JP7261583B2

JP7261583B2 - 補体媒介性疾患を処置するための組成物及び方法

Info

Publication number: JP7261583B2
Application number: JP2018515539A
Authority: JP
Inventors: 宋文超; ガリパリ，ダモダル; 三輪隆史
Original assignee: ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア
Priority date: 2015-09-24
Filing date: 2016-09-23
Publication date: 2023-04-20
Anticipated expiration: 2036-09-23
Also published as: US20190177381A1; CN108291216A; RU2018114907A; CN108291216B; CN115976105A; JP2023139256A; JP2022000017A; US10988519B2; US20210171592A1; IL296929A; RU2018114907A3; HK1251482A1; WO2017053732A3; EP3359663A2; IL258024A; CA2999299A1; KR20180055872A; AU2016326627A1; EP3359663A4; AU2016326627B2

Description

連邦に資金提供される研究若しくは開発に関する声明
本発明は、米国立保健研究所（ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ）により与えられる助成金番号ＡＩ０８５５９６の下での政府支援を伴い生み出された。米国政府は本発明においてある種の権利を有する。

補体系は生体防御において重要な役割を演じる自然免疫の一部である。補体は３種の異なる経路すなわち古典的、代替及びレクチン経路により活性化され得る。それらのなかで、代替経路は、それが、補体が「遊転」機構により活性化される独立した経路を表すのみならず、しかしまたそれが他の２経路により開始される補体活性化を増幅する点において独特である。代替経路はＣ３、Ｂ因子（ｆＢ）、Ｄ因子（ｆＤ）及びプロパージン（ｆＰ）の参画を必要とする。全部の経路は、代替経路の増幅ループが活動し始めるＣ３活性化段階で収束する。どの経路の補体活性化が発生するかに関係なく、活性化された補体は３種類のエフェクター機能：食作用および排除を助長するためのＣ３ｂ／ｉＣ３ｂ／Ｃ３ｄでの標的のオプソニン作用、炎症前メディエーターＣ３ａ及びＣ５ａの産生、並びに、膜侵襲複合体（ＭＡＣ）としてもまた知られる終末補体活性化エフェクターＣ５ｂ－９による直接的細胞攻撃を生じる。Ｂ細胞及び濾胞樹状細胞上のＣＲ２のような補体受容体（ＣＲ）、並びにマクロファージ及び単球のような白血球上のアナフィラトキシン受容体Ｃ３ａ受容体（Ｃ３ａＲ）及びＣ５ａ受容体（Ｃ５ａＲ）の活性化により、補体はまた適応免疫系と相互作用およびこれを交差調節もし、そして従ってＢ及びＴ細胞免疫学において調節性の役割を演じる。

多数のヒト疾患が補体調節不全により引き起こされ、補体媒介性の自己組織傷害をもたらす。補体調節不全は、これらの調節物質がもはや正常に機能しないような、補体調節物質若しくは調節物質関連遺伝子中の体細胞性若しくは生殖系列性いずれかの変異から生じうる。この分類の例は、ＧＰＩアンカー生合成における重要な酵素をコードするＰＩＧ－Ａ遺伝子の造血幹細胞中の変異を包含し、そして、こうした変異は、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）患者の血液細胞上のＤＡＦ及びＣＤ５９の発現の欠如をもたらす。結果として、ＰＮＨ患者の赤血球及び血小板は補体攻撃から保護されず、そしてそれらは血管内溶血及び血小板活性化を発生し、貧血及び血栓性発作に至る。第２の一例は、腎における補体の代替経路の過剰活性化をなす膜調節物質ＭＣＰ又は液相調節物質ｆＨ若しくはｆＩ中の変異であり、Ｃ３糸球体腎症若しくは非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）の発病に至る。ＤＡＦ、ＣＤ５９、ｆＨ、ｆＩ及びＭＣＰの発現の非存在若しくは機能障害に至るこうした希少かつ高浸透性の変異に加え、より高頻度かつより低浸透性であるがしかしにもかかわらず補体媒介性の機構を介して疾患の発病に寄与することが同定されているｆＨ中の一塩基多型（ＳＮＰ）が存在する。非常に良好に特徴づけられている一例は、ｆＨ中のＹ４２０Ｈ多型の加齢黄斑変性（ＡＭＤ）との強い関連である。従って、補体調節物質の機能障害若しくは配列の変動は普遍的な及び稀なヒト疾患につながりうる。

補体調節不全は、調節性変異／多型からのみならず、しかしまた、代替経路の極めて重要な成分すなわちＣ３及びｆＢをコードする遺伝子中の変異から、並びにｆＨ、Ｃ３若しくはｆＢのような調節物質若しくは補体タンパク質に対する自己抗体の存在によっても生じうる。Ｃ３若しくはｆＢ中のある種の変異が、活性化される場合に調節性タンパク質による調節に抵抗性である異常に安定な代替経路Ｃ３転換酵素Ｃ３ｂＢｂを形成するタンパク質をもたらすことができ、それが順に補体調節不全及び過剰活性化につながり得ることが、今や理解されている。補体調節物質に対する自己抗体の場合、それらはこうしたタン
パク質をコードする遺伝子中の変異をしばしば模倣し、その結果は液相中若しくは細胞表面上のこうしたタンパク質の低下された機能的効力である。独立して、Ｃ３腎炎因子（Ｃ３ｎｅｆ）と呼ばれるＣ３ｂに対する自己抗体は、代替経路Ｃ３転換酵素Ｃ３ｂＢｂを結合かつ安定化することが可能であり、従って、Ｃ３若しくはｆＢ遺伝子変異により生じられるものと同一の転換酵素の半減期の延長及び活性の効果を達成する。全体として、補体活性化カスケードの調節不全から生じる過度の補体活性化により引き起こされる普遍的及び希少ヒト疾患が存在する。補体調節不全の基礎機構は多様であり、一部は遺伝子変異にかつ他者は自己抗体により、そして自己抗体の変異遺伝子若しくは標的は代替経路の調節タンパク質若しくは成分であり得る。

現在の治療アプローチは、特定の代替経路若しくは終末経路補体成分を結合かつ阻害するｍＡｂ、ペプチド若しくは他の小分子のような試薬の開発に集中されている。臨床で検証された一例は、エクリズマブすなわちＰＮＨ及びａＨＵＳの処置のため承認された補体Ｃ５に対するヒト化ｍＡｂである。記述されている他のアプローチは、ｆＢ、ｆＤ若しくはｆＰに対するｍＡｂ、及びＣ３を結合かつ阻害する環状ペプチドを包含する。これらのアプローチの限界は、それらが患者の頻回のかつ不便なＩＶ投与を必要とすることである。さらに、それらは代替経路若しくは終末経路を阻害するため、それらは生体防御を損なうという危険を冒す。実際、エクリズマブ治療中の患者は、致死性の髄膜炎を引き起こす細菌株に対しワクチン接種されなければならず、そしてこれらの患者は、承認されたｍＡｂ薬で処置される前に予防的抗生物質治療もまた処方される。

他のアプローチにおいて、可溶性ＤＡＦ、ＣＲ１、ＣＲＩｇのような組換え調節タンパク質、並びにｆＨの最小ドメインを含んでなるタンパク質（Ｎ末端ショートコンセンサスリピート［ＳＣＲ］１－５及びＣ末端ＳＣＲ１９－２０）若しくはｆＨとＣＲ２の間の融合タンパク質（ＴＴ３０）が試験されている。例えば、特許文献１；特許文献２を参照されたい。しかしながら、治療薬としてのこうしたタンパク質の大スケールの異種発現は多大な労力を必要とし、また、動物研究は投与後のそれらのｉｎｖｉｖｏ消失速度が迅速であることを示しており（非特許文献１；非特許文献２）、こうした治療戦略を厄介かつより少なく現実的にする。こうしたタンパク質薬物の複数のかつ頻繁な投与が必要となろうからである。

より大きいかつより長期間持続する有効性を伴う、補体媒介性疾患を処置するのに有用な組成物に対する必要性が当該技術分野において今も存在する。

米国特許公開第２０１３／０２９６２５５号明細書米国特許公開第２００８／０２２１０１１号明細書

ＮｉｃｈｏｌｓＥＭ，ＢａｒｂｏｕｒＴＤ，ＰａｐｐｗｏｒｔｈＩＹ，ＷｏｎｇＥＫ，ＰａｌｍｅｒＪＭ，ＳｈｅｅｒｉｎＮＳ，ＰｉｃｋｅｒｉｎｇＭＣ，ＭａｒｃｈｂａｎｋＫＪ．ＫｉｄｎｅｙＩｎｔ．２０１５Ｊｕｌ２９．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｋｉ．２０１５．２３３．Ｆｒｉｄｋｉｓ－ＨａｒｅｌｉＭ，ＳｔｏｒｅｋＭ，ＭａｚｓａｒｏｆｆＩ，ＲｉｓｉｔａｎｏＡＭ，ＬｕｎｄｂｅｒｇＡＳ，ＨｏｒｖａｔｈＣＪ，ＨｏｌｅｒｓＶＭ，Ｂｌｏｏｄ．２０１１Ｏｃｔ２７；１１８（１７）：４７０５－１３．ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ－２０１１－０６－３５９６４６．Ｅｐｕｂ２０１１Ａｕｇ２２．

［発明の要約］
一局面において、本発明は、その発現を指図する発現制御配列に操作可能に連結されている人工改変されたヒト補体調節物質Ｈ因子（ｆＨ）遺伝子を含んでなる発現カセットをその中にパッケージングしている組換えベクターを提供し、前記ｈｆＨ遺伝子は補体調節機能を保持する可溶性ｈｆＨタンパク質バリアントをコードし、前記ｆＨバリアントは、ショートコンセンサスリピート（ＳＣＲ）１、２、３、４、１９及び２０と、ＳＣＲ７、ＳＣＲ１７及び／ＳＣＲ１８のうち最低１種とを含んでなり、被験体への該ベクターの投与及び発現後に、ｈｆＨバリアントの検出可能な血漿レベルが被験体で最低１週間存在する。

別の局面において、本発明は、その発現を指図する発現制御配列に操作可能に連結されている人工改変されたヒト補体調節物質Ｈ因子（ｆＨ）遺伝子を含んでなる発現カセットをその中にパッケージングしている組換えＡＡＶベクターを提供し、前記ｈｆＨ遺伝子は補体調節機能を保持する可溶性ｈｆＨタンパク質バリアントをコードし、前記ｆＨバリアントは、ショートコンセンサスリピート（ＳＣＲ）１、２、３、４、１９及び２０を含んでなり、被験体への該ベクターの投与及び発現後に、ｈｆＨバリアントの検出可能な治療上有用な血漿レベルが被験体で最低約１か月間存在する。

さらなる一局面において、担体及び／又は賦形剤、並びにｆＨバリアントを発現する本明細書に記述されるところの組換えベクターを含んでなる医薬組成物が提供される。

なお別の局面において、本明細書に記述されるところのベクターを被験体に送達することによる補体関連障害の処置方法が提供される。補体関連障害は、とりわけ、膜性増殖性糸球体腎炎、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、微小血管症性溶血性貧血、血小板減少症、急性腎不全、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、統合失調症、虚血性脳卒中、及び／又は細菌性病原体の動員により引き起こされる細菌感染症でありうる。

さらなる一局面において、ＡＭＤを処置するための組換えベクターの使用が提供される。別の局面において、ＰＮＨ、ａＨＵＳ、若しくは別の補体関連障害を処置するためのｒＡＡＶベクターの使用が記述される。

別の局面において、リーダー配列、並びに：（ａ）ＳＣＲ１－４、７及び１９－２０；（ｂ）ＳＣＲ１－４、６、７及び１９－２０；（ｃ）ＳＣＲ１－４、７、８及び１９－２０；（ｄ）ＳＣＲ１－４、６、７、８及び１９－２０；（ｅ）ＳＣＲ１－４、１７及び１９－２０；（ｆ）ＳＣＲ１－４及び１８－２０；（ｇ）ＳＣＲ１－４及び１７－２０よりなるヒト補体受容体ＳＣＲを含んでなる、人工改変されたｈｆＨバリアントが提供される。他の態様は、例えば、ＳＣＲ１－４、７及び１８－２０；ＳＣＲ１－４、６、７及び１８－２０；ＳＣＲ１－４、７、８及び１８－２０；若しくはＳＣＲ１－４、６、７、８及び１８－２０、ＳＣＲ１－４、７及び１７－２０；ＳＣＲ１－４、６、７及び１７－２０；ＳＣＲ１－４、７、８及び１７－２０；若しくはＳＣＲ１－４、６、７、８及び１７－２０を包含する。場合によっては、最低１個の糖鎖付加部位がＳＣＲの最低１個中に人工改変される。別の局面において、人工改変されたｈｆＨバリアントの１種がペグ化される。

なお別の局面において、最低１種類の人工改変されたｈｆＨバリアント、担体及び／又は賦形剤を含んでなる医薬組成物が提供される。こうした組成物は、それ自体で、若しくは別の治療、具体的には例えば本明細書に記述されるベクター治療との組合せで使用しうる。

本発明の他の局面及び利点は、本発明の以下の詳細な記述から容易に明らかであることができる。

成熟ヒトＨ因子タンパク質のドメイン構造の図解を提供する。リーダーペプチドの核酸及びアミノ酸配列を提供し、かつ、下の実施例で具体的に説明されるｆＨバリアントの生成において使用される２０種のショートコンセンサスリピート（ＳＣＲ）ドメインの場所を同定する。配列番号１は該核酸配列を提供し；配列番号２はシグナルペプチドのアミノ酸配列を提供する。ＳＣＲ１－２０のアミノ酸配列は、配列番号３（ＳＣＲ１）、５（ＳＣＲ２）、７（ＳＣＲ３）、９（ＳＣＲ４）、１１（ＳＣＲ５）、１３（ＳＣＲ６）、１４（ＳＣＲ７）、１６（ＳＣＲ８）、１７（ＳＣＲ９）、１９（ＳＣＲ１０）、２１（ＳＣＲ１１）、２３（ＳＣＲ１２）、２５（ＳＣＲ１３）、２７（ＳＣＲ１４）、２９（ＳＣＲ１５）、３１（ＳＣＲ１６）、３３（ＳＣＲ１７）、３５（ＳＣＲ１８）、３７（ＳＣＲ１９）及び３８（ＳＣＲ２０）にそれぞれ提供される。ｆＨアイソフォーム１中のこれらのドメインの場所は、Ｃ．Ｅｓｔａｌｌｅｒら、ＥｕｒＪＩｍｍｕｎｏｌ．１９９１Ｍａｒ；２１（３）：７９９－８０２に記述される規約に基づく。定義されるＳＣＲ間のアミノ酸配列はｆＨの柔軟性を提供するリンカー配列である［それぞれ配列番号４、６、８、１０、１２、１５、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４及び３６］］。ＳＣＲ１９とＳＣＲ２０の間のリンカーはわずか３アミノ酸（Ｌｅｕ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）であり、そして従って配列表中で特徴により生成されない。ＳＣＲ１－４、６－８及び１９－２０を含有するヒトＨ因子バリアントの図解のドメイン構造を提供する。ｆＨバリアントＳＣＲ１－４、６－８及び１９－２０のリーダーペプチド及び９種のショートコンセンサスリピート（ＳＣＲ）ドメインの核酸［配列番号４１のｎｔ５３－１８０４］及びアミノ酸配列［配列番号４２］を提供する。リーダーペプチド並びにＳＣＲ１－４、６－８及び１９－２０を含有するヒトＨ因子短縮化構築物（ｈｆＨ１－４．６７８．１９－２０）の完全なｃＤＮＡ［配列番号４１のｎｔ５３－１８０４］並びに５’－［配列番号４１のｎｔ１－５２］及び３’－ＵＴＲ［配列番号４１のｎｔ１８０５－２０６８］である。リーダーペプチド（下線）及びＳＣＲ１－４、６－８、１９－２０を含有するＨ因子短縮化構築物（ｈｆＨ１－４．６７８．１９－２０）のアミノ酸配列である［配列番号４２］。ｈｆＨ１－４．６７８．１９－２０のタンパク質発現及び安定性の確認を提供するゲルである。ＳＣＲ１－４、６－８及び１９－２０を含有するヒトｆＨ短縮化バリアント［配列番号４１］の図２に示されるｃＤＮＡ配列を真核生物発現ベクター中にクローン化し、それをその後使用してＨＥＫ細胞をトランスフェクトした。細胞培養物上清をウエスタンブロット分析に使用して切断型ｆＨタンパク質発現を検出した。パネルＡ：レーン１、トランスフェクトされないＨＥＫ細胞；レーン２及び３、ｆＨ短縮化バリアントのｃＤＮＡを含有するｐＣＭＶＳｐｏｒｔ６ベクターでトランスフェクトされたＨＥＫ細胞；レーン４－６、ｆＨバリアントｃＤＮＡを含有するｐＣＢＡＲＢＧベクターでトランスフェクトされたＨＥＫ細胞。ｐＣＢＡＲＢＧベクターは、図４に示されるｐＡＡＶベクター構築物と同一の５’及び３’調節エレメントを含有する。パネルＢ：レーン１、トランスフェクトされないＨＥＫ細胞；レーン２、対照として切断型ｆＨバリアントのｃＤＮＡを含有するｐＣＢＡＲＧベクターでトランスフェクトされたＨＥＫ細胞；レーン３、切断型ｆＨバリアントのｃＤＮＡを含有するＡＡＶ８プラスミドでトランスフェクトされたＨＥＫ細胞。組換えｈｆＨ１－４．６７８．１９－２０の精製を示すＳＤＳゲルである。ＳＤＳゲル分析は、ｐＣＢＡＲＢＧベクターを使用してＨＥＫ細胞をトランスフェクトすることにより発現されたＳＣＲ１－４、６－８及び１９－２０を含有するヒトｆＨ短縮化バリアントのクマシーブルー染色を介して実施した。該組換えｆＨ短縮化タンパク質は、ＳＣＲ２－３中の１エピトープを認識するヒトＨ因子に対するｍＡｂ（クローンＯＸ－２３）を使用して製造されたアフィニティーカラムを通過させることにより上清から精製した。タンパク質分子量マーカーのサイズと位置を左側に示す。組換えｈｆＨ１－４．６７８．１９－２０が補体調節活性（補助因子活性）を保持することを示すゲルである。ＳＣＲ１－４、６－８及び１９－２０を含有するヒトｆＨ短縮化バリアントを、Ｉ因子に媒介されるＣ３ｂ切断のための補助因子活性について試験した。このアッセイのため、ヒトＣ３ｂを、完全長ｆＨ（ｈｆＨ）若しくは切断型ｆＨバリアント（ｈｆＨ１－４．６７８．１９－２０）の存在（レーン１－６）若しくは非存在（レーン７）下でＩ因子と混合した。反応混合物をインキュベートし、そしてその後ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット分析により分析した。補助因子活性はｉＣ３ｂ α鎖フラグメントの出現により示される。組換えｈｆＨ１－４．６７８．１９－２０（四角、上の線）が強いヘパリン結合活性を有することを示す線グラフである。ＳＣＲ１－４、６－８及び１９－２０を含有するヒトｆＨ短縮化バリアントはヘパリン結合活性を保持する。そのヘパリン結合活性は用量依存性であり、そしてμｇ／ｍｌに基づき完全長ヒトｆＨ（菱形、下の線）と比較した場合、それはより高い活性を示した。ヘパリン結合活性は、プレート被覆されたヘパリン、完全長若しくは切断型ｆＨタンパク質溶液のオーバーレイ、及び洗浄後にｍＡｂＯＸ－２３（ＳＣＲ２－３中の１エピトープに対する）による結合されたｆＨ若しくは切断型ｆＨの検出を使用するＥＬＩＳＡにより評価した。組換えｈｆＨ１－４．６７８．１９－２０（正方形、上の線）が強いＣ３ｂ結合活性を有することを示す線グラフである。ＳＣＲ１－４、６－８及び１９－２０を含有するヒトｆＨ短縮化バリアントはＣ３ｂ結合活性を保持する。そのＣ３ｂ結合活性は用量依存性であり、そしてμｇ／ｍＬに基づき完全長ヒトｆＨ（菱形、下の線）と比較した場合、それはより高い活性を示した。Ｃ３ｂ結合活性は、プレート被覆されたＣ３ｂ、完全長若しくは切断型ｆＨタンパク質溶液のオーバーレイ、及び洗浄後にｍＡｂＯＸ－２３（ＳＣＲ２－３中の１エピトープに対する）による結合されたｆＨ若しくは切断型ｆＨの検出を使用するＥＬＩＳＡにより評価した。ＡＡＶ８媒介性ｆＨ遺伝子治療１週後の３匹の異なるｆＨ変異体マウス（ｆＨ^m/m；Ｆ１、Ｆ２、Ｆ２０）の血液中のｈｆＨ１－４．６７８．１９－２０のＥＬＩＳＡ検出を示す線グラフである。ｆＨ^m/mマウスはＳＣＲ１９の始めに未熟な終止コドンを有するｆＨ変異体マウスの一系統である。これらマウスは痕跡量の切断型ｆＨ（ＳＣＲ１９－２０を欠く）を産生し、そして液相代替経路補体活性化及び消費制御不全（二次的Ｃ３及びｆＢ欠乏症）を有する。マウスを、ｈｆＨ１－４．６７８．１９－２０（３×１０¹¹遺伝子コピー／マウス）を含有するＡＡＶ８ウイルスで後眼窩Ｉ．Ｖ．により感染させ、そして１週後に血液サンプルを収集しかつヒトｆＨタンパク質検出のため処理した。ＥＬＩＳＡアッセイのため、ｍＡｂＯＸ－２３を捕捉抗体（ヒトｆＨＳＣＲ２－３中の１エピトープを認識する）として使用し、そしてビオチニル化ｍＡｂＬ２０／３を検出抗体（ヒトｆＨＳＣＲ１９を認識する）として使用した。図に示されるとおり、ＡＡＶ－ｈｆＨ１－４．６７８．１９－２０処置前（Ｐｒｅ）に、３ｆＨ^m/mマウス（Ｆ１、Ｆ２、Ｆ２０）の血液中にｈｆＨ１－４．６７８．１９－２０は存在しないが、しかしｈｆＨ１－４．６７８．１９－２０は処置１週後（１Ｗ）に検出された。ｆＨ^m/mマウスにおけるＡＡＶ８媒介性のヒトｆＨ遺伝子治療が、十分な内因性マウスｆＨ発現の欠如により代替経路補体活性化を阻害し、処置されないｆＨ^m/mマウスは制御されない液相代替経路補体活性化を有し、そして結果としてそれらが血漿Ｃ３及びｆＢを消費する（ＷＴのレーン１を遺伝子治療前の３ｆＨ^m/mマウスのレーン２，４、６と比較されたい）ことを示すウエスタンブロット分析である。ｆＨ^m/mマウスをＡＡＶ８－ｈｆＨ１－４．６７８．１９－２０で処置した１週後、血漿Ｃ３及びｆＢレベルは処置前のレベルと比較して有意に増大し、ＡＡＶ８媒介性のヒトｆＨ遺伝子治療が制御されない代替経路補体活性化並びにＣ３及びｆＢ消費を阻害したことを示唆する。全３マウス（Ｆ１、Ｆ２及びＦ２０）が後眼窩Ｉ．Ｖ．を介してそれぞれ３×１０¹¹遺伝子コピーを受領した。ＳＣＲ１－４、６－８及び１７－２０を含有するヒトＨ因子バリアントの図解のドメイン構造を提供し、Ｎ－糖鎖付加部位の場所を矢印により具体的に説明する。ｆＨバリアントＳＣＲ１－４、６－８及び１７－２０のリーダーペプチド及び１１種のショートコンセンサスリピート（ＳＣＲ）ドメインの核酸及びアミノ酸配列を提供する［それぞれ配列番号４５及び４６］。リーダーペプチド並びにＳＣＲ１－４、６－８及び１７－２０を含有するヒトＨ因子バリアント（ｈｆＨ１－４．６７８．１７－２０）の完全なｃＤＮＡおよび５’ＵＴＲ配列である（５’ＵＴＲは大文字である）［配列番号４７］。リーダーペプチド（下線）並びにＳＣＲ１－４、６－８及び１７－２０を含有するＨ因子短縮化構築物（ｈｆＨ１－４．６７８．１７－２０）のアミノ酸配列である［配列番号４８］。変動する用量のＡＡＶ８－ｈｆＨ１－４．６７８．１７－２０で処置された３ｆＨ変異体マウスの血漿中のｈｆＨ１－４．６－８．１７－２０タンパク質のＥＬＩＳＡ検出を示す。ｆＨ^m/mマウスはＳＣＲ１９の始めに未成熟な終止コドンを有するｆＨ変異体マウスの一系統である。これらマウスは痕跡量の切断型ｆＨ（ＳＣＲ１９－２０を欠く）を産生し、そして液相代替経路補体活性化及び消費制御不全（二次的Ｃ３及びｆＢ欠乏症）を有する。マウスを、３つの用量すなわちそれぞれ１×１０¹²遺伝子コピー（ＧＣ）／マウス、３×１０¹¹ＧＣ／マウス及び１×１０¹¹ＧＣ／マウスのｈｆＨ１－４．６７８．１７－２０を含有するＡＡＶ８ウイルスで後眼窩Ｉ．Ｖ．により感染させた。血漿サンプルを、ＡＡＶ処置前（Ｐｒｅ）又はＡＡＶ処置後１週（Ｗ１）、２週（Ｗ２）、１か月（Ｍ１）、２か月（Ｍ２）若しくは３か月（Ｍ３）にＥＬＩＳＡアッセイのため回収した。ＥＬＩＳＡアッセイのため、ｍＡｂＯＸ－２３を捕捉抗体（ヒトｆＨＳＣＲ２－３中の１エピトープを認識する）として使用し、かつ、ビオチニル化ｍＡｂＬ２０／３を検出抗体（ヒトｆＨＳＣＲ１９を認識する）として使用した。図に示されるとおり、ＡＡＶ－ｈｆＨ１－４．６７８．１７－２０処置前（Ｐｒｅ）のｆＨ^m/mマウスの血液中にｈｆＨ１－４．６７８．１７－２０は存在しないが、しかし、高レベルのｈｆＨ１－４．６７８．１７－２０がＡＡＶ処置後に検出され、そしてｈｆＨ１－４．６７８．１７－２０発現は最低３か月間安定のままであった。ｆＨ^m/mマウスのＡＡＶ８－ｈｆＨ１－４．６７８．１７－２０遺伝子治療での処置が代替経路補体活性化を阻害することを示すウエスタンブロット分析である。十分な内因性マウスｆＨ発現の欠如により、処置されないｆＨ^m/mマウスは液相代替経路補体活性化制御不全を有し、そして結果として、それらは血漿Ｃ３及びｆＢを消費する（レーン１）。それぞれ１×１０¹²遺伝子コピー（ＧＣ）／マウス（図１６Ａ）、３×１０¹¹遺伝子コピー（ＧＣ）／マウス（図１６Ｂ）及び１×１０¹¹遺伝子コピー（ＧＣ）／マウス（図１６Ｃ）で後眼窩Ｉ．Ｖ．により処置された３ｆＨ^m/mマウスにおいて、代替経路補体活性化が、処置されたマウスをＡＡＶ８－ｈｆＨ１－４．６７８．１７－２０遺伝子治療後１週（Ｗ１）、１か月（Ｍ１）、２か月（Ｍ２）及び３か月（Ｍ３）で検査した場合に、血漿Ｃ３及びｆＢの対応する回復を伴い予防された。すべての処置投薬量及び時間点（レーン２、３、４、５）において、血漿Ｃ３及びｆＢは、ＡＡＶ８－ｈｆＨ１－４．６７８．１７－２０遺伝子治療後に処置前（Ｐｒｅ、レーン１）より顕著に高かった。マウスにおけるリーダーペプチド及び２０種のショートコンセンサスリピート（ＳＣＲ）ドメインの核酸及びアミノ酸配列［それぞれ配列番号７９及び８０］を示す。定義されるＳＣＲの間のアミノ酸配列はｆＨに柔軟性を与えるリンカー配列である。マウスｆＨバリアントのリーダーペプチド及び９種のショートコンセンサスリピート（ＳＣＲ）ドメインの核酸及びアミノ酸配列［それぞれ配列番号８１及び８２］を提供する。定義されるＳＣＲの間のアミノ酸配列はｆＨタンパク質に柔軟性を与えるリンカー配列である。マウスｆＨのこのバリアントを、後の研究においてｈｆＨ１－４．６７８．１９－２０のｉｎｖｉｖｏ機能を試験するための代理物として使用する。リーダーペプチド（下線）及びＳＣＲ１－４、６－８、１９－２０を含有するマウスＨ因子短縮化構築物（ｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０）のコーディング配列並びに５’及び３’－ＵＴＲ配列［配列番号４３］を提供する。リーダーペプチド（下線）並びにＳＣＲ１－４、６－８及び１９－２０を含有するマウスＨ因子短縮化構築物（ｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０）のアミノ酸配列［配列番号４４］を提供する。ｍｆＨ１－４．１９－２０及びｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０のタンパク質発現及び安定性の確認を示すゲルである。ＳＣＲ１－４、６７８及び１９－２０を含有するマウスｆＨ短縮化バリアントのｃＤＮＡ配列、若しくはＳＣＲ１－４及び１９－２０を含有する別のｆＨ短縮化バリアントのｃＤＮＡ配列を、真核生物発現ベクターｐＣＢＡＲＢＧにクローン化し、それをその後使用してマウス肝細胞株Ｈｅｐａ１Ｃ１Ｃ７細胞をトランスフェクトした。細胞培養物上清をウエスタンブロット分析に使用して切断型マウスｆＨタンパク質発現を検出した。Ｍ：分子量マーカー；レーン１、トランスフェクトされないＨｅｐａ１Ｃ１Ｃ７細胞（対照）；レーン２及び３、ｐＣＢＡＲＢＧ－ｍｆＨ１－４．１９－２０クローン３若しくはクローン４でトランスフェクトされたＨｅｐａ１Ｃ１Ｃ７細胞；レーン５及び６、ｐＣＢＡＲＢＧ－ｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０クローン１（センス）若しくはクローン２（アンチセンス）でトランスフェクトされたＨｅｐａ１Ｃ１Ｃ７細胞。血液サンプルをｆＨタンパク質検出のためどのように収集かつ処理したかを示すフローチャートである。ｆＨ^m/mマウスは、ＳＣＲ１９の始めに未熟な終止コドンを運搬するｆＨ変異体マウスの一系列である。これらマウスは痕跡量の切断型ｆＨ（ＳＣＲ１９－２０を欠く）を産生し、そして制御されない液相代替経路補体活性化及び消費（二次的Ｃ３及びｆＢ欠乏症）を有する。マウスをｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０を含有するＡＡＶ８ウイルス（３×１０¹²遺伝子コピー／マウス）で後眼窩Ｉ．Ｖ．により感染させ、そして１週後に、フローチャートに示されるとおり血液サンプルを収集し、処理しかつ分析した。ＡＡＶ８媒介性ｆＨ遺伝子治療１週後のｆＨ変異体マウス（ｆＨ^m/m）の血液中のｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０のウエスタンブロット検出である。図に示されるとおり、ＷＴ及び処置されないｆＨ^m/mマウスにｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０（およそ７０ｋｄ）が存在しなかった。３匹のウイルスに感染させたｆＨ^m/mマウスＭ３、Ｆ１０、Ｆ３０（Ｍは雄性を示しかつＦは雌性を示す）において、ｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０が明確に検出された。ｆＨ^m/mマウスにおけるＡＡＶ８媒介性ｆＨ遺伝子治療が代替経路補体活性化制御不全を予防することを示すウエスタンブロット分析である。十分な内因性ｆＨ発現の欠如により、未処置ｆＨｍ／ｍマウスは液相代替経路補体活性化制御不全を有し、そして結果としてそれらは血漿Ｃ３及びｆＢを消費する（ＷＴのレーン１を遺伝子治療前のｆＨ^m/mマウスのレーン２、５、８と比較されたい）。ｆＨ^m/mマウスをＡＡＶ８－ｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０で処置した後、１週（１Ｗ、レーン３、６、９）及び１か月（１Ｍ、レーン４、７、１０）で血漿Ｃ３及びｆＢレベルがＷＴのレベルに回復され、ＡＡＶ８媒介性ｆＨ遺伝子治療が代替経路補体活性化制御不全並びにＣ３及びｆＢ消費を予防したこと、並びに、治療効果が早くも１週から明らかでありかつ最低１か月持続することを示唆する。ＡＡＶ８媒介性ｆＨ遺伝子治療が致死性Ｃ３糸球体腎症のマウスモデルにおいて代替経路補体活性化制御不全を予防することを示すウエスタンブロット分析である。プロパージンもまた欠乏しているｆＨ^m/mマウス（ｆＨ^m/mＰ^-/-）において、Ｃ３及びｆＢ消費を伴う類似の制御されない代替経路補体活性化が発生する。ｆＨ^m/mマウスと比較して、ｆＨｍ／ｍＰ－／－マウスは致死性の形態のＣ３Ｇを発症し、そしてそれらは１０～１２週齢までに死亡する。この実験において、それぞれ約７週齢の２ｆＨ^m/mＰ^-/-マウスを、ＡＡＶ８－ｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０、若しくは対照群（対照ＡＡＶ）として空のＡＡＶ８ベクター（ｐＡＡＶ．ＴＢＧ．ｒＢＧ）で処置した。ＡＡＶ８遺伝子治療１週後に血液サンプルを回収し、そしてＣ３及びｆＢレベルについてウエスタンブロットにより分析した。該パネルに示されるとおり、ＡＡＶ８処置前の血液サンプル（ｐｒｅ）と比較して、対照ＡＡＶ８処置後１週（１Ｗ）に無傷のＣ３若しくはｆＢレベルの差異が存在しなかった（レーン２－５）。しかしながら、ＡＡＶ８－ｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０での処置１週後のマウスにおける血漿Ｃ３及びｆＢレベルは有意に増大し（レーン６－９）、代替経路補体活性化制御不全が遺伝子治療により阻害されたことを示唆する。マウスは後眼窩Ｉ．Ｖ．注入を介してＡＡＶ８（３×１０¹²遺伝子コピー／マウス）で処置した。ＡＡＶ８－ｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０遺伝子治療で処置されたｆＨ^m/mＰ^-/-（図２４からのＭ３）の長期経過観察を示す。Ｃ３及びｆＢが遺伝子治療後に野生型マウスレベルに持続的に上昇したことを示し、治療効果が長期間持続したことを示唆する、遺伝子治療前（Ｐｒｅ）、並びにＡＡＶ８－ｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０での処置後１週（１Ｗ）、１、２、３、４、５及び６か月（１Ｍ、２Ｍ、３Ｍ、４Ｍ、５Ｍ、６Ｍ）の血漿Ｃ３及びｆＢレベルのウエスタンブロット分析。ＡＡＶ８－ｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０遺伝子治療で処置されたｆＨ^m/mＰ^-/-（図２４からのＭ３）の長期経過観察を示す。治療的タンパク質薬物としてのｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０が持続的に発現されたことを示す、ＡＡＶ８－ｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０で処置する前（Ｐｒｅ）、並びに１週、１、２、３、４、５及び６か月（Ｍ）後のｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０タンパク質の血漿レベルのＥＬＩＳＡ分析。Ｃ３糸球体腎症における腎の病理の予防におけるＡＡＶ８－ｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０遺伝子治療の有効性を示す。対照ＡＡＶ８ベクターで処置されたｆＨ^m/mＰ^-/-マウス（図２４からのマウスＭ１）は処置の２週以内に瀕死状態となり、そしてその腎の免疫染色は、未処置ｆＨ^m/mＰ^-/-マウスについて以前に記述されたとおり強い糸球体Ｃ３沈着を示した（左パネル）。対照的に、ＡＡＶ８－ｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０ベクターで処置されたｆＨ^m/mＰ^-/-マウス（図２３からのＭ３）は生き残り、そして処置後６か月でなお健康であり、その時点でそれを屠殺しかつ腎の組織像について分析した。糸球体Ｃ３沈着はこのマウスで検出されず（右パネル）、Ｃ３糸球体腎症がＡＡＶ８－ｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０遺伝子治療により予防されたことを示唆する。ＡＡＶ８－ｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０遺伝子治療が膜調節物質機能障害により引き起こされる代替経路補体活性化を予防することを示す。この実験において、２種の膜調節物質ＤＡＦ及びＣｒｒｙが欠乏しているマウスをＡＡＶ８－ｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０（後眼窩経路、Ｉ．Ｖ．、３×１０¹²遺伝子コピー／マウス）で処置した。血漿サンプルを、遺伝子治療前及び１週後（１Ｗ）に回収してウエスタンブロットにより血漿Ｃ３（Ａ）及びｆＢ（Ｂ）レベルを分析した。該データにより示されるとおり、ＤＡＦ／Ｃｒｒｙ二重変異体マウスは、Ｃ３及びｆＢレベル低下を伴う過度の代替経路補体活性化を有した（Ｐｒｅ）。ＡＡＶ８－ｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０処置後、Ｃ３及びｆＢ双方が野生型マウスレベルに復帰し、ＡＡＶ８－ｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０処置が膜補体調節物質により引き起こされる病態を是正し得ることを示唆する。このデータは、ＡＡＶ８－ｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０処置が、根底にある調節機構の欠陥に関係なく、代替経路補体調節制御不全により引き起こされる補体媒介性疾患に広範に有効であったことを示唆した。本研究で使用されたＤＡＦ／Ｃｒｒｙ二重変異体マウスはＤＡＦノックアウトマウスとＣｒｒｙ^flox/flox－Ｔｉｅ－２Ｃｒｅ⁺マウスの間の交雑種である。Ｔｉｅ－２－Ｃｒｅは生殖細胞中で発現されるため、それは一部子孫におけるＣｒｒｙ遺伝子の生殖系列欠失につながり、全体的Ｃｒｒｙ欠失に至る。読み出し情報としてＣ３回復を使用するＡＡＶ８－ｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０遺伝子治療の投薬量比較を提供する。この実験において、多様な用量のＡＡＶ８－ｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０をｆＨ^m/mマウスに投与した（後眼窩経路、Ｉ．Ｖ．）。各２マウスに以下の投薬量：１×１０¹²遺伝子コピー／マウス（Ｍ＃１、Ｍ＃２）、３×１０¹¹遺伝子コピー／マウス（Ｍ＃３、Ｍ＃６）及び１×１０¹¹遺伝子コピー／マウス（Ｍ＃４、Ｍ＃５）を与えた。ウエスタンブロットを実施して、遺伝子治療前（Ｐｒｅ）及び１週（１Ｗ）若しくは１か月（１Ｍ）後の血漿Ｃ３レベルを分析した。示されるとおり、試験された全部の用量は、１Ｗ及び１Ｍの時間点で検査される場合に血漿Ｃ３レベルを増大させることが可能であった。読み出し情報としてｆＢ回復を使用するＡＡＶ８－ｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０遺伝子治療の投薬量比較を提供する。ウエスタン分析は、本質的に、Ｃ３を読み出し情報として使用した図２９Ａ－Ｂにおいて記述されるとおり実施した。示されるとおり、試験された全部の用量は、１Ｗ及び１Ｍの時間点で検査される場合に血漿ｆＢレベルを増大させることが可能であった。マウスｆＨのＳＣＲ２０中のＷからＲへの突然変異（位置１２０６、ヒトｆＨ中の位置１１８３に対応する）を導入するのに使用された遺伝子ターゲッティング戦略を示す図解である。野生型同腹仔マウス及びｆＨ中にＷ１２０６Ｒ突然変異を有する変異体マウスの生存曲線を示す。ｆＨ変異体マウスはａＨＵＳの特徴的病理を発現し、そしてそれらの半分近くが３０週齢までに死亡した。野生型、ヘテロ接合性及びホモ接合性変異体マウスにおける血小板数の比較を示す。ホモ接合性変異体マウスは血小板数低下を示し、それらが慢性血小板減少症に苦しんでいたことを示唆する。野生型、ヘテロ接合性及びホモ接合性変異体マウスにおけるヘモグロビンレベルの比較を示す。ホモ接合性変異体マウスはヘモグロビンレベル低下を示し、それらが慢性溶血性貧血に苦しんでいることを示唆する。Ｗ１２０６Ｒ変異体マウスの腎切片がａＨＵＳに特徴的な病理を示したことを示す。該病理学的特徴は、メサンギウム拡大及び毛細管腔の狭窄（パネルＡ）、パネルＡ及びパネルＣで矢印により示される小血管中の血栓を包んだ。電子顕微鏡検査は、糸球体の毛細血管壁が、ふわふわした粒状の電子密度の低い物質を伴う内皮下の拡大、並びに二重輪郭線及び新たな糸球体基底膜の形成を表したことを示した。ｆＨ中にＷ１２０６Ｒ突然変異を運搬するマウスが網膜傷害および眼中の血液凝固もまた発症したことを示す。野生型マウスの正常に見える網膜（図３５Ａ）と比較して、ｆＨＷ１２０６Ｒ変異体マウスの網膜中に多くの白斑、網膜浮腫及び拡張された血管が存在した（図３５Ｂ）。加えて、フルオレセイン血管造影法は、変異体マウスの網膜の灌流が良好でなかったことを示した。色素は、野生型マウスの眼中の全部の血管に３０秒以内に達した（図３５Ｃ）が、しかし該色素は変異体マウス網膜の同じ領域の多くに４分経っても近づかなかった（図３５Ｄ）からである。ｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０タンパク質が、３×１０¹¹ＧＣ／マウスのＡＡＶ８－ｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０ベクターでの処置後１か月及び２か月にｆＨ^{W1206R/W1206R}マウスの血液中でＥＬＩＳＡにより検出されたが、しかしＡＡＶ遺伝子治療前のこれらマウスの血液中で検出されなかったことを示す。３×１０¹¹ＧＣ／マウスのＡＡＶ８－ｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０ベクターでのｆＨ^{W1206R/W1206R}マウスの処置がそれらの血小板数を正常化したことを示す線グラフである。ＡＡＶ８－ｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０で処置された全３ｆＨ^{W1206R/W1206R}マウスは生存しかつ健康であった。それらの血小板数（図３７Ａ）及びヘモグロビンレベル（Ｈｂ、図３７Ｂ）は増大しかつ正常範囲で維持された。対照的に、対照ＡＡＶベクターで処置された２ｆＨ^{W1206R/W1206R}マウスの１匹は（処置後４週で）死亡し、かつ、残存するマウスは、一貫して、血小板数が低下し、変動するヘモグロビンレベルがＡＡＶ８－ｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０で処置されたマウスのものより下であった。

［発明の詳細な説明］
新規の人工改変されたＨ因子（ｆＨ）遺伝子及びタンパク質バリアントを本明細書に説明する。これらバリアントは、Ｈ因子に関連する状態及び他の補体障害の処置における半減期の延長及び有効性の増大を特徴とする。

多数の経路を介し、及び具体的にはｒＡＡＶベクターのような組換えベクターにより媒介されるｉｎｖｉｖｏの発現による、それの必要な被験体へのこれらバリアントの送達が記述される。Ｈ因子関連障害を処置するための投与計画でのこれらバリアントの使用方法もまた提供される。有利には、本明細書で提供される組成物は、複数の経路に同時に標的を定めかつ／若しくは多様な因子により引き起こされる制御されない代替経路補体調節を処置若しくは調節するために有用である。

本明細書で使用される「補体Ｈ因子障害を処置する（こと）」という用語は、無症候性の再発性細菌感染症及び腎不全を包含する数種の異なる表現型として現れ得る、補体Ｈ因子障害と関連する症状を軽減すること、低下すること及び／又は寛解すること、並びに／又は付加的症状の発生を予防することを包含しうる。これは、典型的に、Ｈ因子、補体成分Ｃ３の低下された血清レベル、及び代替補体経路の活性化を示す他の終末補体成分の減少を特徴とする。この障害は、Ｃ３糸球体腎症及び非典型溶血性尿毒症症候群を包含する多様な臨床症状及び進行を伴う多数の腎疾患と関連する。とりわけ加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、非典型溶血性尿毒症症候群（例えば、微小血管症性溶血性貧血、血小板減少症、急性腎不全を包含する）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、統合失調症、虚血性脳卒中の１種若しくはそれ以上を処置する、及び／或いは細菌性病原体（例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の種；ライム病菌（Ｂｏｒｒｅｌｉａｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）；Ｂ．ダットナイ（Ｂ．ｄｕｔｔｏｎｉｉ）；Ｂ．リカレンティス（Ｂ．ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ）；カンジダアルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ）；野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）；インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）；髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）；化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）、又はライム病ボレリア（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）の５種のＨ因子結合タンパク質（ＣＲＡＳＰ－１、ＣＲＡＳＰ－２、ＣＲＡＳＰ－３、ＣＲＡＳＰ－４若しくはＣＲＡＳＰ－５）の１種の動員により引き起こされる細菌感染症を予防若しくは処置するための組成物及び方法もまた本明細書で提供される。

本明細書で使用される「補体関連障害を処置する（こと）」という用語は、症状、上で同定された補体Ｈ因子障害と、代替経路補体調節の制御不全と関連する他の障害との双方を軽減、低下及び／又は寛解することを包含する。より具体的には、本明細書で提供されるデータは、最低１種のＡＡＶ媒介性ｆＨバリアントが、根底にある調節機構の欠陥に関係なく、代替経路補体調節の制御不全により引き起こされる補体媒介性疾患に広範に有効であることを示唆する。例えば図２３を参照されたい。

「補体媒介性障害」は、無症候性の再発性細菌感染症を包含する数種の異なる表現型として現れ得る補体調節不全に関連する症状、及び限定されるものでないが腎疾患を挙げることができる多様な組織傷害を包含しうる。他に特記されない限り、ホモ接合性被験体及びヘテロ接合性被験体の双方がこの定義に含まれる。補体調節不全は、典型的に、ｆＨ、Ｉ因子（ｆＩ）及び膜補助因子タンパク質（ＭＣＰ）を挙げることができるがこれらに限られない補体調節タンパク質中の機能欠失変異若しくはそれに対する自己抗体により、又はＣ３及びＢ因子（ｆＢ）を挙げることができるがこれらに限られない他の補体タンパク質中の機能獲得変異により引き起こされる。補体調節不全は、典型的に、とは言え常にではなく、代替及び／又は終末補体経路の活性化を示す、Ｈ因子、補体成分Ｃ３、ｆＢの血清レベルの低下、及び他の終末補体成分の減少を特徴とする。組成物及び方法の本発明により処置され得る補体媒介性の病理は、多様な臨床症状及び進行を伴う以下の疾患：その２種の既知の形態－デンスデポジット病（ＤＤＤ）及びＣ３糸球体腎炎（Ｃ３ＧＮ）が存在するＣ３糸球体腎症（以前はＩＩ型膜性増殖性糸球体腎炎若しくはＭＰＧＮＩＩと呼ばれる）；非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、志賀毒素様毒素産生大腸菌ＨＵＳ（ＳＴＥＣ－ＨＵＳ）及び血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）を挙げることができるがこれらに限られない血栓性微小血管症（ＴＭＡ）；加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、ＲＰＥ変性、網脈絡膜変性、光受容体変性を包含する網膜変性眼疾患、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、全部の器官及び状況の虚血再灌流傷害、関節リウマチ、血液透析、糖尿病性ニューロパシー、糖尿病性脈管障害、喘息、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、虚血性脳卒中、腹部大動脈瘤（ＡＡＡ）、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）媒介性血管炎（ＡＮＣＡ血管炎）、ＡＮＣＡ媒介性出血性肺傷害及び疾患、ＡＮＣＡ糸球体腎炎、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、臓器移植における急性若しくは遅発性移植片拒絶、クローン病、乾癬、多発性硬化症、抗リン脂質抗体症候群、妊娠高血圧腎症、アテローム硬化症、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、自己免疫性皮膚水疱形成疾患、水疱性類天疱瘡（ＢＰ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、並びに、細菌性病原体（例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の種；ライム病ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、Ｂ．ダットナイ（Ｂ．ｄｕｔｔｏｎｉｉ）；Ｂ．リカレンティス（Ｂ．ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ）；カンジダアルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ）；野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）；インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）；髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）；化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）の動員により引き起こされる細菌感染症を挙げることができるが、これらに限られない。こうした障害の他の例は下でより詳細に論考する。

成熟「野生型」ヒト補体Ｈ因子（アイソフォーム１）のアミノ酸配列はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ０８６０３として本明細書で提供され、そしてｈｆＨアイソフォーム１のアミノ酸番号付け［配列番号３９に再現される］のための参照としてはたらく。リーダー配列は配列番号３９を参照してＨ因子のアミノ酸１ないし１８に位置する。該リーダーのアミノ酸配列は配列番号２に提供される。成熟（分泌型）ｈｆＨタンパク質は、配列番号３９を参照してアミノ酸１９ないし１２３１に位置する。２０種のショートコンプリメントリピート（ＳＣＲ）の場所の代替の決定方法が存在する。下に提供される実験で使用されるドメインの場所は図１中で注釈が付けられ、かつ、Ｃ．Ｅｓｔａｌｌｅｒら、ＥｕｒＪＩｍｍｕｎｏｌ．１９９１Ｍａｒ；２１（３）：７９９－８０２で使用される番号付けに基づく。

野生型ヒト補体Ｈ因子、アイソフォーム１のアミノ酸配列は配列番号３９に再現される。配列番号１の特徴の欄は、２０種のショートコンセンサスリピート（ＳＣＲ）ドメインのそれぞれの開始／終止を同定するための代替系もまた具体的に説明する。この系において、リンカー配列はＳＣＲのそれぞれの間に存在しない。

場合によっては、本明細書で提供される人工改変されたｈｆＨバリアントは、天然のｈｆＨリーダー配列の代わりに用いられる異種リーダー配列を有しうる。加えて、若しくは場合によっては、その配列が例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ０８６０３から入手可能である別のｈｆＨアイソフォーム（例えばアイソフォーム２）、及び／又は、ある障害と関連しないその中の天然のアミノ酸バリアントの１種。配列番号４０を参照されたい。以下の記述において、置換は（一文字記号により同定される第１のアミノ酸）－残基位置番号－（一文字記号により同定される第２のアミノ酸）として書かれることができ、これにより、第１のアミノ酸が置換されるアミノ酸であり、そして第２のアミノ酸がアイソフォーム１を参照して指定される位置の置換するアミノ酸であるが；しかしながら、慣習的アライメント段階により、アイソフォーム１の番号付けに関して本明細書で同定される対応するアミノ酸残基が、アイソフォーム２及びｆＨのアイソフォーム１若しくは２のＳＣＲの疾患を引き起こさない天然のバリアント中に位置し得る。

本明細書で使用されるところの、言及がＳＣＲ＃－＃＃になされる場合、該ドメインは終点を包含しかつ「ＳＣＲ＃，．．．ＳＣＲ＃＃」と同一である。ある態様において、ピリオドをドメイン間に使用する。例えば、ＳＣＲ１－４は「ＳＣＲ１、ＳＣＲ２、ＳＣＲ３及びＳＣＲ４」を指し、そして「ＳＣＲ１，２，３，４」若しくはＳＣＲ１．２．３．４．」と同一である。ＳＣＲ１９－２０はＳＣＲ１９及びＳＣＲ２０を指し、そして「ＳＣＲ１９，２０」と同一である。例えば、「ＳＣＲ６－８」、「ＳＣＲ６．７．８」及び「ＳＣＲ６，７，８」は同一ドメインを指す。

本明細書で使用されるところの「機能的ｆＨバリアント」という用語は、ＳＣＲ１－４中に位置する補体調節活性（補助因子活性）、及び場合によっては野生型ｆＨに特徴的な機能的Ｃ３ｂ結合及びＧＡＧ結合能力（野生型ＳＣＲ７及びＳＣＲ１９－２０内に位置する）を有することを特徴とするｆＨバリアントを包含する。いくつかの態様において、人工改変されたｆＨバリアントは野生型ｆＨ補助因子活性及び／又はＧＡＧ結合能力の１００％以上を有する。例えば、図８、並びに本明細書に記述されるｆＨバリアントが完全長ヒトｆＨより統計学的により高い、例えば約１０％ないし４０％より高いＧＡＧ及びＣ３ｂ結合活性を有することを示す下の実施例を参照されたい。別の態様において、人工改変されたｆＨバリアントは野生型の機能的ｆＨの約９５％未満ないし約１００％を有する。例えば、人工改変されたｆＨバリアントは、機能的野生型ｆＨに存在する補助因子活性の最低５０％、及びより望ましくは最低約６０％、最低約７５％、最低約８０％、最低約８５％、最低約９０％、最低約９５％、若しくは最低約９９％を有しうる。別の態様において、人工改変されたｆＨバリアントは、あるいは、若しくは加えて、機能的ｆＨのＧＡＧ結合能力の最低５０％、及びより望ましくは最低約６０％、最低約７５％、最低約８０％、最低約８５％、最低約９０％、最低約９５％若しくは最低約９９％を有しうる。ｈｆＨタンパク質に比較した補助因子活性、結合の測定及び／又は増大された循環半減期の測定方法は当該技術分野で既知であり、そして少なくとも１種のこれらのアッセイを下の実施例に具体的に説明する。

機能的ｆＨバリアントの例は、１個のＳＣＲ７、ＳＣＲ１７若しくはＳＣＲ１８ドメインの１種若しくはそれ以上とともにｆＨタンパク質のＳＣＲ１－４及び１９－２０を有するものを包含する。さらなるバリアントは、ＳＣＲ６、ＳＣＲ８、ＳＣＲ１６、ＳＣＲ１７、ＳＣＲ１８若しくはそれらのフラグメントの１種若しくはそれ以上及びそれらの組合せを有するものを包含する。例えば、こうしたバリアントは、例えば、とりわけ、ｆＨＳＣＲ１－４，６－８，１９－２０；ｆＨＳＣＲ１－４，６－８，１８－２０；ｆＨＳＣＲ１－４，６－８，１７－２０；ｆＨＳＣＲ１－４，６－７，１９－２０；ｆＨＳＣＲ１－４，６－７，１８－２０；ｆＨＳＣＲ１－４，６－７，１７－２０；ｆＨＳＣＲ１－４，７－８，１９－２０；ｆＨＳＣＲ１－４，７－８，１８－２０；ｆＨＳＣＲ１－４，７－８，１７－２０；ｆＨＳＣＲ１－４，７，１９－２０；ｆＨＳＣＲ１－４，７，１８－２０；ｆＨＳＣＲ１－４，７，１７－２０；ＳＣＲ１－４，１７，１９－２０；ＳＣＲ１－４，１８－２０；ＳＣＲ１－４，１７－２０及び／又はｆＨＳＣＲ１－４，７，１６－２０を包含しうる。ある態様において、ｈｆＨバリアントは、付加的なｈｆＨＳＣＲ例えばＳＣＲ６、ＳＣＲ８、ＳＣＲ１６若しくはそれらの組合せをさらに含んでなる。好ましい態様においてｈｆＨＳＣＲ５は存在しない。しかしながら、ある態様において、ｈｆＨＳＣＲ５は全体若しくはその一部分が存在してもよい。ある態様において、ｈｆＨＳＣＲ９、ＳＣＲ１０、ＳＣＲ１１、ＳＣＲ１２、ＳＣＲ１３、ＳＣＲ１４及び／又はＳＣＲ１５が存在しないか、又は少なくとも機能的に欠失している。場合によっては、これらのバリアント中のＳＣＲの１個若しくはそれ以上は、図１若しくは配列番号１の特徴で示されるところの完全長ＳＣＲよりはむしろＳＣＲの「機能的フラグメント」でありうる。「機能的フラグメント」とは、補体阻害活性、ヘパリンを結合する能力及び／又はＣ３ｂ結合活性の１種若しくはそれ以上を有することを特徴とする完全長ＳＣＲ未満のアミノ酸配列（若しくはそのコーディング配列）を意味する。

これら及び他のバリアントは他のｆＨ配列を包含しうる。例えば、ウイルスベクターから発現される場合、ｆＨバリアントのコーディング配列はリーダー配列もまた包含する。こうしたリーダー配列はｆＨリーダーでありうる。場合によっては、リーダー配列は別の供給源から、例えば、本明細書に引用することにより組み込まれるＩＬ－２リーダー［例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ．ｄｅ／に同定される哺乳動物リーダー配列の索引を参照されたい］であり得る。一態様において、選択されるリーダー配列は長さがアミノ酸約２６個未満（例えばアミノ酸約１から約２６個まで）、より好ま
しくはアミノ酸２０個未満（約１から約２０アミノ酸まで）、及び最も好ましくは長さがアミノ酸約１８個未満（約１から約１８アミノ酸まで）である。「機能的欠失」により、補体阻害活性、Ｃ３ｂ結合活性を欠きかつ場合によってはヘパリン結合活性もまたさらに欠くアミノ酸配列（若しくはそのコーディング配列）を意味している。

該バリアントで、ドメインは相互に直に隣接して位置しうる（例えば１ドメインのカルボキシ末端が先行するドメインのアミノ末端の直後に続きうる）。あるいは、ＳＣＲドメインの１若しくはそれ以上は、それらの間に配置されるアミノ酸１ないし約１２ないし１８個から構成されるリンカーを有しうる。例えば、バリアントはＳＣＲ１－（Ｌ１）－ＳＣＲ２－（Ｌ２）－ＳＣＲ３－（Ｌ３）－ＳＣＲ４－（Ｌ４）－（ＳＣＲ６－（Ｌ４’））－ＳＣＲ７－（Ｌ５）－（ＳＣＲ８－（Ｌ５’））－（ＳＣＲ１６－（Ｌ５”））－（ＳＣＲ１７－（Ｌ５”’））－（ＳＣＲ１８－（Ｌ５””））－ＳＣＲ１９－（Ｌ６）－ＳＣＲ２０を含有することができ、ここで（）は任意の成分を示し、「Ｌ」はリンカーを指し、そしてＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ４’、Ｌ５、Ｌ５’、Ｌ５”、Ｌ５”’、Ｌ５””及びＬ６のそれぞれは、非存在でありうるか若しくはアミノ酸約１ないし約１２－１８個のアミノ酸配列から独立に選択されうる。言い換えれば、バリアントが複数のリンカーを含有する場合、リンカーのそれぞれは同一配列若しくは異なる配列を有しうる。ある態様において、バリアントは最低１、最低２、最低３、最低４、最低５個のリンカー、最低６個のリンカーを含有する。適するリンカーの例は、図１若しくは図１７、配列番号４、６、８、１０、１２、１５、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４及び３６に同定される天然のリンカー、又は合成リンカーを包含する。これら野生型リンカーのそれぞれはそれらの本来の位置に位置しうる。あるいは、これら野生型リンカーの１種若しくはそれ以上を１個の異なるリンカー位置若しくは複数の異なるリンカー位置で使用しうる。

場合によっては、これらのリンカーの１個若しくはそれ以上はｆＨ配列であることができかつ独立に選択されうる。あるいは、該リンカーの１個若しくはそれ以上はｆＨに対し異種、例えば人工であれ、合成であれ、ｆＨバリアントに適する柔軟性を付与する異なるタンパク質からであれ、異なる供給源からでありうる。他の適するリンカーの例は、例えば、ポリＧｌｙリンカー及び適する柔軟性を提供する他のリンカーを包含しうる（例えばｈｔｔｐ：／／ｐａｒｔｓ．ｉｇｅｍ．ｏｒｇ／Ｐｒｏｔｅｉｎ＿ｄｏｍａｉｎｓ／Ｌｉｎｋｅｒ）（本明細書に引用することにより組み込まれる）。ある態様において、リンカーはいかなるｆＨ機能も欠く。

「アミノ酸置換」という用語及び上述されたその同義語は、あるアミノ酸を別の代わりのアミノ酸で置換することによるアミノ酸配列の改変を包含することを意図している。置換は保存的置換でありうる。それはまた非保存的置換でもありうる。２種のアミノ酸に言及する際の保存的という用語は、該アミノ酸が当業者により認識される共通の特性を共有することを意味することを意図している。例えば、疎水性の非酸性側鎖を有するアミノ酸、疎水性の酸性側鎖を有するアミノ酸、親水性の非酸性側鎖を有するアミノ酸、親水性の酸性側鎖を有するアミノ酸、及び親水性の塩基性側鎖を有するアミノ酸。共通の特性は、疎水性側鎖を有するアミノ酸、脂肪族疎水性側鎖を有するアミノ酸、芳香族疎水性側鎖を有するアミノ酸、極性の中性側鎖をもつアミノ酸、電気的に荷電した側鎖をもつアミノ酸、電気的に荷電した酸性側鎖をもつアミノ酸及び電気的に荷電した塩基性側鎖をもつアミノ酸の場合もまたありうる。天然に存在するアミノ酸及び天然に存在しないアミノ酸の双方が当該技術分野で既知であり、そして態様においてアミノ酸を置換するとして使用される。アミノ酸の置換方法は当業者に公知であり、そして前記アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の突然変異を挙げることができるがこれに限られない。本明細書の「１若しくはそれ以上」への言及は、例えば１、２、３、４、５、６若しくはそれ以上の個別の態様を包含することを意図している。

本明細書で提供されるｆＨタンパク質バリアントに加え、これらｆＨタンパク質バリアントをコードする核酸配列が提供される。これらバリアントのコーディング配列は、リーダー配列の野生型配列及び／又はアイソフォーム１、アイソフォーム２若しくは疾患に関連しないバリアントの1種若しくはそれ以上のＳＣＲからの場合がある。あるいは、若しくは加えて、ウェブに基づく若しくは商業的に入手可能なコンピュータープログラム、並びにサービスに基づく企業を使用して、リーダー配列のアミノ酸配列及び／又はＳＣＲの１種若しくはそれ以上を、ＲＮＡ及び／又はｃＤＮＡ双方を包含する核酸コーディング配列に逆翻訳しうる。例えば、ＥＭＢＯＳＳによるｂａｃｋｔｒａｎｓｅｑ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｔ／；ＧｅｎｅＩｎｆｉｎｉｔｙ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｉｎｆｉｎｉｔｙ．ｏｒｇ／ｓｍｓ－／ｓｍｓ＿ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ．ｈｔｍｌ）；ＥｘＰａｓｙ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／）を参照されたい。一態様において、ＲＮＡ及び／又はｃＤＮＡコーディング配列をヒト細胞中での最適な発現のため設計する。

コドン最適化されたコーディング領域は多様な異なる方法により設計し得る。この最適化は、オンラインで入手可能である方法、公表された方法、若しくはコドン最適化サービスを提供する企業を使用して実施しうる。１つのコドン最適化方法が例えば第ＷＯ２０１５／０１２９２４Ａ２号明細書（本明細書に引用することにより組み込まれる）に説明されている。簡潔には、生成物をコードする核酸配列を同義のコドン配列で改変する。好適には、該生成物のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の全長を改変する。しかしながら、いくつかの態様において、ＯＲＦの１フラグメントのみを変更しうる。これらの方法の１つを使用することにより、いずれかの所定のポリペプチド配列に頻度を適用し得、そして該ポリペプチドをコードするコドン最適化されたコーディング領域の核酸フラグメントを製造し得る。

核酸配列の文脈における「同一性パーセント（％）」、「配列同一性」、「配列同一性パーセント」若しくは「同一なパーセント」という用語は、対応のため整列される場合に同一である２本の配列中の塩基を指す。配列同一性比較の長さは、ゲノムの完全長、遺伝子コーディング配列の完全長、若しくは最低ヌクレオチド約５００ないし５０００個のフラグメント、又は所望のとおりの場合がある。しかしながら、例えば最低ヌクレオチド約９個、通常は最低ヌクレオチド約２０ないし２４個、最低ヌクレオチド約２８ないし３２個、最低ヌクレオチド約３６個若しくはそれ以上のより小さいフラグメント間の同一性もまた望ましい場合がある。複数配列アライメントプログラムもまた核酸配列について利用可能である。こうしたプログラムの例は、インターネット上のウェブサーバーを通じてアクセス可能である「ＣｌｕｓｔａｌＷ」、「ＣＡＰＳｅｑｕｅｎｃｅＡｓｓｅｍｂｌｙ」、「ＢＬＡＳＴ」、「ＭＡＰ」及び「ＭＥＭＥ」を包含する。こうしたプログラムの他の供給源は当業者に既知である。あるいは、ＶｅｃｔｏｒＮＴＩユーティリティもまた使用される。上述のプログラムに含有されるものを包む、ヌクレオチド配列の同一性を評価するために使用し得る当該技術分野で既知の多数のアルゴリズムもまた存在する。別の例として、ポリヌクレオチド配列は、ＧＣＧバージョン６．１中のプログラムＦａｓｔａ^TMを使用して比較し得る。Ｆａｓｔａ^TMはクエリ及び検索配列の間の最良の重なりの領域のアライメント及び配列同一性パーセントを提供する。例えば、核酸配列間の配列同一性パーセントは、引用することにより本明細書に組み込まれる、ＧＣＧバージョン６．１中に提供されるデフォルトのパラメータ（６個のワードサイズ（ｗｏｒｄｓｉｚｅ）及びスコアリングマトリックス（ｓｃｏｒｉｎｇｍａｔｒｉｘ）についてのＮＯＰＡＭファクター）を用いてＦａｓｔａ^TMを使用して決定し得る。

アミノ酸配列の文脈における「同一性パーセント（％）」、「配列同一性」、「配列同一性パーセント」若しくは「同一のパーセント」という用語は、対応のため整列される場
合に同一である２本の配列中の残基を指す。同一性パーセントは、完全長のタンパク質、ポリペプチド、アミノ酸約３２個、約３３０個若しくはそのペプチドフラグメント、又は対応する核酸配列コーディング配列にわたるアミノ酸配列について容易に決定しうる。適するアミノ酸フラグメントは長さが最低アミノ酸約８個であることができ、そしてアミノ酸約７００個まででありうる。一般に、２個の異なる配列間の「同一性」、「相同性」若しくは「類似性」を指す場合、「同一性」、「相同性」若しくは「類似性」は「整列された」配列に関して決定される。「整列された」配列若しくは「アライメント」は、参照配列に比較して欠けている若しくは付加的な塩基若しくはアミノ酸についての補正をしばしば含有する、複数の核酸配列若しくはタンパク質（アミノ酸）配列を指す。アライメントは、多様な公的に若しくは商業的に利用可能な複数配列アライメントプログラム（ＭｕｌｔｉｐｌｅＳｅｑｕｅｎｃｅＡｌｉｇｎｍｅｎｔＰｒｏｇｒａｍ）のいずれかを使用して実施する。配列アライメントプログラムはアミノ酸配列について利用可能であり、例えば「ＣｌｕｓｔａｌＸ」、「ＭＡＰ」、「ＰＩＭＡ」、「ＭＳＡ」、「ＢＬＯＣＫＭＡＫＥＲ」、「ＭＥＭＥ」及び「Ｍａｔｃｈ－Ｂｏｘ」プログラム。一般に、これらのプログラムのいずれもデフォルトの設定で使用されるとは言え、当業者は必要に応じてこれらの設定を変更し得る。あるいは、当業者は、参照されるアルゴリズム及びプログラムにより提供される同一性若しくはアライメントのレベルを少なくとも提供する別のアルゴリズム若しくはコンピュータープログラムを利用し得る。例えば、Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、“Ａｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｍｕｌｔｉｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ”、２７（１３）：２６８２－２６９０（１９９９）を参照されたい。

一態様において、本明細書に記述されるｆＨバリアントをコードする核酸配列（例えばｈｆＨバリアント遺伝子）は、例えばＤＮＡ若しくはＲＮＡを運搬するナノ粒子、パッケージング宿主細胞中のウイルスベクターを生成するため、及び／又は被験体中の宿主細胞への送達のため、その上に運搬されるｈｆＨ配列を宿主細胞に移入するいずれかの適する遺伝要素、例えば裸のＤＮＡ、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）、エピソームなどに人工改変される。一態様において遺伝要素はプラスミドである。選択された遺伝要素は、トランスフェクション、電気穿孔法、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡ被覆ペレット、ウイルス感染及びプロトプラスト融合を包含するいずれかの適する方法により送達しうる。こうした構築物を作成するのに使用される方法は核酸操作の当業者に既知であり、遺伝子工学、組換え工学及び合成技術を包含する。例えば、Ｇｒｅｅｎ及びＳａｍｂｒｏｏｋ、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（２０１２）を参照されたい。

本明細書で使用されるところの「発現カセット」は、ｈｆＨバリアントのコーディング配列、プロモーターを含んでなりかつそのための他の調節配列（例えば５’及び／又は３’ＵＴＲ配列）を包含しうる核酸分子を指し、このカセットは遺伝要素に人工改変されかつ／又はウイルスベクターのキャプシド（例えばウイルス粒子）中にパッケージングされうる。典型的に、ウイルスベクターを生成するためのこうした発現カセットは、ウイルスゲノムのパッケージングシグナルと、本明細書に記述される他の発現制御配列とに挟まれる本明細書に説明されるｈｆＨ配列を含有する。

発現カセットは典型的に発現制御配列の一部としてプロモーター配列を含有する。本明細書に記述される具体的に説明するプラスミド及びベクターはニワトリβアクチンを使用する。あるいは、別の構成的プロモーターを選択しうる。ある態様において、望ましくない標的細胞の脱標的化（ｄｅ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）を適切なベクター要素例えばマイクロＲＮＡの使用により達成しうる。加えて、若しくは、あるいは、選択されるベクターは所望の組織に対する優先的ターゲッティングを有することができ、例えば、肝に対しＡＡ
Ｖ８、ＡＡＶ９若しくはＡＡＶｒｈ１０、眼に対しＡＡＶ８、ＡＡＶ１若しくは他のＡＡＶ、など。

しかしながら、所望の組織にベクターを標的化することはタンパク質の発現を最大化するために望ましい場合がある。だから、肝特異的プロモーターを選択しうる。適するプロモーターの例は、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）、α１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）；ヒトアルブミンＭｉｙａｔａｋｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７１：５１２４３２（１９９７）、ｈｕｍＡｌｂ；及びＢ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇら、ＧｅｎｅＴｈｅｒ．、３：１００２９（１９９６）］。ＴＴＲミニマルエンハンサー／プロモーター、αアンチトリプシンプロモーター、ＬＳＰ（８４５ｎｔ）２５（イントロンなしｓｃＡＡＶを必要とする）を包含する。あるいは他の肝特異的プロモーターを使用しうる［例えば、ＴｈｅＬｉｖｅｒＳｐｅｃｉｆｉｃＧｅｎｅＰｒｏｍｏｔｅｒＤａｔａｂａｓｅ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、ｈｔｔｐ：／／ｒｕｌａｉ．ｓｃｈｌ．ｅｄｕ／ＬＳＰＤを参照されたい。あるいは、別の組織へのターゲッティングが望ましい場合は、異なる組織特異的プロモーターを選択しうる。プロモーターはいずれの種に由来する場合もある。例えば、眼での使用のため、例えば網膜色素上皮（ＲＰＥ）プロモーター若しくは光受容体プロモーターを選択しうる。別の態様において、プロモーターはヒトＧタンパク質共役型受容体プロテインキナーゼ１（ＧＲＫ１）プロモーター（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ３２７５８０）である。別の態様において、プロモーターはＧＲＫ１プロモーターの２９２ｎｔのフラグメント（位置１７９３－２０８７）である（Ｂｅｌｔｒａｎら、ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ２０１０１７：１１６２－７４（本明細書に引用することによりここに組み込まれる）もまた参照されたい）。別の好ましい態様において、プロモーターはヒト光受容体間レチノイド結合タンパク質近位（ＩＲＢＰ）プロモーターである。別の態様において、プロモーターは発現されるべき遺伝子の本来のプロモーターである。一態様において、プロモーターはＲＰＧＲ近位プロモーターである（Ｓｈｕら、ＩＯＶＳ、Ｍａｙ２０１２（本明細書に引用することにより組み込まれる）。本発明で有用な他のプロモーターは、ロッドオプシンプロモーター、赤緑オプシンプロモーター、青オプシンプロモーター、ｃＧＭＰ－β－ホスホジエステラーゼプロモーター、マウスオプシンプロモーター（上で引用されるＢｅｌｔｒａｎら２０１０）、ロドプシンプロモーター（Ｍｕｓｓｏｌｉｎｏら、ＧｅｎｅＴｈｅｒ、Ｊｕｌｙ２０１１、１８（７）：６３７－４５）；コーントランスデューシンのαサブユニット（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙら、ＢＭＣＤｅｖ，Ｂｉｏｌ、Ｊａｎ２０１１、１１：３）；βホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）プロモーター；網膜色素変性症（ＲＰ１）プロモーター（Ｎｉｃｏｒｄら、Ｊ．ＧｅｎｅＭｅｄ、Ｄｅｃ２００７、９（１２）：１０１５－２３）；ＮＸＮＬ２／ＮＸＮＬ１プロモーター（Ｌａｍｂａｒｄら、ＰＬｏＳＯｎｅ、Ｏｃｔ．２０１０、５（１０）：ｅ１３０２５）、ＲＰＥ６５プロモーター；ｒｅｔｉｎａｌｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｌｏｗ／ペリフェリン２（Ｒｄｓ／ｐｅｒｐｈ２）プロモーター（Ｃａｉら、ＥｘｐＥｙｅＲｅｓ．２０１０Ａｕｇ；９１（２）：１８６－９４）；及びＶＭＤ２プロモーター（Ｋａｃｈｉら、ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ、２００９（２０：３１－９））を包むがこれらに限定されない。光受容体特異的プロモーターの例は、ロッドオプシンプロモーター、赤緑オプシンプロモーター、青オプシンプロモーター、光受容体間結合タンパク質（ＩＲＢＰ）プロモーター及びｃＧＭＰ－β－ホスホジエステラーゼプロモーターを包むがこれらに限られない。あるいは、ウイルスプロモーター、構成的プロモーター、調節可能プロモーター［例えば第ＷＯ２０１１／１２６８０８号明細書及び第ＷＯ２０１３／０４９４３号明細書を参照されたい］、又は生理学的合図に応答性のプロモーターのような他のプロモーターを、本明細書に記述されるベクター中で使用しうる。

プロモーターに加え、発現カセット及び／又はベクターは、他の適切な転写開始、終止、エンハンサー配列、スプライシング及びポリアデニル化（ポリＡ）シグナルのような効率的ＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を高める配列（例えばコサックコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を高める配列；並びに所望の場合はコードされる産物の分泌を高める配列を含有しうる。適するポリＡ配列の例は、例えばＳＶ４０、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、ウサギβグロブリン及びＴＫポリＡを包含する。適するエンハンサーの例は、例えば、とりわけ、αフェトプロテインエンハンサー、ＴＴＲミニマルプロモーター／エンハンサー、ＬＳＰ（ＴＨ結合グロブリンプロモーター／α１ミクログロブリン／ビクニンエンハンサー）を包含する。

これら制御配列はｆＨ遺伝子配列に「操作可能に連結」される。本明細書で使用されるところの「操作可能に連結される」という用語は、目的の遺伝子と連続する発現制御配列と、目的の遺伝子を制御するためにトランス又は遠位で作用する発現制御配列との両方を指す。

薬物送達若しくはウイルスベクターの産生に使用される発現カセットは、プラスミド上で人工改変される場合がある。適するウイルスベクターは、好ましくは複製欠損であり、そして眼細胞を標的とするもののなかから選択される。ウイルスベクターは、アデノウイルス；ヘルペスウイルス；レンチウイルス；レトロウイルス；パルボウイルスなどを含むがこれらに限られない、遺伝子治療に適するいかなるウイルスを包む場合がある。

好適には、これらのベクターの１種が生成される場合、複製欠損ウイルスベクターとして産生される。「複製欠損ウイルス」若しくは「ウイルスベクター」は、その中に目的の遺伝子を含有する発現カセットがウイルスキャプシド若しくはエンベロープ中にパッケージングされている、合成若しくは組換えウイルス粒子を指し、ここで該ウイルスキャプシド若しくはエンベロープ内にまたパッケージングされているいかなるウイルスゲノム配列も複製欠損であり；すなわち、それらは子孫ビリオンを生成し得ないがしかし標的細胞を感染させる能力を保持する。一態様において、ウイルスベクターのゲノムは複製するために必要とされる酵素をコードする遺伝子を包含しない（該ゲノムは「中身がない（ｇｕｔｌｅｓｓ）」であるように人工改変される場合がある、すなわち、人工ゲノムの増幅及びパッケージングに必要とされるシグナルに挟まれた目的の導入遺伝子のみを含有する）が、しかしこれら遺伝子は産生中に供給されうる。従って、それは遺伝子治療における使用に安全と思われる。複製及び子孫ビリオンによる感染が、複製のため必要とされるウイルス酵素の存在下を除き発生し得ないためである。

一態様において、ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルスベクターは、標的細胞への送達のための核酸配列をパッケージングされているＡＡＶタンパク質キャプシドを有するＡＡＶＤＮアーゼ抵抗性粒子である。ＡＡＶキャプシドは、選択されるＡＡＶに依存しておよそ１：１：１０ないし１：１：２０の比で正二十面体対称で配置される６０個のキャプシドタンパク質サブユニットＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３から構成される。

本明細書に説明される研究は、具体的に説明するベクターとしてＡＡＶ８を利用する。本明細書で使用される「ＡＡＶ８キャプシド」は、本明細書に引用することにより組み込まれるＧｅｎＢａｎｋ受託：ＹＰ＿０７７１８０にコードされるアミノ酸配列を有するＡＡＶ８キャプシドを指す。ＧｅｎＢａｎｋ受託：ＹＰ＿０７７１８０；米国特許第７，２８２，１９９号明細書、同第７，７９０，４４９号明細書；同第８，３１９，４８０号明細書；同第８，９６２，３３０号明細書；第ＵＳ８，９６２，３３２号明細書中の参照アミノ酸配列に対する約９９％の同一性、（すなわち参照配列から約１％未満の変動）を有する配列を包含しうる、このコードされる配列からの若干の変動が本発明に含まれる。別の態様において、ＡＡＶ８キャプシドは第ＷＯ２０１４／１２４２８２明細書（本明細書に引用することにより組み込まれる）に説明されるＡＡＶ８バリアントのＶＰ１配列を
有しうる。キャプシド、それをコードする配列の生成方法及びｒＡＡＶウイルスベクターの製造方法が説明されている。例えば、Ｇａｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（１０）、６０８１－６０８６（２００３）、第ＵＳ２０１３／００４５１８６Ａ１号明細書及び第ＷＯ２０１４／１２４２８２号明細書を参照されたい。ある態様において、所望の標的細胞、例えば肝、光受容体、ＲＰＥ若しくは他の眼細胞に対する親和性を示すＡＡＶ８バリアントを選択する。例えば、ＡＡＶ８キャプシドは、Ｋａｙら、ＴａｒｇｅｔｉｎｇＰｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓｖｉａＩｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌＤｅｌｉｖｅｒｙＵｓｉｎｇＮｏｖｅｌ，Ｃａｐｓｉｄ－ＭｕｔａｔｅｄＡＡＶＶｅｃｔｏｒｓ、ＰＬｏＳＯｎｅ．２０１３；８（４）：ｅ６２０９７．２０１３年４月２６日オンラインで公表された（引用することにより本明細書に組み込まれる）に説明されるＹ４４７Ｆ、Ｙ７３３Ｆ及びＴ４９４Ｖ突然変異（「ＡＡＶ８（Ｃ＆Ｇ＋Ｔ４９４Ｖ）」及び「ｒｅｐ２－ｃａｐ８（Ｙ４４７Ｆ＋７３３Ｆ＋Ｔ４９４Ｖ）」ともまた呼ばれる）を有しうる。例えばＭｏｗａｔら、Ｔｙｒｏｓｉｎｅｃａｐｓｉｄ－ｍｕｔａｎｔＡＡＶｖｅｃｔｏｒｓｆｏｒｇｅｎｅｄｅｌｉｖｅｒｙ
ｔｏｔｈｅｃａｎｉｎｅｒｅｔｉｎａｆｒｏｍａｓｕｂｒｅｔｉｎａｌｏｒｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌａｐｐｒｏａｃｈ、ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ２１、９６－１０５（Ｊａｎｕａｒｙ２０１４）（引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい。別の態様において、ＡＡＶキャプシドは、双極細胞を優先的に標的とするＡＡＶ８ｂｐキャプシドである。第ＷＯ２０１４／０２４２８２号明細書（引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ１、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ２、ｒｈ８を包含する他のＡＡＶ血清型を、ＡＡＶウイルスベクターのキャプシド（ＤＮアーゼ抵抗性ウイルス粒子）の供給源として選択しうる［例えば、米国公開特許出願第２００７－００３６７６０－Ａ１号明細書；米国公開特許出願第２００９－０１９７３３８－Ａ１号明細書；第ＥＰ１３１０５７１号明細書を参照されたい］。第ＷＯ２００３／０４２３９７号明細書（ＡＡＶ７及び他のサルＡＡＶ）、米国特許第７７９０４４９号明細書及び米国特許第７２８２１９９号明細書（ＡＡＶ８）、第ＷＯ２００５／０３３３２１号明細書並びに第ＵＳ７，９０６，１１１号明細書（ＡＡＶ９）、並びに第ＷＯ２００６／１１０６８９号明細書］もまた参照されたく、並びに、ｒｈ１０［第ＷＯ２００３／０４２３９７号明細書］、それらの若しくはなお発見されるべきバリアント、又はそれらに基づく組換えＡＡＶをＡＡＶキャプシドの供給源として使用しうる。これらの文書はＡＡＶを生成するために選択しうる他のＡＡＶもまた説明し、そして引用することにより組み込まれる。いくつかの態様において、ウイルスベクター中での使用のためのＡＡＶｃａｐは、前述のＡＡＶＣａｐ若しくはそのコーディング核酸の１種の突然変異誘発により（すなわち挿入、欠失若しくは置換により）生成し得る。いくつかの態様において、ＡＡＶキャプシドは、前述のＡＡＶキャプシドタンパク質の２若しくは３若しくは４種又はそれ以上からのドメインを含んでなるキメラである。いくつかの態様において、ＡＡＶキャプシドは、２若しくは３種の異なるＡＡＶ又は組換えＡＡＶからのＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３単量体のモザイクである。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ組成物は前述のＣａｐの１種以上を含んでなる。

ＩＴＲは、発現カセットをビリオン中にパッケージングするために、遺伝子と同一の構築物中にシスで必要とされる唯一のＡＡＶ成分である。一態様において、複製（ｒｅｐ）及び／又はキャプシド（ｃａｐ）のコーディング配列がＡＡＶゲノムから除去され、そして、ＡＡＶベクターを生成するためにトランスで若しくはパッケージング細胞株により供給される。例えば、上述されたとおり、シュードタイピングされたＡＡＶは、ＡＡＶキャプシドの供給源と異なる供給源からのＩＴＲを含有しうる。加えて、若しくは、あるいは、キメラＡＡＶキャプシドを利用しうる。なお他のＡＡＶ成分を選択しうる。こうしたＡ
ＡＶ配列の供給源は本明細書に説明され、そしてまた単離されうるか、又は学術的、商業的若しくは公的供給源（例えばＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、バージニア州マナサス）から得ることもできる。あるいは、ＡＡＶ配列は、文献で、若しくは例えばＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）、ＰｕｂＭｅｄ（登録商標）などのようなデータベースで、利用可能である公表された配列への参照により合成若しくは他の適する手段により得ることができる。

発現カセットをＡＡＶウイルス粒子中にパッケージングするのに必要とされる最小配列は、キャプシドと同一ＡＡＶ起源のものでありうるか若しくは（ＡＡＶシュードタイプを産生するため）異なるＡＡＶ起源のものである、ＡＡＶの５’及び３’ＩＴＲである。一態様において、ＡＡＶ２からのＩＴＲ配列若しくはその欠失バージョン（ΔＩＴＲ）を便宜的に及び規制上の承認の時期を早めるために使用する。しかしながら、他のＡＡＶ供給源からのＩＴＲを選択しうる。ＩＴＲの供給源がＡＡＶ２からでありかつＡＡＶキャプシドが別のＡＡＶ供給源からである場合、生じるベクターはシュードタイピングされたと呼ぶことができる。典型的に、ＡＡＶベクターの発現カセットは、ＡＡＶ５’ＩＴＲ、コーディング配列及びいずれかの制御配列、並びにＡＡＶ３’ＩＴＲを含んでなる。しかしながらこれら要素の他の構成が適切な場合がある。Ｄ配列及び末端解離部位（ｔｒｓ）が欠失されているΔＩＴＲと命名される短縮されたバージョンの５’ＩＴＲが記載されている。他の態様において、完全長のＡＡＶ５’及び３’ＩＴＲが使用される。

「ｓｃ」という略語は自己相補性を指す。「自己相補性ＡＡＶ」は、組換えＡＡＶ核酸配列により遺伝されるコーディング領域が分子内二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するよう設計されている発現カセットを有するプラスミド若しくはベクターを指す。感染に際して、第２の鎖の細胞を介する合成を待つよりむしろ、ｓｃＡＡＶの相補性のある半分２つが会合して、複製及び転写の準備ができている１個の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）単位を即座に形成することができる。例えば、ＤＭＭｃＣａｒｔｙら、“Ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓ（ｓｃＡＡＶ）ｖｅｃｔｏｒｓｐｒｏｍｏｔｅｅｆｆｉｃｉｅｎｔｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙｏｆＤＮＡｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”、ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ、（Ａｕｇｕｓｔ２００１）、Ｖｏｌ８、Ｎｕｍｂｅｒ１６、１２４８－１２５４ページを参照されたい。自己相補性ＡＡＶは、例えば米国特許第６，５９６，５３５号明細書；同第７，１２５，７１７号明細書；及び同第７，４５６，６８３号明細書（それらのそれぞれはそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に説明されている。

被験者への送達に適するＡＡＶウイルスベクターの生成及び単離方法は当該技術分野で既知である。例えば、米国特許第７７９０４４９号明細書；米国特許第７２８２１９９号明細書；第ＷＯ２００３／０４２３９７号明細書；第ＷＯ２００５／０３３３２１号明細書、第ＷＯ２００６／１１０６８９号明細書；及び第ＵＳ７５８８７７２Ｂ２号明細書を参照されたい］。１つのシステムでは、産生細胞株を、ＩＴＲにより隣接されている導入遺伝子をコードする構築物並びにｒｅｐ及びｃａｐをコードする構築物（１個若しくは複数）で一過性にトランスフェクトする。第２のシステムでは、ｒｅｐ及びｃａｐを安定して供給するパッケージング細胞株を、ＩＴＲにより隣接されている導入遺伝子をコードする構築物で一過性にトランスフェクトする。これらのシステムのそれぞれにおいて、ＡＡＶビリオンがヘルパーアデノウイルス若しくはヘルペスウイルスへの感染に応答して産生され、汚染するウイルスからのｒＡＡＶの分離を必要とする。より最近、ＡＡＶを回収するためにヘルパーウイルスへの感染を必要としないシステムが開発された。必要とされるヘルパー機能（すなわちアデノウイルスＥ１、Ｅ２ａ、ＶＡ及びＥ４若しくはヘルペスウイルスＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ５２及びＵＬ２９、並びにヘルペスウイルスポリメラーゼ）もまた前記システムによりトランスに供給される。これらのより新しいシステ
ムにおいて、ヘルパー機能は、必要とされるヘルパー機能をコードする構築物での細胞の一過性トランスフェクションにより供給し得るか、若しくは、細胞を、ヘルパー機能をコードする遺伝子を安定に含有するよう操作し得、その発現は転写若しくは転写後レベルで制御し得る。なお別のシステムでは、ＩＴＲにより隣接されている導入遺伝子及びｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を、バキュロウイルスに基づくベクターへの感染により昆虫細胞中に導入する。これら産生システムに関する総説については、全般として、例えば、Ｚｈａｎｇら、２００９、“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓ
ｈｙｂｒｉｄｆｏｒｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ２０：９２２－９２９（そのそれぞれの内容はそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい。これら及び他のＡＡＶ産生システムの作成及び使用方法は以下の米国特許（それらのそれぞれの内容はそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）：第５，１３９，９４１号明細書；同第５，７４１，６８３号明細書；同第６，０５７，１５２号明細書；同第６，２０４，０５９号明細書；同第６，２６８，２１３号明細書；同第６，４９１，９０７号明細書；同第６，６６０，５１４号明細書；同第６，９５１，７５３号明細書；同第７，０９４，６０４号明細書；同第７，１７２，８９３号明細書；同第７，２０１，８９８号明細書；同第７，２２９，８２３号明細書；及び同第７，４３９，０６５号明細書にもまた説明されている。全般として、例えばＧｒｉｅｇｅｒとＳａｍｕｌｓｋｉ、２００５、“Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓａｓａｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙｖｅｃｔｏｒ：Ｖｅｃｔｏｒｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９９：１１９－１４５；Ｂｕｎｉｎｇら、２００８、“Ｒｅｃｅｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓｉｎａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓ
ｖｅｃｔｏｒｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，”Ｊ．ＧｅｎｅＭｅｄ．１０：７１７－７３３；及び下に引用される参考文献（それらのそれぞれはそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい。本発明のいずれかの態様を構築するのに使用される方法は核酸操作の当業者に既知であり、そして遺伝子工学、組換え工学及び合成技術を包含する。例えば、ＧｒｅｅｎとＳａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（２０１２）を参照されたい。同様に、ｒＡＡＶビリオンの生成方法は公知であり、そして適する方法の選択は本発明を限定するものではない。例えばＫ．Ｆｉｓｈｅｒら、（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７０：５２０－５３２及び米国特許第５，４７８，７４５号明細書を参照されたい。

場合によっては、本明細書に説明されるｆＨ遺伝子はｒＡＡＶ以外のウイルスベクターを介して送達しうる。こうした他のウイルスベクターは、アデノウイルス；ヘルペスウイルス；レンチウイルス；レトロウイルス；などを挙げることができるが、これらに限られない、遺伝子治療に適するいかなるウイルスも包含しうるを使用しうる。好適には、これら他のベクターの１種を生成する場合、それは複製欠損ウイルスベクターとして製造される。

「複製欠損ウイルス」若しくは「ウイルスベクター」は、その中で目的の遺伝子を含有する発現カセットがウイルスキャプシド又はエンベロープ中にパッケージングされている合成又は人工ウイルス粒子を指し、ここでウイルスキャプシド若しくはエンベロープ内にまたパッケージングされているいかなるウイルスゲノム配列も複製欠損であり；すなわちそれらは子孫ビリオンを生成し得ないが、しかし標的細胞を感染させる能力を保持する。一態様において、ウイルスベクターのゲノムは複製するために必要とされる酵素をコードする遺伝子を包含しない（該ゲノムは「中身がない（ｇｕｔｌｅｓｓ）」である、すなわ
ち人工ゲノムの増幅及びパッケージングに必要とされるシグナルにより隣接されている目的の導入遺伝子のみを含有するように人工改変し得る）が、しかしこれら遺伝子は産生中に供給されうる。従って、それは遺伝子治療における使用に安全と思われる。複製及び子孫ビリオンによる感染が、複製のため必要とされるウイルス酵素の存在下を除き発生し得ないためである。

本明細書に記載される医薬組成物は、いずれかの適する経路若しくは異なる経路の組合せ、例えば肝への直接送達（場合によっては静脈内を介し、肝動脈を介し、若しくは移植により）、経口、吸入、鼻内、気管内、動脈内、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内及び他の非経口投与経路によるそれの必要な被験体への送達のため設計される。本明細書に記述されるウイルスベクターは単一組成物若しくは複数組成物中で送達しうる。場合によっては、２種若しくはそれ以上の異なるＡＡＶ又は複数のウイルス［例えば第ＷＯ２０１１／１２６８０８号明細書及び第ＷＯ２０１３／０４９４９３号明細書を参照されたい］を送達しうる。別の態様において、複数のウイルスは異なる複製欠損ウイルス（例えばＡＡＶ及びアデノウイルス）を含有しうる。

前記複製欠損ウイルスは、遺伝子移入及び遺伝子治療の応用における使用のため生理学的に許容できる担体と配合し得る。ＡＡＶウイルスベクターの場合、ゲノムコピー（ＧＣ）の定量化を製剤中に含有される用量の尺度として使用しうる。当該技術分野で既知のいずれの方法も、本発明の複製欠損ウイルス組成物のゲノムコピー（ＧＣ）数を決定するのに使用し得る。ＡＡＶＧＣ数滴定の一実施方法は以下のとおりである：精製されたＡＡＶベクターサンプルを最初にＤＮアーゼで処理して、キャプシド形成されないＡＡＶゲノムＤＮＡ若しくは汚染するプラスミドＤＮＡを製造工程から排除する。ＤＮアーゼ抵抗性粒子をその後熱処理にかけてキャプシドからゲノムを放出させる。放出されたゲノムをその後、ウイルスゲノムの特定の領域（通常はポリＡシグナル）を標的とするプライマー／プローブ組を使用するリアルタイムＰＣＲにより定量する。

また、複製欠損ウイルス組成物は、ヒト患者について約１．０×１０⁹ＧＣないし約１．０×１０¹⁵ＧＣ（体重が７０ｋｇの平均的被験体を処置するため）、及び好ましくは１．０×１０¹²ＧＣないし１．０×１０¹⁴ＧＣの範囲にある複製欠損ウイルスの量を含有するように投薬量単位で配合し得る。別の態様において、用量は約１．５×１０¹¹ＧＣ／ｋｇ未満である。例えば、ＡＡＶウイルスの用量は、約１×１０⁹ＧＣ、約５×１０⁹ＧＣ、約１×１０¹⁰ＧＣ、約５×１０¹⁰ＧＣ若しくは約１×１０¹¹ＧＣでありうる。別の例において、バリアントは約０．００１ｍｇないし約１０ｍｇ／ｋｇの量で送達しうる。

前記組換えベクターは公表された方法に従って宿主細胞に送達しうる。好ましくは生理学的に適合性の担体に懸濁されているｒＡＡＶをヒト若しくはヒト以外の哺乳動物被験体に投与しうる。適する担体は、移入ウイルスが向けられる適応症を鑑み当業者により容易に選択されうる。例えば、ある好適な担体は、多様な緩衝溶液と配合されうる生理的食塩水を包含する（例えばリン酸緩衝生理的食塩水）。他の例示的担体は、無菌生理的食塩水、乳糖、ショ糖、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ラッカセイ油、ゴマ油及び水を包含する。担体の選択は本発明を限定しない。

場合によっては、本発明の組成物は、ｒＡＡＶ及び／又はバリアント並びに担体（１種若しくは複数）に加え、保存剤、化学的安定化剤、懸濁化剤及び／又は界面活性剤のような他の非活性の慣習的製薬学的成分を包含する賦形剤を含有しうる。適する例示的保存剤は、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化イオウ、没食子酸プロピル、パラベン類、エチルバニリン、グリセリン、フェノール及びパラクロロフェノールを包含する。好適な化学的安定化剤はゼラチン及びアルブミンを包含する。場合によっては、タンパク質に基づく又は抗体に基づく組成物のために、例えば増量剤、ビーズ、充填
剤、崩壊剤、滑剤、香料、着色料又は他の成分を包含する固体組成物に適する賦形剤を選択しうる。

本明細書に記載されるウイルスベクターその他の構築物を、それの必要な被験体にｆｈバリアントを送達する、増大された半減期を有するｆＨバリアントを被験体に供給するため、及び／又は補体関連障害を処置するための医薬品の製造において使用しうる。

１クールの処置は、同一ウイルスベクター（例えば１種のＡＡＶ８ベクター）又は異なるウイルスベクター（例えば１種のＡＡＶ８及び１種のＡＡＶｒｈ１０）の反復投与を場合によっては必要としうる。例えば、肝に標的化される場合、反復投与は、１８か月、２年、又は天然の肝細胞増殖により引き起こされる発現の希釈によりより長い時間の期間にわたり望ましい場合がある。ウイルス及びタンパク質に基づく処置のさらに他の組合せを、本明細書に記載されるウイルスベクターを使用して選択しうる。場合によっては、本明細書に記載される組成物を、他の抗補体薬物（例えばモノクローナル抗体など）又はタンパク質に基づく治療薬（例えば本明細書に記載されるところの１種又はそれ以上のｆＨバリアントを含有する組成物の送達を包含する）を必要とする投与計画で組合せうる。

例えば、本明細書に記載されるところの人工改変されたｈｆＨバリアントはタンパク質の形態で送達しうる。場合によっては、タンパク質の形態で被験体に送達される場合、ｆＨバリアントはリーダー配列を有するか、又はリーダー配列の全部若しくは一部分を欠く場合がある。場合によっては、タンパク質に基づく治療を、ウイルスに媒介されるｈｆＨバリアントの投与と共に使用しうる。一態様において、ｆＨタンパク質は、ウイルス媒介性の送達システムからの発現の開始になんらかな遅延時間が存在することが見出される場合は、即時放出の形態のｈｆＨ、例えば約２４時間ないし約４８時間若しくはないし約７２時間以内に被験体から消失されることを開始することができるのが典型的な、投与後２時間以内の検出可能な血漿レベルを被験体に提供し得る。別の態様において、ｈｆＨバリアントは、該バリアント中に最低１個の糖鎖付加部位を人工改変することによりその半減期を延長するようさらに改変され、前記バリアント中に存在するＳＣＲの最低１個、前記バリアント中に存在するＳＣＲの最低２個、前記バリアント中に存在するＳＣＲの最低３個若しくはそれ以上で人工改変される。例えば、糖鎖付加部位はＳＣＲ１、ＳＣＲ２、ＳＣＲ３、ＳＣＲ４、ＳＣＲ１９及び／又はＳＣＲ２０の１種又はそれ以上中に人工改変されうる。別の態様において、ＳＣＲ１７及び／又はＳＣＲ１８が付加的に又はあるいはグリコシル化される。なおさらなる一態様において、ＳＣＲ４、１７及び１８がグリコシル化される。ある態様において、糖鎖付加部位をリンカー中に人工改変する場合がある。しかしながら、こうした場合において、リンカーは好ましくは長さが最低アミノ酸６個から約１８個まで、例えば８～１８、１０～１５又は１２アミノ酸である。加えて、又は、あるいは、人工改変されたｈｆＨタンパク質バリアントは、既知技術を使用してペグ化すなわちポリエチレングリコール部分で修飾されうる［例えばＦｅｅ，ＣｏｎａｎＪ．；ＶａｎＡｌｓｔｉｎｅ，ＪａｍｅｓＭ．（２００６）．“ＰＥＧ－ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｎｄｓｅｐａｒａｔｉｏｎｉｓｓｕｅｓ”．ＣｈｅｍｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＳｃｉｅｎｃｅ６１（３）：９２４を参照されたい］。

本明細書で使用されるところの糖鎖付加部位は、炭素原子（Ｃ－結合）、窒素原子（Ｎ－結合）若しくは酸素原子（Ｏ－結合）へのオリゴ糖の付加、又は糖化（タンパク質の窒素原子（例えばＡｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（式中ＸはＰｒｏを除くいずれかのアミノ酸）の一部であるアスパラギン（Ａｓｎ）側鎖の窒素原子への還元糖の非酵素的付加）の点を指す。ある態様において、Ｎ－糖鎖付加部位が望ましい。多様な技術がＮ－糖鎖付加部位を操作するために当該技術分野で既知である。例えば、ＹＬｉｕら、Ｂｉｏｔｅｃｈ
Ｐｒｏｇ２００９Ｓｅｐ－Ｏｃｔ；２５（５）：１４６８－１４７５；Ｓａｌａ
ＲＪ，ＧｒｉｅｂｅｎｏｓＫ．Ｇｌｙｃｏｓｌｙｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓ：ａｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅｓｔｒａｔｅｇｙｔｏｏｐｔｉｍｉｚｅｅｆｆｉｃａｃｙ．ＢｉｏＤｒｕｇｓ．２０１０Ｆｅｂ１；２４（１）：９－２１を参照されたい。

さらに、本明細書で提供されるところの人工改変されたｈｆＨバリアントは、いずれかの適する経路による被験体への送達のために適切な担体及び／又は賦形剤と配合される場合がある。従来の懸濁液担体に加え、担体はリポソーム若しくはナノ担体でありうる。ｈｆＨバリアントの適切な用量は補体関連障害を処置するための十分な血漿レベルを達成するものを包含する。ｈｆＨバリアントの投薬量の例は、限定されるものでないが、約０．０１μｇ／ｋｇないし約３００ｍｇ／ｋｇ、若しくは約０．１μｇ／ｋｇないし約４０ｍｇ／ｋｇ、若しくは約１μｇ／ｋｇないし約２０ｍｇ／ｋｇ、若しくは約１μｇ／ｋｇないし約１０ｍｇ／ｋｇのいずれかの投薬量範囲内の有効量を挙げることができる。例えば、眼内に投与される場合、前記組成物は、例えば約０．１μｇ／ｋｇ以下、約０．０５μｇ／ｋｇ以下、又は０．０１μｇ／ｋｇ以下を包含する低マイクログラム範囲で投与しうる。いくつかの態様において、個体に投与されるｈｆＨバリアントの量は、用量あたり約１０μｇないし約５００ｍｇ、若しくは約１０μｇないし約５０μｇ、約５０μｇないし約１００μｇ、約１００μｇないし約２００μｇ、約２００μｇないし約３００μｇ、約３００μｇないし約５００μｇ、約５００μｇないし約１ｍｇ、約１ｍｇないし約１０ｍｇ、約１０ｍｇないし約５０ｍｇ、約５０ｍｇないし約１００ｍｇ、約１００ｍｇないし約２００ｍｇ、約２００ｍｇないし約３００ｍｇ、約３００ｍｇないし約４００ｍｇ、若しくは用量あたり約４００ｍｇないし約５００ｍｇである。

本医薬組成物は単独で投与しうる。場合によっては、本明細書に説明される組成物は有益な効果を有することが既知の他の分子と組合せで投与しうる。例えば、有用な補助因子は、防腐剤、抗生物質、抗ウイルス及び抗真菌剤並びに鎮痛薬、抗炎症薬、麻酔薬を包含する症状を軽減する補助因子を包含する。別の態様において、眼内投与を企図している場合、網膜の付着若しくは損傷された網膜組織の処置に役立つ分子が望ましいことができる。有用な補助因子の例は、抗ＶＥＧＦ薬（ＶＥＧＦに対する抗体のような）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、アキソカイン（ａｘｏｋｉｎｅ）（ＣＮＴＦの変異タンパク質）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、ニュートロトロフィン（ｎｅｕｔｒｏｔｒｏｐｈｉｎ）３（ＮＴ－３）、ニューロトロフィン－４（ＮＴ－４）、神経成長因子（ＮＧＦ）、インスリン様成長因子ＩＩ、プロスタグランジンＥ２、３０ｋＤ生存因子、タウリン及びビタミンＡを包含する。別の適切な治療薬は、抗補体抗体例えば抗補体調節物質Ｃ３（例えばエクリズマブとして商業的に入手可能であるような）を包含しうる。

本明細書に説明される組成物（ベクターに媒介される及びタンパク質に基づくの双方）は、静脈内（例えば注入ポンプによる）、腹腔内、眼内、動脈内、肺内、経口、吸入、小胞内、筋肉内、気管内、皮下、眼内（硝子体内及び網膜内を包含する）、くも膜下腔内、経皮、経胸膜、動脈内、局所、吸入（例えばスプレーの霧として）、粘膜、（鼻粘膜を介するような）、皮下、経皮、胃腸、関節内、大槽内、脳室内、直腸（すなわち坐剤を介して）、膣（すなわちペッサリーを介して）、頭蓋内、尿道内、肝内及び腫瘍内を含むが、これらに限定されない、いずれかの経路を介して被験体に投与される場合がある。いくつかの態様において、組成物は全身に（例えば静脈内注入により）投与される。いくつかの態様において、組成物は局所に（例えば動脈内若しくは眼内注入により）投与される。

従って、さらなる一局面において、例えば、本明細書に説明されるような補体Ｈ因子関連障害、並びに：急性心筋梗塞後の虚血－再灌流による組織損傷、動脈瘤、卒中、出血性ショック、挫滅創、多臓器不全、循環血液量減少性ショック腸虚血、脊髄損傷及び外傷
性脳傷害；炎症性障害例えば火傷、内毒血症及び敗血症ショック、成人呼吸窮迫症候群、心肺バイパス、血液透析；アナフィラキシーショック、重度喘息、血管浮腫、クローン病、鎌形赤血球貧血、連鎖球菌感染後糸球体腎炎、膜性腎炎、及び膵炎；移植片拒絶例えば超急性異種移植片拒絶；再発性胎児消失及び妊娠高血圧腎症のような妊娠関連疾患；有害薬物反応例えば薬物アレルギー、ＩＬ－２誘発性血管漏出症候群及びＸ線造影剤アレルギー；並びに限定されるものでないが重症筋無力症、アルツハイマー病、多発性硬化症、肺気腫、肥満、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、インスリン依存性糖尿病、急性散在性脳脊髄炎、アジソン病、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性肝炎、クローン病、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本病、特発性血小板減少性紫斑病、天疱瘡、シェーグレン症候群、及び高安動脈炎、心肺バイパス後合併症を挙げることができる自己免疫障害；心筋梗塞；虚血／再灌流傷害；卒中；急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）；敗血症；熱傷；心肺バイパス及び血液透析に伴う炎症；血漿交換；血小板アフェレーシス；白血球フェレーシス；体外式膜型人工肺（ＥＣＭＯ）；ヘパリン誘発性体外ＬＤＬ沈殿（ｅｘｔｒａｃｏｒｐｏｒｅａｌＬＤＬｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）（ＨＥＬＰ）；Ｘ線造影剤誘発性アレルギー反応；移植片拒絶を含むがこれらに限定されない他の補体関連障害を包含する補体関連障害の処置における医薬組成物の使用。

「ある（ａ）」若しくは「ある（ａｎ）」という用語は１若しくはそれ以上を指すことに注意されるべきである。であるから、「ある（ａ）」（若しくは「ある（ａｎ）」）、「１若しくはそれ以上」及び「最低１」は本明細書で互換性に使用される。

「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含んでなる（こと）（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は排他的よりはむしろ包括的に解釈されるべきである。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ）」、「からなる（こと）（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」という語及びその変形は包括的よりはむしろ排他的に解釈されるべきである。本明細中の多様な態様は「含んでなる（こと）」との文言を使用して提示される一方、他の環境下では、関連する態様は「からなる（こと）」若しくは「から本質的になる（こと）」との文言を使用して解釈及び記述されることもまた意図している。

本明細書で使用されるところの「約」という用語は、別の方法で明記されない限り、示される参照からの１０％の変動可能性を意味している。

本明細書で使用されるところの「調節」という用語若しくはその変形は、組成物が生物学的経路の１若しくはそれ以上の成分を阻害できる能力を指す。

本明細書で別の方法で明記されない限り、ホモ接合性被験体及びヘテロ接合性被験体の双方が補体媒介性障害を有する被験体という文言に包含される。

「被験体」は、哺乳動物、例えばヒト、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、ウマ、乳牛、ブタ、又はサル、チンパンジー、ヒヒ若しくはゴリラのようなヒト以外の霊長類である。

本明細書で使用されるところの「疾患」、「障害」、「機能障害」及び「状態」は、別の方法で明記されない限り、被験体における異常な状態を示すために互換的に使用される。

本明細で別の方法で定義されない限り、本明細書で使用される技術および科学用語は、当業者により、及び本出願で使用される用語の多くに対する一般的指針を当業者に提供する刊行物の説明への参照により普遍的に理解されると同一の意味するところを有する。

以下の実施例は例示のみでありかつ本発明を限定することを意図していない。

ヒトＨ因子短縮化バリアント（ｈｆＨ１－４．６７８．１９－２０）の操作及びクローニング：
短縮化バリアントを、製造元のプロトコルに従い、ＰｈｕｓｉｏｎハイフィデリティーＤＮＡポリメラーゼ（カタログ番号Ｍ０５３０Ｓ、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を使用するインバースＰＣＲ法により生成した。インバースＰＣＲの鋳型として使用された完全長ヒト補体Ｈ因子ｃＤＮＡｐＣＭＶＳｐｏｒｔ６はＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃから得た（カタログ番号ＭＨＳ６２７８－２０２８００２９４、クローンＩＤ４０１４８７７１）。ｈｆＨ１－４．６７８．１９－２０の生成に使用されたＰＣＲプライマーを表１に列挙する。ＰＣＲフラグメントを０．８％アガロースゲル上で分離しかつＡｃｃｕＰｒｅｐゲル抽出キット（カタログ番号Ｋ－３０３５、Ｂｉｏｎｅｅｒ）により抽出した後、５０ｎｇのゲル精製されたフラグメントをＲａｐｉｄＤＮＡライゲーションキット（カタログ番号Ｋ－４１２３、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）による核酸連結のため使用し、そしてＤＨ５αコンピテント細胞（カタログ番号１８２５８０１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に形質転換した。陽性クローンを、制限消化又は特異的プライマーを使用するＰＣＲスクリーニングのいずれかにより確認した。その後、ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ６からのｈｆＨ１－４．６７８．１９－２０挿入断片をＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ消化により遊離し、そしてゲル精製されたフラグメントをＥｎｄ－ｒｅｐａｉｒモジュール（カタログ番号Ｅ６０５０Ｓ、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）により平滑化しかつ精製した。このフラグメントを、ｐＣＢＡＢＧベクター（ＣＭＶエンハンサーを伴うニワトリβアクチンプロモーター及び同一遺伝子の部分的イントロン配列、並びにウサギβグロブリン遺伝子ポリアデニル化シグナル配列を有する）中にＥｃｏＲＶ部位でサブクローニングした。陽性クローンを制限消化及びＰＣＲ法により選択した。

ヒトＨ因子短縮化バリアントｈｆＨ１－４．６７８．１７－２０の操作及びクローニング：
短縮化バリアントを、製造元のプロトコルに従ってＰｈｕｓｉｏｎハイフィデリティー
ＤＮＡポリメラーゼ（カタログ番号Ｍ０５３０Ｓ、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を使用するインバースＰＣＲ法により生成した。完全長ヒト補体Ｈ因子ｃＤＮＡｐＣＭＶＳｐｏｒｔ６（インバースＰＣＲの鋳型として使用される）はＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃから得た（カタログ番号ＭＨＳ６２７８－２０２８００２９４、クローンＩＤ４０１４８７７１）。ｈｆＨ１－４．６７８．１７－２０の生成に使用されたＰＣＲプライマーを表１に列挙する。ＰＣＲフラグメントを０．８％アガロースゲル上で分離しかつＡｃｃｕＰｒｅｐゲル抽出キット（カタログ番号Ｋ－３０３５、Ｂｉｏｎｅｅｒ）により抽出した後、５０ｎｇのゲル精製されたフラグメントをＲａｐｉｄＤＮＡライゲーションキット（カタログ番号Ｋ－４１２３、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）による核酸連結のため使用し、そしてＤＨ５αコンピテント細胞（カタログ番号１８２５８０１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に形質転換した。陽性クローンを、制限消化又は特異的プライマーを使用するＰＣＲスクリーニングのいずれかにより確認した。その後、ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ６中の人工改変されたｈｆＨ１－４．６７８．１７－２０バリアントを、ｉｎｆｕｓｉｏｎクローニング法（Ｃｌｏｎｔｅｃｈカタログ番号６３８９０９）によりｐＣＢＡＢＧベクター中にＥｃｏＲＩ部位でサブクローニングした。短縮化タンパク質製造及び発現ベクター中へのクローニングのためのプライマーが表２にあった。

組換えｈｆＨ１－４．６７８．１９－２０タンパク質の発現及び精製：
陽性クローン（ｐＣＢＡＲＢＧベクター中のｈｆＨ１－４．６７８．１９－２０）を、ｈｆＨ１－４．６７８．１９－２０タンパク質の安定性及び機能的活性を評価するためＨＥＫ細胞中にトランスフェクトした。６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ、カタログ番号３５３０４６）中の約８０％コンフルエントのＨＥＫ細胞を、製造元の説明書に従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（カタログ番号１１６６８０１９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｐＣＢＡＲＢＧ中のｈｆＨ１－４．６７８．１９－２０ｃＤＮＡでト
ランスフェクトした。タンパク質発現を、ヤギ抗ヒトＨ因子ＩｇＧ（カタログ番号Ａ２３７、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｔｅｃｈ）を使用するウエスタンブロッティングにより確認した。タンパク質大量発現のため、１５０ｃｍ皿（Ｆａｌｃｏｎ、カタログ番号３５３０２５）中の８０％コンフルエントのＨＥＫ細胞を、製造元の説明書に従って、ＰＥＩ（カタログ番号２３９６６、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いｐＣＢＡＲＢＧプラスミド中のエンドトキシンフリーｈｆＨ１－４．６７８．１９－２０ｃＤＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクション２日後に上清をプレートから回収しかつ０．２μｍフィルターで濾過し、そしてＰＢＳで平衡化されたＯｘ－２３（ＳＣＲ２／３に特異的なマウス抗ヒトｆＨｍＡｂ、カタログ番号１０４０２－１ＶＬ、Ｓｉｇｍａ）セファロースアフィニティーカラム上に負荷した。２５カラム容量を伴う５００ｍＭＮａＣｌを含有するＰＢＳで洗浄した後に、結合されたｈｆＨ１－４．６７８．１９－２０を１００ｍＭグリシンＨＣｌｐＨ２．７で溶離し、そして溶離された画分（画分あたり２ｍｌ）を２００μｌの１．５Ｍトリス－ＨＣｌｐＨ８．５で中和した。溶離されたタンパク質の純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより確認し、そして純粋な画分を合わせかつＰＢＳを２回交換しながら一夜透析した。

マウスＨ因子短縮化バリアント（ｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０）の操作及びクローニング：
短縮化バリアントを、製造元のプロトコルに従い、ＰｈｕｓｉｏｎハイフィデリティーＤＮＡポリメラーゼを使用するインバースＰＣＲ法により生成した。インバースＰＣＲのための鋳型として使用されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（－）中の完全長マウス補体Ｈ因子ｃＤＮＡはＭ．Ｎｏｎａｋａ博士（東京大学、日本、ＮＣＢＩＮＭ００９８８８．３のヌクレオチド１１０－４３６１）より恵与された。ｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０バリアントの生成に使用された全ＰＣＲプライマーを表３に列挙する。ＰＣＲフラグメントを０．８％アガロースゲル上で分離しかつＡｃｃｕＰｒｅｐゲル抽出キットにより抽出した後、５０ｎｇのゲル精製されたフラグメントをＲａｐｉｄＤＮＡライゲーションキットによる核酸連結に使用し、そしてＤＨ５αコンピテント細胞中に形質転換した。陽性クローンを、制限消化により若しくは特異的プライマーを使用するＰＣＲスクリーニングによりのいずれかで確認した。その後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（－）からのｍｆＨ１－４．６７８．－１９－２０挿入断片をＳｍａＩ及びＥｃｏＲＶ消化により遊離しそしてゲル精製した。このフラグメントをｐＣＢＡＲＢＧベクター中にＥｃｏＲ
Ｖ部位でサブクローニングした。陽性クローンを制限消化及びＰＣＲ法により選択した。

組換えｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０タンパク質の発現：
陽性クローン（ｐＣＢＡＲＢＧベクター中のｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０）を、ｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０タンパク質の安定性及び機能的活性を評価するためにＨｅｐａ１Ｃ１Ｃ７細胞（マウス肝細胞癌細胞株、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２０２６）中にトランスフェクトした。６ウェルプレート中の約８０％コンフルエントの細胞を、製造元の説明書に従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用してｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０ｃＤＮＡでトランスフェクトした。タンパク質発現をウサギ抗マウスｆＨＩｇＧ（参照番号１）を使用するウエスタンブロッティングにより確認した。ブロットはＰｉｅｒｃｅＥＣＬｐｌｕｓウエスタンブロッティング基質（カタログ番号８０１９６、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して可視化した。

ＡＡＶ移入プラスミド及びウイルスの生成：
ｐＣＢＡＲＢＧベクターからのｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０若しくはｈｆＨ１－４．６７８．１９－２０発現カセットをＨｉｎｃＩＩ及びＰｓｔＩ消化により遊離し、そしてゲル精製されたフラグメントをＥｎｄＲｅｐａｉｒＭｏｄｕｌｅ（カタログ番号Ｅ６０５０Ｓ、ＮＥＢ）で平滑化し、そして、ＮｈｅＩ及びＸｈｏＩで消化されかつ平滑化された、ペンシルバニア大学ベクターコア（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａＶｅｃｔｏｒＣｏｒｅ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｄ．ｕｐｅｎｎ．ｅｄｕ／ｇｔｐ／ｖｅｃｔｏｒｃｏｒｅ／ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．ｓｈｔｍｌ）からのｐＡＡＶＴＢＧ．ＰＩ．ＥＧＦＰ．ＷＰＲＥ．ＢＧＨベクター（カタログ番号ＰＬ－Ｃ－ＰＶ０１４６）に連結した。陽性クローンをＳｍａＩ消化によりスクリーニングした。

ｈｆＨ１－４．６７８．１７－２０ベクターをもつｐＣＢＡＢＧを、Ｉｎｆｕｓｉｏｎクローニング方法を使用することにより発現カセットの５’端（配列番号６１：ｃｔｇｃｇｃｇｃｔｃｇｃｔｃｇｃｔｃａｃｔｇａｇｇｃｃｇｃｃｃｇｇｇｃａａａｇｃｃｃｇｇｇｃｇｔｃｇｇｇｃｇａｃｃｔｔｔｇｇｔｃｇｃｃｃｇｇｃｃｔｃａｇｔｇａｇｃｇａｇｃｇａｇｃｇｃｇｃａｇａｇａｇｇ－ｇａｇｔｇｇｃｃａａｃｔｃｃ－ａｔｃａｃｔａｇｇｇｇｔｔｃｃｔｔｇｔａｇｔｔａａｔ、ＨｉｎｃＩＩ部位で）及び３’端（配列番号６
２：ａｔｔａａｃｔａｃａａｇｇａａｃｃｃｃｔａｇｔｇａｔｇｇａｇｔｔｇｇｃｃａｃｔｃｃｃｔｃｔｃｔｇｃｇｃｇｃｔｃｇｃｔｃｇｃｔｃａｃｔｇａｇｇｃｃｇｇｇｃｇａｃｃａａａｇｇｔｃｇｃｃｃｇａｃｇｃｃｃｇｇｇｃｔｔｔｇｃｃｃｇｇｇｃｇｇｃｃｔｃａｇｔｇａｇｃｇａｇｃｇａｇｃｇｃｇｃａｇ、ＰｓｔＩ部位で）にＩＴＲｓ（末端逆位配列）を挿入することにより、ＡＡＶ移入プラスミド中に改変した。プライマーを使用して、表４に列挙される鋳型として使用されるｐＥＮＮ．ＡＡＶ．ＴＢＧ．ＰＩ．ＲＢＧベクターからＡＡＶＩＴＲｓを増幅した。ｐＥＮＮ．ＡＡＶ．ＴＢＧ．ＰＩ．ＲＢＧベクターはペンシルバニア大学ベクターコア（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａＶｅｃｔｏｒＣｏｒｅ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｄ．ｕｐｅｎｎ．ｅｄｕ／ｇｔｐ／ｖｅｃｔｏｒｃｏｒｅ／ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．ｓｈｔｍｌ）から得た（カタログ番号ＰＬ－Ｃ－ＰＶ１０１５）。

スーパーコイルのエンドトキシンフリーＡＡＶプラスミドをＥｎｄｏｆｒｅｅプラスミドキット（カタログ番号１２３６２、Ｑｉａｇｅｎ）により製造し、そしてペンシルバニア大学ベクターコア（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａＶｅｃｔｏｒＣｏｒｅ）若しくはマサチューセッツ大学遺伝子治療センターベクターコア（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ
ＣｅｎｔｅｒＶｅｃｔｏｒＣｏｒｅ）によるＡＡＶウイルス製造に使用した。ｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０、ｈｆＨ１－４．６７８．１９－２０若しくはｈｆＨ１－４．６７８．１７－２０をコードするＡＡＶのパッケージング、精製及び力価測定は、記述されるところの標準的手順（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｄ．ｕｐｅｎｎ．ｅｄｕ／ｇｔｐ／ｖｅｃｔｏｒｃｏｒｅ／ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．ｓｈｔｍｌ）を使用することにより達成した。

ｆＨ^m/mマウスにおけるｈｆＨ１－４．６７８．１９－２０及びｈｆＨ１－４．６７８．１７－２０ＡＡＶの治療的有効性：
Ｃ３糸球体腎症を発症したｆＨ^m/mマウスの生成は、過去にＬｅｓｈｅｒら（２０１３）による論文“ＣｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆｆａｃｔｏｒＨｍｕｔａｔｉｏｎａｎｄｐｒｏｐｅｒｄｉｎｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｃａｕｓｅｓｓｅｖｅｒｅＣ３ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ”、ＪＡｍＳｏｃＮｅｐｈｒｏｌ．２
０１３Ｊａｎ；２４（１）：５３－６５．Ｅｐｕｂ２０１２Ｎｏｖ３０に説明されている。Ｃ３糸球体腎症の処置におけるｈｆＨ１－４．６７８．１９－２０及びｈｆＨ１－４．６７８．１７－２０の発現レベル、持続期間及び治療的有効性を試験するため、１０－１２週齢ｆＨ^m/mマウスに３×１０¹²遺伝子コピー／マウス（ｈｆＨ１－４．６７８．１９－２０について）若しくは１×１０¹¹～１×１０¹²遺伝子コピー／マウス（ｈｆＨ１－４．６７８．１７－２０について）を後眼窩経路により注入した。マウスの別個の群において、対照ＡＡＶベクター（ｐＡＡＶ．ＴＢＧ．ＮＵＬＬ．ｒＢＧ）を対照として使用した。天然のヒトｆＨがマウスにおける代替経路（ＡＰ）補体活性化の阻害において機能的に活性であることが以前の研究から既知である（Ｆａｋｈｏｕｒｉ，Ｆ．ら、ＫｉｄｎｅｙＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（２０１０）７８、２７９－２８６；２０１０年５月５日オンラインで公表された）。血液を、注入前、及び注入後１週（ｈｆＨ１－４．６７８．１９－２０について）若しくは注入後１、２週、１、２、３か月（ｈｆＨ１－４．６７８．１７－２０について）に、後眼窩出血を介して回収した。ｆＨ^m/mマウスは、血漿ＡＰ補体活性化制御不全を特徴とする自然発症Ｃ３糸球体腎症を発症し、Ｃ３、Ｂ因子（ｆＢ）及びＣ５消費並びにＣ３及びＣ５ｂ－９の顕著な糸球体沈着に至る（Ｌｅｓｈｅｒら２０１３）。ｈｆＨ１－４．６７８．１９－２０若しくはｈｆＨ１－４．６７８．１７－２０がｆＨ^m/mマウスにおいて機能的に活性である場合、Ｃ３及びｆＢ消費の低減が期待されるであろう。従って、ｈｆＨ１－４．６７８．１９－２０及びｈｆＨ１－４．６７８．１７－２０の治療的有効性についての読み出し情報として、われわれは、ｆＨ^m/mマウス中へのＡＡＶ注入前及び後にウエスタンブロットにより血漿Ｃ３及びｆＢのレベルを検査した。マウス血漿（１μｌ）をサンプル緩衝液で希釈し、そして還元条件下で４－２０％勾配ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに負荷する前に煮沸させた。サンプルをその後ＰＶＤＦメンブレンに転写しそして適切な抗体でプロ－ビングした。Ｃ３及びｆＢの検出のため、ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＣ３Ａｂ（１：４０００、ＭＰＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ
カタログ番号０８５５５５７）若しくはアフィニティー精製されたヤギ抗ヒトｆＢＡｂ（マウスｆＢと交差反応する；１：２５００、カタログ番号Ａ２３５、ＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を一次抗体として、次いでＨＲＰ結合ウサギ抗ヤギＩｇＧ（１：４０００、カタログ番号１７２１０３４、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用した。ブロットをＰｉｅｒｃｅＥＣＬＰｌｕｓウエスタンブロッティング基質を使用して可視化した。

マウス血液中のｈｆＨ１－４．６７８．１９－２０若しくはｈｆＨ１－４．６７８．１７－２０タンパク質の検出：
ＡＡＶ処置されたｆＨ^m/mマウスにおけるｈｆＨ１－４．６７８．１９－２０又はｈｆＨ１－４．６７８．１７－２０の存在を検出するため、ＥＬＩＳＡ法を開発しかつ使用した。簡潔には、９６ウェルプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ）を、４μｇ／ｍｌの抗ヒトＨ因子ｍＡｂ（ＯＸ－２３）で室温で２時間前コーティングした。プレート上の占有されない結合部位をＰＢＳ中１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用して室温で１時間ブロッキングした。１０ｍＭＥＤＴＡを含有するブロッキング緩衝液中の連続して希釈されたマウス血漿サンプルをウェルに添加しかつ室温で１時間インキュベートし、次いで２μｇ／ｍｌのビオチン標識抗ｈｆＨｍＡｂ（クローンＬ２０／３、ヒトＨ因子のＳＣＲ１９に特異的、カタログ番号５１８５０４、Ｂｉｏ－Ｌｅｇｅｎｄ）及び室温で１時間インキュベートした。洗浄した後、プレートをその後アビジン－ＨＲＰ（１／１０００、Ｃａｔ５５４０５８、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とともに室温で１時間インキュベートし、そしてＴＭＢ基質試薬（Ｃａｔ５１－２６０６ＫＣ及びＢＤＣａｔ５１－２６０７ＫＣ、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して発色させた。

ｆＨ^m/m若しくはｆＨ^m/mＰ^-/-マウスにおけるＡＡＶにより送達されるｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０の治療的有効性：
ｈｆＨ１－４．６７８．１９－２０の代理物としてのｍｆＨ１－４．６７８．１９－２
０の治療的有効性を試験するため、ｆＨ^m/mマウス及びｆＨ^m/mＰ^-/-マウスを、ｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０のコーディング配列を含有するＡＡＶベクターに感染させた。Ｌｅｓｈｅｒら（Ｌｅｓｈｅｒら、２０１３、上で引用される）により過去に説明されたとおり、ｆＨ^m/mマウスはＣ３及びｆＢ消費を伴う致死性でないＣ３糸球体腎症を発症した一方、二重変異体ｆＨ^m/mＰ^-/-マウス（プロパージンが欠損にされたｆＨ^m/mマウス）は悪性かつ致死性の形態のＣ３糸球体腎症を発症し、そして１０～１２週齢までに死亡した（Ｌｅｓｈｅｒら２０１３）。従って、ｆＨ^m/mＰ^-/-マウスは、われわれがｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０ＡＡＶの治療的有効性のもう一つの読み出し情報として死亡率を使用することもまた可能にするとみられる。７週齢ｆＨ^m/m若しくはｆＨ^m/mＰ^-/-マウスに対照ＡＡＶ（ｐＡＡＶ．ＴＢＧ．ＮＵＬＬ．ｒＢＧ）若しくはｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０ＡＡＶのいずれかを３×１０¹²遺伝子コピー／マウスで後眼窩経路により注入した。血液を、注入前、注入後１週間以降の多様な時間点で後眼窩出血を介して回収した。血漿Ｃ３及びｆＢレベルを評価するため、マウス血漿（１μｌ）をサンプル緩衝液で希釈し、そして還元条件下で４－２０％勾配ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに負荷する前に煮沸させた。サンプルをその後ＰＶＤＦメンブレンに転写し、そして適切な抗体でプロービングした。Ｃ３及びｆＢについて、ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＣ３Ａｂ若しくはアフィニティー精製されたヤギ抗ヒトｆＢＡｂ（マウスｆＢと交差反応する）を一次抗体として使用し、次いでＨＲＰ結合ウサギ抗ヤギＩｇＧで検出した。いくつかの場合において、処置されたマウスは、死亡の予防におけるｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０ＡＡＶの有効性並びに／若しくは読み出し情報として血漿Ｃ３及びｆＢレベルを使用するＡＰ補体活性化を観察するため、６若しくは１０か月間追跡した。

ｆＨ^m/mマウスにおけるｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０ＡＡＶの投薬量決定：
治療的有効性を達成するのに必要とされるｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０ＡＡＶコピーの量を滴定することを目的とされる実験において、１０～１２週齢ｆＨ^m/mマウス（Ｌｅｓｈｅｒ、２０１３）に１×１０¹²、３×１０¹¹若しくは１×１０¹¹遺伝子コピー／マウスのＡＡＶを後眼窩経路により注入した。血液を、注入前及び指定される時間点（注入１週及び１か月後）に後眼窩出血を介して回収した。マウス血漿（１μｌ）をサンプル緩衝液で希釈し、そして還元条件下で４－２０％勾配ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに負荷する前に煮沸させた。サンプルをその後ＰＶＤＦメンブレンに転写し、そして適切な抗体でプロービングした。Ｃ３及びｆＢの検出のため、ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＣ３Ａｂ（１：４０００、カタログ番号０８５５５５７、ＭＰＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）若しくはアフィニティー精製されたヤギ抗ヒトｆＢＡｂ（マウスｆＢと交差反応する；１：２５００、カタログ番号Ａ２３５、ＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）を一次抗体として使用し、次いでＨＲＰ結合ウサギ抗ヤギＩｇＧ（１：４０００、カタログ番号１７２１０３４、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で検出した。ブロットをＰｉｅｒｃｅＥＣＬＰｌｕｓウエスタンブロッティング基質を使用して可視化した。

ＥＬＩＳＡによるマウス血液中のｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０タンパク質の検出：
マウス血液中のｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０タンパク質の存在を検出するため、ＥＬＩＳＡアッセイを開発しかつ使用した。簡潔には、９６ウェルプレートを、２μｇ／ｍｌのマウス抗マウスｆＨＳＣＲ１９－２０ｍＡｂ（クローン１２、ｆＨ^m/mマウスを組換えマウスｆＨＳＣＲ１９－２０で免疫化することにより学内で生成された（Ｂａｒａｔａ，Ｌ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ１９０（６）：２８８６－９５（２０１３））で３７℃で１～２時間室温で前コーティングした。プレート上の占有されない結合部位をＰＢＳ中１％ＢＳＡで室温で１時間ブロッキングした。１０ｍＭＥＤＴＡを含有するブロッキング緩衝液中の連続して希釈されたマウス血漿サンプルをウェルに添加しかつ室温で１時間、次いでビオチン標識ウサギ抗マウスｆＨ抗体（Ｌｅｓｈｅｒら、２０１３）室温で１時間インキュベートした。プレートをアビジン－ＨＲＰとともに室温で１時間インキュベートし、その後ＴＭＢ基質試薬を使用して発色させた。

ウエスタンブロッティングによるマウス血漿中のｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０タンパク質の検出：
ウエスタンブロットによるマウス血液中のｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０タンパク質の存在を検出するため、１０μｌのマウス血漿を１０ｍＭＥＤＴＡを含有する９０μｌのＰＢＳで希釈し、そして抗マウスｆＨｍＡｂ（クローン１２）結合されたＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビーズと室温で３０分間インキュベートした。５００ｍＭＮａＣｌを含有するＰＢＳで２回洗浄した後、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビーズをＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプル緩衝液とともに５分間煮沸し、そしてＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で泳動した。サンプルをその後ＰＶＤＦメンブレンに転写し、そしてｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０タンパク質を、ＢＳＡに前吸収されたウサギ抗マウスｆＨ１９－２０Ａｂ（Ｌｅｓｈｅｒら、２０１３）により検出した。ブロットはＰｉｅｒｃｅＥＣＬＰｌｕｓウエスタンブロッティング基質を使用して可視化した。

腎におけるＣ３の免疫蛍光染色：
対照ＡＡＶ若しくはｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０ＡＡＶで処置されたｆＨ^m/m若しくはｆＨ^m/mＰ^-/-マウスからの腎を、ＯＣＴ培地中で急速凍結しかつ－８０℃で保存した。免疫蛍光研究のため、４μｍ切片を薄切しかつ染色に使用した。Ｃ３染色のため、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＣ３Ａｂを使用し（１：５００、カタログ番号８５５５００、ＭＰＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）、そして実験は説明された（Ｌｅｓｈｅｒら２０１３）とおり実施された。

マウス生存分析：
以下の表は対照ＡＡＶ８ベクター若しくはＡＡＶ８－ｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０ベクターで処置されたｆＨ^m/mＰ^-/-マウスの生存データの要約を提供する。対照ＡＡＶ８ベクターで処置された全８ｆＨ^m/mＰ^-/-マウスが処置の２～３週以内に死亡した一方、ＡＡＶ８－ｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０ベクターで処置された９ｆＨ^m/mＰ^-/-マウスのうち７匹が致死性Ｃ３糸球体腎症から救助された。全マウスに３×１０¹²遺伝子コピー／マウスのそれぞれのＡＡＶウイルスを後眼窩Ｉ．Ｖ．経路を通じ注入した。対照ＡＡＶ若しくはｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０ＡＡＶで処置されたｆＨ^m/mＰ^-/-マウスの生存をＡＡＶ処置後１０か月間記録した。データは打ち切り（安楽死）又は自然死であるとして分類し、そしてＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ（カリフォルニア州ラホヤ）により分析した。

ヘパリン結合アッセイ：
ｈｆＨ１－４．６７８．１９－２０及びｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０タンパク質のヘパリン結合活性を試験するため、９６ウェルプレートを重炭酸緩衝液（ｐＨ６．９）中１００μｇのヘパリン（Ｓｉｇｍａ、Ｈ３３９３）で３７℃で１時間前被覆した。プレート上の占有されない結合部位をＰＢＳ中１％ＢＳＡで室温で１時間ブロッキングした。多様な量のｈｆＨ１－４．６７８．１９－２０又はｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０タンパク質を添加しそして室温で１時間、次いで２μｇ／ｍｌのマウス抗ヒトｆＨｍＡｂ（ＯＸ－２３）とともに室温で１時間インキュベートした。プレートをＨＲＰ結合ウサギ抗マウスＩｇＧ（１／４０００、カタログ番号Ａ９０４４、Ｓｉｇｍａ）とともに室温で１時間インキュベートし、その後ＴＭＢ基質試薬を使用して発色させた。

Ｃ３ｂ結合アッセイ：
ｈｆＨ１－４．６７８．１９－２０及びｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０タンパク質のＣ３ｂ結合活性を試験するため、９６ウェルプレートを２μｇ／ｍｌのヒトＣ３ｂ（カタログ番号Ａ１１４、ＣｏｍｐＴｅｃｈ）で３７℃で１時間前コーティングした。プレート上の占有されない結合部位をＰＢＳ中１％ＢＳＡで室温で１時間ブロッキングした。多様な量のｈｆＨ１－４．６７８．１９－２０又はｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０タンパク質を添加しそして室温で１時間、次いで２μｇ／ｍｌのマウス抗ヒトｆＨｍＡｂ（ＯＸ－２３）室温で１時間インキュベートした。プレートをＨＲＰ結合ウサギ抗マウスＩｇＧとともに室温で１時間インキュベートし、その後ＴＭＢ基質試薬を使用して発色させた。

Ｉ因子に媒介されるＣ３ｂ切断におけるｆＨタンパク質の液相補助因子活性のアッセイ：
Ｃ３ｂのＩ因子に媒介される切断におけるｈｆＨ１－４．６７８．１９－２０及びｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０タンパク質の液相補助因子活性を評価するため、０．５又は０．２５μｇの精製されたｈｆＨ１－４．６７８．１９－２０又はｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０タンパク質を１５μｌのＰＢＳ中の２μｇのヒトＣ３ｂと混合し、そして１μｇのヒトＩ因子（カタログ番号Ａ１３８、ＣｏｍｐＴｅｃｈ）をその後添加しかつ３７℃で１５分間インキュベートした。反応を５×還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプル緩衝液を添加することにより停止した。Ｃ３ｂのタンパク質分解を、還元条件下で４－２０％勾配
ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを使用してα鎖の切断並びにα４１及びα３９フラグメントの生成を分析すること、次いでＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＣ３ＩｇＧ（１／４０００、カタログ番号８５５２３７、ＭＰｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を使用するウエスタンブロット検出により測定した。ブロットはＰｉｅｒｃｅＥＣＬＰｌｕｓウエスタンブロッティング基質を使用して可視化した。

膜補体調節物質の欠損により引き起こされるＡＰ補体活性化の予防におけるｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０の治療的有効性の評価：
ｆＨ１－４．６７８．１９－２０ＡＡＶ処置が膜補体調節物質の欠損により引き起こされるＡＰ補体活性化の予防においてもまた有効でありうるかどうかを決定するため、ｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０を、２種の膜補体調節物質ＤＡＦ及びＣｒｒｙが欠損しているマウスの一系統（ＤＡＦ／Ｃｒｒｙ二重変異体マウス）において試験した。ＤＡＦ／Ｃｒｒｙ二重変異体マウス（ＤＡＦ^-/-－Ｃｒｒｙ^flox/flox－Ｔｉｅ－２Ｃｒｅ⁺）の作出は、過度のＡＰ補体活性化による二次的補体欠乏症の表現型で以前に説明された（Ｂａｒａｔａら、２０１３）。ｆＨ^m/mマウスと同様、ＤＡＦ／Ｃｒｒｙ二重変異体マウスにおいてＣ３及びｆＢ消費が存在した（Ｂａｒａｔａら、２０１３）。ＤＡＦ／Ｃｒｒｙ二重変異体マウス（１０週齢）に、ｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０ＡＡＶを３×１０¹²遺伝子コピー／マウスで後眼窩経路により注入した。血液を注入前及び注入後１週に後眼窩出血を介して回収した。治療的有効性を、ウエスタンブロット分析を使用してｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０ＡＡＶ処置前及び後の血漿Ｃ３及びｆＢレベルを測定することにより評価した。ウエスタンブロットのため、マウス血漿（１μｌ）をサンプル緩衝液で希釈し、そして還元条件下で４－２０％勾配ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに負荷する前に煮沸させた。サンプルをその後ＰＶＤＦメンブレンに転写しかつ適切な抗体でプロービングした。マウスＣ３及びｆＢの検出のため、ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＣ３Ａｂ（１：４０００、カタログ番号０８５５５５７、ＭＰＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）若しくはアフィニティー精製されたヤギ抗ヒトｆＢＡｂ（カタログ番号Ａ２３５、ＣｏｍｐＴｅｃｈ、テキサス州、マウスｆＢと交差反応する）を一次抗体として使用し、次いでＨＲＰ結合ウサギ抗ヤギＩｇＧで検出した。ブロットはＰｉｅｒｃｅＥＣＬＰｌｕｓウエスタンブロッティング基質を使用して可視化した。

ａＨＵＳマウスモデルの生成：
ＡＡＶ媒介性ｆＨ遺伝子治療の治療的有効性を試験するためのマウスａＨＵＳモデルを創成するため、ａＨＵＳ患者で見出されるヒトｆＨＷ１１８３Ｒ突然変異に対応するＳＣＲ２０中の１個のｆＨ点突然変異を有する変異体マウス系統を、相同的組換えに基づく遺伝子ターゲッティング技術（Ｌｅｓｈｅｒら、２０１３；Ｄｕｎｋｅｌｂｅｒｇｅｒら、ＪＩｍｍｕｎｏｌ．２０１２Ａｐｒ１５；１８８（８）：４０３２－４０４２；Ｔａｋａｓｈｉら、Ｂｌｏｏｄ．２００９Ｍａｒ１９；１１３（１２）：２６８４－２６９４；ＫｉｍｕｒａＹ１ら、Ｂｌｏｏｄ．２００８Ｊａｎ１５；１１１（２）：７３２－４０．Ｅｐｕｂ２００７Ｏｃｔ４；ＫｉｍｕｒａＹ１ら、ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ．２０１０Ｏｃｔ；１２０（１０）：３５４５－５４）により作成した。この実験のため、ｆＨ遺伝子フラグメントを、遺伝子ターゲッティングベクターを構築するために、ＥｘｐａｎｄＬｏｎｇＴｅｍｐｌａｔｅＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ、インディアナ州インディアナポリス）を使用することによりＣ５７ＢＬ／６マウスゲノムＤＮＡから増幅した。ターゲッティングベクターのロングアームは、マウスｆＨ遺伝子の第２１エキソン及び隣接するイントロン配列を含有する６ｋｂフラグメントから構成された。それを、以下のプライマー：配列番号６７：５’－ｇｃｇｇｃｃｇｃｃｃｔａｔｃｃａｔｔａｇｔｇａｇｔｇｔｇｇ－３’及び配列番号６８：５’－ｃｔｃｇａｇｇａｃａｇｃｇａｔｇｔａａｇａａｃａａｔｃ－３’を使用するＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に連結し、そして挿入断片をその後ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩ制限消化によりＰＣＲ２．１ベクターから遊離し、精製
し、そしてＮＥＯカセットの上流のｐＮＤ１ベクター中にサブクローニングした。ｐＮＤ１ベクターの使用は遺伝子ターゲッティング実験以前の刊行物に記載されており（Ｌｅｓｈｅｒら（２０１３）；Ｄｕｎｋｅｌｂｅｒｇｅｒら、２０１２；Ｍｉｗａら、２００９；Ｋｉｍｕｒａら、２００８；Ｋｉｍｕｒａら２０１２）、そしてこのベクターは、それぞれ陽性及び陰性選択のためのネオマイシン（ＮＥＯ）及びジフテリア毒素（ＤＴ）カセットを含有する（Ｌｅｓｈｅｒら（２０１３）；Ｄｕｎｋｅｌｂｅｒｇｅｒら、２０１２；Ｍｉｗａら、２００９；Ｋｉｍｕｒａら、２００８；Ｋｉｍｕｒａら２０１２）。該ｐＮＤ１ベクターは、ｌｏｘＰ部位、及びＦＬＰｅ組換え酵素によるＮＥＯの潜在的除去のためのＮＥＯカセットに隣接する２個のフリッパーゼ認識標的（ＦＲＴ）部位もまた含有する（ＲｏｄｒiｇｕｅｚＣＩら、ＮａｔＧｅｎｅｔ．２０００Ｊｕｎ；２５（２）：１３９－４０．）。

ショートアーム配列は、マウスｆＨ遺伝子のＳＣＲ２０をコードする第２２エキソン及び隣接するイントロン配列を含有する３．８５ｋｂのフラグメントから構成された。この配列を、以下のプライマー：配列番号６９：５’－ｇｇｔａｃｃａａｇｃｔｔａｔｔｇａｃｃａｇｃｔａｃａｇａｃａｇｔａ－３’及び配列番号７０：５’－ｇｇｔａｃｃｃｔｃａｃｔｃａｇｇｔｇｔａｔｔａｃｔｃ－３’を使用してＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ２．１ベクター中にクローン化し、そしてその後、ＳＣＲ２０中のヒトｆＨのＷ１１８３Ｒ突然変異に対応する位置１２０６のトリプトファン（Ｗ）からアルギニン（Ｒ）突然変異を、以下の２種のプライマー、配列番号７１：５’－ＧＧＡＡＴＣＡＣＡＣＡＡＴＡＴＡＡＴＴＣＴＣＡＡＡＡＧＧＡＧＡＣＡＣＡＣＴＧ－３’及び配列番号７２：５’－ＣＡＧＴＧＴＧＴＣＴＣＣＴＴＴＴＧＡＧＡＡＴＴＡＴＡＴＴＧＴＧＴＧＡＴＴＣＣ－３’とともにＳｔｒａｔａｇｅｎｅＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州）を使用する部位特異的突然変異誘発により作成した。ＷからＲ突然変異を確認した後に、ショートアームフラグメントをＫｐｎＩ消化によりＰＣＲ２．１から遊離し、そして同一制限部位のＮＥＯカセットの下流でｐＮＤ１ベクター中にサブクローニングした。該ターゲッティングベクターをその後ＮｏｔＩ消化により直鎖状にし、そして電気穿孔法によりＣ５７ＢＬ／６胚性幹（ＥＳ）細胞（ＥｍｂｒｏＭＡＸ胚性幹細胞株－系統Ｃ５７ＢＬ／６、カタログ番号ＣＭＴＩ－２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にトランスフェクトした。トランスフェクトされたＥＳ細胞を電気穿孔４８時間後から開始するＧ４１８選択にかけた。相同的組換えを伴うＥＳ細胞を、プライマーとして配列番号７３：５’－ＡＴＡＧＣＡＴＧＴＧＣＣＡＧＧＡＧＡＣＡＣ－３’及び配列番号８３：５’－ＡＧＴＧＴＴＧＡＣＴＣＧＴＧＧＡＧＡＣＣＡ－３’を使用して増幅される４８０ｂｐの３’プローブを用いるＨｉｎｄＩＩＩ消化後のゲノムＤＮＡのサザンブロット分析によりスクリーニングした。野生型対立遺伝子は１２．５ｋｂのフラグメントを生じた一方、標的化された対立遺伝子は１０．２ｋｂのフラグメントを生じた。正しく標的化されたＥＳ細胞（ｆＨ^{W1201R(Neo-positive)/+}）を、ペンシルバニア大学医学部トランスジェニックコア施設（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆ
ＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａＳｃｈｏｏｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＣｏｒｅＦａｃｉｌｉｔｙ）で交尾３．５日後のＣ５７ＢＬ／６Ｊ胚盤胞中に注入してキメラを生成した。結果として生じるキメラは、被毛色、並びに以下の２種のプライマー：Ｎｅｏ－４プライマー：配列番号７４：５－ＣＴＴＧＧＧＴＧＧＡＧＡＧＧＣＴＡＴＴＣ－３’及び配列番号７５：Ｎｅｏ－５プライマー：５’－ＡＧＧＴＧＡＧＡＴＧＡＣＡＧＧＡＧＡＴＣ－３’を使用するＮＥＯの検出のためのＰＣＲスクリーニングの組合せにより評価される、生殖系列の伝達を生じた。ターゲッティングベクター中のネオマイシン耐性カセット（ＮＥＯ）は、フリッパーゼ（ＦＬＰ）組換え酵素によるその後の除去を可能にするため２個のＦＬＰ組換え酵素標的（ＦＲＴ）部位に挟まれた。ヘテロ接合性のＦＨ標的化マウス（ｆＨ^{W1206R(Neo-positive)/+}）をＦＬＰｅトランスジェニックマウス（Ｃ５７ＢＬ／６遺伝的背景でＦＬＰの強化されたバージョンを発現する）と交雑して、ｆＨ対立遺伝子からＮＥＯを除去しかつＮＥＯ遺伝子カセットを伴わないヘテロ接
合性ｆＨ変異体マウス（ｆＨ^W1206R/+）を作成した。ｆＨ^W1206R/+マウスを異系交配して、Ｃ５７ＢＬ／６の遺伝的背景のｆＨ^{W1206R/W1206R}ホモ接合性マウスを作成した。遺伝子型判定のため、以下のプライマーをＰＣＲによる野生型及び変異されたｆＨ対立遺伝子の検出のため使用した：ＷＲ１（ＦＨ特異的）配列番号７６：５’－ＧＡＴＡＴＧＧＴＣＡＡＴＴＴＡＧＧＧＡＡＡＧＴ、配列番号７７：Ｎｅｏ７（ＮＥＯ特異的）５’－ＧＧＧＴＧＧＧＡＴＴＡＧＡＴＡＡＡＴＧＣＣ－３’及び配列番号７８：ＷＲ４（ＦＨ特異的）５’－ＴＡＣＴＧＴＣＴＧＴＡＧＣＴＧＧＴＣＡＡＴ３’。

以下の表は、対照ＡＡＶ若しくはＡＡＶ８－ｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０ベクターを３×１０¹¹ＧＣ／マウスで受領するｆＨ^{W1206R/W1206R}マウスの処置の転帰を要約する。

ホモ接合性ｆＨ^{W1206R/W1206R}マウスは、４～６週齢で明らかになる有意に低い体重及び３０週までの５０％近い死亡率を伴い、元気に育つことができなかった。全ｆＨ^{W1206R/W1206R}マウスが、ａＨＵＳの特徴的な特徴、すなわち腎傷害（上昇された血液尿素窒素レベル及び／又は糸球体中の血栓性微小血管症の組織学的徴候）、血小板減少症及び貧血の１又はそれ以上を示した。ｆＨ^{W1206R/W1206R}マウスの約３分の１は卒中を暗示する重度の神経学的症状も発症した。腎糸球体における血栓性微小血管症に加え、複数器官（肝、肺、脾、腎、脳及び眼）における多数の大血管血栓がｆＨ^{W1206R/W1206R}マウスに存在した。

上で報告された時点で、ＡＡＶ８－ｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０で処置された全３ｆＨ^{W1206R/W1206R}マウスは、正常な血小板数を伴い生存かつ健康であった一方、対照ＡＡＶベクターで処置された２ｆＨ^{W1206R/W1206R}マウスの１匹が死亡し（処置後４週で）及び残存するマウスは血小板減少症を包含するａＨＵＳの症状を示した。

ｆＨ^{W1206R/W1206R}マウスにおけるＡＡＶにより送達されるｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０の治療的有効性：
ｈｆＨ１－４．６７８．１９－２０の代理物としてのｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０の治療的有効性を試験するため、われわれは、４週齢のホモ接合性ｆＨ^{W1206R/W1206R}マウスに３×１０¹¹遺伝子コピー／マウスを後眼窩経路により注入した。ｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０がｆＨ^{W1206R/W1206R}マウスにおいて機能的に活性である場合、血小板減少症及び腎傷害の低下を期待するであろう。従って、ｍｆＨ１－４．６７８．１９－
２０の治療的有効性の読み出し情報として、われわれは血小板の数を計数しかつ血清の血液尿素窒素のレベルを測定した。ｆＨ^{W1206R/W1206R}マウスは、４～６週齢で明白な有意に低い体重及び３０週までに５０％近い死亡率を伴い、元気に育つことができなかったためである。ｆＨ^{W1206R/W1206R}マウスは、われわれがｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０
ＡＡＶの治療的有効性についてのもう一つの読み出し情報として死亡率を使用することもまた可能にするとみられる。

対照ＡＡＶ及びｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０ＡＡＶで処置されたｆＨ^{W1206R/W1206R}マウスにおける血小板数
対照ＡＡＶ及びｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０ＡＡＶで処置されたｆＨ^{W1206R/W1206R}マウスにおける血小板数を測定するため、血液を、注入前及び注入後１か月で開始する多様な時間点で、後眼窩出血を介してＥＤＴＡとともに回収し（最終濃度：０．０２Ｍ）、そしてフィラデルフィア小児病院のＣＴＲＣトランスレーショナルコア検査室（ＣＴＲＣＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌＣｏｒｅＬａｂｏｒａｔｏｒｙａｔｔｈｅ
Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＰｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｔｒｃ．ｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｈｏｐ．ｅｄｕ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ－ｆａｃｉｌｉｔｉｅｓ／ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ－ｃｏｒｅ－ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ－ｔｃｌ／ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ）でＳｙｓｍｅｘＸＴ－２０００ｉＶ自動化血液学分析装置で分析した。

対照ＡＡＶ及びｍｆＨ１－４．６７８．１９－２０ＡＡＶで処置されたｆＨ^{W1206R/W1206R}マウスにおける血液尿素窒素（ＢＵＮ）測定：
血液尿素窒素の血清レベルを測定するため、血液サンプルを注入前及び注入後１か月で開始する多様な時間点で後眼窩出血を介して回収した。血清ＢＵＮレベルを、製造元の説明書に従うことにより尿素窒素試薬（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して測定した。

ｆＨ^{W1206R/W1206R}マウスの腎及び他の器官の組織学的検査：
腎及び他の器官の１対をｆＨ^{W1206R/W1206R}マウスから収集した。一方をホルマリン溶液中で一夜固定しかつパラフィン包埋のため処理し、そして他方をＯＣＴコンパウンド（ＳａｋｕｒａＦｉｎｅｔｅｋ）中で急速凍結した。腎及び他の器官を、光学顕微鏡検査並びに免疫蛍光及び免疫ペルオキシダーゼを包含する免疫組織化学を使用して、ａＨＵＳ／血栓性微小血管症の徴候について組織学的に評価した。

以下の情報は数字見出し＜２２３＞の下のフリーテキストを含む配列について提供される。

本明細で引用される全部の刊行物は引用することにより本明細書に組み込まれる。２０１５年９月２４日に出願された米国仮出願第６２／２３２，００８号明細書もまた引用することにより組み込まれる。同様に、本明細書で参照されかつ添付される配列表中に出現
する配列番号は引用することにより組み込まれる。本発明は特定の態様に関して説明された一方、改変が本発明の技術思想から離れることなくなされ得ることが認識される場合がある。こうした改変は、添付される請求の範囲の範囲内であることを意図している。

Claims

その発現を指図する発現制御配列に操作可能に連結されている人工改変ヒト補体調節物質Ｈ因子（ｆＨ）遺伝子を含む発現カセットをその中にパッケージングしているＡＡＶキャプシドを含む組換えＡＡＶベクターであって、前記ｆＨ遺伝子は配列番号４８のアミノ酸配列を含むｆＨバリアントをコードする、組換えＡＡＶベクター。
前記キャプシドは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ１、ＡＡＶ９又はＡＡＶｒｈ１０キャプシドである、請求項１に記載の組換えＡＡＶベクター。
前記発現カセットは、肝細胞中でのｈｆＨバリアントの発現を特異的に指図するプロモータを含む、請求項２に記載の組換えＡＡＶベクター。
前記発現カセットは、眼について組織特異的なプロモータを含む、請求項１に記載の組換えＡＡＶベクター。
製薬学的に許容できる担体と、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクターとを含む、医薬組成物。
補体関連障害の処置に使用するための、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクターまたは請求項５に記載の医薬組成物。
(i)前記補体関連障害は、デンスデポジット病及びＣ３糸球体腎炎を包含するＣ３糸球
体腎症、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、微小血管症性溶血性貧血、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、急性腎不全、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、統合失調症、虚血性脳卒中、及び／又は細菌性病原体の動員により引き起こされる細菌感染症である、
(ii)前記ＡＡＶベクターは、静脈内、眼内、筋肉内、皮下若しくはそれらの組合せから選択される経路を介して送達される、又は
(iii) タンパク質に基づくｆＨ治療が、ベクターの投与と同時に、それを必要とする被験体に送達される、
請求項６に記載の組換えＡＡＶベクター。
前記補体媒介性障害は加齢黄斑変性であり、
任意的に、前記ベクターは網膜下に投与される、
請求項６に記載の組換えＡＡＶベクター。
前記補体媒介性障害は腎障害である、請求項６に記載の組換えＡＡＶベクター。
配列番号４８のアミノ酸配列を含む、人工改変ヒトｆＨバリアント。
請求項１０に記載の人工改変ヒトｆＨバリアントがペグ化されている、ペグ化ヒトｆＨバリアント。
請求項１０に記載の人工改変ヒトｆＨバリアント、及び担体及び／又は賦形剤を含んでなる医薬組成物。
前記担体はリポソームである、
前記担体はナノ担体である、及び／又は
前記人工改変ｈｆＨバリアントはペグ化されている、
請求項１２に記載の医薬組成物。