas.

Pode efetuar-se análise estatística usando os dados de painel de população agregada com equações de estimativa generalizada e a razão de taxa de incidência (IRR). A taxa de incidência é usualmente definida como o número de lesões de grau 4 que ocorrem durante um determinado intervalo de tempo dividido pelo número total de lesões induzidas. Na fase 1, a IRR refere-se à razão de taxa de incidência de lesões de grau 4 nos olhos de prevenção e a taxa de incidência nos olhos de controlo. Uma IRR de 1 significa que não há qualquer diferença entre as taxas de incidência. Um número muito menor do que 1 indicará uma redução na incidência de lesões de grau 4 no grupo de prevenção relativamente ao grupo de controlo. Na fase 2, compara-se a incidência de lesões de grau 4 nos olhos de controlo relativamente aos olhos de tratamento. Tal significa que a incidência de lesões de grau 4 é comparada ao longo do tempo no conjunto de olhos que foram primeiramente atribuídos ao grupo de controlo, mas que nos dias 42 e 56 são tratados com anticorpo e tornam-se olhos de tratamento.

RASTREIO PARA AGENTES ÚTEIS NO TRATAMENTO DE AMD 0 estudo e tratamento de degeneração macular relacionada com a idade (AMD) pode ser conseguido usando um novo modelo animal compreendendo ratinhos deficientes quer em proteína 1 quimioatratora de monócitos (Ccl-2; também denominada MCP-1) ou do seu cognato receptor 2 C-C de quimiocina (Ccr-2) (Ambati, J. et ai. Nat Med. novembro de 2003; 9 (11) :1390-7. Epub 19 de outubro de 2003) . Estes ratinhos desenvolvem caraterísticas fundamentais de AMD, incluindo acumulação de lipofuscina e drusas imediatamente abaixo do epitélio pigmentado da retina (RPE) e atrofia de fotorreceptor e neovascularização coroidal (CNV). O tratamento destes ratinhos com um agente pretendido pode permitir avaliar a eficácia de tal agente para a sua eficácia no tratamento de AMD.

Concretizações preferidas: 1. Método para prevenir ou melhorar uma doença ocular num indivíduo, compreendendo a etapa de administrar um inibidor de via do complemento a um indivíduo com necessidade de tal administração. 2. Método do item 1, em que a via do complemento é a via do complemento alternativa. 3. Método de acordo com o item 1, em que a doença ocular é selecionada do grupo que consiste de degeneração da retina, retinopatia diabética e angiogénese ocular. 4. Método de acordo com o item 3, em que o indivíduo necessita de inibição de neovascularização ocular que afeta o tecido coroidal, epitélio pigmentado da retina ou tecido da retina. 5. Método de acordo com qualquer dos itens 1-4, em que o inibidor da via do complemento é um anticorpo, uma proteína, péptido, um peptidomimético ou uma molécula pequena. 6. Método de acordo com qualquer um dos itens 1-4, em que o inibidor da via do complemento é fator H ou um seu péptido funcional. 7. Método de acordo com o item 1, em que o inibidor da via do complemento é um anticorpo ou um seu fragmento de ligação. 8. Método de acordo com o item 7, em que o inibidor do complemento é um fragmento de anticorpo compreendendo um Fab, Fab', F(ab')2, Fv ou um Fv em cadeia simples. 9. Método de acordo com o item 7, em que o inibidor de complemento é um anticorpo de domínio simples. 10. Método de acordo com o item 7, em que o inibidor de complemento é um anticorpo monoclonal. 11. Método de acordo com o item 7, em que o inibidor de complemento é um anticorpo quimérico, desimunizado, humanizado, primatizado ou humano. 12. Método de acordo com o item 7, em que o anticorpo se liga especificamente a um componente da via do complemento alternativa. 13. Método de acordo com o item 12, em que o anticorpo se liga especificamente a fator D, properdina, fator B, fator Ba, ou fator Bb. 14. Método de acordo com o item 13, em que o anticorpo se liga especificamente a fator D. 15. Método de acordo com o item 14, em que o anticorpo é anticorpo monoclonal 166-32 produzido a partir do hibridoma depositado em ATCC e denominado HB12476. 16. Método de acordo com o item 14, em que o anticorpo se liga especificamente ao mesmo epítopo que o anticorpo monoclonal 166-32 produzido a partir do hibridoma depositado em ATCC e denominado HB 12476. 17. Método de acordo com o item 14, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal humanizado derivado de 166-32 produzido a partir do hibridoma depositado em ATCC e denominado HB 12476. 18. Método de acordo com o item 7, em que o anticorpo se liga especificamente a um componente das vias do complemento clássica ou de lectina. 19. Método de acordo com o item 18, em que o anticorpo se liga especificamente a C2, C2a, C3a, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9 ou C5b-9. 20. Método de acordo com o item 18, em que o anticorpo se liga especificamente a componente de complemento C5a. 21. Método de acordo com o item 20, em que o anticorpo é 137-26 produzido a partir do hibridoma depositado em ATCC e denominado PTA-3650. 22. Método de acordo com item 20, em que o anticorpo se liga ao mesmo epítopo do que 137-26 produzido a partir do hibridoma depositado em ATCC e denominado PTA-3650. 23. Método de acordo com qualquer um dos itens 1-22, em que o inibidor da via do complemento é administrado por (a) administração parentérica, administração oral, administração entérica ou administração tópica (b) implante de libertação prolongada biocompatível ou suscetível a bioerosão; (c) implante de uma bomba de infusão; ou (d) administração local, tal como administração intravítreo ou administração subconjuntiva. 24. Método de acordo com o item 23, em que a administração tópica é uma solução de lavagem ocular, uma pomada ocular, uma proteção ocular ou uma solução de gotas oculares. 25. Método de acordo com o item 23, compreendendo adicionalmente a etapa de administrar um composto de imunomodulação ou imunossupressão ao referido indivíduo. 26. Método de inibir a ativação da via do complemento alternativa num indivíduo com uma doença ocular, compreendendo administrar um ARNsi específico para uma proteína da via do complemento. 27. Método de inibir a ativação da via do complemento alternativa num doente com uma doença ocular, compreendendo administrar um ácido nucleico que codifica um inibidor de via do complemento.

Lisboa, 2015-08-24

Claims (21)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Inibidor de complemento para uso num método para tratamento de uma doença ocular associada a ativação de complemento num indivíduo, em que o inibidor de complemento é um anticorpo ou um seu fragmento de ligação a antigénio ou um ácido nucleico que codifica o anticorpo ou o fragmento de ligação a antigénio, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio se liga especificamente a fator D.
2. 2. Inibidor de complemento para uso na reivindicação 1, em que o fragmento de ligação de antigénio compreende um Fab, Fab', F(ab,)2, Fv, um Fv em cadeia simples, diacorpos ou um anticorpo de domínio simples.
3. 3. Inibidor de complemento para uso na reivindicação 1, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo desimunizado, um anticorpo humanizado, um anticorpo primatizado ou um anticorpo humano.
4. 4. Inibidor de complemento para uso na reivindicação 1, em que o anticorpo ou o seu fragmento de ligação a antigénio está conjugado a uma parte terapêutica.
5. 5. Inibidor de complemento para uso na reivindicação 1, em que o anticorpo é anticorpo monoclonal 166-32 produzido a partir do hibridoma depositado em ATCC e denominado HB 12476.
6. 6. Inibidor de complemento para uso na reivindicação 1, em que o anticorpo se liga especificamente ao mesmo epítopo do que o anticorpo monoclonal 166-32 e em que o anticorpo monoclonal 166-32 é produzido a partir do hibridoma depositado em ATCC e denominado HB 12476.
7. 7. Inibidor de complemento para uso na reivindicação 1, em que o anticorpo é um anticorpo humanizado derivado de anticorpo monoclonal 166-32 e em que o anticorpo monoclonal 166-32 é produzido a partir do hibridoma depositado em ATCC e denominado HB 12476.
8. 8. Composição farmacêutica compreendendo o inibidor de complemento, tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1-7, e um diluente ou transportador farmaceuticamente aceitável, em que a composição é para uso num método de tratamento de uma doença ocular associada a ativação de complemento num indivíduo.
9. 9. Composição para uso da reivindicação 8, que está sob a forma de administração intraocular, forma de administração intravítreo, forma de administração subconjuntiva, forma de administração parentérica, forma de administração intradérmica, forma de administração intramuscular, forma de administração intraperitoneal, forma de administração intravenosa, forma de administração subcutânea, forma de administração intranasal, forma de administração oral, forma de administração entérica, forma de administração tópica, forma de administração intratecal, forma de administração intraventricular, forma epidural, forma de inalação, um implante de libertação prolongada biocompatível ou suscetível a bioerosão ou uma bomba de infusão implantada.
10. 10. Composição para uso da reivindicação 8, que é uma solução de lavagem ocular, uma pomada ocular, uma proteção ocular ou uma solução de gotas oculares.
11. 11. Composição para uso da reivindicação 8, que compreende adicionalmente ou é para administração com um composto de imunomodulação, um composto imunossupressor, um composto anti-inflamatório ou um composto anti-angiogénico.
12. 12. Composição para uso da reivindicação 8, que compreende adicionalmente ou é para administração com um esteroide.
13. 13. Composição para uso da reivindicação 8, em que o inibidor de complemento está numa quantidade entre 0,1 mg/kg e 100 mg/kg do peso corporal do indivíduo.
14. 14. Inibidor do complemento para uso num método de tratamento de uma doença ocular associada a ativação de complemento num indivíduo, em que o inibidor de complemento é (i) anticorpo monoclonal 166-32 produzido a partir do hibridoma depositado em ATCC e denominado HB 1247 6 ou urn seu fragmento de ligação a antigénio, (ii) anticorpo que se liga especificamente ao mesmo epitopo do que o anticorpo monoclonal 166-32 ou um seu fragmento de ligação a antigénio, ou (iii) anticorpo humanizado derivado de anticorpo monoclonal 166-32 ou um seu fragmento de ligação a antigénio, em que a doença ocular é degeneração macular, retinopatia diabética ou angiogénese ocular.
15. 15. Uso de um inibidor de complemento para a preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença ocular associada a ativação do complemento num indivíduo, em que o inibidor de complemento é um anticorpo ou um seu fragmento de ligação a antigénio que se liga especif icamente a fator D, ou um ácido nucleico que codifica o referido anticorpo ou o fragmento de ligação a antigénio.
16. 16. Uso da reivindicação 15, em que o anticorpo é anticorpo monoclonal 166-32 produzido a partir do hibridoma depositado em ATCC e denominado HB 12476.
17. 17. Uso da reivindicação 15, em que o anticorpo se liga especificamente ao mesmo epitopo do que o anticorpo monoclonal 166-32 produzido a partir do hibridoma depositado em ATCC e denominado HB 12476.
18. 18. Uso da reivindicação 15, em que o anticorpo é um anticorpo humanizado derivado de anticorpo monoclonal 166-32 produzido a partir do hibridoma depositado em ATCC e denominado HB 12476.
19. 19. Inibidor de complemento para uso na reivindicação 1, composição para uso na reivindicação 8 ou o uso da reivindicação 15, em que a doença ocular é degeneração macular, retinopatia diabética ou angiogénese ocular.
20. 20. Inibidor de complemento para uso da reivindicação 19, composição para uso da reivindicação 19 ou uso da reivindicação 19, em que a degeneração macular é a forma seca de degeneração macular relacionada com a idade.
21. 21. Inibidor de complemento para uso da reivindicação 19, composição para uso da reivindicação 19 ou uso da reivindicação 19, em que a degeneração macular é a forma húmida de degeneração macular relacionada com a idade. Lisboa, 2015-08-24