ES2551202T5 - Uso de inhibidores de la vía del complemento para tratar enfermedades oculares - Google Patents

Description

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DESCRIPCION

Uso de inhibidores de la v^a del complemento para tratar enfermedades oculares Campo de la invencion

Esta invencion se refiere a la inhibicion de la v^a del complemento, particularmente Factor D, en pacientes que padecen afecciones oculares relacionadas y enfermedades asociadas con la activacion del complemento, la degeneracion macular relacionada con la edad.

Antecedentes de la invencion

La degeneracion macular es una expresion clmica que se utiliza para describir una familia de enfermedades que se caracterizan por una perdida progresiva de la vision central asociada con anomalfas de la membrana de Bruch, la coroides, la retina neural y/o el epitelio pigmentario de la retina. En el centro de la retina se encuentra la macula lutea, que es aproximadamente 1/3 a 1/2 cm de diametro. La macula proporciona la vision detallada, en particular en el centro (la fovea), dado que los conos son mas altos en densidad. Los vasos sangumeos, celulas ganglionares, la capa nuclear interna y las celulas, y las capas plexiformes estan desplazadas hacia un lado (en lugar de reposando sobre), permitiendo de este modo a la luz un camino mas directo a los conos. Debajo de la retina se encuentra el coroides, una coleccion de vasos sangumeos incrustados dentro de un tejido fibroso, y el epitelio pigmentado (PE), que se superpone a la capa de la coroides. Los vasos sangumeos coroideos proporcionan nutricion a la retina (en particular sus celulas visuales). La coroides y el PE se encuentran en la parte posterior del ojo.

Las celulas de la retina del epitelio pigmentario (RPE), que componen el PE, producen, almacenan y transportan una diversidad de factores que son responsables de la funcion normal y la supervivencia de los fotorreceptores. Estas celulas multifuncionales transportan metabolitos a los fotorreceptores de su suministro de sangre, la corio capilaris del ojo. Celulas de la RPE tambien funcionan como macrofagos, fagocitando las puntas de los segmentos externos de bastones y conos, que se producen en el curso normal de la fisiologfa celular. Diversos iones, protemas y agua se mueven entre las celulas de la RPE y el espacio interfotorreceptor, y estas moleculas afectan, en ultima instancia, al metabolismo y a la viabilidad de los fotorreceptores.

La degeneracion macular relacionada con la edad (AMD), la degeneracion macular mas frecuente, se asocia con la perdida progresiva de la agudeza visual en la parte central del campo visual, cambios en la vision del color y adaptacion y sensibilidad a la oscuridad anormal. Se han descrito dos principales manifestaciones clmicas de AMD tal como la forma seca o atrofica, y la forma humeda o exudativa. La forma seca se asocia con la muerte celular atrofica de la retina o macula central, que es necesaria para la vision fina utilizada para actividades como leer, conducir o reconocer caras. Alrededor del 10-20% de estos pacientes con AMD seca progresan a la segunda forma de AMD, conocido como la AMD humeda.

La AMD humeda (neovascular / exudativa) es provocada por un crecimiento anormal de los vasos sangumeos detras de la retina por debajo de la macula y la fuga vascular, dando como resultado el desplazamiento de la retina, hemorragia y formacion de cicatrices.Esto resulta en un deterioro de la vision a lo largo de un periodo de meses a anos. Sin embargo, los pacientes pueden sufrir una rapida perdida de vision. Todos los casos de AMD humeda se originan a partir de la AMD seca avanzada. La forma humeda representa el 85% de la ceguera debido a AMD. En la AMD humeda, como los vasos sangumeos dejan escapar fluido y sangre, se forma tejido cicatricial que destruye la retina central.

Los factores de riesgo mas importantes para el desarrollo de ambas formas son la edad y la deposicion de las drusas, depositos extracelulares anormales, detras del epitelio pigmentario de la retina. Las drusas provocan un estiramiento lateral de la monocapa de RPE y el desplazamiento ffsico de la RPE de su suministro vascular inmediato, el coriocapilar. Este desplazamiento crea una barrera ffsica que pueda impedir metabolito normal y la difusion de residuos entre el coriocapilar y la retina. Las drusas son los depositos distintivos asociados con AMD. La biogenesis de drusas implica una disfuncion de la RPE, una digestion alterada de los segmentos externos de los fotorreceptores y la acumulacion de subsiguientes desechos. Las drusas contienen activadores del complemento, inhibidores, fragmentos del complemento espedfico de la activacion, y componentes de la via terminal, incluyendo el complejo de ataque a la membrana (MAC o C5b-9), lo que sugiere que la concentracion focal de estos materiales puede producir un poderoso estfmulo quimiotactico para los leucocitos que actuan a traves de una cascada del complemento (Killingsworth, et al., (2001) Exp Eye Res 73, 887-96). Estudios recientes han implicado la inflamacion local y la activacion de la cascada del complemento en su formacion (Bok D. Proc Natl Acad Sci (USA). 2005; 102: 7053-4; Hageman GS, et al. Prog Retin Res Eye. 2001; 20: 705-32; Anderson DH, et al. Am J Ophthalmol. 2002; 134: 411-31. Johnson LV, et al. Exp Eye Res. 2001; 73: 887-96).

La AMD humeda se asocia con la neovascularizacion coroidea (CNV) y es un proceso biologico complejo. La patogenesis de la formacion de nuevos vasos coroidea es poco conocida, pero se piensa que es importante utilizar factores tales como inflamacion, isquemia y la produccion local de factores angiogenicos. Aunque se ha sugerido que la inflamacion juega un papel, el papel de complemento no ha sido explorado. Un estudio preliminar de la CNV se ha demostrado que es provocada por la activacion del complemento en un modelo de raton (Bora PS, J Immunol. 2005; 174: 491-497).

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El sistema del complemento es un componente crucial de la inmunidad innata contra la infeccion microbiana y comprende un grupo de protemas que normalmente estan presentes en el suero en un estado inactivo. Estas protemas estan organizadas en tres vfas de activacion: la clasica, la lectina y las vfas alternativas (V.M. Holers, En Clinical Immunology: Principles and Practice, comp. R.R. Rich, Mosby Press; 1996, 363-391). Las moleculas en la superficie de los microbios pueden activar estas vfas que resultan en la formacion de complejos de proteasa conocidos como C3-convertasas. La via clasica es una cascada dependiente de calcio/magnesio, que normalmente se activa por la formacion de complejos de antigeno-anticuerpo. Tambien se puede activar de una manera independiente del anticuerpo por la union de la protema C reactiva complejada con ligando y por muchos agentes patogenos, incluyendo bacterias gram-negativas. La via alternativa es una cascada dependiente de magnesio que es activada por deposicion y activacion de C3 sobre determinadas superficies sensibles (p. ej., polisacaridos de la pared celular de levaduras y bacterias y determinados materiales biopolimericos).

La via alternativa participa en la amplificacion de la actividad tanto de la via clasica como de la via de la lectina (Suankratay, C., ibid; Farriers, T.C. et al., Mol. Immunol. 27: 1155-1161 (1990)). La activacion de la via del complemento genera fragmentos biologicamente activos de protemas del complemento, p. ej., anafilotoxinas C3a, C4a y C5a y C5b y complejos de ataque a la membrana (MAC) C5b-9, que median en las respuestas inflamatorias a traves de la implicacion de la quimiotaxis de leucocitos, la activacion de macrofagos, neutrofilos, plaquetas, mastocitos y celulas endoteliales, aumento de la permeabilidad vascular, citolisis y lesion del tejido.

El Factor D puede ser una diana adecuada para la inhibicion de esta amplificacion de las vfas del complemento, debido a que su concentracion plasmatica en seres humanos es muy baja (1,8 Mg/ml), y se ha demostrado que es la enzima limitante de la activacion de la via alternativa del complemento (P.H. Lesavre y H.J. Muller-Eberhard J. Exp. Med., 1978; 148: 1498-1510; J.E. Volanakis et al., New Eng. J. Med., 1985; 312: 395-401). La inhibicion de la activacion del complemento ha demostrado ser eficaz en el tratamiento de varias indicaciones de enfermedades utilizando modelos animales y en estudios ex vivo, p. ej., lupus eritematoso sistemico y glomerulonefritis (Y. Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci.; 1996, 93: 8563 a 8568). El documento WO 99/42133 se refiere a inhibidores de factor D que se unen a factor D y bloquean la actividad funcional de factor D en la activacion del complemento. La inhibicion incluye moleculas de anticuerpos, asf como homologos, analogos y formas modificadas o derivadas de las mismas, incluidos fragmentos de inmunoglobulina tales como Fab, (Fab')2 y Fv, moleculas pequenas, incluidos peptidos, oligonucelotidos, peptido mimeticos y compuestos organicos. Se genero un anticuerpo monoclonal que se urna a factor D y que bloqueaba su capacidad de activar el complemento, y se designo 166-32. El hibridoma que produce este anticuerpo se deposito en la American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 201102209, bajo el Numero de Acceso HB-12476.

Utilizando el polimorfismo de un solo nucleotido (SNP) el analisis de los pacientes con AMD, se encontro que una variante genetica de Factor H (Y402H) se asocia altamente con una incidencia incrementada de AMD (Zareparsi S, Branham KEH, Li M, et al. Am J Hum Genet. 2005; 77: 149-53; Haines JL, et al. Sci 2005; 208: 419-21). Personas que son homocigotos o heterocigotos para esta mutacion puntual del gen del Factor H pueden representar el 50% de los casos de AMD. Factor H es el inhibidor soluble clave de la via alternativa del complemento (Rodriguez de Cordoba S, et al. Mol Immunol 2004; 41: 355-67). Se une a C3b y, por lo tanto, acelera la descomposicion de la via alternativa C3-convertasa (C3bBb) y actua como un co-factor para la inactivacion proteolftica de C3b mediada por el Factor I. Los estudios de tincion histoqmmica demuestran que hay una distribucion similar de Factor H y MAC en la interfaz RPE-coroides.

Cantidades significativas de MAC depositado en esta interfaz que se encuentra en pacientes con AMD indican que el haplotipo Factor H (Y402H) puede tener funcion inhibidora del complemento atenuada. Se especula que el Factor H (Y402H) puede tener una afinidad de union inferior para C3b. Por lo tanto, no es tan eficaz como la del Factor H de tipo salvaje en la inhibicion de la activacion de la via alternativa del complemento. Esto pone a las celulas del RPE y coroides en riesgo constante de ataque del complemento mediado por la via alternativa.

Se ha demostrado que la falta de Factor H en el plasma provoca una activacion incontrolada de la via alternativa con el consumo de C3 y, con frecuencia, otros componentes terminales del complemento tales como C5. En consonancia con este hallazgo, es conocido que los niveles plasmaticos de Factor H disminuyen el tabaquismo, un factor de riesgo conocido para AMD (Esparza-Gordillo J, et al. Inmunogenetics. 2004; 56: 77-82).

Actualmente, no existe una terapia medica probada para la AMD seca, y no hay tratamientos disponibles para la degeneracion macular seca avanzada. En casos seleccionados de la AMD humeda, una tecnica conocida como fotocoagulacion con laser puede ser eficaz para el sellado de los vasos sangumeos que gotean o sangran. Desafortunadamente, la fotocoagulacion con laser no suele restablecer la vision perdida, sino que simplemente se ralentiza y, en algunos casos, evita una perdida adicional. Recientemente, la terapia fotodinamica ha demostrado ser eficaz en detener el crecimiento anormal de vasos sangumeos en aproximadamente un tercio de los pacientes con AMD humeda cuando se trata a tiempo. En la terapia fotodinamica Visdyne (PDT), se inyecta un colorante en el ojo del paciente, se acumula en la zona de fuga de los vasos en la retina y, cuando se expone a un laser de baja potencia, reacciona sellando los vasos con fugas. Ademas de estas dos tecnicas de laser, se estan desarrollando varias terapias anti-angiogenesis dirigidas al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) para el tratamiento de la AMD humeda. Sin embargo, solo el 10% de los pacientes tratados muestran una mejora de la vision.

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A la vista de estos inadecuados tratamientos para la AMD humeda y la falta total de tratamientos disponibles para la degeneracion macular seca avanzada, existe una clara necesidad del desarrollo de nuevos tratamientos para esta enfermedad grave. La invencion de los autores de la misma proporciona un nuevo enfoque para el tratamiento de esta grave enfermedad.

Sumario de la invencion

La presente invencion se refiere a inhibidores del complemento para uso en un metodo para el tratamiento de afecciones o enfermedades relacionadas con los ojos, tales como la degeneracion macular asociada a la edad (AMD). El tratamiento de AMD incluye tanto las formas seca como humeda de AMD.

Los inhibidores del complemento de la presente invencion incluyen, pero no se limitan a los que inhiben la via alternativa del complemento tales como el Factor D, properdina, Factor B, Factor Ba y Factor Bb, y la via clasica del complemento tales como C3a, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9 y C5b-9. La presente invencion tambien incluye el uso de inhibidores del complemento en combinacion con otros agentes tales como agentes anti-angiogenicos y agentes anti-inflamatorios tales como esteroides.

Otra realizacion de la presente invencion se refiere al uso de inhibidores de C5aR y C3aR tales como anticuerpos y fragmentos derivados y construcciones de dominio unico, asf como compuestos de moleculas pequenas.

Otra realizacion de la presente invencion se refiere al uso de CR1 recombinante soluble (TP10) y sus protemas derivadas; al uso de la inhibicion de moleculas de C3 (tales como compstatina, un peptidomimetico que se une e inhibe la activacion de C3); ARNsis que bloquean la smtesis de C3, C5, FD, el factor P, factor B.

Estos inhibidores pueden ser, pero no se limitan a pequenos compuestos qmmicos de la molecula, nucleotidos, peptidos, protemas, peptidomimeticos y anticuerpos.

Otra realizacion de la presente invencion incluye el uso de Factor H humano purificado a partir de sangre humana o Factor H humano recombinante administrado a los pacientes por via intraocular o por cualquier otra via clmicamente eficaz.

Los anticuerpos de la presente invencion incluyen inmunoglobulinas enteras, scFv, Fab, Fab', Fv, F(ab')2, o dAb. Anticuerpos de dominio comprenden un dominio VH o un dominio VL.

Una realizacion de la presente invencion es el uso de un anticuerpo monoclonal que se une al factor D y bloquea su capacidad para activar la via alternativa del complemento. Tales anticuerpos se describen en los documentos WO 01/70818 y US 20020081293 tal como un anticuerpo monoclonal 166-32 producido a partir del hibridoma depositado en la ATCC y designado HB12476. La presente invencion tambien incluye anticuerpos que se unen espedficamente al mismo epftopo que el anticuerpo monoclonal 166-32. Los anticuerpos monoclonales de la presente invencion pueden incluir tambien los anticuerpos humanizados de solicitud en tramitacion.

Una realizacion de la presente invencion es el uso de un anticuerpo monoclonal que se une al componente C5a del complemento. Tales anticuerpos incluyen el anticuerpo 137-26 producido a partir del hibridoma depositado en la ATCC y designado PTA-3650, y cualquier anticuerpo que se une espedficamente al mismo epftopo que 137-26.

De acuerdo con la presente invencion, el inhibidor de la via del complemento se puede administrar por (a) administracion parenteral; (b) implante de liberacion sostenida biocompatible o biodegradable; (c) la implantacion de una bomba de infusion; o (d) la administracion local tal como la administracion subconjuntival o por administracion intravftrea. El inhibidor del complemento tambien se puede administrar por administracion parenteral seleccionada de administracion oral, administracion enteral y administracion topica. La administracion topica puede incluir una disolucion de lavado de ojos, una pomada para los ojos, un protector de ojos o un colirio en solucion.

Ademas, el inhibidor del complemento de la presente invencion se puede administrar en combinacion con un compuesto inmunomodulador o inmunosupresor.

Otra realizacion de la presente invencion se refiere a la administracion de construcciones de acido nucleico que son capaces de expresar los inhibidores de la via del complemento para la terapia genica.

Otra realizacion de la presente invencion incluye un metodo para la deteccion de inhibidores del complemento que son utiles en el tratamiento de AMD, que comprende el uso de un modelo de AMD en ratones deficientes en CCL-2 o CCR-2 senescentes. Estos ratones manifiestan cambios histopatologicos similares a los encontradas en AMDs seca y humeda humanas. Estos ratones pueden ser tratados con inhibidores del complemento o factor H por via intravftrea. El examen histologico se puede realizar para determinar la proteccion contra el desarrollo de AMD en los ratones tratados con los agentes a ensayar.

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Descripcion detallada de la invencion

Tal como se utiliza en esta memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singulares "un", "una", y "el", “la” incluyen una referencia al plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario, p. ej., la referencia a "una celula huesped" incluye una pluralidad de tales celulas huesped.

A menos que se defina lo contrario, todos los terminos y expresiones tecnicos y cientificos y cualesquiera acronimos utilizados en esta memoria tienen los mismos significados que se entiende comunmente por un experto ordinario en la tecnica en el campo de la invencion. Aunque cualesquiera metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento se pueden utilizar en la practica de la presente invencion, ejemplos de metodos, dispositivos y materiales se describen en esta memoria.

Sin embargo, nada en esta memoria debe ser interpretado como una admision de que la invencion no tiene derecho a preceder a dicha divulgacion en virtud de la invencion anterior.

Definiciones

La expresion “variante de secuencia de aminoacidos" se refiere a polipeptidos que tienen secuencias de aminoacidos que difieren hasta cierto punto de un polipeptido de secuencia nativa. Ordinariamente, las variantes de secuencia de aminoacidos poseeran al menos aproximadamente un 70% de homologfa, o al menos aproximadamente un 80%, o al menos aproximadamente un 90% de homologfa con el polipeptido nativo. Las variantes de secuencia de aminoacidos poseen sustituciones, deleciones y/o inserciones en determinadas posiciones dentro de la secuencia de aminoacidos de la secuencia de aminoacidos nativa.

El termino "identidad" u "homologfa" se define como el porcentaje de residuos aminoacidos en la secuencia candidata que son identicos a los residuos de una secuencia correspondiente con la que se compara, despues de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario para lograr el maximo porcentaje de identidad para la secuencia completa, y sin considerar ninguna sustitucion conservativa como parte de la identidad de secuencia. Ni extensiones ni inserciones N- o C-terminales se entenderan como la reduccion de identidad u homologfa. Metodos y programas de ordenador para el alineamiento son bien conocidos en la tecnica. La identidad de secuencia se puede calcular facilmente por metodos conocidos, incluyendo pero no limitados a los descritos en (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., comp., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Information and Genome Projects, Smith, D.W., comp., Academic Press, Nueva York, 1993;. Computer Analisis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A.M., y Griffin, H.G., comps., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis Primer in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., comps., M Stockton Press, Nueva York, 1991; y Carillo, 30 H., y Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Metodos para determinar la identidad estan disenados para dar la mayor coincidencia entre las secuencias sometidas a ensayo. Los metodos de programas informaticos para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete de programas GCG (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12 (1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul, S. F., et al., J Molec. Biol. 215: 403-410 (1990). El programa BLAST X esta disponible al publico de NCBI y otras fuentes (BLASTManual, Altschul, S., et al, nCbI NlM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). El algoritmo de Smith Waterman bien conocido tambien se puede usar para determinar la identidad.

El termino "anticuerpo" en esta memoria se utiliza en el sentido mas amplio y cubre espedficamente anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespedficos (por ejemplo, anticuerpos bi- espedficos) formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpos, siempre que presenten la actividad biologica deseada.

El termino "anticuerpo monoclonal", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un anticuerpo obtenido de una poblacion de anticuerpos sustancialmente homogeneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la poblacion son identicos, excepto por posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades menores. En contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales que incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epttopos), cada uno de los anticuerpos monoclonales se dirige contra un unico determinante en el antfgeno. El modificador "monoclonal" indica el caracter del anticuerpo como el obtenido de una poblacion sustancialmente homogenea de anticuerpos, y no debe interpretarse como que requiere la produccion del anticuerpo mediante cualquier procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a utilizar de acuerdo con la presente invencion pueden hacerse por el metodo del hibridoma descrito por vez primera por Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), o pueden prepararse por metodos de ADN recombinante (vease, por ejemplo, la patente de EE.UU. N° 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" tambien pueden aislarse a partir de bancos de anticuerpos en fagos utilizando las tecnicas descritas en Clackson et al, Nature, 352: 624-628 (1991) y Marks et al, J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), por ejemplo.

Los anticuerpos monoclonales de esta memoria incluyen espedficamente anticuerpos "quimericos" en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es identica u homologa a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase particular de anticuerpo correspondiente, mientras que el resto de la o las cadenas es identico u homologo a las secuencias

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correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, as^ como fragmented de dichos anticuerpos, siempre que presenten la actividad biologica deseada (Patente de EE.UU. N° 4.816.567; y Morrison et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)).

Los “fragmented de anticuerpos" comprenden una porcion de un anticuerpo intacto que comprende la region de union a antigeno o variable del mismo. Ejemplos de fragmented de anticuerpos incluyen fragmented Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moleculas de anticuerpo de cadena sencilla; y anticuerpos multiespedficos formados a partir de fragmento(s) de anticuerpo.

Un anticuerpo "intacto" es uno que comprende una region variable de union a antigeno asf como un dominio constante de la cadena ligera (Cl) y los dominios constantes de la cadena pesada, Ch1, Ch2 y Ch3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencias nativas (p. ej. dominios constantes de secuencias nativas humanas) o la secuencia de aminoacidos variante de las mismas. El anticuerpo intacto puede tener una o mas funciones efectoras.

"Funciones efectoras" de anticuerpo se refieren a aquellas actividades biologicas atribuibles a la region Fc (una region Fc de la secuencia nativa o region Fc variante de la secuencia de aminoacidos) de un anticuerpo. Ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen la union de C1q; citotoxicidad dependiente del complemento; union al receptor Fc; citotoxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; regulacion a la baja de los receptores de la superficie celular (p. ej., receptor de celulas B; BCR), etc.

Dependiendo de la secuencia de aminoacidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos intactos pueden asignarse a diferentes "clases". Existen cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de ellas pueden ser divididas en "subclases" (isotipos), p. ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de anticuerpos se denominan a, 8, £, y y M, respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas.

“Citotoxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpos" (ADCC) se refiere a una reaccion mediada por celulas en la que celulas citotoxicas no espedficas que expresan receptores Fc (FcR) (p. ej., celulas asesinas naturales (NK), neutrofilos y macrofagos) reconocen el anticuerpo unido en una celula diana y posteriormente provocan la lisis de la celula diana. Las celulas primarias para mediar en la ADCC, celulas NK, expresan FcyRIII solamente, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRII y FcyRIII. La expresion de FcR en las celulas hematopoyeticas. Para evaluar la actividad de la ADCC de una molecula de interes, se puede realizar un ensayo ADCC in vitro, tal como el descrito en la patente de EE.UU. N° 5.500.362 o 5.821.337. Celulas efectoras utiles para ensayos de este tipo incluyen celulas mononucleares de la sangre periferica (PBMC) y celulas asesinas naturales (NK). Alternativa, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molecula de interes puede evaluarse in vivo, p. ej., en un modelo animal. Varios de estos modelos estan disponibles.

El termino "variable" se refiere al hecho de que determinadas porciones de los dominios variables difieren ampliamente en la secuencia entre anticuerpos y se utilizan en la union y especificidad de cada uno de los anticuerpos particulares por su antfgeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente a traves de los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos denominados regiones hipervariables, en los dominios variables tanto de la cadena ligera como de la cadena pesada. Estas regiones hipervariables tambien se denominan regiones determinantes de la complementariedad o CDRs. Las porciones mas altamente conservadas de los dominios variables se denominan las regiones marco (FRs). Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras nativas comprenden cada uno cuatro FRs, adoptando en gran medida una configuracion de lamina p, conectados por tres regiones hipervariables, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de la lamina p. Las regiones hipervariables en cada una de las cadenas se mantienen juntas en estrecha proximidad por las FRs y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formacion del sitio de union a antfgeno de los anticuerpos (vease Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Servicio de Salud Publica, 5a Ed. Instituto Nacional de la Salud, Bethesda, Md. (1991)).

La expresion "region hipervariable", cuando se utiliza en esta memoria, se refiere a los residuos aminoacidos de un anticuerpo que son responsables de la union a antfgeno. La region hipervariable comprende generalmente residuos aminoacidos de una "region determinante de la complementariedad" o "CDR" (p. ej., residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Servicio de Salud Publica, 5a Ed. Instituto Nacional de la Salud, Bethesda, Md. (1991)) y/o los residuos de un "bucle hipervariable" (p. ej., residuos 2632 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). "Region de marco" o residuos "FR" son aquellos residuos del dominio variable diferentes de los residuos de la region hipervariable tal como se definen en esta memoria.

La digestion con papama de los anticuerpos produce dos fragmentos identicos de union a antfgeno, llamados fragmentos "Fab", cada uno con un unico sitio de union al antfgeno, y un fragmento residual "Fc", cuyo nombre

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refleja su capacidad para cristalizar facilmente. El tratamiento con pepsina proporciona un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de union a antfgeno y todavfa es capaz de reticular el antigeno.

El fragmento Fab tambien contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adicion de unos pocos residuos en el extremo carboxi del dominio CH1 de cadena pesada, incluyendo una o mas cistemas de la region bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designacion en esta memoria para Fab' en la que el o los residuos cistema de los dominios constantes portan al menos un grupo tiol libre. Fragmentos de anticuerpos F(ab')2 se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' que tienen cistemas bisagra entre ellos. Tambien se conocen otros acoplamientos qmmicos de fragmentos de anticuerpos.

Las "cadenas ligeras" de los anticuerpos de cualquier especie de vertebrado pueden asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, denominados kappa (k) y lambda (A), basado en las secuencias de aminoacidos de sus dominios constantes.

“Fv" es el fragmento de anticuerpo mmimo que contiene un antfgeno completo de reconocimiento y el sitio de union al antigeno. Esta region consiste en un dfmero de una cadena pesada y una cadena ligera de dominio variable en estrecha asociacion no covalente. Es en esta configuracion en la que las tres regiones hipervariables de cada uno de los dominios variables interaction para definir un sitio de union al antfgeno en la superficie del dfmero Vh-Vl. Colectivamente, las seis regiones hipervariables confieren especificidad de union a antfgeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un unico dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres regiones hipervariables espedficas para un antfgeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antfgeno, aunque a una afinidad menor que el sitio de union.

“Fv de cadena sencilla" o "fragmentos de anticuerpos scFv" comprenden los dominios Vh y Vl del anticuerpo, en donde estos dominios estan presentes en una unica cadena polipeptidica. Preferiblemente, el polipeptido Fv comprende, ademas, un enlazador polipeptido entre los dominios Vh y Vl que permite al scFv formar la estructura deseada para la union a antfgeno. Para una revision de scFv, vease Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore comps., Springer-Verlag, Nueva York, pags. 269-315 (1994). Fragmentos scFv de anticuerpo anti-ErbB2 se describen en el documento WO93/16185; la patente de EE.UU. N° 5.571.894; y la patente de EE.UU. N° 5.587.458.

El termino "diacuerpos" se refiere a pequenos fragmentos de anticuerpos con dos sitios de union al antfgeno, que comprenden un dominio pesado variable (Vh) conectado a un dominio ligero variable (Vl) en la misma cadena polipeptidica (Vh-Vl). Mediante el uso de un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios son forzados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de union a antfgeno. Los diacuerpos se describen mas completamente en, por ejemplo, los documentos EP 404.097; WO 93/11161; y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993).

Un "anticuerpo de dominio unico" es sinonimo de "dAb" y se refiere a un polipeptido de la region variable de inmunoglobulina en donde la union al antfgeno se efectua por un unico dominio de la region variable. Un "anticuerpo de dominio unico", tal como se utiliza en esta memoria, incluye i) un anticuerpo que comprende la cadena pesada del dominio variable (VH), o fragmento de union a antfgeno del mismo, que forma un sitio de union a antfgeno de forma independiente de cualquier otro dominio variable, ii) un anticuerpo que comprende una cadena ligera de dominio variable (VL), o fragmento de union a antfgeno del mismo, que forma un sitio de union a antfgeno de forma independiente de cualquier otro dominio variable, iii) un anticuerpo que comprende un polipeptido de dominio VH vinculado a otro VH o un polipeptido de dominio VL (p. ej., VH-VH o VHx-VL), en el que cada uno de los dominios V forma un sitio de union a antfgeno de forma independiente de cualquier otro dominio variable, y iv) un anticuerpo que comprende polipeptido de dominio VL enlazado a otro polipeptido de dominio VL (VL-VL), en donde cada uno de los dominios V forma una sitio de union al antfgeno de forma independiente de cualquier otro dominio variable. Tal como se utiliza en esta memoria, el dominio VL se refiere tanto a las formas kappa como lambda de las cadenas ligeras.

Las formas “humanizadas" de anticuerpos no humanos (p. ej., de roedores) son anticuerpos quimericos que contienen una secuencia minima derivada de inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas en las que las regiones hipervariables se reemplazan por residuos de una region hipervariable de una especie no humana tales como raton, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, la region marco (FR) de residuos de inmunoglobulina humana se reemplazan por los correspondientes residuos no humanos. Ademas, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo humano o en el anticuerpo no humano. Estas modificaciones se realizan para refinar aun mas el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprendera sustancialmente todos de al menos uno, y tfpicamente dos, dominios variables, en que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. Opcionalmente, el anticuerpo humanizado tambien comprendera al menos una porcion de una region constante de inmunoglobulina (Fc), tfpicamente la de una inmunoglobulina humana. Ejemplos de tecnologfa de

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humanizacion se pueden encontrar en, p. ej., Queen et al. patentes de EE.UU. N° 5.585.089, 5.693.761; 5.693.762; y 6.180.370, que se incorporan en esta memoria como referencia.

Generacion de anticuerpos

Los anticuerpos de la presente invencion pueden generarse por cualquier metodo adecuado conocido en la tecnica. Los anticuerpos de la presente invencion pueden comprender anticuerpos policlonales. Metodos de preparar anticuerpos policlonales son conocidos por el experto en la tecnica (Harlow, et al, Antibodies: a Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed (1988).

Por ejemplo, los anticuerpos pueden ser generados mediante la administracion de un inmunogeno que comprende el antigeno de interes a diversos animales huespedes, incluyendo, pero no limitados a, conejos, ratones, ratas, etc., para inducir la produccion de sueros que contienen anticuerpos policlonales espedficos para el antigeno. La administracion del inmunogeno puede implicar una o mas inyecciones de un agente inmunizante y, si se desea, un adyuvante. Se pueden utilizar diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunologica, dependiendo de la especie del huesped, e incluyen, pero no se limitan a, medio de Freund (completo e incompleto), geles minerales tales como hidroxido de aluminio, sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles pluronicos, polianiones, peptidos, emulsiones de aceite, hemocianinas de lapa bocallave, dinitrofenol y adyuvantes humanos potencialmente utiles tales como BCG (bacilo de Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Ejemplos adicionales de adyuvantes que pueden emplearse incluyen el adyuvante MPL-TDM (monofosforil-lfpido A, dicorinomicolato de trehalosa sintetico). Los protocolos de inmunizacion son bien conocidos en la tecnica y pueden realizarse por cualquier metodo que provoque una respuesta inmune en el huesped animal elegido. Los adyuvantes tambien son bien conocidos en la tecnica.

Tfpicamente, el inmunogeno (con o sin adyuvante) es inyectado en el mairnfero mediante multiples inyecciones subcutaneas o intraperitoneales, o por via intramuscular o a traves de IV. El inmunogeno puede incluir un polipeptido antigenico, una protema de fusion o variantes de los mismos. Dependiendo de la naturaleza de los polipeptidos (es decir, porcentaje de hidrofobicidad, porcentaje de hidrofilicidad, estabilidad, carga neta, punto isoelectrico, etc.), puede ser util conjugar el inmunogeno a una protema conocida por ser inmunogenica en el mamffero que se inmuniza. Una conjugacion de este tipo incluye la conjugacion qmmica derivatizando grupos funcionales qmmicos activos tanto para el inmunogeno como para la protema inmunogenica a ser conjugada de tal manera que se forma un enlace covalente, o a traves de la metodologfa basada en protemas de fusion, u otros metodos conocidos por el experto en la materia. Ejemplos de tales protemas inmunogenicas incluyen, pero no se limitan a, hemocianina de lapa bocallave, ovoalbumina, albumina de suero, tiroglobulina bovina, inhibidor de tripsina de soja y los peptidos T helper promiscuos. Pueden utilizarse diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunologica tal como se describe anteriormente.

Los anticuerpos utiles en la presente invencion comprenden anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar utilizando la tecnologfa de hibridoma tal como la descrita por Kohler y Milstein, Nature, 256: 495 (l975) y la patente de EE.UU. N° 4.376.110, por Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2.sup.nd ed. (1988), por Hammerling, et al, Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomes (Elsevier, N.Y., (1981)), u otros metodos conocidos por el experto. Otros ejemplos de metodos que se pueden emplear para producir anticuerpos monoclonales incluyen, pero no se limitan a, la tecnica del hibridoma de celulas B humanas (Kosbor et al, 1983, Immunology Today 4:72; Cole et al, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030), y la tecnica de hibridoma de HBV (Cole et al, 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pags. 77-96). Tales anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina, incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD y cualquier subclase de las mismas. El hibridoma que produce los anticuerpos de esta invencion puede cultivarse in vitro o in vivo.

Utilizando tecnicas tfpicas de hibridoma, un huesped tal como un raton, un raton humanizado, un raton con un sistema inmunitario humano, hamster, conejo, camello o cualquier otro animal huesped apropiado, es tfpicamente inmunizado con un inmunogeno para obtener linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se uniran espedficamente al antfgeno de interes. Alternativamente, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro con el antfgeno.

Generalmente, en la produccion de hibridomas productores de anticuerpos, se utilizan linfocitos de sangre periferica ("PBLs") si se desean celulas de origen humano, o se utilizan celulas de bazo o celulas de ganglios linfaticos si se desean fuentes de mamfferos no humanos. Los linfocitos se fusionan despues con una lmea celular inmortalizada utilizando un agente de fusion adecuado tal como polietilenglicol, para formar una celula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986), pags. 59-103). Lmeas celulares inmortalizadas son habitualmente celulas de mamffero transformadas, particularmente celulas de mieloma de origen de roedor, bovino o humano. Tfpicamente, se emplea una lmea celular de mieloma de rata o raton. Las celulas de hibridoma pueden cultivarse en un medio de cultivo adecuado que contiene preferiblemente una o mas sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las celulas inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las celulas parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluira tfpicamente hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"), sustancias que impiden el crecimiento de celulas deficientes en HGPRT.

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Lmeas celulares inmortalizadas preferidas son aquellas que se fusionan eficientemente, soportan la expresion estable de alto nivel de anticuerpo por las celulas productoras de anticuerpos seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Lmeas celulares inmortalizadas mas preferidas son lmeas de mieloma murino, que pueden obtenerse, por ejemplo, del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif., y la American Type Culture Collection, Manassas, Va. Lmeas de celulas de mieloma humano y de heteromieloma de raton tambien se pueden utilizar para la produccion de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol. 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, (1987) pags. 51-63).

El medio de cultivo en el que se cultivan las celulas de hibridoma puede entonces someterse a ensayo en cuanto a la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el inmunogeno. La especificidad de union de anticuerpos monoclonales producidos por las celulas de hibridoma se determina, p. ej., mediante inmunoprecipitacion o mediante ensayo de union in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoadsorbente ligado a enzimas (ELISA). Tales tecnicas se conocen en la tecnica y dentro de la habilidad del experto. La afinidad de union del anticuerpo monoclonal puede, por ejemplo, determinarse por analisis de Scatchard (Munson et al., Anal. Biochem., 107: 220 (1980)).

Despues de identificar las celulas de hibridoma deseadas, los clones pueden subclonarse mediante procesos de dilucion limitante y crecer mediante metodos estandares (Goding, supra). Medios de cultivo adecuados para este proposito incluyen, por ejemplo, medio de Dulbecco modificado por Eagle y RPMI-1640. Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones pueden aislarse o purificarse a partir del medio de cultivo mediante procedimientos de purificacion de inmunoglobulina convencionales tales como, p. ej., protema A-sefarosa, cromatograffa de hidroxiapatito, cromatograffa de exclusion en gel, electroforesis en gel, dialisis o cromatograffa de afinidad.

Existe una diversidad de metodos en la tecnica para la produccion de anticuerpos monoclonales y, por tanto, la invencion no se limita a su unica produccion en hibridomas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden hacerse por metodos de ADN recombinante tales como los descritos en la patente de EE.UU. N° 4.816.567. En este contexto, la expresion "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo derivado de un solo clon eucariotico, de fago o procariotico. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la invencion puede aislarse y secuenciarse facilmente utilizando procesos convencionales (p. ej., utilizando sondas de oligonucleotidos que son capaces de unirse espedficamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos murinos, o cadenas de seres humanos, humanizadas o de otras fuentes). Las celulas de hibridoma de la invencion sirven como una fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN podna colocarse en vectores de expresion, que luego se transforman en celulas huesped tales como celulas NS0, celulas COS de simio, celulas de ovario de hamster chino (CHO) o celulas de mieloma que de otro modo no producen protema inmunoglobulina, para obtener la smtesis de anticuerpos monoclonales en las celulas huesped recombinantes. El ADN tambien puede modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante de los dominios constantes de cadena pesada y ligera humanas en lugar de las secuencias murinas homologas (Patente de EE.UU. N°. 4.816.567; Morrison et al, supra) o mediante union covalente a la secuencia codificante de inmunoglobulina toda o parte de la secuencia codificante para un polipeptido no inmunoglobulina. Un polipeptido no inmunoglobulina de este tipo puede sustituirse con los dominios constantes de un anticuerpo de la invencion, o puede sustituirse con los dominios variables de un sitio de combinacion de antfgeno de un anticuerpo de la invencion para crear un anticuerpo bivalente quimerico.

Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monovalentes. Metodos para preparar anticuerpos monovalentes son bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, un metodo implica la expresion recombinante de la cadena ligera y la cadena pesada modificada de inmunoglobulina. La cadena pesada se trunca generalmente en cualquier punto en la region Fc para evitar que se reticule la cadena pesada. Alternativamente, los residuos cistema relevantes se sustituyen con otro residuo aminoacido o se suprimen para prevenir el entrecruzamiento.

Fragmentos de anticuerpos que reconocen epftopos espedficos pueden generarse por tecnicas conocidas. Por ejemplo, fragmentos Fab y F(ab')2 de la invencion pueden ser producidos por escision proteolftica de moleculas de inmunoglobulina, utilizando enzimas tales como papama (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab')2). Los fragmentos F(ab')2 contienen la region variable, la region constante de la cadena ligera y el dominio CH1 de la cadena pesada.

Para algunos usos, incluyendo el uso in vivo de anticuerpos en seres humanos y en ensayos de deteccion in vitro, puede ser preferible utilizar anticuerpos quimericos, humanizados o humanos. Un anticuerpo quimerico es una molecula en la que diferentes porciones del anticuerpo se derivan de diferentes especies animales tales como anticuerpos que tienen una region variable derivada de un anticuerpo monoclonal murino y una region constante de inmunoglobulina humana. Metodos para producir anticuerpos quimericos son conocidos en la tecnica. Vease, p. ej., Morrison, Science 229: 1202 (1985); Oi et al, BioTechniques 4: 214 (1986); Gillies et al., (1989) J. Immunol. Methods 125: 191-202; patentes de EE.UU. N°s. 5.807.715; 4.816.567; y 4.816.397.

Los anticuerpos humanizados son moleculas de anticuerpos generados en una especie no humana que se unen al antfgeno deseado que tiene una o mas regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) de las especies no humanas y regiones marco (FR) de una molecula de inmunoglobulina humana. A menudo, los residuos estructurales

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en las regiones marco humanas se sustituiran con el residuo correspondiente del anticuerpo donante de CDR para alterar, preferiblemente mejorar, la union a antigeno. Estas sustituciones estructurales se identifican mediante metodos bien conocidos en la tecnica, p. ej., mediante modelado de las interacciones de la CDR y los residuos estructurales para identificar residuos marco importantes para la union a antigeno y comparacion de secuencias para identificar residuos estructurales inusuales en posiciones particulares. (Vease, p. ej., Queen et al, patente de EE.UU. N° 5.585.089; Riechmann et al, Nature 332: 323 (1988). Los anticuerpos pueden humanizarse usando una diversidad de tecnicas conocidas en la tecnica, incluyendo, por ejemplo, injerto de CDR (documento EP 239.400; publicacion PCT WO 91/09967; Patentes de EE.UU. N°s. 5.225.539; 5.530.101; y 5.585.089), recubrimiento o revestimiento (documentos EP 592.106; EP 519.596; Padlan, Molecular Immunology 28 (4/5): 489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6): 805-814 (1994); Roguska et al, PNAS 91: 969-973 (1994)) y mezcla aleatoria de cadenas (patente de EE.UU. N°. 5.565.332).

Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o mas residuos aminoacidos introducidos en el de una fuente que no es humana. Estos residuos aminoacidos no humanos se denominan frecuentemente residuos "importados" que, por lo general, se toman de un dominio variable de "importacion". La humanizacion puede realizarse esencialmente siguiendo los metodos de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988), mediante la sustitucion de CDRs o secuencias de CDR de roedores por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quimericos (Patente de EE.UU. N° 4.816.567), en donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la practica, los anticuerpos humanizados son tfpicamente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de CDR y posibles algunos residuos de FR se sustituyen de sitios analogos en anticuerpos de roedores.

Los anticuerpos completamente humanos son particularmente deseables para el tratamiento terapeutico de pacientes humanos. Los anticuerpos humanos se pueden hacer por una diversidad de metodos conocidos en la tecnica, incluyendo metodos de presentacion en fagos descritos anteriormente usando bancos de anticuerpos derivados de secuencias de inmunoglobulina humana. Veanse tambien las patentes de EE.UU. N°s. 4.444.887 y 4.716.111; y las publicaciones PCT WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 y WO 91/10741. Las tecnicas de Cole et al., y Boerder et al., tambien estan disponibles para la preparacion de anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Riss, (1985); y Boerner et al., J. Immunol, 147 (1): 86-95, (1991)).

Los anticuerpos humanos tambien pueden ser anticuerpos de un solo dominio que tienen un dominio VH o VL que funciona de forma independiente de cualquier otro dominio variable. Estos anticuerpos se seleccionan tfpicamente a partir de bancos de anticuerpos expresados en fagos. Estos anticuerpos y metodos para aislar tales anticuerpos se describen en las patentes de EE.UU. N° 6.595.142; 6.248.516; y solicitudes US20040110941 y US20030130496.

Los anticuerpos humanos tambien pueden producirse utilizando ratones transgenicos que son incapaces de expresar inmunoglobulinas endogenas funcionales, pero que pueden expresar genes de inmunoglobulina humana. Por ejemplo, los complejos de genes de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera humana pueden introducirse al azar o mediante recombinacion homologa en celulas madre embrionarias de raton. Alternativamente, la region variable humana, la region constante y la region diversidad se pueden introducir en celulas madre embrionarias de raton ademas de los genes de cadena pesada y ligera humanos. Los genes de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina de raton pueden hacerse no funcionales por separado o simultaneamente con la introduccion de loci de inmunoglobulina humana mediante recombinacion homologa. En particular, la delecion homocigota de la region JH impide la produccion de anticuerpos endogenos. Las celulas madre embrionarias modificadas se expanden y micro-inyectan en blastocistos para producir ratones quimericos. Los ratones quimericos son luego criados para producir descendencia homocigota que expresa anticuerpos humanos. Los ratones transgenicos se inmunizan de la manera normal con un antfgeno seleccionado, p. ej., todo o una porcion de un polipeptido de la invencion. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antfgeno se pueden obtener de los ratones transgenicos inmunizados utilizando tecnologfa de hibridoma convencional. Los transgenes de inmunoglobulina humana albergados por los ratones transgenicos se reordenan durante la diferenciacion de celulas B, y posteriormente se someten a cambio de clase y mutacion somatica. Por lo tanto, utilizando una tecnica de este tipo, es posible producir anticuerpos IgG, IgA, IgM e IgE terapeuticamente utiles. Para una vision general de esta tecnologfa para la produccion de anticuerpos humanos, vease Lonberg y Huszar, Int. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995). Para una discusion detallada de esta tecnologfa para producir anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos y protocolos para producir tales anticuerpos, veanse, p. ej., las publicaciones PCT WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; patente europea N° 0 598 877; patentes de EE.UU. N°s. 5.413.923; 5.625.126; 5.633.425; 5.569.825; 5.661.016; 5.545.806; 5.814.318; 5.885.793; 5.916.771; y 5.939.598. Ademas, comparuas tales como Abgenix, Inc. (Freemont, Calif.), Genpharm (San Jose, California) y Medarex, Inc. (Princeton, N.J.) se pueden encargar de proporcionar anticuerpos humanos dirigidos contra un antigeno seleccionado usando tecnologfa similar a la descrita anteriormente.

Tambien MAbs humanos podnan hacerse mediante la inmunizacion de ratones a los que se han trasplantado leucocitos humanos de sangre periferica, esplenocitos o medulas oseas (p. ej., las tecnicas de trioma de XTL). Anticuerpos completamente humanos que reconocen un epftopo seleccionado pueden generarse utilizando una

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tecnica denominada "seleccion guiada”. En este enfoque un anticuerpo monoclonal no humano seleccionado, p. ej., un anticuerpo de raton, se utiliza para guiar la seleccion de un anticuerpo completamente humano que reconoce el mismo epftopo. (Jespers et al., Bio/technology 12: 899-903 (1988)).

Ademas, anticuerpos para los polipeptidos de la invencion pueden, a su vez, utilizarse para generar anticuerpos anti- idiotipo que "imitan" a polipeptidos de la invencion utilizando tecnicas bien conocidas para los expertos en la tecnica. (Vease, p. ej., Greenspan y Bona, FASEB J. 7 (5): 437-444; (1989) y Nissinoff, J. Immunol. 147 (8): 2429-2438 (1991)). Por ejemplo, los anticuerpos que se unen a e inhiben competitivamente la multimerizacion del polipeptido y/o la union de un polipeptido de la invencion a un ligando se pueden utilizar para generar anti-idiotipos que "imitan" la multimerizacion del polipeptido y/o dominio de union y, como consecuencia , se unen y neutralizan polipeptido y/o su ligando. Tales neutralizantes anti-idiotipos o fragmentos Fab de tales anti-idiotipos pueden utilizarse en regfmenes terapeuticos para neutralizar el ligando del polipeptido. Por ejemplo, tales anticuerpos anti-idiotipicos pueden utilizarse para unir un polipeptido de la invencion y/o para unir sus ligandos/receptores, y de ese modo bloquear su actividad biologica.

Los anticuerpos de la presente invencion pueden ser anticuerpos biespedficos. Los anticuerpos biespedficos son anticuerpos monoclonales, preferiblemente humanos o humanizados, que tienen especificidades de union para al menos dos antfgenos diferentes. En la presente invencion, una de las especificidades de union puede ser dirigida hacia Factor D, la otra puede ser para cualquier otro antfgeno, y preferentemente para una protema de la superficie celular, receptor, subunidad de receptor, antfgeno espedfico de tejido, protema derivada de forma viral, protema de la envuelta codificada de forma viral, protema derivada de bacterias o protema de la superficie bacteriana, etc. Los anticuerpos biespedficos tambien pueden comprender dos o mas anticuerpos de un solo dominio.

Los metodos para producir anticuerpos biespedficos son bien conocidos. Tradicionalmente, la produccion recombinante de anticuerpos biespedficos se basa en la co-expresion de dos pares de inmunoglobulina de cadena pesada/cadena ligera, en donde las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades (Milstein y Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983) . Debido a la variedad aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de diez moleculas de anticuerpo diferentes, de las cuales solo una tiene la estructura biespedfica correcta. La purificacion de la molecula correcta se logra generalmente mediante etapas de cromatograffa de afinidad. Procesos similares se describen en el documento WO 93/08829, publicado el 13 de mayo de 1993, y en Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991).

Dominios variables de anticuerpos con las especificidades de union deseadas (sitios de combinacion anticuerpo- antfgeno) pueden fusionarse a secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusion preferiblemente es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. Puede tener la primera region constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la union de cadena ligera presente en al menos una de las fusiones. Los ADNs que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresion separados y son co-transformados en un organismo huesped adecuado. Para detalles adicionales de generacion de anticuerpos biespedficos vease, por ejemplo, Suresh et al., Meth. En Enzym, 121: 210 (1986).

Los anticuerpos heteroconjugados tambien se contemplan por la presente invencion. Los anticuerpos heteroconjugados estan compuestos de dos anticuerpos unidos covalentemente. Tales anticuerpos han sido propuestos, por ejemplo, para fijar como objetivo celulas del sistema inmune a celulas no deseadas (Patente de EE.UU. N° 4.676.980). Se contempla que los anticuerpos pueden prepararse in vitro utilizando metodos conocidos en la qrnmica de protemas sinteticas, incluyendo aquellos que implican agentes de reticulacion. Por ejemplo, se pueden construir inmunotoxinas utilizando una reaccion de intercambio de disulfuro o formando un enlace tioester. Ejemplos de reactivos adecuados para este proposito incluyen iminotiolato y 4-mercaptobutirimidato de metilo y los descritos, por ejemplo, en la patente de EE.UU. N°. 4.676.980. Ademas, se pueden generar anticuerpos de un solo dominio a IL-13. Ejemplos de esta tecnologfa se han descrito en el documento WO9425591 para los anticuerpos derivados de cadena pesada de Camelidae Ig, asf como en el documento US20030130496 que describen el aislamiento de anticuerpos de dominio unico totalmente humanos a partir de bancos de fagos.

Generacion de anticuerpos monoclonales (mabs)

En una realizacion de la invencion, los anticuerpos monoclonales tales como anti-Factor D, pueden ser creados por inmunizacion de roedores (p. ej., ratones, ratas, hamsters y cobayas), ya sea con Factor D nativo purificado a partir de plasma humano u orina, o Factor D recombinante o sus fragmentos expresados por cualquiera de los sistemas eucariotas o procariotas. Para la inmunizacion se pueden utilizar otros animales, por ejemplo, primates no humanos, ratones transgenicos que expresan inmunoglobulinas humanas y ratones inmunodeficientes combinados severos (SCID) trasplantados con linfocitos B humanos. Los hibridomas pueden ser generados por procesos convencionales fusionando linfocitos B de los animales inmunizados con celulas de mieloma (p. ej., Sp2/0 y NS0), tal como se describe por G. Kohler y C. Milstein (Nature, 1975: 256: 495-497).

Ademas, los anticuerpos monoclonales pueden ser generados mediante rastreo de bancos de Fv o Fab de cadena sencilla recombinantes de linfocitos B humanos en sistemas de expresion de fagos. La especificidad de los MAbs

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para un antigeno dado puede ser testada mediante el ensayo inmunoadsorbente ligado a enzimas (ELISA), inmunotransferencia Western u otras tecnicas inmunoqmmicas. La actividad inhibidora de los anticuerpos sobre la activacion del complemento puede ser evaluada por ensayos hemolfticos utilizando globulos rojos (RBCs) de conejo no sensibilizado o cobaya para la via alternativa, y utilizando RBCs de pollo u oveja sensibilizados para la via clasica. Los hibridomas en los pocillos positivos se clonan por dilucion limitante. Los anticuerpos se purifican para la caracterizacion de la especificidad para el antigeno, tales como el factor D, mediante ensayos bien conocidos en la tecnica.

Tambien se pueden crear moleculas de union de una sola cadena peptfdica, en las que se conectan las regiones Fv de cadena pesada y ligera. Anticuerpos de cadena sencilla ("scFv") y el metodo de su construccion se describen en la Patente de EE.UU. N°. 4.946.778. Alternativamente, el Fab puede construirse y expresarse por medios similares (M.J Evans et al., J. Immunol. Meth., 1995; 184: 123-138). Todos los anticuerpos total y parcialmente humanos son menos inmunogenicos que los MAbs totalmente murinos, y los fragmentos y anticuerpos de cadena sencilla son tambien menos inmunogenicos. Es menos probable que todos estos tipos de anticuerpos, por lo tanto, evoquen una respuesta inmune o alergica. Por consiguiente, son mas adecuados para la administracion in vivo en seres humanos que los anticuerpos totalmente animales, especialmente cuando es necesaria una administracion repetida o a largo plazo. Ademas, el tamano mas pequeno del fragmento de anticuerpo puede ayudar a mejorar la biodisponibilidad de tejido, lo que puede ser critico para una mejor acumulacion de dosis en indicaciones de enfermedades agudas.

En una realizacion preferida de la invencion, se utiliza terapeuticamente un Fab quimerico, que tiene regiones variables de animales (raton) y regiones constantes humanas. El Fab se prefiere, porque es mas pequeno que una inmunoglobulina completa y puede proporcionar una mejor permeacion de tejido; como molecula monovalente, hay menos posibilidades de una formacion de inmunocomplejos y agregados; y se puede producir en un sistema microbiano, que puede ser mas facilmente aumentado que un sistema de mairnfero.

Aplicaciones de los inhibidores de la via del complemento

Los inhibidores del complemento, tales como anticuerpos y sus fragmentos de union, pueden ser administrados a los sujetos en una formulacion farmaceutica apropiada por una diversidad de vfas, incluyendo, pero no limitadas a, infusion intravenosa, inyeccion intravenosa en bolo y las vfas intraperitoneal, intradermica, intramuscular, subcutanea, intranasal, intratraqueal, intraespinal, intracraneal y oral. Tal administracion les permite unirse al antfgeno endogeno, tal como el factor D y, por lo tanto, inhibir la generacion de anafilotoxinas C3b, C3a y C5a, y C5b-9.

La dosis preferida estimada de este tipo de anticuerpos y moleculas esta entre 10 y 500 |jg/ml de suero. La dosificacion real se puede determinar en ensayos clrnicos siguiendo la metodologfa convencional para determinar dosificaciones optimas, es decir, administrando diversas dosis y determinando cual es la mas eficaz.

Los inhibidores de la via del complemento pueden funcionar para inhibir la activacion del complemento in vivo y/o la via alternativa del complemento y las manifestaciones inflamatorias que la acompanan tales como el reclutamiento y la activacion de macrofagos, neutrofilos, plaquetas y mastocitos, edema y dano tisular. Estos inhibidores pueden utilizarse para el tratamiento de enfermedades o afecciones que estan mediadas por la activacion excesiva o incontrolada del sistema del complemento.

Los anticuerpos de la presente invencion pueden ser mono-espedficos, bi-espedficos, tri-espedficos o de mayor multiespecificidad. Los anticuerpos multi-espedficos pueden ser espedficos para diferentes epftopos de un antfgeno seleccionado o pueden ser espedficos tanto para el antfgeno, asf como para un epftopo heterologo, tal como un polipeptido heterologo o material de soporte solido. Vease, p. ej., las publicaciones PCT WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt, et al., J. Immunol. 147: 60-69 (1991); patentes de EE.UU.. N°s 4.474.893; 4.714.681; 4.925.648; 5.573.920; 5.601.819; Kostelny et al., J. Immunol. 148: 1547-1553 (1992).

Anticuerpos utiles en la presente invencion pueden describirse o especificarse en terminos del o de los epftopos o parte o partes de un componente de la via del complemento, tales como el factor D, que reconocen o se unen espedficamente. El o los epftopos o parte o partes de polipeptido pueden especificarse tal como se describe en esta memoria, p. ej., mediante las posiciones N-terminales y C-terminales, por el tamano en residuos aminoacidos contiguos.

Anticuerpos utiles en la presente invencion tambien pueden describirse o especificarse en terminos de su reactividad cruzada. Los anticuerpos que se unen a polipeptidos componente de la via del complemento, que tienen al menos 95%, al menos 90%, al menos 85%, al menos 80%, al menos 75%, al menos 70%, al menos 65%, al menos 60%, al menos 55% y al menos 50% de identidad (segun se calcula utilizando metodos conocidos en la tecnica y descritos en esta memoria) para IL-13 tambien se incluyen en la presente invencion. Los anticuerpos anti-Factor D tambien se pueden unir con una KD de menos de aproximadamente 10-7 M, menos de aproximadamente 10-6 Mo menos de aproximadamente 10-5 M a otras protemas tales como anticuerpos Factor D de especies distintas de aquellas contra las que el anticuerpo anti-Factor D esta dirigido.

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Vectores y celulas huesped

En otro aspecto, la presente invencion proporciona construcciones de vectores que comprenden una secuencia de nucleotidos que codifica los anticuerpos de la presente invencion y una celula huesped que comprende un vector de este tipo. Tecnicas estandares para la clonacion y la transformacion se pueden utilizar en la preparacion de lmeas celulares que expresan los anticuerpos de la presente invencion.

Vectores de expresion recombinantes que contienen una secuencia de nucleotidos que codifica los anticuerpos de la presente invencion se pueden preparar utilizando tecnicas bien conocidas. Los vectores de expresion incluyen una secuencia de nucleotidos operativamente enlazada a las secuencias de nucleotidos reguladoras de la transcripcion o traduccion adecuadas tales como las derivadas de genes de mairnferos, microbianos, virales o de insectos. Ejemplos de secuencias reguladoras incluyen promotores transcripcionales, operadores, potenciadores, sitios de union ribosomal de ARNm y/u otras secuencias apropiadas que controlan el inicio y la terminacion de la transcripcion y traduccion. Secuencias de nucleotidos estan "operativamente enlazadas" cuando la secuencia reguladora se relaciona funcionalmente con la secuencia de nucleotidos para el polipeptido apropiado. Por lo tanto, una secuencia de nucleotidos promotora esta enlazada operativamente a, p. ej., la secuencia de la cadena pesada del anticuerpo si la secuencia de nucleotidos promotora controla la transcripcion de la secuencia de nucleotidos apropiada.

Ademas, las secuencias que codifican peptidos senal apropiados que no estan asociadas de forma natural con las secuencias de anticuerpo de cadena pesada y/o ligera se pueden incorporar en vectores de expresion. Por ejemplo, una secuencia de nucleotidos para un peptido senal (lider secretor) puede fusionarse en marco a la secuencia del polipeptido, de modo que el anticuerpo se secreta al espacio periplasmico o en el medio. Un peptido senal que es funcional en las celulas huesped pretendidas potencia la secrecion extracelular del anticuerpo apropiado. El peptido senal se puede escindir del polipeptido despues de la secrecion de anticuerpo de la celula. Ejemplos de este tipo de senales secretoras son bien conocidos e incluyen, p. ej., los descritos en los documentos US5698435; US5698417 y US6204023.

Celulas huesped utiles en la presente invencion incluyen, pero no se limitan a microorganismos tales como bacterias (p. ej., E. coli, B. subtilis) transformadas con ADN de bacteriofago recombinante, ADN de plasmido o vectores de expresion de ADN de cosmido que contienen secuencias codificadoras de anticuerpos; levadura (p. ej., Saccharomyces, Pichia) transformada con vectores de expresion de levadura recombinantes que contienen secuencias codificadoras de anticuerpos; sistemas de celulas de insecto infectadas con vectores de expresion de virus recombinantes (p. ej., baculovirus) que contienen secuencias codificadoras de anticuerpos; sistemas de celulas vegetales infectadas con vectores de expresion de virus recombinantes (p. ej., virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformadas con vectores de expresion de plasmidos recombinantes (p. ej., plasmido Ti) que contienen secuencias codificadoras de anticuerpos; o sistemas de celulas de marnfferos (p. ej., celulas COS, CHO, BHK, 293, 3T3) que albergan construcciones de expresion recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de celulas de mamffero (p. ej., promotor de metalotionema) o de virus de mamfferos (p. ej., el promotor tardfo de adenovirus; el promotor del virus vacuna 7.5K).

El vector puede ser un vector de plasmido, un vector de fago de cadena sencilla o doble o un vector viral de ARN o ADN de cadena sencilla o doble. Vectores de este tipo pueden introducirse en celulas como polinucleotidos mediante tecnicas bien conocidas para introducir ADN y ARN en las celulas. Los vectores, en el caso de vectores de fagos y virales tambien pueden introducirse en celulas tales como virus empaquetados o encapsulados mediante tecnicas bien conocidas para infeccion y transduccion. Los vectores virales pueden ser competentes en la replicacion o defectuosos en la replicacion. En este ultimo caso, la propagacion viral generalmente se producira solo en celulas huesped de complementacion. Sistemas de traduccion libres de celulas tambien pueden emplearse para producir la protema utilizando ARNs derivados de las presentes construcciones de ADN. Vectores de este tipo pueden incluir la secuencia de nucleotidos que codifica la region constante de la molecula de anticuerpo (vease, p. ej., la publicacion PCT WO 86/05807; la publicacion PCT WO 89/01036; y la Patente de EE.UU. N° 5.122.464) y el dominio variable del anticuerpo puede clonarse en dicho vector de expresion de toda la cadena pesada o ligera.

Procariotas utiles como celulas huesped en la presente invencion incluyen organismos gram-negativos o gran- positivos tales como E. coli y B. subtilis. Vectores de expresion para uso en celulas huesped procariotas generalmente comprenden uno o mas genes marcadores seleccionables fenotfpicos. Un gen marcador seleccionable fenotfpico es, por ejemplo, un gen que codifica una protema que confiere resistencia a antibioticos o que suministra un requerimiento autotrofico. Ejemplos de vectores de expresion utiles para celulas huesped procariotas incluyen los derivados de plasmidos disponibles comercialmente tales como la serie de vectores pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia), pGEMI (Promega Biotec, Madison, Wisconsin, EE.UU.) y pET (Novagen , Madison, Wisconsin, EE.UU.) y pRSET (Invitrogen Corporation, Carlsbad, California, EE.UU.) (Studier, F.W., J. Mol. Biol. 219: 37 (1991); Schoepfer, R. Gene 124: 83 (1993)). Secuencias de promotores comunmente utilizadas para los vectores de expresion de celulas huesped recombinantes procariotas incluyen T7 (Rosenberg, et al. Gene 56,125-135 (1987)), p-lactamasa (penicilinasa), sistema promotor de lactosa (Chang et al., Nature 275: 615, (1978); y Goeddel et al., Nature 281: 544, (1979)), sistema promotor de triptofano (trp) (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8: 4057, (1980)), y el promotor tac (Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a Ed, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.).

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Levaduras utiles en la presente invencion incluyen las del genera Saccharomyces, Pichia, Actinomycetes y Kluyveromyces. Los vectores de levadura contendran, a menudo, un origen de secuencia de replicacion de un plasmido de levadura 2|j, una secuencia de replicacion autonoma (ARS), una region del promotor, secuencias para poliadenilacion, secuencias para la terminacion de la transcripcion y un gen marcador seleccionable. Secuencias de promotor adecuadas para vectores de levadura incluyen, entre otros, promotores para metalotionema, 3- fosfoglicerato quinasa (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255: 2073, (1980)) u otras enzimas glucoltticas (Holland et al., Biochem 17: 4900, (1978)) tales como enolasa, gliceraldehndo-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6- fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa. Otros vectores y promotores adecuados para su uso en la expresion de levaduras se describen adicionalmente en Fleer et al., Gene, 107: 285-195 (1991). Otros promotores y vectores adecuados para los protocolos de levadura y transformacion de levadura son bien conocidos en la tecnica. Protocolos de transformacion de levaduras son bien conocidos. Uno de tales protocolos se describe por Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 75: 1929 (1978). el protocolo de Hinnen selecciona transformantes Trp+ en un medio selectivo.

Sistemas de cultivo de celulas huesped de marnfferos o insectos tambien se pueden emplear para expresar anticuerpos recombinantes, p. ej., sistemas de baculovirus para la produccion de proternas heterologas. En un sistema de insectos, el virus de la poliedrosis nuclear Autographa californica (AcNPV) se puede utilizar como un vector para expresar genes extranos. El virus crece en celulas de Spodoptera frugiperda. La secuencia codificadora de anticuerpos puede clonarse individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo, el gen de poliedrina) del virus y se coloca bajo el control de un promotor AcNPV (por ejemplo, el promotor de poliedrina).

Se pueden usar celulas NS0 o de ovario de hamster chino (CHO) para la expresion en marnfferos de los anticuerpos de la presente invencion. Las secuencias de control de la transcripcion y la traduccion para los vectores de expresion de celulas huesped de mairnferos se pueden extraer de genomas virales. Secuencias de promotor y secuencias de potenciador comunmente utilizadas se derivan de virus del polioma, Adenovirus 2, Virus de Simio 40 (SV40) y citomegalovirus humano (CMV). Secuencias de ADN derivadas del genoma viral SV40 se pueden utilizar para proporcionar otros elementos geneticos para la expresion de una secuencia genica estructural en una celula de mamffero huesped, p. ej., origen SV40, promotor temprano y tardra, potenciador, corte y empalme, y sitios de poliadenilacion. Los promotores virales tempranos y tardfos son particularmente utiles, ya que ambos se obtienen facilmente de un genoma viral tal como un fragmento que tambien puede contener un origen de replicacion viral. Ejemplos de vectores de expresion para uso en celulas huesped de mam^era estan disponibles comercialmente.

Polinucleotidos que codifican anticuerpos

La invencion proporciona, ademas, polinucleotidos o acidos nucleicos, p. ej., ADN, que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un anticuerpo de la invencion y fragmentos del mismo. Polinucleotidos a modo de ejemplo incluyen los que codifican cadenas de anticuerpo que comprenden una o mas de las secuencias de aminoacidos descritas en esta memoria. La invencion tambien abarca polinucleotidos que se hibridan en condiciones de hibridacion rigurosas o de baja rigurosidad a polinucleotidos que codifican un anticuerpo de la presente invencion.

Los polinucleotidos pueden obtenerse, y la secuencia de nucleotidos de los polinucleotidos puede determinarse, por cualquier metodo conocido en la tecnica. Por ejemplo, si se conoce la secuencia de nucleotidos del anticuerpo, un polinucleotido que codifica el anticuerpo puede ensamblarse a partir de oligonucleotidos sintetizados qmmicamente (p. ej., tal como se describe en Kutmeier et al, BioTechniques 17: 242 (1994)) que, en srntesis, implica la smtesis de oligonucleotidos solapantes que contienen porciones de la secuencia que codifica el anticuerpo, reasociacion y ligamiento de esos oligonucleotidos, y despues amplificacion de los oligonucleotidos ligados por PCR.

Alternativamente, un polinucleotido que codifica un anticuerpo puede generarse a partir de acido nucleico a partir de una fuente adecuada. Si no esta disponible un clon que contiene un acido nucleico que codifica un anticuerpo particular, pero la secuencia de la molecula de anticuerpo es conocida, un acido nucleico que codifica la inmunoglobulina puede sintetizarse qmmicamente u obtenerse de una fuente adecuada (p. ej., un banco de ADNc de anticuerpo, o un banco de ADNc generado a partir de, o acido nucleico, preferiblemente aRn poli A+, aislado de cualquier tejido o celulas que expresan el anticuerpo tales como celulas de hibridoma seleccionadas para expresar un anticuerpo de la invencion) mediante amplificacion por PCR utilizando cebadores sinteticos hibridables a los extremos 3' y 5' de la secuencia o mediante clonacion utilizando una sonda de oligonucleotido espedfica para la secuencia genica particular para identificar, p. ej., un clon de ADNc de un banco de ADNc que codifica el anticuerpo. Acidos nucleicos amplificados generados mediante PCR pueden entonces ser clonados en vectores de clonacion replicables utilizando cualquier metodo bien conocido en la tecnica.

Una vez que se determina la secuencia de nucleotidos y la correspondiente secuencia de aminoacidos del anticuerpo, la secuencia de nucleotidos del anticuerpo puede manipularse utilizando metodos bien conocidos en la tecnica para la manipulacion de secuencias de nucleotidos, p. ej., tecnicas de ADN recombinantes, mutagenesis dirigida al sitio, PCR, etc. (veanse, por ejemplo, las tecnicas descritas en Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., y Ausubel et al., comps., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y, para generar anticuerpos que tengan una

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secuencia de aminoacidos diferente, por ejemplo para crear sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoacidos.

En una realizacion espedfica, la secuencia de aminoacidos de los dominios variables de cadena pesada y/o cadena ligera puede ser inspeccionada para identificar las secuencias de las CDRs por metodos bien conocidos, p. ej., mediante comparacion con secuencias de aminoacidos conocidas de otras regiones variables de cadena pesada y ligera para determinar las regiones de hipervariabilidad de la secuencia. Utilizando tecnicas rutinarias de ADN recombinante, una o mas de las CDRs pueden insertarse dentro de las regiones marco, p. ej., en regiones marco humanas para humanizar un anticuerpo no humano tal como se describe supra. Las regiones marco pueden ser regiones de origen natural o marco de consenso y regiones marco preferiblemente humanas (vease, p. ej., Chothia et al., J. Mol. Biol. 278: 457-479 (1998) para obtener una lista de las regiones marco humanas). Preferiblemente, el polinucleotido generado por la combinacion de las regiones marco y CDRs codifica un anticuerpo que se une espedficamente a un polipeptido de la invencion. Preferiblemente, como se discutio supra, una o mas sustituciones de aminoacidos pueden hacerse dentro de las regiones marco y, preferiblemente, las sustituciones de aminoacidos mejoran la union del anticuerpo a su antfgeno. Adicionalmente, metodos de este tipo pueden ser utilizarse para hacer sustituciones de aminoacidos o deleciones de uno o mas residuos cistema de la region variable que participan en un enlace disulfuro intracatenario para generar moleculas de anticuerpo que carecen de uno o mas enlaces disulfuro intracatenarios. Otras alteraciones en el polinucleotido son abarcadas por la presente invencion y dentro de la experiencia de la tecnica.

Ademas, pueden utilizarse tecnicas desarrolladas para la produccion de "anticuerpos quimericos" (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 851-855 (1984); Neuberger et al., Nature 312: 604-608 (1984); Takeda et al, Nature 314: 452-454 (1985)) mediante genes de corte y empalme de genes de una molecula de anticuerpo de raton de especificidad de antfgeno apropiada junto con genes de una molecula de anticuerpo humano de actividad biologica apropiada. Tal como se ha descrito anteriormente, un anticuerpo quimerico es una molecula en la que diferentes porciones se derivan de diferentes especies animales tales como los que tienen una region variable derivada de un MAb murino y una region constante de inmunoglobulina humana, p. ej., anticuerpos humanizados.

Alternativamente, las tecnicas descritas para la produccion de anticuerpos de cadena sencilla (Patente de EE.UU. N° 4.946.778; Bird, Science 242: 423-42. (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 (1988); y Ward et al, Nature 334: 544-54 (1989)) se pueden adaptar para producir anticuerpos de cadena sencilla. Anticuerpos de cadena sencilla se forman uniendo los fragmentos de cadena pesada y ligera de la region Fv a traves de un puente aminoacido, resultando un polipeptido de cadena sencilla. Tambien pueden utilizarse tecnicas para el ensamblaje de fragmentos Fv funcionales en E. coli (Skerra et al, Science 242: 1038-1041 (1988)).

Metodos de producir anticuerpos

Los anticuerpos de la invencion pueden producirse por cualquier metodo conocido en la tecnica para la smtesis de anticuerpos, en particular, por smtesis qmmica o, preferiblemente, por tecnicas de expresion recombinantes.

La expresion recombinante de un anticuerpo de la invencion, o fragmento, derivado o analogo del mismo, (p. ej., una cadena pesada o ligera de un anticuerpo de la invencion o un anticuerpo de cadena sencilla de la invencion), requiere la construccion de un vector de expresion que contiene un polinucleotido que codifica el anticuerpo o un fragmento del anticuerpo. Una vez que se ha obtenido un polinucleotido que codifica una molecula de anticuerpo, el vector para la produccion del anticuerpo puede ser producido mediante tecnologfa de ADN recombinante. Se construye un vector de expresion que contiene secuencias de codificacion de anticuerpos y senales de control de la transcripcion y la traduccion apropiadas. Estos metodos incluyen, por ejemplo, tecnicas de ADN recombinante in vitro, tecnicas sinteticas y recombinacion genetica in vivo.

El vector de expresion se transfiere a una celula huesped mediante tecnicas convencionales y las celulas transfectadas se cultivan entonces mediante tecnicas convencionales para producir un anticuerpo de la invencion. En un aspecto de la invencion, los vectores que codifican tanto las cadenas pesadas como ligeras pueden ser co- expresados en la celula huesped para la expresion de toda la molecula de inmunoglobulina, como se detalla a continuacion.

Se puede utilizar una diversidad de sistemas de vectores de expresion en el huesped para expresar las moleculas de anticuerpo de la invencion tal como se describe anteriormente. Tales sistemas de expresion en el huesped representan vehmulos, mediante los cuales las secuencias codificantes de interes pueden producirse y posteriormente purificarse, pero tambien representan celulas que pueden, cuando son transformadas o transfectadas con las secuencias codificadoras de nucleotidos apropiadas, expresar una molecula de anticuerpo de la invencion in situ. Celulas bacterianas tales como E. coli, y celulas eucariotas se utilizan comunmente para la expresion de una molecula de anticuerpo recombinante, especialmente para la expresion de moleculas completas de anticuerpo recombinante. Por ejemplo, celulas de mairnfero tales como celulas de ovario de hamster chino (CHO), en union con un vector tal como el elemento promotor del gen temprano intermedio principal del citomegalovirus humano es un sistema de expresion eficaz para anticuerpos (Foecking et al., Gene 45:101 (1986); Cockett et al, Bio/Technology 8: 2 (1990)).

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Ademas, se puede escoger una cepa de celulas huesped que module la expresion de las secuencias insertadas, o que modifique y procese el producto genico en la forma espedfica deseada. Tales modificaciones (p. ej., glicosilacion) y procesamiento (p. ej., escision) de productos proteicos puede ser importante para la funcion de la protema. Diferentes celulas huesped tienen mecanismos caractensticos y espedficos para el procesamiento post- traduccion y la modificacion de protemas y productos genicos. Lmeas celulares o sistemas huesped apropiados se pueden elegir para asegurar la modificacion y el procesamiento correctos de la protema extrana expresada. Para este fin, se pueden utilizar celulas huesped eucariotas que poseen la maquinaria celular para el procesamiento apropiado del transcrito primario, la glicosilacion y la fosforilacion del producto genico. Tales celulas huesped de mairnfero incluyen, pero no se limitan a, celulas CHO, COS, 293, 3T3 o de mieloma.

Para la produccion de protemas recombinantes a largo plazo, de alto rendimiento, se prefiere una expresion estable. Por ejemplo, lmeas celulares que expresan establemente la molecula de anticuerpo pueden modificarse por ingeniena genetica. En lugar de utilizar vectores de expresion que contienen ongenes de replicacion virales, las celulas huesped pueden transformarse con ADN controlado por elementos de control de la expresion apropiados (p. ej., promotor, potenciador, secuencias, terminadores de la transcripcion, sitios de poliadenilacion, etc.), y un marcador seleccionable. Tras la introduccion del ADN extrano, las celulas tratadas mediante ingeniena genetica pueden dejarse crecer durante 1-2 dfas en un medio enriquecido y, a continuacion, cambiarse a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plasmido recombinante confiere resistencia a la seleccion y permite que las celulas integren de forma estable el plasmido en sus cromosomas y crezcan para formar focos que, a su vez, pueden clonarse y expandirse en lmeas celulares. Este metodo se puede utilizar ventajosamente para tratar mediante ingeniena genetica lmeas celulares que expresan la molecula de anticuerpo. Tales lmeas celulares tratadas mediante ingeniena genetica pueden ser particularmente utiles en el rastreo y la evaluacion de compuestos que interaction directa o indirectamente con la molecula de anticuerpo.

Se puede utilizar un cierto numero de sistemas de seleccion, incluyendo, pero no limitado a la timidina quinasa del virus herpes simplex (Wigler et al, Cell 11:223 (1977)), hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (Szybalska y Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202 (1992)), y genes de adenina fosforribosiltransferasa (Lowy et al, Cell 22:. 817 (1980)) se pueden emplear en celulas tk, hgprt o aprt, respectivamente. Tambien, la resistencia antimetabolito se puede utilizar como la base de seleccion para los siguientes genes: dhfr, que confiere resistencia al metotrexato (Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:357 (1980); O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527 (1981)); gpt, que confiere resistencia al acido micofenolico (Mulligan y Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072 (1981)); neo, que confiere resistencia al aminoglicosido G-418 (Wu y Wu, Biotherapy 3: 87-95 (1991)); e hygro, que confiere resistencia a la higromicina (Santerre et al, Gene 30: 147 (1984)). Metodos comunmente conocidos en la tecnica de la tecnologfa del ADN recombinante pueden aplicarse rutinariamente para seleccionar el clon recombinante deseado, y metodos de este tipo se describen, por ejemplo, en Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, nY (1990); y en los capftulos 12 y 13, Dracopoli et al. (comps.), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150: 1 (1981).

Los niveles de expresion de una molecula de anticuerpo pueden aumentarse mediante amplificacion del vector (para una revision, vease Bebbington y Hentschel, "The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells" (DNA Cloning, Vol.3. Academic Press, Nueva York, 1987)). Cuando un marcador en el sistema vector que expresa el anticuerpo es amplificable, el aumento en el nivel de inhibidor presente en el cultivo de la celula huesped aumentara el numero de copias del gen marcador. Puesto que la region amplificada se asocia con el gen del anticuerpo, la produccion del anticuerpo tambien aumentara (Crouse et al., Mol. Cell. Biol. 3: 257 (1983)).

La celula huesped puede ser co-transfectada con dos vectores de expresion de la invencion, codificando el primer vector un polipeptido derivado de la cadena pesada y codificando el segundo vector un polipeptido derivado de la cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables identicos que permiten una expresion igual de polipeptidos de cadena pesada y ligera. Alternativamente, puede utilizarse un unico vector que codifica, y es capaz de expresar, los polipeptidos tanto de cadena pesada como ligera. En tales situaciones, la cadena ligera debe ser colocada antes de la cadena pesada para evitar un exceso de cadena pesada libre toxica (Proudfoot, Nature 322: 52 (1986); Kohler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 2197 (1980)). Las secuencias codificadoras para las cadenas pesadas y ligeras pueden comprender ADNc o ADN genomico.

Una vez que una molecula de anticuerpo de la invencion ha sido producida por un animal, ha sido sintetizada qmmicamente o expresada de forma recombinante, la misma puede purificarse por cualquier metodo conocido en la tecnica para la purificacion de una molecula de inmunoglobulina, por ejemplo, mediante cromatograffa (p. ej., intercambio ionico, afinidad, particularmente mediante afinidad por el anffgeno espedfico despues de protema A, y cromatograffa de exclusion por tamano), centrifugacion, solubilidad diferencial, o por cualquier otra tecnica estandar para la purificacion de protemas. Ademas, los anticuerpos de la presente invencion o fragmentos de los mismos pueden fusionarse con secuencias de polipeptidos heterologos descritas en esta memoria o de otra manera conocida en la tecnica, para facilitar la purificacion.

La presente invencion abarca anticuerpos fusionados de forma recombinante o conjugados qmmicamente (incluyendo tanto conjugaciones covalentes como no covalentes) a un polipeptido. Anticuerpos fusionados o

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conjugados de la presente invencion se pueden utilizar para la facilidad en la purificacion. Vease, p. ej., Harbor et al, supra, y la publicacion PCT WO 93/21232; documento EP 439.095; Naramura et al., Immunol. Lett. 39: 91-99 (1994); patente de EE.UU. N° 5.474.981; Gillies et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 1428-1432 (1992); Fell et al., J. Immunol. 146: 2446-2452 (1991).

Ademas, los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la presente invencion pueden fusionarse con secuencias marcadoras, tal como un peptido, para facilitar la purificacion. En realizaciones preferidas, la secuencia de aminoacidos marcadora es un peptido hexa-histidina tal como la etiqueta proporcionada en un vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif., 91311), entre otros, muchos de los cuales estan comercialmente disponibles. Tal como se describe en Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821-824 (1989), por ejemplo, la hexa-histidina proporciona una purificacion conveniente de la protema de fusion. Otras etiquetas peptfdicas utiles para la purificacion incluyen, pero no se limitan a, la etiqueta "HA", que corresponde a un epttopo derivado de la protema hemaglutinina de la gripe (Wilson et al, Cell 37: 767 (1984)) y la etiqueta “flag”.

Usos diagnosticos para anticuerpos

Los anticuerpos de la invencion incluyen derivados que estan modificados, es decir, mediante la union covalente de cualquier tipo de molecula al anticuerpo, de manera que la union covalente no interfiere con la union al antfgeno. Por ejemplo, pero no a modo de limitacion, los derivados de anticuerpo incluyen anticuerpos que han sido modificados, p. ej., por biotinilacion, HRP, o cualquier otro resto detectable.

Los anticuerpos de la presente invencion se pueden utilizar para, por ejemplo, pero no limitados a, detectar Factor D, incluyendo metodos de diagnostico tanto in vitro como in vivo. Por ejemplo, los anticuerpos tienen uso en inmunoensayos para medir cualitativa y cuantitativamente los niveles de Factor D en muestras biologicas obtenidas de los ojos de los sujetos que padecen afecciones o enfermedades oculares. Tfpicamente, se describen inmunoensayos en, p. ej., Harlow et al, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988.).

Tal como se comenta con mayor detalle a continuacion, los anticuerpos de la presente invencion se pueden utilizar solos o en combinacion con otras composiciones. Los anticuerpos pueden ademas fusionarse de forma recombinante a un polipeptido heterologo en el extremo N o C, o pueden conjugarse qmmicamente (incluyendo conjugaciones de manera covalente y no covalente) a polipeptidos u otras composiciones. Por ejemplo, los anticuerpos de la presente invencion pueden fusionarse de forma recombinante a o conjugarse con moleculas utiles tales como marcadores en ensayos de deteccion.

La presente invencion abarca, ademas, el uso de anticuerpos o fragmentos de los mismos conjugados con un agente de diagnostico para la deteccion de los niveles de componentes de la via del complemento en el ojo de un individuo afectado. Los anticuerpos pueden utilizarse diagnosticamente, por ejemplo, para controlar el desarrollo o el progreso de una afeccion ocular o enfermedad como parte de un procedimiento de ensayo clinico para, p. ej., determinar la eficacia de un regimen de tratamiento dado. La deteccion puede facilitarse mediante acoplamiento del anticuerpo a una sustancia detectable. Ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prosteticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, materiales radiactivos, metales emisores de positrones utilizando diversas tomograffas de emision de positrones, e iones metalicos paramagneticos no radiactivos. La sustancia detectable puede acoplarse o conjugarse directamente al anticuerpo (o fragmento del mismo) o indirectamente, a traves de un intermedio (tal como, por ejemplo, un enlazador conocido en la tecnica) utilizando tecnicas conocidas en la tecnica. Vease, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N° 4.741.900 para iones metalicos que pueden conjugarse con anticuerpos para su uso como diagnostico de acuerdo con la presente invencion. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rabano picante, fosfatasa alcalina, beta- galactosidasa o acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos de grupos prosteticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluorescema, isotiocianato de fluorescema, rodamina, diclorotriazinilamina fluorescema, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina, y aequorina; y ejemplos de materiales radiactivos adecuados incluyen 125I, 131I, 111In o - 99Tc.

Los anticuerpos tambien pueden unirse a soportes solidos, que son particularmente utiles para inmunoensayos o purificacion del antfgeno diana. Tales soportes solidos incluyen, pero no se limitan a, vidrio, celulosa, poliacrilamida, nilon, poliestireno, poli(cloruro de vinilo) o polipropileno.

Anticuerpos marcados, y derivados y analogos de los mismos, que se unen espedficamente al Factor D se pueden utilizar para fines de diagnostico para detectar, diagnosticar o controlar enfermedades, trastornos y/o afecciones asociadas con la expresion y/o actividad aberrante de Factor D. La invencion proporciona la deteccion de la expresion aberrante de Factor D, que comprende (a) ensayar la expresion del factor D en celulas o fluido corporal de un individuo utilizando uno o mas anticuerpos de la presente invencion espedficos para Factor D y (b) comparar el nivel de la expresion genica con un nivel de expresion genica estandar, con lo cual un aumento o disminucion en el nivel de expresion del factor D ensayado en comparacion con el nivel de expresion estandar es indicativo de la expresion aberrante.

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Los anticuerpos pueden utilizarse para detectar la presencia y/o niveles de Factor D en una muestra, p. ej., fluido ocular. El metodo de deteccion puede comprender poner en contacto la muestra con un anticuerpo anti-Factor D y determinar la cantidad de anticuerpo que se une a la muestra.

La invencion proporciona un ensayo de diagnostico para el diagnostico de un trastorno, que comprende (a) ensayar la expresion del Factor D en celulas o fluido corporal de un individuo utilizando uno o mas anticuerpos de la presente invencion y (b) comparar el nivel de la expresion genica con un nivel de expresion genica estandar, con lo cual un aumento o disminucion en el nivel de expresion genica ensayado en comparacion con el nivel de expresion estandar es indicativo de un trastorno particular.

Los anticuerpos de la invencion pueden utilizarse para ensayar niveles de protema en una muestra biologica utilizando metodos inmunohistologicos clasicos conocidos por los expertos en la tecnica (p. ej., vease Jalkanen, et al., J. Cell. Biol. 101: 976-985 (1985); Jalkanen, et al., J. Cell. Biol. 105: 3087-3096 (1987)). Otros metodos basados en anticuerpos utiles para detectar la expresion genica de protemas incluyen inmunoensayos tales como el ensayo inmunoadsorbente ligado a enzimas (ELISA) y el radioinmunoensayo (RIA). Marcadores de ensayo de anticuerpos adecuados son conocidos en la tecnica e incluyen marcadores enzimaticos tales como glucosa oxidasa; radioisotopos tales como yodo (125I, 121I), carbono (14C), azufre (35S), tritio (3H), indio (112In) y tecnecio (99Tc); marcadores luminiscentes tales como luminol; y marcadores fluorescentes tales como fluorescema y rodamina, y biotina.

Un aspecto de la invencion es la deteccion y el diagnostico de una enfermedad o trastorno asociado con la activacion del complemento en los ojos de un sujeto, preferiblemente un mairnfero y lo mas preferiblemente un ser humano. En una realizacion, el diagnostico comprende: a) tomar una muestra del ojo de un paciente; b) medir el nivel de componentes del complemento, tal como C3a o C3b o C5a.

El nivel de fondo puede determinarse mediante diversos metodos que incluyen, comparar la cantidad de molecula marcada detectada con un valor estandar determinado previamente para un sistema particular.

En una realizacion, el seguimiento de la enfermedad o trastorno se lleva a cabo repitiendo el metodo para diagnosticar la enfermedad o la enfermedad, por ejemplo, un mes despues del diagnostico inicial, seis meses despues del diagnostico inicial, un ano despues del diagnostico inicial, etc.

Usos terapeuticos de los inhibidores de la via del complemento

Inhibidores de la via del complemento se pueden administrar a un sujeto que padece una enfermedad ocular como la degeneracion macular relacionada con la edad. Un anticuerpo, con o sin un resto terapeutico conjugado a el, se puede utilizar como agente terapeutico. La presente invencion esta dirigida al uso de inhibidores de la via del complemento, en particular los anticuerpos, que comprende administrar dichos inhibidores a un animal, un mamffero o un ser humano, para tratar una enfermedad, trastorno o afeccion ocular, que implica la activacion de la via del complemento, en particular la degeneracion macular relacionada con la edad. El animal o sujeto puede ser un animal en necesidad de un tratamiento particular tal como un animal al que se ha diagnosticado un trastorno particular, p. ej., uno relativo al complemento. Los anticuerpos dirigidos contra el Factor D son utiles para inhibir la via alternativa del complemento y, de este modo, inhibir trastornos o afecciones relacionados con la via del complemento. En particular, la presente invencion se refiere al tratamiento de la AMD. Por ejemplo, mediante la administracion de una dosis terapeuticamente aceptable de un anticuerpo, o anticuerpos, de la presente invencion, o un coctel de los presentes anticuerpos, o en combinacion con otras moleculas de diferentes fuentes, los efectos de la activacion de componentes de la via del complemento pueden ser reducidos o eliminados en el mamnfero tratado.

Los compuestos terapeuticos de la invencion incluyen, pero no se limitan a los anticuerpos de la invencion (incluyendo fragmentos, analogos y derivados de los mismos tal como se describe en esta memoria) y acidos nucleicos que codifican anticuerpos de la invencion tal como se describe a continuacion (incluyendo fragmentos, analogos y derivados de los mismos y anticuerpos anti-idiotipo tal como se describe en este documento). Los anticuerpos de la invencion pueden utilizarse para tratar, inhibir o prevenir enfermedades, trastornos o afecciones asociadas con una expresion aberrante y/o actividad de la via del complemento, en particular la via alternativa, y en particular Factor D. El tratamiento y/o la prevencion de enfermedades, trastornos o afecciones asociados con la expresion y/o actividad aberrante de Factor D incluye, pero no se limita a, el alivio de al menos uno de los smtomas asociados con esas enfermedades, trastornos o afecciones. Los anticuerpos de la invencion pueden proporcionarse en composiciones farmaceuticamente aceptables tal como se conoce en la tecnica o como se describe en esta memoria.

La cantidad del anticuerpo que sera eficaz en el tratamiento, inhibicion y prevencion de una enfermedad o trastorno asociado con la expresion y/o activacion de la via del complemento aberrante puede determinarse por tecnicas clmicas estandares. El anticuerpo se puede administrar en regfmenes de tratamiento consistentes con la enfermedad, p. ej., una sola o unas pocas dosis a lo largo de uno a varios dfas para mejorar un estado patologico o dosis periodicas durante un tiempo prolongado para prevenir enfermedades o afecciones oculares.

Ademas, los ensayos in vitro se pueden emplear opcionalmente para ayudar a identificar los intervalos de dosificacion optimos. La dosis precisa a emplear en la formulacion tambien dependera de la via de administracion, y

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la gravedad de la enfermedad o trastorno, y debe decidirse de acuerdo con el juicio del medico y las circunstancias de cada paciente. Dosis eficaces se pueden extrapolar a partir de curvas de dosis-respuesta derivadas de sistemas de ensayo in vitro o de modelos animales.

Para los anticuerpos, la dosificacion administrada a un paciente es tipicamente de 0,1 mg/kg a 100 mg/kg de peso corporal del paciente. Preferiblemente, la dosificacion administrada a un paciente es de entre 0,1 mg/kg y 20 mg/kg de peso corporal del paciente, mas preferiblemente de 1 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal del paciente Generalmente, los anticuerpos humanos tienen una semivida mas larga dentro del cuerpo humano que los anticuerpos de otras especies debido a la respuesta inmune a los polipeptidos extranos. Por lo tanto, a menudo son posibles dosis mas bajas de anticuerpos humanos y una administracion menos frecuente. Ademas, la dosis y frecuencia de administracion de anticuerpos de la invencion pueden reducirse potenciando la captacion y penetracion tisular (p. ej., en el cerebro) de los anticuerpos mediante modificaciones tales como, por ejemplo, lipidacion. En un aspecto preferido, el anticuerpo se purifica sustancialmente (p. ej., esta sustancialmente libre de sustancias que limitan su efecto o producen efectos secundarios no deseados).

Se conocen diversos sistemas de entrega y se pueden utilizar para administrar un anticuerpo de la presente invencion, incluyendo la inyeccion, p. ej., encapsulacion en liposomas, micropartfculas, microcapsulas, celulas recombinantes capaces de expresar el compuesto, endocitosis mediada por receptor (vease, p. ej., Wu et al., J. Biol. Chem. 262: 4429-4432 (1987)), construccion de un acido nucleico como parte de un vector retroviral o de otro tipo, etc.

El anticuerpo se puede administrar al mairnfero de cualquier manera aceptable. Metodos de introduccion incluyen, pero no se limitan a las vfas intradermica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutanea, intranasal, epidural, por inhalacion y oral. Sin embargo, para el proposito de la presente invencion, la via de administracion preferida es intraocular.

La administracion puede ser sistemica o local. Ademas, puede ser deseable introducir los anticuerpos terapeuticos o composiciones de la invencion en el sistema nervioso central por cualquier via adecuada, incluyendo la inyeccion intraventricular e intratecal; la inyeccion intraventricular se puede facilitar mediante un cateter intraventricular, por ejemplo, unido a un deposito, tal como un recipiente Ommaya.

En otra realizacion, el anticuerpo puede administrarse en una vesfcula, en particular un liposoma (vease Langer, Science 249: 1527-1533 (1990); Treat et al, en Liposomes in the Therapy of Infections Disease and Cancer, Lopez- Berestein y Fidler (comps.), Liss, Nueva York, pags. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid, pags. 317-327; vease en general ibid.).

En aun otra realizacion, el anticuerpo se puede suministrar en un sistema de liberacion controlada. En una realizacion, se puede utilizar una bomba (vease Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Ing. 14: 201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88: 507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321: 574 (1989)). En otra realizacion, se pueden utilizar materiales polimericos (vease Medical Applications of Controlled Release, Langer y Wise (comps.), CRC Pres., Boca Raton, Florida. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drugs Product Design and Performance, Smolen y Ball (comps.), Wiley, Nueva York (1984); Ranger y Peppas, J., Macromol. Sci. Rev.

Macromol. Chem. 23:61 (1983); vease tambien Levy et al, Science 228: 190 (1985); During et al., Ann. Neurol. 25: 351 (1989); Howard et al., J. Neurosurg. 71: 105 (1989)). En todavfa otra realizacion, un sistema de liberacion controlada puede ser colocado en la proximidad de la diana terapeutica.

La presente invencion tambien proporciona composiciones farmaceuticas utiles en el presente metodo. Tales composiciones comprenden una cantidad terapeuticamente eficaz del anticuerpo y un soporte fisiologicamente aceptable. En una realizacion espedfica, la expresion "fisiologicamente aceptable" significa aprobado por una Agencia Reguladora del Gobierno Federal o Estatal o listado en la Farmacopea de los EE.UU. u otra farmacopea generalmente reconocida para uso en animales, y mas particularmente en seres humanos. El termino "soporte" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehfcuio con el que se administra el agente terapeutico. Tales soportes fisiologicos pueden ser lfquidos esteriles, tales como agua y aceites, incluyendo los de origen del petroleo, animal, vegetal o sintetico tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sesamo y similares. El agua es un soporte preferido cuando la composicion farmaceutica se administra por via intravenosa. Disoluciones salinas y disoluciones de dextrosa y glicerol acuosas tambien pueden emplearse como soportes lfquidos, particularmente para disoluciones inyectables. Excipientes farmaceuticos adecuados incluyen almidon, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, yeso, gel de sflice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche descremada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. La composicion, si se desea, tambien puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes tampon de pH. Estas composiciones pueden adoptar la forma de disoluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, pfldoras, capsulas, polvos, formulaciones de liberacion sostenida, y similares. La composicion se puede formular como un supositorio, con aglutinantes y vehfculos tradicionales tales como trigliceridos. La formulacion oral puede incluir soportes estandares tales como calidades farmaceuticas de manitol, lactosa, almidon, estearato de magnesio, sacarina sodica, celulosa, carbonato de magnesio, etc. Ejemplos de soportes adecuados se describen en "Remington Pharmaceutical Sciences" por E.W. Martin. Tales composiciones contendran una cantidad

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eficaz del anticuerpo, preferiblemente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de vehmulo para proporcionar la forma para la administracion apropiada al paciente. La formulacion debe adecuarse al modo de administracion.

En una realizacion, la composicion se formula de acuerdo con procedimientos rutinarios como una composicion farmaceutica adaptada para administracion intravenosa a seres humanos. Tfpicamente, las composiciones para administracion intravenosa son disoluciones en tampon acuoso isotonico esteril. Cuando sea necesario, la composicion tambien puede incluir un agente solubilizante y un anestesico local tal como lignocama para aliviar el dolor en el sitio de la inyeccion. Generalmente, los ingredientes se suministran por separado o mezclados juntos en forma de dosificacion unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado anhidro en un recipiente hermeticamente sellado tal como una ampolla o un sobre que indique la cantidad de agente activo. Cuando la composicion se ha de administrar por infusion, se puede dispensar con una botella de infusion que contiene agua de calidad farmaceutica esteril o solucion salina. Cuando la composicion se administra mediante inyeccion, se puede proporcionar una ampolla de agua esteril para inyeccion o solucion salina para que los ingredientes se puedan mezclar antes de la administracion.

La invencion tambien proporciona un envase o kit farmaceutico que comprende uno o mas recipientes llenos con uno o mas de los ingredientes de las composiciones farmaceuticas de la invencion. Opcionalmente asociado con un recipiente o recipientes puede existir una nota en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricacion, uso o venta de productos farmaceuticos o biologicos, nota que refleje la aprobacion por la agencia de la fabricacion, uso o venta para la administracion humana.

Ademas, los anticuerpos de la presente invencion pueden conjugarse con diversas moleculas efectoras tales como polipeptidos heterologos, farmacos, radionucleotidos o toxinas. Vease, p. ej., las publicaciones PCT WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; la patente de EE.UU. N° 5.314.995; y el documento EP 396.387. Un anticuerpo o fragmento del mismo puede conjugarse a un resto terapeutico tal como una citotoxina, p. ej., un agente citostatico o citocida, un agente terapeutico o un ion metalico radiactivo, p. ej., emisores alfa tales como, por ejemplo, 213Bi. Un agente de citotoxina o citotoxico incluye cualquier agente que es perjudicial para las celulas. Ejemplos incluyen paclitaxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etoposido, tenoposido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxi-antracina-diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-dehidrotestosterona, glucocorticoides, procama, tetracama, lidocama, propranolol, y puromicina y analogos u homologos de los mismos. Agentes terapeuticos incluyen, pero no se limitan a, antimetabolitos (p. ej., metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo decarbazina), agentes alquilantes (p. ej., mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalan, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (p. ej., daunorubicina (anteriormente daunomicina) y doxorubicina), antibioticos (p. ej., dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC)), y agentes anti-mitoticos (p. ej., vincristina y vinblastina).

Tecnicas para conjugar un resto terapeutico de este tipo con anticuerpos son bien conocidas, vease, p. ej., Amon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Od drugs In Cancer Therapy ", en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (comps.), pags. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2a Ed.), Robinson et al. (comps.), pags. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (comps.), pags. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (comps.), pags. 303-16 (Academic Press, 1985), y Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. 62: 119-58 (1982). Alternativamente, un anticuerpo puede conjugarse con un segundo anticuerpo para formar un heteroconjugado de anticuerpo. (Vease, p. ej., Segal en la patente de EE.UU. N°. 4.676.980).

Los conjugados de la invencion pueden utilizarse para modificar una respuesta biologica dada, el agente terapeutico o resto de farmaco no debe ser interpretado como limitado a los agentes terapeuticos qmmicos clasicos. Por ejemplo, el resto de farmaco puede ser una protema o polipeptido que posee una actividad biologica deseada. Tales protemas pueden incluir, por ejemplo, una toxina tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas o toxina de la difteria; una protema tal como el factor de necrosis tumoral, interferon a, interferon p, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas, activador del plasminogeno tisular, un agente apoptotico, p. ej., TNF-a, TNF-p, AIM I (vease, la Publicacion Internacional N° WO 97/33899), AIM II (vease, la Publicacion Internacional N° WO 97/34911), ligando Fas (Takahashi et al., Int. Immunol., 6: 1567-1574 (1994)), VEGI (vease la Publicacion Internacional N° WO 99/23105), un agente trombotico o un agente anti-angiogenico, p. ej., angiostatina o endostatina; o, modificadores de la respuesta biologica tales como, por ejemplo, linfoquinas, interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), Factor estimulante de colonias de granulocitos macrofagos ("GM-CSF"), Factor estimulante de colonias de granulocitos ("G-CSF"), u otros Factores de crecimiento.

Terapia genica basada en anticuerpos

En un otro aspecto de la invencion, los acidos nucleicos que comprenden secuencias que codifican anticuerpos o fragmentos de union de los mismos, se administran para tratar, inhibir o prevenir una enfermedad o trastorno

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asociado con la expresion aberrante y/o activacion de la via del complemento por medio de la terapia genica, en particular AMD. La terapia genica se refiere a la terapia realizada por la administracion a un sujeto de un acido nucleico expresado o expresable. En esta realizacion de la invencion, los acidos nucleicos producen su protema codificada que media en un efecto terapeutico. Cualquiera de los metodos de terapia genica disponibles se puede utilizar de acuerdo con la presente invencion. Metodos a modo de ejemplo se describen a continuacion.

Para revisiones generales de los metodos de terapia genica, vease Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 12: 488-505 (1993); Wu y Wu, Biotherapy 3: 87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596 (1993); Mulligan, Science 260: 926-932 (1993); y Morgan y Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217 (1993); May, TIBTECH 11 (5): 155-215 (1993).

En un aspecto, el compuesto comprende secuencias de acidos nucleicos que codifican un anticuerpo, siendo parte dichas secuencias de acidos nucleicos de vectores de expresion que expresan el anticuerpo o fragmentos o protemas quimericas o cadenas pesadas o ligeras del mismo en un huesped adecuado. En particular, tales secuencias de acidos nucleicos tienen promotores operativamente enlazados a la region codificadora de anticuerpos, siendo dicho promotor inducible o constitutiva y, opcionalmente, espedfico para el tejido.

En otra realizacion particular, se utilizan moleculas de acidos nucleicos en las que las secuencias codificadoras del anticuerpo y cualesquiera otras secuencias deseadas estan flanqueadas por regiones que fomentan la recombinacion homologa en un sitio deseado en el genoma, proporcionando de este modo la expresion intracromosomica del anticuerpo que codifica acidos nucleicos (Koller y Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8932-8935 (1989); Zijlstra et al, Nature 342: 435-438 (1989). En realizaciones espedficas, la molecula de anticuerpo expresada es un anticuerpo de cadena sencilla; alternativamente, las secuencias de acidos nucleicos incluyen secuencias que codifican tanto las cadenas pesadas como ligeras, o fragmentos de las mismas, del anticuerpo.

El suministro de los acidos nucleicos a un paciente puede ser directo, en cuyo caso el paciente es expuesto directamente al acido nucleico o a vectores portadores de acidos nucleicos, o indirecto, en cuyo caso, las celulas se transforman primero con los acidos nucleicos in vitro y luego son trasplantadas al paciente. Estos dos enfoques son conocidos, respectivamente, como terapia genica in vivo o ex vivo.

En una realizacion espedfica, las secuencias de acidos nucleicos se administran directamente in vivo, en donde se expresan para producir el producto codificado. Esto se puede lograr por cualquiera de numerosos metodos conocidos en la tecnica, p. ej., mediante la construccion de los mismos como parte de un vector de expresion de acido nucleico apropiado y la administracion de modo que se conviertan en intracelulares, p. ej., mediante infeccion utilizando vectores retrovirales defectuosos o atenuados u otros vectores virales (vease la Patente de EE.UU. N°. 4.980.286.), o mediante inyeccion directa de ADN desnudo, o mediante el uso de bombardeo de micropartfculas (p. ej., una pistola de genes; Biolistic, Dupont), o recubrimiento con lfpidos o receptores de superficie celular o agentes de transfeccion, encapsulacion en liposomas, micropartfculas o microcapsulas, o mediante la administracion de los mismos en union a un peptido que se sabe que penetra en el nucleo, administrandolo en union a un ligando sometido a endocitosis mediada por receptor (vease, p. ej., Wu y Wu, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432 (1987)) (que puede ser utilizado para fijar como objetivo tipos celulares que expresan espedficamente los receptores), etc.

En otra realizacion, se pueden formar complejos de ligando de acido nucleico en donde el ligando comprende un peptido viral fusogenico para alterar endosomas, permitiendo que el acido nucleico evite la degradacion lisosomal. En aun otra realizacion, el acido nucleico puede dirigirse in vivo para la captacion y expresion espedfica de celulas, al fijar como objetivo un receptor espedfico (veanse, p. ej., las publicaciones PCT Wo 92/06180; WO 92/22635; WO 92/20316; WO 93/14188, wO 93/20221). Alternativamente, el acido nucleico puede ser introducido intracelularmente e incorporado dentro del ADN de la celula huesped para la expresion, por recombinacion homologa (Koller y Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8932-8935 (1989); Zijlstra et al, Nature 342: 435-438 (1989)).

En una realizacion espedfica, se utilizan vectores virales que contengan secuencias de acido nucleico que codifican un anticuerpo de la invencion. Por ejemplo, se puede utilizar un vector retroviral (vease Miller et al., Meth. Enzymol. 217: 581-599 (1993)). Estos vectores retrovirales contienen los componentes necesarios para el correcto empaquetamiento del genoma viral y la integracion en el ADN de la celula huesped. Las secuencias de acidos nucleicos que codifican el anticuerpo a ser utilizado en la terapia genica se clonan en uno o mas vectores, lo que facilita la entrega del gen en un paciente. Mas detalles acerca de los vectores retrovirales se pueden encontrar en Boesen et al, Biotherapy 6: 291-302 (1994), que describe el uso de un vector retroviral para suministrar el gen mdrl a las celulas madre hematopoyeticas con el fin de hacer las celulas madre mas resistentes a la quimioterapia. Otras referencias que ilustran el uso de vectores retrovirales en terapia genica son: Clowes et al, J. Clin. Invest. 93: 644651 (1994); Kiem et al, Blood 83: 1467-1473 (1994); Salmones y Gunzberg, Human Gene Therapy 4: 129-141 (1993); y Grossman y Wilson, Curr. Opin. Gen. and Dev. 3: 110-114 (1993).

Los adenovirus tambien se pueden utilizar en la presente invencion. Los adenovirus son vehfculos especialmente atractivos en la presente invencion para suministrar anticuerpos para el epitelio respiratorio. Los adenovirus infectan de forma natural el epitelio respiratorio. Otros objetivos para los sistemas de suministro basados en adenovirus son el hngado, el sistema nervioso central, las celulas endoteliales y el musculo. Los adenovirus tienen la ventaja de ser capaces de infectar celulas que no se dividen. Kozarsky y Wilson, Curr. Opin. Gen. Dev. 3: 499-503 (1993)

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presentan una revision de la terapia genica basada en adenovirus. Bout et al, Human Gene Therapy 5: 3-10 (1994) demostraron el uso de vectores de adenovirus para transferir genes al epitelio respiratorio de monos rhesus. Otros ejemplos del uso de adenovirus en terapia genica pueden encontrarse en Rosenfeld et al, Science 252: 431-434 (1991); Rosenfeld et al, Cell 68: 143-155 (1992); Mastrangeli et al., J. Clin. Invest. 91: 225-234 (1993); Publicacion PCT WO 94/12649; y Wang, et al., Gene Therapy 2: 775-783 (1995). Tambien se han propuesto virus adeno- asociados (AAV) para uso en terapia genica (Walsh et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204: 289-300 (1993); patentes de EE.UU. N°s. 5.436.146; 6.632.670; 6.642.051).

Otro enfoque para la terapia genica implica transferir un gen a las celulas en cultivo tisular por metodos tales como electroporacion, lipofeccion, transfeccion mediada por fosfato de calcio, o infeccion viral. Habitualmente, el metodo de transferencia incluye la transferencia de un marcador seleccionable a las celulas. Las celulas se colocan entonces bajo seleccion para aislar aquellas celulas que han captado y expresan el gen transferido. Esas celulas se entregan a un paciente.

En esta realizacion, el acido nucleico se introduce en una celula antes de la administracion in vivo de la celula recombinante resultante. Una introduccion de este tipo puede llevarse a cabo por cualquier metodo conocido en la tecnica, incluyendo, pero no limitado a, transfeccion, electroporacion, microinyeccion, infeccion con un vector viral o bacteriofago que contiene las secuencias de acidos nucleicos, fusion celular, transferencia de genes mediada por cromosomas, transferencia de genes mediada por microcelulas, fusion de esferoplastos, etc. En la tecnica son conocidas numerosas tecnicas para la introduccion de genes extranos en celulas (vease, p. ej., Loeffler y Behr, Meth. Enzymol. 217: 599-618 (1993); Cohen et al., Meth. Enzymol. 217: 618-644 (1993); Cline, Pharmac. Ther. 29: 69-92m (1985) y puede ser utilizadas de acuerdo con la presente invencion, siempre que no se interrumpan las funciones de desarrollo y fisiologicas necesarias de las celulas receptoras. La tecnica debe proporcionar la transferencia estable del acido nucleico a la celula, de modo que el acido nucleico sea expresable por la celula y preferiblemente heredable y expresable por su progenie celular.

Las celulas recombinantes resultantes se pueden suministrar a un paciente por diversos metodos conocidos en la tecnica. Celulas de la sangre recombinantes (p. ej., celulas madre o progenitoras hematopoyeticas) se administran preferiblemente por via intravenosa. La cantidad de celulas previstas para uso depende del efecto deseado, estado del paciente, etc., y puede ser determinada por un experto en la tecnica.

Celulas en las que un acido nucleico se puede introducir para fines de terapia genica abarcan cualquier tipo de celula deseado, disponible, e incluyen pero no se limitan a celulas epiteliales, celulas endoteliales, queratinocitos, fibroblastos, celulas musculares, hepatocitos; celulas de la sangre tales como linfocitos T, linfocitos B, monocitos, macrofagos, neutrofilos, eosinofilos, megacariocitos, granulocitos; diversas celulas madre o progenitoras, en particular celulas madre o progenitoras hematopoyeticas, p. ej., tal como se obtienen de la medula osea, sangre del cordon umbilical, sangre periferica, fugado fetal, etc.

En una realizacion, la celula utilizada para la terapia genica es autologa para el paciente. Secuencias de acidos nucleicos que codifican un anticuerpo de la presente invencion se introducen en las celulas de tal manera que son expresables por las celulas o su progenie, y las celulas recombinantes se administran luego in vivo para el efecto terapeutico. En una realizacion espedfica, se derivan o se utilizan celulas progenitoras. Cualquier celula madre y/o progenitora que pueda aislarse y mantenerse in vitro puede ser potencialmente utilizada de acuerdo con esta realizacion de la presente invencion (vease, p. ej., la Publicacion PCT WO 94/08598; Stemple y Anderson, Cell 71: 973-985 (1992); Rheinwald, Meth. Cell Bio. 21A: 229 (1980); y Pittelkow y Scott, Mayo Clinic Proc. 61: 771 (1986)).

Modulacion de la expresion del componente de la via del complemento por ARNsi

ARNsis han demostrado ser utiles como herramienta en estudios de modulacion de la expresion genica donde los antagonistas tradicionales, tales como pequenas moleculas o anticuerpos, pueden ser menos eficaces. (Shi Y., Trends in Genetics 19 (1): 9-12 (2003)). ARNs de doble cadena, sintetizados in vitro, que son de 21 a 23 nucleotidos de longitud pueden actuar como ARNs de interferencia (ARNis) y pueden inhibir espedficamente la expresion genica (Fire A., Trends in Genetics 391, 806-810 (1999)). Estos ARNis actuan por mediacion de la degradacion de sus ARNs diana. Puesto que son de menos de 30 nucleotidos de longitud, no desencadenan un mecanismo de defensa antiviral de la celula. Tales mecanismos incluyen la produccion de interferon, y una interrupcion general de la smtesis de protemas de la celula huesped. Practicamente, los ARNsis pueden ser sintetizados y luego clonados en vectores de ADN. Tales vectores se pueden transfectar y se hacen para que expresen el ARNsi en niveles altos. El alto nivel de expresion de ARNsi se utiliza para "inactivar" o reducir significativamente la cantidad de protema producida en una celula y, por lo tanto, es util en experimentos en los que se cree que la sobre-expresion de una protema esta vinculada a un trastorno como el cancer. ARNsis son antagonistas utiles para complementar protemas de la via mediante la limitacion de la produccion celular del antfgeno y para inhibir la activacion de la cascada del complemento.

Peptidomimeticos y pequenas moleculas

Es bien conocido por los expertos normales en la tecnica que es posible reemplazar los peptidos por peptidomimeticos. Los peptidomimeticos son generalmente preferibles como agentes terapeuticos a peptidos debido

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a su biodisponibilidad mejorada y a la relativa falta de ataque de las enzimas proteolfticas. Se pueden utilizar tecnicas de modelado molecular para disenar un peptidomimetico que imite la estructura de los peptidos del complemento relacionados descritos en esta memoria. Por consiguiente, la presente invencion tambien proporciona peptidomimeticos y otros compuestos de plomo que pueden ser identificados en base a los datos obtenidos a partir del analisis estructural de la protema de la via del complemento. Un analogo potencial de Factor D puede ser examinado a traves del uso de modelos de ordenador utilizando un programa de acoplamiento tal como GRAM, DOCK o AUTODOCK. Este proceso puede incluir un ajuste de ordenador de analogos potenciales de Factor D. Los programas de ordenador tambien se pueden emplear para estimar la atraccion, repulsa y el impedimento esterico de un analogo a un potencial sitio de union. Generalmente, cuanto mas apretado sea el ajuste (p. ej., cuanto menor sea el impedimento esterico y/o cuanto mayor sea la fuerza de atraccion) mas potente sera farmaco potencial, ya que estas propiedades son consistentes con una constante de union mas fuerte. Ademas, cuanto mayor sea la especificidad en el diseno de un farmaco potencial, mas probable sera que el farmaco no interfiera con otras propiedades del sistema de expresion. Esto reducira al mmimo los posibles efectos secundarios no deseados debido a las interacciones con otras protemas.

Inicialmente un potencial analogo de factor D se podna obtener mediante el rastreo de un banco aleatorio de peptidos producido por un bacteriofago recombinante, por ejemplo, o un banco qmmico. Un ligando analogo seleccionado de esta manera podna entonces ser modificado de manera sistematica por los programas de modelado por ordenador hasta que se identifiquen uno o mas ligandos potenciales prometedores.

Un modelado por ordenador de este tipo permite la seleccion de un numero finito de modificaciones qmmicas racionales, en oposicion a la innumerable cantidad de modificaciones qmmicas esencialmente aleatorias que se podnan hacer, y de la que cualquiera podna conducir a un farmaco util. Por lo tanto, mediante el uso de la estructura tridimensional descrita en esta memoria y del modelado por ordenador, un gran numero de compuestos se rastrea rapidamente y se pueden determinar unos pocos candidatos probables sin la smtesis laboriosa de un numero incalculable de compuestos.

Una vez que se identifica un potencial analogo de factor D, este se puede seleccionar ya sea a partir de un banco de productos qmmicos comercialmente disponibles de la mayona de las grandes comparuas qmmicas grandes incluyendo Merck, GlaxoWelcome, Bristol Meyers Squib, Monsanto/Searle, Eli Lilly, Novartis y Pharmacia Upjohn o, alternativamente, el potencial ligando se sintetiza de novo. Tal como se menciono anteriormente, la smtesis de novo de un o incluso un grupo relativamente pequeno de compuestos espedficos es razonable en la tecnica de diseno de farmacos.

Alternativamente, en base a las estructuras moleculares de las regiones variables de los anticuerpos anti-Factor D, se podna utilizar el modelado molecular y el diseno molecular racional para generar y detectar pequenas moleculas que imitan las estructuras moleculares de la region de union de los anticuerpos e inhibir las actividades de Factor D. Estas pequenas moleculas pueden ser peptidos, peptidomimeticos, oligonucleotidos o compuestos organicos.

Ejemplo

Eficacia de Anticuerpo en una neovascularizacion coroidea (CNV) inducida por laser como un modelo de AMD humeda

La eficacia de las inyecciones intraoculares de un anticuerpo se puede someter a ensayo en un modelo de CNV de lesion por laser tal como se describe anteriormente por Krzystolik MG et al. (Arco Ophthalm. 2002; 120: 338-346). Este modelo puede ser utilizado para someter a ensayo la eficacia de cualquier farmaco candidato para la prevencion y/o mejora de AMD. Este modelo de CNV inducida por laser utiliza laser de argon verde para inducir la CNV en la macula de mono. Existe una buena correlacion entre el numero de lesiones de la CNV con fugas angiograficas significativas.

Hay dos fases de los estudios: Fase 1, la fase de prevencion, implica el inicio del tratamiento con anticuerpos antes de la induccion por laser de la CNV y 1 semana despues de la exposicion al laser para inhibir la formacion de CNV, que aparece tfpicamente de 2 a 3 semanas despues de la lesion por laser. Fase 2, la fase de tratamiento, se inicio el dfa 42 (3 semanas despues de la lesion con laser), cuando se esperanan lesiones de la CNV en los ojos de control de la fase 1. La fase 2 evalua el efecto del tratamiento sobre la atenuacion de la extension y la permeabilidad de las lesiones de CNV existentes.

Diez monos cynomolgus (Macaca fascicularis) se utilizan tfpicamente en un estudio de este tipo. Los monos se anestesiaron para todos los procedimientos con inyecciones intramusculares de, p. ej., hidrocloruro de ketamina (20 mg/kg); maleato de acepromazina (0,125 mg/kg); y sulfato de atropina (0,125 mg/kg). Se puede administrar una anestesia suplementaria de 5 a 6 mg/kg de hidrocloruro de ketamina, segun sea necesario. Ademas, para la anestesia topica se utiliza tfpicamente 0,5% de hidrocloruro de proparacama. Antes de la enucleacion se puede administrar una anestesia complementaria, con solucion intravenosa de pentobarbital sodico (5 mg/kg). Los animales fueron sacrificados despues de la experimentacion.

Tratamiento con anticuerpos

El anticuerpo a ensayar se administra en un tampon fisiologico a una concentracion de aproximadamente, p. ej., 10 pg/pL. Al ojo de control se le inyecta un vehmulo que consiste en todos los componentes excepto el anticuerpo a ensayar. Inyecciones intraoculares de alrededor de, por ejemplo, 50 pL por ojo, ya sea con el anticuerpo o el 5 vehmulo se realiza en cada ojo, respectivamente, a traves de la para plana utilizando una aguja de calibre 30 y una jeringa de tuberculina despues de instilar una anestesia topica y disolucion de yodo povidona al 5%. El anticuerpo se retira de un vial a traves de un filtro de 5 pm, y una nueva aguja (afilada) de calibre 30 se utiliza para la inyeccion intraocular. Despues de la inyeccion, una pomada oftalmica bactericida como bacitracina se instila en los fondos del saco. Los sitios de inyeccion se vanan ffpicamente para evitar el trauma a la esclerotica.

10 En la fase 1, el ojo derecho o izquierdo de cada uno de los animales se asignaron aleatoriamente para recibir inyecciones intraoculares de anticuerpos a una dosis de alrededor de, por ejemplo, 500 pg (50 pL por ojo), y este ojo se denomina el ojo prevencion. La dosis utilizada puede determinarse sobre la base de un estudio de seguridad y toxicologfa antes de este estudio de eficacia, o por otros medios apropiados clmicamente. El otro ojo se asigna a recibir inyecciones intraoculares de vehmulo y se denomina el ojo de control. Los dos ojos de cada uno de los 15 animales reciben ffpicamente dos inyecciones intraoculares, ya sea con el anticuerpo a ensayar o el vehmulo solo los dfas 0 y 14 antes del tratamiento con laser. El dfa 21, todos los ojos se someten a una fotocoagulacion con laser de argon verde para inducir lesiones de la CNV. El dfa 28, una semana despues de la induccion por laser, el ojo prevencion recibe otra inyeccion de anticuerpo y el ojo de control recibe vehmulo. La fase 2 del estudio comienza el dfa 42 o 3 semanas despues de la induccion por laser, cuando se espera que se haya desarrollado una CNV. Tras la 20 angiograffa con fluorescema el dfa 42, los dos ojos de cada uno de los animales recibira inyecciones intraoculares

de anticuerpos a una dosis de alrededor de, por ejemplo, 500 g (50 pL por ojo), y esto se repite el dfa 56.

Induccion de cnv experimental

Las membranas de la CNV se inducen en la macula de monos cynomolgus con quemaduras por laser de argon verde (Coherent Argon Dye Laser 920; Coherent Medical Laser, Palo Alto, Calif.) utilizando una lampara de 25 hendidura y una lente de contacto de fondo plano. Nueve lesiones se colocan simetricamente en la macula de cada uno de los ojos por un cirujano enmascarado. Las variables de laser incluyen un tamano del punto de 50 a 100 pm, 0,1 segundos de duracion y la potencia que oscila entre 350 y 700 mW. La potencia utilizada se determina por la capacidad del laser para producir una ampolla y una pequena hemorragia bajo la potencia elegida. Si no se observa hemorragia, un punto de laser adicional sera colocado adyacente al primer lugar siguiendo el mismo proceso laser. 30 Fotograffas en color y angiograffa con fluorescema se utilizan normalmente para detectar y medir el alcance y la

permeabilidad de la CNV. Sin embargo, se puede utilizar cualquier metodo capaz de medir la CNV inducida por laser y sus efectos asociados.

Examenes oculares

Los ojos de los animales se comprueban en cuanto al defecto pupilar aferente y luego se dilatan con hidrocloruro de 35 fenilefrina al 2,5% y tropicamida al 0,8%. Los dos ojos se examinan mediante biomicroscopfa con lampara de hendidura y oftalmoscopia indirecta los dfas 0, 14, 28, 42 y 56 (antes de la inyeccion de anticuerpos); los dfas 1, 15, 29, 43 y 57 (despues de la inyeccion); el dfa 21 (antes del laser); los dfas 35 y 49 (dfas intermedios); y el dfa 63 (enucleacion y muerte).

Fotograffa en color y angiograffa con fluorescema

40 La fotograffa del fondo se realiza normalmente en todos los animales en los mismos dfas que el examen ocular. Las

fotograffas pueden ser obtenidas con una camara de fondo de ojo (Canon Fundus CF-60Z, Canon USA Inc, Lake Success, NY) y peffcula de 35 mm, pero se puede utilizar cualquier dispositivo fotografico.

Se puede utilizar el Sistema de Angiograffa Imagenet Digital (Topcon 501 A y sistema Imagenet; Topcon America Corp, Paramus, NJ) para la angiograffa con fluorescema. Tfpicamente se obtienen fotograffas libres de color rojo de 45 ambos ojos seguido por la angiograffa con fluorescema utilizando 0,1 mL/ kg de peso corporal de fluorescema sodica al 10% (Akorn Inc, Abita Springs, La) a una velocidad de 1 mL/s. Despues de la inyeccion de fluorescema, se obtiene una rapida serie de imagenes en el primer minuto del polo posterior, primero del ojo derecho y despues del ojo izquierdo. Pares adicionales de imagenes se obtienen ffpicamente en aproximadamente 1 a 2 y 5 minutos. Entre 2 y 5 minutos, se toman de cada uno de los ojos dos imagenes de los campos de la periferia media (temporal y 50 nasal). La angiograffa con fluorescema se realiza al inicio del estudio (dfa 0) y los dfas 7, 14, 29, 42, 49, 57 y 63.

Analisis de datos oftalmicos

Fotograffas y angiograffas se evaluan para la evidencia de fugas angiograficas, hemorragias o cualquier otra anomaffa. Las hemorragias del fondo de ojo se clasifican sobre la base de un sistema de clasificacion con hemorragias de la retina que implica menos de 3 areas de disco se definen como de grado 1, hemorragias entre las 55 zonas 3 y 6 de disco se definen como de grado 2 y hemorragias de mas de 6 areas de disco se definen como de grado 3. Tambien se evalua la asociacion de hemorragias con membranas de la CNV o el sitio de induccion laser.

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Un sangrado clmicamente significativo se define como cualquier hemorragia del fondo de ojo mayor que o igual a un area de 6 discos.

La inflamacion ocular tambien se evaluo mediante una biomicroscop^a con lampara de hendidura. Celulas de la camara anterior y vftreas se cuentan con una lampara de hendidura de 2 mm a una gran ampliacion y se clasifican utilizando el esquema de la Academia Americana de Oftalmologfa. Las lesiones de la CNV se califican mediante la revision de las angiograffas con fluorescema realizadas los dfas 35, 42, 49, 56 y 63 por examinadores experimentados, ffpicamente dos, quienes clasifican mediante opinion de consenso. Las lesiones de la CNV se clasifican de acuerdo con el siguiente esquema, utilizando angiograffas estandarizadas para la comparacion. Lesiones de grado 1 no tienen hiperfluorescencia. Lesiones de grado 2 exhiben hiperfluorescencia sin fugas. Lesiones de grado 3 muestran hiperfluorescencia en las imagenes de principios o mediados de transito y fugas tardfas. Lesiones de grado 4 muestran una hiperfluorescencia brillante en el transito y fugas tardfas mas alla de las areas tratadas. Lesiones de grado 4 se definen como clmicamente significativas.

El analisis estadfstico se puede realizar utilizando los Datos del Panel Agregados en la Poblacion con Ecuaciones de Estimacion Generalizadas y la relacion de tasas de incidencia (IRR). La tasa de incidencia se define habitualmente como el numero de lesiones de grado 4 que se producen durante un intervalo dado, dividido por el numero total de lesiones inducidas. En la fase 1, la IRR se refiere a la relacion de la tasa de incidencia de lesiones de grado 4 en los ojos de prevencion a la tasa de incidencia en los ojos de control. Una IRR de 1 significa que no hay diferencia entre las tasas de incidencia. Un numero mucho mas pequeno que 1 indica una reduccion en la incidencia de lesiones de grado 4 en el grupo de prevencion frente al grupo de control. En la fase 2, se compara la incidencia de lesiones de grado 4 en los ojos de control frente a los ojos de tratamiento. Esto significa que la incidencia de lesiones de grado 4 se compara a lo largo del tiempo en el conjunto de ojos que se asignan primero al grupo control, pero los dfas 42 y 56 se tratan con anticuerpos y se convierten en los ojos de tratamiento.

Rastreo de agentes de utiles en el tratamiento de amd

El estudio y tratamiento de la degeneracion macular relacionada con la edad (AMD) pueden llevarse a cabo utilizando un nuevo modelo animal, que comprende ratones deficientes ya sea en protema quimiotactica de monocitos-1 (Ccl-2, tambien conocida como MCP-1) o su receptor 2 de quimioquinas C-C cognatas (Ccr-2) (Ambati, J. et al. Nat Med. noviembre de 2003; 9 (11): 1390-7. Epub 19 de octubre de 2003). Estos ratones desarrollan caractensticas cardinales de AMD, incluyendo acumulacion de lipofuscina en y drusas debajo del epitelio pigmentado de la retina (RPE), la atrofia de los fotorreceptores y la neovascularizacion coroidea (NVC).

El tratamiento de estos ratones con un agente deseado puede permitir la evaluacion de la eficacia de un agente por su eficacia en el tratamiento de AMD.

Realizaciones preferidas:

1. Un metodo para prevenir o mejorar una enfermedad ocular en un sujeto, que comprende la etapa de administrar un inhibidor de la via del complemento a un sujeto en necesidad de tal administracion.

2. El metodo del punto 1, en el que la via del complemento es la via alternativa del complemento.

3. El metodo de acuerdo con el punto 1, en el que la enfermedad ocular se selecciona del grupo que consiste en degeneracion de la retina, retinopaffa diabetica y angiogenesis ocular.

4. El metodo de acuerdo con el punto 3, en el que el sujeto requiere la inhibicion de la neovascularizacion ocular que afecta a la coroides, el epitelio pigmentado de la retina o tejido de la retina.

5. El metodo de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1-4, en el que el inhibidor de la via del complemento es un anticuerpo, una protema, un peptido, un peptidomimetico o una molecula pequena.

6. El metodo de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1-4, en el que el inhibidor de la via del complemento es Factor H o un peptido funcional de la misma.

7. El metodo de acuerdo con el punto 1, en el que el inhibidor de la via del complemento es un anticuerpo o un fragmento de union del mismo.

8. El metodo de acuerdo con el punto 7, en el que el inhibidor del complemento es un fragmento de anticuerpo que comprende un Fab, Fab', F(ab')2, Fv, o un Fv de cadena sencilla.

9. El metodo de acuerdo con el punto 7, en el que el inhibidor del complemento es un anticuerpo de dominio unico.

10. El metodo de acuerdo con el punto 7, en el que el inhibidor del complemento es un anticuerpo monoclonal.

11. El metodo de acuerdo con el punto 7, en el que el inhibidor del complemento es un anticuerpo quimerico, desinmunizado, humanizado, humano o primatizado.

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12. El metodo de acuerdo con el punto 7, en el que el anticuerpo se une espedficamente a un componente de la v^a alternativa del complemento.

13. El metodo de acuerdo con el punto 12, en el que el anticuerpo se une espedficamente al factor D, properdina, Factor B, Factor Ba o Factor Bb.

14. El metodo de acuerdo con el punto 13, en el que el anticuerpo se une espedficamente al factor D.

15. El metodo de acuerdo con el punto 14, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal 166-32 producido a partir del hibridoma depositado en la ATCC y designado HB12476.

16. El metodo de acuerdo con el punto 14, en el que el anticuerpo se une espedficamente al mismo epftopo que el anticuerpo monoclonal 166-32 producido a partir del hibridoma depositado en la ATCC y designado HB12746.

17. El metodo de acuerdo con el punto 14, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humanizado derivado 166-32 producido a partir del hibridoma depositado en la ATCC y designado HB12746.

18. El metodo de acuerdo con el punto 7, en el que el anticuerpo se une espedficamente a un componente de la via clasica o del complemento de lectina.

19. El metodo de acuerdo con el punto 18, en el que el anticuerpo se une espedficamente a C2, C2a, C3a, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9 o C5b-9.

20. El metodo de acuerdo con el punto 18, en el que el anticuerpo se une espedficamente al componente C5a del complemento.

21. El metodo de acuerdo con el punto 20, en el que el anticuerpo es 137-26 producido a partir del hibridoma depositado en la ATCC y designado PTA-3650.

22. El metodo de acuerdo con el punto 20, en el que el anticuerpo se une al mismo epftopo que 137-26 producido a partir del hibridoma depositado en la ATCC y designado PT-3650.

23. El metodo de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1-22, en el que el inhibidor de la via del complemento se administra por (a) administracion parenteral, administracion oral, administracion enteral o administracion topica (b) implante de liberacion sostenida bioerosionable o biocompatible; (c) la implantacion de una bomba de infusion; o (d) la administracion local tal como la administracion intravttrea o administracion subconjuntival.

24. El metodo de acuerdo con el punto 23, en el que la administracion topica es una disolucion de lavado de ojos, una pomada para los ojos, un protector de ojos o un colirio en solucion.

25. El metodo de acuerdo con el punto 23, que comprende, ademas, la etapa de administrar un compuesto inmunomodulador o inmunosupresor a dicho sujeto.

26. Un metodo para inhibir la activacion de la via alternativa del complemento en un sujeto que tiene una enfermedad ocular, que comprende administrar un ARNsi espedfico para una protema de la via del complemento.

27. Un metodo para inhibir la activacion de la via alternativa del complemento en un paciente que tiene una enfermedad ocular, que comprende administrar un acido nucleico que codifica un inhibidor de la via del complemento.

Claims (18)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   REIVINDICACIONES

   1. Un inhibidor del complemento para uso en un metodo para el tratamiento de una enfermedad ocular asociada con la activacion del complemento de un sujeto, en donde el inhibidor del complemento es un anticuerpo o un fragmento de union a antigeno del mismo o un acido nucleico que codifica el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno, en donde el anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo se une espedficamente a Factor D, y en donde la enfermedad ocular es degeneracion macular relacionada con la edad (AMD).
2. 2. El inhibidor del complemento para uso de la reivindicacion 1, en donde el fragmento de union a antigeno comprende un Fab, Fab', F(ab')2, Fv, un Fv de cadena sencilla, diacuerpo o un anticuerpo de dominio sencillo.
3. 3. El inhibidor del complemento para uso de la reivindicacion 1, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimerico, un anticuerpo desinmunizado, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo primatizado o un anticuerpo humano.
4. 4. El inhibidor del complemento para uso de la reivindicacion 1, en donde el anticuerpo o el fragmento de union a antigeno del mismo esta conjugado con un resto terapeutico.
5. 5. El inhibidor del complemento para uso de la reivindicacion 1, en donde el anticuerpo es el anticuerpo monoclonal 166-32 producido a partir del hibridoma depositado ante la ATCC y designado HB 12476.
6. 6. El inhibidor del complemento para uso de la reivindicacion 1, en donde el anticuerpo se une espedficamente al mismo epftopo que el anticuerpo monoclonal 166-32, y en donde el anticuerpo monoclonal 166-32 se produce a partir del hibridoma depositado ante la ATCC y designado HB 12476.
7. 7. El inhibidor del complemento para uso de la reivindicacion 1, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humanizado, derivado del anticuerpo monoclonal 166-32, y en donde el anticuerpo monoclonal 166-32 se produce a partir del hibridoma depositado ante la ATCC y designado HB 12476.
8. 8. Una composicion farmaceutica que comprende el inhibidor del complemento segun se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 y un diluyente o soporte farmaceuticamente aceptable, en donde la composicion es para uso en un metodo para el tratamiento de una enfermedad ocular asociada con la activacion del complemento en un sujeto, y en donde la enfermedad ocular es degeneracion macular relacionada con la edad (AMD).
9. 9. La composicion para uso de la reivindicacion 8, que es una forma de administracion intraocular, una forma de administracion intravitreal, una forma de administracion subconjuntival, una forma de administracion parenteral, una forma de administracion intradermica, una forma de administracion intramuscular, una forma de administracion intraperitoneal, una forma de administracion intravenosa, una forma de administracion subcutanea, una forma de administracion intranasal, una forma de administracion oral, una forma de administracion enteral, una forma de administracion topica, una forma de administracion intratecal, una forma de administracion intraventricular, una forma epidural, una forma de inhalacion, un implante de liberacion sostenida biocompatible o bioerosionable o una bomba de infusion implantada.
10. 10. La composicion para uso de la reivindicacion 8, que es una disolucion de lavado de ojos, una pomada para los ojos, un protector de ojos o un colirio en solucion.
11. 11. La composicion para uso de la reivindicacion 8, que comprende, ademas, o es para la administracion con un compuesto inmunomodulador, un compuesto inmunosupresor, un compuesto anti-inflamatorio o un compuesto anti- angiogenico.
12. 12. La composicion para uso de la reivindicacion 8, que comprende, ademas, o es para la administracion con un esteroide.
13. 13. La composicion para uso de la reivindicacion 8, en donde el inhibidor del complemento esta en una cantidad entre 0,1 mg/kg y 100 mg/kg del peso corporal del sujeto.
14. 14. Un inhibidor del complemento para uso en un metodo para el tratamiento de una enfermedad ocular asociada con la activacion del complemento en un sujeto, en donde el inhibidor del complemento es

    (i) un anticuerpo monoclonal 166-32 producido a partir del hibridoma depositado ante la ATCC y designado HB 12476 o un fragmento de union a antfgeno del mismo,

    (ii) un anticuerpo que se une espedficamente al mismo epftopo que el anticuerpo monoclonal 166-32 o a un fragmento de union a antfgeno del mismo, o

    (iii) un anticuerpo humanizado derivado del anticuerpo monoclonal 166-32 o un fragmento de union a antfgeno del mismo,

    y en donde la enfermedad ocular es la degeneracion macular relacionada con la edad (AMD).
15. 15. Uso de un inhibidor del complemento para la preparacion de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad ocular asociada con la activacion del complemento en un sujeto, en donde el inhibidor del complemento es un anticuerpo o un fragmento de union a antigeno del mismo que se une espedficamente a Factor D, o un acido nucleico que codifica dicho anticuerpo o el fragmento de union a antigeno, y en donde la enfermedad ocular es la

    5 degeneracion macular relacionada con la edad (AMD).
16. 16. El uso de la reivindicacion 15, en donde el anticuerpo es anticuerpo monoclonal 166-32 producido a partir del hibridoma depositado ante la ATCC y designado HB 12746.
17. 17. El uso de la reivindicacion 15, en donde el anticuerpo se une espedficamente al mismo epftopo que el anticuerpo monoclonal 166-32 producido a partir del hibridoma depositado ante la ATCC y designado HB 12746.

    10 18. El uso de la reivindicacion 15, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humanizado derivado del anticuerpo

    monoclonal 166-32 producido a partir del hibridoma depositado ante la ATCC y designado HB 12746.
18. 19. El inhibidor del complemento para uso de la reivindicacion 1, la composicion para uso de la reivindicacion 8 o el uso de la reivindicacion 15, en donde la degeneracion macular es la forma seca de degeneracion macular relacionada con la edad.

    15 20. El inhibidor del complemento para uso de la reivindicacion 1, la composicion para uso de la reivindicacion 8, o el

    uso de la reivindicacion 15, en donde la degeneracion macular es la forma humeda de la degeneracion macular relacionada con la edad.