ES2327609T3 - Procedimientos y compuestos para controlar la liberacion de vectores de parvovirus reconbinantes. - Google Patents

Procedimientos y compuestos para controlar la liberacion de vectores de parvovirus reconbinantes. Download PDF

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Abstract

Una matriz quirúrgicamente implantable, en la que se ha secado un parvovirus recombinante sobre la matriz quirúrgicamente implantable.

Description

Procedimientos y compuestos para controlar la liberación de vectores de parvovirus recombinantes.
Ámbito de la invención
Esta invención se refiere a la liberación controlada de vectores de parvovirus y, especialmente, a la liberación controlada in vivo de vectores víricos adenoasociados recombinantes (VAAr).
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Antecedentes de la invención
Son conocidas la preparación y administración de muchos fármacos y proteínas terapéuticas tras el secado por congelación (liofilización). Los avances en la química de polímeros y biomateriales han logrado la administración de fármacos mediante su unión a materiales injertados. Por ejemplo, se han utilizado heparina y uroquinasa unidas a materiales injertados vasculares en un intento por mejorar la permeabilidad a largo plazo de los injertos vasculares. Se han impregnado obleas con fármacos quimioterapéuticos para la administración prolongada en el tiempo. Sin embargo, ninguno de estos sistemas administra ADN con el objetivo de una expresión persistente de proteínas terapéuticas en las células hospedadoras.
Los sistemas de administración de terapia génica viral o no viral (p. ej., mediada por lípidos o potenciada por electroporación) dependen de la administración de vectores génicos en soluciones. Las soluciones pueden inyectarse por vía intravenosa, intramuscular, subcutánea o pueden incluso administrarse por vía oral. Estas estrategias se ven dificultadas por el hecho de que muchos vectores o formulaciones para terapia génica no son estables (es decir, pierden la capacidad para infectar células y administrar el ADN) cuando el vector se expone a alteraciones en condiciones como temperatura, hidratación o pH. Además, estas vías pueden inducir una biodistribución indeseablemente rápida del virus administrado a órganos alejados del tejido de administración (p. ej., segundos después de la administración, o de minutos a horas tras la administración intramuscular). Por consiguiente, existe la necesidad de procedimientos en los que pueda conseguirse la inserción génica de forma controlada en el tiempo o retardada y, potencialmente, con una biodistribución retardada del virus, alejada del tejido diana.
El virus adenoasociado (VAA) es un miembro auxiliar no patogénico de la familia de parvovirus. Una de las características que identifican a este grupo es la encapsulación de un genoma de ADN de cadena sencilla (ADNcs). Las cadenas de polaridad más y menos independientes se empaquetan con igual frecuencia y ambas son infecciosas. En cada extremo del genoma de ADNcs, una estructura de repetición terminal (RT) palindrómica se empareja consigo misma dando origen a una configuración en horquilla. Esto sirve como cebador para que la ADN polimerasa celular sintetice la cadena complementaria tras la desencapsulación en la célula hospedadora. El virus adenoasociados generalmente necesita un virus auxiliar para una infección productiva. Aunque normalmente el adenovirus (Ad) sirve para este fin, el tratamiento de las células infectadas por VAA con radiación UV o hidroxiurea (HU) también permitirá una replicación limitada.
Los vectores de inserción génica de VAA recombinantes (VAAr) también empaquetan ADNcs de polaridad más o menos y debe depender de factores de replicación celular para la síntesis de la cadena complementaria. Mientras que, inicialmente, se esperaba que esta etapa pudiera realizarse espontáneamente por medio de rutas de replicación o reparación del ADN celular, este no parece ser el caso. Trabajos preliminares con vectores VAAr mostraron que la capacidad para conseguir la expresión de genes marcadores se potenciaba considerablemente cuando las células se infectaban conjuntamente con adenovirus o se trataban previamente de forma transitoria con agentes genotóxicos. Se ha observado una inducción similar de vectores VAAr in vivo tras el tratamiento con Ad, radiación ionizante o inhibidores de la topoisomerasa. Sin embargo, el efecto era muy variable entre tejidos y tipos celulares diferentes.
Rabinowitz y col. describieron en el Third International Cancer Gene Therapy Meeting, en mayo de 1998, el esfuerzo para establecer la eficacia de la inserción génica mediada por VAA tras una desecación completa. En aquel momento, se demostró que el VAA recombinante seguía siendo infeccioso y competente para la transducción inserción génica que induce la expresión de la proteína transgénica). Desde ese momento, los presentes inventores han realizado estudios adicionales de inserción génica mediada por VAA tras la desecación del virus, basados en el argumento de que una limitación de la terapia génica con vectores virales administrados al torrente sanguíneo, o incluso administrado a nivel local a tejidos como el pulmón o músculo en dosis grandes, es la dispersión de virus a muchos sitios desde el pretendido sitio de acción.
Una desventaja de la dispersión de virus es que, generalmente, se presenta o administra demasiado poco gen terapéutico en el lugar pretendido. Por ejemplo, la utilidad de un gen CFTR que se pretende insertan en el pulmón como tratamiento para la fibrosis quística disminuirá si la mayoría del virus va al hígado o al bazo. Otro problema con los sistemas de inserción génica conocidos es que es difícil calcular una dosis exacta del vector génico requerido para logar el efecto terapéutico deseado. Finalmente, si el vector viral tiene efectos potencialmente tóxicos tras la exposición de órganos distintos a la diana, es deseable localizar el tratamiento terapéutico sólo en el tejido diana y disminuir la dispersión del virus. Un problema constante con la terapia génica es la posibilidad teórica de diseminación no deseada de un vector de inserción génica a las gónadas del sujeto, llevando quizás, por tanto, a la mutagénesis por inserción en las células de la línea germinal. Por consiguiente, la dirección precisa y la cantidad de vectores de terapia génica administrada continúa siendo una prioridad en el desarrollo de sistemas de inserción génica segura y fiable.
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Resumen de la invención
La invención utiliza parvovirus recombinantes y, en particular, virus adenoasociados recombinantes (VAAr) para administrar secuencias de ácidos nucleicos (es decir, genes y secuencias de ADN) para terapia génica tras una etapa de deshidratación o secado (es decir, desecación parcial o completa, liofilización) en la que el vector del virus terapéutico se seca (es decir, se fija) sobre una matriz soporte. Las matrices de soporte útiles incluyen materiales quirúrgicamente implantables (es decir, suturas, material quirúrgico injertable, dispositivos implantables y similares) para el empaquetamiento y transporte al sujeto permitiendo así la administración de terapia génica a través del VAAr unido a las matrices soporte.
Los presentes inventores han caracterizado exhaustivamente el uso del virus adenoasociado en solución como vector de transferencia de genes. Las presentes investigaciones para caracterizar la extraordinaria estabilidad de VAAr en comparación con otros virus de transferencia de genes han llevado al desarrollo de estrategias para deshidratar el virus con el fin de lograr un transporte estable del virus y secar el VAAr sobre materiales implantables (p. ej., suturas, materiales injertables y otros materiales quirúrgicamente implantables), para aplicar directamente el virus a zonas tisulares específicas y locales para la terapia génica.
Se ha caracterizado la estabilidad del VAAr en un intervalo de condiciones de hidratación, pH, temperaturas y contenido de la solución (p. ej., cantidad de estabilizante, azúcar, etc.). Estos estudios llevaron a la caracterización de la estabilidad del VAAr con el tiempo en estado deshidratado. Se encontró que el VAAr producido usando la estructura de la cápside vírica utilizada más frecuentemente (VAA de serotipo 2) mantenía su potencial de transducción tras la desecación. También se encontró que los VAAr producidos usando cápsides de los serotipos 1, 3, 4 y 5 mantenían el potencial de inserción génica tras la desecación.
La presente invención proporciona la capacidad de administrar genes mediante el virus deshidratado cuando se aplica a diversos materiales de sutura (seda, catgut, monofilamento de Vicryl y similares), a membranas de nailon con carga positiva, a matrices de gelatina espumosa y a materiales injertables de politetrafluoroetileno (PTFE). Se ha demostrado la inserción génica y la expresión de proteínas usando cada uno de estos materiales in vitro e in vivo.
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Breve descripción de las figuras
La fig. 1A es un esquema que ilustra el procedimiento básico de la presente invención. Una matriz quirúrgicamente implantable, como una sutura, se pone en contacto con un vector VAA, preferiblemente un vector VAAr que contiene un ácido nucleico heterólogo. A continuación, el vector se seca (es decir, se deseca) sobre la matriz quirúrgicamente implantable. Como se muestra en la fig. 1B, la matriz que contiene el vector VAA desecado se implanta o sutura, a continuación en o sobre un sujeto (p. ej., un humano o animal no humano), preferiblemente de modo que el material de la matriz se absorba en el cuerpo del sujeto. La fig. 1C es una gráfica que muestra que el porcentaje de hematocrito en un ratón inyectado por vía intramuscular con un vector viral portador de eritropoyetina (EPO) es menor con el tiempo que el porcentaje del hematocrito en un ratón tratado con suturas que contienen el vector viral portador de EPO.
La fig. 2 es una gráfica de la realización de la invención descrita a continuación en el Ejemplo 5. En esta figura "SS" significa "super sutura" que es un material de sutura tratado con el vector VAAr portador del gen de EPO. El eje Y corresponde al porcentaje del hematocrito del sujeto (un ratón en este caso). El eje X corresponde a los días tras la administración de VAAr. La leyenda detalla qué puntos de datos proceden de la inyección intramuscular del vector VAAr portador del gen de EPO y cuales son de suturas en las que se ha disecado el vector VAAr portador del gen de EPO, así como la dosis de vector administrada mediante cada uno de los procedimientos. Como se muestra en la fig. 1C, el porcentaje de hematocrito en un ratón inyectado por vía intramuscular con un vector viral portador de EPO es menor con el tiempo que el porcentaje de hematocrito en un ratón tratado con suturas que contienen un vector viral portador de EPO.
La fig. 3 es una ilustración gráfica que compara la transducción de VAAr/mEPO administrado por vía intramuscular y mediante la administración por sutura de VAAr/mEPO.
La fig. 4 es una ilustración gráfica de la administración eficaz del gen GFP y de los genes del factor IX humano con VAA/Goretex® a células en cultivos tisulares.
La fig. 5 es una ilustración gráfica de un ejemplo de representación que compara el rendimiento de los serotipos 1, 2, 3, 4 y 5 de VAAr tras el almacenamiento en estado desecado en un tampón compuesto principalmente de una solución de dextrosa al 25%.
La fig. 6 es una ilustración gráfica en la que se compara el efecto sobre la estabilidad del VAAr de tipo 2 de soluciones almacenadas que comprenden diferentes estabilizantes a concentraciones variables.
Descripción de las realizaciones preferidas
Ahora la presente invención se describirá más detalladamente a partir de aquí, con referencia a los dibujos y a la memoria descriptiva adjuntos, en los que se muestran las realizaciones preferidas de la invención.
Siempre que no se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que normalmente entiende un experto en la materia a la que pertenece esta invención. Según se usa en la descripción de la invención y en las reivindicaciones adjuntas, se pretende que las formas singulares "un/una" y "el/la" incluya también las formas en plural, siempre que el contexto no indique claramente otra cosa.
Excepto cuando se indique otra cosa, pueden utilizarse procedimientos convencionales conocidos por los expertos en la materia para la construcción de genomas de VAAr, transcomplementación de vectores empaquetados y empaquetado de células transfectadas transitoria y establemente para su uso en la presente invención. Los expertos en la materia conocen estas técnicas. Véase, por ejemplo, J. Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989) y F. M. Ausubel y col., Current Protocols In Molecular Biology (Green Publishing Associates, Inc. and Wiley-Interscience, Nueva York, 1991).
Los parvovirus son virus animales con ADN relativamente pequeños que contienen un genoma de ADN de cadena sencilla lineal. El término "parvovirus" como se utiliza en este documento, abarca a la familia Parvoviridae, que incluye parvovirus que se replican de forma autónoma y dependovirus. Los parvovirus autónomos incluyen miembros de los géneros Parvovirus, Erythrovirus, Densovirus, Iteravirus y Contravirus. Los parvovirus autónomos incluyen miembros de los géneros Parvovirus, Erythrovirus, Densovirus, Iteravirus y Contravirus Los ejemplos de parvovirus autónomos incluyen, aunque sin limitaciones, el virus diminuto del ratón, parvovirus bovino, parvovirus canino, parvovirus de pollo, virus de la panleucopenia felina, parvovirus felino, parvovirus de ganso y virus B19. Los expertos en la materia conocen otros parvovirus autónomos. Ver, por ejemplo, K. I. Berns y col., "Parvoviridae: The Viruses And Their Replication", en Virology, Tercera edición (B. N. Fields y col., eds., Lippincott-Raven, Filadelfia, PA, 1996, pág. 2173-2197).
Dentro de la familia de parvovirus, el género Dependovirus comprende los virus adenoasociados (VAA). El virus adenoasociado (VAA) es un miembro no patogénico dependiente de un virus auxiliar de la familia de parvovirus. Los virus adenoasociados incluyen, aunque sin limitaciones, VAA de tipo 1, VAA de tipo 2, VAA de tipo 3, VAA de tipo 4, VAA de tipo 5, VAA de tipo 6, VAA aviar, VAA bovino, VAA canino, VAA equino y VAA ovino. En el uso de la presente invención, se prefieren los VAA de tipo 1, VAA de tipo 2, VAA de tipo 3, VAA de tipo 4 y VAA de tipo 5, siendo especialmente preferido el VAA de tipo 2.
Una de las características que identifican a este grupo de virus es que es un genoma de ADN de cadena sencilla. En el caso de VAA, puede empaquetarse tanto la cadena de polaridad más como menos con igual eficacia, y ambas son infecciosas. Los virus adenoasociados generalmente necesitan un virus auxiliar para lograr una infección productiva. Aunque normalmente el adenovirus (Ad) sirve para este fin, el tratamiento de las células infectadas por VAA con radiación UV o hidroxiurea también permitirá una replicación limitada.
Los vectores de inserción génica de VAA recombinantes (VAAr) también se empaquetan como cadenas sencillas de polaridad más o menos y deben depender de factores de replicación celular para la síntesis de la cadena complementaria. Mientras que originalmente se esperaba que esta etapa pudiera realizarse espontáneamente mediante rutas de reparación de ADN celular, esta visión parece ahora haberse simplificado demasiado. Trabajos preliminares con vectores de VAAr en células cultivadas mostraron que la capacidad para lograr la expresión de genes marcadores se potenciaba considerablemente cuando las células se infectaban conjuntamente con adenovirus. Este efecto se observó en ausencia de cualquier gen vírico de VAA y secuencias reguladoras transcripcionales que actúan en cis de VAA conocidas. Posteriormente, dos grupos demostraron que podía conseguirse un efecto potenciando a través de la expresión del gen E4orf6 de Ad. Se observaba un aumento similar cuando las células se trataban con radiación UV u otros tipos de estrés celular. Adicionalmente, la dosis de estos tratamientos se correlacionaba con el nivel de aumento, lo que también se correlacionaba con la conversión del genoma de ADN del virión (ADNv) de cadena sencilla en doble. También se ha observado una inducción similar de vectores VAAr in vivo tras el tratamiento con Ad, radiación UV, radiación ionizante o inhibidores de la topoisomerasa. Sin embargo, el efecto era muy variable entre tejidos diferentes. Lo más importante, se ha definido que los vectores VAA in vivo necesitan de una a dos semanas antes de que puedan observarse los niveles óptimos de expresión del transgen, una característica adscrita a la síntesis de la segunda cadena. Véase, por ejemplo, Samulski y col., "Adeno-associated Viral Vectors", en The Development of Human Gene Therapy (T. Friedmann, ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York,-
1999).
Las secuencias genómicas de diversos parvovirus autónomos y los diferentes serotipos de VAA, así como las secuencias de las RT, subunidades de la cápside y proteínas Rep son conocidas en la técnica. Dichas secuencias pueden encontrarse en la bibliografía o en bases de datos públicas como GenBank. Véase, por ejemplo, los números de acceso a GenBank NC 002077, NC 001863, NC 001862, NC 001829, NC 001729, NC 001701, NC 001510, NC 001401, AF063497, U89790, AF043303, AF028705, AF028704, J02275, J01901, J02275, X01457, AF288061, AH009962, AY028226, AY028223, NC 001358, NC 001540. Véase también, por ejemplo, Chiorini y col. (1999) J. Virology 73:1309; Xiao y col., (1999) J. Virology 73:3994; Muramatsu y col., (1996) Virology 221:208; publicaciones de patentes internacionales WO 00/28061, WO 99/61601, WO 98/11244; patente de EE.UU. Nº 6.156.300. Xiao, X., (1996), en "Characterization of Adeno-associated virus (AAV) DNA replication and integration", Defensa de Tesis Doctoral, Universidad de Pittsburgh, Pittsburgh, PA proporciona una descripción preliminar de las secuencias RT de VAA1, VAA2 y VAA3.
Preferiblemente, el genoma de VAAr contiene (es decir, "porta") una secuencia de ácido nucleico heteróloga, como una secuencia de ADN o un gen. Según la presente invención, puede administrarse cualquier secuencia (o secuencias) nucleotídica heteróloga. Los ácidos nucleicos de interés incluyen ácidos nucleicos que codifican péptidos y proteínas, preferiblemente péptidos o proteínas terapéuticas (p. ej., para uso médico o veterinario) o inmunogénicos (p. ej., para vacunas).
Como se usa en este documento, el término "vector" o "vector de inserción génica" puede referirse a una partícula de parvovirus (p. ej., VAA) que funcione como vehículo de inserción génica y que comprenda ADNv (es decir, el genoma vector) empaquetado dentro de la cápside del parvovirus (p. ej., VAA). Alternativamente, en determinados contextos, el término "vector" puede utilizarse para referirse al genoma/ADNv vector.
Típicamente, una "secuencia nucleotídica heteróloga" será una secuencia que no aparece de forma natural en el virus. Alternativamente, una secuencia nucleotídica heteróloga puede referirse a una secuencia vírica que se coloca en un entorno en el que no aparece de forma natural (p.ej., mediante la asociación con un promotor con el que no se asocia de forma natural en el virus).
Según se usa en este documento, un "genoma vector de parvovirus recombinante" es un genoma de parvovirus (es decir, ADNv) en el que se ha insertado una secuencia nucleotídica (p. ej., un transgen). Una "partícula de parvovirus recombinante" comprende un genoma vector de parvovirus recombinante empaquetado dentro de una cápside de parvovirus.
Asimismo, un "genoma de vector VAAr" es un genoma de VAA (es decir, ADNv) que comprende una secuencia nucleotídica heteróloga. Los vectores de VAAr necesitan sólo las repeticiones terminales de 145 bases en cis para generar el virus. Todas las demás secuencias víricas son dispensables y pueden administrarse en trans (Muzyczka, (1992) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 158:97). Típicamente, el genoma vector de VAAr retendrá sólo las secuencias de repetición terminal (RT) mínimas de modo que se maximice el tamaño del transgén que puede empaquetarse de forma eficaz por el vector. Una "partícula de VAAr" comprende un genoma vector de VAAr empaquetado dentro de una cápside de VAA.
Las partículas de parvovirus de la presente invención pueden ser partículas "híbridas" en las que las RT víricas y la cápside vírica son de diferentes parvovirus. Preferiblemente, las RT y la cápside víricas son de diferentes serotipos de VAA (p. ej., como se describe en la publicación de patente internacional WO 00/28004, solicitud provisional para EE.UU. Nº 60/248.920; solicitud de patente para EE.UU. Nº 09/438.268 de Rabinowizt y col. y Chao y col. (2000) Molecular Therapy 2:619. Asimismo, el parvovirus puede ser una cápside "quimérica" (p. ej., que contenga secuencias de diferentes parvovirus, preferiblemente diferentes serotipos de VAA) o una cápside "dirigida" (p. ej., un tropismo dirigido) como se describe en la solicitud de patente internacional WO 00/28004.
Según se utiliza en este documento, una "partícula de parvovirus" abarca partículas de virus híbridas, quiméricas o dirigidas. Preferiblemente, la partícula de parvovirus tiene una cápside de VAA que pude además ser una cápside quimérica o dirigida, como se describe anteriormente.
Según se utiliza en este documento, el término "polipéptido" abarca tanto a péptidos como a proteínas, siempre que no se indique otra cosa.
Según se usa en este documento, "transducción" o "infección" de una célula por VAA significa que el VAA entre en la célula para establecer, respectivamente, una infección latente o activa (es decir, lítica). Véase, por ejemplo, Virology, Tercera edición (B. N. Fields y col., eds., Lippincott-Raven, Filadelfia, PA, 1996, pág. 2173-2197). En realizaciones de la invención en las que se introduce un vector de VAAr en una célula con el fin de insertar una secuencia de nucleótidos en las células, se prefiere que el VAA se integre en el genoma y establezca una infección latente.
La cápside vírica puede ser de cualquier parvovirus, tanto un parvovirus autónomo como un dependovirus, como se describe anteriormente. Preferiblemente, la cápside vírica es una cápside de VAA (p. ej., cápside de VAA1, VAA2, VAA3, VAA4, VAA5 o VAA6). En general, se prefieren la cápside de VAA1, cápside de VAA5 y cápside de VAA3. La elección de la cápside de parvovirus puede basarse en varias consideraciones conocidas en la técnica, por ejemplo, el tipo de célula diana, el nivel de expresión deseado, la naturaleza de la secuencia nucleotídica heteróloga que se va a expresar, aspectos relacionados con la producción vírica y similares. Por ejemplo, la cápside de VAA1 puede emplearse de forma ventajosa para músculo esquelético, hígado y células del sistema nervioso central (p. ej., cerebro); VAA5 para células de las vías respiratorias y pulmones; VAA3 para células de la médula ósea y VAA4 para células especiales del cerebro (p. ej., células ependimarias).
En realizaciones preferidas, el vector parvovirus además contiene una secuencia (o secuencias) nucleotídica heteróloga (como se describe a continuación) que se empaqueta para su inserción en una célula diana. Según esta realización en particular, la secuencia nucleotídica heteróloga se localiza entre las RT víricas en cualquier extremo del sustrato. En realizaciones preferidas adicionales, se delecionan los genes cap del parvovirus (p. ej., VAA) y los genes rep del parvovirus (p. ej., VAA) del vector. Esta configuración maximiza el tamaño de la secuencia (secuencias) de ácido nucleico heterólogo que puede ser portada por la cápside del parvovirus.
Preferiblemente, la secuencia o secuencias nucleotídicas heterólogas tendrán una longitud de menos de 5,0 kb (más preferiblemente, menos de aproximadamente 4,8 kb, todavía más preferiblemente menos de aproximadamente 4,4 kb, aún más preferiblemente menos de 4,0 kb de longitud) para facilitar el empaquetado por la cápside de VAA. Ejemplos de secuencias nucleotídicas son las que codifican el Factor IX, eritropoyetina, superóxido dismutasa, globina, leptina, timidina quinasa, catalasa, tirosina hidroxilasa, así como citocinas (p. ej., interferón \alpha, interferón \beta, interferón \gamma, interleucina 2, interleucina 4, interleucina 12, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos, linfotoxina y similares), factores de crecimiento y hormonas peptídicos (p. ej., somatotropina, insulina, factores de crecimiento similares a insulina 1 y 2, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento nervioso, factores neurotróficos 3 y 4, factor neurotrófico derivado del cerebro, factor de crecimiento derivado de la glía, factor de crecimiento transformante \alpha y \beta y
similares).
La presente invención también puede utilizarse para administrar vectores con el fin de expresar un péptico o proteína inmunogénica en un sujeto, por ejemplo, para vacunación. Preferiblemente, los vectores comprenderán un ácido nucleico que codifique cualquier inmunógeno de interés conocido en el arte incluyendo, pero sin limitaciones, inmunógenos procedentes del virus de la inmunodeficiencia humana, virus de la gripe, proteínas gag, antígenos tumorales, antígenos cancerígenos, antígenos bacterianos, antígenos virales y similares.
Como alternativa adicional, la secuencia nucleotídica heteróloga puede codificar un polipéptido indicador (p. ej., una enzima como la proteína fluorescente verde o la fosfatasa alcalina).
Alternativamente, en realizaciones particulares de la invención, el ácido nucleico de interés puede codificar un ácido nucleico complementario, una ribozima (p. ej., como se describe en la patente de EE.UU. Nº 5.877.022), ARN que actúan en ayuste en trans mediado por ayustosoma (véase, Puttaraju y col. (1999) Nature Biotech. 17:246; patente de EE.UU. Nº 6.013.487; patente de EE.UU. Nº 6.083.702), ARN de interferencia (ARNi) que media en el ayuste génico (véase Sharp y col., (2000) Science 287:2431) y otros ARN no traducidos, como ARN "guías" (Gorman y col., (1998) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95:4929; patente de EE.UU. Nº 5.869.248 de Yuan y col.) y similares.
El ácido nucleico heterólogo puede estar asociado de forma operativa con elementos de control de la expresión como señales de control de transcripción/traducción, orígenes de replicación, señales de poliadenilación y sitios internos de entrada del ribosoma (IRES), promotores, potenciadores y similares. Los expertos en la materia apreciarán que pueden usarse diversos promotores/potenciadores dependiendo del nivel de expresión y especificidad de tejido deseados. El promotor/potenciador puede ser constitutivo o inducible, dependiendo del patrón de expresión deseado. El promotor/potenciador puede ser nativo o extraño y puede ser una secuencia natural o sintética.
Los más preferidos son los promotores/potenciadores que son nativos para el sujeto que se va a tratar. También se prefieren promotores/potenciadores nativos para la secuencia de ácido nucleico heterólogo. El promotor/potenciador se elige de modo que funcionará en la célula (células) diana de interés. También se prefieren promotores/potenciadores de mamíferos.
Se prefieren elementos de control de expresión inducibles en aquellas aplicaciones en las que es deseable proporcionar regulación sobre la expresión de la secuencia (secuencias) de ácido nucleico heterólogo. Los elementos promotores/potenciadores inducibles para inserción génica son preferiblemente elementos promotores/potenciadores específicos de tejido e incluyen elementos promotores/potenciadores específicos de músculo (como músculo cardíaco, esquelético y/o liso), específico de tejido nervioso (p. ej., específico del cerebro), específico de hígado, específico de médula ósea, específico de páncreas, específico del bazo, específico de retina y específico de pulmón. Otros elementos promotores/potenciadores inducibles incluyen elementos inducibles por hormonas e inducibles por metales. Los ejemplos de elementos promotores/potenciadores inducibles incluyen, pero sin limitaciones, elemento de activación/desactivación tet, un promotor inducible por RU486, un promotor inducible por ecdisona, un promotor inducible por rapamicina y un promotor de metalotioneína.
En realizaciones de la invención en las que la secuencia (secuencias) de ácido nucleico heterólogo se transcribirá y, a continuación, traducirá en las células diana, generalmente se necesitan señales específicas de iniciación para la traducción eficaz de secuencias insertadas de codificación de proteínas. Estas secuencias exógenas de control de traducción, que pueden incluir el codon de iniciación ATG y secuencias adyacentes, pueden ser de diversos orígenes, tanto naturales como sintéticos.
El vector puede contener algunos o todos los genes cap y rep de parvovirus (p. ej., VAA). Preferiblemente, sin embargo, algunas o todas las funciones cap y rep se proporcionan en trans introduciendo un vector (vectores) empaquetado que codifica la cápside y/o proteínas Rep dentro de la célula. Más preferiblemente, el vector no codifica la cápside o proteínas Rep. Alternativamente, se usa una línea celular empaquetadora que se transforma establemente para expresar los genes cap y/o rep (véase, p. ej., Gao y col., (1998) Human Gene Therapy 9:2353; Inoue y col., (1998) J. Virol. 72:7024; patente de EE.UU. Nº 5.837.484; documento WO 98/27207; patente de EE.UU. Nº 5.658.785; WO 96/17947).
Un "polipéptido terapéutico" es un polipéptido que puede aliviar o reducir los síntomas que resultan de una ausencia o defecto en una proteína de una célula o sujeto. Alternativamente, un "polipéptido terapéutico" es aquel que, por otro lado, confiere un beneficio a un sujeto, por ejemplo, efectos anticancerígenos o mejora de la supervivencia del trasplante.
El vector parvovirus también puede codificar una secuencia nucleotídica heteróloga que comparte homología y recombina con un locus en el cromosoma del hospedador. Esta estrategia puede utilizarse para corregir un defecto genético en la célula hospedadora.
La presente invención también puede utilizarse para expresar un polipéptido inmunogénico en un sujeto, por ejemplo, para vacunación. El ácido nucleico puede codificar cualquier inmunógeno de interés conocido en la técnica incluyendo, pero sin limitaciones, inmunógenos para el virus de la inmunodeficiencia humana, virus de la gripe, proteínas gag, antígenos tumorales, antígenos cancerígenos, antígenos bacterianos, antígenos virales y similares.
En la técnica se conoce el uso de parvovirus como vacunas (véase, p. ej., Miyamura y col., (1994) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91:8507; Patente de EE.UU. Nº 5.916.563 de Young y col., Nº 5.905.040 de Mazzara y col., patente de EE.UU. Nº 5.882.652, patente de EE.UU. Nº 5.863.541 de Samulski y col.). El antígeno puede estar presente en la cápside del parvovirus. Alternativamente, el antígeno puede expresarse a partir de un ácido nucleico heterólogo introducido en un genoma vector recombinante. Puede proporcionarse cualquier inmunógeno de interés mediante un vector parvovirus. Los inmunógenos de interés son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero sin limitaciones, inmunógenos del virus de la inmunodeficiencia humana, virus de la gripe, proteínas gag, antígenos tumorales, antígenos cancerígenos, antígenos bacterianos, antígenos virales y similares.
Un polipéptido inmunogénico, o inmunógeno, puede ser cualquier polipéptido adecuado para proteger al sujeto frente a una enfermedad, incluyendo, pero sin limitaciones, enfermedades microbiológicas, bacterianas, protozoarias, parasitarias y víricas. Por ejemplo, el inmunógeno puede ser un inmunógeno de ortomixovirus (p. ej., inmunógeno del virus de la gripe, como la proteína de superficie hemaglutinina (HA) del virus de la gripe, el gen de la nucleoproteína del virus de la gripe o un inmunógeno del virus de la gripe equina) o un inmunógeno de lentivirus (p. ej., un inmunógeno del virus infeccioso de la anemia equina, un inmunógeno del virus de la inmunodeficiencia de simios (VIS) o un inmunógeno del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), como la proteína de la envoltura GP160 del VIH o VIS, las proteínas de la matriz/cápside del VIH o VIS y los productos de los genes gag, pol y env del VIH o VIS). El inmunógeno también puede ser un inmunógeno de arenavirus (p. ej., inmunógeno del virus de la fiebre de Lassa, como el gen de la proteína de la nucleocápside del virus de la fiebre de Lassa y el gen de la glucoproteína de la envoltura del virus de la fiebre de Lassa), un inmunógeno de poxvirus (p. ej., virus de la variolovacuna, como los genes L1 o L8 del virus de la variolovacuna), un inmunógeno de flavivirus (p. ej., inmunógeno del virus de la fiebre amarilla o un inmunógeno del virus de la encefalitis japonesa), un inmunógeno de filovirus (p. ej., un inmunógeno del virus del Ébola o un inmunógeno del virus de Marburgo, como los genes NP y GP), un inmunógeno de bunyavirus (p. ej., virus RVFV, CCHF y SFS) o un inmunógeno de coronavirus (p. ej., un inmunógeno de coronavirus humano infeccioso, como el gen de la glucoproteína de la envoltura de coronavirus humano o un inmunógeno del virus de la gastroenteritis transmisible porcina o un inmunógeno del virus de la bronquitis infecciosa aviar). El inmunógeno puede adicionalmente ser un inmunógeno de la polio, antígeno del herpes (p. ej., inmunógenos de CMV, EBV y HSV), inmunógeno de paperas, inmunógeno de sarampión, inmunógeno de rubéola, inmunógeno de toxina diftérica y de otras difterias, antígeno de pertussis, inmunógeno
de hepatitis (p. ej., hepatitis A o hepatitis B) o cualquier otro inmunógeno de vacunas conocido en la técnica.
Alternativamente, el inmunógeno puede ser cualquier antígeno de célula tumor o cancerígena. Preferiblemente, el antígeno tumoral o cancerígeno se expresa en la superficie de la célula cancerígena. En S. A. Rosenberg, (1999) Immunity 10:281, se describen ejemplos de antígenos de células cancerígenas y tumorales. Otros antígenos cancerígenos y tumorales ilustrativos incluyen, pero sin limitaciones: producto del gen BRCA1, producto del gen BRCA2, gp100, tirosinasa, GAGE-1/2, BAGE, RAGE, NY-ESO-1, CDK-4, catenina \beta, MUM-1, caspasa-8, KIAA0205, HPVE, SART-1, PRAME, p15, antígenos tumorales de melanoma (Kawakami y col., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3515); Kawakami y col., (1994) J. Exp. Med., 180:347); Kawakami y col., (1994) Cancer Res. 54:3124), incluyendo MART-1 (Coulie y col., (1991) J. Exp. Med. 180:35), gp100 (Wick y col., (1988) J. Cutan. Pathol. 4:201) y antígeno MAGE, MAGE-1, MAGE-2 y MAGE-3 (Van der Bruggen y col., (1991) Science, 254:1643); CEA, TRP-1, TRP-2, P-15 y tirosinasa (Brichard y col., (1993) J. Exp. Med. 178:489); producto del gen HER-2/neu (patente de EE.UU. Nº 4.968.603), CA 125, LK26, FB5 (endosialina), TAG 72, AFP, CA19-9, NSE, DU-PAN-2, CA50, SPan-1, CA72-4, HCG, STN (antígeno sialil-Tn), proteínas cerbB-2, PSA, L-CanAg, receptor de estrógenos, globulina de la grasa de la leche, proteína supresora tumoral p53 (Levine, (1993) Ann. Rev. Biochem. 62:623); antígenos de mucina (publicación de patente internacional WO 90/05142); telomerasas; proteínas de la matriz nuclear, fosfatasa ácida prostática; antígenos del virus del papiloma y antígenos asociados con los siguientes cánceres: melanomas, metástasis, adenocarcinoma, timoma, linfoma, sarcoma, cáncer de pulmón, cáncer hepático, cáncer de colon, linfoma no Hodgkin, linfoma Hodgkin, leucemias, cáncer de útero, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de vejiga, cáncer de riñón, cáncer pancreático y otros (véase, p. ej., Rosenberg (1996) Ann. Rev. Med. 47:481-91).
Por consiguiente, la presente invención encuentra su uso en procedimiento de tratamiento del cáncer o tumores, por ejemplo, administrando agentes anticancerígenos o antígenos cancerígenos. En realizaciones particulares, los procedimientos de la invención se usan para administrar agentes anticancerígenos o antígenos cancerígenos para prevenir metástasis, por ejemplo, tras una cirugía de extirpación de un tumor primario.
Los procedimientos y las matrices de la invención pueden también utilizarse de forma ventajosa en el tratamiento de individuos con trastornos metabólicos (p. ej., deficiencia de ornitina transcarbamilasa). Típicamente, estos trastornos necesitan un inicio de expresión relativamente rápido de un polipéptido terapéutica por el vector de inserción génica. Aún como una alternativa adicional, los vectores de la invención pueden administrarse para proporcionar agentes que mejoren la supervivencia de un trasplante (p. ej., superóxido dismutasa) o combatir la sepsis.
Los vectores de la VAAr de la presente invención se aplican para su administración sobre las matrices quirúrgicamente implantables como se describe en este documento. En el procedimiento de la presente invención, los vectores VAAr en solución se ponen en contacto con matrices o materiales quirúrgicamente implantables y se permite que se seque o deshidrate sobre o dentro de los materiales o matrices quirúrgicamente implantables. Los vectores en solución pueden ponerse en contacto con las matrices o materiales implantables sumergiendo o sumiendo las matrices o materiales en la solución. Alternativamente, los vectores en solución pueden ponerse en contacto con las matrices implantables mediante goteo o puede rociarse sobre las matrices implantables o ponerse en contacto de otra forma con las matrices usando procedimientos que los expertos en la materia determinarán fácilmente.
En una realización preferida de la invención, antes del secado/desecación, los vectores de parvovirus (p. ej., VAAr) están en una solución y/o se mantienen en solución (p. ej., una solución de conservación) que contiene un estabilizante. En otras palabras, en una realización preferida, los vectores VAAr están en una solución que contiene un estabilizante cuando se han desecado. Los presentes inventores han descubierto inesperadamente que los vectores VAAr en soluciones que contienen al menos un estabilizante son más estables después de la desecación y rehidratación/resuspensión. Además, tras la desecación, los vectores VAAr originalmente desecados a partir de una solución que contiene un estabilizante tienen una eficacia de transducción mayor en comparación con los vectores que no se desecan a partir de una solución que contiene un estabilizante (p. ej., cuando se compara con el virus sólo en tampón PBS). Los estabilizantes preferidos son azúcares y alcoholes de azúcares; los estabilizantes más preferidos son sorbitol, sacarosa y dextrosa, siendo especialmente preferido el sorbitol. En realizaciones preferidas, el estabilizante (p. ej., sorbitol) constituye al menos aproximadamente el 5% de la solución (p. ej., es una solución del sorbitol al 5%); más preferiblemente, al menos aproximadamente el 10% de la solución, incluso más preferiblemente, al menos aproximadamente el 15%, aún más preferiblemente el 20%, y, en una realización especialmente más preferida, al menos el 25%. En una realización preferida, la solución de conservación que contiene el vector/virus contiene sorbitol al 25%. La fig. 6 ilustra gráficamente la comparación de soluciones de conservación, comparando diferentes estabilizantes a diversas concentraciones; la comparación se expresa en términos de estabilidad de los vectores VAAr 2 (como porcentaje de los vectores control) siete días después de la inserción génica y 30 días después de la inserción génica del vector desecado.
La etapa de secado o deshidratación puede realizarse según técnicas conocidas (desecación, desecación en condiciones de vacío, liofilización, evaporación, etc.). Preferiblemente, se completa la desecación o el secado (es decir, hasta o aproximándose a una solución o agua al 0%) aunque, alternativamente, puede ser parcial.
Las matrices o materiales quirúrgicamente implantables son aquellos materiales que pueden insertarse, implantarse, suturarse o ponerse en contacto de otro modo con las células, tejidos y/o cuerpo de un sujeto, interna o externamente. Las matrices o materiales quirúrgicamente implantables de la presente invención pueden ser porosos o no porosos, flexibles o no flexibles, tejidos o no tejidos, absorbibles o no absorbibles.
Preferiblemente, la matriz quirúrgicamente implantable es absorbible; es decir, la matriz es absorbida por el organismo del sujeto con el tiempo. Estas matrices incluyen suturas, dispositivos y materiales quirúrgicamente implantables y materiales injertables. Si se desea la absorción del material y/o el vector VAAr, puede controlarse el tiempo o velocidad de absorción seleccionando el material, mediante la dosis del virus, localización del material implantable, etc. Las suturas utilizadas en la presente invención pueden coserse sobre o dentro de la piel, músculo, peritoneo u otras superficies en o sobre el cuerpo de los sujetos. Los materiales quirúrgicamente implantables (injertos, suturas, etc.) especialmente útiles en la presente invención incluyen Vicryl y Monocryl (disponibles en Ethicon, una filial de Johnson and Johnson), Nytran^{TM}, Gortex® (politetrafluoroetileno o "PTFE"), Marlex®, polipropileno, catgut (crómico, aproximadamente una a dos semanas, hasta que el organismo lo absorbe), polilactina (tres a cuatro semanas para su absorción),
PDS (aproximadamente seis semana para su absorción) y Dacron®, siendo actualmente preferidos catgut y Gortex®.
En una realización de la invención, el material quirúrgicamente implantable está recubierto. En la técnica se conocen materiales de recubrimiento adecuados como colágeno y colágeno unido a glutaraldehído. Otra estrategia que se ha usado con los injertos utilizados dentro de los vasos sanguíneos (donde no se desea que el material implantado extraño desarrolle fibrosis) es unir heparina al material injertado que se libera lentamente durante las primeras semanas después de que el injerto se implanta. También se han usado recubrimientos de albúmina, así como determinados geles de recubrimiento conocidos en la técnica. En una realización alternativa de la invención, se usa heparina para recubrir el material quirúrgicamente implantable y se usa para "adherir" o unir el VAAr al material implantable (véase la solicitud de patente de EE.UU. Nº de serie 09/228.203 de Samulski y col.). A continuación, el VAAr puede liberarse del material implantado mediante su intercambio con receptores celulares mientras que la heparina es absorbida a partir del injerto.
En otras realizaciones de la invención, opcionalmente se proporcionan las funciones de virus auxiliar al vector parvovirus, preferiblemente en el lugar de la administración. En una realización preferida, el tejido o célula diana de la inserción génica se trata con una función del virus auxiliar (es decir, se trata con una solución de virus auxiliar) antes de la implantación de la matriz VAAr/quirúrgica de la presente invención. Tanto el adenovirus como el virus del herpes simple pueden servir como virus auxiliar para VAA. Véase, por ejemplo, BERNARD N. FIELDS y col., VIROLOGY, volumen 2, capítulo 69 (3ª ed., Lippincott-Raven Publishers) Los ejemplos de virus auxiliares incluyen, aunque sin limitación, virus del herpes simple (HSV), varicela zóster, citomegalovirus y Epstein-Barr. La multiplicidad de infección (MDI) y la duración de la infección dependerán del tipo de virus utilizado y de la línea de células empaquetadoras empleada. Puede emplearse cualquier vector auxiliar adecuado. Preferiblemente, el vector (vectores) auxiliar es un plásmido, por ejemplo, como se describe en Xiao y col. (1998) J. Virology 72: 2224. El vector puede introducirse en la célula empaquetadora por cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica, como se describe anteriormente.
Un procedimiento preferido para proporcionar funciones auxiliares emplea un miniplásmido de adenovirus no infeccioso que porta todos los genes auxiliares necesarios para una producción eficaz de VAA (Ferrari y col., (1997) Nature Med. 3:1295; Xiao y col., (1998) J. Virology 72:2224). Los valores de VAAr obtenidos con miniplásmidos de adenovirus son 40 veces superiores a los obtenidos con procedimientos convencionales de infección por adenovirus de tipo salvaje (Xiao y col. (1998) J. Virology 72:2224). Esta estrategia obvia la necesidad de realizar cotransfecciones con adenovirus (Holscher y col., (1994), J. Virology 68:7169; Clark y col., (1995) Hum. Gene Ther. 6:1329; Trempe y Yang, (1993), en Fifth Parvovirus Workshop, Crystal River, FL).
También puede usarse el virus del herpes como virus auxiliar para VAA. Los virus del herpes híbridos que codifican la proteína (proteínas) Rep de VAA pueden facilitar de forma ventajosa esquemas de producción de vectores de VAA más ampliable. Se ha descrito un vector del virus del herpes simple de tipo I (VHS-1) híbrido que expresa los genes rep y cap de VAA-2 (Conway y col. (1999) Gene Therapy 6:986 y el documento WO 00/17377).
A la vista de lo anterior, la presente invención es útil para la administración de genes y otras secuencias de ácido nucleico tanto in vitro (a células) como in vivo (a sujetos) poniendo en contacto células, tejidos o el cuerpo de los sujetos con material quirúrgicamente implantable tratado con VAAr. Los sujetos adecuados incluyen tanto aves como mamíferos, prefiriéndose los mamíferos. El término "ave" según se utiliza en este documento incluye, pero sin limitaciones, pollos, patos, gansos, codornices, pavos y faisanes. El término "mamífero" según se utiliza en este documento incluye, aunque sin limitaciones, humanos, bovinos, ovinos, caprinos, equinos, felinos, caninos, lagomorfos, etc. Los más preferidos son los seres humanos. Los seres humanos incluyen fetos, neonatos, bebes, jóvenes y adultos.
Los vectores virales recombinantes se administran preferiblemente a un tejido diana en una cantidad biológicamente eficaz. Una cantidad "biológicamente eficaz" de vector viral es una cantidad que es suficiente para dar lugar a una infección (o transducción) y expresión de la secuencia de ácido nucleico heterólogo en el tejido diana. Si el virus se administra in vivo (es decir, se administra a un sujeto como se describe a continuación), una cantidad "biológicamente eficaz" del vector viral es una cantidad suficiente para dar lugar a la transducción y expresión de la secuencia heteróloga de ácido nucleico es una célula diana.
El vector de parvovirus administrado al sujeto puede transducir cualquier célula o tejido que lo permita. Las células adecuadas para la transducción por los vectores de parvovirus de la invención incluyen, pero sin limitaciones: células nerviosas (incluyendo células de los sistemas nerviosos periférico y central, en especial, células del cerebro), células pulmonares, células de la retina, células epiteliales (p. ej., células epiteliales intestinales y respiratorias), células musculares, células dendríticas, células pancreáticas (incluyendo células insulares), células hepáticas, células miocárdicas, células óseas (p. ej., células madre de médula ósea), células madre hematopoyéticas, células esplénicas, queratinocitos, fibroblastos, células endoteliales, células de próstata, células germinales y similares. Alternativamente, la célula puede ser cualquier célula progenitora. Como alternativa adicional, la célula puede ser una célula madre (p. ej., célula madre nerviosa o célula madre hepática). Aún como una alternativa adicional, la célula puede ser una célula cancerígena o tumoral. Además, las células pueden proceder de cualquier especie, como se indica anteriormente.
Las dosis de las partículas de parvovirus de la invención dependerán del modo de administración, la enfermedad o afección que se va a tratar, el estado individual del sujeto, el vector viral en particular y el gen que se va a administrar y puede determinarse de forma rutinaria. Los ejemplos de dosis para conseguir efectos terapéuticos son valores de virus de al menos aproximadamente 10^{5}, 10^{6}, 10^{7}, 10^{1}, 10^{9}, 10^{10}, 10^{11}, 10^{12}, 10^{3}, 10^{14} y 10^{15} unidades de transducción o más, preferiblemente aproximadamente 10^{8}-10^{13} unidades de transducción, todavía más preferiblemente 10^{12} unidades de transducción.
Los procedimientos de la presente invención también proporcionan un sistema para administrar secuencias nucleotídicas heterólogas en una amplia gama de tejidos y células, incluidos tejidos que contienen células en división y/o no en división. La presente invención puede emplearse para administrar una secuencia nucleotídica de interés a una célula in vitro, por ejemplo, para producir un polipéptido in vitro o para terapia génica ex vivo. Las células, formulaciones farmacéuticas y procedimientos de la presente invención son adicionalmente útiles en un procedimiento de administración de una secuencia nucleotídica a un sujeto que necesita de esta, por ejemplo, para expresar un polipéptido inmunogénico o terapéutico. De esta forma, el polipéptido puede producirse así in vivo en el sujeto. El sujeto puede necesitar el polipéptido debido a que tiene una deficiencia del mismo, o porque la producción del polipéptido en el sujeto puede proporcionar determinado efecto terapéutico, como un procedimiento de tratamiento o por otro motivo, y como se explica adicionalmente a continuación.
En general, la presente invención puede emplearse para administrar cualquier ácido nucleico extraño con un efecto biológico para tratar o mejorar los síntomas asociados con cualquier trastorno relacionado con la expresión génica. Los estados patológicos ilustrativos incluyen, pero sin limitaciones: fibrosis quística (y otras enfermedades pulmonares), hemofilia A, hemofilia B, talasemia, anemia y otros trastornos hematológicos, SIDA, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis amiotrófica lateral, epilepsia y otros trastornos neurológicos, cáncer, diabetes mellitus, distrofias musculares (p. ej., de Duchenne y Becker), enfermedad de Gaucher, enfermedad de Hurler, deficiencia de adenosina desaminasa, enfermedades de almacenamiento de glucógeno y otros defectos metabólicos, enfermedades degenerativas de la retina (y otras enfermedades oculares), enfermedades de órganos sólidos (p. ej., cerebro, hígado, riñón y corazón) y similares.
La transferencia génica tiene un posible uso importante para comprender los estados patológicos y proporcionar tratamiento a los mismos. Existen varias enfermedades hereditarias de las que se conocen los genes defectuosos y se han clonados. En general, los estados patológicos anteriores se incluyen dentro de dos clases: estados de deficiencia, normalmente de enzimas, que generalmente son hereditarios de forma recesiva, y estados de desequilibrio, que puede afectar a proteínas reguladoras o estructurales y que son típicamente hereditarios de forma dominante. Para enfermedades de estados de deficiencia podría utilizarse la transferencia génica para llevar un gen normal a los tejidos afectados para un tratamiento de sustitución, así como para crear modelos animales para la enfermedad utilizando mutaciones complementarias. Para estados patológicos de desequilibrio, podría usarse la transferencia génica para crear un estado patológico en un sistema modelo que, a continuación podría usarse en un intento de contrarrestar el estado patológico. Por tanto, los procedimientos de la presente invención permiten el tratamiento de enfermedades genéticas. Según se usa en este documento, un estado patológico se trata remediando parcial o completamente la deficiencia o desequilibrio que causa la enfermedad o la hace más grave. También es posible el uso de recombinación específica de sitio de secuencias nucleotídicas para producir mutaciones o corregir los defectos.
La presente invención también puede emplearse para proporcionar un ácido nucleico complementario a una célula in vivo. La expresión del ácido nucleico complementario en la célula diana disminuye la expresión por la célula de una proteína en particular. Por consiguiente, puede administrase ácidos nucleicos complementarios para disminuir la expresión de una proteínas en particular en un sujeto que necesita de ésta.
La aplicación de desecación/secado de VAAr para el empaquetado, transporte y posterior administración tras la reconstitución o suministro con una matriz física implantables es aplicable en una gran variedad de situaciones terapéuticas. Una aplicación clara podría ser para el desarrollo de vacunas. Los vectores de VAAr diseñados para provocar y mantener una respuesta inmune (y la inmunidad innata del hospedador, p. ej., frente a los virus de la hepatitis o de la inmunodeficiencia) podrían transportarse a países en desarrollo y distribuirse en áreas incluso remotas sin necesidad de procedimientos rigurosos de conservación.
Las realizaciones e ilustraciones adicionales de la presente invención incluyen las siguientes:
Gortex® impregnado con VAAr u otro material injertable pude revestir directamente al músculo o a otros tejidos para administrar a una gran masa muscular a lo largo tiempo. Otras estrategias terapéuticas donde esta realización puede ser especialmente eficaz incluye la transducción de un músculo delgado y largo, como el diafragma, donde penetrar una gran área superficial del tejido podría producir una considerable diferencia en la función pulmonar y usando la inserción a nivel local de un gen anticancerígeno tras una cirugía citorreductora de un tumor para eliminar el tumor residual en el lecho quirúrgico (p. ej., con angiostatina/endostatina).
Adicionalmente, puede transducirse una gran masa de músculo a partir del lecho vascular con una estrategia que implica a cualquier injerto vascular impregnado con VAAr (o un injerto vascular de VAAr en combinación con una dosis intravascular en bolo o un vector viral). Esta realización implica el aislamiento de la arteria que irriga, por ejemplo, el músculo cuádriceps completo. La implantación de un injerto impregnado con VAAr en esta arteria hace que el virus se libere de forma continua dentro del lecho completo de los capilares terminales del músculo, mejor que simplemente la parte del músculo al que se llega con una inyección intramuscular o la superficie que está debajo del injerto. Esto sería análogo a la inyección directa dentro de la vena porta, aunque no se administraría necesariamente toda la dosis de una vez. De hecho, el flujo de salida venoso de una extremidad en concreto podría estar ocluido temporalmente (durante media hora o más) de modo que podría administrarse un bolo de virus para saturar inmediatamente la unión, seguido de la liberación a largo plazo desde el injerto mientras se absorbe o cicatriza.
El procedimiento actual podría también ser útil para la transducción de VAA al músculo liso vascular (es decir, tratamiento con ganciclovir/transducción de la arteria coronaria para restenosis).
La presente invención encuentra un uso particular en la aplicación o administración de una cantidad conocida de virus VAAr como una película a una matriz permanente o absorbible para la inserción génica a áreas de superficie amplia, a través de la cual la dispersión sería difícil con procedimientos de inyección. Como ejemplo, el músculo diafragma humano tiene un espesor de varias capas de células aunque su área superficial total se mide en centímetros cuadrados. El fallo del diafragma conduce a la insuficiencia respiratoria que contribuye, finalmente, a la muerte en la enfermedad de distrofia muscular. Podría aplicarse al diafragma un material de matriz implantable, capaz de una liberación rápida de un vector VAA de terapia génica (p. ej., PTFE con un minigén de distrofina) e inducir una uniformidad de transducción a lo largo de una superficie grande de tal forma que sería difícil conseguir con inyecciones múltiples de un vector de terapia génica.
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De forma similar, pueden administrarse hojas o películas de VAAr directa e uniformemente a superficies planas y anatómicamente complejas. Por ejemplo, la presente invención podría utilizarse para administrar vectores de VAAr que contienen y codifican agentes antitumorales directamente dentro del lecho tumoral tras una resección completa o parcial, para prevenir recurrencias locales del tumor. Se ha demostrado que crecerán varios tipos de tumores sólidos principalmente en el sitio del tumor original, aunque tras la resección del tumor original desaparecerán los sitios distantes de enfermedad micrometastásica. Podría administrarse de este modo cualquiera de los diversos genes antineoplásicos, incluyendo genes de agentes inhibidores de angiogénesis (p. ej., endostatina (realización preferida) angiostatina), de antimetabolitos dirigidos al tumor y de interleucinas y otros mediadores que afectan a la recurrencia local o a la metástasis.
En otra realización, la invención facilita la administración de factores de crecimiento sobre "soportes" tisulares absorbibles o permanentes para dirigir la remodelación del hueso o del tejido óseo. Por ejemplo podrían inmovilizarse de forma estable vectores de VAAr que codifican genes para proteínas morfogenéticas óseas (BMP) o los factores antes del extremo 5' que median sobre las proteínas morfogenéticas óseas, en soportes poliméricos biodegradables. En un ámbito clínico, puede usarse la combinación de virus VAA/biomaterial como sustituto de un injerto óseo para estimular la reparación de un hueso o ligamento, como mecanismo osteoinductor o condrogénico. Los materiales sintéticos que se utilizan actualmente como soporte estructural para la formación de hueso nuevo incluyen polímeros de ácido poliláctico (PLA), copolímeros en bloque de ácido poliláctico y polietilénglicol (PLA-PEG) y poliglicólido (PGA). Los genes candidatos que podrían administrarse mediante VAAr desecados establemente inmovilizados incluyen factores de crecimiento (factor de crecimiento transformante beta 1) y proteínas morfogenéticas óseas (BMP). Mientras que el hueso o ligamento nuevo responde al factor de crecimiento administrado por VAAr e infiltra el soporte, este soporte puede degradarse y el hueso o ligamento nuevo se ve estimulado por la terapia génica viral a crecer y reparar el defecto.
Podría usarse una estrategia similar para atraer y dirigir la regeneración nerviosa. Ya se ha demostrado la capacidad de VAAR para administrar factores de crecimiento al sistema nervioso central (p. ej., factor neurotrófico derivado de una línea celular de la glía, GDNF). Este y otros factores de crecimiento nervioso (NGF) podrían localizarse para guiar la regeneración nerviosa mediante VAAr/NGF que se hubieran desecado sobre materiales implantables inertes, por ejemplo, para la regeneración de la médula espinal.
Aún en otra realización de la invención, se desarrollan materiales para injerto vascular (p. ej., GoreTex®) que tienen vectores VAAr de terapia génica en la superficie o están impregnados con vectores VAAr de terapia génica. Un problema de la mayoría de los materiales para injerto vascular es que tienden a ocluirse de nuevo debido al crecimiento interno de células endoteliales (un proceso especialmente dirigido por factores de crecimiento angiogénico de una realización preferida) y procesos aterotrombóticos. Los VAAr dirigidos a la expresión de oligonucleótidos complementarios frente a factores de crecimiento del endotelio vascular, quinasa de adhesión focal (FAK) u otros factores diferentes pueden permitir una permeabilidad vascular prolongada tras la colocación de un injerto vascular, especialmente si puede controlarse la inserción del gen para que se exprese a una velocidad lenta con el tiempo. Una realización es un material para injerto vascular para derivaciones arteriovenosas de hemodiálisis, formuladas con un vector VAAr que inhiba la pérdida de permeabilidad de la derivación y un vector de eritropoyetina regulado por VAAr adicional que corrija la anemia por deficiencia de eritropoyetina de la insuficiencia renal.
Alternativamente, puede formularse un VAAr terapéutico seco para una liberación más lenta con el tiempo, seguido de la restauración de la permeabilidad en los vasos sanguíneos coronarios (corazón) o periféricos, administrando factores de crecimiento angiogénicos para invertir la miocardiopatía o miopatía periférica alterada. Se ha intentado la inserción génica en vasos sanguíneos usando la oclusión completa transitoria de dichos vasos sanguíneos y la infusión de vectores de terapia génica, con el tiempo de exposición al vector necesariamente limitado por el tiempo que puede estar bloqueado el vaso sanguíneo. La posibilidad de administrar el VAAr secado por si mismo sobre un material para injerto vascular con propiedades características de liberación del virus puede obviar esta limitación de forma ventajosa.
Varias realizaciones viene sugeridas por la demostrada estabilidad del VAAr cuando se deshidrata a partir de soluciones de estabilizante al 10-25% (p. ej., sorbitol), dando lugar a masas o "bolas" sólidas, tamponadas a base de azúcar de VAAr que retienen su capacidad de transducción. Por ejemplo, será posible hacer perlas de VAAr para la administración local dirigida de tratamiento. Para determinadas estrategias de tratamiento del cáncer, la presente invención facilita la liberación de VAAr a partir de perlas de sorbitol para una exposición más prolongada al vector VAAr que la que puede lograrse usando la inyección directa. Una exposición más prolongada dará lugar al contacto con una mayor proporción de células que están dentro del ciclo celular, es decir más células que son susceptibles a los productos antineoplásicos o a genes suicidas. Podría aplicarse una estrategia similar al uso de braquiterapia para radioterapia intracavitaria.
Las pacientes con cáncer de cuello uterino se tratan a menudo con braquiterapia, lo que supone la colocación de aplicadores de carga diferida dentro de las cavidades vaginal y uterina y la confirmación radiográfica de la adecuada colocación de los aplicadores en la proximidad del tumor. Posteriormente se insertan las fuentes radioactivas encapsuladas en los aplicadores y se administra la radioterapia anatómicamente localizada a lo largo del tiempo mientras que el material (normalmente ^{137}Cs o ^{226}Ra) se desintegra en días. En lugar de radiación podrían colocarse "bolas" o "perlas" de VAAr seco, bien localizadas en la proximidad anatómica de la lesión para administrar agentes anticancerígenos y/o lograr una muerte tumoral "espectadora" que no sería posible con la simple inyección de VAAr en solución. Esta estrategia es posible para una variedad de cánceres (tratados actualmente con radiación por braquiterapia), que incluyen cáncer anal/rectal, carcinoma de cuello uterino, carcinoma de endometrio, cáncer de vagina, mesotelioma pleural, carcinoma nasofaríngeo y cáncer de próstata.
La demostración de la estabilidad del virus en estado seco/desecado facilita la administración de la medicina molecular, especialmente en ámbitos fuera de hospitales de especialidades. Las estrategias desarrolladas en esta solicitud para la estabilización de VAAr de serotipos 1, 2, 3, 4 y 5 también pueden aplicarse a los vectores de VAAr de estructura de cápside denominada quimérica o híbrida (véase la solicitud de patente de EE.UU. 09/438.268 de Rabinowitz y col.).
Actualmente, las soluciones de vectores de terapia génica requieren condiciones cuidadosas de conservación (requiriendo generalmente el mantenimiento en estado congelado a -20 o -80 grados centígrados). La demostración de que los vectores VAAr pueden mantener la capacidad de transducción eficaz secado a temperatura ambiente hace posible la administración de medicina molecular en áreas geográfica o tecnológicamente alejadas, incluyendo países en desarrollo. Por ejemplo, una solicitud análoga ha sido el desarrollo a principios de este siglo de sistemas para el mantenimiento de la viabilidad de vacunas distribuidas a países en desarrollo. Este sistema depende del establecimiento de la "cadena del frío", que en algunos países con electricidad poco fiable depende del queroseno o de la refrigeración solar. El establecimiento de la eficacia de VAAr tras la conservación a temperatura ambiente en estado seco, con la capacidad de manipular la liberación controlada, sugiere que las estrategias de la presente invención serán críticas para el amplio desarrollo de las vacunas VAAr. Los vectores de VAAr diseñados para provocar y mantener una respuesta inmune (y la inmunidad innata del hospedador, p. ej., frente al virus de la hepatitis o de la inmunodeficiencia humana) podrían transportarse a países en desarrollo y administrarse incluso en áreas lejanas sin necesidad de procedimientos de conservación rigurosos.
En general, la terapia génica sigue siendo prometedora para la corrección de estados patológicos para los que existe terapia disponible para el tratamiento sintomático, porque es demasiado costoso para la mayoría de las poblaciones del mundo Por ejemplo, el coste medio del tratamiento con factor de coagulación IX o VII para los pacientes hemofílicos norteamericanos oscila entre 50.000 y 100.000 dólares al año. En países subdesarrollados, este coste impide cualquier tratamiento para la mayoría de los pacientes hemofílicos, puesto que hace necesaria la refrigeración de los productos de tratamiento. Estudios preclínicos y clínicos recientes con VAAr sugieren que se conseguirá la corrección prolongada de la hemofilia con terapia génica con VAAr. La capacidad para preparar y transportar el VAAr como se describe en esta invención sugiere que las limitaciones para el uso del tratamiento convencional en países subdesarrollados podrían superarse mediante la estabilidad del VAAr desecado/implantable.
Aunque las aplicaciones para el desarrollo de vacunas o para la secreción por el hospedador de una proteína terapéutica (como en la corrección de la hemofilia) generalmente conlleva un efecto sistémico, una ventaja de la presente invención es la capacidad de administrar los genes localmente (es decir, no sistémicamente, sino limitada a un tejido, órgano, área, etc., en particular). Por ejemplo, tras la resección de un cáncer del tipo que se sabe recurre a nivel local, podría aplicarse un VAAr para luchar contra el cáncer (es decir, un vector VAAr que contenga un ácido nucleico que codifique un compuesto anticancerígeno) sobre una malla inerte al lecho del tumor para prevenir la recurrencia local, como tratamiento complementaria a la cirugía y quimioterapia. La localización del tratamiento en el lecho del tumor y la posible expresión local de genes para luchar contra el cáncer podrían ser más específico que la quimioterapia, que podría administrarse sistémicamente (con efectos sobre todo el cuerpo) o podría difundir rápidamente después de la administración local. Las enfermedades causadas por deficiencias proteicas dentro de tipos específicos de células de tejido, podrían abordarse usando una matriz implantable impregnada con el vector viral. Por ejemplo, la administración del gen de la distrofina sobre una matriz aplicada directamente al músculo diafragma podría inducir la mejora de los mecanismos pulmonares y la disminución de la mortalidad por distrofia muscular.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar la presente invención y no deben interpretarse como limitantes de la misma.
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Ejemplo 1
Un VAA2 recombinante producido usando un protocolo de transfección triple que expresa el gen de la proteína fluorescente verde (GFP) se aplicó al material de sutura Vicryl 3.0 (Ethicon, Somerville, NJ) o a un círculo de membrana de nailon cargada positivamente (GeneScreen Plus, NEN Life Science, Boston, MA) y se dejó secar al aire al vacío a temperatura ambiente. Se crecieron células HeLa hasta la confluencia del 80-90% aproximadamente en cultivo tisulares monocapa que se recubrieron con la sutura VAA/GFP o Nytran VAA/GFP y se permitió la infección durante periodos de tiempo de hasta 30 minutos antes de retirar el material impregnado con el virus. Después de la incubación durante una noche, se examinó la transfección de las células con GFP mediante visualización de las células fluorescentes usando un microscopio de fluorescencia Leitz DM IRB (Leica, Heerbrugg, Suiza).
Posteriormente, la sutura VAAr (sutura de poliglactina trenzada recubierta 3-0 o recubierta 4-0, o sutura de hilo de tripa crómico 4-0) se preparó en condiciones estériles en una cabina de cultivo de presión negativa suspendiendo el material de sutura Vicryl 3.0 (Ethicon, Somerville, NJ) a través del borde de un vaso de precipitado autoclavado y aplicando mediante goteo el virus a la sutura de modo que se conozca el valor exacto del VAAr aplicado. A continuación los trozos de sutura con las dosis conocidas aplicadas se sujetaron, se conservaron secos y se esterilizaron a temperatura ambiente durante diversos periodos de tiempo de días a meses. En puntos temporales secuenciales, los trozos de sutura VAAr que codifica el gen lacZ se aplicaron a células 293 en cultivo, las cuales previamente se había sometido a incubación durante una hora con adenovirus de tipo 2. Después de una hora de infección con sutura VAArlacZ, se retiró la sutura. Al día siguiente, las células se tiñeron para observar la transducción y expresión de lacZ, un gen marcador que hace que las células se vuelvan azules en condiciones de tinción específicas. La sutura, preparada y conservada a temperatura ambiente como se ha descrito, no perdía eficacia de transducción apreciable después de la primera semana desde su preparación y retenía la infectividad durante al menos tres meses.
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Ejemplo 2
En paralelo a los experimentos explicados en el Ejemplo 1, se estudió Nytran® (membrana de nitrocelulosa cargada positivamente) como plataforma para el virus. Se prepararon círculos de tamaño uniforme de Nytran® y se esterilizaron en autoclave. Se añadieron a la membrana diversa dosis del virus (10^{6}, 5 x 10^{5}, 10^{5}, 5 x 10^{4}, 10^{4} y 5 x 10^{3} unidades de transducción) en un volumen total de 10 ml y se desecaron in situ al vacío sin calor. El papel subyacente del disco de Nytran® estaba visiblemente húmedo por los diez microlitros de virus. Los discos de Nytran® y el papel subyacente se colocaron invertidos sobre células 293 prácticamente confluyentes, que previamente se habían infectado con Ad (4 horas antes de la matriz VAAr). La posición del disco sobre la placa se marcó en el fondo de la placa y el disco se retiró después de una hora de infección. Al día siguiente, las placas de células se tiñeron para comprobar la expresión de lacZ y la tinción azul observada aparecía principalmente en las células que se encontraban directamente debajo de la colocación de la matriz/VAAr.
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Ejemplo 3
Cada uno de los experimentos anteriores se repitió usando VAAr/sutura y VAAr/matriz portadora del gen para el marcador proteína fluorescente verde (GFP) y se realizaron en células HeLa. Se obtuvieron resultados comparables, observándose el marcador fluorescente verde en las células sobre las que se pusieron los materiales impregnados con el virus.
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Ejemplo 4
Los intentos iniciales de aplicación in vivo de la tecnología de sutura VAAr/GFP se realizaron en músculo de ratón, aunque se limitaron a autofluorescencia en músculos de ratón que hacía que cualquier detección de fluorescencia mediada por GFP sobre la fluorescencia de fondo sea imposible. Para comprobar la utilidad de la estrategia de la invención con un gen de importancia fisiológica, se produjo un VAA recombinante que portaba el gen de ratón para la eritropoyetina (VAAr/mEpo). La eritropoyetina es secretada normalmente por los riñones y se dirige a la médula ósea para aumentar la producción de eritrocitos, lo que se refleja en un aumento del hematocrito (el porcentaje de volumen sanguíneo ocupado por eritrocitos). El vector VAAr/mEpo se produjo usando un protocolo de transfección plasmídica triple que minimiza la contaminación del preparado VAAr con proteínas del adenovirus auxiliar. El virus se purificó adicionalmente mediante centrifugación en un gradiente de iodixanol y purificación en columna de FPLC con una columna de sulfato de heparina. Tras la determinación del valor del genoma del vector VAAr mediante un ensayo radiactivo de transferencia en puntos, el virus se dializó frente a solución salina tamponada con fosfato (PBS) estéril y se diluyó hasta una concentración de 8 x 10^{11} genomas del vector/ml (gv/ml). Se prepararon suturas independientes usando la técnica descrita anteriormente (suspensión de sutura con volúmenes conocidos de alícuotas del virus a la sutura en forma de gotas) con las siguientes dosis:
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2,4 x 10^{10} gv sobre un único monofilamento de poliglactina (sutura Monocryl de la marca Ethicon).
7,2 x 10^{10} gv en una única sutura Monocryl.
9,6 x 10^{10} gv en una única sutura Monocryl.
1,9 x 10^{11} gv en una única sutura Monocryl.
5 x 10^{11} gv divididos en una sutura crómica de hilo de tripa 5-0 y una sutura Monocryl.
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Cada sutura se marcó para delimitar el trozo de sutura sobre el que se localizaba el virus. Las suturas se colocaron al vacío a baja temperatura absorbiéndose todos los virus en 24 horas.
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Ejemplo 5
Se obtuvieron muestras de sangre de cinco ratones BalbC de 4 semanas de edad para determinar los niveles basales normales de hematocrito. Los niveles de hematocritos en los cuatro ratones estaban entre el 43 y el 46% al inicio. Cada ratón se anestesió con avertina intraperitoneal y se le realizó una incisión para exponer el músculo cuádriceps de la pierna. La sutura se colocó a lo largo del músculo hasta que el marcador se colocó dentro del lecho muscular y se anudó es su sitio. Los bordes de la incisión se volvieron a unir y la piel se cerró usando una o dos grapas para piel. Se recogieron muestras de sangre del plexo retroorbital a intervalos de diez días. El día veinte tras la colocación de la sutura, el ratón que recibió la dosis más alta mostraba un nivel de hematocrito significativamente más alto que los ratones que recibieron la dosis más baja, todos los cuales tenían niveles comparables a un ratón control no inyectado. Estos resultados se resumen en la fig. 2. Esta elevación del nivel de hematocrito continuó durante 105 días postinyección, en cuyo momento el ratón tratado con la dosis más alta mantenía un hematocrito en el intervalo del 65-74%, con cada uno de los otros ratones en el intervalo del 44-50% (es decir, sin diferencia significativa con respecto al inicio o al control no inyectado (datos no mostrados)). Los ratones se sacrificaron y un hematopatólogo preparó y analizó la médula ósea del ratón policitémico, que confirmó la eritropoyesis suprafisiológica en la médula ósea, concordante con el aumento de la expresión de eritropoyetina.
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Ejemplo 6
Se realizaron dos experimentos adicionales para apoyar los resultados mostrados anteriormente. En un experimento, el virus VAAr/mEpo en una preparación convencional (solución dializada, conservada en condiciones convencionales a -20ºC y no desecada antes de su uso) se inyectó por vía intramuscular en un intervalo amplio de dosis en ratones BalbC y se comprobó que existía una dosis umbral para el aumento del hematocrito.
Los ratones que recibieron 5 x 10^{10} gv mostraban un marcado aumento del hematocrito hasta el 80% o superior. Por tanto, la respuesta del ratón con supersatura con la dosis más alta es coherente con estas condiciones y resultados intramusculares. Estos resultados se ilustran gráficamente en la fig. 3.
Adicionalmente, los ratones que recibieron la colocación de sutura usando las suturas trenzadas monofilamento impregnadas con VAAr/lacz desecado realmente pareció que mostraban una respuesta de cicatrización inespecífica más marcada alrededor de lugar de la sutura, que parecía afectar negativamente a la expresión.
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Ejemplo 7
Se usó material de injerto Gortex® (PTFE) como plataforma para la administración de VAA seco. El gen GFP y los genes del factor IX humano se administraron de forma eficaz a las células en cultivo con el VAA/Gortex.
Las células HeLa se dispusieron en placas de 6 pocillos a razón de 1 x 10^{5} células/pocillo. Todos los medios utilizados para las células se prepararon con suero bovino que había sido preparado con sulfato de bario para eliminar cualquier factor de coagulación dependiente de vitamina K, incluido el factor IX bovino. Se cortaron cuadrados de material para injerto vascular recubierto de politetrafluoroetileno (PTFE) (Gore-Tex®, GORE, Flagstaff, Arizona) de 0,5 x 0,5 cm o de 1,0 x 1,0 cm y se esterilizaron en autoclave.
Se usó VAA2 preparado con un protocolo de transfección triple y purificado mediante centrifugación en iodixanol y cromatografía en columna, con un promotor de CMV para dirigir la expresión del gen del factor IX humano. Se aplicaron virus a dosis necesarias para administrar 1 x 10^{4} genomas del vector viral (gv)/célula o 1 x 10^{6} gv/célula a una matriz de PTFE. Se colocó PTFE/VAA sobre las células durante 1 hora, se retiró y las células se incubaron durante toda la noche. El día después de la infección, los medios se sustituyeron por 1,5 ml de medios sin factor IX. Veinticuatro horas después, se retiraron los medios, se alicuotaron y se cuantificó el factor IX secretado a los medios usando un ELISA tipo sándwich con anticuerpos específicos para el factor IX humano, como se ha descrito previamente (Monahan y col., Gene Therapy 5,40-49 (1998)). La comparación de las dos áreas de VAA/matriz (0,25 cm^{2} frente a 1,0 cm^{2}) frente a virus aplicados al pocillo completo (área de 9,5 cm^{2}) se expresa en la fig. 4 como nanogramos de factor IX expresado por 24 horas.
Estos experimentos sugerían que el tiempo necesario para el que virus saliera de la superficie del Gortex® (teflón) es muy corto y además sugiere que pueden elegirse diferentes plataformas de liberación para diferentes aplicaciones con el fin de lograr cursos temporales y distribuciones diferentes de transferencia génica.
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Ejemplo 8
Se usó una preparación de virus VAA2r/ADNc de eritropoyetina murina que se obtuvo usando un procedimiento diferente al anterior: se usó un protocolo de transfección triple idéntico para la producción del virus, sin embargo, se llevó a cabo la purificación del VAAr para aislar sólo los viriones VAAr que empaquetaban una cadena de longitud próxima al genoma del VAAr (denominado "VAAr autocomplementario"). Las fracciones agrupadas de VAAr que contenían predominantemente viriones VAAr/mEpo autocomplementarios se usaron para preparar la sutura de hilo de tripa absorbible 5.0 o se alicuotaron como virus en solución para obtener el mismo número total de partículas víricas (=5 x 10^{10} gv) para infecciones.
Se implantó el material de sutura o la solución de virus se inyectó por vía intramuscular en el músculo cuádriceps derecho de ratones Balb/cByJ con visualización directa a través de una incisión en la piel de 4-5 mm. Los ratones control se inyectaron con virus VAAr/Lacz (producidos como se señala anteriormente) en solución o tras la preparación de la sutura de una forma idéntica al virus con mEpo. Las suturas se prepararon al menos 48 horas antes de coserse en su lugar. Se recogió sangre completa del plexo venoso retroorbital el día 0 y, a continuación, cada 10 días. El hematocrito se determinó mediante centrifugación de la sangre en tubos de microcapilaridad. Estos resultados indican que los vectores VAA administrados sobre materiales implantables pueden llevar a una expresión génica funcional a lago plazo.
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Ejemplo 9
Los vectores de virus VAA de serotipos 1, 2, 3, 4 y 5 que contenían GFP se desecaron en diversos tampones potencialmente estabilizantes que incluían azúcares, sales y/o proteínas. Después de siete días en estado seco, los virus se resuspendieron y usaron para infectar células en cultivo en monocapa. La eficacia de la transducción se comparó con virus que se habían mantenido en solución en hielo sin congelar/descongelar (es decir, comparado como porcentaje del control). En la fig. 5 se ilustra un gráfico ejemplo del rendimiento comparativo de los VAAr de serotipos 1, 2, 3, 4 y 5 tras la conservación en estado seco en un tampón compuesto principalmente por una solución de dextrosa al 25%.
La descripción anterior ilustra la presente invención y no deberán interpretarse como limitantes de la misma.

Claims (45)

1. Una matriz quirúrgicamente implantable, en la que se ha secado un parvovirus recombinante sobre la matriz quirúrgicamente implantable.
2. La matriz quirúrgicamente implantable según la reivindicación 1, en la que el vector de parvovirus recombinante es un vector de virus adenoasociado recombinante (VAAr).
3. La matriz quirúrgicamente implantable según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que el vector de parvovirus recombinante comprende una cápside de VAA seleccionada entre el grupo compuesto por: una cápside de VAA de tipo 1, una cápside de VAA de tipo 2, una cápside de VAA de tipo 3, una cápside de VAA de tipo 4, una cápside de VAA de tipo 5 y una cápside de VAA de tipo 6.
4. La matriz quirúrgicamente implantable según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el vector de parvovirus recombinante se selecciona entre el grupo compuesto por: un vector VAA recombinante de tipo 2, un vector VAA recombinante de tipo 3, un vector VAA recombinante de tipo 4, un vector VAA recombinante de tipo 5, un vector VAA recombinante de tipo 1 y un vector VAA recombinante de tipo 6.
5. La matriz quirúrgicamente implantable según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el vector de parvovirus recombinante es un virus parvovirus híbrido.
6. La matriz quirúrgicamente implantable según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el vector de parvovirus recombinante es un virus parvovirus quimérico.
7. La matriz quirúrgicamente implantable según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el vector de parvovirus recombinante es un virus parvovirus dirigido.
8. La matriz quirúrgicamente implantable según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que el vector VAAr contiene una secuencia heteróloga de ácido nucleico.
9. La matriz quirúrgicamente implantable según la reivindicación 8, en la que la secuencia heteróloga de ácido nucleico codifica un polipéptido.
10. La matriz quirúrgicamente implantable según la reivindicación 9, en la que la secuencia heteróloga de ácido nucleico es una secuencia heteróloga de ácido nucleico que codifica el factor IX, eritropoyetina, superóxido dismutasa, globina, leptina, timidina quinasa, catalasa, tirosina hidroxilasa, una citocina, un factor de crecimiento u hormona peptídico, distrofina, minidistrofina, endostatina, una proteína morfogenética ósea u ornitina transcarbamilasa.
11. La matriz quirúrgicamente implantable según la reivindicación 9, en la que la secuencia heteróloga de ácido nucleico codifica un polipéptido para su uso en el tratamiento de la fibrosis quística u otras enfermedades pulmonares, hemofilia A, hemofilia B, talasemia, anemia u otros trastornos hematológicos, SIDA, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis amiotrófica lateral, epilepsia u otros trastornos neurológicos, cáncer, diabetes melitus, distrofia muscular incluyendo distrofia muscular de Duchenne y distrofia muscular de Becker, enfermedad de Gaucher, enfermedad de Hurler, deficiencia de adenosina desaminasa, una enfermedad de almacenamiento de glucógeno u otro defecto metabólico, una enfermedad degenerativa de la retina u otras enfermedades oculares.
12. La matriz quirúrgicamente implantable según la reivindicación 9, en la que la secuencia heteróloga de ácido nucleico codifica un antígeno cancerígeno o un antígeno tumoral.
13. La matriz quirúrgicamente implantable según la reivindicación 9, en la que la secuencia heteróloga de ácido nucleico codifica un antígeno bacteriano, un antígeno vírico, antígeno de protozoos o antígeno de parásito.
14. La matriz quirúrgicamente implantable según la reivindicación 8, en la que la secuencia heteróloga de ácido nucleico codifica un ácido nucleico complementario, una ribozima, un ARN que actúa en ayuste en trans mediado por ayustosoma, un ARN de interferencia (ARNi), un ARN guía u otro ARN no traducido.
15. La matriz quirúrgicamente implantable según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la que la secuencia heteróloga de ácido nucleico se asocia de forma operativa con un elemento promotor o potenciador.
16. La matriz quirúrgicamente implantable según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en la que la matriz quirúrgicamente implantable contiene un dispositivo implantable, un material quirúrgico injertable, una membrana de nailon cargada positivamente, una sutura, catgut, un soporte tisular o un sustituto de injerto óseo.
17. La matriz quirúrgicamente implantable según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en la que la matriz quirúrgicamente implantable comprende politetrafluoroetileno, poliglecaprona, polietileno de alta densidad, polipropileno, poliglatina, polidiaxanona (PDS) o polietileno tereftalato.
18. La matriz quirúrgicamente implantable según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en la que el vector VAAr se conserva en solución antes del secado.
19. La matriz quirúrgicamente implantable según la reivindicación 18, en la que la solución comprende un estabilizante.
20. La matriz quirúrgica implantable según la reivindicación 19, en la que la solución contiene azúcar o alcohol de azúcar, opcionalmente sorbitol, sacarosa o dextrosa.
21. La matriz quirúrgicamente implantable según la reivindicación 20, en la que la solución contiene sorbitol al 25%.
22. La matriz quirúrgicamente implantable según cualquiera de la reivindicaciones 1 a 21, en la que la matriz quirúrgicamente implantable está recubierta.
23. Uso de un vector de parvovirus recombinante en el que dicho vector se seca sobre una matriz quirúrgicamente implantable para la fabricación de un medicamento para la administración de dicho vector a una célula.
24. Uso según la reivindicación 23, en el que el vector de parvovirus recombinante es un vector VAA recombinante (VAAr).
25. Uso según la reivindicación 23 o la reivindicación 24, en el que el vector de parvovirus recombinante comprende una cápside de VAA seleccionada entre el grupo compuesto por una cápside de VAA de tipo 1, una cápside de VAA de tipo 2, una cápside de VAA de tipo 3, una cápside de VAA de tipo 4, una cápside de VAA de tipo 4, una cápside de VAA de tipo 5 y una cápside de VAA de tipo 6.
26. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25, en el que el vector de parvovirus recombinante se selecciona entre el grupo compuesto por: un vector VAA recombinante de tipo 2, un vector VAA recombinante de tipo 3, un vector VAA recombinante de tipo 4, un vector VAA recombinante de tipo 5, un vector VAA recombinante de tipo 1 y un vector VAA recombinante de tipo 6.
27. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26, en el que el vector viral contiene una secuencia heteróloga de ácido nucleico.
28. Uso según la reivindicación 27, en el que la secuencia heteróloga de ácido nucleico codifica un polipéptido.
29. Uso según la reivindicación 28, en el que la secuencia heteróloga de ácido nucleico es una secuencia heteróloga de ácido nucleico que codifica el factor IX, eritropoyetina, superóxido dismutasa, globina, leptina, timidina quinasa, catalasa, tirosina hidroxilasa, una citocina, un factor de crecimiento u hormona peptídico, distrofina, minidistrofina, endostatina, una proteína morfogenética ósea u ornitina transcarbamilasa.
30. Uso según la reivindicación 28, en el que la secuencia heteróloga de ácido nucleico codifica un polipéptido para el tratamiento de la fibrosis quística u otras enfermedades pulmonares, hemofilia A, hemofilia B, talasemia, anemia u otros trastornos hematológicos, SIDA, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, epilepsia o otros trastornos neurológicos, cáncer, diabetes melitus, distrofia muscular incluyendo distrofia muscular de Duchenne y distrofia muscular de Becker, enfermedad de Gaucher, enfermedad de Hurler, deficiencia de adenosina desaminasa, una enfermedad de almacenamiento de glucógeno u otro defecto metabólico, una enfermedad degenerativa de la retina u otras enfermedades oculares.
31. Uso según la reivindicación 28, en el que la secuencia heteróloga de ácido nucleico codifica el factor IX para el tratamiento de la hemofilia B.
32. Uso según la reivindicación 28, en el que la secuencia heteróloga de ácido nucleico codifica minidistrofina para el tratamiento de la distrofia muscular de Duchenne.
33. Uso según la reivindicación 28, en el que la secuencia heteróloga de ácido nucleico codifica un antígeno cancerígeno o un antígeno tumoral.
34. Uso según la reivindicación 28, en el que la secuencia heteróloga de ácido nucleico codifica un antígeno bacteriano, un antígeno vírico, un antígeno de protozoos o un antígeno de parásito.
35. Uso según la reivindicación 27, en el que la secuencia heteróloga de ácido nucleico codifica un ácido nucleico complementario, una ribozima, un ARN que actúa en ayuste en trans mediado por ayustosoma, un ARN de interferencia (ARNi), un ARN guía u otro ARN no traducible.
36. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 35, en el que la matriz quirúrgicamente implantable comprende un dispositivo implantable, un material quirúrgico injertable, una membrana de nailon cargada positivamente, una sutura, catgut, un soporte tisular o un sustituto de injerto óseo.
37. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 36, en el que la matriz quirúrgicamente implantable contiene politetrafluoroetileno, poliglecaprona, polietileno de alta densidad, polipropileno, poliglactina, polidiaxanona (PDS) o polietileno.
38. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 37, en el que el vector es un vector de parvovirus híbrido.
39. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 38, en el que el vector es un vector de parvovirus quimérico.
40. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 39, en el que el vector es un vector de parvovirus dirigido.
41. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 40, en el que la matriz quirúrgicamente implantable está recubierta.
42. Un procedimiento in vitro de administración de un vector de parvovirus recombinante a una célula, que comprende secar el vector sobre una matriz quirúrgicamente implantable y poner en contacto la matriz con una célula.
43. Un procedimiento para conservar un vector de parvovirus recombinante que contiene un ácido nucleico heterólogo, caracterizado porque el vector se seca sobre una matriz quirúrgicamente implantable antes de su conservación.
44. El procedimiento según la reivindicación 42 o la reivindicación 43, en el que el vector de parvovirus recombinante es un vector VAA recombinante (VAAr).
45. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 42 a 44, en el que el vector de parvovirus recombinante se seca mediante desecación al vacío, liofilización o evaporación.
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