JP2024515626A

JP2024515626A - 血液脳関門を横断し低減された液性応答を惹起する合理的ポリプロイドａａｖビリオン

Info

Publication number: JP2024515626A
Application number: JP2023562886A
Authority: JP
Inventors: レスタースアレス，; アモリプポメリノ，; オードリーフェルナンデス，
Original assignee: アスクレピオスバイオファーマシューティカル，インコーポレイテッド
Priority date: 2021-04-16
Filing date: 2022-04-14
Publication date: 2024-04-10
Also published as: WO2022221529A1; AU2022256479A1; AU2022256479A9; EP4323015A1; CA3216491A1

Abstract

本発明は、血液脳関門（ＢＢＢ）を横断する合理的ポリプロイドアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ビリオンの実質的に均一な集団であって、合理的ポリプロイドが、ＢＢＢを横断する任意のＡＡＶ血清型からのＶＰ３ウイルス構造タンパク質を含む、集団に関する。一部の実施形態では、合理的ポリプロイドは、対象への全身またはくも膜下腔内投与時にＢＢＢを横断する。一部の実施形態では、合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンは、ＶＰ３タンパク質に加えて、少なくとも１つのＶＰ１および／またはＶＰ２ウイルス構造タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＶＰ３カプシドタンパク質は、非ヒト霊長類からのものであり、一部の実施形態では、ＶＰ３カプシドタンパク質は、ＡＡＶアカゲザル血清型である。

Description

相互参照出願
本発明は、２０２１年４月１６日に出願した米国特許仮出願第６３／１７５，９５４号および２０２１年４月２７日に出願した米国特許仮出願第６３／１８０，４１４号の利益を合衆国法典第３５巻第１１９条（ｅ）項に基づいて主張するものであり、前記仮出願各々の内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

配列表
本願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出した配列表を含み、この配列表は、その全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる。２０２１年４月２６日に作成した前記ＡＳＣＩＩコピーは、０４６１９２－０９８０２０ＰＬ０２＿ＳＬ．ｔｘｔという名であり、サイズ１３９，９０４バイトである。

発明の分野
本発明は、所望の特性を有する合理的ポリプロイドアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子、ビリオンおよびウイルスカプシドの一群の産生のための方法、ビリオン、そのようなビリオンの実質的に均一な集団、実質的に均一な集団を産生するための方法、ならびにそれらの使用に関する。より具体的には、本発明は、血液脳関門（ＢＢＢ）を横断する任意のＡＡＶ血清型からのＶＰ３構造タンパク質を含むポリプロイドＡＡＶビリオン粒子であって、ポリプロイドＡＡＶビリオンが、全身またはくも膜下腔内投与時にＢＢＢを横断するおよび／またはＢＢＢの細胞に形質導入する、ポリプロイドＡＡＶビリオン粒子に関する。

発明の背景
中枢神経系（ＣＮＳ）疾患は、血液脳関門（ＢＢＢ）がＣＮＳへの多くの治療薬物の通過をほぼ完全に制限するため、最も処置が困難な疾患の一部である。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、様々な中枢神経系（ＣＮＳ）疾患の処置に幅広く使用されている。血液脳関門（ＢＢＢ）の存在に起因して、ＡＡＶに基づくＣＮＳ疾患の処置の初期の試みは、主として頭蓋内注射によって行われた。例えば、中枢神経系（ＣＮＳ；すなわち、脳および脊髄）の障害の処置において、ＡＡＶに基づく治療薬の送達は複雑であり、直接投与は、一般に、侵襲的外科手術を要し、全身投与した場合、血液脳関門が、ＡＡＶに基づく治療薬のＣＮＳへの到達を妨げる。さらに、標的ＣＮＳ組織への十分な形質導入を生じさせるために高用量のＡＡＶに基づく治療薬が必要であり、したがって、必要とされる高容量を考えると副作用のリスク上昇および／または生産の難しさにつながる。末梢神経系（ＰＮＳ；すなわち、脳および脊髄の外部の神経組織）は、治療介入のためにより利用しやすいと考えられ得るが、一部のＰＮＳ組織、例えば、後根神経節は、依然として標的とすることが難しい。ＡＡＶ血清型ＡＡＶ９は、ＢＢＢを横断して星状膠細胞に形質導入するその能力について幅広く研究されているが、その効率は、限られている。例えば、ＡＡＶ９の全身性注射は、複数のＣＮＳ疾患についての臨床試験で評価されている。しかし、ＣＮＳ疾患を処置するための全身性ＡＡＶ注射の開発は、ＡＡＶのＢＢＢ横断効率、ＡＡＶにより送達される遺伝子の発現によって引き起こされる末梢毒性、および血液におけるＡＡＶに対する免疫バリアなどの、多くの課題をいまだに伴う。

これまでに、１２のＡＡＶ血清型および１００より多くのバリアント、ならびにアカゲザル（ＡＡＶｒｈ）およびチンパンジーをはじめとする動物および非ヒト霊長類ＡＡＶ血清型が同定されている。異なる血清型カプシドは、組織または培養細胞において異なる感染力を有し、この感染力は、細胞表面の一次受容体および共受容体またはそれ自体の細胞内輸送経路に依存する。ＡＡＶベクターの適用は、安全だと証明されており、治療効果が示されているが、血清型間には、異なる形質導入および生体内分布プロファイルをはじめとする差があった。

一部の臨床試験では、前臨床マウス研究では高度な導入遺伝子発現を示すがヒト臨床試験では同様の遺伝子発現を欠いている、マウス、非ヒト霊長類およびヒトの間での導入遺伝子発現の明確に異なる種特異的な差についての報告があり、これには、治療不全につながる、ＡＡＶにより形質導入された肝細胞を根絶する潜在的なカプシド特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答が含まれていた。したがって、これらの臨床試験からの結果は、ベクターカプシド負荷量を増加させずにＡＡＶ形質導入を増強するための有効な手法を探究する必要性を強調している。加えて、大多数の人々は、ＡＡＶに自然に曝露されている。結果として、人口の大部分は、血液および他の体液中に、ＡＡＶのある特定の血清型に対する中和抗体（Ｎａｂ）が生じている。

アデノ随伴ウイルスに対する免疫応答の全範囲は、自然免疫応答、細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答および液性応答を含むと評価されている。既存の抗ＡＡＶ免疫、特に、ＡＡＶ血清型に対する中和抗体（ＮＡｂ）は、ＡＡＶベクター媒介遺伝子送達の臨床応用の大きな課題として浮上してきた。いくつかの研究によって、一般に使用されるＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ血清型１～９）に対する既存のＮＡｂの保有率が論じられている。いくつかの研究によって、幼児期のＡＡＶへの自然曝露による抗体の導入は、遺伝子治療ベクターとしてのＡＡＶのその後の使用を損ない得ること、および／またはＡＡＶベクターにより導入される強力な液性応答は、同じＡＡＶベクターの反復投薬についての潜在的要件を損ない得ることが示されている（Hurlbut et al., Mol Ther, 2010, 18(11):1983；Manno et al., Nat Med, 2006, 12(3):342；およびWang et al., Blood, 2006, 107(5):1810；Calcedo et al., Front Immunol, 2013, 4, 341；これらの各々の内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
したがって、ＡＡＶベクターに対する液性応答は、有効な遺伝子移入への／に対する有意な障壁となっており、その結果、ＡＡＶベクターは、標的細胞に侵入する前にクリアランスされることになる。ＡＡＶカプシドに対する抗体は、このウイルスの天然の宿主であるヒトに高度に見られ、カプシドタンパク質配列の相同性の程度によって広範な血清型と交差反応する。ＮＡｂは、ｉｎｖｉｖｏでＡＡＶ媒介形質導入を効率的に遮断することができるので、ウイルスカプシドに対する液性免疫を克服するための戦略は、遺伝子移入成功を達成するために非常に重要である。

Hurlbut et al., Mol Ther, 2010, 18(11):1983 Manno et al., Nat Med, 2006, 12(3):342 Wang et al., Blood, 2006, 107(5):1810 Calcedo et al., Front Immunol, 2013, 4, 341

したがって、ＢＢＢを効率的に横断するＡＡＶベクターであって、遺伝子治療薬物開発において非常に有益となる異なる形質導入効率および低減された免疫応答をはじめとする望ましい特徴の複合セットを有するＡＡＶベクターをあつらえる必要がある。

発明の概要
本明細書における技術は、血液脳関門（ＢＢＢ）を横断するおよび／または抗原性が低下された、合理的ポリプロイドまたはハプロイドＡＡＶベクター、ビリオンまたはそれらの医薬組成物の実質的に均一な集団に関する。ＣＮＳへの遺伝子治療ベクターおよびウイルスベクターによる治療用遺伝子の送達が血液脳関門であることは周知である。血液脳関門は、血流中のある特定の化学物質および分子が横断して中枢神経系の細胞外液に入るのを防止する、内皮細胞の半透過性の境界である。本明細書では、本発明者らは、全身およびくも膜下腔内送達後にＣＮＳおよびＰＮＳへのベクター形質導入効率を上昇させるために１つより多くの血清型からの構造ＶＰタンパク質を含むようにＡＡＶビリオンを合理的に設計した。本発明の実施形態は、血液脳を効率的に横断することが公知のＡＡＶ血清型からのＶＰ３ウイルス構造タンパク質が血液脳横断表現型の原因となるという驚くべき発見に基づく。それ故、合理的ポリプロイドを、血液脳関門を横断するように設計することができ、親血清型に対する免疫応答を回避し、例えば、その結果、中和抗体から逃れ、合理的ポリプロイドを作出する親血清型に対する液性応答をあまり惹起しないように設計することができる。

以前の報告は、合理的ポリプロイドなどの、２つまたはそれより多くのＡＡＶ血清型からのカプシドで構成されているＡＡＶベクターの設計が、トロピズム、形質導入または抗原性などの性質の変更のために個々の血清型を利用することができることを示す。これらのポリプロイドウイルスの一部には、トロピズムおよび形質導入効率を変化させる能力、ならびに中和抗体（Ｎａｂ）による中和を逃避する能力がある。

本発明者らは、ビリオンの合理的設計および産生を可能にする方法論を以前に発見しており、ビリオンは、カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３が、全て同じ血清型ではなく、少なくとも２つの異なる血清型に由来するということを指すために合理的ポリプロイドビリオンと呼ばれることもある。時には、カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３が少なくとも２つの異なる血清型からのものであるビリオンを指すために用語ハプロイドが使用され、カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３が３つの異なる血清型からのものであるビリオンを一般に指すために用語トリプロイドが使用される。特に、そのような合理的ポリプロイド、例えば合理的ハプロイドビリオン、およびそれらの産生方法は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第１０，５５０，４０５号において開示されている。

本明細書での技術は、血液脳関門（ＢＢＢ）を横断する任意のＡＡＶ血清型からのＶＰ３構造タンパク質を含む合理的ポリプロイドアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子、ビリオンおよびウイルスカプシドの均一な集団であって、ポリプロイドＡＡＶビリオンが、全身またはくも膜下腔内投与時に、ＢＢＢを横断する、および／または脳循環によって脳への送達を可能にするように血液成分に形質導入する、均一な集団に一般に関する。一部の実施形態では、ＶＰ３カプシドタンパク質は、ＡＡＶアカゲザル（ｒｈＡＡＶ）血清型などの非ヒト霊長類からのものである。合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンは、ＶＰ３タンパク質とは異なる血清型からの少なくとも１つのＶＰ１および／またはＶＰ２ウイルス構造タンパク質も含み得る。一部の実施形態では、合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンは、ＡＡＶ８からのＶＰ１カプシドタンパク質と、ＢＢＢを横断する任意のＡＡＶ血清型からの少なくとも１つのＶＰ３カプシドタンパク質とを含む。一部の実施形態では、ウイルス構造タンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３のいずれか１つまたは複数）を、例えば、化学的に改変されたヌクレオチド、混合された血清型などに変化させることにより、改変することができる。

例えば、ＢＢＢを効率的に横断する任意のＡＡＶ血清型からのＶＰ３構造タンパク質の、使用は、全身またはくも膜下腔内投与後にベクターの生体内分布および形質導入効率を変化させ、特に、ＡＡＶベクターのＢＢＢを横断する能力およびＣＮＳまたは末梢神経系（ＰＮＳ）における１つまたは複数の組織に形質導入する能力の増大を示す。一部の実施形態では、本明細書で開示されるＡＡＶポリプロイドビリオンは、生体内分布の変更、ならびに脳循環による脳（またはＣＮＳもしくはＰＮＳ）へのＡＡＶ形質導入細胞の送達を可能にする、脳血管（ＢＢＶ）および／または血液成分、例えば血液中の細胞、に形質導入するＡＡＶベクターの能力の増大を示す。一部の実施形態では、合理的ポリプロイドベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ｒｈ１０、ｒｈ７４、ｒｈ３９、およびｒｈ４３からなる群から選択される任意の血清型からのＶＰ３ウイルス構造タンパク質を含む。一部の実施形態では、合理的ポリプロイドベクターは、任意の非霊長類ＡＡＶ血清型、例えばアカゲザルＡＡＶ血清型、からのＶＰ３ウイルス構造タンパク質を含む。

一部の実施形態では、合理的ポリプロイドベクターは、ＢＢＢを効率的に横断する血清型、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ｒｈ１０、ｒｈ７４、ｒｈ３９、およびｒｈ４３などからの、ＶＰ１もしくはＶＰ２構造タンパク質、またはＶＰ１とＶＰ２両方の構造タンパク質を含む。他の実施形態では、本明細書で開示される合理的ポリプロイドベクターは、ＢＢＢを横断しない血清型からの、ＶＰ１もしくはＶＰ２、またはＶＰ１とＶＰ２両方の構造タンパク質を含む。一部の実施形態では、合理的ポリプロイドベクターは、任意の非霊長類ＡＡＶ血清型、例えば、ｒｈｅｓｕｓ血清型の少なくとも１つが異なるならば、アカゲザルＡＡＶ血清型（ｒｈＡＡＶ、またはＡＡＶｒｈ）からの、ＶＰ１もしくはＶＰ２、またはＶＰ１とＶＰ２両方の構造タンパク質を含む。あるいは、一部の実施形態では、合理的ポリプロイドベクターは、非霊長類ＡＡＶ血清型からのものではないＶＰ１もしくはＶＰ２、またはＶＰ１とＶＰの両方を含む。本発明の合理的ポリプロイド集団のＶＰ３が選択され得るＡＡＶ血清型の非限定的な例は、２０１８年１２月１９日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６６５５１（ＷＯ２０１９１２６３５６Ａ１）、または２０１４年９月１２日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５５４９０（ＷＯ２０１５０３８９５８）、またはMolecular Therapy: Methods & Clinical Development Vol. 20 March 2021に記載されており、これらの参考文献の各々は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。本発明の合理的ポリプロイド集団のＶＰ３が選択され得るＡＡＶアカゲザル血清型の非限定的な例は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるGao et al., Journal of Virology, June 2004, pg 6381-6388に記載されているような、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶｒｈ３９、ＡＡＶｒｈ４３、ＡＡＶｒｈ３８、ＡＡＶｒｈ４０、ＡＡＶｒｈ２、ＡＡＶｒｈ２５、ＡＡＶｒｈ５７、ＡＡＶｒｈ５０、ＡＡＶｒｈ４９、ＡＡＶｒｈ５８、ＡＡＶｒｈ６１、ＡＡＶｒｈ５２、ＡＡＶｒｈ５３、ＡＡＶｒｈ５１、ＡＡＶｒｈ６４、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１、ＡＡＶｒｈ６２、ＡＡＶｒｈ４８、ＡＡＶｒｈ５４、ＡＡＶｒｈ５５、ＡＡＶｒｈ３５、ＡＡＶｒｈ３７、ＡＡＶｒｈ３６、ＡＡＶｒｈ１３、ＡＡＶｒｈ３２、ＡＡＶｒｈ３３、ＡＡＶｒｈ３４である。

一部の実施形態では、本明細書で開示される合理的ポリプロイドベクターは、ＡＡＶ８ベクターと比べて脳微小血管内皮細胞（ＢＭＶＥＣ）への増強された結合を示す。一部の実施形態では、合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団は、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＰＨＰ．ＢまたはＰＨＰ．ｅＢと比べて脳微小血管内皮細胞（ＢＭＶＥＣ）への増強された結合を示す。一部の実施形態では、集団は、ＡＡＶ８と比べて、少なくとも２倍増強された結合、少なくとも３倍増強された結合、少なくとも４倍増強された結合、少なくとも５倍増強された結合、少なくとも６倍増強された結合、少なくとも７倍増強された結合、少なくとも８倍増強された結合、少なくとも９倍増強された結合、少なくとも１０倍またはそれより大きく増強された結合を示す。一部の実施形態では、合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団は、ＡＡＶ９、ＰＨＰ．ＢまたはＰＨＰ．ｅＢと比較してＢＭＶＥＣへの同等の結合を示す。一部の実施形態では、ハプロイドＡＡＶビリオンの集団は、血液脳関門を効率的に横断しないＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ８またはＡＡＶ２またはＡＡＶ５と比べて、脳微小血管内皮細胞（ＢＭＶＥＣ）への浸透の増進を示す。一部の実施形態では、本明細書で開示される合理的ポリプロイドベクターは、血液脳関門を効率的に横断する能力を欠いている非合理的ポリプロイドＡＡＶ粒子と比べて、対象の皮質、線条体、視床、髄質、海馬、小脳および脊髄のうちの１つまたは複数への増強された形質導入を示す。一部の実施形態では、本明細書で開示される合理的ポリプロイドベクターは、髄質神経叢、頸神経叢、胸神経叢、腰神経叢および脈絡叢からなる群から選択されるＣＮＳ領域の１つまたは複数においてＡＡＶ２、ＡＡＶ８またはＡＡＶ５のいずれか１つと比べて増強された形質導入を示す。

一部の実施形態では、本明細書で開示される合理的ポリプロイドベクターは、ＣＮＳの細胞または組織に形質導入する。ＣＮＳの細胞は、これらに限定されないが、ニューロン（例えば、興奮性ニューロン、抑制性ニューロン、運動ニューロン、感覚ニューロン、自律神経ニューロン、交感神経ニューロン、副交感神経ニューロン、プルキンエニューロン、ベッツニューロンなど）、グリア細胞（例えば、ミクログリア、星状膠細胞、乏突起膠細胞）、および／または脳の支持細胞、例えば免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）であり得る。ＣＮＳの組織は、これらに限定されないが、皮質（例えば、前頭皮質、頭頂皮質、後頭皮質、側頭皮質）、視床、視床下部、線条体、被殻、尾状核、海馬、嗅内皮質、基底核、または深部小脳核であり得る。一部の実施形態では、本明細書で開示される合理的ポリプロイドベクターは、ＰＮＳの細胞または組織に形質導入する。ＰＮＳの細胞または組織は、これに限定されないが、後根神経節（ＤＲＧ）であり得る。

一部の実施形態では、本明細書で開示される合理的ポリプロイドベクターは、ＣＮＳにおける生体内分布を有し、一部の実施形態では、ＣＮＳにおける生体内分布は、ＣＮＳにおけるＡＡＶ９の生体内分布と同じ（すなわち、同等）であるか、またはそれより大きい（すなわち、増加される）。

一部の実施形態では、本明細書で開示される合理的ポリプロイドベクターは、少なくとも０．０５ｖｇ／細胞、０．１ｖｇ／細胞、少なくとも０．２ｖｇ／細胞、少なくとも０．４ｖｇ／細胞、少なくとも０．６ｖｇ／細胞、少なくとも０．８ｖｇ／細胞、少なくとも１ｖｇ／細胞、少なくとも５ｖｇ／細胞、少なくとも１０ｖｇ／細胞、少なくとも２０ｖｇ／細胞、少なくとも２５ｖｇ／細胞、または好ましくはそれより大きいｖｇ／細胞値を有する。

一部の実施形態では、本明細書で開示される合理的ポリプロイドベクターは、親ＡＡＶＶＰ１またはＡＡＶＶＰ２血清型により惹起される液性応答と比較して少ないまたは低い液性免疫応答を惹起する－つまり、例えば、合理的ポリプロイドベクターが、ＡＡＶ８血清型からのＶＰ１および／またはＶＰ２と、ＢＢＢを横断する血清型からのＶＰ３とを含む場合、合理的ポリプロイドベクターにより惹起される液性応答は、ＡＡＶ８親ビリオンと比較して少ない。液性応答の低減は、親ＡＡＶＶＰ１またはＡＡＶＶＰ２血清型と比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、または４０％より高度であり得る。一実施形態では、液性応答は、親ＡＡＶＶＰ３血清型により惹起される液性応答と比較して低減される。一部の実施形態では、本明細書で開示される合理的ポリプロイドベクターは、親ＡＡＶＶＰ３血清型により惹起される液性応答と比較して少ないまたは低い液性免疫応答を惹起する－つまり、例えば、合理的ポリプロイドベクターが、ＡＡＶ８血清型からのＶＰ１および／またはＶＰ２と、例えばＡＡＶｒｈ１０またはＡＡＶｒｈ７４などのＡＡＶｒｈ血清型をはじめとする、ＢＢＢを横断する血清型からのＶＰ３とを含む場合、合理的ポリプロイドベクターにより惹起される液性応答は、ＡＡＶｒｈ１０またはＡＡＶｒｈ７４親ビリオンと比較して少ない。一部の実施形態では、液性応答の低減は、親ＡＡＶＶＰ３血清型と比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、または４０％より高度であり得る。実施形態のある特定の態様では、ＶＰ３は、非ヒトパルボウイルス血清型、例えば、本明細書でおよび実施例で開示のＡＡＶｒｈ１０またはＡＡＶｒｈ７４などのＡＡＶｒｈから選択される。一部の実施形態では、親血清型に対する液性免疫応答と比較して低減された液性免疫応答に起因して、それは反復投薬を可能にし、例えば、本明細書で開示の合理的ポリプロイドベクターを、複数回、例えば、初回用量、続いて１または複数の後続の用量（例えば、ブースター）を投与することができる。

一部の実施形態では、本明細書で開示される合理的ポリプロイドベクターは、ＶＰ１またはＶＰ２またはＶＰ３ウイルス構造タンパク質の親血清型に対する中和抗体から逃れる－つまり、例えば、合理的ポリプロイドベクターが、ＡＡＶ８血清型からのＶＰ１および／またはＶＰ２と、ＢＢＢを横断する血清型からの、例えばＡＡＶ９血清型からの、ＶＰ３とを含む場合、合理的ポリプロイドベクターは、親ＡＡＶ８および／またはＡＡＶ９血清型に対する中和抗体から逃れる。一部の実施形態では、親血清型に対する抗ＡＡＶ中和抗体からの合理的ポリプロイドベクターの中和の量は、３０％未満、または２０％未満、または１０％未満、またはさらには１０％未満である。単に説明のために、一部の実施形態では、親血清型に対する抗ＡＡＶ抗体が、親ＡＡＶ血清型を５０％中和する場合、親血清型に対する抗ＡＡＶ抗体は、合理的ポリプロイドを４０％、または３０％、または２０％、または１０％、または１０％未満、中和または不活性化する。

一部の実施形態では、本明細書で開示されるものは、反復投薬を可能にする合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団であって、ＡＡＶＶＰ１またはＶＰ２ウイルス構造タンパク質の少なくとも一方と、ＡＡＶＶＰ３ウイルス構造タンパク質とを含み；ＶＰ１およびＶＰ２ウイルス構造タンパク質が、各々、任意のＡＡＶウイルス血清型からのものであり、ＶＰ３ウイルス構造タンパク質が、アカゲザルＡＡＶ血清型から選択され；合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団が、ＶＰ１またはＶＰ２ウイルス構造タンパク質の親ＡＡＶ血清型により惹起される液性応答と比較して低減された液性応答を惹起し、ＶＰ１およびＶＰ２が、ＲｈｅｓｕｓＡＡＶ血清型からのものではなく、反復投薬が、合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団の第１の投与、およびＶＰ１構造ウイルスタンパク質またはＶＰ２構造ウイルスタンパク質の親ＡＡＶ血清型の第２の投与を含む、集団に関する。

合理的ポリプロイドビリオンが低減された液性免疫応答を有することに起因して、本発明の中で説明されるような合理的ポリプロイドビリオンは、親ＡＡＶ血清型での反復投薬を可能にし、例えば、反復投薬は、合理的ポリプロイドビリオンでの第１の投与と、合理的ポリプロイドビリオンのＶＰ１またはＶＰ２の構造タンパク質を提供するために使用された親ＡＡＶ血清型の第２の投与とを含む。単に説明のために、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０の合理的ポリプロイドベクターは、第１の用量として投与され、第２の用量は、ＡＡＶ８－８－８血清型であり得る。一部の実施形態では、合理的ポリプロイドビリオンは、反復投薬を可能にし、反復投薬は、合理的ポリプロイドビリオンの第１の投与と、親ＡＡＶ血清型ＶＰ３ウイルス構造タンパク質の第２の投与とを含み、ＶＰ３は、ＡＡＶアカゲザル血清型からのものである。単に説明のために、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０の合理的ポリプロイドベクターは、第１の用量として投与され、第２の用量は、ＡＡＶｒｈ１０－ｒｈ１０－ｒｈ１０血清型であり得る。

一部の実施形態では、ウイルスカプシドタンパク質のうちの少なくとも１つは、改変ウイルスカプシドタンパク質である。一部の実施形態では、ウイルスカプシドタンパク質のうちの少なくとも１つは、キメラウイルスカプシドタンパク質である。ウイルスカプシドタンパク質は、１個または複数個のアミノ酸の置換、挿入または欠失により改変され得る。一部の実施形態では、ＶＰカプシドウイルスタンパク質のうちの少なくとも１つは、キメラのものではない。一部の実施形態では、ＶＰ１は、キメラＶＰ１タンパク質である。一部の実施形態では、ＶＰ１およびＶＰ２は、キメラのものであり、ＶＰ３のみが、非キメラのものである。例えば、任意の他の非ＡＡＶ８ベクター、例えばｒｈ１０、ｒｈ７４など、からのＶＰ３のみと対にされた、キメラＡＡＶ２／８（ＡＡＶ２のＮ末端およびＡＡＶ８のＣ末端）からのＶＰ１／ＶＰ２で構成されている、ウイルス粒子のみ。別の実施形態では、ＶＰ３のみがキメラのものであり、ＶＰ１およびＶＰ２は、非キメラのものである。別の実施形態では、ウイルスタンパク質のうちの少なくとも１つは、完全に異なる血清型からのものである。別の例では、キメラのものは存在しない。

一実施形態では、ＡＡＶゲノム（２つのＡＡＶＩＴＲ間に位置する異種遺伝子を含む）をカプシド内封入している本明細書に記載されるＡＡＶ合理的ポリプロイドビリオンは、ウイルス構造タンパク質のうちの２つ、ＶＰ１およびＶＰ３、のみで形成され得る。一実施形態では、そのようなＡＡＶ合理的ポリプロイドビリオンは、高次構造的に正しく、すなわち、Ｔ＝１の正二十面体対称性を有する。一実施形態では、本明細書に記載されるＡＡＶハプロイドビリオンは、感染性である。ＩＴＲは、任意の血清型、例えばＡＡＶ８もしくはＡＡＶ２からのＩＴＲであることもあり、または遺伝子治療のために単離されたＡＡＶの１２の血清型のいずれか、他の種、変異型の血清型、そのような遺伝子のシャフリングされた血清型、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＶＰ１．５、ＡＡＶ４ＶＰ２、ＡＡＶ４ＶＰ３、Ｒｈ１０ＶＰ３、Ｒｈ７４ＶＰ３、Ｒｈ７４ＶＰ２もしくは所望される、例えば表１で開示されるような、任意の他のＡＡＶ血清型からのＩＴＲであることもある。

一部の実施形態では、本明細書で開示されるＡＡＶ合理的ポリプロイドビリオンの実質的に純粋な集団は、少なくとも１０^１個のビリオン、少なくとも１０^２個のビリオン、少なくとも１０^３個のビリオン、少なくとも１０^４個のビリオン、少なくとも１０^５個のビリオン、少なくとも１０^６個のビリオン、少なくとも１０^７個のビリオン、少なくとも１０^８個のビリオン、少なくとも１０^９個のビリオン、少なくとも１０^１０個のビリオン、少なくとも１０^１１個のビリオン、少なくとも１０^１２個のビリオン、少なくとも１０^１５個のビリオン、少なくとも１０^１７個のビリオンである。一実施形態では、集団は、少なくとも１００個のウイルス粒子である。一実施形態では、本明細書で開示されるＡＡＶ合理的ポリプロイドビリオンの集団は、１０^９～１０^１２個のビリオンである。

一実施形態では、集団は、少なくとも１×１０^４ウイルスゲノム（ｖｇ）／ｍｌであるか、少なくとも１×１０^５ウイルスゲノム（ｖｇ）／ｍｌであるか、少なくとも１×１０^６ウイルスゲノム（ｖｇ）／ｍｌ、少なくとも１×１０^７ウイルスゲノム（ｖｇ）／ｍｌ、少なくとも１×１０^８ウイルスゲノム（ｖｇ）／ｍｌ、少なくとも１×１０^９ウイルスゲノム（ｖｇ）／ｍｌ、ｍｌ当たり少なくとも１×１０^１０ｖｇ、ｍｌ当たり少なくとも１×１０^１１ｖｇ、ｍｌ当たり少なくとも１×１０^１２ｖｇである。一実施形態では、集団は、約１×１０^５ｖｇ／ｍｌ～約１×１０^１３ｖｇ／ｍｌの範囲である。

脳もしくは脊髄の疾患もしくは障害またはニューロンもしくは神経変性疾患を処置するための方法に有用な本明細書で開示のポリプロイドＡＡＶベクターの一部の実施形態では、治療効果を発揮するための例示的な用量は、少なくとも約１．０Ｅ１２～４．０Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、または約１．２Ｅ１２～３．０Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、または約１．２Ｅ１２～２．５Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、または約２．５Ｅ１２～４．０Ｅ１２ｖｇ／ｋｇの力価である。

実質的に均一な集団は、本明細書に記載される所望のＡＡＶ合理的ポリプロイドのみの少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも９９．９％である。一実施形態では、集団は、完全に均一である。したがって、本明細書に記載される技術の一部の態様は、実質的に均一なハプロイドまたは合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンを産生するための系であって、表１から選択される１つのＡＡＶ血清型のみからのＶＰ１、ならびに必要に応じて、表１から選択される１つのＡＡＶ血清型のみからのＶＰ２、およびＢＢＢを効率的に横断する任意のＡＡＶ血清型、例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ｒｈ１０、ｒｈ７４、ｒｈ３９およびｒｈ４３、からのＶＰ３をコードする核酸を含むベクターを含む系に関する。一部の実施形態では、ＶＰ３タンパク質は、本明細書で開示の非ヒト霊長類、例えば、チンパンジーまたはアカゲザルＡＡＶ（ＡＡＶｒｈ）血清型、例えば、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ．７３、ＡＡＶｒｈ．７５、ＡＡＶｒｈ．７６、ｒＡＡＶｒｈ．３９、ｒＡＡＶｒｈ．４３からのものである。一部の実施形態では、例示的な系は、（ｉ）第１のＡＡＶ血清型のみからのＶＰ１およびＶＰ２をコードするが第１のＡＡＶ血清型からのＶＰ３を発現しない核酸に動作可能に連結されたプロモーターであって、第１のＡＡＶ血清型が表１に収載される任意の血清型から選択される、プロモーターと、（ｉｉ）本明細書で開示のＢＢＢを効率的に横断する任意のＡＡＶ血清型、例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ｒｈ１０、ｒｈ７４、ｒｈ３９およびｒｈ４３、からのＶＰ３タンパク質をコードする核酸に動作可能に連結されたプロモーターとを含む。

本明細書で提供される一態様は、血液脳関門を横断する際の使用に好適な合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団であって、合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンが、ＡＡＶＶＰ１またはＶＰ２ウイルス構造タンパク質の少なくとも一方と、ＡＡＶＶＰ３ウイルス構造タンパク質とを含み；ＶＰ１およびＶＰ２ウイルス構造タンパク質が、各々、任意のＡＡＶ血清型からのものであり、ＶＰ３ウイルス構造タンパク質が、血液脳関門を効率的に横断し、ＶＰ１またはＶＰ２の少なくとも一方の血清型とは異なるＡＡＶ血清型からのものである、集団であり；全身またはくも膜下腔内投与時に、血液脳関門（ＢＢＢ）を横断する、ならびに／またはＢＢＢの内皮細胞におよび／もしくはＢＢＢを横断する血液成分に形質導入する、合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団を提供する。

本明細書におけるいずれかの態様の一実施形態では、集団は、血液脳関門を横断する能力を欠いている非合理的ポリプロイドＡＡＶ粒子と比べて、血液脳関門（ＢＢＢ）を越える形質導入活性の増強を示す。

本明細書におけるいずれかの態様の一実施形態では、ＶＰ３ウイルス構造タンパク質は、ＡＡＶアカゲザル血清型である。

本明細書におけるいずれかの態様の一実施形態では、ＶＰ３ウイルス構造タンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶｒｈ．３９、およびＡＡＶｒｈ４３からなる群から選択される、血液脳関門を効率的に横断する血清型からのものである。

本明細書におけるいずれかの態様の一実施形態では、集団は、血液脳関門を効率的に横断する能力を欠いている非合理的ポリプロイドＡＡＶ粒子と比べて、対象の皮質、線条体、視床、髄質、海馬、小脳および脊髄のうちの１つまたは複数への増強された形質導入を示す。

本明細書におけるいずれかの態様の一実施形態では、前記合理的ポリプロイドＡＡＶは、髄質神経叢、頸神経叢、胸神経叢、腰神経叢および脈絡叢からなる群から選択されるＣＮＳ領域の１つまたは複数においてＡＡＶ２と比べて増強された形質導入を示す。

本明細書におけるいずれかの態様の一実施形態では、前記合理的ポリプロイドＡＡＶは、ＡＡＶ８と比べて脳微小血管内皮細胞（ＢＭＶＥＣ）への増強された結合を示す。

本明細書におけるいずれかの態様の一実施形態では、集団は、ＣＮＳにおける生体内分布を有する。

本明細書におけるいずれかの態様の一実施形態では、ＣＮＳ生体内分布は、少なくとも０．０５ｖｇ／細胞、０．１Ｖｖｇ／細胞、少なくとも０．２ｖｇ／細胞、少なくとも０．４ｖｇ／細胞、少なくとも０．６ｖｇ／細胞、少なくとも０．８ｖｇ／細胞、少なくとも１ｖｇ／細胞、少なくとも５ｖｇ／細胞、少なくとも１０ｖｇ／細胞、少なくとも２０ｖｇ／細胞、少なくとも２５ｖｇ／細胞であり、または好ましくはそれより多い。

本明細書におけるいずれかの態様の一実施形態では、血液脳関門を横断するＡＡＶ血清型から選択される、ＶＰ１またはＶＰ２のどちらか。

本明細書におけるいずれかの態様の一実施形態では、血液脳関門を横断しないＡＡＶ血清型から選択される、ＶＰ１またはＶＰ２のどちらか。

本明細書におけるいずれかの態様の一実施形態では、ＡＡＶアカゲザル血清型から選択されない、ＶＰ１またはＶＰ２。

本明細書におけるいずれかの態様の一実施形態では、ＡＡＶアカゲザル血清型から選択される、ＶＰ１またはＶＰ２のどちらか。

本明細書におけるいずれかの態様の一実施形態では、集団は、親ＡＡＶＶＰ１またはＡＡＶＶＰ２血清型により惹起される液性応答と比較して少ない液性免疫応答を惹起する。

本明細書におけるいずれかの態様の一実施形態では、集団は、ＡＡＶＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３ウイルス構造タンパク質の親血清型に対する中和抗体から逃れる。

本明細書で提供される一態様は、血液脳関門を越えて導入遺伝子を送達するための方法であって、本明細書に記載される合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンのいずれかについての集団を投与するステップを含む方法を提供する。

本明細書で提供される一態様は、第１および第２の投与を含む反復投薬（repeat doing）のための方法であって、反復投薬が、本明細書に記載される合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンのいずれかの第１の投与、およびＶＰ１またはＶＰ２ウイルス構造タンパク質の親ＡＡＶ血清型の第２の投与を含み、合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団が、ＶＰ１またはＶＰ２ウイルス構造タンパク質の親ＡＡＶ血清型により惹起される液性応答と比較して低減された液性応答を惹起し、ＶＰ１またはＶＰ２が、ＲｈｅｓｕｓＡＡＶ血清型からのものでない、方法を提供する。

本明細書で提供される一態様は、反復投薬を可能にする合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団であって、ＡＡＶＶＰ１またはＶＰ２ウイルス構造タンパク質の少なくとも一方と、ＡＡＶＶＰ３ウイルス構造タンパク質とを含み；ＶＰ１およびＶＰ２ウイルス構造タンパク質が、各々、任意のＡＡＶウイルス血清型からのものであり、ＶＰ３ウイルス構造タンパク質が、アカゲザルＡＡＶ血清型から選択され；合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団が、ＶＰ１またはＶＰ２ウイルス構造タンパク質の親ＡＡＶ血清型により惹起される液性応答と比較して低減された液性応答を惹起し、ＶＰ１およびＶＰ２が、ＲｈｅｓｕｓＡＡＶ血清型からのものではなく、反復投薬が、合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団の第１の投与、およびＶＰ１構造ウイルスタンパク質またはＶＰ２構造ウイルスタンパク質の親ＡＡＶ血清型の第２の投与を含む、集団を提供する。

本明細書で提供される一態様は、合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団であって、（ａ）ＡＡＶ８ウイルス血清型から選択されるＡＡＶウイルス構造タンパク質のＶＰ１およびＶＰ２と、（ｂ）ＡＡＶアカゲザル血清型、ＡＡＶｒｈ１０またはＡＡＶｒｈ７４、から選択されるＶＰ３とを含み、

親ＡＡＶ８血清型により惹起されるものよりも低減された液性応答を惹起する、合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団を提供する。

本明細書で提供される一態様は、第１および第２の投与を含む反復投薬のための方法であって、第１の投与が、本明細書に記載される合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンのいずれかについての集団であり、第２の投与が、ＶＰ１またはＶＰ２ウイルス構造タンパク質の親ＡＡＶ血清型のものであり、第１の投与が、ＶＰ１またはＶＰ２ウイルス構造タンパク質の親ＡＡＶ血清型により惹起される液性応答と比較して低減された液性応答を惹起し、ＶＰ１またはＶＰ２が、ＲｈｅｓｕｓＡＡＶ血清型からのものでない、方法を提供する。

本明細書におけるいずれかの態様の一実施形態では、ＶＰ３タンパク質は、ＡＡＶｒｈ１０またはＡＡＶｒｈ７４血清型からの変異ＶＰ３タンパク質である。

本明細書におけるいずれかの態様の一実施形態では、変異ＡＡＶｒｈ７４ＶＰ３タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列、もしくは配列番号２に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するタンパク質のアミノ酸配列を有し、または変異ＡＡＶｒｈ７４ＶＰ３は、配列番号２の以下の改変：Ｎ２６３Ｓ、Ｇ２６４Ａ、Ｔ２６５Ｓ、Ｓ２６６Ｔ、Ｇ２６８Ａ、Ｔ２７０ｄｅｌ、Ｔ２７４Ｈ、Ｅ５３３Ｋ、Ｒ７２６Ｈ、Ｎ７３６Ｐのうちの少なくとも１つを含む。

本明細書におけるいずれかの態様の一実施形態では、変異ＡＡＶｒｈ１０ＶＰ３タンパク質は、配列番号５のＡＡＶｒｈ１０＿ＶＰ３核酸と比較してＱ２１４Ｎ、Ｓ４６２ＮおよびＤ５１７Ｅ変異のうちの少なくとも１つまたは複数を含む配列番号５の核酸によりコードされるか、またはＱ２１４Ｎ、Ｓ４６２ＮおよびＤ５１７Ｅから選択される少なくとも１つの変異を含む配列番号５に対して少なくとも８５％の配列同一性の核酸配列を含む配列番号５の核酸によりコードされる。

本明細書におけるいずれかの態様の一実施形態では、ＶＰ３タンパク質は、配列番号２もしくは３のアミノ酸配列、または配列番号２もしくは配列番号２に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するタンパク質のアミノ酸配列を含むＡＡＶｒｈ７４ＶＰ３タンパク質であり、あるいは配列番号２のＮ２６３Ｓ、Ｇ２６４Ａ、Ｔ２６５Ｓ、Ｓ２６６Ｔ、Ｇ２６８Ａ、Ｔ２７０ｄｅｌ、Ｔ２７４Ｈ、Ｅ５３３Ｋ、Ｒ７２６Ｈ、Ｎ７３６Ｐのアミノ酸改変のうちの少なくとも１つを含む。

本明細書で提供される一態様は、本明細書に記載されるビリオンのいずれかについての実質的に均一な集団であって、少なくとも１０^１個のビリオンである集団を提供する。

本明細書で提供される一態様は、５’から３’の方向に、（ａ）第１のプロモーターに動作可能に連結されたＡＡＶｒｈ１０ＶＰ３カプシドタンパク質をコードする第１の核酸、（ｂ）第１のポリＡ配列、（ｃ）ｒｅｐタンパク質をコードする第２の核酸、（ｄ）ＡＡＶ８ＶＰ１およびＶＰ２ウイルス構造タンパク質をコードする第３の核酸であって、ＡＡＶ８ＶＰ３ウイルス構造タンパク質を発現することができない、第３の核酸、ならびに（ｅ）第２のポリＡ配列を含む核酸を提供する。

本明細書で提供される一態様は、５’から３’の方向に、（ａ）第１のプロモーターに動作可能に連結されたＡＡＶｒｈ７４ＶＰ３カプシドタンパク質をコードする第１の核酸、（ｂ）第１のポリＡ配列、（ｃ）ｒｅｐタンパク質をコードする第２の核酸、（ｄ）ＡＡＶ８ＶＰ１およびＶＰ２ウイルス構造タンパク質をコードする第３の核酸であって、第ＡＡＶ８ＶＰ３ウイルス構造タンパク質を発現することができない、第３の核酸、ならびに（ｅ）第２のポリＡ配列を含む核酸を提供する。

本明細書で提供される一態様は、（ａ）本明細書に記載されるＡＡＶビリオンのいずれか、および（ｂ）少なくとも１つの末端反復配列と異種遺伝子とを含む核酸を含む、ウイルスベクターであって、核酸がＡＡＶカプシドに封入されている、ウイルスベクターを提供する。

本明細書におけるいずれかの態様の一実施形態では、集団は、キメラまたは改変ウイルス構造タンパク質を含み、改変ウイルス構造タンパク質は、１個または複数個のアミノ酸の挿入、欠失または置換を含む。

本明細書におけるいずれかの態様の一実施形態では、実質的に均一な集団は、親ＡＡＶ血清型を含むビリオンの実質的に均一な集団と比較して、ｉｎｖｉｖｏで血清中のＶＰ１またはＶＰ２構造タンパク質の親ＡＡＶ血清型に対する有意に少ない抗ＡＡＶＩｇＧ抗体を産生する。

本明細書におけるいずれかの態様の一実施形態では、親ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ８である。

本明細書で提供される一態様は、反復投薬を可能にする合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団であって、ＡＡＶＶＰ１またはＶＰ２ウイルス構造タンパク質の少なくとも一方と、ＡＡＶＶＰ３ウイルス構造タンパク質とを含み；ＶＰ１およびＶＰ２ウイルス構造タンパク質が、各々、任意のＡＡＶウイルス血清型からのものであり、ＶＰ３ウイルス構造タンパク質が、アカゲザルＡＡＶ血清型から選択され；合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団が、ＶＰ３ウイルス構造タンパク質の親ＡＡＶアカゲザル血清型に対する中和抗体から逃れ、ＶＰ１およびＶＰ２が、ＲｈｅｓｕｓＡＡＶ血清型からのものではなく、反復投薬が、ＶＰ３構造タンパク質の親ＡＡＶアカゲザル血清型の集団の第１の投与、および合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団の第２の投与を含み、合理的ポリプロイドビリオンのＶＰ３構造タンパク質が、ＡＡＶアカゲザル変異ウイルス構造タンパク質ＶＰ３である、集団を提供する。

本明細書におけるいずれかの態様の一実施形態では、ＡＡＶアカゲザル変異ウイルス構造タンパク質ＶＰ３は、変異ＡＡＶｒｈ１０ＶＰ３ウイルス構造タンパク質からのものであるか、または変異ＡＡＶｒｈ７４ＶＰ３ウイルス構造タンパク質からのものである。

本明細書におけるいずれかの態様の一実施形態では、変異ウイルス構造タンパク質ＶＰ３は、Ｎ２６３、Ｇ２６４、Ｔ２６５、Ｓ２６Ｔ、Ｇ２６８、Ｔ２７０、Ｔ２７４、Ｅ５３３からなる群から選択されるアミノ酸に対応するアミノ酸における変異を含み、この場合のアミノ酸位置の全てが、ＡＡＶｒｈ１０またはＡＡＶｒｈ７４のネイティブＶＰ１配列番号付けに対応する。

本明細書におけるいずれかの態様の一実施形態では、変異は、Ｎ２６３Ｓ、Ｇ２６４Ａ、Ｔ２６５Ｓ、Ｓ２６６Ｔ、Ｇ２６８Ａ、Ｔ２７０ｄｅｌ、Ｔ２７４Ｈ、Ｅ５３３Ｋからなる群から選択される。

本明細書におけるいずれかの態様の一実施形態では、変異ウイルス構造タンパク質ＶＰ３は、Ｒ７２７およびＮ７３７からなる群から選択されるアミノ酸に対応するアミノ酸における変異をさらに含み、この場合のアミノ酸位置の全てが、ＡＡＶｒｈ１０のネイティブＶＰ１配列番号付けに対応する。

本明細書におけるいずれかの態様の一実施形態では、変異は、Ｒ７２７ＨおよびＮ７３７Ｐからなる群から選択される。

本明細書におけるいずれかの態様の一実施形態では、変異ウイルス構造タンパク質ＶＰ３は、Ｒ７２６およびＮ７３６からなる群から選択されるアミノ酸に対応するアミノ酸における変異をさらに含み、この場合のアミノ酸位置の全てが、ＡＡＶｒｈ７４のネイティブＶＰ１配列番号付けに対応する。

本明細書におけるいずれかの態様の一実施形態では、変異は、Ｒ７２６ＨおよびＮ７３６Ｐからなる群から選択される。

本明細書におけるいずれかの態様の一実施形態では、変異ウイルス構造タンパク質ＶＰ３は、５８１におけるＷに対応するアミノ酸における、Ｗが２個の後続のＶ残基（ＶＶ）に置き換えられる変異をさらに含み、この場合のアミノ酸位置の全てが、ＡＡＶｒｈ７４のネイティブＶＰ１配列番号付けに対応する。

本明細書におけるいずれかの態様の一実施形態では、ＡＡＶＶＰ１またはＶＰ２ウイルス構造タンパク質は、表１から選択される任意のＡＡＶ血清型である。

本明細書におけるいずれかの態様の一実施形態では、ＡＡＶＶＰ１またはＶＰ２ウイルス構造タンパク質は、ＡＡＶ８である。

追加の実施形態では、本発明は、（ａ）本明細書で開示の合理的ポリプロイドＡＡＶベクターと（ｂ）少なくとも１つの末端反復配列を含む核酸とを含む、ＡＡＶ合理的ポリプロイドウイルスベクターであって、核酸が、ＡＡＶ合理的ポリプロイドウイルスによりカプシド内封入されている、ＡＡＶ合理的ポリプロイドウイルスベクターを提供する。ＡＡＶ合理的ポリプロイドウイルスベクターは、ＡＡＶハプロイド粒子であり得、本明細書で開示のＡＡＶ合理的ポリプロイドウイルスベクタータンパク質、カプシド、ウイルスベクターおよび／またはＡＡＶハプロイド粒子は、薬学的に許容される担体をさらに含む組成物中に存在し得る。

さらなる実施形態では、本発明は、核酸を細胞に投与する方法であって、細胞を本発明のＡＡＶハプロイドウイルスベクターおよび／または本発明の組成物と接触させるステップを含む方法を提供する。

核酸を対象に送達する方法であって、本発明のＡＡＶハプロイドウイルスベクターおよび／または組成物を対象に投与するステップを含む方法も、本明細書で提供される。

加えて、障害または疾患の有益な処置における医薬の使用のための本発明のＡＡＶ８ハプロイドカプシドタンパク質、カプシド、ウイルスベクター、ＡＡＶ粒子および／または組成物が、本明細書で提供される。

さらなる態様では、本発明は、反復投薬（すなわち、初回用量、および１、または２、または３、または４、または５、または５より多くの後続の用量またはブースター）を可能にする合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団であって、ＡＡＶＶＰ１またはＶＰ２ウイルス構造タンパク質の少なくとも一方と、ＡＡＶＶＰ３ウイルス構造タンパク質とを含み；ＶＰ１およびＶＰ２ウイルス構造タンパク質が、各々、任意のＡＡＶウイルス血清型からのものであり、ＶＰ３ウイルス構造タンパク質が、アカゲザルＡＡＶ血清型（ｒｈＡＡＶ）から選択され、合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団が、ＶＰ３ウイルス構造タンパク質の親ＡＡＶアカゲザル血清型に対する中和抗体から逃れ、ＶＰ１およびＶＰ２が、ＲｈｅｓｕｓＡＡＶ血清型からのものではなく、反復投薬が、ＶＰ３構造タンパク質の親ＡＡＶアカゲザル血清型の集団の第１の投与、および合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団の第２の投与を含み、合理的ポリプロイドビリオンのＶＰ３構造タンパク質が、ＡＡＶアカゲザル変異ウイルス構造タンパク質である、集団を提供する。一部の実施形態では、ＶＰ３構造タンパク質は、ｒｈＡＡＶからの改変ＶＰ３タンパク質、例えば、ｒｈ１０またはｒｈ７４からの改変ＶＰ３タンパク質である。一部の実施形態では、改変ＶＰ３タンパク質は、本明細書で開示のｒｈ１０－ＬＰ２ＶＰ３タンパク質である。一部の実施形態では、改変ＶＰ３タンパク質は、本明細書で開示のｒｈ７４－ＬＰ２ＶＰ３タンパク質である。

一部の実施形態では、反復投薬が、合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの第１の投与、およびアカゲザル血清型の親ＡＡＶＶＰ３ウイルス構造タンパク質の第２の投与を含み、合理的ポリプロイドビリオンのＶＰ３構造タンパク質が、ＡＡＶアカゲザル変異ウイルス構造タンパク質ＶＰ３である、反復投薬を可能にする合理的ポリプロイドビリオンの集団であって、ＡＡＶＶＰ１またはＶＰ２ウイルス構造タンパク質の少なくとも一方とＡＡＶＶＰ３ウイルス構造タンパク質とを含み、ＶＰ１およびＶＰ２ウイルス構造タンパク質が、各々、任意のＡＡＶウイルス血清型からのものであり、ＶＰ３ウイルス構造タンパク質が、アカゲザルＡＡＶ血清型から選択される、集団であり、ＶＰ３ウイルス構造タンパク質の親ＡＡＶアカゲザル血清型に対する中和抗体から逃れ、ＶＰ１およびＶＰ２の少なくとも一方が、ＲｈｅｓｕｓＡＡＶ血清型からのものではない、合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団。一部の実施形態では、ＶＰ１構造タンパク質とＶＰ２構造タンパク質の両方が、ＲｈｅｓｕｓＡＡＶ血清型からのものではない。

親ＡＡＶアカゲザル血清型に対する中和Ａｂから逃れることができる、アカゲザル改変ＶＰ３タンパク質（例えば、本明細書で開示の改変：Ｎ２６３Ｓ、Ｇ２６４Ａ、Ｔ２６５Ｓ、Ｓ２６６Ｔ、Ｇ２６８Ａ、Ｔ２７０ｄｅｌ、Ｔ２７４Ｈ、Ｅ５３３Ｋ、Ｒ７２７Ｈ、Ｎ７３７Ｐのうちのいずれか１つもしくは複数を含むｒｈ１０－ＶＰ３タンパク質、またはＮ２６３Ｓ、Ｇ２６４Ａ、Ｔ２６５Ｓ、Ｓ２６６Ｔ、Ｇ２６８Ａ、Ｔ２７０ｄｅｌ、Ｔ２７４Ｈ、Ｅ５３３Ｋ、Ｒ７２６Ｈ、Ｎ７３６Ｐのうちのいずれか１つもしくは複数を含むｒｈ７４－ＶＰ３タンパク質）を含む合理的ポリプロイド。一部の実施形態では、集団は、親ＡＡＶＶＰ１血清型またはＡＡＶＶＰ２血清型に対する中和Ａｂから逃避することができ、ＶＰ１またはＶＰ２は、アカゲザル血清型からのものではない。

本発明のこれらのおよび他の態様は、下記に示される本発明の説明の中でより詳細に取り上げられる。

本特許出願は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を伴う本願公報のコピーは、請求し、必要料金を支払うと、特許商標庁によって提供されるであろう。添付の図面は、本発明の態様を説明する。

例として与えられるが、記載される特定の実施形態に本発明を限定するように意図されたものではない、以下の詳細な説明は、参照により本明細書に組み込まれる添付の図面と組み合わせることで理解され得る。本発明の様々な好ましい特徴および実施形態が、非限定的な例として、添付の図面に関連して、これから説明される。

図１Ａ～１Ｂは、本明細書で開示のＡＡＶ８ハプロイドの生成のためのオールインワン構築物の概略図を示す。図１Ａは、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０またはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ベクターの生成のための構築物であって、（ｉ）ＡＡＶｒｈ１０血清型またはＡＡＶｒｈ７４血清型からのＶＰ３タンパク質をコードする核酸、続いてポリＡ配列に動作可能に連結されているプロモーター、（ｉｉ）Ｒｅｐ２遺伝子（例えば、プロモーターｐ５、ｐ１５およびｐ４０を含む）をコードする核酸配列、ならびに（ｉｉｉ）ＡＡＶ８血清型からのＶＰ１およびＶＰ２をコードする核酸を含み、ＶＰ３カプシドタンパク質発現のためのスタート開始コドンが不活性化されている、構築物の概略図を示す。この構築物は、ｉｎｖｉｔｒｏでのハプロイドＡＡＶ８ウイルスの生成に使用され得る。図１Ｂは、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドベクターの生成のための例示的なプラスミドマップを示す。同上。

図２は、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０（左側）およびＡＡＶ８－８－ｒｈ７４（右側）ハプロイドウイルス（ＶＰサブユニットは異なる形で結合し得るので、１つの集団からの４つのランダムカプシド）の構造モデルを示し、赤色は、ＡＡＶ８ＶＰ１またはＶＰ２カプシドタンパク質によるビリオンの表面であり、緑色は、ＡＡＶｒｈ１０血清型からのＶＰ３カプシドタンパク質の描写を示し、青色は、ＡＡＶｒｈ７４血清型からのＶＰ３カプシドタンパク質からの表面描写を示す。

図３は、ＡＡＶｒｈ１０血清型（左側）またはＡＡＶｒｈ７４血清型（右側）からのＶＰ３カプシドタンパク質の三次タンパク質構造の刺激およびモデリングを示す。

図４：親血清型、ＡＡＶ８８ｒｈ．１０およびＡＡＶ８８ｒｈ．７４ハプロイド、ＡＡＶｒｈ．１０残基をＡＡＶｒｈ．７４における対応する残基に置き換える変異体、ならびに親ＡＡＶｒｈ．１０ＶＰ３の代わりにこれらの変異体を使用することの結果として生じるハプロイドについての界面解析。Ｙ軸は、ＶＰ３サブユニットと、直接接触している全ての隣接サブユニットとの間の計算相互作用エネルギーを示す。各複合体を相互作用エネルギーの計算の前に最小化し、このプロセスを複合体ごとに３０回反復した。相互作用エネルギーの平均値をウィルコクソンのペアワイズ検定により比較した。箱ひげ図の上部の異なる表示文字は、群間の統計的有意差を表す。

図５は、ＶＰ３ＡＡＶ８カプシドタンパク質の翻訳を防止するための、２つのアミノ酸置換Ｍ２０３ＶおよびＭ２１１Ｖに至るための２つのＡＴＧ開始コドンのＧＴＧへの改変を示す、ＡＡＶ８血清型からのＶＰ１およびＶＰ２を含むＡＡＶ８ハプロイドの生成のための構築物の概略図を示す。図５は、出現順に配列番号２８～４０をそれぞれ開示する。

図６は、ＡＡＶ８と比較して、またはＡＡＶ８－８－ＶＰ３ＫＯの場合の、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０またはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドからのＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３タンパク質の発現を示すウェスタンブロットからの結果を示す。上のパネルは、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０またはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドの産生のための構築物についての図１に示されている概略図であり、下のパネルは、ＡＡＶ８ベクター、またはＡＡＶ８－８－ｒｈ１０もしくはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドに感染させたＰｒｏ１０細胞のウェスタンブロット解析、ならびにＡＡＶ８血清型からのＶＰ１およびＶＰ２とＡＡＶｒｈ７４（レーン１）またはＡＡＶｒｈ１０（レーン２）またはＡＡＶ８（レーン４）からのＶＰ３とを検出するために使用した抗ＣＡＰ抗体を示す。レーン３は、ＶＰ３カプシドタンパク質発現の非存在を示し、これは、ＶＰ３ＡＡＶ８カプシドタンパク質の翻訳および発現を防止するアミノ酸置換Ｍ２０３ＶおよびＭ２１１Ｖに至るように２つのＡＴＧ開始コドンがＧＴＧに変えられている核酸を含む構築物から、ＶＰ３が発現されないことを示す。

図７は、ＡＡＶ８ベクター（ＡＡＶ８－８－８［ＷＴ］）またはＡＡＶ８－ＶＰ３ＫＯ（ＡＡＶ８－８－ＶＰ３ＫＯ）と比較してＡＡＶ８－８－ｒｈ１０またはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドのゲノム保護アッセイの結果を示す。

図８は、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０生産性がＡＡＶ８およびＡＡＶｒｈ１０対照に匹敵したことを示す、ｑＰＣＲおよびＥＬＩＳＡによって決定されたＡＡＶ８－８－ｒｈ１０またはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドの比生産性についての表である。ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４は、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０および対照と比較して低い生産性レベルであった。統計学的に有意でない平均値の比較。

図９Ａ～９Ｂは、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０またはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドの親和性クロマトグラフィー結果およびＡＥＸクロマトグラフィーを示す。図９Ａは、産生中のより低いパッケージング効率を示唆する、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドのより低いＳＥＣ２６０／２８０値（矢印を参照されたい）を示す、親和性クロマトグラフィー結果を示す。図９Ｂは、親和性クロマトグラフィーの後に、空のカプシドをフルカプシドから分離するためにイオジキサノール密度勾配超遠心分離（ＤＧＵＣ）プロセスステップを行い、イオジキサノールプールを希釈し、ＡＥＸカラムに負荷する、ＡＥＸクロマトグラフィーを示す。１．３により近い（約７５％またはそれより高い）ＳＥＣ２６０／２８０値は、フルカプシドＡＡＶ８－８－ｒｈ７４値のエンリッチメント成功（矢印）が、より低いエンリッチメントを示す１．１であることを示唆する。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。

図１０Ａ～１０Ｄは、ＡＡＶ８およびＡＡＶｒｈ１０対照と比較してＡＡＶ８－８－ｒｈ１０またはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドからのｑＰＣＲおよびＥＬＩＳＡにより決定された産物回収率についての結果を示す。図１０Ａは、ＡＡＶ８対照からの産物回収率を示し、図１０Ｂは、ＡＡＶｒｈ１０対照からの産物回収率を示す。ＡＡＶ８およびＡＡＶｒｈ１０についての現行の生成プロセスの回収率は、ｑＰＣＲアッセイに基づいて８～１２％であり、ＡＡＶ８およびＡＡＶｒｈ１０対照の回収率は、互いに匹敵する。図１０Ｃは、全回収率がＡＡＶ８およびＡＡＶｒｈ１０対照（それぞれ、図１０Ａおよび１０Ｂ）に匹敵することを示す、ルシフェラーゼ遺伝子を含むＡＡＶ８－８－ｒｈ１０ベクターからの産物回収率を示す。図１０Ｄは、５％の未満の全回収率を示す、ルシフェラーゼ遺伝子を含むＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ベクターからの産物の回収率を示し、初期生産性が低いほど低い回収率に至るが、ＤＳＰ単位操作は、親和性クロマトグラフィーで出発して、より低い回収率（約５～１２％）を報告する。同上。同上。同上。

図１１Ａ～１１Ｃは、ＡＡＶ８およびＡＡＶｒｈ１０対照と比較してＡＡＶ８－８－ｒｈ１０またはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドの電気泳動図解析を示す。図１１Ａは、ＡＡＶ８およびＡＡＶｒｈ１０対照と比較してＡＡＶ８－８－ｒｈ１０またはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドのＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の比を示す。図１１Ｂは、ＡＡＶ８対照の電気泳動図解析（３つの個々の調製物のオーバーレイ）を示す。図１１Ｃは、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０ハプロイド（下側）およびＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイド（上側）の電気泳動図解析を示す。同上。同上。

図１２Ａ～１２Ｂは、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０またはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドの代表的な電気泳動図解析を示す。図１２Ａは、ＡＡＶ８参照材料、およびＡＡＶ８－８－ｒｈ１０またはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ビリオンの各々を示す、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０またはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドの２つの代表的な電気泳動図のグラフを示す。図１２Ｂは、異なる血清型が３つのカプシドタンパク質の異なる相対比を有する、ＡＡＶ５およびＡＡＶ９血清型の代表的な電気泳動図のグラフを示す。同上。同上。

図１３Ａ～１３Ｂは、ＡＡＶ８およびＡＡＶｒｈ１０対照と比較してＰｒｏ１０細胞におけるＡＡＶ８－８－ｒｈ１０またはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドの形質導入効率の結果を示す。図１３Ａは、各ＡＡＶ８ハプロイドベクターの形質導入有効性を決定するためのプロトコールの概略図を示し、ベクターの生成のためのプラスミドが、Ｐｒｏ１０産生細胞系に形質導入するために使用される。図１３Ｂは、２つの実験の１００ＫＭＯＩでの形質導入の効率の結果（左側および中央のグラフ）、ならびにＡＡＶ８およびＡＡＶｒｈ１０対照と比較してＡＡＶ８－８－ｒｈ１０またはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドの複合メタ解析の結果（右側のグラフ）を示し、これらの結果は、Ｐｒｏ１０細胞に形質導入するハプロイドベクターの能力に多少の差があることを示した：ＡＡＶ８－８－Ｒｈ７４ハプロイドは、ＡＡＶ８対照と同様にＰｒｏ１０細胞に形質導入した。統計は、ＡＮＯＶＡ＋チューキー検定により行った。同上。

図１４Ａ～１４Ｂは、ＡＡＶ８およびＡＡＶｒｈ１０対照と比較してＡＡＶ８－８－ｒｈ１０またはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドによるＡＡＶ８中和抗体からの逃避を示す。図１４Ａは、２つの実験からの結果（左側および中央のグラフ）および複合メタ解析からの結果（右側のグラフ）を示し、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０またはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドが、ＡＡＶ８およびＡＡＶｒｈ１０対照と比較して中和ＡｂＡＡＶ８１／１００から効率的に逃避することができ、したがって、対照と比較して低いルシフェラーゼ阻害％を示すことを示唆している。図１４Ｂは、２つの実験からの結果（左側および中央のグラフ）および複合メタ解析からの結果（右側のグラフ）を示し、ＡＡＶ８およびＡＡＶｒｈ１０対照と比較して中和ＡｂＡＡＶ８１／２００から効率的に逃避する上でのＡＡＶ８－８－ｒｈ１０またはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドの高い効率を、対照と比較して低いルシフェラーゼ阻害％により示唆される通り、示す。同上。

図１５（実験１、実験２および複合メタ解析）は、ＡＡＶ８中和Ａｂ（ＡＡＶ８を接種したマウスからの血清）の存在下でＡＡＶ８媒介ルシフェラーゼ発現は用量依存的に影響を受けたが、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４媒介ルシフェラーゼ発現はＡＡＶ８中和抗体の存在下でも非存在下でも（黒色の棒）影響を受けなかったことを示す。統計は、ＡＮＯＶＡ＋チューキー検定により行った。

図１６（実験１、実験２および複合メタ解析）は、ＡＡＶ８中和Ａｂを含むＡＡＶ８接種マウスからの血清の存在下で、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０媒介ルシフェラーゼ発現がＡＡＶ８対照（図１５に示されている通り）とほぼ同様に影響を受けたことを示す。図１６の下方のパネルにより示唆されるように、ＡＡＶ８中和Ａｂ（ＡＡＶ８血清）は、ＡＡＶｒｈ１０に対する交差反応を示した。統計は、ＡＮＯＶＡ＋チューキー検定により行った。

図１７Ａ～１７Ｂは、ヒト線維芽細胞系ＧＭ１６０９５細胞においてＡＡＶ８およびＡＡＶｒｈ１０対照と比較してＡＡＶ８－８－ｒｈ１０またはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドの形質導入効率の結果を示す。図１７Ａは、各ＡＡＶ８ハプロイドベクターの形質導入有効性を決定するためのプロトコールの概略図を示し、ベクターの生成のためのプラスミドが、神経細胞系ＧＭ１６０９５に形質導入するために使用される。図１７Ｂは、ＡＡＶ８およびＡＡＶｒｈ１０対照と比較してＡＡＶ８－８－ｒｈ１０またはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドの１００ＫＭＯＩでの形質導入の効率についての結果を示し、これらの結果は、ＧＭ１６０９５細胞に形質導入するハプロイドベクターの能力に多少の差があることを示した：ＡＡＶ８－８－Ｒｈ７４ハプロイドは、ＡＡＶ８またはＡＡＶｒｈ１０対照より有意に効率よくＧＭ１６０９５細胞に形質導入したが、ＡＡＶｒｈ１０は、このＧＭ１６０９５細胞系においてＡＡＶ８より効率が高かった。統計は、ＡＮＯＶＡ＋チューキー検定により行った。同上。

図１８Ａ～１８Ｂは、ＡＡＶ８およびＡＡＶｒｈ１０対照と比較してＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドによるＧＭ１６０９５細胞におけるＡＡＶ８中和抗体（Ｎａｂ）からの逃避を示す。図１８Ａは、ＡＡＶ８を接種したマウスの血清におけるＮＡｂが、ＡＡＶ８でのＧＭ１６０９５細胞への形質導入を用量依存的に阻害したことを示す。ＡＡＶ８－８－Ｒｈ７４ハプロイドベクターは、抗ＡＡＶ８ＮＡｂから効率的に逃避し、ＮＡｂの存在下と非存在下でルシフェラーゼ導入遺伝子発現に差は見られなかった。ＡＡＶ８－８－Ｒｈ１０ハプロイドでの形質導入は、ＡＡＶ８対照と比べて同程度、ＮＡｂによって阻害された。抗ＡＡＶ８ＮＡｂの交差反応性がＡＡＶＲｈ１０して検出された。図１８Ｂは、１／１００または１／２００でＡＡＶ８を接種したマウスの血清におけるＮＡｂが、ＡＡＶ８およびＡＡＶ８－８－ｒｈ１０でのＧＭ１６０９５細胞への形質導入を阻害したが、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４でのＧＭ１６０９５細胞への形質導入を１／１００濃度でも１／２００濃度でも阻害しなかったことを示し、これは、ＡＡＶ８－８－Ｒｈ７４ハプロイドベクターは抗ＡＡＶ８ＮＡｂから逃避することができたが、ＡＡＶ８－８－Ｒｈ１０ハプロイドでの形質導入はＡＡＶ８対照と比べて同程度、ＮＡｂによって阻害されたことを実証する。抗ＡＡＶ８ＮＡｂの交差反応性がＡＡＶＲｈ１０に対して検出された。同上。

図１９Ａ～１９Ｂは、ＡＡＶ８ハプロイドベクターによるｉｎｖｉｔｒｏでのＰｒｏ１０細胞への形質導入の効率、およびＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドのＰｒｏ１０細胞における中和抗体（Ｎａｂ）からの逃避を、ＡＡＶ８およびＡＡＶｒｈ１０対照と比較して示す。図１９Ａは、１００ＫＭＯＩ（左側）で、ならびに１／１００（中央）および１／２００濃度でのＡＡＶ８血清の存在下で、ＡＡＶ８またはＡＡＶｒｈ１０と比較したＰｒｏ１０細胞へのＡＡＶ８－８－ｒｈ７４形質導入のより高い効率を示す。図１９Ｂは、ＡＡＶ８を接種したマウスの血清におけるＮＡｂが、ＡＡＶ８でのＰｒｏ１０細胞への形質導入を用量依存的に阻害したことを示す。ＡＡＶ８－８－Ｒｈ７４ハプロイドベクターは、抗ＡＡＶ８ＮＡｂから逃避することができ、ＮＡｂの存在下と非存在下でＡＡＶ８－８－ｒｈ７４媒介ルシフェラーゼ導入遺伝子発現に差は見られなかった。ＡＡＶ８－８－Ｒｈ１０ハプロイドでの形質導入は、ＡＡＶ８対照と比べて同程度、ＮＡｂによって阻害された。抗ＡＡＶ８ＮＡｂの交差反応性がＡＡＶＲｈ１０に対して検出された。同上。

図２０は、ｉｎｖｉｖｏでマウスにおいてＡＡＶ８およびＡＡＶｒｈ１０対照と比較してＡＡＶ８－８－ｒｈ１０またはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドの形質導入の生体内分布を解析するためのプロトコールを示す概略図である。実験を４群のマウスを用いて行い、各群は、群内に５匹を有し、各群内の４匹のマウスに実験ベクターを注射し（実験マウス）、１匹を無処置で放置した（対照マウス）。マウスに、５×１０^１０ｖｇ／マウスの対照ＡＡＶ８（対照マウス）、あるいはＡＡＶｒｈ１０またはハプロイドＡＡＶ８－８－ｒｈ１０もしくはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４（実験マウス）を静脈内注射した。

図２１Ａ～２１Ｄは、ルシフェラーゼ実験により決定されたｉｎｖｉｖｏでのＡＡＶ８ハプロイドからの形質導入の生体内分布を示す。図２１Ａは、ＡＡＶ８（群１）およびＡＡＶｒｈ１０（群４）対照と比較してＡＡＶ８－８－ｒｈ１０（群２）またはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４（群３）ハプロイドの注射後７日目（ｄｐｉ）での３０秒露光後のルシフェラーゼ発現の腹側生体内分布を示し、全身性の生体内分布も、脳および脊髄におけるならびに血液脳関門を横断するＡＡＶ８－８－Ｒｈ７４の有意な分布も示す、ＡＡＶ８－８－Ｒｈ７４ベクターの異なる生体内分布を示す。図２１Ｂは、ＡＡＶ８（群１）およびＡＡＶｒｈ１０（群４）対照と比較してＡＡＶ８－８－ｒｈ１０（群２）またはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４（群３）ハプロイドの注射後７日目（７ｄｐｉ）での１分露光後のルシフェラーゼ発現の腹側生体内分布を示し、ＡＡＶ８－８－Ｒｈ７４の有意により高度な分布を示し、２１Ａに示されている結果を確証する。図２１Ｃは、ＡＡＶ８（群１）およびＡＡＶｒｈ１０（群４）対照と比較してＡＡＶ８－８－ｒｈ１０（群２）またはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４（群３）ハプロイドの注射後７日目（７ｄｐｉ）における自動露光後のルシフェラーゼ発現の腹側生体内分布を示し、これは、４群全てにおける基礎生体内分布レベルを示し、ひいては他の群と比較してＡＡＶ８－８－ｒｈ７４の生体内分布の有意な向上をさらに裏付ける。図２１Ｄは、７日後のルシフェラーゼ発現の背側対腹側像の全光束（ｐ／ｓ）のグラフ表現である。統計は、ＡＮＯＶＡ＋チューキー検定（マウスｎ＝４／群）により行った。同様の結果が注射後１４日および２１日目に得られ、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４は、ｉｎｖｉｖｏで他の群と比較して全身性の生体内分布の向上を、例えばＣＮＳおよび他の組織において、一貫して示す。統計は、ＡＮＯＶＡ＋チューキー検定（マウスｎ＝４／群）により行った。同様の結果が注射後１４日および２１日目に得られ、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４は、他の群と比較して全身性の生体内分布の向上を、例えばＣＮＳおよび他の組織において、一貫して示す。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。

図２２は、ＡＡＶｒｈ７４からのＶＰ３カプシドタンパク質（下側の配列）と比較したＡＡＶｒｈ１０からのＶＰ３カプシドタンパク質（上側の配列）のアミノ酸配列アラインメントであって、これらの配列が４領域においてのみ異なることを示すアラインメントを示す。

図２３Ａ～２３Ｃは、ＡＡＶｒｈ．１０（緑色）をＡＡＶｒｈ．７４（青緑色）に対して示す。両方の血清型からのＶＰ３ドメインは、５つの位置においてのみ異なる：Ｑ４１７Ｎ（赤色）、ＶＶ５８１Ｗ（青色）、Ｓ６６５Ｎ（赤紫色）およびＤ７２０Ｅ（橙色）［ＶＰ１カプシドタンパク質のアミノ酸配列からの命名法／番号付けを使用］。図２３Ａは、目的の残基を記載の通り着色した、ＡＡＶｒｈ．７４からのＶＰ３カプシドタンパク質に対するＡＡＶｒｈ．１０からのＶＰ３カプシドタンパク質の重ね合わせ三次構造を示し、その一方で図２３Ｂは、ＡＡＶｒｈ１０カプシドの表面、図２３Ｃは、ＡＡＶｒｈ７４カプシドの表面を、前述の色の規定に従って示す。図２３Ｂおよび２３Ｃは、４１７を除いて全ての位置が溶媒（およびＮＡｂ）に接触可能であることを明らかに示す。ＡＡＶｒｈ．１０におけるＱ４１７とＡＡＶｒｈ．７４におけるＮ４１７の両方は埋もれている（表面に赤色パッチがない）ため、それらは、ＮＡｂによる認識のいかなる差の原因にもならない可能性が高い。５８１および／または６６５および／または７２０位は、ＡｃＮによるＡＡＶｒｈ．１０のＡＡＶｒｈ７４とは異なる認識の原因となり得、このことは、それらを含有するハプロイドに広げられる。

図２４は、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０またはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイド間のプロテアーゼ切断プロファイルに由来する。４９のプロテアーゼからの１９のプロテアーゼにおける切断の変量の数値を解析した。これらから、以下の群が強調され得る：（ｉ）カテプシンＫ（予測セットにおける唯一のリソソーム酵素）。ＡＡＶｒｈ．７４は、追加の切断部位を有する。（ｉｉ）マトリックスメタロペプチダーゼ－１、－２、－３および－９。ＡＡＶｒｈ．７４は、－１および－３については１部位を失い、ＭＭＰ－２および－９については１部位を得る。カテプシンＫと同様に、カプシドがそれらの正常な生体内分布および感染プロセスにおいてこれらの酵素と接触し得る可能性が高い。（ｉｉｉ）グランザイム、エラスターゼ、カテプシンＧおよびカスパーゼ：これらの酵素は、ウイルスに対する免疫応答に関連する可能性がある。（ｉｖ）ペプシンおよびキモトリプシンは、消化酵素である。

図２５Ａ～２５Ｄは、ＡＡＶ８およびＡＡＶｒｈ１０対照と比較してＡＡＶ８－８－ｒｈ１０またはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドの液性免疫応答を示す。図２５Ａは、抗ＡＡＶ８ＩｇＧレベル（１／１０００の血清希釈度）を示し、図２５Ｂは、抗ＡＡＶ８ＩｇＧレベル（１／５０００の血清希釈度）を示し、これらは、ＡＡＶ８を注射したマウスと比較して両方のハプロイドベクターを接種したマウスの血清において有意に低下した抗ＡＡＶ８ＩｇＧレベルが検出されたことを示す。ＡＡＶ８に対する交差反応性は、試験した血清希釈度でＡＡＶｒｈ１０を接種したマウスからの血清では見られなかった。図２５Ｃは、抗ＡＡＶｒｈ１０ＩｇＧレベル（１／１０００の血清希釈度）を示し、図２５Ｄは、抗ＡＡＶｒｈ１０ＩｇＧレベル（１／５０００の血清希釈度）を示し、ＡＡＶｒｈ１０の免疫原性がＡＡＶ８より有意に低かったこと、および試験した血清希釈度でＡＡＶｒｈ１０を接種したマウスと実験群の残部との間に抗ＡＡＶｒｈ１０ＩｇＧレベルの有意差が認められなかったことを示す。統計は、ＡＮＯＶＡ＋チューキー検定（マウスｎ＝４／群）により行った。

図２６Ａ～２６Ｂは、Ｎａｂの存在下での、例えば、ＡＡＶ８を接種したマウス（群１）、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０を接種したマウス（群２）、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４を接種したマウス（群３）、ＡＡＶｒｈ１０を接種したマウス（群４）、および無処置対照（群５）からの血清の存在下での、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ１０、ハプロイドＡＡＶ８－８－ｒｈ１０およびＡＡＶ８－８－ｒｈ７４に対する液性免疫応答、ならびにＡＡＶ８媒介ＧＭ１６０９５細胞形質導入を示す。図２６Ａは、ＡＡＶ８血清によるＧＭ１６０９５細胞へのＡＡＶ８媒介形質導入の用量依存的な中和を示すが、ＡＡＶ８媒介形質導入は、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０ハプロイドを接種したマウス（群２）、またはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドを接種したマウス（群３）、またはＡＡＶｒｈ１０を接種したマウス（群４）、または無処置対照（群５）からの血清（１／１００、または１／２００、または１／４００の希釈度）の存在下では中和されなかった。図２６Ｂは、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０ハプロイドからでもＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドからでもＡＡＶｒｈ１０からでもなく、ＡＡＶ８のみからのルシフェラーゼ発現の阻害を示す、１／１００の希釈度（左側）または１／２００の希釈度（右側）でのＡＡＶ８血清による中和のグラフを示し、これらの濃度でのＡＡＶ８血清が、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０またはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドによるトランスフェクション効率も形質導入効率も中和しないことを明らかにする。同上。

図２７Ａ～２７Ｂは、Ｎａｂ、例えば、ＡＡＶ８を接種したマウス（群１）、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０を接種したマウス（群２）、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４を接種したマウス（群３）、ＡＡＶｒｈ１０を接種したマウス（群４）、および無処置対照（群５）からの血清の存在下での、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ１０、ハプロイドＡＡＶ８－８－ｒｈ１０およびＡＡＶ８－８－ｒｈ７４に対する液性免疫応答、ＡＡＶｒｈ１０媒介ＧＭ１６０９５細胞形質導入を示す。図２７Ａは、ＡＡＶｒｈ１０でのＧＭ１６０９５細胞形質導入の中和が、試験したいずれの希釈度（１／１００、１／２００および１／４００）のＡＡＶｒｈ１０を接種したマウス（群４）からの血清でも検出されなかったことを示す。図２７Ｂは、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０およびＡＡＶ８－８－ｒｈ７４からのルシフェラーゼ発現の阻害を示す、１／１００の希釈度（左側）または１／２００の希釈度（右側）でのＡＡＶｒｈ１０による中和のグラフであって、ＡＡＶｒｈ１０血清に対するそれらの交差反応性を示唆するグラフを示し；ＡＡＶ８、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０およびＡＡＶ８－８－ｒｈ７４からのルシフェラーゼ発現の阻害を示す、１／１００の希釈度（左側）または１／２００の希釈度（右側）でのＡＡＶｒｈ１０血清による中和のグラフであって、ＡＡＶｒｈ１０血清に対するそれらの交差反応性を示唆するグラフを示す。同上。

図２８は、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドの生成のための構築物（上側の構築物）またはＡＡＶ８－８－ｒｈ１０ハプロイドの生成のための構築物（下側の構築物）の概略図を示す。ＡＡＶｒｈ７４からのＶＰ３カプシドタンパク質（下側の配列）と比較してＡＡＶｒｈ１０からのＶＰ３カプシドタンパク質（上側の配列）のアミノ酸配列アラインメントも示し、これらの配列が４つの領域；ＡＡＶｒｈ１０からのＶＰ３カプシドタンパク質のアミノ酸配列（図２２にも示されている）からの命名法／番号付けを使用する場合、Ｑ２１４Ｎ、ＶＶ３７８Ｗ、Ｓ４６２Ｎ、Ｄ５１７Ｅ、においてのみ異なることを示す。ＡＡＶｒｈ１０のＶＰ１カプシドタンパク質によると対応するアミノ酸位置は、Ｑ４１７Ｎ、Ｖ５８１（ｄｅｌ）Ｖ５８２Ｗ、Ｓ６６５ＮおよびＤ７２０Ｅである。同上。

図２９Ａ～２９Ｃは、アミノ酸改変を含むＡＡＶ８－８－ｒｈ１０またはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドの生産収率を示す。図２９Ａは、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４（未改変）からの収率と比較してＡＡＶ８－８－ｒｈ７４（Ｗ５８１ＶＶ）（ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ｖｖとも呼ばれる）の収率の４倍より大きい増加を示し、この収率は、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０の収率と同様である。図２９Ａでは、ＡＡＶｒｈ７４ｖｖは、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４５８１－Ｗ５８２Ｖ（本願を通してＷ５８１ＶＶと交換可能に使用される）として表されている。ｒｈ７４ＶＰ３タンパク質のＮ４１７ＱおよびＮ６６４ＳおよびＥ７１９Ｄの改変は、収率を改善しなかった（ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４（Ｎ４１７Ｑ）、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４（Ｎ６６４Ｓ）、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４（Ｅ７１９Ｄ）を参照されたい）。３つの独立した形質導入実験からの結果が示されている。図２９Ｂは、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０（Ｖ５８１ｄｅｌ）およびＡＡＶ８－８－ｒｈ１０（Ｖ５８２Ｗ）は未改変ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０と比較して収率を有意に低下させたが、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０（Ｓ６６５Ｎ）およびＡＡＶ８－８－ｒｈ１０（Ｄ７２０Ｅ）は未改変ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０と比較して収率に有意な影響を与えなかったことを示す。まとめると、図２９Ａおよび図２９Ｂは、正変異および復帰変異により、Ｒｈ１０からのＶＰ３カプシドタンパク質のアミノ酸５８１および５８２位がウイルス産生に重要であることを裏付ける。図２９Ｃは、ＤＮａｓｅおよびプロテイナーゼＫ処理後にＩＴＲ－ｑＰＣＲ解析を使用して、Ｑ４１７Ｎ、Ｓ６６５ＮおよびＤ７２０Ｅがウイルス産生にあまり影響を与えなかったが、Ｖ５８１ｄｅｌおよびＶ５８２Ｗが未改変ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０と比較してウイルス産生を低減させたことをさらに裏付け；ＤＮａｓｅおよびプロテイナーゼＫ処理後にＩＴＲ－ｑＰＣＲ解析を使用して、Ｑ４１７Ｎ、Ｓ６６５ＮおよびＤ７２０Ｅがウイルス産生にあまり影響を与えなかったが、Ｖ５８１ｄｅｌおよびＶ５８２Ｗが未改変ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０と比較してウイルス産生を低減させたことをさらに裏付ける。同上。

図３０Ａ～３０Ｃは、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ベクターを静脈内投与したマウスからの脳および脊髄組織におけるルシフェラーゼ導入遺伝子の遺伝子発現を示し、これは、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ベクターが血液脳関門（ＢＢＢ）を横断することを裏付ける。図３０Ａは、２．５×１０^１２ｖｇ／ｋｇのＡＡＶベクターのｉ．ｖ．投与の２８日後に組織を収集し、ルシフェラーゼ転写物をＲＴ－ＰＣＲにより評価することを示す、脳、脊髄および小腸におけるハプロイドＡＡＶ８－８－Ｒｈ７４またはＡＡＶ８－８－Ｒｈ１０ベクターの生体内分布を評価するためのプロトコールを示す。図３０Ｂは、２．５×１０^１２ｖｇ／ｋｇのＡＡＶＲｈ１０、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８－８－Ｒｈ７４またはＡＡＶ８－８－Ｒｈ１０（ｎ＝４）のいずれかのｉ．ｖ．投与の２８日後のマウスの脳組織におけるルシフェラーゼのＲＴ－ＰＣＲの結果を示す。図３０Ｃは、２．５×１０^１２ｖｇ／ｋｇのＡＡＶＲｈ１０、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８－８－Ｒｈ７４またはＡＡＶ８－８－Ｒｈ１０（ｎ＝４）のいずれかのｉ．ｖ．投与の２８日後のマウスの脊髄組織におけるルシフェラーゼのＲＴ－ＰＣＲの結果を示す。同上。同上。

図３１は、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ベクターが、ＡＡＶＲｈ１０、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ８－８－Ｒｈ１０と比較して有意なトロピズムを有し、小腸に効率的に形質導入することを実証する、ＡＡＶＲｈ１０、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８－８－Ｒｈ７４またはＡＡＶ８－８－Ｒｈ１０（ｎ＝４）の静脈内投与の２８日後のマウスの小腸におけるルシフェラーゼ導入遺伝子の遺伝子発現を決定するためのＲＴ－ＰＣＲの結果を示す。

図３２は、表９、１０、１１および１２を示す。同上。同上。同上。同上。同上。

発明の詳細な説明
本発明は、次に、本発明の代表的な実施形態が示されている添付の図面を参照して説明される。しかし、本発明は異なる形態で実施することができ、本明細書で示される実施形態に限定されると見なすべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が徹底した完全なものになるように、また本発明の範囲を当業者に十分に知らせるために、提供される。

別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての専門および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書での本発明の説明において使用される用語法は、特定の実施形態を説明することを目的にしたものに過ぎず、本発明を限定することを意図したものでない。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、受託番号および他の参考文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本発明の説明および添付の特許請求の範囲におけるＡＡＶカプシドウイルス構造タンパク質中の全てのアミノ酸位置の指定は、ＶＰ１カプシドサブユニット番号付け（ネイティブＡＡＶ８ＶＰ１カプシドタンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ５１３８５２．１、タンパク質ＩＤ：ＡＡＮ０３８５６．１）に関するものである。本明細書に記載される改変が、ＡＡＶｃａｐ遺伝子に挿入された場合、カプシドサブユニットを構成する構造ウイルスタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３の改変につながり得ることは、当業者には理解されるであろう。あるいは、カプシドサブユニットを独立して発現させて、カプシドサブユニットうちの１つだけまたは２つ（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ１＋ＶＰ２）の改変を達成することができる。

特に、以前の研究で、本発明者らは、複数の血清型からのＶＰを使用することによるポリプロイド（例えば、ハプロイド）ＡＡＶベクターが、異なる生体内分布、特定の組織、例えば肝臓でのより高度な形質導入を生じさせる結果となることを実証した。

本明細書での技術は、血液脳関門（ＢＢＢ）を横断する任意のＡＡＶ血清型からのＶＰ３構造タンパク質を含む合理的ポリプロイドアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子、ビリオンおよびウイルスカプシドの均一な集団であって、ポリプロイドＡＡＶビリオンが、全身またはくも膜下腔内投与時に、ＢＢＢを横断する、ならびに／またはＢＢＢの細胞にもしくは脳血管（ＢＢＶ）内皮細胞（ＢＢＶ－ＥＣ）におよび／もしくはＢＢＢを横断する血液成分に形質導入する、均一な集団に一般に関する。一部の実施形態では、ＶＰ３カプシドタンパク質は、非ヒト霊長類からのものであり、一部の実施形態では、ＶＰ３カプシドタンパク質は、ＡＡＶアカゲザル血清型である。一部の実施形態では、合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンは、ＶＰ３タンパク質に加えて、少なくとも１つのＶＰ１および／またはＶＰ２ウイルス構造タンパク質を含む。特定の実施形態では、合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンは、ＡＡＶ８からのＶＰ１カプシドタンパク質と、ＢＢＢを横断する任意のＡＡＶ血清型からの少なくとも１つのＶＰ３カプシドタンパク質とを含む。

一部の実施形態では、ＢＢＢを横断することができる、ならびに／またはＢＢＢの細胞にもしくは脳血管（ＢＢＶ）内皮細胞（ＢＢＶ－ＥＣ）におよび／もしくはＢＢＢを横断する血液成分に形質導入することができる、本明細書で開示される合理的ポリプロイドアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の均一な集団は、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ｖｖ、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０ＬＰ２、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ＬＰ２、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ｖｖＬＰ２のうちのいずれかから選択され得る。一部の実施形態では、ＢＢＢを横断する、ならびに／またはＢＢＢの細胞にもしくはＢＢＶ－ＥＣにもしくはＢＢＢを横断する細胞に形質導入する、そのようなＡＡＶハプロイドビリオンは、ＡＡＶ８ＶＰ１およびＶＰ２構造タンパク質（例えば、配列番号７および８）を含むこともあり、または配列番号７もしくは８の改変タンパク質と、ｒｈ１０ＶＰ３（配列番号１）、ｒｈ７４ＶＰ３（配列番号３）、ｒｈ７４ｖｖＶＰ３（配列番号２）、ｒｈ１０－ＬＰ２ＶＰ３タンパク質（配列番号１４）、ｒｈ７４－ＬＰ２ＶＰ３タンパク質（配列番号１７）、およびｒｈ７４ｖｖ－ＬＰ２ＶＰ３タンパク質（配列番号１５）のうちのいずれかから選択されるＶＰ３タンパク質、もしくは配列番号１、２、３、１４、１５および１８のいずれかに対して少なくとも８５％配列同一性であるアミノ酸配列を有するＶＰ３タンパク質とを含むこともある。

本明細書に記載される技術は、ＢＢＢを効率的に横断する任意のＡＡＶ血清型からの、本明細書では「カプシドタンパク質」とも呼ばれる、ＶＰ３構造タンパク質の使用が、全身またはくも膜下腔内投与後にベクターの生体内分布および形質導入効率を変化させ、特に、一部の実施形態では、ＡＡＶベクターのＢＢＢを横断する能力およびＣＮＳまたは末梢神経系（ＰＮＳ）における１つまたは複数の組織に形質導入する能力の増大を示すという発見に、一部は基づく。一部の実施形態では、それは、ＢＢＢ内皮細胞（ＢＢＢＥＣ）へのおよび／もしくはＢＢＢの成分への形質導入の増加、または脳血管（ＢＢＶ）の内皮細胞への形質導入の増加、またはＢＢＢを横断する血液成分への形質導入の増加を示す。一部の実施形態では、合理的ポリプロイドベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ｒｈ１０、ｒｈ７４、ｒｈ３９、およびｒｈ４３からなる群から選択される任意の血清型からのＶＰ３ウイルス構造タンパク質を含む。一部の実施形態では、合理的ポリプロイドベクターは、任意の非霊長類ＡＡＶ血清型、例えばアカゲザルＡＡＶ血清型、からのＶＰ３ウイルス構造タンパク質を含む。

単に説明のために、実施例によって、全身またはくも膜下腔内投与時にＢＢＢを横断する能力の増大を有する例示的なポリプロイド、例えばハプロイドベクターが実証される。単に例示を目的として、そのようなハプロイドベクターは、ＢＢＢを効率的に横断する任意のＡＡＶ血清型からのＶＰ３と、ＡＡＶ８血清型からのＶＰ１および／またはＶＰ２とを含む。ＡＡＶＶＰ１および／またはＶＰ２構造タンパク質は、表１から選択される任意のＡＡＶ血清型からのＶＰ１またはＶＰ２であり得る。したがって、例示的なハプロイドベクターが本明細書に記載され、ＡＡＶ８血清型からのものであるカプシドタンパク質ＶＰ１と、ＢＢＢを横断する任意のＡＡＶ血清型からのおよび／または非ヒト霊長類からのものであり、ＡＡＶ８血清型ではない、少なくとも１つのカプシドタンパク質ＶＰ３とを含む。

好ましくは、合理的ポリプロイドビリオンのそのような集団は、実質的に均一である。一部の実施形態では、本発明の合理的ポリプロイドビリオンは、ＶＰ２カプシドタンパク質を含み得、前記ＶＰ２カプシドタンパク質は、任意の血清型からのものであるか、もしくはそのキメラＶＰ２タンパク質であり、またはＶＰ２カプシドタンパク質は、ＶＰ３が由来する血清型と同じである任意の血清型からのものであり、または代替的に、ＶＰ２カプシドタンパク質は、ＶＰ３が由来する血清型とは異なる血清型からのものである。

一部の実施形態では、ＡＡＶ８血清型からのＶＰ１と、少なくとも１つのＶＰ３カプシドタンパク質とを含有する、本明細書で開示される合理的ポリプロイドビリオンであって、ＶＰ３が、ＡＡＶ８からのものではなく、ＢＢＢを横断する任意の血清型から選択される、および／または非ヒト霊長類ＡＡＶ血清型である、合理的ポリプロイドビリオンが、産生される。
Ｉ．定義

以下の用語が、本明細書の説明および添付の特許請求の範囲において使用される：

単数形「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」および「ｔｈｅ（その）」は、文脈による別段の明確な指示がない限り、複数形も含むように意図されている。

さらに、用語「約」は、測定可能な値、例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の長さの量、用量、時間、温度などへの言及の際に本明細書で使用される場合、指定量の±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％、またはさらには±０．１％の変動量を包含するように意図されている。

また、本明細書で使用される場合、「および／または」は、付随する記載事項の１つまたは複数についての任意のおよび全ての可能な組合せはもちろん、選択的に（「または」と）解釈されるときには組合せの欠如も指し、それらを包含する。

本明細書で使用される場合、移行句「から本質的になる」は、請求項の範囲を、特許請求の範囲で述べられている指定材料またはステップ、ならびに請求項に記載の発明の、「基本および新規特徴に実質的に影響を与えないもの」を包含するように解釈すべきであることを意味する。In re Herz, 537 F.2d 549, 551-52, 190 USPQ 461,463 (CCPA 1976)（強調は原文通り）を参照されたい。MPEP § 2111.03も参照されたい。したがって、用語「から本質的になる」は、本発明の特許請求の範囲で使用される場合、「含む」と同等であると解釈されるように意図されたものではない。文脈による別段の指示がない限り、本明細書に記載される本発明の様々な特徴が任意の組合せで使用され得ることが、特に意図されている。

さらに、本発明は、本発明の一部の実施形態では、本明細書で示される任意の特徴または特徴の組合せが除外または削除され得ることも企図している。

さらに説明すると、例えば、本明細書が、特定のアミノ酸がＡ、Ｇ、Ｉ、Ｌおよび／またはＶから選択され得ることを示す場合、この言い回しは、アミノ酸が、これらのアミノ酸の任意のサブセット、例えば、Ａ、Ｇ、ＩまたはＬ；Ａ、Ｇ、ＩまたはＶ；ＡまたはＧ；Ｌのみなどから、それぞれのそのような部分的組合せが本明細書に明示的に示されている場合と同様に、選択され得ることも示す。さらに、そのような言い回しは、指定アミノ酸の１つまたは複数が（例えば、否定的但し書きにより）権利放棄され得ることも示す。例えば、特定の実施形態では、アミノ酸は、各々のそのような可能な権利放棄が本明細書に明示的に示されている場合と同様に、ＡでもＧでもＩでもない；Ａではない；ＧでもＶでもない、など。

本明細書で使用される場合、用語「低減する（ｒｅｄｕｃｅ）」、「低減する（ｒｅｄｕｃｅｓ）」、「低減」および同様の用語は、少なくとも約２５％、３５％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％の、またはそれより大きい減少を意味する。本明細書で使用される場合、用語「増強する（ｅｎｈａｎｃｅ）」、「増強する（ｅｎｈａｎｃｅｓ）」、「増強」および同様の用語は、少なくとも約２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％の、またはそれより大きい増大を示す。血液脳関門を越える本発明の合理的ポリプロイドビリオンの形質導入能力の増強は、血液脳関門を横断する能力を欠いているＡＡＶビリオンと比べてである。血液脳関門を越える合理的ポリプロイドビリオンの形質導入能力の増強は、血液脳関門を横断する能力を欠いているＡＡＶビリオンのものと比較して、少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％、もしくは１００％大きいか、または少なくとも１．２倍、もしくは少なくとも１．５倍、もしくは少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍であり、もしくはそれより大きい。血液脳関門を横断する能力を欠いているＡＡＶ血清型の非限定的な例としては、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８が挙げられる。一実施形態では、集団は、血液脳関門を効率的に横断しないＡＡＶ血清型、例えばＡＡＶ８、ＡＡＶ２またはＡＡＶ５、と比べて脳血液関門（ＢＢＢ）を越える形質導入活性の増強を示す。一実施形態では、集団は、ＡＡＶ８と比べて、血液脳関門（ＢＢＢ）を越える形質導入活性の増強を示す。一実施形態では、集団は、ＡＡＶ２と比べて、血液脳関門（ＢＢＢ）を越える形質導入活性の増強を示す。別の実施形態では、集団は、ＡＡＶ５と比べて、血液脳関門（ＢＢＢ）を越える形質導入活性の増強を示す。一部の実施形態では、合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団は、ＡＡＶ８と比べて、脳および脊髄における生体内分布の向上を有する。用語「パルボウイルス」は、本明細書で使用される場合、自己複製パルボウイルスおよびディペンドウイルスを含む、パルボウイルス科を包含する。自律的なパルボウイルスには、Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ、Ｅｒｙｔｈｒｏｖｉｒｕｓ、Ｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ、ＩｔｅｒａｖｉｒｕｓおよびＣｏｎｔｒａｖｉｒｕｓ属のメンバーが含まれる。例示的な自律的なパルボウイルスとしては、マウス微小ウイルス、ウシパルボウイルス、イヌパルボウイルス、ニワトリパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコパルボウイルス、ガチョウパルボウイルス、Ｈ１パルボウイルス、バリケンパルボウイルス、Ｂ１９ウイルス、および現在公知のまたは後に発見される任意の他の自律的なパルボウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。他の自律的なパルボウイルスは、当業者に公知である。例えば、BERNARD N. FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)を参照されたい。

本明細書で使用される場合、用語「アデノ随伴ウイルス」（ＡＡＶ）は、これらに限定されないが、ＡＡＶ１型、ＡＡＶ２型、ＡＡＶ３型（３Ａおよび３Ｂ型を含む）、ＡＡＶ４型、ＡＡＶ５型、ＡＡＶ６型、ＡＡＶ７型、ＡＡＶ８型、ＡＡＶ９型、ＡＡＶ１０型、ＡＡＶ１１型、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、および現在公知のまたは後に発見される任意の他のＡＡＶを含む。例えば、BERNARD N. FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)を参照されたい。いくつかの比較的新しいＡＡＶ血清型およびクレードが同定されている（例えば、Gao et al., (2004) 1 Virology 78:6381-6388；Moris et al., (2004) Virology 33-375-383；および表３を参照されたい）。

ＡＡＶおよび自律的パルボウイルスの様々な血清型のゲノム配列、ならびにネイティブ末端リピート（ＴＲ）、Ｒｅｐタンパク質、およびカプシドサブユニットの配列は、当技術分野において公知である。そのような配列は、文献において、またはＧｅｎＢａｎｋなどの公開データベースにおいて見つけることができる。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２０７７、ＮＣ＿００１４０１、ＮＣ＿００１７２９、ＮＣ＿００１８６３、ＮＣ＿００１８２９、ＮＣ＿００１８６２、ＮＣ＿０００８８３、ＮＣ＿００１７０１、ＮＣ＿００１５１０、ＮＣ＿００６１５２、ＮＣ＿００６２６１、ＡＦ０６３４９７、Ｕ８９７９０、ＡＦ０４３３０３、ＡＦ０２８７０５、ＡＦ０２８７０４、Ｊ０２２７５、Ｊ０１９０１、Ｊ０２２７５、Ｘ０１４５７、ＡＦ２８８０６１、ＡＨ００９９６２、ＡＹ０２８２２６、ＡＹ０２８２２３、ＮＣ＿００１３５８、ＮＣ００１５４０、ＡＦ５１３８５１、ＡＦ５１３８５２、ＡＹ５３０５７９を参照されたく、これらの開示は、パルボウイルスおよびＡＡＶの核酸およびアミノ酸配列の教示について参照により本明細書に組み込まれる。例えば、Srivistava et al., (1983) J. Virology 45:555；Chiarini et al., (1998) J. Virology 71:6823；Chiarini et al., (1999) J. Virology 73:1309；Bantel-Schaal et al., (1999) J. Virology 73:939；Xiao et al., (1999) J. Virology 73:3994；Muramatsu et al., (1996) Virology 221:208；Shade et al., (1986) J. Virol. 58:921；Gao et al., (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99:11854；Moris et al., (2004) Virology 33-:375-383；国際特許公開ＷＯ００／２８０６１、同ＷＯ９９／６１６０１、同ＷＯ９８／１１２４４；および米国特許第６，１５６，３０３号も参照されたく、これらの参考文献の開示は、パルボウイルスおよびＡＡＶの核酸およびアミノ酸配列の教示について参照により本明細書に組み込まれる。表１も参照されたい。

自律的なパルボウイルスおよびＡＡＶのカプシド構造は、より詳細に、BERNARD N. FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, chapters 69 & 70 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)に記載されている。ＡＡＶ２（Xie et al., (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. 99:10405-10）、ＡＡＶ４（Padron et al., (2005) J. Virol. 79: 5047-58）、ＡＡＶ５（Walters et al., (2004) J. Virol. 78: 3361-71）およびＣＰＶ（Xie et al., (1996) J. Mol. Biol. 6:497-520およびTsao et al., (1991) Science 251: 1456-64）の結晶構造の説明も参照されたい。

用語「トロピズム」は、本明細書で使用される場合、ある特定の細胞または組織へのウイルスの優先的侵入を指し、必要に応じて、この侵入に続いて、細胞においてウイルスゲノムにより運ばれた配列の発現（例えば、転写、および必要に応じて翻訳）、例えば、組換えウイルスの場合は目的の異種核酸の発現が生じる。

本明細書で使用される場合、「全身性トロピズム」および「全身性形質導入」（および同義語）は、本発明のウイルスカプシドまたはウイルスベクターが、全身（例えば、脳、肺、骨格筋、心臓、肝臓、腎臓および／または膵臓）の組織に対するトロピズムを示すことおよび／または組織に形質導入することを示す。本発明の実施形態では、中枢神経系（例えば、脳、神経細胞など）への全身性形質導入が観察される。

本明細書で使用される場合、「選択的トロピズム」または「特異的トロピズム」は、ある特定の標的細胞および／またはある特定の組織への、ウイルスベクターの送達および／または特異的形質導入を意味する。

別段の指示がない限り、「効率的形質導入」または「効率的トロピズム」または同様の用語は、好適な対照を参照することにより決定され得る（例えば、対照の形質導入またはトロピズムそれぞれの少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、５００％、またはそれより高い％）。一部の実施形態では、ＡＡＶビリオンが「血液脳関門を効率的に横断する」ことができるかどうかを決定するための参照として役立つ対照は、脳血液関門を横断する能力を欠いているＡＡＶビリオンである。特定の実施形態では、本明細書に記載される合理的ポリプロイドウイルスベクターは、神経細胞および非神経細胞を含む、ＣＮＳもしくは末梢神経系（ＰＮＳ）に効率的に形質導入するか、または前記ＣＮＳもしくはＰＮＳに対する効率的トロピズムを有する。好適な対照は、所望のトロピズムおよび／または形質導入プロファイルをはじめとする様々な因子に依存することになる。当業者は、本明細書で開示される合理的ポリプロイドＡＡＶベクターが、同じ条件下でＡＡＶ２よりも良好に血液脳関門を効率的に横断することができるかどうかを、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるMolecular Therapy vol. 19 no. 8 aug. 2011に記載されているように、ＣＮＳ領域、例えば脳領域を越える形質導入のモニタリングにより決定することができる。モニタリングは、当業者に公知の任意の方法により行うことができ、動物モデルの、脳および脊髄組織のＲＴ－ＰＣＲ解析、脳および脊髄組織のウェスタンブロット、または脳および脊髄組織の免疫組織化学的検査、ならびに動物モデルにおけるルシフェラーゼを発現する合理的ポリプロイドの生物発光のｉｎｖｉｖｏ解析を含む。血液脳関門を効率的に横断する血清型は、脳血液関門を横断し、ＣＮＳ領域、例えば脳領域、に形質導入する上でＡＡＶ６よりも良好であることが好ましい。一実施形態では、集団は、ＡＡＶ５よりも良好に、血液脳関門を横断し、ＣＮＳ領域に形質導入することができる。一部の実施形態では、集団は、血液脳関門を効率的に横断する能力を欠いている非ハプロイドＡＡＶ粒子であるＡＡＶ８と比べて、対象の皮質、線条体、視床、髄質、海馬、小脳および脊髄のうちの１つまたは複数への増強された形質導入を示す。一部の実施形態では、合理的ポリプロイド集団は、静脈内注射、またはくも膜下腔内注射、または脳内の血管内注射により、対象に投与される。ＣＮＳまたは脳領域に形質導入する本明細書で開示される合理的ポリプロイドビリオンの増強された形質導入能力は、同じ条件下で、ＡＡＶ２またはＡＡＶ５ビリオンのものと比較して、少なくとも２０％大きい、もしくは３０％大きい、もしくは４０％大きい、もしくは５０％大きい、６０％大きい、７０％大きい、８０％大きい、９０％大きい、もしくは９５％大きい、もしくは１００％大きいか、または少なくとも１．２倍、もしくは少なくとも１．５倍、もしくは少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍であり、もしくはそれより大きい。

同様に、ウイルスが、標的組織に、「効率的に形質導入しない」かどうか、もしくは標的組織に対して、「効率的トロピズムを有さない」かどうか、または類似の表現の通りであるかどうかを、好適な対照を参照することにより決定することができる。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、肝臓、腎臓、生殖腺および／または胚細胞に効率的に形質導入しない（すなわち、それらに対して効率的トロピズムを有さない）。特定の実施形態では、組織（例えば、肝臓）への形質導入（例えば、望ましくない形質導入）は、所望の標的組織（例えば、骨格筋、横隔膜筋、心筋、および／または中枢神経系の細胞）への形質導入レベルの２０％もしくはそれ未満、１０％もしくはそれ未満、５％もしくはそれ未満、１％もしくはそれ未満、０．１％もしくはそれ未満である。

本発明の一部の実施形態では、本発明のカプシドを含むＡＡＶ粒子は、ある特定の組織／細胞への効率的な形質導入、およびある特定の組織／細胞への形質導入、望ましくない形質導入、の非常に低いレベル（例えば、低減された形質導入）という、複数の表現型を実証することができる。

本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、別段の指示がない限り、ペプチドとタンパク質の両方を包含する。

「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド塩基の配列であり、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド配列（天然に存在するヌクレオチドと天然に存在しないヌクレオチドの両方を含む）であり得るが、代表的な実施形態では、一本鎖ＤＮＡ配列または二本鎖ＤＮＡ配列のどちらかである。

本明細書で使用される場合、「単離された」ポリヌクレオチド（例えば、「単離されたＤＮＡ」または「単離されたＲＮＡ」）は、そのポリヌクレオチドと会合した状態で一般に見いだされる、天然に存在する生物またはウイルスの他の成分、例えば、細胞もしくはウイルス構造成分または他のポリペプチドもしくは核酸、の少なくとも一部から少なくとも部分的に分離されたポリヌクレオチドを意味する。代表的な実施形態では、「単離された」ヌクレオチドは、出発材料と比較して少なくとも約１０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍またはそれより高度にエンリッチされている。

同様に、「単離された」ポリペプチドは、ポリペプチドと会合した状態で一般に見いだされる、天然に存在する生物またはウイルスの他の成分、例えば、細胞もしくはウイルス構造成分または他のポリペプチドもしくは核酸、の少なくとも一部から少なくとも部分的に分離されているポリペプチドを意味する。代表的な実施形態では、「単離された」ポリペプチドは、出発材料と比較して少なくとも約１０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍またはそれより高度にエンリッチされている。

「単離された細胞」は、それがその天然の状態で通常は会合している他の成分から分離されている細胞を指す。例えば、単離された細胞は、培養培地中の細胞、および／または本発明の薬学的に許容される担体中の細胞であり得る。したがって、単離された細胞を対象に送達および／または導入することができる。一部の実施形態では、単離された細胞は、対象から除去され、ｅｘｖｉｖｏで本明細書に記載の通りにマニピュレートされ、その後、対象に戻される、細胞であり得る。

ビリオンの集団は、本明細書に記載される方法のいずれかにより生成され得る。一実施形態では、集団は、少なくとも１０^１個のビリオンである。一実施形態では、集団は、少なくとも１０^２個のビリオン、少なくとも１０^３個のビリオン、少なくとも１０^４個のビリオン、少なくとも１０^５個のビリオン、少なくとも１０^６個のビリオン、少なくとも１０^７個のビリオン、少なくとも１０^８個のビリオン、少なくとも１０^９個のビリオン、少なくとも１０^１０個のビリオン、少なくとも１０^１１個のビリオン、少なくとも１０^１２個のビリオン、少なくとも１０^１３個のビリオン、少なくとも１０^１４個のビリオン、少なくとも１０^１５個のビリオン、少なくとも１０^１６個のビリオン、または少なくとも１０^１７個のビリオンである。ビリオンの集団は、不均一であることもあり、または均一（例えば、実質的に均一もしくは完全に均一）であることもある。

「実質的に均一な集団」は、この用語が本明細書で使用される場合、集団内に夾雑物ビリオン（同一でないもの）がほとんど～全くない、ほぼ同一であるビリオンの集団を指す。実質的に均一な集団は、同一のビリオン（例えば、所望のビリオン）の少なくとも９０％であり、同一のビリオンの少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％であることもある。

完全に均一であるビリオンの集団は、同一のビリオンのみを含有する。

本明細書で使用される場合、ウイルスベクターまたはウイルス粒子またはウイルス粒子の集団を「単離する」または「精製する」（または文法的等価表現）とは、ウイルスベクターまたはウイルス粒子またはウイルス粒子の集団が、出発材料中の他の成分の少なくとも一部から少なくとも部分的に分離されていることを意味する。代表的な実施形態では、「単離された」または「精製された」ウイルスベクターまたはウイルス粒子またはウイルス粒子の集団は、出発材料と比較して少なくとも約１０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍またはそれより高度にエンリッチされている。

「治療用ポリペプチド」は、細胞もしくは対象におけるタンパク質の非存在もしくは欠損の結果として生じる症状を緩和、低減、予防、遅延および／もしくは安定化することができるポリペプチドであり、ならびに／または別様に対象に恩恵、例えば、抗がん効果、もしくは移植片の生存性の向上、もしくは免疫応答の誘導、をもたらすポリペプチドである。

用語「処置する」、「処置すること」、または「の処置」（およびこれらの文法的変化形）とは、対象の状態の重症度を低下させる、少なくとも部分的に改善もしくは安定化すること、および／または少なくとも１つの臨床症状の何らかの緩和、軽減、減少もしくは安定化を達成すること、および／または疾患もしくは障害の進行の遅延があることを意味する。

用語「予防する」、「予防すること」、および「予防」（およびこれらの文法的変化形）は、本発明の方法の非存在下で起こるものと比べて、対象における疾患、障害および／もしくは臨床症状の発症の予防および／もしくは遅延、ならびに／または疾患、障害および／もしくは臨床症状の発症の重症度の低下を指す。予防は、完全な予防、例えば、疾患、障害および／または臨床症状の全くの非存在、であることがある。予防は、対象における疾患、障害、および／もしくは臨床症状の出現、ならびに／または発症の重症度が、本発明の非存在下で起こるものに実質的に満たないような、部分的な予防であることもある。

「処置有効」量は、本明細書で使用される場合、対象に何らかの改善または恩恵をもたらすのに十分である量である。別の言い方をすれば、「処置有効」量は、対象における少なくとも１つの臨床症状の何らかの緩和、軽減、減少または安定化をもたらすことになる量である。何らかの恩恵が対象に提供されるのであれば、治療効果が完全である必要も、治癒的である必要もないことが、当業者には理解されるであろう。

「予防有効」量は、本明細書で使用される場合、本発明の方法の非存在下で起こるものと比べて、対象における疾患、障害、および／もしくは臨床症状の発症を予防するおよび／もしくは遅延させるのに、ならびに／または対象における疾患、障害、および／もしくは臨床症状の発症の重症度を低下および／もしくは遅延させるのに、十分である量である。何らかの予防的恩恵が対象に提供されるのであれば、予防レベルが完全である必要がないことが、当業者には理解されるであろう。

用語「異種ヌクレオチド配列」および「異種核酸分子」は、本明細書では交換可能に使用され、ウイルスに天然に存在しない核酸配列を指す。一般に、異種核酸分子または異種ヌクレオチド配列は、目的の（例えば、細胞および／または対象への送達のための）ポリペプチドおよび／または非翻訳ＲＮＡをコードするオープンリーディングフレームを含む。

本明細書で使用される場合、用語「ウイルスベクター」、「ベクター」、または「遺伝子送達ベクター」は、核酸送達ビヒクルとして機能し、ビリオン内にパッケージングされたベクターゲノム（例えば、ウイルスＤＮＡ［ｖＤＮＡ］）を含む、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）粒子を指す。あるいは、一部の文脈では、用語「ベクター」は、単独でのベクターゲノム／ｖＤＮＡを指すために使用され得る。

「ｒＡＡＶベクターゲノム」または「ｒＡＡＶゲノム」は、１つまたは複数の異種核酸配列を含むＡＡＶゲノム（すなわち、ｖＤＮＡ）である。ｒＡＡＶベクターは、一般に、ウイルスを生成するためにシスでの末端リピート（ＴＲ）のみを必要とする。全ての他のウイルス配列は、重要でなく、トランスで供給されることもある（Muzyczka, (1992) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 158:97）。典型的には、ｒＡＡＶベクターゲノムは、ベクターによって効率的にパッケージングされ得る導入遺伝子のサイズを最大にするために１つまたは複数のＴＲ配列のみを保持することになる。構造および非構造タンパク質コード配列は、トランスで（例えば、プラスミドなどのベクターから、または配列をパッケージング細胞に安定的に組み込むことにより）提供されることもある。本発明の実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムは、少なくとも１つのＴＲ配列（例えば、ＡＡＶＴＲ配列）を含み、必要に応じて、２つのＴＲ（例えば、２つのＡＡＶＴＲ）を含み、これら２つのＴＲは、典型的には、ベクターゲノムの５’および３’末端にあり、異種核酸に隣接しているであろうが、異種核酸と連続している必要はない。ＴＲは、互いに同じであることもあり、または異なることもある。

用語「末端リピート」または「ＴＲ」は、ヘアピン構造を形成し、逆方向末端リピートとして機能する（すなわち、所望の機能、例えば、複製、ウイルスパッケージング、組込み、および／またはプロウイルスレスキューなど、を媒介する）、任意のウイルス末端反復または合成配列を含む。ＴＲは、ＡＡＶＴＲであることもあり、または非ＡＡＶＴＲであることもある。例えば、非ＡＡＶＴＲ配列、例えば、他のパルボウイルス（例えば、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、マウスパルボウイルス（ＭＶＭ）、ヒトパルボウイルスＢ－１９）のもの、または任意の他の好適なウイルス配列（例えば、ＳＶ４０複製起点としての機能を果たすＳＶ４０ヘアピン）を、ＴＲとして使用することができ、それを、短縮化、置換、欠失、挿入および／または付加によってさらに改変することができる。さらに、ＴＲは、部分的にまたは完全に合成のもの、例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉらの米国特許第５，４７８，７４５号に記載されているような「二重Ｄ配列」であることもある。

「ＡＡＶ末端リピート」または「ＡＡＶＴＲ」は、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２、または現在公知のもしくは後に発見される任意の他のＡＡＶを含むがこれらに限定されない、任意のＡＡＶからのものであり得る（例えば、表１を参照されたい）。ＡＡＶ末端リピートは、その末端リピートが、所望の機能、例えば、複製、ウイルスパッケージング、組込み、および／またはプロウイルスレスキューなど、を媒介するのであれば、ネイティブ末端反復配列を有する必要はない（例えば、ネイティブＡＡＶＴＲ配列が、挿入、欠失、短縮および／またはミスセンス変異によって変更されていてもよい）。ＡＡＶタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３は、互いに相互作用して正十二面体対称性のＡＡＶカプシドを形成する、カプシドタンパク質である。ＶＰ１．５は、米国特許出願公開第２０１４／００３７５８５号に記載されているＡＡＶカプシドタンパク質である。本発明において、一部の実施形態では、ＡＡＶＩＴＲは、１４５ｂｐである。一部の実施形態では、ＡＡＶＩＴＲは、１４５ｂｐより小さい。一部の実施形態では、ＡＡＶＩＴＲは、１３０ｂｐである。

本発明のウイルスベクターは、さらに、国際特許公開ＷＯ００／２８００４およびChao et al., (2000) Molecular Therapy 2:619に記載されているような「標的化」ウイルスベクター（例えば、方向付けられたトロピズムを有する）および／または「ハイブリッド」パルボウイルス（すなわち、ウイルスＴＲおよびウイルスカプシドが異なるパルボウイルスからのものである）であり得る。

本発明のウイルスベクターは、さらに、国際特許公開ＷＯ０１／９２５５１（この開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているような二重鎖パルボウイルス粒子であり得る。したがって、一部の実施形態では、二本鎖（二重鎖）ゲノムが、本発明のウイルスカプシドにパッケージングされ得る。

さらに、ウイルスカプシドまたはゲノムエレメントは、挿入、欠失および／または置換をはじめとする他の改変を含有し得る。

「キメラ」ウイルス構造タンパク質は、本明細書で使用される場合、野生型と比べてカプシドタンパク質のアミノ酸配列内の１個または複数個（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個など）のアミノ酸残基の置換、ならびに野生型と比べてアミノ酸配列内の１個または複数個（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個など）のアミノ酸残基の挿入および／または欠失によって改変されている、ＡＡＶウイルス構造タンパク質（カプシド）を意味する。一部の実施形態では、１つのＡＡＶ血清型からの完全なまたは部分的なドメイン、機能的領域、エピトープなどが、任意の組合せで、異なるＡＡＶ血清型の対応する野生型ドメイン、機能的領域、エピトープなどに置き換わって、本発明のキメラカプシドタンパク質を産生し得る。他の実施形態では、置換は、全て同じ血清型からのものである。他の実施形態では、置換は、全てＡＡＶからのまたは合成のものである。当技術分野において周知のプロトコールに従ってキメラカプシドタンパク質の産生を行うことができ、多数のキメラカプシドタンパク質が本明細書ばかりでなく文献にも記載されており、それらは本発明のカプシドに含めることができる。一部の実施形態では、合理的ポリプロイドは、少なくとも１つのキメラウイルス構造タンパク質を含む。この態様では、ウイルス構造タンパク質は、１つのＡＡＶ血清型のＮ末端および別のＡＡＶ血清型のＣ末端により生成される。一部の実施形態では、合理的ポリプロイドは、キメラウイルス構造タンパク質を含まない。

「改変」ウイルス構造タンパク質は、非カプシドタンパク質もしくは改変を含む、または化学的に改変されたウイルス構造タンパク質、例えば、天然に存在しないもしくは合成アミノ酸の付加、または天然に存在しないアミノ酸でのアミノ酸の置換、ならびにＡＡＶカプシドタンパク質の１個もしくは複数個の既存のアミノ酸への化学的改変である構造カプシドタンパク質であり得る。カプシドタンパク質への表面改変は、米国特許第１０，２９４，２８１号、同第９，４０９，９５３号、および米国特許出願公開第２０１８／０１０５５５９号において開示されており、この参考特許文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、表面改変は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０２００２８７５１、特にＷＯ２０２００２８７５１の表２、において開示されているような、ＣＮＳを標的とする標的化タンパク質を含み得る。ある特定の実施形態では、合理的操作および／または変異方法は、改変に、および／または標的組織（例えば、ＣＮＳまたはＰＮＳ）への増強された形質導入を示す標的化ペプチドに、使用される。本明細書で開示される合理的ポリプロイドベクターの１つまたは複数のカプシドタンパク質の使用および改変のための標的化ペプチドは、当技術分野において公知の任意の方法により、例えば、Deverman et al., (Nature Biotechnology 34(2):204-209 (2016))にならびに国際特許出願公開番号ＷＯ２０１５０３８９５８および同Ｗ０２０１７１００６７１に記載されているようなＣＲＥＡＴＥシステムを使用して、同定および／または設計することができ、これらの参考文献は、それらの全体が本明細書に組み込まれる。

代替実施形態では、ビリオン粒子を構築することができ、この場合、ＡＡＶカプシドタンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３、からなる群から選択される少なくとも１つのウイルスタンパク質は、ＡＡＶゲノムをカプシド内封入することができるビリオン粒子を形成するために必要とされる他のウイルスタンパク質のうちの少なくとも１つとは異なる。存在するウイルスタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３）各々について、タンパク質は、同じタイプ（例えば、全てＡＡＶ２ＶＰ１）である。１つの例では、ウイルスタンパク質のうちの少なくとも１つは、キメラウイルスタンパク質であり、他の２つのウイルスタンパク質の少なくとも一方は、キメラのものではない。一実施形態では、ＶＰ１およびＶＰ２は、キメラのものであり、ＶＰ３のみが、非キメラのものである。例えば、ＡＡＶ２からのＶＰ３のみと対にされた、キメラＡＡＶ２／８（ＡＡＶ２のＮ末端およびＡＡＶ８のＣ末端）からのＶＰ１／ＶＰ２；またはＡＡＶ２のＶＰ３のみと対にされたキメラＶＰ１／ＶＰ２２８ｍ－２Ｐ３（ＶＰ３スタートコドンの変異を伴わない、ＡＡＶ８からのＮ末端およびＡＡＶ２からのＣ末端）のみ、で構成されているウイルス粒子のみ。別の実施形態では、ＶＰ３のみがキメラのものであり、ＶＰ１およびＶＰ２は、非キメラのものである。別の実施形態では、ウイルスタンパク質のうちの少なくとも１つは、完全に異なる血清型からのものである。例えば、ＡＡＶ３のみからのＶＰ３と対にされたキメラＶＰ１／ＶＰ２２８ｍ－２Ｐ３のみ。別の例では、キメラのものは存在しない。

本明細書で使用される場合、用語「アミノ酸」は、任意の天然に存在するアミノ酸、その改変形態、および合成アミノ酸を包含する。天然に存在する左旋性（Ｌ－）アミノ酸は、表１０で示される。

あるいは、アミノ酸は、改変アミノ酸残基であり得（非限定的な例は、表１２で示される）、および／または翻訳後改変（例えば、アセチル化、アミド化、ホルミル化、ヒドロキシ化、メチル化、リン酸化または硫酸化）により改変されているアミノ酸であり得る。

さらに、天然に存在しないアミノ酸は、Wang et al., Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35:225-49 (2006)により記載されているような「非天然」アミノ酸であり得る。これらの非天然アミノ酸は、目的の分子をＡＡＶカプシドタンパク質に化学的に連結させるために有利に使用され得る。

本明細書で使用される場合、用語「相同組換え」は、ヌクレオチド配列がＤＮＡの２つの類似のまたは同一の分子間で交換される遺伝子組換えの一種を意味する。相同組換えは、ＤＮＡ配列の新しい組合せも生じさせる。ＤＮＡのこれらの新しい組合せは、遺伝的多様性を意味する。相同組換えは、ウイルスの異なる株および種間で遺伝物質を交換するための遺伝子水平伝播にも使用される。

宿主へのウイルスの感染は、宿主の免疫防御システムを刺激して、感染した宿主をウイルスから守ることができる。宿主が異物の攻撃から自らを防御するために活性化する免疫応答の１つは液性免疫応答であり、この応答によって抗体媒介免疫が生じる。

本明細書で使用される場合、用語「液性免疫」は、分泌抗体、補体タンパク質およびある特定の抗菌ペプチドなどの、細胞外液に見られる高分子により媒介される（細胞性免疫とは対照的に）、抗体媒介ベータ細胞免疫系を指す。特に、それは、宿主の抗体媒介免疫応答を指す。

本明細書で使用される場合、「抗原性の」または「抗原性」は、「免疫原性」と交換可能に使用され、特異的免疫応答を誘導する物質、例えば合理的ポリプロイドビリオン、の能力を指す。それは、物質が免疫応答を刺激することができる程度、例えば、抗体にまたはＴ細胞受容体にまたはＢ細胞に結合することができる物質の能力も指す。

本明細書で使用される場合、用語「中和抗体」は、「Ｎａｂ」と交換可能に使用され、ウイルス機能にとって極めて重要なエピトープに特異的に結合し、ウイルスの感染力に干渉する、例えば、宿主細胞へのＡＡＶビリオン侵入を遮断する抗体を指す。この定義に包含される中和抗体（ＮＡｂ）は、抗原または感染性因子が生物学的に発揮するあらゆる効果を阻害または中和することにより、それらの抗原または感染性因子から細胞を防御する抗体を指す。一般に、抗体は、抗原に結合し、この抗原が標的とした（フラグを立てた）白血球にシグナルを伝達する。フラグを立てられた抗原は、プロセシングされ、その結果として破壊されるが、中和抗体は、抗原自体の生物学的効果を中和する。ＮＡｂは、ウイルスの複数の血清型に作用する広域中和抗体（ｂＮＡｂ）であることもあり、または１つの血清型を特異的に認識する特異的ＮＡｂであることもある。

ウイルスの、特に、ＡＡＶカプシドおよびＡＡＶ血清型の「中和」は、本明細書では、ウイルス血清型への中和化合物（例えば、抗体）の結合、および／または細胞表面の結合、およびＡＡＶとの相互作用の防止による、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏでのウイルス感染力の抑止と定義される。本発明に関して、この定義は、（宿主）細胞表面のウイルスの受容体に結合する中和抗体による感染の遮断を含まない。

一部の例では、中和能は、レポーター遺伝子産物（例えば、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ）の活性を測定することにより決定される。特異的ＡＡＶ血清型に対する抗体の中和能は、少なくとも５０％、例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも９９％であり得る。

本明細書で使用される場合、「血液脳関門」または「ＢＢＢ」は、循環血中の溶質が非選択的に横断して、ニューロンが存在する中枢神経系の細胞外液に入ることを防止する、内皮細胞の高選択的な半透過性の境界を指す。血液脳関門は、毛細血管壁の内皮細胞、毛細血管を鞘で覆う星状膠細胞足突起、および毛細血管基底膜に埋め込まれた周皮細胞により形成される。この系は、受動拡散により一部の分子の通過を可能にし、神経機能にとって極めて重要である様々な栄養素、イオン、有機アニオンならびに高分子、例えばグルコース、水およびアミノ酸、の選択的な能動輸送も可能にする。

本明細書で使用される場合、「脳血管」または「ＢＢＶ」は、脳循環の一部であり、ＢＢＢ機能を有する、脳内の血管および毛細血管を指す。

本明細書で使用される場合、句「ＢＢＢの細胞」は、ＢＢＢの一部であるかまたはその成分である任意の細胞を指し、ＢＢＢの毛細血管壁の内皮細胞、毛細血管を鞘で覆う星状膠細胞足突起、および毛細血管基底膜に埋め込まれた周皮細胞を含む。

本明細書で使用される場合、句「ＢＢＢの内皮細胞」は、本明細書では「ＢＢＢＥＣ」または「ＢＢＢ内皮細胞」と交換可能に使用され、ＢＢＢの毛細血管壁の内皮細胞を指す。

本明細書で使用される場合、句「ＢＢＢを横断する細胞」は、インタクトなＢＢＢ、すなわち、漏出性でなく損なわれてもいないＢＢＢ、を横断することができる任意の細胞を指す。ＢＢＢを横断することができる細胞としては、血管周囲周皮細胞、マクロファージ、Ｔ細胞および単球が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、本明細書で使用される場合の「血液成分」は、血液中の細胞を指し、血小板（ｐｌａｔｅｌｅｔ）（血小板（ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｅ））、赤血球（ｒｅｄｂｌｏｏｄｃｅｌｌ）（ｒｂｃ）（赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ））、白血球を指し、白血球には、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球および好中球が含まれる。

本明細書で使用される場合、用語「遺伝子編集」、「ゲノム編集」または「ゲノム操作」は、操作されたヌクレアーゼ、または「分子バサミ」を使用して、生体のゲノムにおいてＤＮＡが挿入される、欠失される、または置き換えられる、遺伝子操作の一種を意味する。これらのヌクレアーゼは、ゲノム内の所望の位置において部位特異的二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じさせる。

本明細書で使用される場合、用語「遺伝子送達」は、外来ＤＮＡが遺伝子治療の適用のために宿主細胞に移入されるプロセスを意味する。

本明細書で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲ」は、クラスターを形成し規則正しい間隔を持つパリンドロームリピート（ＣｌｕｓｔｅｒｅｄＲｅｇｕｌａｒｌｙＩｎｔｅｒｓｐａｃｅｄＳｈｏｒｔＰａｌｉｎｄｒｏｍｉｃＲｅｐｅａｔｓ）を表し、これは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ゲノム編集技術の基礎をなす細菌の防御システムの顕著な特徴である。

本明細書で使用される場合、用語「ジンクフィンガー」は、折り畳み構造を安定化するための、１つまたは複数の亜鉛イオンの配位を特徴とする、低分子タンパク質構造モチーフを意味する。
ＩＩ．合理的ハプロイドまたはポリプロイドＡＡＶベクター全般

本明細書で使用される場合の合理的ポリプロイド、例えば、合理的ハプロイドは、少なくとも２つの異なるＡＡＶ血清型に由来するウイルス構造タンパク質ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３から形成されるビリオンであって、ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３の各々が、１つの親ＡＡＶ血清型のみからのものである、ビリオンを指す。非合理的ハプロイドは、キメラまたはモザイクハプロイドを指し得る。一実施形態では、親血清型のウイルス構造タンパク質は、改変ウイルス構造タンパク質であり得、またはキメラのものであり得る。一実施形態では、親血清型は、キメラ血清型ではない。一部の実施形態では、改変親ＡＡＶ血清型は、１個または複数個のアミノ酸の挿入、欠失または置換を含む。本発明の合理的ポリプロイドビリオン、例えば、合理的ハプロイドは、モザイクビリオンではない。

一部の実施形態では、本明細書で開示のＡＡＶハイブリッド粒子は、異なるｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏ応用に好適である様々な望ましい表現型を提示するように設計された、合成ＡＡＶハイブリッドウイルスベクターであり得る。したがって、一実施形態では、本発明は、ＡＡＶハイブリッド粒子またはビリオンを提供する。一実施形態では、本発明は、ＡＡＶハイブリッド粒子またはビリオンの実質的に純粋な集団を提供する。

本発明は、異なるｉｎｖｉｔｒｏ、ｉｎｖｉｖｏおよび臨床応用に好適である様々な望ましい表現型を提示する数々の合成ウイルスベクターを提供する。

特に、本発明は、ＢＢＢを効率的に横断する任意のＡＡＶ血清型のみからの少なくともＶＰ３カプシドタンパク質を、異なる血清型のみからのＶＰ１および／またはＶＰ２カプシドタンパク質（例えば、表１から選択されるＡＡＶ血清型からのＶＰ１および／またはＶＰ２カプシドタンパク質）と組み合わせることによって、個々のカプシド各々に複数の望ましい表現型を有する改善されたＡＡＶビリオンを生じさせることが可能になるという、予想外の発見に基づき、望ましい表現型には、これらに限定されないが、全身性送達の増加およびトロピズムの増大、ならびに異なる抗原性プロファイル、例えば、投与後にｉｎｖｉｖｏで中和抗体（Ｎａｂ）から逃れる能力などが含まれる。

一部の実施形態では、本明細書で開示される合理的ポリプロイドベクターは、ＢＢＢを横断する合理的ポリプロイドの能力に起因してＣＮＳおよび／またはＰＮＳにおける生体内分布を有する。一部の実施形態では、本明細書で開示される合理的ポリプロイドベクターは、脳血管（ＢＢＶ）および／または血液成分に形質導入する能力に起因してＣＮＳおよび／またはＰＮＳにおける生体内分布を有する。一部の実施形態では、本明細書で開示される合理的ポリプロイドベクターは、脳循環によって脳へのＡＡＶ形質導入細胞の送達を可能にする、脳血管（ＢＢＶ）および／または血液成分、例えば血液中の細胞、への形質導入により、ＣＮＳおよび／またはＰＮＳにおける生体内分布を有する。一部の実施形態では、本明細書で開示される合理的ポリプロイドベクターは、血管周囲周皮細胞およびマクロファージをはじめとする内皮細胞を横断する細胞、ならびに他の免疫細胞、例えばＴ細胞および血中単球、に形質導入することができる。つまり、一部の実施形態では、合理的ポリプロイドＡＡＶベクターは、間接的な経路によって脳における生体内分布を有する－本明細書で開示されるＡＡＶポリプロイドベクターは、脳に侵入する細胞に形質導入することによって、および／または脳内の内皮細胞を含む脳血管（ＢＢＶ）に形質導入することにより、間接的に脳に到達することができる。一部の実施形態では、本明細書で開示される合理的ポリプロイドベクターは、脳血管または他の臓器と接触している神経細胞および／または非神経細胞により、例えば、自律または末梢神経線維経由での末梢臓器からＣＮＳへの逆行性輸送によって、取り込まれ得る。一部の実施形態では、本発明の合理的ポリプロイドは、ＡＡＶ８のものと比較して脳微小血管内皮細胞（ＢＭＶＥＣ）への増強された結合を示す。一部の実施形態では、本発明の合理的ポリプロイドは、ＡＡＶ２のものと比較して脳微小血管内皮細胞（ＢＭＶＥＣ）への増強された結合を示す。ＢＭＶＥＣへの結合は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるMolecular Therapy, Methods & Clinical development, vol 20, March 2021に記載されている。一部の実施形態では、本発明の合理的ポリプロイドは、内皮関門、例えば血液脳関門、を越えて拡散またはトランスサイトーシスまたは往復することができ、ＡＡＶ２のものと比較して血液脳関門の完全性に影響を与えない。逆に、ＡＡＶ２は、エンドサイトーシスを受け、したがって、内皮関門を越えてほとんど拡散せずにＢＭＶＥＣに形質導入する。本発明の合理的ポリプロイドは、ＢＭＶＥＣのトランスサイトーシスに関与し、ＣＮＳ領域、例えば、脳実質細胞に形質導入する。初代ＢＭＶＥＣは、J Neurochem 2017 January 140(2), 216-230；およびJ Neurochem 2017, 140, 192-194に記載されているように、有効な内皮関門を作出し、ＡＡＶ血清型をトランスサイトーシス、エンドサイトーシスおよび形質導入について試験するためのヒトＢＢＢに関するモデルとして役立っており、これらの参考文献の両方は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

このようなハプロイドまたはポリプロイドビリオンは、カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３が少なくとも２つの異なる血清型に由来することを指すために、トリプロイドビリオンと呼ばれることもある。そのようなＡＡＶハプロイドビリオンを産生するための例示的な方法は、本明細書に記載される。ＶＰ１またはＶＰ２ＡＡＶ血清型からのＶＰ３の望ましくないオープンリーディングフレームの翻訳を防止することにより、これらの方法は、生成ビリオンの均一な集団の産生をもたらす。

組換えＡＡＶハプロイドビリオンの（例えば、実質的にまたは完全に）均一な集団を生成できることによって、望ましくない／夾雑ビリオンの特性（例えば、形質導入特異性または抗原性）のキャリーオーバーが劇的に低減または消失される。

一実施形態では、ＡＡＶゲノム（２つのＡＡＶＩＴＲ間に位置する異種遺伝子を含む）をカプシド内封入する本明細書に記載されるＡＡＶハプロイドビリオンは、ウイルス構造タンパク質のうちの２つ、ＶＰ１およびＶＰ３、のみで形成され得る。一実施形態では、そのようなＡＡＶハプロイドビリオンは、高次構造的に正しく、すなわち、Ｔ＝１の正二十面体対称性を有する。一実施形態では、本明細書に記載されるＡＡＶハプロイドビリオンは、感染性である。一実施形態では、本明細書に記載されるＡＡＶハプロイドビリオンは、ネイティブＡＡＶ血清型と比較して異なる生体内分布を有し、例えば、本明細書に記載されるＡＡＶハプロイドビリオンは、ネイティブＡＡＶ血清型と比較して全身性形質導入を有する。一実施形態では、本明細書に記載されるＡＡＶハプロイドビリオンは、ネイティブＡＡＶ血清型と比較して低減された抗原性プロファイルを有し、例えば、本明細書に記載されるＡＡＶハプロイドビリオンは、ネイティブＡＡＶ血清型と比較して、液性免疫応答を誘導する能力の低下、または中和抗体（Ｎａｂ）から逃避する能力の増大を有する。

ＡＡＶビリオンは、Ｔ＝１の正二十面体対称性を有し、３つの構造ウイルスタンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３、で構成されている。１：１：８～１０（それぞれ、ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）の比での３つのウイルスタンパク質の６０コピーがビリオンを形成する（Rayaprolu, V., et al., J. Virol. 87(24): 13150-13160 (2013)）。

一実施形態では、２つのＡＡＶＩＴＲ間に位置する異種遺伝子を含むＡＡＶゲノムをカプシド内封入するＡＡＶビリオンは、ウイルス構造タンパク質のうちの２つ、ＶＰ１およびＶＰ３、のみで形成され得る。一実施形態では、このビリオンは、高次構造的に正しく、すなわち、Ｔ＝１の正二十面体対称性を有する。一実施形態では、ビリオンは、感染性である。感染性ビリオンは、ＶＰ１／ＶＰ３またはＶＰ１／ＶＰ２／ＶＰ３を含む。典型的には、ＶＰ２／ＶＰ３のみまたはＶＰ３のみを含むビリオンは、感染性ではない。

一部の実施形態では、本明細書における技術は、１つまたは１つより多くの第１のＡＡＶ血清型からのものであるカプシドタンパク質ＶＰ１と、１つまたは１つより多くの第２のＡＡＶ血清型からのものであるカプシドタンパク質ＶＰ２とを含むＡＡＶカプシドであって、前記第１のＡＡＶ血清型の少なくとも１つが、いずれの組合せにおいても、前記第２のＡＡＶ血清型の少なくとも１つと異なり、ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３のうちの少なくとも１つが、アカゲザルＡＡＶ（ＡＡＶｒｈ）血清型からのものである、ＡＡＶカプシドも提供する。一部の実施形態では、いかなるキメラウイルス構造タンパク質もビリオン中に存在しない。

一部の実施形態では、本明細書で開示のＡＡＶハプロイド粒子は、カプシドタンパク質ＶＰ３を含むカプシドタンパク質であって、前記カプシドタンパク質ＶＰ３が、１つまたは１つより多くの第３のＡＡＶ血清型からのものであり、前記第３のＡＡＶ血清型が、ＢＢＢを横断するＡＡＶ血清型であり、前記１つまたは１つより多くの第３のＡＡＶ血清型の少なくとも１つが、いずれの組合せにおいても、前記第１のＡＡＶ血清型および／または前記第２の血清型とは異なり、第１または第２のＡＡＶ血清型が、両方ではないが、アカゲザルＡＡＶ（ＡＡＶｒｈ）血清型である、カプシドタンパク質を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＡＶカプシドは、カプシドタンパク質ＶＰ１．５を含み得る。

本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドを含むＡＡＶ粒子であって、カプシドが、１つまたは１つより多くの第１のＡＡＶ血清型（例えば、表１から選択される血清型）からのものであるカプシドタンパク質ＶＰ１と、１つまたは１つより多くの第２のＡＡＶ血清型からのものであるカプシドタンパク質ＶＰ１．５とを含み、前記第１のＡＡＶ血清型の少なくとも１つが、いずれの組合せにおいても、前記第２のＡＡＶ血清型の少なくとも１つと異なり、第１のＡＡＶ血清型または第２のＡＡＶ血清型が、両方ではないが、アカゲザルＡＡＶ（ＡＡＶｒｈ血清型）からのものである、ＡＡＶ粒子をさらに提供する。

一部の実施形態では、カプシドは、カプシドタンパク質ＶＰ３を含み、前記カプシドタンパク質ＶＰ３は、ＢＢＢを横断するＡＡＶ血清型である１つまたは１つより多くの第３のＡＡＶ血清型からのものであり、前記１つまたは１つより多くの第３のＡＡＶ血清型の少なくとも１つは、いずれの組合せにおいても、前記第１のＡＡＶ血清型および／または前記第２のＡＡＶ血清型とは異なり、第１のＡＡＶ血清型、第２のＡＡＶ血清型または第３のＡＡＶ血清型の少なくとも１つは、ＢＢＢを横断するＡＡＶ血清型、または一部の実施形態では、非ヒトＡＡＶ血清型、例えばアカゲザルＡＡＶ（ＡＡＶｒｈ）血清型、からのものであり、他の血清型は、表１から選択される任意のＡＡＶ血清型から選択される。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＡＶカプシドは、カプシドタンパク質ＶＰ１．５を含み得る。

一部の例では、ＶＰ３タンパク質は、ＢＢＢを横断するように化学的に改変されていることがあり、または代替的に、一部の実施形態では、ＢＢＢを横断するその能力を増大させるための標的ペプチドを含むことがある。本発明は、１つまたは１つより多くの第１のＡＡＶ血清型からのものであるカプシドタンパク質ＶＰ１と、１つまたは１つより多くの第２のＡＡＶ血清型からのものであるカプシドタンパク質ＶＰ１．５とを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドであって、前記第１のＡＡＶ血清型の少なくとも１つが、いずれの組合せにおいても、前記第２のＡＡＶ血清型の少なくとも１つと異なり、第１のＡＡＶ血清型または第２のＡＡＶ血清型が、両方ではないが、アカゲザルＡＡＶ（ＡＡＶｒｈ）血清型からのものであり、他の血清型が、表１から選択される任意のＡＡＶ血清型から選択される、ＡＡＶカプシドをさらに提供する。

一部の実施形態では、本発明のＡＡＶカプシドは、カプシドタンパク質ＶＰ３を含み、前記カプシドタンパク質ＶＰ３は、ＢＢＢを横断するＡＡＶ血清型である１つまたは１つより多くの第３のＡＡＶ血清型からのものであり、前記１つまたは１つより多くの第３のＡＡＶ血清型の少なくとも１つは、いずれの組合せにおいても、前記第１のＡＡＶ血清型および／または前記第２のＡＡＶ血清型とは異なり、第１のＡＡＶ血清型または第２のＡＡＶ血清型または第３のＡＡＶ血清型のうちの少なくとも１つは、ＢＢＢを横断するＡＡＶ血清型、および一部の実施形態では、非霊長類ＡＡＶ、例えばアカゲザルＡＡＶ（ＡＡＶｒｈ）、血清型からのものであり、他の血清型は、表１から選択される任意のＡＡＶ血清型から選択され得る。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＡＶカプシドタンパク質は、カプシドタンパク質ＶＰ２を含み得る。

一部の実施形態では、本明細書で開示される合理的ポリプロイドビリオンは、異なるｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏ応用に好適である様々な望ましい表現型を提示するように設計された、合成の合理的ポリプロイドＡＡＶウイルスベクターであり得る。したがって、一実施形態では、本発明は、合理的ポリプロイドＡＡＶウイルスベクターまたはビリオンを提供する。一実施形態では、本発明は、合理的ポリプロイドＡＡＶウイルスベクターまたはビリオンの実質的に純粋な集団を提供する。

宿主へのウイルスの感染は、宿主の免疫防御システムを刺激して、感染した宿主をウイルスから守ることができる。宿主が異物の攻撃から自らを防御するために活性化する免疫応答の１つが液性免疫応答であり、この応答によって抗体媒介免疫が生じる。一実施形態では、本明細書で開示される合理的ポリプロイドビリオンは、親血清型と比較して低減された液性応答を惹起し、親血清型と比較して抗ＡＡＶ中和抗体によってあまりもたらされない。

単に説明を目的として、中和抗体は、非中和抗体とは異なる。抗体に基づく免疫は、中和抗体と非中和抗体からなり、非中和抗体は、免疫応答中に生成される抗体プールのより大きな部分を構成するが、ほんの一部だけは、ときには他の免疫細胞とのおよび／または補体系との相互作用によって、機能性であり、感染細胞のクリアランスに関与する。その一方で、中和抗体は、ウイルス機能にとって極めて重要なエピトープに特異的に結合し、ウイルスの感染力に干渉する、例えば、宿主細胞へのウイルス侵入を遮断する。中和抗体（ＮＡｂ）は、いくつかの機序によって、標的細胞に結合し、標的細胞へのＡＡＶ形質導入を阻害する。ＡＡＶ中和抗体は、ＡＡＶ介在遺伝子治療の有効性に対するそれらの有意に有害な効果のため、多くの研究の焦点になっている。最近の研究は、ＡＡＶ結合抗体もＡＡＶベクターの分布および安全性に影響を与え得ることを示している（Klasse et al., J Gen Virol, 2002, 83(Pt 9):2091；およびWang et al., Hum Gene Ther, 2011, 22(11):1389；これらの参考文献の各々の内容はそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

ＡＡＶ遺伝子送達におけるＡＡＶカプシドおよびＡＡＶ血清型に対する既存の中和抗体の検出は、これらの先立つ抗体によって仮定される課題を克服する方法に関する適切な手法の開発に不可欠である。中和抗体のより低い力価または非存在が患者または患者群において検出される、異なる／代替ＡＡＶカプシドおよびＡＡＶ血清型の使用により、この課題は克服され得る。
ＩＩＩ．ＢＢＢを横断する合理的ＡＡＶポリプロイドベクター

本発明は、異なるｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏ応用に好適である様々な望ましい表現型を提示する、数々の合成の合理的ポリプロイドＡＡＶウイルスベクターを提供する。特に、本発明は、ＢＢＢを効率的に横断する少なくとも１つのＶＰ３構造タンパク質、例えばカプシドタンパク質を、個々のカプシドにおいて、任意の異なるＡＡＶ血清型からの少なくとも１つのＶＰ１カプシドタンパク質および／またはＶＰ２カプシドタンパク質と組み合わせることによって、複数の望ましい表現型、例えば、これらに限定されないが、ＣＮＳおよび／またはＰＮＳに対するトロピズムの増大、血液脳関門（ＢＢＢ）を横断するおよび／または脳循環による脳への合理的ＡＡＶカプシドの送達を可能にする、脳血管（ＢＢＶ）もしくは血液成分に形質導入する能力、低減された液性応答の惹起、投与後にｉｎｖｉｖｏで中和抗体（Ｎａｂ）から逃れる能力から選択される少なくとも１つの特性を、個々のカプシド各々に有する、改善されたＡＡＶカプシドを生じさせることが可能になるという、予想外の発見に基づく。一部の実施形態では、合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンにより示される１つの望ましい特性は、それを再投薬ベクターとして選択することを可能にする能力である。そのようなハプロイドまたはポリプロイドビリオンは、カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３が少なくとも２つの異なる血清型に由来することを指す。そのような合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンを産生するための例示的な方法は、本明細書に記載される。ＶＰ１および／またはＶＰ２タンパク質のＡＡＶ血清型からのＶＰ３の望ましくないオープンリーディングフレームの翻訳を防止することにより、これらの方法は、生成ビリオンの均一な集団の産生をもたらす。

組換え合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの（例えば、実質的にまたは完全に）均一な集団を生成できることによって、望ましくない／夾雑ビリオンの特性（例えば、形質導入特異性または抗原性）のキャリーオーバーが劇的に低減または消失される。

一部の実施形態では、本明細書で開示の合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団は、血液脳関門に横断する能力を欠いている非ハプロイドＡＡＶ粒子、例えば、ＡＡＶ２またはＡＡＶ５またはＡＡＶ８と比べて、対象の脳血管（ＢＢＶ）の内皮細胞、星状膠細胞、乏突起膠細胞、ＣＣ１＋乏突起膠細胞、ニューロンのサブタイプ（脳全体にわたるＮｅｕＮ＋細胞、中脳チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）＋ドーパミン作動性ニューロン、カルビンジン＋小脳プルキンエ細胞を含む）、介在ニューロン集団およびＣＤ３１＋内皮細胞のうちの１つまたは複数への増強された形質導入を示す。一部の実施形態では、合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団は、血液脳関門を横断する能力を有する非ハプロイドＡＡＶ粒子と比べて、対象の皮質、線条体、視床、髄質、海馬、小脳および脊髄のうちの１つまたは複数への同等のまたは増強された形質導入を示す。実施形態の一部の態様では、血液脳関門に横断する能力を有する非合理的ポリロイドＡＡＶ粒子と比べて、対象の星状膠細胞、乏突起膠細胞、ＣＣ１＋乏突起膠細胞、ニューロンのサブタイプ（脳全体にわたるＮｅｕＮ＋細胞、中脳チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）＋ドーパミン作動性ニューロン、カルビンジン＋小脳プルキンエ細胞を含む）、介在ニューロン集団およびＣＤ３１＋内皮細胞のうちの１つまたは複数への、合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団の同等のまたは増強された形質導入。

相対形質導入効率を決定するための方法は、www.moleculartherapy.org vol. 19 no. 8, 1440-1448, 2011に記載されており、この非特許文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、本明細書で開示されるハプロイドＡＡＶビリオンの集団は、ＡＡＶ２またはＡＡＶ５と比べてＣＮＳ全体にわたって増強された形質導入を示す。一部の実施形態では、ハプロイドＡＡＶビリオンの集団は、ＡＡＶ２またはＡＡＶ５ビリオンと比べて線条体において増強された形質導入、例えば、同様の条件下でＡＡＶ２またはＡＡＶ５ビリオンのものと比較して線条体における少なくとも２０％、もしくは３０％、もしくは４０％、もしくは５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％、または１００％良好な形質導入、あるいは少なくとも１．２倍、または少なくとも１．５倍、または少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、またはそれより大きい、増強された形質導入を示す。

一実施形態では、本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ハプロイドまたはポリプロイドカプシドであって、任意の血清型からのものであるカプシドタンパク質ＶＰ１と、ＢＢＢを横断する任意のＡＡＶ血清型からのおよび／または非ヒト霊長類からのものであり、かつＶＰ１（または、存在する場合には、ＶＰ２）ＡＡＶ血清型の血清型と同じ血清型ではない、少なくとも１つのカプシドタンパク質ＶＰ３とを含む、カプシドを提供する。好ましくは、合理的ポリプロイドビリオンのそのような集団は、実質的に均一である。一部の実施形態では、本明細書で開示される合理的ポリプロイドビリオンは、ＶＰ２カプシドタンパク質を含み得、前記ＶＰ２カプシドタンパク質は、表１で開示される任意のＡＡＶ血清型からのものであるか、もしくはそのキメラＶＰ２タンパク質であり、またはＶＰ２カプシドタンパク質は、ＶＰ３が由来する血清型と同じである任意の血清型からのものであり、または代替的に、ＶＰ２カプシドタンパク質は、ＶＰ３が由来する血清型とは異なる血清型からのものである。本明細書で開示される合理的ポリプロイド、例えばハプロイドビリオンの、ＶＰ１－ＶＰ２－ＶＰ３の例示的な配置は、Ｘ－Ｙ－Ｚ、Ｘ－Ｘ－Ｚ、Ｚ－Ｘ－Ｚ、Ｘ－Ｚ－Ｚとして表されることがあり、ここで、Ｘ、ＹおよびＺは、各々、１つのＡＡＶ血清型のみから選択され、異なる血清型であり、ＸおよびＺは、表１で開示される任意の血清型から選択され得、Ｚは、ＢＢＢを横断する任意の血清型からのものである。つまり、いずれの合理的ハプロイドベクターにおいても、ＶＰ３は、１つのＺ血清型のみからのものであり、ＶＰ１は、１つのＸ血清型のみからのものである、などである。一部の実施形態では、ＸおよびＹは、ＢＢＢを横断する任意の血清型、および／または非ヒト霊長類ＡＡＶ血清型から選択され得るが、そのような例では、それらは、Ｚの血清型とは異なる血清型からのものである。一部の実施形態では、Ｚは、任意の非霊長類ＡＡＶ血清型からの、例えば、アカゲザル血清型からのものである。一部の実施形態では、Ｚは、任意の血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ｒｈ１０、ｒｈ７４、ｒｈ３９、およびｒｈ４３から選択され得る。

一実施形態では、ＡＡＶゲノム（２つのＡＡＶＩＴＲ間に位置する異種遺伝子を含む）をカプシド内封入する本明細書に記載される合理的ハプロイドビリオンは、ウイルス構造タンパク質のうちの２つ、ＶＰ１およびＶＰ３、のみで形成され得る。一実施形態では、そのような合理的ハプロイドビリオンは、高次構造的に正しく、すなわち、Ｔ＝１の正二十面体対称性を有する。一実施形態では、本明細書に記載される合理的ハプロイドＡＡＶビリオンは、感染性である。

一実施形態では、合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンは、他のＶＰとは異なる血清型からのウイルス構造タンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３、のうちの少なくとも１つを有する、単離されたビリオンであり、各ＶＰは、１つの血清型のみからのものである。単に説明のために、ＶＰ１がＡＡＶ２のみからのものである場合、ＶＰ２は、ＡＡＶ４のみからのものであり、ＶＰ３は、ＡＡＶ２でもＡＡＶ４でもないＢＢＢを横断する血清型からのものである。一部の実施形態では、合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団は、ＡＡＶ８と比べて、脳および脊髄における生体内分布の向上を有する。一部の実施形態では、ＣＮＳ生体内分布は、少なくとも０．１ＶＧ／細胞、少なくとも０．２ｖｇ／細胞、少なくとも０．４ｖｇ／細胞、少なくとも０．６ｖｇ／細胞、少なくとも０．８ｖｇ／細胞、少なくとも１ｖｇ／細胞、少なくとも２ｖｇ／細胞、少なくとも３ｖｇ／細胞、少なくとも４ｖｇ／細胞、少なくとも５ｖｇ／細胞、少なくとも６ｖｇ／細胞、少なくとも７ｖｇ／細胞、少なくとも８ｖｇ／細胞、少なくとも９ｖｇ／細胞、少なくとも１０ｖｇ／細胞、少なくとも１０～１５ｖｇ／細胞の間、少なくとも１５～２０ｖｇ／細胞の間、少なくとも２０～３０ｖｇ／細胞の間、少なくとも３０～４０ｖｇ／細胞の間、少なくとも４０～５０ｖｇ／細胞の間、少なくとも５０ＶＧ／細胞、少なくとも５０～６０ｖｇ／細胞の間、少なくとも６０～７０ｖｇ／細胞の間、少なくとも７０～８０ｖｇ／細胞の間、少なくとも８０～９０ｖｇ／細胞の間、少なくとも９０～１００ｖｇ／細胞の間、少なくとも１００ｖｇ／細胞であるか、またはそれより多い。

ＣＮＳ生体内分布は、脳の領域および脊髄の領域における生体内分布に相当する。非限定的な例示的なＣＮＳ生体内分布領域としては、嗅球、線条体、海馬、皮質、視床、視床下部、小脳、髄質、頸神経叢、胸神経叢、腰神経叢、脈絡叢、手綱核、アンモン角、歯状回、尾状核被殻、扁桃体が挙げられる。一部の実施形態では、合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団は、グリア細胞よりニューロンにおいて増強された形質導入を示す。一部の実施形態では、合理的ポリプロイドビリオンの集団は、星状膠細胞において増強された形質導入を示す。一部の実施形態では、合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団は、ＣＮＳ以外の組織における有意な形質導入を示す。実施形態のいくつかの態様では、合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団は、肺、腎臓において形質導入を示し、肝臓、心臓、骨格筋、腸および脾臓において超生理的レベルを有する。

一部の実施形態では、本発明の合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団は、脳血管（ＢＢＶ）の内皮細胞への有意な形質導入を示す。一部の実施形態では、本発明の合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団は、ＢＢＢの内皮細胞、ＢＢＢの内皮細胞を包囲する（「グリア境界膜」としても公知の）星状膠細胞足と呼ばれる星状膠細胞の細胞表面突起、のうちのいずれか１つまたは複数を含む、ＢＢＢの一部である細胞への有意な形質導入を示す。一部の実施形態では、本発明の合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団は、活性化Ｔ細胞、血中単球、マクロファージを含むがこれらに限定されない、ＢＢＢを横断することができる血液成分への有意な形質導入を示す。

一実施形態では、２つのＡＡＶＩＴＲ間に異種遺伝子を含むＡＡＶゲノムをカプシド内封入する合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンは、ウイルス構造タンパク質のうちの２つ、ＶＰ１およびＶＰ３、のみで形成され得、ＶＰ３は、ＢＢＢを効率的に横断する血清型からのものである。一実施形態では、このビリオンは、高次構造的に正しく、すなわち、Ｔ＝１の正二十面体対称性を有する。一実施形態では、ビリオンは、感染性である。

感染性ビリオンは、ＶＰ１／ＶＰ３またはＶＰ１／ＶＰ２／ＶＰ３を含む。典型的には、ＶＰ２／ＶＰ３のみまたはＶＰ３のみを含むビリオンは、感染性ではない。

一部の実施形態では、合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンのこれらの集団を生成するために使用されるウイルス構造タンパク質ＶＰ２は、遺伝子治療のために単離されたＡＡＶの１２の血清型のいずれか、他の種、変異型の血清型、そのような遺伝子のシャフリングされた血清型、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶＶＰ１．５、ＡＡＶ４ＶＰ２、ＡＡＶ４ＶＰ３、ＡＡＶＲｈ１０ＶＰ３、ＡＡＶＲｈ７４ＶＰ３、ＡＡＶＲｈ７４ＶＰ２または所望される、例えば表１で開示されるような、任意の他のＡＡＶ血清型からのものであり得る。

本明細書で開示されるように、ＶＰ３構造カプシドタンパク質は、ＢＢＢを効率的に横断する任意のＡＡＶ血清型から選択される。ＢＢＢを横断するそのようなＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ｒｈ１０、ｒｈ７４、ｒｈ３９およびｒｈ４３のいずれかから選択される。本明細書で開示される方法および組成物における使用のための、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３タンパク質を含む例示的な合理的ポリプロイドベクターには、これらに限定されないが、ＡＡＶ－Ｘ－Ｙ－１、ＡＡＶ－Ｘ－Ｘ－１、ＡＡＶ－Ｘ－Ｙ－６、ＡＡＶ－Ｘ－Ｘ－６、ＡＡＶ－Ｘ－Ｙ－６．２、ＡＡＶ－Ｘ－Ｘ－６．２、ＡＡＶ－Ｘ－Ｙ－７、ＡＡＶ－Ｘ－Ｘ－７、ＡＡＶ－Ｘ－Ｙ－９、ＡＡＶ－Ｘ－Ｘ－９、ＡＡＶ－Ｘ－Ｙ－ｒｈ１０、ＡＡＶ－Ｘ－Ｘ－ｒｈ１０、ＡＡＶ－Ｘ－Ｙ－ｒｈ７４、ＡＡＶ－Ｘ－Ｘ－ｒｈ７４、ＡＡＶ－Ｘ－Ｙ－ｒｈ３９、ＡＡＶ－Ｘ－Ｘ－ｒｈ３９、ＡＡＶ－Ｘ－Ｙ－４３、ＡＡＶ－Ｘ－Ｘ－４３が含まれ、ここで、ＸおよびＺは、各々、１つのＡＡＶ血清型のみから選択され、異なる血清型であり、表１で開示される任意の血清型から選択される。一部の実施形態では、Ｘおよび／またはＹは、ＢＢＢを横断する任意の血清型からのものであり得、または代替的に、任意の非ヒト霊長類ＡＡＶ血清型からのものであり得、これが存在する場合、Ｘおよび／またはＹの血清型は、ＶＰ３のものからの血清型とは異なる。合理的ポリプロイドがＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３タンパク質を含む、一部の実施形態では、ＶＰ１タンパク質血清型の血清型は、ＢＢＢを横断するＶＰ３タンパク質の血清型と同じであり、ＶＰ２タンパク質の血清型は、異なる血清型からのものである。合理的ポリプロイドがＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３タンパク質を含む一部の実施形態では、ＶＰ２タンパク質血清型の血清型は、ＢＢＢを横断するＶＰ３タンパク質の血清型と同じであり、ＶＰ１タンパク質の血清型は、異なる血清型からのものである。

一部の実施形態では、合理的ポリプロイドベクターは、ＶＰ１およびＶＰ３タンパク質のみ、またはＶＰ２およびＶＰ３タンパク質のみを含み得、本明細書で開示される方法および組成物における使用のためのそのような例示的な合理的ポリプロイドベクターには、これらに限定されないが、ＡＡＶ－Ｘ－１、ＡＡＶ－Ｘ－６、ＡＡＶ－Ｘ－６．２、ＡＡＶ－Ｘ－７、ＡＡＶ－Ｘ－９、ＡＡＶ－Ｘ－ｒｈ１０、ＡＡＶ－Ｘ－ｒｈ７４、ＡＡＶ－Ｘ－ｒｈ３９、ＡＡＶ－Ｘ－４３が含まれ、ここで、Ｘは、ＶＰ１またはＶＰ２のどちらかであり、表１で開示される任意の血清型から選択される１つの血清型のみから選択される。一部の実施形態では、Ｘは、ＢＢＢを横断する任意の血清型からのものであり得、または代替的に、任意の非ヒト霊長類ＡＡＶ血清型からのものであり得、これが存在する場合、Ｘの血清型は、ＶＰ３のＡＡＶ血清型とは異なる。

一部の実施形態では、ＶＰ３は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶｒｈ３９およびＡＡＶｒｈ４３、またはネイティブアミノ酸配列に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するバリアントを含むがこれらに限定されない、ＢＢＢを横断する任意のＡＡＶ血清型から選択され得る。ＢＢＢを横断するＡＡＶ血清型は、Zhang et al., Mol. Therapy, 19(8); 2011; 1440-1448、Nonnenmacher et al., Mol Ther: Methods and Clinical development; 2021, 336、およびGao et al., J. Virol, 2004; 6381-6388において開示されており、これらの参考文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

一部の実施形態では、本明細書で開示される合理的ＡＡＶポリプロイドベクターは、ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３タンパク質を含み、ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３は、各々、異なる血清型からのものであり、血清型ＸまたはＹは、表１から選択される任意のＡＡＶ血清型であり、血清型Ｚは、ＢＢＢを横断する任意の血清型のみからの、および／または、代替的に、および血清型Ｘでも血清型ＹでもないＢＢＢを横断する非ヒト霊長類ＡＡＶまたは任意の血清型またはキメラもしくは天然に存在しない血清型からの、ものである。

一部の実施形態では、ＡＡＶ合理的ポリプロイドは、３つの血清型、例えば、Ｘ、ＹおよびＺを含み、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３は、１つの血清型のみからのものであり、それらの各々が異なる血清型であり、ＸおよびＹは、表１から選択される任意の血清型から選択され得、ＶＰ３（血清型Ｚ）は、ａからのものである／ＢＢＢを横断する任意のＡＡＶ血清型である。そのような組合せが表２に示される。

表2: 3つの異なる血清型:X、YおよびZ(ここで、血清型Zは、BBBを横断する任意のAAV血清型から選択される)を含む、合理的AAVポリプロイドの異なるカプシドタンパク質の組合せの表。

一部の実施形態では、ＡＡＶ合理的ハプロイドベクターは、２つの血清型のみを含み、血清型の１つは、ＢＢＢを横断する任意のＡＡＶ血清型（血清型Ｚと呼ばれる）であり、および血清型の１つ（血清型Ｘ）は、表１から選択される任意の血清型からのものである。一部の実施形態では、血清型Ａの例示的な血清型には、これらに限定されないが、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ｂが含まれる。一部の実施形態では、血清型Ｚの例示的血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶｒｈ３９のうちのいずれかから選択される、ＢＢＢを横断するＡＡＶ血清型である。一部の実施形態では、血清型Ｚの血清型は、アカゲザル血清型ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ．７３、ＡＡＶｒｈ．７５、ＡＡＶｒｈ．７６、ｒＡＡＶｒｈ３９、ｒＡＡＶｒｈ．４３を含む、任意の非霊長類ＡＡＶ血清型からも選択され得る。
ＩＶ．ＢＢＢを横断する例示的なＡＡＶ８ハプロイドベクター

一実施形態では、本明細書で開示される合理的ポリプロイドベクターは、アデノ随伴ウイルス８（ＡＡＶ８）ハプロイドまたはポリプロイドカプシドであり、カプシドは、ＡＡＶ８血清型からのものであるカプシドタンパク質ＶＰ１と、ＢＢＢを横断する任意のＡＡＶ血清型からのおよび／または非ヒト霊長類からのものであり、かつＡＡＶ８血清型ではない、少なくとも１つのカプシドタンパク質ＶＰ３とを含む。好ましくは、ＡＡＶ８ハプロイドビリオンのそのような集団は、実質的に均一である。一部の実施形態では、本発明のＡＡＶ８ハプロイドカプシドは、ＶＰ２カプシドタンパク質を含み得、前記ＶＰ２カプシドタンパク質は、ＡＡＶ８血清型からのものであるか、もしくはそのキメラＶＰ２タンパク質であり、またはＶＰ２カプシドタンパク質は、ＶＰ３が由来する血清型と同じである任意の血清型からのものであり、または代替的に、ＶＰ２カプシドタンパク質は、ＶＰ３が由来する血清型とは異なる血清型からのものである。本発明のＡＡＶ８ハプロイドカプシドにおけるＶＰ１－ＶＰ２－ＶＰ３の例示的な配置は、ＡＡＶ８－８－Ｙ、ＡＡＶ８－Ｘ－Ｙ、ＡＡＶ８－Ｙ－Ｙとして表されることがあり、ここで、Ｘは、任意の血清型（ＡＡＶ８を除く）からのＶＰ２カプシドタンパク質であり、Ｙは、任意の血清型（ＡＡＶ８を除く）からのＶＰ３タンパク質であり、ＸおよびＹは、異なる血清型からのものであり、ＸおよびＹは、ＢＢＢを横断する任意の血清型および／または非ヒト霊長類ＡＡＶ血清型から選択され得る。

一部の実施形態では、ＡＡＶ８血清型からのＶＰ１と、少なくとも１つのＶＰ３カプシドタンパク質とを含有する、本明細書で開示されるＡＡＶ８ハプロイドまたはポリプロイドビリオンであって、ＶＰ３が、ＡＡＶ８からのものではなく、ＢＢＢを横断する任意の血清型から選択される、および／または非ヒト霊長類ＡＡＶ血清型である、ＡＡＶ８ハプロイドまたはポリプロイドビリオンが、産生される。例えば、ＶＰ１および必要に応じてＶＰ２が、ＡＡＶ８血清型からのものであり、ＶＰ３が、ＡＡＶ８からのものではなく、ＢＢＢを横断する任意のＡＡＶ血清型から選択される、および／または非ヒト霊長類ＡＡＶ血清型である、ＡＡＶ８ハプロイドまたはポリプロイドビリオンが、産生される。

一実施形態では、ＡＡＶ８ビリオンは、ＡＡＶ８血清型からのＶＰ１と、ＡＡＶ８とは異なる血清型からのウイルス構造タンパク質、ＶＰ２および／またはＶＰ３、の一方とを少なくとも有する、単離されたビリオンであって、ＶＰ２および／またはＶＰ３のどちらかが、ネイティブＡＡＶベクターがＢＢＢを横断する任意のＡＡＶ血清型からのものである、単離されたビリオンである。例えば、本明細書に記載されるＡＡ８ハプロイドビリオンは、ＡＡＶ８からのＶＰ１と、ＡＡＶ９、ＡＡＶ７（受託番号ＡＦ５１３８５２、これはＡＡＶ７の全ゲノムである）、ｒＡＡＶｒｈ７４、ｒＡＡＶｒｈ．３９、ｒＡＡＶｒｈ．４３またはそのバリアントからのＶＰ２またはＶＰ３またはＶＰ２とＶＰ３の両方と、を含み得る。

一実施形態では、ＡＡＶ８ビリオンは、ＡＡＶ８血清型からのＶＰ１と、ＡＡＶ８とは異なる血清型からのウイルス構造タンパク質、ＶＰ２および／またはＶＰ３、の一方とを少なくとも有する、単離されたビリオンであって、ＶＰ２および／またはＶＰ３のどちらかが任意の非ヒト霊長類ＡＡＶ血清型からのものである、単離されたビリオンである。例えば、ＶＰ１は、ＡＡＶ８のみからのものであり、ＶＰ２および／またはＶＰ３は、アカゲザルからのものである。例えば、本明細書に記載されるＡＡ８ハプロイドビリオンは、ＡＡＶ８からのＶＰ１と、ｒＡＡＶｒｈ．１０、ｒＡＡＶｒｈ．７４、ｒＡＡＶｒｈ．３９もしくはｒＡＡＶｒｈ．４３またはそのバリアントからのＶＰ２またはＶＰ３またはＶＰ２とＶＰ３の両方と、を含み得る。本願を通して、本明細書に記載されるビリオンは、ＡＡＶ（ＶＰ１）－ＶＰ２－ＶＰ３として、または代替的に「ＡＡＶｎｎｎ」として表されることがある。例えば、単に説明のために、ＡＡＶ８からのＶＰ１、ＡＡＶ８からのＶＰ２、およびＡＡＶｒｈ．１０からのＶＰ３を有するビリオンは、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０またはＡＡＶ８８ｒｈ１０として表されることがあり得る。したがって、この命名法を使用すると、本明細書における例示的なＡＡＶ８ハプロイドビリオンには、これらに限定されないが、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４、ＡＡＶ８－８－ｒｈ３９、ＡＡＶ８－８－ｒｈ４３、またはそのバリアントが含まれ、ここで、ＶＰ１およびＶＰ２カプシドタンパク質は、ＡＡＶ８からのものであり、ＶＰ３は、示されている通りの血清型からのものである。他の例示的なＡＡＶ８ハプロイドベクターには、これらに限定されないが、ＡＡＶ８－Ｘ－ｒｈ１０、ＡＡＶ８－Ｘ－ｒｈ７４、ＡＡＶ８－Ｘ－ｒｈ３９、ＡＡＶ８－Ｘ－ｒｈ４３、またはそのバリアントが含まれ、ここで、Ｘは、ＡＡＶ８を除く任意の血清型からのＶＰ２である。一部の実施形態では、Ｘは、ＡＡＶｒｈ１０、ｒＡＡＶｒｈ７４、ｒＡＡＶｒｈ．３９もしくはｒＡＡＶｒｈ．４３、またはそのバリアントを含むがこれらに限定されない、任意のアカゲザルＡＡＶ血清型からのＶＰ２カプシドタンパク質である。

本明細書における一部の実施形態では、ＶＰ１カプシドタンパク質がＡＡＶ８からのものであり、ＶＰ２またはＶＰ３ウイルスタンパク質の少なくとも一方がＡＡＶ８からのものでない、ビリオン粒子が構築され得る。一部の実施形態では、ＶＰ１およびＶＰ２は、ＡＡＶ８血清型からのものであり得る。本明細書で開示される全ての実施形態では、ＶＰ３は、ＡＡＶ８からのものではない。一部の実施形態では、ＶＰ２およびＶＰ３は、同じ血清型、例えば、ＡＡＶ８－ｒｈ１０－ｒｈ１０からのものである。一部の実施形態では、ＶＰ２およびＶＰ３は、異なる血清型、例えば、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０、またはＡＡＶ８－ｒｈ７４－ｒｈ１０からのものである。本明細書で開示される全ての実施形態の各態様では、少なくとも、ＡＡＶ８からのＶＰ１および別の血清型からのＶＰ３カプシドタンパク質が、ＡＡＶゲノムをカプシド内封入することができるビリオン粒子を形成するために必要とされる。各ビリオン粒子について、カプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３）は同じタイプである（例えば、全てのビリオンがＡＡＶ８ＶＰ１を含む）。一部の実施形態では、ウイルスカプシドタンパク質のうちの少なくとも１つは、キメラウイルスタンパク質であり、他の２つのウイルスタンパク質の少なくとも一方は、キメラのものではない。一部の実施形態では、ＶＰ１は、キメラＡＡＶ８ＶＰ１タンパク質である。一部の実施形態では、ＶＰ１およびＶＰ２は、キメラのものであり、ＶＰ３のみが、非キメラのものである。例えば、任意の他の非ＡＡＶ８ベクター、例えばｒｈ１０、ｒｈ７４など、からのＶＰ３のみと対にされた、キメラＡＡＶ２／８（ＡＡＶ２のＮ末端およびＡＡＶ８のＣ末端）からのＶＰ１／ＶＰ２で構成されている、ウイルス粒子のみ。別の実施形態では、ＶＰ３のみがキメラのものであり、ＶＰ１およびＶＰ２は、非キメラのものである。別の実施形態では、ウイルスタンパク質のうちの少なくとも１つは、完全に異なる血清型からのものである。別の例では、キメラのものは存在しない。

一部の実施形態では、本明細書で開示される合理的ポリプロイドビリオンは、ＡＡＶ８ハプロイドビリオンであり、ＡＡＶ８８ｒｈ１０、ＡＡＶ８８ｒｈ７４、ＡＡＶ８８ｒｈ７４ｖｖ、ＡＡＶ８８ｒｈ１０ＬＰ２、ＡＡＶ８８ｒｈ７４ＬＰ２、ＡＡＶ８８ｒｈ７４ｖｖＬＰ２のいずれかから選択され得、これらの各々は、本明細書で提供される実施例セクションで説明される。一部の実施形態では、これらのＡＡＶ８ハプロイドビリオンは、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ｖｖ、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０ＬＰ２、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ＬＰ２、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ｖｖＬＰ２として表されることがある。単に説明として、これらのＡＡＶハプロイドビリオンは、ＡＡＶ８ＶＰ１およびＶＰ２構造タンパク質（例えば、配列番号７および８）を含むか、または配列番号７もしくは８の改変タンパク質と、ｒｈ１０ＶＰ３（配列番号１）、ｒｈ７４ＶＰ３（配列番号３）、ｒｈ７４ｖｖＶＰ３（配列番号２）、ｒｈ１０－ＬＰ２ＶＰ３タンパク質（配列番号１４）、ｒｈ７４－ＬＰ２ＶＰ３タンパク質（配列番号１７）、およびｒｈ７４ｖｖ－ＬＰ２ＶＰ３タンパク質（配列番号１５）のうちのいずれかから選択されるＶＰ３タンパク質、もしくは配列番号１、２、３、１４、１５および１８のいずれかに対して少なくとも８５％配列同一性であるアミノ酸配列を有するＶＰ３タンパク質とを含む。一部の実施形態では、改変ＡＡＶ８ＶＰ１またはＶＰ２タンパク質は、本明細書で開示の標的化ペプチドまたはＢＢＢ浸透ペプチドを含むがこれらに限定されない、ペプチドの挿入を、ＶＰ１および／またはＶＰ２タンパク質中の適切な部位に含む。一部の実施形態では、リンカー、例えば、ペプチドリンカーは、標的化ペプチドに隣接し得る（すなわち、標的化ペプチドの各末端がペプチドリンカーを構成し得る）か、または標的ペプチドの一方の末端に位置するペプチドリンカーがある。一部の実施形態では、ＡＡＶ８ＶＰ１および／またはＶＰ２構造タンパク質は、Gilkes Site-specific modifications to AAV8 capsid yields enhanced brain transduction in the neonatal MPS IIIB mouse. Gene Ther (2020)において開示されているように、二重変異体（Ｙ４４４＋７３３Ｆ）または三重変異体（Ｙ４４４＋７３３ＦＴ４９４Ｖ）として改変されており、この非特許文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれ；この非特許文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

一部の実施形態では、ＡＡＶ８からのＶＰ１カプシドタンパク質と、ＡＡＶ８とは異なる血清型からのものであるＶＰ３カプシドタンパク質とを含有するビリオンのみが、産生される。例えば、ＶＰ１およびＶＰ２は、ＡＡＶ８血清型からのものであり、ＶＰ３は、代替血清型のみからのものである。他の実施形態では、ＶＰ１は、ＡＡＶ８血清型からのものであり、ＶＰ２およびＶＰ３は、別の血清型のみからのものであり、ＶＰ２およびＶＰ３カプシドタンパク質は、ＢＢＢを横断するおよび／または非ヒト霊長類ＡＡＶ血清型である、血清型からのものである。別の実施形態では、ＶＰ１がＡＡＶ８血清型からのものであり、ＶＰ２が第２の血清型からのものであり、ＶＰ３がさらに別の血清型からのものである、粒子のみが産生され、本明細書ではポリプロイドＡＡＶ８ビリオンと呼ばれる。

これは、例えば、スプライスドナー部位、スプライスアクセプター部位、スタートコドンおよびこれらの組合せを変化させる部位特異的欠失および／または付加によって、行われ得る。

これは、ポリプロイドビリオン－例えばハプロイド粒子－の実質的に均一な集団である集団を産生するための方法を可能にする。

一部の実施形態では、例示的なＡＡＶ８ハプロイドベクターは、以下から選択される：
ａ．ＡＡＶ８－８－ｒｈＹ（ここで、Ｙは、アカゲザルをはじめとする非ヒト霊長類ＡＡＶ血清型からのＶＰ３である）；
ｂ．ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０；
ｃ．ＡＡＶ８－Ｘ－ｒｈ１０、ここで、ｘは、Ｒｈ１０を除く任意の血清型である；
ｄ．ＡＡＶ８－Ｘ－ｒｈ１０、ここで、ｘは、ＡＡＶ８を除く任意の血清型である；
ｅ．ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４；
ｆ．ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ｖｖ、ここで、ｒｈ７４ＶＰ３カプシドタンパク質は、Ｗ５８１ＶＶ改変を含む；
ｇ．ＡＡＶ８－Ｘ－ｒｈ７４またはｒｈ７４ｖｖ、ここで、ｘは、Ｒｈ７４を除く任意の血清型である；
ｈ．ＡＡＶ８－Ｘ－ｒｈ７４／ｒｈ７４ｖｖ、ここで、ｘは、ＡＡＶ８を除く任意の血清型である；
ｉ．ＡＡＶ８－８－Ｙ、ここで、Ｙは、ＢＢＢを横断する任意の血清型からのＶＰ３カプシドタンパク質である（例えば、ＢＢＢを横断する例示的なＶＰ３カプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７（受託番号ＡＦ５１３８５２、これはＡＡＶ７の全ゲノムである）、ＡＡＶ９、ｒＡＡＶｒｈ１０、ｒＡＡＶｒｈ７４、ｒＡＡＶｒｈ３９、ｒＡＡＶｒｈ４３から選択され得る）；
ｊ．ＡＡＶ８－Ｘ－Ｙ、ここで、Ｘは、ＡＡＶ８を除く任意の血清型であり、Ｙは、ＢＢＢを横断する任意の血清型からのＶＰ３であり、Ｙは、ＡＡＶ８からのものではない；
ｋ．ＡＡＶ８－Ｘ－Ｙ、ここで、Ｘは、ＢＢＢを横断する任意の血清型であり、Ｙは、ＢＢＢを横断する任意の血清型からのＶＰ３であり、ＸおよびＹは、それぞれ、ＡＡＶ８血清型からのＶＰ２カプシドタンパク質でもＶＰ３カプシドタンパク質でもなく、ＢＢＢを横断する血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７（受託番号ＡＦ５１３８５２、これはＡＡＶ７の全ゲノムである）、ＡＡＶ９、ｒＡＡＶｒｈ１０、ｒＡＡＶｒｈ７４、ｒＡＡＶｒｈ３９、ｒＡＡＶｒｈ４３から選択され得る；
ｌ．ＡＡＶ８－Ｘ－Ｘ、ここで、Ｘは、ＢＢＢを横断する任意の血清型であり、Ｘは、それぞれ、ＡＡＶ８血清型からのＶＰ２カプシドタンパク質でも、ＶＰ３カプシドタンパク質でもなく、ＢＢＢを横断する血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７（受託番号ＡＦ５１３８５２、これはＡＡＶ７の全ゲノムである）、ＡＡＶ９、ｒＡＡＶｒｈ１０、ｒＡＡＶｒｈ７４、ｒＡＡＶｒｈ３９、ｒＡＡＶｒｈ４３から選択され得る；
ｍ．ＡＡＶ８－Ｘ－Ｙ、ここで、Ｘは、ＡＡＶ８を除く任意の血清型であり、Ｙは、ＢＢＢを横断する任意の血清型からのＶＰ３であり、Ｙは、ＡＡＶ８からのものではない。

一部の実施形態での、ＢＢＢを横断する例示的なＡＡＶハプロイドベクターが、表４で開示される。

表4: VP3が、BBBを横断する血清型(例えば、AAV1、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV9、AAVrh10、AAVrh74、AAVrh39から選択される)からのものであり、VP1および/またはVP2が、VP3の血清型のものとは異なる血清型からのものであり、また、BBBを横断する血清型からのものであり得るか、またはAAV8もしくはXから選択され得、Xが、AAV8ではない血清型であり、表1からの任意の血清型から選択され得る、例示的な合理的ポリプロイドまたはポリプロイドベクター。
（ｉ）ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０ハプロイドベクター

一部の実施形態では、例示的なＡＡＶハプロイドベクターは、ＶＰ１およびＶＰ２がＡＡＶ８血清型のみからのものであり、ＶＰ３がアカゲザルＡＡＶ１０（ＡＡＶｒｈ１０）血清型のみからのものである、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０である。一部の実施形態では、ＶＰ３カプシドタンパク質は、ＡＡＶｒｈ１０血清型からのキメラＶＰ３タンパク質である。一部の実施形態では、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０ハプロイドベクターは、配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号１に対して少なくとも８５％、もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％、もしくは少なくとも９８％の配列同一性のアミノ酸配列を有する、ＶＰ３カプシドタンパク質を含み、配列番号１は、ＡＡＶｒｈ１０からのコドン最適化ＶＰ３カプシドタンパク質のアミノ酸である。一部の実施形態では、ＶＰ３は、配列番号１のＱ２１４Ｎ、Ｓ４６２ＮおよびＤ５１７Ｅから選択される少なくとも１つ、または少なくとも２つ、または少なくとも３つの改変を含む、改変ＶＰ３タンパク質である。ＡＡＶｒｈ１０血清型からのＶＰ３のアミノ酸を含む配列番号１は、配列番号５の核酸配列、または配列番号５に対して少なくとも９５％もしくは少なくとも９８％の核酸配列同一性のバリアントの核酸配列によりコードされる。

一部の実施形態では、例示的なＡＡＶ８ハプロイドベクターは、ＶＰ１およびＶＰ２が、配列番号６の核酸配列によりコードされる、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０であって、前記核酸配列が、ＡＡＶ８血清型からのＶＰ３タンパク質が発現されないようにＭ２０３ＶおよびＭ２１１Ｖ、Ｍ２０４および／またはＭ２１２Ｍ２０４および／またはＭ２１２を含む、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０である。一部の実施形態では、核酸バリアントは、ＶＰ２のスタートコドン（トレオニン（ＴまたはＴｈｒ））を破壊するまたは作動不能にするために配列番号６の４１２～４１４位におけるＡＣＧの少なくとも１塩基の改変を含み、したがって、配列番号６のこの核酸は、ＡＡＶ８血清型のＶＰ１のみをコードし、ＡＡＶ８血清型からのＶＰ２とＶＰ３のどちらもコードしない。そのような実施形態では、ＡＡＶ８ハプロイドベクターは、異なる血清型、例えばＡＡＶｒｈ血清型、からのＶＰ２タンパク質を含み得るか、または代替的に、ＶＰ２には本明細書で論じられるようなＡＡＶ８ハプロタイプが非存在であり得、したがって、ＡＡＶ８血清型からのＶＰ３タンパク質は発現されない。一部の実施形態では、核酸バリアントは、ＶＰ２のスタートコドン（トレオニン（ＴまたはＴｈｒ））を破壊するまたは作動不能にするために配列番号６の４１２～４１４位におけるＡＣＧの少なくとも１塩基の改変を含み、したがって、配列番号６のこの核酸は、ＡＡＶ８血清型のＶＰ１のみをコードし、ＡＡＶ８血清型からのＶＰ２とＶＰ３のどちらもコードしない。そのような実施形態では、ＡＡＶ８ハプロイドベクターは、異なる血清型、例えばＡＡＶｒｈ血清型、からのＶＰ２タンパク質を含み得るか、または代替的に、ＶＰ２には本明細書で論じられるようなＡＡＶ８ハプロタイプが非存在であり得る。

本明細書における実施例で示されるように、合理的ポリプロイドＡＡＶ８－８－ｒｈ１０は、親ＡＡＶ８と比較して少ない液性応答を生じさせ（図２５Ａ）、これによって、このＡＡＶ８－８－ｒｈ１０ハプロイドが、親ＡＡＶ８ベクターと比較して異なる、減少した抗原性プロファイルを有することが実証された。図８Ｂおよび１０Ｃによって、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０からの生産収率および比生産性が、ＡＡＶ８またはＡＡＶｒｈ１０対照に匹敵することも実証された。

一部の実施形態では、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０ハプロイドは、配列番号１３の構築物を含む、配列番号１２のプラスミドを使用して産生された。
（ｉｉ）ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドベクター

一部の実施形態では、例示的なＡＡＶハプロイドベクターは、ＶＰ１およびＶＰ２がＡＡＶ８血清型のみからのものであり、ＶＰ３がアカゲザルＡＡＶ７４（ＡＡＶｒｈ７４）血清型のみからのものである、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４である。一部の実施形態では、ＶＰ３カプシドタンパク質は、ＡＡＶｒｈ７４血清型からのキメラＶＰ３タンパク質である。一部の実施形態では、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドベクターは、配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３に対して少なくとも８５％、もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％、もしくは少なくとも９８％の配列同一性のアミノ酸配列を有する、ＶＰ３カプシドタンパク質を含み、配列番号３は、ＡＡＶｒｈ７４からの野生型ＶＰ３カプシドタンパク質のアミノ酸である。

一部の実施形態では、ｒｈ７４ＶＰ３は、少なくとも１つまたは複数のアミノ酸改変を含む、改変ＶＰ３タンパク質である。特定の実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４ＶＰ３カプシドタンパク質は、配列番号３のアミノ酸５８１位（ＡＡＶｒｈ７４からのＶＰ１カプシドタンパク質のアミノ酸配列からの命名法／番号付けを使用する）においてトリプトファン（ＷまたはＴｒｐ）で２つの連続するバリン（Ｖまたはｖａｌ）アミノ酸が置換されているＷ５８１ＶＶ改変を含む改変ＶＰ３タンパク質である。したがって、一部の実施形態では、ＡＡＶハプロイドベクターは、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２に対して少なくとも８５％、もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％、もしくは少なくとも９８％の配列同一性のアミノ酸配列を有する、ＶＰ３カプシドタンパク質を含む、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ｖｖハプロイドベクターであって、配列番号２が、Ｗ５８１ＶＶ改変を含むｒｈ７４ｖｖ－ＶＰ３カプシドタンパク質のアミノ酸である、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ｖｖハプロイドベクターである。

ｒｈ７４ｖｖ－ＶＰ３カプシドタンパク質のアミノ酸を含む配列番号２は、配列番号４の核酸配列によりコードされる。

一部の実施形態では、ＡＡＶハプロイドベクターは、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２に対して少なくとも８５％、もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％、もしくは少なくとも９８％の配列同一性のアミノ酸配列を有する、ＶＰ３カプシドタンパク質を含む、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ｖｖハプロイドベクターであって、配列番号２が、Ｗ５８１ＶＶ改変を含むｒｈ７４ｖｖ－ＶＰ３カプシドタンパク質のアミノ酸であり、ｒｈ７４ｖｖ－ＶＰ３カプシドタンパク質が、配列番号４を含む核酸配列、または配列番号４に対して少なくとも８５％、もしくは少なくとも８７％、もしくは少なくとも８８％、もしくは少なくとも８９％、もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％、もしくは少なくとも９８％配列同一性の核酸配列によりコードされる、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ｖｖハプロイドベクターである。

本明細書におけるいずれかの態様の一実施形態では、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ｖｖハプロイドベクターにおけるＡＡＶｒｈ７４ＶＰ３タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列、もしくは配列番号２に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するタンパク質のアミノ酸配列を有し、または変異ＡＡＶｒｈ７４ＶＰ３は、配列番号２の以下の改変：Ｎ２６３Ｓ、Ｇ２６４Ａ、Ｔ２６５Ｓ、Ｓ２６６Ｔ、Ｇ２６８Ａ、Ｔ２７０ｄｅｌ、Ｔ２７４Ｈ、Ｅ５３３Ｋ、Ｒ７２６Ｈ、Ｎ７３６Ｐのうちの少なくとも１つを含む。

本明細書におけるいずれかの態様の一実施形態では、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ｖｖハプロイドベクターにおけるＡＡＶｒｈ１０ＶＰ３タンパク質は、配列番号５のＡＡＶｒｈ１０＿ＶＰ３核酸と比較してＱ２１４Ｎ、Ｓ４６２ＮおよびＤ５１７Ｅ変異のうちの少なくとも１つまたは複数を含む配列番号５の核酸によりコードされるか、またはＱ２１４Ｎ、Ｓ４６２ＮおよびＤ５１７Ｅから選択される少なくとも１つの変異を含む配列番号５に対して少なくとも８５％の配列同一性の核酸配列を含む配列番号５の核酸によりコードされる。

本明細書におけるいずれかの態様の一実施形態では、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ｖｖハプロイドベクターにおけるＡＡＶｒｈ７４ＶＰ３タンパク質は、配列番号２もしくは３のアミノ酸配列、または配列番号２もしくは２に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するタンパク質のアミノ酸配列を含むか、または配列番号２のＮ２６３Ｓ、Ｇ２６４Ａ、Ｔ２６５Ｓ、Ｓ２６６Ｔ、Ｇ２６８Ａ、Ｔ２７０ｄｅｌ、Ｔ２７４Ｈ、Ｅ５３３Ｋ、Ｒ７２６Ｈ、Ｎ７３６Ｐのアミノ酸改変のうちの少なくとも１つを含む。

重要なこととして、本明細書において実施例でおよび図３０Ｂ～３０Ｃで開示されるように、ハプロイドＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ベクターは、親ＡＡＶ血清型で免疫されたマウスと比較して、改善された脳および脊髄形質導入能力ならびにＢＢＢ横断能力を有する。

重要なこととして、本明細書において実施例で開示されるように、ハプロイドＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ベクターは、親血清型で免疫された血清からの中和抗体からの改善された逃避能力を有する。重要なこととして、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４は、全身投与後にマウスの全身に形質導入する上で親ＡＡＶ８またはＡＡＶｒｈ１０より驚くほど効率が高く、ハプロイドＡＡＶ８－８－ｒｈ１０より効率が高い（図２１Ａ～２１Ｄを参照されたい）。さらに、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４は、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ１０とは対照的に血液脳関門を横断する能力を示し、したがって、その親ＡＡＶ８と比較して予想外の結果、およびＡＡＶ８ハプロイドにより示されるのとは異なる表現型を示した。さらに、ハプロイドベクターＡＡＶ８－８－ｒｈ７４は、ＡＡＶ８対照と同様にＰｒｏ１０細胞に形質導入し、重要なこととして、ＧＭ１６０９５細胞には親ベクターＡＡＶ８より有意に効率よく形質導入した。さらに、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドは、抗ＡＡＶ８中和抗体から逃避すること（図１８Ａ～１８Ｂ、図１９を参照されたい）および親ＡＡＶ８と比較して少ない液性応答を生じさせること（図２５Ａ）が判明し、したがって、このＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドは、親ＡＡＶ８ベクターと比較して異なる、減少した抗原性プロファイルを有することが実証された。

一部の実施形態では、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドは、配列番号１１の構築物を含む、配列番号１０のプラスミドを使用して産生された。
Ｖ．ＡＡＶハプロイドまたはポリプロイドカプシドのバリアント

一部の実施形態では、本明細書に包含されるＡＡＶハプロイドまたはポリプロイドビリオンは、典型的な３つのウイルス構造タンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３、より多くのウイルス構造タンパク質によって形成され得る（例えば、Wang, Q. et al., "Syngeneic AAV Pseudo-particles Potentiate Gene Transduction of AAV Vectors," Molecular Therapy: Methods and Clinical Development, Vol. 4, 149-158 (2017)を参照されたい）。そのようなＡＡＶハプロイドまたはポリプロイドウイルスカプシドも本発明に含まれる。例えば、ＡＡＶゲノムをカプシド内封入するＡＡＶハプロイドまたはポリプロイドビリオンを形成するために十分なウイルスカプシド構造タンパク質を有する単離されたＡＡＶビリオンであって、ＶＰ１が、表１に収載される任意のＡＡＶ血清型からのものであり、ＶＰ３が、ＢＢＢを横断する任意の血清型からのものである、単離されたＡＡＶビリオン。さらなる実施形態では、単離されたＡＡＶハプロイドまたはポリプロイドビリオンは、ＡＡＶカプシドタンパク質、ＶＰ１、ＶＰ１．５およびＶＰ３、からなる群からの少なくとも２つのウイルス構造タンパク質を有し、これら２つのウイルスタンパク質は、ＡＡＶゲノムをカプシド内封入するＡＡＶハプロイドまたはポリプロイドを形成するのに十分なものであり、ＶＰ１またはＶＰ１．５は、表１に収載されている任意のＡＡＶ血清型からのものであり、ＶＰ３は、ＢＢＢを横断する任意の血清型からのものである。例えば、ＶＰ１．５は、表１に収載されている任意のＡＡＶ血清型からのものであり、ＶＰ３は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ｒＡＡＶｒｈ１０、ｒＡＡＶｒｈ７４、ｒＡＡＶｒｈ３９、ｒＡＡＶｒｈ４３を含むがこれらに限定されないＢＢＢを横断するＡＡＶ血清型のいずれか１つまたは複数からのものであり得る。

一部の実施形態では、本発明のカプシドは、カプシドタンパク質ＶＰ１．５を含み、前記カプシドタンパク質ＶＰ１．５は、ＶＰ１と同じ血清型からのものでも、ＶＰ３カプシドタンパク質と同じ血清型からのものでもない。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＡＶハプロイドまたはポリプロイドカプシドタンパク質は、本明細書に記載のカプシドタンパク質ＶＰ２を含み得る。

一部の実施形態では、本発明のカプシドは、カプシドタンパク質ＶＰ２を含み、前記カプシドタンパク質ＶＰ２は、ＡＡＶ８血清型もしくは表１に収載されている任意の血清型、またはカプシドのＶＰ３タンパク質と同じ血清型、またはＶＰ３に使用されるようなものとは異なる血清型のうちのいずれかから選択される。一部の実施形態では、本明細書に記載される合理的ポリプロイドＡＡＶベクターは、カプシドタンパク質ＶＰ１．５を含み得る。ＶＰ１．５は、米国特許出願公開第２０１４／００３７５８５号に記載されており、ＶＰ１．５のアミノ酸配列は、本明細書で提供される。

したがって、ある特定の実施形態では、ウイルス構造タンパク質のうちの少なくとも１つ、例えば、ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３は、キメラウイルス構造タンパク質であり得、すなわち、１つより多くのタンパク質からのセグメントを含有し得る。一実施形態では、キメラウイルス構造タンパク質は、全て、同じ血清型からのものである。別の実施形態では、キメラウイルス構造タンパク質は、１つより多くの血清型からの成分で構成されているが、これらの血清型は、少なくとも１つの他の血清型と異なる。一実施形態では、ウイルス構造タンパク質は、キメラのものではない。一実施形態では、キメラＡＡＶ構造タンパク質は、イヌパルボウイルスからの構造アミノ酸を含まない。一実施形態では、キメラＡＡＶ構造タンパク質は、ｂ１９パルボウイルスからの構造アミノ酸を含まない。一実施形態では、キメラＡＡＶ構造タンパク質は、イヌパルボウイルスからの構造アミノ酸も、ｂ１９パルボウイルスからの構造アミノ酸も、含まない。一実施形態では、キメラＡＡＶ構造タンパク質は、ＡＡＶからの構造アミノ酸のみを含む。一部の実施形態では、合理的ポリプロイドＡＡＶベクターは、キメラＶＰ１タンパク質を含まない。一部の実施形態では、合理的ポリプロイドＡＡＶベクターは、キメラＶＰ１タンパク質、例えば、ＡＡＶ８血清型からのキメラＶＰ１タンパク質を含む。

一部の実施形態では、本明細書で開示される合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンは、典型的な３つのウイルス構造タンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３、より多くのウイルス構造タンパク質によって形成され得る（例えば、Wang, Q. et al., "Syngeneic AAV Pseudo-particles Potentiate Gene Transduction of AAV Vectors," Molecular Therapy: Methods and Clinical Development, Vol. 4, 149-158 (2017)を参照されたい）。そのようなウイルスカプシドも本発明に含まれる。例えば、ＡＡＶゲノムをカプシド内封入するＡＡＶビリオンを形成するのに十分なウイルスカプシド構造タンパク質を有する単離されたＡＡＶビリオンであって、ウイルスカプシド構造タンパク質のうちの少なくとも１つが、他のウイルスカプシド構造タンパク質とは異なり、各ウイルスカプシド構造タンパク質が、同じタイプのもののみである、単離されたＡＡＶビリオン。さらなる実施形態では、単離されたＡＡＶビリオンは、ＡＡＶカプシドタンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ１．５およびＶＰ３、からなる群から選択される少なくとも２つのウイルス構造タンパク質を有し、２つのウイルスタンパク質は、ＡＡＶゲノムをカプシド内封入するＡＡＶビリオンを形成するのに十分なものであり、存在するウイルス構造タンパク質のうちの少なくとも１つは、他のウイルス構造タンパク質とは異なる血清型からのものであり、ＶＰ１は、１つの血清型のみからのものであり、ＶＰ２は、１つの血清型のみからのものであり、ＶＰ３は、ＢＢＢを効率的に横断する１つの血清型のみからのものである。一実施形態では、合理的ポリプロイドは、ＶＰ１．５を含む。単に例示を目的として、ＶＰ１．５は、ＡＡＶ血清型８からのものであり得、ＶＰ３は、ＢＢＢを横断するＡＡＶ血清型、および／または代替的にＡＡＶｒｈ血清型からのものであり得る。

一部の実施形態では、１つの血清型（例えば、表１に収載されている血清型）からのＶＰ１カプシドタンパク質と、ＶＰ１のものとは異なる血清型からのＶＰ３カプシドタンパク質とを含有し、ＡＡＶ血清型がＢＢＢを効率的横断する、ビリオンのみが、産生される。例えば、ＶＰ１およびＶＰ２は、表１に収載されている任意の血清型、例えばＡＡＶ８血清型、からのものであり、ＶＰ３は、ＢＢＢを横断する代替血清型のみからのものである。他の実施形態では、ＶＰ１は、１つの血清型（例えば、ＡＡＶ８血清型）のみからのものであり、ＶＰ２およびＶＰ３は、別の血清型のみからのものであり、ＶＰ２およびＶＰ３カプシドタンパク質は、ＢＢＢを横断する血清型からのものである。別の実施形態では、ＶＰ１が、表１に収載されている血清型（例えば、ＡＡＶ８血清型）からのものであり、ＶＰ２が第２の血清型のみからのものであり、ＶＰ３のみが、ＢＢＢを横断するさらに別の血清型からのものである、粒子のみが産生され、本明細書ではポリプロイドＡＡＶ８ビリオンと呼ばれる。

一部の実施形態では、本明細書における技術は、１つまたは１つより多くの第１のＡＡＶ血清型からのものであるカプシドタンパク質ＶＰ１と、１つまたは１つより多くの第２のＡＡＶ血清型からのものであるカプシドタンパク質ＶＰ２とを含む、ＡＡＶカプシドであって、前記第１のＡＡＶ血清型の少なくとも１つが、いずれの組合せにおいても、前記第２のＡＡＶ血清型の少なくとも１つと異なり、ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３のうちの少なくとも１つが、ＢＢＢを横断する血清型からのものであるか、または代替的に、非霊長類ＡＡＶ血清型、例えば、アカゲザルＡＡＶ（ＡＡＶｒｈ）血清型からのものである、ＡＡＶカプシドも提供する。一部の実施形態では、いかなるキメラウイルス構造タンパク質もビリオン中に存在しない。
ＶＩ．ＶＰ１およびＶＰ３カプシドタンパク質への改変

本発明は、本発明のカプシドタンパク質、カプシド、ウイルスベクター、ＡＡＶ粒子組成物および／または医薬製剤と薬学的に許容される担体とを含む、医薬製剤であり得る組成物をさらに提供する。

一部の非限定的な例では、本発明は、３回回転軸ループ４（Opie et al., J. Viral. 77: 6995-7006 (2003)）におけるアミノ酸配列の改変を含むＡＡＶカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ１．５、ＶＰ２および／またはＶＰ３）、ならびに改変ＡＡＶカプシドタンパク質を含むウイルスカプシドおよびウイルスベクターを提供する。ＢＢＢを横断するＡＡＶ血清型からの少なくとも１つのＶＰ構造タンパク質、例えば、ＢＢＢを横断する血清型からのＶＰ３を含む、本明細書で開示される合理的ポリプロイドまたはポリプロイドＡＡＶベクターは、全身またはくも膜下腔内送達後に親ＡＡＶベクターと比較して異なる形質導入プロファイルを有し、驚くべきことに、くも膜下腔内もしくは全身送達後にＢＢＢを横断する能力の増大、ならびに／またはＢＢＢの内皮細胞におよび／もしくはＢＢＢを横断する血液細胞に形質導入する能力の増大を有する。例えば、本明細書において実施例で開示されるＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドＡＡＶベクターは、全身投与後に全身性形質導入の有意な増加を示し、したがって、それによって各標的組織、例えば、骨格筋、心筋などへの形質導入が増加されることになる。

ある実施形態では、改変ＡＡＶカプシドは、定方向進化によって細胞型特異的ベクターを生じさせるようにＤＮＡシャフリングによって作出されるＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３で構成され得る。ＡＡＶに関するＤＮＡシャフリングは、一般に、Li, W. et al., Mol. Ther. 16(7): 1252-12260 (2008)に記載されており、この参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。ある実施形態では、ＤＮＡシャフリングは、２つもしくはそれより多くの異なるＡＡＶ血清型、ＡＡＶキメラまたは他のＡＡＶからのカプシド遺伝子ＤＮＡ配列を使用してＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３を作出するために使用され得る。ある実施形態では、ハプロイドＡＡＶは、ＤＮＡシャフリングにより作出されたＶＰ１、ＤＮＡシャフリングにより作出されたＶＰ２、および／またはＤＮＡシャフリングにより作出されたＶＰ３で構成され得る。一部の実施形態では、本明細書で開示の合理的ポリプロイドビリオンのＶＰ１タンパク質は、改変されており、ＶＰ３は、改変タンパク質ではない。一部の実施形態では、合理的ポリプロイドビリオンは、改変ＶＰ３タンパク質を含み、ＶＰ１は、改変されていない。一部の実施形態では、本明細書で開示される合理的ポリプロイドビリオンは、改変ＶＰ１タンパク質および改変ＶＰ３タンパク質を含む。

改変ＶＰ１タンパク質の例としては、ＶＰ１タンパク質におけるペプチドの挿入が挙げられるが、これらに限定されない。そのようなペプチドには、これらに限定されないが、本明細書で開示のＣＮＳまたはＰＮＳの細胞を標的とするペプチドなどの標的化ペプチドであるペプチドが含まれる。一部の実施形態では、標的化ペプチドは、ＢＢＢに浸透するペプチド、例えば、米国特許第８，７４８，５６７号または同第９，７５７，４７０号において開示されているようなＲＶＧ－９Ｒペプチドまたはそのバリアントであり、これらの参考特許文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、ペプチドは、アミノ酸残基４５０～４８０の間、ポリプロイドビリオンのネイティブＡＡＶ８ＶＰ１カプシドタンパク質および／もしくはＡＡＶ８ＶＰ２カプシドタンパク質のアミノ酸残基５７５～６００（ＡＡＶ８ＶＰ１番号付けに基づく番号付け）または別のＡＡＶからのカプシドタンパク質の対応する位置、から選択される任意の位置に挿入され得る、またはその位置に／で置換され得る。

別の実施形態では、ＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３をコードする核酸は、ＤＮＡシャフリングによって作出され得る。一実施形態では、ＤＮＡシャフリングにより作出される第１の核酸は、ＶＰ１をコードすることになる。この同じ実施形態では、ＤＮＡシャフリングにより作出される第２の核酸は、ＶＰ２およびＶＰ３をコードすることになる。別の実施形態では、ＤＮＡシャフリングにより作出される第１の核酸は、ＶＰ１をコードすることになる。この同じ実施形態では、ＤＮＡシャフリングにより作出される第２の核酸は、ＶＰ２をコードすることになり、第３の核酸は、ＶＰ３をコードすることになる。さらなる実施形態では、ＤＮＡシャフリングにより作出される第１の核酸は、ＶＰ１およびＶＰ２をコードすることになり、ＤＮＡシャフリングにより作出される第２の核酸は、ＶＰ３をコードすることになる。追加の実施形態では、ＤＮＡシャフリングにより作出される第１の核酸は、ＶＰ１およびＶＰ３をコードすることになり、ＤＮＡシャフリングにより作出される第２の核酸は、ＶＰ２をコードすることになる。

本発明の実施形態では、本明細書で開示される合理的ポリプロイドベクターは、ＣＮＳおよび／または末梢神経系（ＰＮＳ）における１つまたは複数の組織への形質導入の増加を示す。一部の実施形態では、本明細書で開示される合理的ポリプロイドベクターは、血液脳関門を効率的に横断する能力を欠いている非合理的ポリプロイドＡＡＶ粒子と比べて、全身またはくも膜下腔内投与後にｉｎｖｉｖｏで対象の皮質、線条体、視床、髄質、海馬、小脳および脊髄のうちの１つまたは複数への増強された形質導入を示す。一部の実施形態では、本明細書で開示される合理的ポリプロイドまたはポリプロイドベクターは、脳および／または脊髄において親ＡＡＶベクターと比較して少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％、または２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、１０００倍の、もしくは１０００倍より高い形質導入レベルを有する。

特定の実施形態では、本発明の改変ＡＡＶカプシドタンパク質は、３回回転軸ループ４（ネイティブＡＡＶ８ＶＰ１カプシドタンパク質のアミノ酸５７５～６００位の間［５７５位および６００位を含む］、または別のＡＡＶからのカプシドタンパク質の対応する領域）のアミノ酸配列の１つまたは複数の改変を含む。本明細書で使用される場合、アミノ酸配列の「改変」は、置換、挿入および／または欠失を含み、これらの各々に１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれより多くのアミノ酸が関与し得る。特定の実施形態では、改変は、置換である。例えば、特定の実施形態では、１つのＡＡＶからの３回回転軸ループ４からの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、またはそれより多くのアミノ酸が、アミノ酸残基４５０～４８０の間、ポリプロイドビリオンのネイティブＡＡＶ８ＶＰ１カプシドタンパク質および／もしくはＡＡＶ８ＶＰ２カプシドタンパク質のアミノ酸残基５７５～６００（ＡＡＶ８ＶＰ１番号付けに基づく番号付け）または別のＡＡＶからのカプシドタンパク質の対応する位置、から選択される任意の位置に置換され得る。一部の実施形態では、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、またはそれより多くのアミノ酸は、アミノ酸残基４５０～４８０の間、合理的ポリプロイドビリオンのネイティブＡＡＶ８ＶＰ１および／またはＡＡＶ８ＶＰ２ウイルス構造タンパク質のアミノ酸残基５７５～６００、から選択される任意の位置に挿入され得る。一部の実施形態では、挿入は、標的化ペプチド、またはＢＢＢに浸透するペプチドを含むがこれらに限定されない、ペプチドである。一部の実施形態では、挿入は、米国特許第８，７４８，５６７号または同第９，７５７，４７０号において開示されているようなＲＶＧ－９Ｒペプチドであり、これらの参考特許文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。しかし、本発明の改変ウイルスカプシドは、１つのＡＡＶカプシドからのアミノ酸が別のＡＡＶカプシドに置換されているＡＡＶカプシドに限定されず、置換および／または挿入アミノ酸は、いずれの供給源からのものであってもよく、さらに、天然に存在することもあり、または部分的にもしくは完全に合成のものであることもある。

本明細書に記載の、いくつかのＡＡＶからのカプシドタンパク質の核酸およびアミノ酸配列は、当技術分野において公知である。したがって、ネイティブＡＡＶ８カプシドタンパク質のアミノ酸５７５～６００位（５７５位および６００位を含む）またはアミノ酸５８５～５９０位（５８５位および５９０位を含む）に「対応する」アミノ酸は、任意の他のＡＡＶについて（例えば、配列アラインメントを使用することにより）容易に決定することができる。

一部の実施形態では、本発明は、本発明の改変カプシドタンパク質が、現在公知のまたは後に発見される任意のＡＡＶのカプシドタンパク質を改変することにより産生され得ることを企図している。さらに、改変されることになるＡＡＶカプシドタンパク質は、天然に存在するＡＡＶカプシドタンパク質（例えば、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ３ａもしくは３ｂ、ＡＡＶ９カプシドタンパク質、または表１に示されているＡＡＶのいずれかのもの）であり得るが、そのように限定されない。ＡＡＶカプシドタンパク質に対する様々なマニピュレーションが当技術分野において公知であり、本発明が、天然に存在するＡＡＶカプシドタンパク質の改変に限定されないことは、当業者には理解されるであろう。例えば、改変されることになるカプシドタンパク質は、天然に存在するＡＡＶと比較して既に変更されていることがある（例えば、天然に存在するＡＡＶカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ３ａもしくは３ｂ、ＡＡＶ９、または現在公知のもしくは後に発見される任意の他のＡＡＶから誘導される）。そのようなＡＡＶカプシドタンパク質も、本発明の範囲内である。

例えば、一部の実施形態では、改変されることになるＡＡＶカプシドタンパク質は、ネイティブＡＡＶ８カプシドタンパク質配列のアミノ酸２６４の直ぐ後にアミノ酸挿入を含むことがあり（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ２００６／０６６０６６を参照されたい）および／またはＰＣＴ公開ＷＯ２００９／１０８２７４に記載されているような変更されたＨＩループを有するＡＡＶであることがあり、および／または精製を容易にするためにポリＨｉｓ配列を含有するように改変されているＡＡＶであることがある。別の説明に役立つ例として、ＡＡＶカプシドタンパク質は、挿入または置換としてその中に組み込まれた配列を標的とするペプチドを有することがある。さらに、ＡＡＶカプシドタンパク質は、カプシドタンパク質に置換および／または挿入された別のＡＡＶからの大きいドメインを含むことがある。

したがって、特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質、例えば、改変されることになるＶＰ３タンパク質は、天然に存在するＡＡＶから誘導され得るが、カプシドタンパク質に挿入および／もしくは置換されるならびに／または１つもしくは複数のアミノ酸の欠失により変更された１つまたは複数の外来配列（例えば、ネイティブウイルスにとって外来性である）をさらに含むことがある。

一部の実施形態では、合理的ポリプロイドビリオンは、ＡＡＶアカゲザル改変または変異ＶＰ３構造タンパク質を含み、ＶＰ１およびＶＰ２は、ＡＡＶアカゲザル血清型ではない。実施形態のある特定の態様では、変異ＶＰ３カプシドタンパク質は、変異ＡＡＶｒｈ１０ＶＰ３または変異ＡＡＶｒｈ７４ＶＰ３ウイルス構造タンパク質である。実施形態のある特定の態様では、ＡＡＶアカゲザル変異ＶＰ３は、Ｎ２６３、Ｇ２６４、Ｔ２６５、Ｓ２６６、Ｇ２６８、Ｔ２７０、Ｔ２７４、Ｅ５３３、Ｒ７２７およびＮ７３７からなる群から選択されるアミノ酸に対応するアミノ酸における少なくとも１つの変異を含み、この場合の全てのアミノ酸位置は、ネイティブＶＰ３に対応する。一部の実施形態では、ＡＡＶアカゲザル変異ＶＰ３ウイルス構造タンパク質は、ＡＡＶｒｈ１０のネイティブＶＰ１配列番号付けのアミノ酸位置Ｎ２６３、Ｇ２６４、Ｔ２６５、Ｓ２６６、Ｇ２６８、Ｔ２７０、Ｔ２７４、Ｅ５３３、Ｒ７２７およびＮ７３７に対応するアミノ酸位置における少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または全ての変異を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶアカゲザルｒｈ１０変異ＶＰ３は、Ｎ２６３Ｓ、Ｇ２６４Ａ、Ｔ２６５Ｓ、Ｓ２６６Ｔ、Ｇ２６８Ａ、Ｔ２７０ｄｅｌ、Ｔ２７４Ｈ、Ｅ５３３Ｋ、Ｒ７２７ＨおよびＮ７３７Ｐからなる群から選択される変異を含む。例示的な実施形態では、ＡＡＶアカゲザルｒｈ１０変異ＶＰ３は、Ｎ２６３Ｓ、Ｇ２６４Ａ、Ｔ２６５Ｓ、Ｓ２６６Ｔ、Ｇ２６８Ａ、Ｔ２７０ｄｅｌ、Ｔ２７４Ｈ、Ｅ５３３Ｋ、Ｒ７２７ＨおよびＮ７３７Ｐ（ＡＡＶｒｈ１０ＬＰ２、またはｒｈ１０ＬＰ２）を含む。一部の実施形態では、改変ＡＡＶｒｈ１０ＶＰ３構造タンパク質は、配列番号１４（ｒｈ１０－ＬＰ２ＶＰ３）のアミノ酸、または配列番号１４に対して少なくとも８５％、９０％、９５％もしくは９８％の配列同一性を有するタンパク質のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、改変ＡＡＶｒｈ１０ＶＰ３構造タンパク質は、配列番号１４（ｒｈ１０－ＬＰ２ＶＰ３）のアミノ酸、または配列番号１４に対して少なくとも８５％、９０％、９５％もしくは９８％の配列同一性を有するタンパク質のアミノ酸を含む。

実施形態の一部の態様では、ＡＡＶアカゲザル変異ＶＰ３は、Ｎ２６３、Ｇ２６４、Ｔ２６５、Ｓ２６６、Ｇ２６８、Ｔ２７０、Ｔ２７４、Ｅ５３３、Ｒ７２６およびＮ７３６からなる群から選択されるアミノ酸に対応するアミノ酸における変異を含み、この場合の全てのアミノ酸位置は、ＡＡＶｒｈ７４のネイティブＶＰ１配列番号付けに対応する。一部の実施形態では、ＡＡＶアカゲザル変異ＶＰ３ウイルス構造タンパク質は、ＡＡＶｒｈ７４のネイティブＶＰ１配列番号付けのアミノ酸位置Ｎ２６３、Ｇ２６４、Ｔ２６５、Ｓ２６６、Ｇ２６８、Ｔ２７０、Ｔ２７４、Ｅ５３３、Ｒ７２６およびＮ７３６に対応するアミノ酸位置における少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または全ての変異を含む。

一部の実施形態では、ＡＡＶアカゲザルｒｈ７４変異ＶＰ３は、Ｎ２６３Ｓ、Ｇ２６４Ａ、Ｔ２６５Ｓ、Ｓ２６６Ｔ、Ｇ２６８Ａ、Ｔ２７０ｄｅｌ、Ｔ２７４Ｈ、Ｅ５３３Ｋ、Ｒ７２６ＨおよびＮ７３６Ｐからなる群から選択される変異を含む。例示的な実施形態では、ＡＡＶアカゲザルｒｈ７４変異ＶＰ３は、Ｎ２６３Ｓ、Ｇ２６４Ａ、Ｔ２６５Ｓ、Ｓ２６６Ｔ、Ｇ２６８Ａ、Ｔ２７０ｄｅｌ、Ｔ２７４Ｈ、Ｅ５３３Ｋ、Ｒ７２６ＨおよびＮ７３６Ｐ（ＡＡＶｒｈ７４ＬＰ２、またはｒｈ７４ＬＰ２）を含む。本明細書では、番号付けは、ｒｈ７４ＶＰ１番号付けに基づく。一部の実施形態では、改変ＡＡＶｒｈ７４ＶＰ３構造タンパク質は、配列番号１５（ｒｈ７４ｖｖ－ＬＰ２ＶＰ３）のアミノ酸、または配列番号１５に対して少なくとも８５％、９０％、９５％もしくは９８％の配列同一性を有するタンパク質のアミノ酸を含む。実施形態の一部の態様では、変異は、ループ１（ＶＲＩ）に、またはＶＲ－ＩＶに、またはＶＰ３ウイルス構造タンパク質の最も端にあるＣ末端ドメインに位置する。実施形態の一部の態様では、変異は、これらの領域のうちの少なくとも２つに位置する。

実施形態のさらに別の態様では、変異ＡＡＶｒｈ７４ＶＰ３ウイルス構造タンパク質は、５８１位のＷまたはトリプトファンが２個の後続のバリン（ＶＶ）残基に置き換えられている変異をさらに含む。Ｗ５８１ＶＶ、Ｎ２６３Ｓ、Ｇ２６４Ａ、Ｔ２６５Ｓ、Ｓ２６６Ｔ、Ｇ２６８Ａ、Ｔ２７０ｄｅｌ、Ｔ２７４Ｈ、Ｅ５３３Ｋ、Ｒ７２６ＨおよびＮ７３６Ｐで構成されるｒｈ７４ＶＰ３変異は、同義的にＡＡＶｒｈ７４ＶＶＬＰ２（またはｒｈ７４ＶＶＬＰ２）として表される。一部の実施形態では、本発明の合理的ポリプロイドビリオンのウイルス構造タンパク質ＶＰ３は、ｒｈ７４ＶＶＬＰ２を含む。本発明者らは、ｒｈ１０ＶＰ３ＬＰ２、ｒｈ７４ＶＰ３ＬＰ２、およびｒｈ７４ＶＶＰ３ＬＰ２を含むポリプロイドビリオンを合理的に設計し、それらの抗原性、例えば、中和抗体から逃れること、および／または液性免疫応答を含む、それらの特性を試験した。一部の実施形態では、本明細書で開示の方法および組成物における使用のための合理的ＡＡＶポリプロイドビリオンは、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ｖｖ、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０ＬＰ２、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ＬＰ２、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ＬＰ２ｖｖのいずれかから選択され、交換可能に、ハプロイドＡＡＶ８－８－ｒｈ１０、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ｖｖ、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０ＬＰ２、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ＬＰ２、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ＬＰ２ｖｖビリオンと呼ばれる。

本発明の全ての態様では、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３ウイルス構造タンパク質は、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３カプシドタンパク質と交換可能に使用される。別の言い方をすれば、用語「ウイルスカプシドタンパク質」および「ウイルス構造タンパク質」は、本明細書では交換可能に使用され、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３ウイルス構造タンパク質（または構造ウイルスタンパク質）を指す。

したがって、本明細書で特異的ＡＡＶカプシドタンパク質（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｒＡＡＶｒｈ１０、ｒＡＡＶｒｈ７４、ｒＡＡＶｒｈ３９、ｒＡＡＶｒｈ４のいずれかから選択されるＶＰ３タンパク質、または表１で示されるＡＡＶのいずれかからのＶＰ１もしくはＶＰ２カプシドタンパク質、など）に言及する場合、それは、ネイティブカプシドタンパク質はもちろん、本発明の改変以外の変更があるカプシドタンパク質も包含するように意図されている。そのような変更には、置換、挿入および／または欠失が含まれる。特定の実施形態では、カプシドタンパク質は、ネイティブＡＡＶカプシドタンパク質配列と比較して（本発明の挿入以外に）それに挿入された１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個もしくは２０個、２０個未満、３０個未満、４０個未満、５０個未満、６０個未満、または７０個未満のアミノ酸を含む。本発明の実施形態では、カプシドタンパク質は、ネイティブＡＡＶカプシドタンパク質配列と比較して（本発明によるアミノ酸置換以外に）１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０、２０未満、３０未満、４０未満、５０未満、６０未満、または７０未満のアミノ酸置換を含む。本発明の実施形態では、カプシドタンパク質は、ネイティブＡＡＶカプシドタンパク質配列と比較して（本発明のアミノ酸欠失以外に）１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個もしくは２０個、２０個より多く、３０個より多く、４０個より多く、５０個より多く、６０個より多く、または７０個より多くのアミノ酸の欠失を含む。

本明細書で開示される合理的ポリプロイドベクターのＶＰ１およびＶＰ２についての例示的血清型としてＡＡＶ血清型８を使用すると、Ｍ１がＶＰ１スタートコドンであり、Ｔ１３８がＶＰ２スタートコドンであり、Ｍ２０３およびＭ２１１がＶＰ３スタートコドンである。概してＭ１およびＴ１３８の置換による、スタートコドンの欠失は、ＶＰ１およびＶＰ２の発現を作動不能にさせるが、ＶＰ３スタートコドンの同様の欠失は、それに足るものではない。これは、ウイルスカプシドＯＲＦが、様々な強度を有する非常に多くのＡＴＧコドンを開始コドンとして含有するためである。したがって、ＶＰ３を発現しない構築物を設計する場合、代替ＶＰ３種が産生されないことを確実にするように注意しなければならない。Ｍ２０４およびＭ２１２のどちらかの消失が必要であるＶＰ３に関して、またはＶＰ３ではなくＶＰ２が所望される場合には、Ｍ２０４およびＭ２１２を欠失させることが、概して最良の手法である（Warrington, K. H. Jr., et al., J. of Virol. 78(12): 6595-6609 (June 2004)）。これは、変異、例えば置換、または当技術分野において公知の他の手段により、行われ得る。他の血清型における対応するスタートコドンを容易に決定することができ、追加のＡＴＧ配列、例えば、ＶＰ３における追加のＡＴＧ配列が、代替開始コドンとして役立ち得るかどうかも、容易に決定することができる。

したがって、例えば、用語「ＡＡＶ８カプシドタンパク質」には、ネイティブＡＡＶ８カプシドタンパク質配列（ネイティブＡＡＶ８ＶＰ１カプシドタンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ５１３８５２．１、タンパク質ＩＤ：ＡＡＮ０３８５６．１を参照されたい）を有するＡＡＶカプシドタンパク質はもちろん、ネイティブＡＡＶ８カプシドタンパク質配列に置換、挿入および／または欠失（上記の段落で説明されたような）を含むものも含まれる。

特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ネイティブＡＡＶカプシドタンパク質配列を有するか、またはネイティブＡＡＶカプシドタンパク質配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％類似しているもしくは同一であるアミノ酸配列を有する。例えば、特定の実施形態では、「ＡＡＶ８」カプシドタンパク質は、ネイティブＡＡＶ８カプシドタンパク質配列はもちろん、ネイティブＡＡＶ８カプシドタンパク質配列と少なくとも約７５％、８０％＜８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％類似しているもしくは同一である配列も包含する。

２つまたはそれより多くのアミノ酸配列間の配列類似性または同一性を決定する方法は、当技術分野において公知である。配列類似性または同一性は、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2,482 (1981)の局所配列同一性アルゴリズムを含むがこれに限定されない当技術分野において公知の標準的な技法を使用して、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48,443 (1970)の配列同一性アラインメントアルゴリズムにより、Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444 (1988)の類似性検索方法により、これらのアルゴリズムのコンピュータによるインプリメンテーション（ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓＳｏｆｔｗａｒｅＰａｃｋａｇｅ、ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ、５７５ＳｃｉｅｎｃｅＤｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）、Devereux et al., Nucl. Acid Res. 12, 387-395 (1984)により記載されたＢｅｓｔＦｉｔ配列プログラムにより、または検査により、決定することができる。

別の好適なアルゴリズムは、Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410, (1990)およびKarlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5873-5787 (1993)に記載されている、ＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Altschul et al., Methods in Enzymology, 266, 460-480 (1996)から得られたＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２プログラムである；blast.wustl/edu/blast/README.html。ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２は、必要に応じてデフォルト値に設定される、いくつかの検索パラメーターを使用する。パラメーターは、動的値であり、プログラム自体によって、特定の配列の組成、および目的の配列が検索される特定のデータベースの構成に依存して確立されるが、値を、感度を高めるように調整することができる。

さらに、追加の有用なアルゴリズムは、Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402により報告されているようなギャップ付きＢＬＡＳＴである。

本発明は、本発明の改変ＡＡＶカプシドタンパク質を含む、それから本質的になる、またはそれからなる、ウイルスカプシドも提供する。特定の実施形態では、ウイルスカプシドは、パルボウイルスカプシドであり、パルボウイルスカプシドは、さらに、自律的パルボウイルスカプシドまたはディペンドウイルスカプシドであり得る。必要に応じて、ウイルスカプシドは、ＡＡＶカプシドである。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ｒＡＡＶｒｈ１０、ｒＡＡＶｒｈ７４、ｒＡＡＶｒｈ３９、ｒＡＡＶｒｈ４３のいずれかから選択されるＶＰ３タンパク質と、表１に示されている、もしくは別様に公知の、もしくは後に発見される、任意の他のＡＡＶからのＶＰ１および／もしくはＶＰ２とを含み、ならびに／または前述のもののいずれかから１つもしくは複数の挿入、置換および／もしくは欠失により誘導される。

本発明の実施形態では、単離されたＡＡＶビリオン、またはＡＡＶビリオンの実質的に均一な集団は、１つの血清型のＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３を発現する１つの核酸ヘルパープラスミドと、別の血清型のＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３を発現する別の核酸ヘルパープラスミドとの混合物の発現の産物ではなく、そのような発現は、「クロスドレッシング」と呼ばれる。

本発明の実施形態では、単離されたＡＡＶビリオンは、モザイクカプシドを含まず、ＡＡＶビリオンの実質的に均一な集団は、モザイクカプシドの実質的に均一な集団を含まない。
ＶＩ．ＣＮＳ障害および疾患を処置するための合理的ポリプロイドＡＡＶベクター

一部の実施形態では、合理的ポリプロイドベクターは、所望の標的組織上に存在する細胞表面分子と相互作用するようにウイルスカプシドを方向付ける標的化配列（標的ペプチドとも呼ばれる）を含む（例えば、ウイルスカプシド内に置換または挿入された）カプシドを含み得る（例えば、国際特許公開番号ＷＯ００／２８００４およびHauck et al., (2003) J. Virology 77:2768-2774；Shi et al., Human Gene Therapy 17:353-361 (2006)［ＡＡＶカプシドサブユニットの５２０および／または５８４位におけるインテグリン受容体結合モチーフＲＧＤの挿入を記載している］；および米国特許第７，３１４，９１２号［ＡＡＶ２カプシドサブユニットのアミノ酸４４７、５３４、５７３および５８７位の後にＲＧＤモチーフを含有するＰ１ペプチドの挿入を記載している］を参照されたい）。挿入を許容するＡＡＶカプシドサブユニット内の他の位置は、当技術分野において公知である（例えば、Grifman et al., Molecular Therapy 3:964-975 (2001)により記載されている４４９および５８８位）。

例えば、本発明のウイルスカプシドの一部は、目的のほとんどの標的組織（例えば、肝臓、骨格筋、心臓、横隔膜筋、腎臓、脳、胃、腸、皮膚、内皮細胞、および／または肺）への比較的非効率的なトロピズムを有する。有利には、標的化配列をこれらの低形質導入ベクターに組み込んで、それによって所望のトロピズム、および必要に応じて特定の組織に対する選択的トロピズムをウイルスカプシドに付与することができる。標的化配列を含むＡＡＶカプシドタンパク質、カプシドおよびベクターは、例えば、国際特許公開ＷＯ００／２８００４に記載されている。別の可能性として、Wang et al., Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35:225-49 (2006)により記載されているような１つまたは複数の天然に存在しないアミノ酸を、低形質導入ベクターを所望の標的組織に向け直す手段として、ＡＡＶカプシドサブユニットの直交部位に組み込むことができる。有利には、これらの非天然アミノ酸を使用してＡＡＶカプシドタンパク質に目的の分子を化学的に連結させることができ、それらには、グリカン（マンノース－樹状細胞標的化）；特定のがん細胞型への標的送達のためのＲＧＤ、ボンベシンもしくは神経ペプチド；特定の細胞表面受容体、例えば、増殖因子受容体、インテグリンなど、に標的化されたファージディスプレイから選択されるＲＮＡアプタマーまたはペプチドが含まれるが、これらに限定されない。アミノ酸を化学的に改変する方法は、当技術分野において公知である（例えば、Greg T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, 1^st edition, Academic Press, 1996を参照されたい）。

代表的な実施形態では、標的化配列は、特定の細胞型に感染を方向付けるウイルスカプシド配列（例えば、自律的なパルボウイルスカプシド配列、ＡＡＶカプシド配列、または任意の他のウイルスカプシド配列）であり得る。

Ｂ１９は、グロボシドをその受容体として使用して初代赤血球前駆細胞に感染する（Brown et al., (1993) Science 262:114）。Ｂ１９の構造は、８Åの分解能まで決定されている（Agbandje-McKenna et al., (1994) Virology 203:106）。グロボシドに結合するＢ１９カプシドの領域は、βバレル構造ＥとＦの間のループアウト領域（Chipman et al., (1996) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 93:7502）である、アミノ酸３９９～４０６の間にマッピングされている（Chapman et al., (1993) Virology 194:419）。したがって、Ｂ１９カプシドのグロボシド受容体結合ドメインをＡＡＶカプシドタンパク質内に置換して、それを含むウイルスカプシドまたはウイルスベクターを、赤血球系細胞に標的化することができる。

代表的な実施形態では、外来性標的化配列は、改変ＡＡＶカプシドタンパク質を含むウイルスカプシドまたはウイルスベクターのトロピズムを変更するペプチドをコードする任意のアミノ酸配列であり得る。特定の実施形態では、標的化ペプチドまたはタンパク質は、天然に存在することもあり、または代替的に、完全にもしくは部分的に合成のものであることもある。例示的な標的化配列としては、細胞表面受容体および糖タンパク質に結合するリガンドおよび他のペプチド、例えば、ＲＧＤペプチド配列、ブラジキニン、ホルモン、ペプチド増殖因子（例えば、上皮増殖因子、神経増殖因子、線維芽細胞増殖因子、血小板由来の増殖因子、インスリン様増殖因子ＩおよびＩＩなど）、サイトカイン、メラニン細胞刺激ホルモン（例えば、α、βまたはγ）、神経ペプチドおよびエンドルフィンなど、ならびにそれらの同族受容体に細胞を標的化する能力を保持するそれらの断片が挙げられる。他の説明に役立つペプチドおよびタンパク質としては、サブスタンスＰ、ケラチノサイト増殖因子、神経ペプチドＹ、ガストリン放出ペプチド、インターロイキン２、ニワトリ卵白リゾチーム、エリスロポエチン、ゴナドリベリン、コルチコスタチン、β－エンドルフィン、ロイシンエンケファリン、リモルフィン、α－ネオ－エンケファリン、アンジオテンシン、ニューマジン、血管作動性腸管ペプチド、ニューロテンシン、モチリン、および上記のこれらの断片が挙げられる。さらに、さらなる代替案として、毒素（例えば、破傷風毒素またはヘビ毒、例えばα－ブンガロトキシンなど）からの結合ドメインが標的配列としてカプシドタンパク質内に置換され得る。さらにさらなる代表的な実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、Cleves(Current Biology 7:R318 (1997))により記載されているような「非古典的」インポート／エクスポートシグナルペプチド（例えば、線維芽細胞増殖因子－１および－２、インターロイキン１、ＨＩＶ－１Ｔａｔタンパク質、ヘルペスウイルスＶＰ２２タンパク質など）のＡＡＶカプシドタンパク質内への置換によって改変され得る。特定の細胞による取込みを指令するペプチドモチーフも包含され、例えば、ＦＶＦＬＰペプチドモチーフ（配列番号２６）は、肝臓細胞による取込みを誘発する。

ファージディスプレイ技法はもちろん、当技術分野において公知の他の技法も、目的の任意の細胞型を認識するペプチドを同定するために使用され得る。

標的化配列は、受容体（例えば、タンパク質、炭水化物、糖タンパク質またはプロテオグリカン）を含む、細胞表面結合部位を標的とする任意のペプチドをコードし得る。細胞表面結合部位の例としては、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、および他のグリコサミノグリカン；ムチン、糖タンパク質およびガングリオシド上に見られるシアル酸部分；ＭＨＣＩ糖タンパク質；マンノース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチルグルコサミン、フコース、ガラクトースなどをはじめとする、膜糖タンパク質上に見られる炭水化物成分が挙げられるが、これらに限定されない。

特定の実施形態では、ヘパラン硫酸（ＨＳ）またはヘパリン結合ドメインは、ウイルスカプシド内に（例えば、そうしなければＨＳまたはヘパリンに結合しないＡＡＶ内に）置換される。ＨＳ／ヘパリン結合が、アルギニンおよび／またはリシンを多く含む「塩基性パッチ」により媒介されることは、当技術分野において公知である。例示的な実施形態では、「Ｂ」が塩基性残基であり、Ｘが中性および／または疎水性である、モチーフＢＸＸＢに続く配列。非限定的な例として、ＢＸＸＢは、ＲＧＮＲ（配列番号２７）である。特定の実施形態では、ＢＸＸＢで、ネイティブＡＡＶ２カプシドタンパク質におけるアミノ酸２６２から２６５位まで、または別のＡＡＶのカプシドタンパク質における対応する位置が置換される。

さらに、さらなる代替案として、標的化配列は、細胞への侵入を目的とする別の分子への化学的カップリングに使用され得る（例えば、それらのＲ基によって化学的にカップリングされ得るアルギニンおよび／またはリシン残基を含み得る）ペプチドであり得る。

別の選択肢として、本発明のＡＡＶカプシドタンパク質またはウイルスカプシドは、ＷＯ２００６／０６６０６６に記載されているような変異を含み得る。例えば、カプシドタンパク質は、ネイティブＡＡＶ２カプシドタンパク質のアミノ酸２６３、７０５、７０８および／もしくは７１６位における選択的アミノ酸置換、または別のＡＡＶからのカプシドタンパク質における対応する変化を含み得る。加えて、または代替的に、代表的な実施形態では、カプシドタンパク質、ウイルスカプシドまたはベクターは、ＡＡＶ２カプシドタンパク質のアミノ酸２６４位の直ぐ後に選択的アミノ酸挿入を含むか、または他のＡＡＶからのカプシドタンパク質における対応する変化を含む。「アミノ酸Ｘ位の直ぐ後に」とは、挿入が、示されているアミノ酸位置の直後にあることが意図されている（例えば、「アミノ酸２６４位の後に」は、２６５位における点挿入、または例えば２６５～２６８位などの、より大きい挿入を示す）。本発明の上述の実施形態を使用して、異種核酸を本明細書に記載の細胞または対象に送達することができる。

一部の実施形態では、本明細書で開示される合理的ポリプロイドまたはハプロイドベクターを使用して、ＣＮＳおよび／または末梢神経系における神経または非神経細胞をはじめとする細胞に、異種核酸を送達することができる。一部の実施形態では、本明細書で開示される合理的ポリプロイドまたはハプロイドベクターは、ＣＮＳ組織もしくは細胞におけるおよび／またはＰＮＳ組織もしくは細胞における遺伝子の異常な遺伝子発現に関連する医学的状態または疾患の処置に有用である。ＣＮＳ細胞は、例えば、ニューロン、星状膠細胞、傍突起膠細胞、上衣細胞またはミクログリア細胞であり得る。ＣＮＳ組織は、例えば、ＣＮＳの頸髄、胸（throratic）髄および腰髄、ならびに髄質および脈絡叢を含む、対象の皮質、線条体、視床、髄質、海馬、中脳、プルキンエ組織、小脳および脊髄よりも多くのものであり得る。

例えば、本明細書で開示される合理的ポリプロイドまたはハプロイドベクターを使用して、脳のがんおよび脳がん（例えば、神経膠芽腫）、神経変性疾患をはじめとする、脳疾患を処置することができ、神経変性疾患には、これらに限定されないが、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性（amytrophic）側索硬化症（ＡＬＳ）、ドーパミントランスポーター欠損症候群（単一遺伝子、ＤＡＴ１／ＳＬＣ６Ａ３、の機能喪失型変異によって引き起こされる小児パーキンソニズムの一種）が含まれる。本明細書で開示される合理的ポリプロイドまたはハプロイドベクターを使用して処置されることに有用なＣＮＳの他の医学的状態または疾患には、例えば、神経学的疾患および／または障害が含まれる。そのような神経変性疾患および／または障害としては、例えば、ドーパミントランスポーター欠損症候群、注意欠陥／多動性障害（ＡＤＨＤ）、双極性障害、癲癇、多発性硬化症、タウオパチー、クラッベ病、副腎白質ジストロフィー、運動ニューロン疾患、脳性麻痺、バッテン病、ゴーシェ病、テイ・サックス病、レット症候群、サンドホフ病、シャルコー・マリー・トゥース病、アンジェルマン症候群、カナバン病、遅発型小児性神経セロイドリポフスチン沈着症、ムコ多糖症ＩＩＩＡ、ムコ多糖症ＩＩＩＢ、異染性白質ジストロフィー、遺伝性リソソーム蓄積症、例えばニーマン・ピック病Ｃ１型、および／または神経セロイドリポフスチン症、例えばバッテン病、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核症候群、および脳がん（星状細胞腫および神経膠芽腫を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の一部の好ましい実施形態では、遺伝子は、治療用発現産物、好ましくは、必要に応じてＣＮＳでの、異常な遺伝子発現に関連する疾患または状態の処置における使用に好適な治療用ポリペプチド、をコードする。

一部の実施形態では、本明細書で開示の合理的ポリプロイドまたはハプロイドベクターを使用して、ＣＮＳ疾患の処置に有用な治療用発現産物を発現させることができる。用語「ＣＮＳ疾患」は、原理上は、当業者により理解されている。この用語は、ＣＮＳへの、特にＣＮＳ細胞への、活性化合物の投与により処置可能および／または予防可能な疾患に関する。一部の実施形態では、ＣＮＳ疾患は、神経変性疾患および／または障害である。

非限定的な例として、ＣＮＳ疾患は、以下のものから選択され得る：透明中隔欠損症、酸性リパーゼ病、酸性マルターゼ欠損症、後天性てんかん性失語症、急性散在性脳脊髄炎、注意欠如多動症（ＡＤＨＤ）、アディー瞳孔、アディー症候群、副腎白質ジストロフィー、脳梁欠損症、失認、アイカルディ症候群、アイカルディ・グティエール症候群障害、ＡＩＤＳ－神経学的合併症、アレキサンダー病、アルパース病、交代性片麻痺、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、無脳症、動脈瘤、アンジェルマン症候群、血管腫症、無酸素症、抗リン脂質症候群、失語症、失行症、くも膜嚢胞、くも膜炎、アーノルド・キアリ奇形、動静脈奇形、アスペルガー症候群、運動失調、毛細血管拡張症性運動失調症、運動失調および小脳または小脳脊髄変性症、心房細動および脳卒中、注意欠如多動症、自閉症スペクトラム障害、自律神経障害、背部痛、バース症候群、バッテン病、ベッカー型ミオトニー、ベーチェット病（Behcet's Disease）、ベル麻痺、良性本態性眼瞼痙攣、良性限局性筋萎縮症、良性頭蓋内圧亢進症、ベルナール・ロス症候群、ビンスワンガー病、眼瞼痙攣、ブロッホ・サルツバーガー症候群、分娩時腕神経叢損傷、腕神経叢損傷、ブラッドベリー・エッグルストン症候群、脳および脊椎腫瘍、脳動脈瘤（ＢｒａｉｎＡｎｅｕｒｙｓｍ）、脳損傷、ブラウン・セカール症候群、球脊髄性筋萎縮症、皮質下梗塞と白質脳症を伴う常染色体優性脳動脈症（ＣＡＤＡＳＩＬ）、カナバン病、手根管症候群、カウザルギー、カベルノーマ、海綿状血管腫、海綿状血管奇形、中心性頸髄症候群、中心性脊髄症候群、中枢性疼痛症候群、橋中心髄鞘崩壊症、頭蓋障害、セラミダーゼ欠損症、小脳変性症、小脳形成不全、脳動脈瘤（Ｃｅｒｅｂｒａｌａｎｅｕｒｙｓｍｓ）、脳動脈硬化症、大脳萎縮、脳性脚気、脳海綿状血管奇形、脳性巨人症、低酸素性脳症、脳性麻痺、脳・眼・顔・骨格症候群（ＣＯＦＳ）、シャルコー・マリー・トゥース病、キアリ奇形、コレステロールエステル蓄積症、舞踏病、有棘赤血球舞踏病、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）、慢性起立性調節障害、慢性疼痛、コケイン症候群ＩＩ型、コフィン・ローリー症候群、脳梁欠損症、昏睡、複合性局所疼痛症候群、先天性顔面両側麻痺、先天性筋無力症、先天性ミオパチー、先天性血管海綿状奇形、大脳皮質基底核変性症、頭部動脈炎、頭蓋骨癒合症、クリー脳炎、クロイツフェルト・ヤコブ病、累積外傷性障害、クッシング症候群、巨細胞封入体症、サイトメガロウイルス感染症、ダンシングアイ－ダンシングフィート症候群、ダンディー・ウォーカー症候群、ドーソン病、ドモルシア症候群、デジュリン・クルンプケ麻痺、認知症、認知症－多発脳梗塞性、認知症－意味性、認知症－皮質下、レビー小体型認知症、歯状小脳性運動失調症、歯状赤核萎縮症、皮膚筋炎、発達性失行、デビック症候群、糖尿病性ニューロパチー、びまん性硬化症、ドラベ症候群、自律神経障害、書字障害、失読症、嚥下障害（ｄｙｓｐｈａｇｉａ）、統合運動障害、ミオクローヌス性小脳性共同運動障害、進行性小脳性共同運動障害、ジストニア、早期乳児てんかん性脳症、エンプティセラ症候群、脳炎、嗜眠性脳炎、脳ヘルニア、脳症、脳症（家族性乳児性）、脳三叉神経領域血管腫症、癲癇、癲癇性片麻痺、エルブ麻痺、エルブ・デュセンヌおよびデジェリーヌ・クルンプケ麻痺、本態性振戦、橋外髄鞘崩壊症、ファブリー病、ファール症候群、失神、家族性自律神経失調症、家族性血管腫、家族性特発性基底核石灰化症、家族性周期性麻痺、家族性痙性麻痺、ファーバー病、熱性痙攣、線維筋性異形成、フィッシャー症候群、ぐにゃぐにゃ乳児症候群、下垂足、フリードライヒ運動失調症、前頭側頭型認知症、ゴーシェ病、全身性ガングリオシドーシス、ゲルストマン症候群、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、巨大軸索ニューロパチー、巨細胞動脈炎、巨細胞封入体病、グロボイド細胞白質ジストロフィー、舌咽神経痛、糖原病、ギラン・バレー症候群、ハラーフォルデン・シュパッツ病、頭部損傷、頭痛、持続性片側頭痛、片側顔面痙攣、交代性片麻痺、遺伝性ニューロパチー、遺伝性痙性対麻痺、多発神経炎型遺伝性失調症、帯状疱疹（ＨｅｒｐｅｓＺｏｓｔｅｒ）、耳帯状疱疹、平山症候群、ホームズ・アディー症候群、全前脳胞症、ＨＴＬＶ－１関連脊髄症、ヒューズ症候群、ハンチントン病、水頭無脳症、水頭症、正常圧水頭症、水脊髄症、副腎皮質機能亢進症、過眠、筋緊張亢進、筋緊張低下、低酸素症、免疫介在性脳脊髄炎、封入体筋炎、色素失調症、乳児筋緊張低下、乳児神経軸索ジストロフィー、乳児フィタン酸蓄積症、乳児レフサム病、乳児痙攣、炎症性筋疾患、後頭孔脳脱出症、腸性脂肪異栄養症、頭蓋内嚢胞、頭蓋内圧亢進症、アイザックス症候群、ジュベール症候群、カーンズ・セイヤー症候群、ケネディー病、キンスボーン症候群、クライン・レビン症候群、クリッペル・フェイル症候群、クリッペル・トレノネー症候群（ＫＴＳ）、クリューバー・ビューシー症候群（Kliiver-Bucy Syndrome）、コルサコフ健忘症候群、クラッベ病、クーゲルベルグ・ウェランダー病、クールー病、ランバート・イートン筋無力症候群、ランドウ・クレフナー症候群、外側大腿皮神経絞扼、外側髄症候群、学習障害、リー病、レノックス・ガストー症候群、レッシュ・ナイハン症候群、白質ジストロフィー、レバイン・クリッチュリー症候群、レビー小体認知症、脂質蓄積症、類脂質タンパク症、滑脳症、閉じ込め症候群、ルー・ゲーリック病、ループス－神経学的後遺症、ライム病－神経学的合併症、マチャド・ジョセフ病、巨大脳症、巨脳症、メルカーソン・ローゼンタール症候群、髄膜炎、髄膜炎および脳炎、メンケス病、異常感覚性大腿神経痛、異染性白質ジストロフィー、小頭症、片頭痛、ミラー・フィッシャー症候群、軽度の脳卒中、ミトコンドリアミオパチー、メビウス症候群、一側性筋萎縮症、運動ニューロン疾患、もやもや病、ムコリピドーシス、ムコ多糖症、多発脳梗塞性認知症、多巣性運動ニューロパチー、多発性硬化症、多系統萎縮症、起立性低血圧を伴う多系統萎縮症、筋ジストロフィー、筋ジストロフィー－先天性、重力筋無力症、びまん性骨髄破壊性硬化症、乳児期ミオクロニー脳症、ミオクローヌス、ミオパチー、ミオパチー－先天性、ミオパチー－甲状腺中毒性、筋強直症、先天性筋強直症、ナルコレプシー、神経有棘赤血球症、脳内鉄沈着を伴う神経変性症、神経線維腫症、神経弛緩薬性悪性症候群、ＡＩＤＳの神経学的合併症、ライム病の神経学的合併症、サイトメガロウイルス感染症の神経学的帰結、ポンペ病の神経症状、ループスの神経学的後遺症、視神経脊髄炎、神経性筋強直症、神経セロイドリポフスチン症、神経細胞移動障害、ニューロパチー－遺伝性、神経サルコイドーシス、神経梅毒、神経毒性、海綿状母斑、ニーマン・ピック病、オサリバン・マクラウド症候群、後頭部神経痛、大田原症候群、オリーブ橋小脳萎縮症、オプソクローヌス・ミオクローヌス、起立性低血圧、過用症候群、疼痛－慢性、パントテン酸キナーゼ関連神経変性症、腫瘍随伴症候群、異常知覚、パーキンソン病、発作性舞踏アテトーゼ、発作性片側頭痛、パリー・ロンベルグ、ペリツェウス・メルツバッハー病、ペナ・ショッカーＩＩ症候群、神経根嚢胞、周期性麻痺、末梢性ニューロパチー、脳室周囲白質軟化症、遷延性植物状態、広汎性発達障害、フィタン酸蓄積症、ピック病、圧迫神経、梨状筋症候群、下垂体腫瘍、多発性筋炎、ポンペ病、孔脳症、ポリオ後症候群、帯状疱疹後神経痛、感染後脳脊髄炎、体位性低血圧症、体位性起立性頻脈症候群、体位性頻脈症候群、原発性歯状核萎縮症、原発性側索硬化症、原発性進行性失語症、プリオン病、進行性顔面片側萎縮症、進行性歩行運動失調、進行性多巣性白質脳症、進行性硬化性ポリオジストロフィー、進行性核上性麻痺、相貌失認、偽Ｔｏｒｃｈ症候群、偽トキソプラズマ症候群、偽脳腫瘍、心因性運動、ラムゼイ・ハント症候群Ｉ、ラムゼイ・ハント症候群ＩＩ、ラスムッセン脳炎、反射性交感神経ジストロフィー症候群、レフサム病、レフサム病－乳児、反復動作障害、反復性のストレス障害、下肢静止不能症候群、レトロウイルス関連脊髄症、レット症候群、ライ症候群、リウマチ性脳炎、ライリー・デイ症候群、仙骨神経根嚢腫、聖ヴィトゥス舞踏病、唾液腺疾患、サンドホフ病、シルダー病、裂脳症、ザイテルベルガー病、発作性障害、意味性認知症、中隔視神経形成異常症、乳児重症ミオクロニー癲癇（ＳＭＥＩ）、乳幼児揺さぶられ症候群、帯状疱疹（Ｓｈｉｎｇｌｅｓ）、シャイ・ドレーガー症候群、シェーグレン症候群、睡眠時無呼吸症、睡眠病、ソトス症候群、痙縮、二分脊椎、脊髄梗塞、脊髄損傷、脊髄腫瘍、脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳萎縮症、脊髄小脳変性症、スティール・リチャードソン・オルゼウスキー症候群、全身硬直症候群、線条体黒質変性症、脳卒中、スタージ・ウェーバー症候群、亜急性硬化性全脳炎、皮質下動脈硬化性脳症、短期間、片側、神経痛様（ＳＵＮＣＴ）頭痛、嚥下障害（ＳｗａｌｌｏｗｉｎｇＤｉｓｏｒｄｅｒ）、シデナム舞踏病、失神、梅毒性脊髄硬化症、脊髄水空洞症、脊髄空洞症、全身性エリテマトーデス、脊髄ろう、遅発性ジスキネジア、タルロブ嚢胞、テイ・サックス病、側頭動脈炎、脊髄係留症候群、トムゼン筋強直、胸郭出口症候群、甲状腺中毒性ミオパチー、疼痛性チック、トッド麻痺、トゥレット症候群、一過性虚血性発作、伝達性海綿状脳症、横断性脊髄炎、外傷性脳損傷、振戦、三叉神経痛、熱帯性痙性不全対麻痺、トロイヤー症候群、結節性硬化症、血管勃起腫瘍、中枢および末梢神経系の血管炎症候群、フォンエコノモ病、フォンヒッペル・リンダウ病（ＶＨＬ）、フォンレックリングハウゼン病、ワレンベルク症候群、ウェルドニッヒ・ホフマン病、ウェルニッケ・コルサフ症候群、ウエスト症候群、むち打ち症、ウィップル病、ウィリアムズ症候群、ウィルソン病、ウォルマン病、Ｘ連鎖性球脊髄性筋萎縮症。

一部の実施形態では、ＣＮＳ疾患は、ドーパミントランスポーター欠損症候群、注意欠陥／多動性障害（ＡＤＨＤ）、双極性障害、癲癇、多発性硬化症、タウオパチー、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、クラッベ病、副腎白質ジストロフィー、運動ニューロン疾患、脳性麻痺、バッテン病、ゴーシェ病、テイ・サックス病、レット症候群、サンドホフ病、シャルコー・マリー・トゥース病、アンジェルマン症候群、カナバン病、遅発型小児性神経セロイドリポフスチン沈着症、ムコ多糖症ＩＩＩＡ、ムコ多糖症ＩＩＩＢ、異染性白質ジストロフィー、遺伝性リソソーム蓄積症、例えばニーマン・ピック病Ｃ１型、および／または神経セロイドリポフスチン症、例えばバッテン病、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核症候群、および脳がん（星状細胞腫および神経膠芽腫を含む）からなるリストから選択される。

一部の実施形態では、本明細書で開示の合理的ポリプロイドまたはハプロイドベクターは、メチルマロン酸血症（ＭＭＡ）、アルファ１アンチトリプシン欠乏症（ＡＡＴＤ）、常染色体優性多発性嚢胞腎（ＡＤＰＫＤ）のいずれかから選択される疾患の処置に有用な治療用発現産物を発現させるために使用され得る。

一部の実施形態では、本明細書で開示の合理的ポリプロイドまたはハプロイドベクターは、筋ジストロフィー（筋強直性ジストロフィー（ＤＭ１およびＤＭ２）、肢帯型ＭＤ、デュセンヌ型ＭＤ、ベッカー型ＭＤ、先天性ＭＤ、顔面肩甲上腕型ＭＤ、エミリー・ドレイフス型ＭＤ、遠位型ＭＤ、眼咽頭型ＭＤ、ＶＩ型コラーゲン関連ＭＤを含む）のいずれかから選択される疾患の処置に有用な治療用発現産物を発現させるために使用され得る。

一部の実施形態では、本明細書で開示の合理的ポリプロイドまたはハプロイドベクターは、消化管起源の疾患、または消化管障害、例えば、炎症性腸疾患（ＩＢＤ、潰瘍性大腸炎およびクローン病を含む）、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、セリアック病、遺伝性ヘモクロマトーシス、リンチ症候群、家族性腺腫性ポリープ、若年性ポリポーシス症候群、ポイツ・ジェガース症候群、好酸球性消化管疾患（例えば、好酸球性胃腸炎（ＥＧＥ））、微絨毛封入体病、巨大膀胱短小結腸腸管蠕動不全症、ミトコンドリア神経胃腸脳症症候群、腸管リンパ管拡張症、自己免疫性消化管運動障害、熱帯性スプルー、ウィップル病、ラクトース不耐症、および遺伝性アミロイドーシスから選択される、任意の消化管障害または小腸の障害、の処置に有用な治療用発現産物を発現させるために使用され得る。

ある特定の実施形態では、本明細書で開示される合理的ポリプロイドＡＡＶベクターは、疾患の発症を防止するために対象に予防的に投与される。別の実施形態では、本開示のＡＡＶ粒子は、疾患またはその症状を処置する（それらの影響を和らげる）ために投与される。さらに別の実施形態では、本明細書で開示される合理的ポリプロイドＡＡＶベクターは、疾患を治癒（消失）させるために投与される。別の実施形態では、本明細書で開示される合理的ポリプロイドＡＡＶベクターは、疾患の進行を防止または緩徐化するために投与される。さらに別の実施形態では、本開示のＡＡＶ粒子は、疾患の有害な影響を好転させるために使用される。疾患ステータスおよび／または進行は、当技術分野において公知の標準的な方法により決定またはモニターされ得る。

一部の実施形態では、本明細書で開示される合理的ポリプロイドＡＡＶベクターは、神経学的疾患および／または障害の処置、予防、緩和または改善のための医療分野において有用である。

一部の実施形態では、本明細書で開示される合理的ポリプロイドＡＡＶベクターは、タウオパチーの処置、予防、緩和または改善のための医療分野において有用である。

一部の実施形態では、本明細書で開示される合理的ポリプロイドＡＡＶベクターは、アルツハイマー病の処置、予防、緩和または改善のための医療分野において有用である。

一部の実施形態では、本明細書で開示される合理的ポリプロイドＡＡＶベクターは、フリードライヒ運動失調症、またはフラタキシンタンパク質の喪失もしくは部分的喪失から生じる任意の疾患の、処置、予防、緩和または改善のための医療分野において有用である。

一部の実施形態では、本明細書で開示される合理的ポリプロイドＡＡＶベクターは、パーキンソン病の処置、予防、緩和または改善のための医療分野において有用である。

一部の実施形態では、本明細書で開示される合理的ポリプロイドＡＡＶベクターは、筋萎縮性側索硬化症の処置、予防、緩和または改善のための医療分野において有用である。

一部の実施形態では、本明細書で開示される合理的ポリプロイドＡＡＶベクターは、ハンチントン病の処置、予防、緩和または改善のための医療分野において有用である。

一部の実施形態では、本明細書で開示される合理的ポリプロイドＡＡＶベクターは、慢性または神経障害性疼痛の処置、予防、緩和または改善のための医療分野において有用である。

一部の実施形態では、本明細書で開示される合理的ポリプロイドＡＡＶベクターは、中枢神経系（ＣＮＳ）に関連する疾患の処置、予防、緩和または改善のための医療分野において有用である。

一部の実施形態では、本明細書で開示される合理的ポリプロイドＡＡＶベクターは、末梢神経系（ＰＮＳ）に関連する疾患の処置、予防、緩和または改善のための医療分野において有用である。

ある特定の実施形態では、本開示のＡＡＶ粒子は、本明細書に記載される疾患または症状の少なくとも１つを有する対象に投与される。

本明細書で使用される場合、中枢または末梢神経系およびその成分（例えば、ニューロン）に関連するいずれの疾患も、「神経学的疾患」と見なされ得る。

以下のものを含むがこれらに限定されない、任意の神経学的疾患が、本開示のＡＡＶ粒子またはその医薬組成物で処置され得る：透明中隔欠損症、酸性リパーゼ病、酸性マルターゼ欠損症、後天性てんかん性失語症、急性散在性脳脊髄炎、注意欠如多動症（ＡＤＨＤ）、アディー瞳孔、アディー症候群、副腎白質ジストロフィー、脳梁欠損症、失認、アイカルディ症候群、アイカルディ・グティエール症候群障害、ＡＩＤＳ－神経学的合併症、アレキサンダー病、アルパース病、交代性片麻痺、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、無脳症、動脈瘤、アンジェルマン症候群、血管腫症、無酸素症、抗リン脂質症候群、失語症、失行症、くも膜嚢胞、くも膜炎、アーノルド・キアリ奇形、動静脈奇形、アスペルガー症候群、運動失調、毛細血管拡張症性運動失調症、運動失調および小脳または小脳脊髄変性症、心房細動および脳卒中、注意欠如多動症、自閉症スペクトラム障害、自律神経障害、背部痛、バース症候群、バッテン病、ベッカー型ミオトニー、ベーチェット病、ベル麻痺、良性本態性眼瞼痙攣、良性限局性筋萎縮症、良性頭蓋内圧亢進症、ベルナール・ロス症候群、ビンスワンガー病、眼瞼痙攣、ブロッホ・サルツバーガー症候群、分娩時腕神経叢損傷、腕神経叢損傷、ブラッドベリー・エッグルストン症候群、脳および脊椎腫瘍、脳動脈瘤（ＢｒａｉｎＡｎｅｕｒｙｓｍ）、脳損傷、ブラウン・セカール症候群、球麻痺、球脊髄性筋萎縮症、皮質下梗塞と白質脳症を伴う常染色体優性脳動脈症（ＣＡＤＡＳＩＬ）、カナバン病、手根管症候群、カウザルギー、カベルノーマ、海綿状血管腫、海綿状血管奇形、中心性頸髄症候群、中心性脊髄症候群、中枢性疼痛症候群、橋中心髄鞘崩壊症、頭蓋障害、セラミダーゼ欠損症、小脳変性症、小脳形成不全、脳動脈瘤（Ｃｅｒｅｂｒａｌａｎｅｕｒｙｓｍｓ）、脳動脈硬化症、大脳萎縮、脳性脚気、脳海綿状血管奇形、脳性巨人症、低酸素性脳症、脳性麻痺、脳・眼・顔・骨格症候群（ＣＯＦＳ）、シャルコー・マリー・トゥース病、キアリ奇形、コレステロールエステル蓄積症、舞踏病、有棘赤血球舞踏病、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）、慢性起立性調節障害、慢性疼痛、コケイン症候群ＩＩ型、コフィン・ローリー症候群、脳梁欠損症、昏睡、複合性局所疼痛症候群、同心円硬化症（バロ硬化症）、先天性顔面両側麻痺、先天性筋無力症、先天性ミオパチー、先天性血管海綿状奇形、大脳皮質基底核変性症、頭部動脈炎、頭蓋骨癒合症、クリー脳炎、クロイツフェルト・ヤコブ病、慢性進行性外眼筋麻痺、累積外傷性障害、クッシング症候群、巨細胞封入体症、サイトメガロウイルス感染症、ダンシングアイ－ダンシングフィート症候群、ダンディー・ウォーカー症候群、ドーソン病、ドモルシア症候群、デジュリン・クルンプケ麻痺、認知症、認知症－多発脳梗塞性、認知症－意味性、認知症－皮質下、レビー小体型認知症、脱髄疾患、歯状小脳性運動失調症、歯状赤核萎縮症、皮膚筋炎、発達性失行、デビック症候群、糖尿病性ニューロパチー、びまん性硬化症、遠位型遺伝性運動ニューロン障害、ドラベ症候群、自律神経障害、書字障害、失読症、嚥下障害（ｄｙｓｐｈａｇｉａ）、統合運動障害、ミオクローヌス性小脳性共同運動障害、進行性小脳性共同運動障害、ジストニア、早期乳児てんかん性脳症、エンプティセラ症候群、脳炎、嗜眠性脳炎、脳ヘルニア、脳脊髄炎、脳症、脳症（家族性乳児性）、脳三叉神経領域血管腫症、癲癇、癲癇性片麻痺、発作性運動失調症、エルブ麻痺、エルブ・デュセンヌおよびデジェリーヌ・クルンプケ麻痺、本態性振戦、橋外髄鞘崩壊症、ファーバー病、ファブリー病、ファール症候群、失神、家族性自律神経失調症、家族性血管腫、家族性特発性基底核石灰化症、家族性周期性麻痺、家族性痙性麻痺、ファーバー病、熱性痙攣、線維筋性異形成、フィッシャー症候群、ぐにゃぐにゃ乳児症候群、下垂足、フリードライヒ運動失調症、前頭側頭型認知症、ゴーシェ病、全身性ガングリオシドーシス（ＧＭ１、ＧＭ２）、ゲルストマン症候群、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、巨大軸索ニューロパチー、巨細胞動脈炎、巨細胞封入体病、グロボイド細胞白質ジストロフィー、舌咽神経痛、糖原病、ギラン・バレー症候群、ハラーフォルデン・シュパッツ病、頭部損傷、頭痛、持続性片側頭痛、片側顔面痙攣、交代性片麻痺、遺伝性ニューロパチー、遺伝性痙性対麻痺、多発神経炎型遺伝性失調症、帯状疱疹（ＨｅｒｐｅｓＺｏｓｔｅｒ）、耳帯状疱疹、平山症候群、ホームズ・アディー症候群、全前脳胞症、ＨＴＬＶ－１関連脊髄症、ヒューズ症候群、ハンチントン病、ハーラー症候群、水頭無脳症、水頭症、正常圧水頭症、水脊髄症、副腎皮質機能亢進症、過眠、筋緊張亢進、筋緊張低下、低酸素症、免疫介在性脳脊髄炎、封入体筋炎、色素失調症、乳児筋緊張低下、乳児神経軸索ジストロフィー、乳児フィタン酸蓄積症、乳児レフサム病、乳児痙攣、炎症性筋疾患、後頭孔脳脱出症、腸性脂肪異栄養症、頭蓋内嚢胞、頭蓋内圧亢進症、アイザックス症候群、ジュベール症候群、カーンズ・セイヤー症候群、ケネディー病、キンスボーン症候群、クライン・レビン症候群、クリッペル・フェイル症候群、クリッペル・トレノネー症候群（ＫＴＳ）、クリューバー・ビューシー症候群、コルサコフ健忘症候群、クラッベ病、クーゲルベルグ・ウェランダー病、クールー病、ランバート・イートン筋無力症候群、ランドウ・クレフナー症候群、外側大腿皮神経絞扼、外側髄症候群、学習障害、リー病、レノックス・ガストー症候群、レッシュ・ナイハン症候群、白質ジストロフィー、レバイン・クリッチュリー症候群、レビー小体認知症、リヒトハイム病、脂質蓄積症、類脂質タンパク症、滑脳症、閉じ込め症候群、ルー・ゲーリック病、ループス－神経学的後遺症、ライム病－神経学的合併症、リソソーム蓄積障害、マチャド・ジョセフ病、巨大脳症、巨脳症、メルカーソン・ローゼンタール症候群、髄膜炎、髄膜炎および脳炎、メンケス病、異常感覚性大腿神経痛、異染性白質ジストロフィー、小頭症、片頭痛、ミラー・フィッシャー症候群、軽度の脳卒中、ミトコンドリアミオパチー、ミトコンドリアＤＮＡ枯渇症候群、メビウス症候群、一側性筋萎縮症、モルヴァン症候群、運動ニューロン疾患、もやもや病、ムコリピドーシス、ムコ多糖症、多発脳梗塞性認知症、多巣性運動ニューロパチー、多発性硬化症、多系統萎縮症、起立性低血圧を伴う多系統萎縮症、筋ジストロフィー、筋ジストロフィー－先天性、重力筋無力症、びまん性骨髄破壊性硬化症、脊髄炎、乳児期ミオクロニー脳症、ミオクローヌス、ミオクローヌス癲癇、ミオパチー、ミオパチー－先天性、ミオパチー－甲状腺中毒性、筋強直症、先天性筋強直症、ナルコレプシー、ＮＡＲＰ（ニューロパチー、運動失調および網膜色素変性）、神経有棘赤血球症、脳内鉄沈着を伴う神経変性症、神経変性疾患、神経線維腫症、神経弛緩薬性悪性症候群、ＡＩＤＳの神経学的合併症、ライム病の神経学的合併症、サイトメガロウイルス感染症の神経学的帰結、ポンペ病の神経症状、ループスの神経学的後遺症、視神経脊髄炎、神経性筋強直症、神経セロイドリポフスチン症、神経細胞移動障害、神経障害性疼痛、ニューロパチー－遺伝性、ニューロパチー、神経サルコイドーシス、神経梅毒、神経毒性、海綿状母斑、ニーマン・ピック病、オサリバン・マクラウド症候群、後頭部神経痛、大田原症候群、オリーブ橋小脳萎縮症、オプソクローヌス・ミオクローヌス、起立性低血圧、過用症候群、疼痛－慢性、パントテン酸キナーゼ関連神経変性症、腫瘍随伴症候群、異常知覚、パーキンソン病、発作性舞踏アテトーゼ、発作性片側頭痛、パリー・ロンベルグ、ペリツェウス・メルツバッハー病、ペナ・ショッカーＩＩ症候群、神経根嚢胞、腓骨筋萎縮症、周期性麻痺、末梢性ニューロパチー、脳室周囲白質軟化症、遷延性植物状態、広汎性発達障害、フィタン酸蓄積症、ピック病、圧迫神経、梨状筋症候群、下垂体腫瘍、多発性筋炎、ポンペ病、孔脳症、ポリオ後症候群、帯状疱疹後神経痛、感染後脳脊髄炎、体位性低血圧症、体位性起立性頻脈症候群、体位性頻脈症候群、原発性歯状核萎縮症、原発性側索硬化症、原発性進行性失語症、プリオン病、進行性球麻痺、進行性顔面片側萎縮症、進行性歩行運動失調、進行性多巣性白質脳症、進行性筋萎縮症、進行性硬化性ポリオジストロフィー、進行性核上性麻痺、相貌失認、仮性球麻痺、偽Ｔｏｒｃｈ症候群、偽トキソプラズマ症候群、偽脳腫瘍、心因性運動、ラムゼイ・ハント症候群Ｉ、ラムゼイ・ハント症候群ＩＩ、ラスムッセン脳炎、反射性交感神経ジストロフィー症候群、レフサム病、レフサム病－乳児、反復動作障害、反復性のストレス障害、下肢静止不能症候群、レトロウイルス関連脊髄症、レット症候群、ライ症候群、リウマチ性脳炎、ライリー・デイ症候群、仙骨神経根嚢腫、聖ヴィトゥス舞踏病、唾液腺疾患、サンドホフ病、シルダー病、裂脳症、ザイテルベルガー病、発作性障害、意味性認知症、中隔視神経形成異常症、乳児重症ミオクロニー癲癇（ＳＭＥＩ）、乳幼児揺さぶられ症候群、帯状疱疹（Ｓｈｉｎｇｌｅｓ）、シャイ・ドレーガー症候群、シェーグレン症候群、睡眠時無呼吸症、睡眠病、ソトス症候群、痙縮、二分脊椎、脊髄梗塞、脊髄損傷、脊髄腫瘍、脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調症、脊髄小脳萎縮症、脊髄小脳変性症、孤発性運動失調症、スティール・リチャードソン・オルゼウスキー症候群、全身硬直症候群、線条体黒質変性症、脳卒中、スタージ・ウェーバー症候群、亜急性硬化性全脳炎、皮質下動脈硬化性脳症、短期間、片側、神経痛様（ＳＵＮＣＴ）頭痛、嚥下障害（ＳｗａｌｌｏｗｉｎｇＤｉｓｏｒｄｅｒ）、シデナム舞踏病、失神、梅毒性脊髄硬化症、脊髄水空洞症、脊髄空洞症、全身性エリテマトーデス、脊髄ろう、遅発性ジスキネジア、タルロブ嚢胞、テイ・サックス病、側頭動脈炎、脊髄係留症候群、トムゼン筋強直、胸郭出口症候群、甲状腺中毒性ミオパチー、疼痛性チック、トッド麻痺、トゥレット症候群、一過性虚血性発作、伝達性海綿状脳症、横断性脊髄炎、外傷性脳損傷、振戦、三叉神経痛、熱帯性痙性不全対麻痺、トロイヤー症候群、結節性硬化症、血管勃起腫瘍、中枢および末梢神経系の血管炎症候群、ビタミンＢ１２欠乏症、フォンエコノモ病、フォンヒッペル・リンダウ病（ＶＨＬ）、フォンレックリングハウゼン病、ワレンベルク症候群、ウェルドニッヒ・ホフマン病、ウェルニッケ・コルサフ症候群、ウエスト症候群、むち打ち症、ウィップル病、ウィリアムズ症候群、ウィルソン病、ウォルマン病、Ｘ連鎖性球脊髄性筋萎縮症。

一部の実施形態では、本明細書で開示の合理的ポリプロイドまたはハプロイドベクターによりコードされる治療用遺伝子または発現産物は、ＮＰＣ１、ＥＡＡＴ２、ＮＰＹ、ＣＹＰ４６Ａ１、ＧＬＢ１、ＡＰＯＥ（例えば、ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３またはＡｐｏＥ４）、ＨＥＸ、ＣＬＮ１、ＣＬＮ２、ＣＬＮ３、ＣＬＮ４、ＣＬＮ５、ＣＬＮ６、ＳＵＭＦ１、ＤＣＴＮ１、ＰＲＰＨ、ＳＯＤ１、ＮＥＦＨ、ＧＢＡ、ＩＤＵＡ、ＮＡＧＬＵ、ＧＵＳＢ、ＡＲＳＡ、ＭＡＮＢ、ＡＡＤＣ、ＧＤＮＦ、ＳＯＤ１、ＮＴＮ、ＡＳＰ、ＭＡＰＴ、ＡＰＯＥ、ＨＴＴ、ＭＥＣＰ２、ＰＴＣＨＤ１、ＧＪＢ１、ＵＢＥ３Ａ、ＨＥＸＡ、ＭＯＧからなる群から選択され得る。

加えて、または代替的に、発現産物は、抗体、抗体断片、または抗体様足場タンパク質であり得る。一部の実施形態では、例示的なポリペプチド発現産物は、神経保護性ポリペプチドおよび抗血管新生性ポリペプチドを含む。一態様では、本明細書で開示される合理的ポリプロイドベクターは、ポリペプチドペイロードをコードするウイルスゲノムを含む。ポリペプチドは、これらに限定されないが、抗体、芳香族Ｌ－アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）、生存運動ニューロン１（ＳＭＮ１）、フラタキシン（ＦＸＮ）、ＡｐｏＥ２、ＧＢＡ１、ＧＲＮ、ＡＳＰＡ、ＣＬＮ２、ＧＬＢ１、ＳＧＳＨ、ＮＡＧＬＵ、ＩＤＳ、ＮＰＣ１、またはＧＡＮであり得る。

追加の好適なポリペプチドには、これらに限定されないが、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ－２）、ニュールツリン（nurturin）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ；例えば、神経成長因子－ベータ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン－３（ＮＴ－３）、ニューロトロフィン－４（ＮＴ－４）、ニューロトロフィン－６（ＮＴ－６）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、Ｗｎｔポリペプチド、可溶性Ｆｉｔ－１、アンジオスタチン、エンドスタチン、ＶＥＧＦ、抗ＶＥＧＦ抗体、可溶性ＶＥＧＦＲ、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、およびヘッジホッグファミリーのメンバー（ソニックヘッジホッグ、インディアンヘッジホッグ、およびデザートヘッジホッグなど）が含まれる。

一部の実施形態では、有用な治療用発現産物は、ホルモンならびに増殖および分化因子を含み、これらには、限定ではないが、インスリン；グルカゴン；成長ホルモン（ＧＨ）；副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）；成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）；黄体形成ホルモン（ＬＨ）；ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；アンジオポエチン；アンジオスタチン；顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）；塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）；酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）；上皮増殖因子（ＥＧＦ）；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；インスリン増殖因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ－ＩおよびＩＧＦ－ＩＩ）；ＴＧＦａをはじめとするトランスフォーミング増殖因子アルファスーパーファミリーのいずれか１つ；アクチビン；インヒビン；または骨形成因子（ＢＭＰ）ＢＭＰ１～１５のいずれか；増殖因子のヘレグリン（heregluin）／ニューレグリン／ＡＲＩＡ／ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）ファミリーのいずれか１つ；神経成長因子（ＮＧＦ）；脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；ニューロトロフィンＮＴ－３およびＮＴ－４／５；絨毛体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）；グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）；ニュールツリン；アグリン；セマフォリン／コラプシンファミリーのいずれか１つ；ネトリン－１およびネトリン－２；肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）；エフリン；ノギン；ソニックヘッジホッグ；ならびにチロシンヒドロキシラーゼが含まれる。

加えて、または代替的に、本明細書で開示の合理的ポリプロイドまたはハプロイドベクターによりコードされる治療用遺伝子または発現産物は、疾患対立遺伝子に方向付けられた遺伝子編集系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮなど）であり得る。加えて、または代替的に、発現産物は、１つまたは複数の調節性ポリヌクレオチド、例えば、治療剤としてのＲＮＡまたはＤＮＡ分子であり得る。例えば、調節性ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡであり得る。標的遺伝子は、任意の神経学的疾患、例えば、これらに限定されないが本明細書に収載されるもの、に関連する遺伝子のいずれかであり得る。例えば、ｓｉＲＮＡ二重鎖またはコードされたｄｓＲＮＡは、ＣＮＳ細胞における標的遺伝子発現を低減またはサイレンシングすることができ、それによって、神経学的疾患の症状が改善される。１つの非限定的な例では、標的遺伝子は、ハンチンチン（ＨＴＴ）である。別の非限定的な例では、標的遺伝子は、微小管関連タンパク質タウ（ＭＡＰＴ）である。一部の実施形態では、有用な発現産物は、免疫系を調節するタンパク質を含み、これらには、限定ではなく、サイトカインおよびリンホカイン、例えば、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ）ＩＬ－１からＩＬ－２５まで（ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１２およびＩＬ－１８を含む）、単球走化性タンパク質、白血病阻害因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子アルファおよびベータ、インターフェロン（アルファ、ベータおよびガンマ）、幹細胞因子、ｆｌｋ－２／ｆｌｔ３リガンドが含まれる。免疫系により産生される遺伝子産物も、本発明において有用である。これらには、限定ではなく、免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、一本鎖抗体、Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、一本鎖Ｔ細胞受容体、クラスＩおよびクラスＩＩＭＨＣ分子、ならびに操作された免疫グロブリンおよびＭＨＣ分子が含まれる。有用な遺伝子産物には、補体調節タンパク質、例えば、補体調節タンパク質、膜補因子タンパク質（ＭＣＰ）、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＣＲ１、ＣＦ２およびＣＤ５９も含まれる。

一部の実施形態では、有用な発現産物は、ホルモン、増殖因子、サイトカイン、リンホカイン、調節タンパク質および免疫系タンパク質についての受容体のいずれか１つを含む。有用な異種核酸配列は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）受容体、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）受容体、およびスカベンジャー受容体をはじめとする、コレステロール調節および／または脂質モジュレーションのための受容体も含む。本発明は、グルココルチコイド受容体およびエストロゲン受容体をはじめとするステロイドホルモン受容体スーパーファミリーのメンバー、ビタミンＤ受容体ならびに他の核受容体などの、遺伝子産物の使用も包含する。加えて、有用な遺伝子産物は、転写因子、例えば、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍａｘ、ｍａｄ、血清応答因子（ＳＲＦ）、ＡＰ－１、ＡＰ－２、ｍｙｂ、ＭｙｏＤおよびミオゲニン、ＥＴＳボックス含有タンパク質、ＴＦＥ３、Ｅ２Ｆ、ＡＴＦ１、ＡＴＦ２、ＡＴＦ３、ＡＴＦ４、ＺＦ５、ＮＦＡＴ、ＣＲＥＢ、ＨＮＦ－４、Ｃ／ＥＢＰ、ＳＰ１、ＣＣＡＡＴボックス含有タンパク質、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ－１）、ウィルムス腫瘍タンパク質、ＥＴＳ結合タンパク質、ＳＴＡＴ、ＧＡＴＡボックス結合タンパク質、例えばＧＡＴＡ－３、ならびにウイングドヘリックスタンパク質のフォークヘッドファミリーを含む。

一部の実施形態では、有用な発現産物は、挿入、欠失またはアミノ酸置換を含有する天然に存在しないアミノ酸配列を有するキメラまたはハイブリッドポリペプチドなどの、天然に存在しないポリペプチドを含む。さらなる好適な発現産物は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、干渉ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、およびアプタマーを含む。

代替実施形態では、本明細書で開示される合理的ポリプロイドまたはハプロイドベクターは、異種核酸をｉｎｖｉｖｏで対象における細胞に送達するために使用され得る。一部の実施形態では、本明細書で開示される合理的ポリプロイドまたはハプロイドベクターは、本明細書に記載されるように次の疾患のうちのいずれか１つまたは複数を処置するために使用され得る：リソソーム蓄積障害、例えば、ムコ多糖症障害（例えば、スライ症候群［β－グルクロニダーゼ］、ハーラー症候群［α－Ｌ－イズロニダーゼ］、シャイエ症候群［α－Ｌ－イズロニダーゼ］、ハーラー・シャイエ症候群［α－Ｌ－イズロニダーゼ］、ハンター症候群［イズロン酸スルファターゼ］、サンフィリッポ症候群Ａ［ヘパランスルファミダーゼ］、Ｂ［Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ］、Ｃ［アセチル－ＣｏＡ；α－グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼ］、Ｄ［Ｎ－アセチルグルコサミン６－スルファターゼ］、モルキオ症候群Ａ［ガラクトース－６－硫酸スルファターゼ］、Ｂ［β－ガラクトシダーゼ］、マロトー・ラミー症候群［Ｎ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼ］など）、ファブリー病（α－ガラクトシダーゼ）、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ）、または糖原貯蔵障害（例えば、ポンペ病；リソソーム酸性α－グルコシダーゼ）。

一部のＡＡＶカプシドタンパク質について、対応するアミノ酸位置が、ウイルスに部分的にもしくは完全に存在するか、または代替的に、完全に非存在であるかに依存して、対応する改変が挿入および／または置換となることは、当業者には理解されるであろう。同様に、ＡＡＶ２以外のＡＡＶを改変する場合、特定のアミノ酸位置は、ＡＡＶ２内のその位置とは異なり得る（例えば、表３を参照されたい）。本明細書中の他の箇所で論じられるように、対応するアミノ酸位置は、当業者には、周知の技法を使用して容易に明らかになる。

代表的な実施形態では、カプシドタンパク質における挿入および／または置換および／または欠失は、（ｉ）その領域内の親水性ループ構造を維持するアミノ酸；（ｉｉ）ループ構造の配置を変更するアミノ酸；（ｉｉｉ）荷電アミノ酸；および／あるいは（ｉｖ）リン酸化もしくは硫酸化され得る、または別様に、ＡＡＶ２カプシドタンパク質における２６４の後の翻訳後改変（例えば、グリコシル化）による変化もしくは別のＡＡＶのカプシドタンパク質における対応する変化を受けるアミノ酸の、挿入、置換および／または再配置につながる。挿入／置換に好適なアミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸、バリン、ロイシン、リシン、アルギニン、トレオニン、セリン、チロシン、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、フェニルアラニン、チロシンまたはグルタミンが挙げられる。特定の実施形態では、トレオニンが、カプシドサブユニットに挿入または置換される。いくつかの他のＡＡＶにおける対応する位置の非限定的な例が表３（位置２）で示される。特定の実施形態では、アミノ酸挿入または置換は、トレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはフェニルアラニンである（この位置にトレオニン、グルタミン酸またはフェニルアラニンを有するＡＡＶを除く）。

さらなる実施形態では、改変カプシドタンパク質またはカプシドは、ＷＯ２００９／１０８２７４に記載されているような変異を含み得る。

別の可能性として、ＡＡＶカプシドタンパク質は、Ｚｈｏｎｇら（Virology 381: 194-202 (2008); Proc. Nat. Acad. Sci. 105: 7827-32 (2008)）により記載されたような変異を含み得る。例えば、ＡＡＶカプシドタンパク質は、アミノ酸７３０位にＹＦ変異を含み得る。

上記の改変を互いに組み合わせて、および／または現在公知のもしくは後に発見される任意の他の改変と組み合わせて、本発明のカプシドタンパク質またはカプシドに組み込むことができる。

本発明は、本発明の改変カプシドタンパク質およびカプシドを含むウイルスベクターも包含する。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、パルボウイルスベクター（例えば、パルボウイルスカプシドおよび／またはベクターゲノムを含む）、例えば、ＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶカプシドおよび／またはベクターゲノムを含む）である。代表的な実施形態では、ウイルスベクターは、本発明の改変カプシドタンパク質サブユニットとベクターゲノムとを含む改変ＡＡＶカプシドを含む。

例えば、代表的な実施形態では、ウイルスベクターは、（ａ）本発明の改変カプシドタンパク質を含む改変ウイルスカプシド（例えば、改変ＡＡＶカプシド）、および（ｂ）末端反復配列（例えば、ＡＡＶＴＲ）を含む核酸を含み、末端反復配列を含む核酸は、改変ウイルスカプシドによってカプシド内封入されている。核酸は、必要に応じて、２つの末端リピート（例えば、２つのＡＡＶＴＲ）を含み得る。

代表的な実施形態では、ウイルスベクターは、目的のポリペプチドまたは機能的ＲＮＡをコードする異種核酸を含む、組換えウイルスベクターである。組換えウイルスベクターは、より詳細に下で説明される。

一部の実施形態では、本明細書で開示される合理的ポリプロイド（例えば、合理的ハプロイド）ＡＡＶベクターは、（ｉ）全身またはくも膜下腔内投与後に非ポリプロイド親ＡＡＶベクターと比較してＢＢＢを横断する能力の増大；（ｉｉ）ＣＮＳもしくはＰＮＳもしくは両方における生体内分布の増加、および／または非ハプロイド親ＡＡＶベクターによる形質導入レベルと比較して脳組織（例えば、ニューロンおよび非ニューロン細胞）に形質導入する能力の増大；（ｉｉｉ）動物対象において非合理的ポリプロイド親ＡＡＶベクターによる形質導入レベルによって観察されるレベルと比較してウイルスベクターによる増強された全身性形質導入を示す；（ｉｖ）非合理的ポリプロイド親ＡＡＶベクターにより惹起される免疫応答のレベルと比較して液性免疫応答の減少；（ｖ）同じ中和抗体への非ポリプロイド親ＡＡＶベクターの中和のレベルと比較して親ＡＡＶベクターに対する中和抗体による中和の減少、を有する。

さらに、本発明の一部の実施形態では、本明細書で開示の合理的ポリプロイドまたはハプロイドＡＡＶベクターは、ＣＮＳの頸髄、胸髄および腰髄ならびに髄質および脈絡叢を含む、対象の皮質、線条体、視床、髄質、海馬、中脳、プルキンエ組織、小脳および脊髄を含むがこれらに限定されない、ＣＮＳおよび／またはＰＮＳ標的組織への効率的形質導入を実証する。

一部の実施形態では、反復投薬を可能にする合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団であって、ＡＡＶＶＰ１またはＶＰ２ウイルス構造タンパク質の少なくとも一方と、ＡＡＶＶＰ３ウイルス構造タンパク質とを含み；ＶＰ１およびＶＰ２ウイルス構造タンパク質が、各々、ＡＡＶ８ウイルス血清型からのものであり、ＶＰ３ウイルス構造タンパク質が、アカゲザルＡＡＶｒｈ１０血清型から選択され；合理的ポリプロイドＡＡＶ８－８－ｒｈ１０ビリオンの集団が、親ＡＡＶ８血清型により惹起される液性応答と比較して低減された液性応答を惹起し、反復投薬が、合理的ポリプロイドＡＡＶ８－８－ｒｈ１０ビリオンの集団の第１の投与、および親ＡＡＶ血清型８ビリオンの第２の投与を含む、合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団。説明のために、本明細書で開示の液性応答は、対象または動物、例えばマウスに、合理的ポリプロイドＡＡＶ８－８－ｒｈ１０ビリオン、またはＡＡＶ８ビリオンのどちらかが注射された後、抗ＡＡＶ８抗体（例えば、ＩｇＧ）の血清レベルにより測定される。したがって、低減された液性応答は、同様の条件下で対象または動物にＡＡＶ８ビリオンが投与されたときに産生される抗ＡＡＶ８ＩｇＧと比較して、対象または動物に合理的ポリプロイド（例えば、合理的ハプロイド）ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０ビリオンが投与されたときに少ないＡＡＶ８ＩｇＧの産生に向かう。合理的ポリプロイド（例えば、合理的ハプロイド）ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０で産生される、より少ない抗ＡＡＶ８ＩｇＧは、それを、第２の投与が必要とされる遺伝子治療レジメンとしての使用に、より好適なものにする。ＡＡＶ遺伝子治療レジメンのこの特定の例については、第１の投与としての合理的ポリプロイドＡＡＶ８－８－ｒｈ１０と、ＡＡＶ８ベクターで後続のまたは第２の投与を使用するのが好適である。

一部の実施形態では、反復投薬を可能にする合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団であって、ＡＡＶＶＰ１またはＶＰ２ウイルス構造タンパク質の少なくとも一方と、ＡＡＶＶＰ３ウイルス構造タンパク質とを含み；ＶＰ１およびＶＰ２ウイルス構造タンパク質が、各々、ＡＡＶ８ウイルス血清型からのものであり、ＶＰ３ウイルス構造タンパク質が、アカゲザルＡＡＶｒｈ７４血清型から選択され；合理的ポリプロイドＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ビリオンの集団が、親ＡＡＶ８血清型により惹起される液性応答と比較して低減された液性応答を惹起し、反復投薬が、合理的ポリプロイドＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ビリオンの集団の第１の投与、および親ＡＡＶ血清型８ビリオンの第２の投与を含む、合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団。説明のために、本明細書で開示の液性応答は、対象または動物、例えばマウスに、合理的ポリプロイドＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ビリオン、またはＡＡＶ８ビリオンのどちらかが注射された後、抗ＡＡＶ８抗体（例えば、ＩｇＧ）の血清レベルにより測定される。

したがって、低減された液性応答は、同様の条件下で対象または動物にＡＡＶ８ビリオンが投与されたときに産生される抗ＡＡＶ８ＩｇＧと比較して、対象または動物に合理的ポリプロイド（例えば、合理的ハプロイド）ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ビリオンが投与されたときに少ないＡＡＶ８ＩｇＧの産生に向かう。合理的ポリプロイド（例えば、合理的ハプロイド）ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４で産生される、より少ない抗ＡＡＶ８ＩｇＧは、それを、第２の投与が必要とされる遺伝子治療レジメンとしての使用に、より好適なものにする。ＡＡＶ遺伝子治療レジメンのこの特定の例については、第１の投与としての合理的ポリプロイドＡＡＶ８－８－ｒｈ７４と、ＡＡＶ８ベクターでの後続のまたは第２の投与、または逆に、第１の投与としてのＡＡＶ８ベクターと、合理的ポリプロイドＡＡＶ８－８－ｒｈ７４で後続のまたは第２の投与、を使用するのが好適である。

本明細書では、ＡＡＶベクターおよびＡＡＶビリオンは、交換可能に使用される。

一部の実施形態では、反復投薬を可能にする合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団であって、ＡＡＶＶＰ１またはＶＰ２ウイルス構造タンパク質の少なくとも一方と、ＡＡＶＶＰ３ウイルス構造タンパク質とを含み；ＶＰ１およびＶＰ２ウイルス構造タンパク質が、各々、ＡＡＶ８ウイルス血清型からのものであり、ＶＰ３ウイルス構造タンパク質が、アカゲザルＡＡＶｒｈ１０血清型またはＡＡＶｒｈ７４血清型から選択され；合理的ポリプロイドＡＡＶ８－８－ｒｈ１０ビリオンまたはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ビリオンの集団が、親ＡＡＶ８血清型により惹起される液性応答と比較して低減された液性応答を惹起し、反復投薬が、親ＡＡＶ血清型８ビリオンの第１の投与、および合理的ポリプロイドＡＡＶ８－８－ｒｈ１０またはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ビリオンの集団の第２の投与を含む、合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団。説明のために、この特定の例では、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０またはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４は、低減された液性応答を惹起し、例えば、ＡＡＶ８ビリオンにより産生されるものと比較して少ない抗ＡＡＶ８ＩｇＧを産生する。親ＡＡＶ血清型、例えばＡＡＶ８、での第１の投与および合理的ポリプロイド（例えば、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０またはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４）での第２の投与によるこのＡＡＶ遺伝子治療レジメンは、合理的ポリプロイド（例えば、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０またはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４）の第２の投与で効率的な形質導入を達成するのに好適である。図２６に示されているように、ＡＡＶ８による第１の投与は、ＡＡＶ８媒介形質導入を中和または阻害することができる抗ＡＡＶ８ＩｇＧを血清中で産生するが、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０またはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４媒介形質導入は、抗ＡＡＶ８ＩｇＧを含有する血清の存在下で阻害されず、この結果として、第１の投与がＡＡＶ８でのものである場合の第２の投与としてのＡＡＶ８－８－ｒｈ１０またはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４の好適な使用が裏付けられる。

一部の実施形態では、反復投薬を可能にする合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団であって、ＡＡＶＶＰ１またはＶＰ２ウイルス構造タンパク質の少なくとも一方と、ＡＡＶＶＰ３ウイルス構造タンパク質とを含み；ＶＰ１およびＶＰ２ウイルス構造タンパク質が、各々、任意のＡＡＶウイルス血清型からのものであり、ＶＰ３ウイルス構造タンパク質が、アカゲザルＡＡＶ血清型から選択され；合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団が、ＶＰ１またはＶＰ２ウイルス構造タンパク質の親ＡＡＶ血清型により惹起される液性応答と比較して低減された液性応答を惹起し、ＶＰ１およびＶＰ２が、ＲｈｅｓｕｓＡＡＶ血清型からのものではなく、反復投薬が、ＶＰ１構造ウイルスタンパク質またはＶＰ２構造ウイルスタンパク質の親ＡＡＶ血清型の第１の投与、および合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団の第２の投与を含む、合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団。

一部の実施形態では、第１および第２の投与を含む反復投薬のための方法であって、反復投薬が、ＶＰ１またはＶＰ２ウイルス構造タンパク質の親ＡＡＶ血清型の第１の投与、および合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの第２の投与を含み、合理的ポリプロイドビリオンのＶＰ３ウイルス構造タンパク質が、血液脳関門を効率的横断する、ＶＰ１またはＶＰ２ウイルス構造タンパク質の少なくとも一方の血清型とは異なるＡＡＶ血清型からのものであり、合理的ポリプロイドビリオンの集団が、ＶＰ１またはＶＰ２ウイルス構造タンパク質の親ＡＡＶ血清型により惹起される液性応答と比較して低減された液性応答を惹起し、ＶＰ１またはＶＰ２が、ＲｈｅｓｕｓＡＡＶ血清型からのものではない、方法。

本発明の改変カプシドタンパク質、ウイルスカプシド、ウイルスベクターおよびＡＡＶ粒子が、それらがそれらのネイティブな状態で存在するまたは見いだされる場合のカプシドタンパク質、カプシド、ウイルスベクターおよびＡＡＶ粒子を除外することは、当業者には理解されるであろう。
ＶＩＩ．ウイルスベクターを産生する方法

本明細書で開示されるＡＡＶ合理的ベクターは、当技術分野において周知の任意の手段により産生され得る。例示的な例としてＡＡＶハプロイドビリオンを使用する、単なる説明に役立つ例として、方法は、（ａ）ＡＡＶハプロイド粒子を組み立てるために必要な全ての機能および遺伝子を一緒に提供する１つもしくは複数のプラスミドを宿主細胞にトランスフェクトするステップ；（ｂ）ＡＡＶハプロイド粒子を組み立てるために必要な全ての機能および遺伝子を一緒に提供するために１つもしくは複数の核酸構築物をパッケージング細胞系もしくはプロデューサー細胞系に導入するステップ；（ｃ）ＡＡＶハプロイド粒子を組み立てるために必要な全ての機能および遺伝子を一緒に提供する１つもしくは複数の組換えバキュロウイルスベクターを宿主細胞に導入するステップ；ならびに／または（ｄ）ＡＡＶハプロイド粒子を組み立てるために必要な全ての機能および遺伝子を一緒に提供する、１つもしくは複数のミニサークルを宿主細胞に導入する、または閉じた線状のＤＮＡ（ｃｌＤＮＡ）もしくはバーベル型ＤＮＡを使用するステップを含む。

本明細書で開示されるものは、本明細書で開示の合理的ポリプロイドまたはハプロイドＡＡＶベクターをＡＡＶ粒子として産生する方法をさらに提供する。したがって、本発明は、本発明の合理的ポリプロイドＡＡＶベクターを含むＡＡＶハプロイドビリオン粒子を作製する方法であって、（ａ）ＡＡＶハプロイドベクター粒子を組み立てるために必要な全ての機能および遺伝子を一緒に提供する１つもしくは複数のプラスミドを宿主細胞にトランスフェクトするステップ；（ｂ）ＡＡＶ粒子を組み立てるために必要な全ての機能および遺伝子を一緒に提供するために１つもしくは複数の核酸構築物をパッケージング細胞系またはプロデューサー細胞系に導入するステップ；（ｃ）ＡＡＶ粒子を組み立てるために必要な全ての機能および遺伝子を一緒に提供する１つもしくは複数の組換えバキュロウイルスベクターを宿主細胞に導入するステップ；ならびに／または（ｄ）ＡＡＶ粒子を組み立てるために必要な全ての機能および遺伝子を一緒に提供する１つもしくは複数の組換えヘルペスウイルスベクターを宿主細胞に導入するステップを含む。ＡＡＶハプロイドビリオンの形成のための条件は、Ａｄヘルパープラスミド、または他のヘルパーウイルス、例えばＨＳＶ、の存在下での細胞へのトランスフェクションを非限定的な例として含む、細胞（例えば、哺乳動物または昆虫細胞）におけるＡＡＶベクターの産生のための標準的な条件である。

本発明のウイルスベクターを作製する様々な方法の非限定的な例は、Clement and Grieger ("Manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors for clinical trials" Mol. Ther. Methods Clin Dev. 3:16002 (2016))に、およびGrieger et al. ("Production of recombinant adeno-associated virus vectors using suspension HEK293 cells and continuous harvest of vector from the culture media for GMP FIX and FLT1 clinical vector" Mol Ther 24(2):287-297 (2016))に記載されており、これらの全内容が参照により本明細書に組み込まれる。

１つの代表的な実施形態では、この技術は、ウイルスベクターを産生する方法であって、（ａ）少なくとも１つのＴＲ配列（例えば、ＡＡＶＴＲ配列）を含む核酸鋳型と（ｂ）核酸鋳型の複製およびＡＡＶカプシドへのカプシド内封入に十分なＡＡＶ配列（例えば、本発明のＡＡＶカプシドをコードする、ＡＡＶｒｅｐ配列およびＡＡＶｃａｐ配列）とを細胞に提供するステップを含む方法も提供する。必要に応じて、核酸鋳型は、少なくとも１つの異種核酸配列をさらに含む。特定の実施形態では、核酸鋳型は、２つのＡＡＶＩＴＲ配列を含み、これらの配列は、異種核酸配列（存在する場合）の５’および３’側に位置するが、その異種核酸配列と直接連続している必要はない。

核酸鋳型ならびにＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ配列は、ＡＡＶカプシド内にパッケージングされた核酸鋳型を含むウイルスベクターが細胞内で産生されるような条件下で提供される。方法は、細胞からウイルスベクターを収集するステップをさらに含み得る。ウイルスベクターは、培地から、および／または細胞を溶解することにより、収集され得る。

一実施形態では、および本明細書において実施例で開示されるように、核酸鋳型は、カプシド（Ｃａｐ）配列が、１つの血清型のみからの核酸配列（第１の核酸配列）から３つ全てのウイルス構造タンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３、を発現することができないように変更される。この変更は、例えば、ウイルス構造タンパク質のうちの少なくとも１つについてのスタートコドンを消失させることによるものであり得る。鋳型は、第１の核酸配列により発現され得ないウイルス構造タンパク質をコードしそれを発現することができる異なる血清型からの少なくとも１つの追加の核酸配列（第２の核酸配列）も含有することになり、第２の核酸配列は、第１の核酸配列により発現され得るウイルス構造タンパク質を発現することができない。一実施形態では、第１の核酸配列は、ウイルス構造タンパク質のうちの２つを発現することができるが、第２の核酸配列は、残りのウイルス配列しか発現することができない。例えば、第１の核酸配列は、１つの血清型からのＶＰ１およびＶＰ２を発現することができるがＶＰ３を発現することができず、第２の核酸配列は、代替血清型からのＶＰ３を発現することができるが、ＶＰ１もＶＰ２も発現することができない。鋳型は、３つのウイルス構造タンパク質のいずれの他のウイルス構造タンパク質も発現することができない。一実施形態では、第１の核酸配列は、３つのウイルス構造タンパク質のうちの１つを発現することのみができ、第２の核酸配列は、他の２つのウイルス配列のみを発現することができるが、第１のものを発現できない。

別の実施形態では、第３の血清型からの第３の核酸配列が存在する。この実施形態では、３つの核酸配列の各々は、３つのカプシドウイルス構造タンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３、のうちの１つを発現することのみができ、各々は、これらの配列の別のものにより発現されるウイルス構造タンパク質を発現せず、したがって、集合的に、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３を含有するカプシドが産生され、カプシド内のウイルス構造タンパク質の各々は、全て、同じ血清型のみからのものであり、この実施形態では、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３は、全て、異なる血清型からのものである。

発現を防止するための変更は、当技術分野において公知の任意の手段により得る。例えば、スタートコドン、スプライスアクセプター、スプライスドナー、およびこれらの組合せを消失させる手段などである。欠失および付加はもちろん、リーディングフレームを変化させるための部位特異的変化も、使用することができる。核酸配列を合成によって産生することもできる。これらのヘルパー鋳型は、典型的にはＩＴＲを含有しない。

細胞は、ＡＡＶウイルス複製可能である細胞であり得る。当技術分野において公知の任意の好適な細胞を利用することができる。特定の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。別の選択肢として、細胞は、複製欠損型ヘルパーウイルスから欠失した機能を提供するトランス補足パッケージング細胞系、例えば、２９３細胞または他のＥ１ａトランス補足細胞であり得る。

ＡＡＶ複製およびカプシド配列は、当技術分野において公知の任意の方法により提供することができる。現行のプロトコールは、概して、単一のプラスミド上にＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を発現する。ＡＡＶ複製およびパッケージング配列を一緒に提供する必要はないが、そうするのが適便であり得る。ＡＡＶｒｅｐおよび／またはｃａｐ配列は、任意のウイルスまたは非ウイルスベクターにより提供することができる。例えば、ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、ハイブリッドアデノウイルスまたはヘルペスウイルスベクター（例えば、欠失アデノウイルスベクターのＥ１ａまたはＥ３領域に挿入された）により提供することができる。ＥＢＶベクターを利用して、ＡＡＶｃａｐおよびｒｅｐ遺伝子を発現させることもできる。この方法の１つの利点は、ＥＢＶベクターが、エピソーム性であるが、一連の細胞分裂を通して高コピー数を維持することになる（すなわち、「ＥＢＶに基づく核内エピソーム」と名付けられた染色体外エレメントとして細胞に安定的に組み込まれる。Margolski, (1992) Curr. Top. Microbiol. Immun. 158:67を参照されたい）ことである。

さらなる代替案として、ｒｅｐ／ｃａｐ配列を細胞に安定的に組み込むことができる。典型的に、ＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ配列は、これらの配列のレスキューおよび／またはパッケージングを防止するために末端リピート（ＴＲ）と隣接しないことになる。

当技術分野において公知の任意の方法を使用して、核酸鋳型を細胞に提供することができる。例えば、鋳型を非ウイルス（例えば、プラスミド）またはウイルスベクターにより供給することができる。特定の実施形態では、核酸鋳型は、ヘルペスウイルスまたはアデノウイルスベクターにより供給される（例えば、欠失アデノウイルスのＥ１ａまたはＥ３領域に挿入される）。別の実例として、Palombo et al., (1998) J. Virology 72:5025には、ＡＡＶＴＲと隣接しているレポーター遺伝子を保有するバキュロウイルスベクターが記載されている。ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子に関して上で説明されたようなＥＢＶベクターを利用して鋳型を送達することもできる。

別の代表的な実施形態では、核酸鋳型は、ｒＡＡＶウイルスの複製により提供される。さらに他の実施形態では、核酸鋳型を含むＡＡＶプロウイルスが細胞の染色体に安定的に組み込まれる。

ウイルス力価を向上させるために、増殖性ＡＡＶ感染を促進するヘルパーウイルス機能（例えば、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）を細胞に提供することができる。ＡＡＶ複製に必要なヘルパーウイルス配列は、当技術分野において公知である。典型的に、これらの配列は、ヘルパーアデノウイルスまたはヘルペスウイルスベクターにより提供されることになる。あるいは、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス配列は、例えば、Ferrari et al., (1997) Nature Med. 3:1295、ならびに米国特許第６，０４０，１８３号および同第６，０９３，５７０号により記載されているような効率的ＡＡＶ産生を促進するヘルパー遺伝子の全てを保有する非感染性アデノウイルスミニプラスミドのような、別の非ウイルスまたはウイルスベクターにより、提供することができる。

さらに、ヘルパーウイルス機能は、ヘルパー配列が染色体に埋め込まれているまたは安定な細胞外エレメントとして維持されているパッケージング細胞により、提供することができる。一般に、ヘルパーウイルス配列は、ＡＡＶビリオンにパッケージングされることがなく、例えば、ＴＲと隣接していない。

単一のヘルパー構築物でＡＡＶ複製およびカプシド配列ならびにヘルパーウイルス配列（例えば、アデノウイルス配列）を提供することが有利であることが、当業者には理解されるであろう。このヘルパー構築物は、非ウイルス構築物であることもあり、またはウイルス構築物であることもある。１つの非限定的な実例として、ヘルパー構築物は、ＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を含む、ハイブリッドアデノウイルスまたはハイブリッドヘルペスウイルスであり得る。

１つの特定の実施形態では、ＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターにより供給される。このベクターは、核酸鋳型をさらに含むことができる。ＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ配列および／またはｒＡＡＶ鋳型は、アデノウイルスの欠失領域（例えば、Ｅ１ａまたはＥ３領域）に挿入することができる。

さらなる実施形態では、ＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターにより供給される。この実施例によると、ｒＡＡＶ鋳型は、プラスミド鋳型として提供することができる。

別の説明に役立つ実施形態では、ＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターにより提供され、ｒＡＡＶ鋳型は、細胞にプロウイルスとして組み込まれる。あるいは、ｒＡＡＶ鋳型は、細胞内に染色体外エレメントとして（例えば、ＥＢＶに基づく核内エピソームとして）維持されるＥＢＶベクターにより提供される。

さらなる例示的な実施形態では、ＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーにより提供される。ｒＡＡＶ鋳型は、別の複製ウイルスベクターとして提供することができる。例えば、ｒＡＡＶ鋳型は、ｒＡＡＶ粒子または第２の組換えアデノウイルス粒子により提供することができる。

上述の方法によると、ハイブリッドアデノウイルスベクターは、典型的に、アデノウイルス複製およびパッケージングに十分なアデノウイルス５’および３’シス配列（すなわち、アデノウイルス末端リピートおよびＰＡＣ配列）を含む。ＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ配列、および存在する場合にはｒＡＡＶ鋳型は、アデノウイルス骨格に埋め込まれており、５’および３’シス配列と隣接しており、したがって、これらの配列は、アデノウイルスカプシドにパッケージングされ得る。上記のように、アデノウイルスヘルパー配列およびＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ配列は、一般に、ＴＲと隣接しておらず、したがって、これらの配列は、ＡＡＶビリオンにパッケージングされない。Zhang et al., ((2001) Gene Ther. 18:704-12)には、アデノウイルスとＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子とを両方とも含むキメラヘルパーが記載されている。

ヘルペスウイルスをＡＡＶパッケージング方法においてヘルパーウイルスとして使用することもできる。ＡＡＶＲｅｐタンパク質をコードするハイブリッドヘルペスウイルスは、有利なことに、スケーラブルなＡＡＶベクター産生スキームを容易にすることができる。ＡＡＶ－２ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を発現するハイブリッド単純ヘルペスウイルスＩ型（ＨＳＶ－１）が記載されている（Conway et al., (1999) Gene Therapy 6:986およびＷＯ００／１７３７７）。

さらなる代替案として、本発明のＡＡＶハプロイドベクターを、例えば、Urabe et al., (2002) Human Gene Therapy 13:1935-43により記載されているように、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子およびｒＡＡＶ鋳型を送達するためにバキュロウイルスベクターを使用して、昆虫細胞において産生することもできる。

夾雑ヘルパーウイルスのないＡＡＶハプロイドベクターストックは、当技術分野において公知の任意の方法により得ることができる。例えば、ＡＡＶとヘルパーウイルスは、サイズに基づいて容易に区別することができる。ＡＡＶハプロイドベクターは、ヘパリン基質に対する親和性に基づいてヘルパーウイルスから分離することもできる（Zolotukhin et al. (1999) Gene Therapy 6:973）。いずれの夾雑ヘルパーウイルスも複製可能でないように、欠失複製欠損型ヘルパーウイルスを使用することができる。さらなる代替案として、アデノウイルス早期遺伝子発現しかＡＡＶウイルスのパッケージングの媒介には必要とされないので、後期遺伝子発現を欠いているアデノウイルスヘルパーを利用することができる。後期遺伝子発現が欠如しているアデノウイルス変異体は、当技術分野において公知である（例えば、ｔｓ１００Ｋおよびｔｓ１４９アデノウイルス変異体）。

一部の実施形態では、本明細書で開示のｒＡＶＶハプロイドベクターを生成するための方法は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，４４１，２０６号に記載されているような方法に従って、ｒＡＡＶ産生細胞系を使用することができる。特に、ＡＡＶハプロイドベクターまたはｒＡＡＶビリオンは、（ａ）ＡＡＶハプロイドベクター発現系をｒＡＡＶ産生細胞系に提供するステップ、（ｂ）ＡＡＶハプロイド粒子が産生される条件下で細胞を培養するステップ、および（ｃ）必要に応じて、ＡＡＶハプロイドベクター粒子を単離するステップを含む方法を使用して産生される。ＸＸ６８０、ＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐヘルパーおよびＴＲプラスミドのプラスミドの比を変えて、ｒＡＡＶベクター産生に最適なプラスミドの比を決定することで、プラスミドのトリプルトランスフェクションの比およびトランスフェクションカクテルの体積を最適化することができる。

一部の例では、細胞は、ＡＡＶ８ハプロイド粒子が産生される条件下、懸濁状態で培養される。別の実施形態では、細胞は、動物由来成分不含条件で培養される。動物由来成分不含培地は、ｒＡＡＶプロデューサー細胞系に適合するいずれの動物由来成分不含培地（例えば、無血清培地）であってもよい。例としては、ＳＦＭ４Ｔｒａｎｓｆｘ－２９３（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、Ｅｘ－Ｃｅｌｌ２９３（ＪＲＨＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＬＣ－ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＰｒｏ１０細胞、またはＰｒｏ２９３－Ｓ（Ｌｏｎｚａ）が挙げられるが、これらに限定されない。ＡＡＶ粒子の複製およびパッケージングに十分な条件は、例えば、本明細書に記載されるｒＡＡＶゲノムの複製およびＡＡＶカプシドへのカプシド内封入に十分なＡＡＶ配列（例えば、ＡＡＶｒｅｐ配列およびＡＡＶｃａｐ配列）ならびにアデノウイルスおよび／またはヘルペスウイルスからのヘルパー配列の存在であり得る。

プラスミド骨格からの細菌ＤＮＡ配列は、組換えＡＡＶベクターの製造中にうっかりＡＡＶ８ハプロイドカプシドにパッケージングされ、その結果、ＴＬＲ９とのその相互作用によって自然免疫系の活性化に至ることがある（Akira, 2006；Chadeuf, 2005；Wright, 2014）。したがって、一部の実施形態では、組換えＡＡＶハプロイド調製物中のプラスミド骨格配列を消失させるために様々な技術、例えば、限られたスケーラビリティーを有するミニサークル（Schnodt, 2016）が使用され得る。プラスミド骨格中の細菌ＤＮＡ配列を回避するための別の方法は、組換えＡＡＶベクターの特異的製造のための、ドギーボーンＤＮＡ（ｄｂＤＮＡ（商標））を含むがこれらに限定されない様々なＤＮＡ複製技術を含む、末端が閉じた線状の二重鎖ＤＮＡの使用である。ｄｂＤＮＡ（商標）などの、末端が閉じた線状の二重鎖ＤＮＡの使用は、細菌骨格を消失させ、ワクチンおよびレンチウイルスを生産するために使用されており（Walters et al, 2014；Scott et al, 2015；Karda et al, 2019）、ＤＮＡワクチン開発者によりＴＬＲ９応答を誘発できないことが示された。

したがって、代替実施形態では、例えばＡＡＶ８－８－ｒｈ１０またはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドの産生により例示される、本明細書で開示の合理的のポリプロイドまたはハプロイドＡＡＶベクターの生成は、米国特許出願公開第２０１８／００３７９４３号およびKarbowniczek et al., Bioinsights, 2017において開示されているような、バーベル型ＤＮＡを含むがこれに限定されない、末端が閉じた線状の二重鎖ＤＮＡを使用して行うことができ、前記参考文献の両方は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。手短に言えば、末端が閉じた線状の二重鎖ＤＮＡ技術を使用するＡＡＶ産生のためのプラスミドは、ＩＴＲを含み、プロモーターおよび目的の遺伝子が、５６ｂｐパリンドロームプロテロメラーゼ認識配列と隣接している。プラスミドが変性され、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ、および適切なプライマーの存在下で、Ｐｈｉ２９は、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を開始し、その結果、元の構築物の二本鎖コンカテマーリピート（cancatameric repeats）が作出される。プロテロメラーゼが添加されると、パリンドロームプロテロメラーゼ認識配列の結合が起こり、切断－結合反応が起こって、単量体の二本鎖（ｄｓ）の線状の共有結合で閉じたＤＮＡ構築物が生じる結果となる。一般的な制限酵素の添加によって、望ましくないＤＮＡプラスミド骨格配列、およびエキソヌクレアーゼ活性による消化が除去され、その結果、ｄｂＤＮＡが生じ、それをサイズ分画して、ＩＴＲとプロモーターと目的の遺伝子とをコードするｄｂＤＮＡ配列を単離することができる。ｄｂＤＮＡ（商標）技術などの末端が閉じた線状の二重鎖ＤＮＡを使用するｒＡＡＶベクターの生成のための例示的なプラスミドは、以下の５’から３’への方向で、５’－プロテロメラーゼＲＳ、５’ＩＴＲ、ＬＳＰプロモーター、ｈＧＡＡ、３’ＵＴＲ、ｈＧＨポリ（Ａ）、３’ＩＴＲ、３’－プロテロメラーゼＲＳ（センス鎖）を含み、センス鎖は、鎖状（ｄｓ）の線状の共有結合で閉じたＤＮＡ構築物については相補アンチセンス鎖に連結されている。本明細書で開示の方法および組成物における使用のためのＡＡＶベクターを製造するための出発材料としての、末端が閉じた線状の二重鎖ＤＮＡ、例えばドギーボーンＤＮＡ（ｄｂＤＮＡ（商標））、の使用によって、ＡＡＶベクターを含有するプラスミドを増殖させるために使用される細菌骨格がなくなり、その産物は、Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）応答を誘発することができない。

ＡＡＶ粒子を作製するさらなる方法は当技術分野において周知であり、例えば、米国特許第６２０４０５９号、同第５７５６２８３号、同第６２５８５９５号、同第６２６１５５１号、同第６２７０９９６号、同第６２８１０１０号、同第６３６５３９４号、同第６４７５７６９号、同第６４８２６３４号、同第６４８５９６６号、同第６９４３０１９号、同第６９５３６９０号、同第７０２２５１９号、同第７２３８５２６号、同第７２９１４９８および同第７４９１５０８号、同第５０６４７６４号、同第６１９４１９１号、同第６５６６１１８号、同第８１３７９４８号；または国際公開番号ＷＯ１９９６０３９５３０、同Ｗ０１９９８０１００８８、同ＷＯ１９９９０１４３５４、同ＷＯ１９９９０１５６８５、同ＷＯ１９９９０４７６９１、同Ｗ０２００００５５３４２、同Ｗ０２００００７５３５３および同Ｗ０２００１０２３５９７；Methods In Molecular Biology, ed. Richard, Humana Press, NJ (1995)；O'Reilly et ah, Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, Oxford Univ. Press (1994)；Samulski et al.,,/. Vir.63:3822-8 (1989)；Kajigaya et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 88: 4646-50 (1991)；Ruffing et al., J. Vir. 66:6922-30 (1992)；Kimbauer et al., Vir., 219:37-44 (1996)；Zhao et al., Vir.272: 382-93 (2000)に記載されており、これらの参考文献の各々の内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、国際特許公開Ｗ０２０１５１９１５０８に記載されている方法を使用して作製され、この参考特許文献の内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

ウイルス複製細胞は、原核（例えば、細菌）細胞と、昆虫細胞、酵母細胞および哺乳動物細胞をはじめとする真核細胞とを含む、任意の生物学的生命体から選択され得る。組換えＡＡＶウイルス粒子の産生に一般的に使用されるウイルス複製細胞には、これらに限定されないが、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＫＢ細胞、ならびに米国特許第６１５６３０３号、同第５３８７４８４号、同第５７４１６８３号、同第５６９１１７６号および同第５６８８６７６号、米国特許出願公開第２００２／００８１７２１号、および国際特許出願番号ＷＯ２００００４７７５７、同ＷＯ２００００２４９１６および同ＷＯ１９９６０１７９４７に記載されているような他の哺乳動物細胞系が含まれ、これらの参考特許文献の各々の内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。ウイルス複製細胞は、他の哺乳動物細胞、例えば、哺乳動物に由来するＡ５４９、ＷＥＨ１、３Ｔ３、１０Ｔ１／２、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＢＭＴ１０、ＶＥＲＯ、Ｗ１３８、Ｓａｏｓ、Ｃ２Ｃ１２、Ｌ細胞、ＨＴ１０８０、ＨｅｐＧ２ならびに初代線維芽細胞、肝細胞および筋芽細胞を含み得る。ウイルス複製細胞は、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギおよびハムスターを含むがこれらに限定されない哺乳動物種に由来する細胞を含み得る。ウイルス複製細胞は、線維芽細胞、肝細胞、腫瘍細胞、細胞系形質転換細胞などを含むがこれらに限定されない細胞型に由来する細胞を含み得る。
ＶＩＩＩ．組換えＡＡＶポリプロイドウイルスベクター

本発明は、細胞に核酸分子を投与する方法であって、細胞を本発明のｒＡＶＶハプロイドウイルスベクターおよび／または組成物または医薬製剤と接触させるステップを含む方法を提供する。

本発明は、核酸を対象に送達する方法であって、本発明のＡＡＶハプロイドウイルスベクター、ＡＡＶ粒子および／または組成物もしくは医薬製剤を対象に投与するステップを含む方法を、さらに提供する。

特定の実施形態では、対象はヒトであり、一部の実施形態では、対象は、遺伝子治療プロトコールにより処置され得る障害を有するか、またはその障害のリスクがある。そのような障害の非限定的な例としては、癲癇、うつ病、ハンチントン病、パーキンソン病またはアルツハイマー病、ＡＤＨＤ、ＡＳＤ、自己免疫疾患、嚢胞性線維症、サラセミア、ハーラー症候群、スライ症候群、シャイエ症候群、ハーラー・シェイエ症候群、ハンター症候群、サンフィリッポ症候群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、モルキオ症候群、マロトー・ラミー症候群、クラッベ病、フェニルケトン尿症、バッテン病、脊髄性大脳性運動失調症を含むがこれらに限定されない、神経学的障害；ＬＤＬ受容体欠損症；高アンモニア血症；貧血；関節炎；黄斑変性を含む、網膜変性障害；アデノシンデアミナーゼ欠損症；代謝障害；および腫瘍形成性のがんを含む、がんが、挙げられる。

本発明の方法の一部の実施形態では、本発明のｒＡＶＶハプロイドベクターおよび／または組成物もしくは医薬製剤を、骨格筋、心筋および／または横隔膜筋に投与することができる。

本明細書に記載される方法では、本発明のｒＡＶＶハプロイドベクターおよび／または組成物もしくは医薬製剤を、本発明の対象に全身経路によって（例えば、静脈内に、動脈内に、腹腔内に、など）投与／送達することができる。一部の実施形態では、ウイルスベクターおよび／または組成物を、対象に、脳室内、大槽内、実質内、頭蓋内および／またはくも膜下腔内経路によって投与することができる。特定の実施形態では、本明細書で開示の合理的ポリプロイドもしくはハプロイドＡＡＶベクターおよび／または本発明の医薬製剤は、くも膜下腔内または静脈内投与される。

本明細書で開示のｒＡＶＶハプロイドベクターは、ｉｎｖｉｔｒｏ、ｅｘｖｉｖｏおよびｉｎｖｉｖｏでの細胞への核酸分子の送達に有用である。特に、ｒＡＶＶハプロイドベクターは、有利なことに、哺乳動物細胞をはじめとする動物細胞に核酸分子を送達または移入するために利用することができる。

目的の任意の異種核酸配列を、本発明のｒＡＶＶハプロイドベクターで送達することができる。目的の核酸分子は、治療用ポリペプチド（例えば、医学的もしくは獣医学的使用のための）および／または免疫学的ポリペプチド（例えば、ワクチンのための）をはじめとするポリペプチドをコードする核酸分子を含む。

治療用ポリペプチドには、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：嚢胞性線維症膜貫通調節タンパク質（ＣＦＴＲ）、ジストロフィン（ミニジストロフィンおよびマイクロジストロフィンを含む；例えば、Vincent et al., (1993) Nature Genetics 5:130；米国特許出願公開第２００３／０１７１３１号；国際特許公開番号ＷＯ／２００８／０８８８９５、Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:13714-13719 (2000)；およびGregorevic et al., Mol. Ther. 16:657-64 (2008)を参照されたい）、ミオスタチンプロペプチド、フォリスタチン、アクチビンＩＩ型可溶性受容体、ＩＧＦ－１、抗炎症性ポリペプチド、例えばＩカッパＢ優性変異体、サルコスパン、ユートロフィン（Tinsley et al., (1996) Nature 384:349）、ミニユートロフィン、凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子など）、エリスロポエチン、アンジオスタチン、エンドスタチン、カタラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、スーパーオキシドジムスターゼ、レプチン、ＬＤＬ受容体、リポタンパク質リパーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、β－グロビン、α－グロビン、スペクトリン、α_１－アンチトリプシン、アデノシンデアミナーゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、グルコセレブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、リソソームヘキソサミニダーゼＡ、分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ、ＲＰ６５タンパク質、サイトカイン（例えば、α－インターフェロン、β－インターフェロン、インターフェロン－γ、インターロイキン－２、インターロイキン－４、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、リンホトキシンなど）、ペプチド増殖因子、神経栄養因子およびホルモン（例えば、ソマトトロロピン、インスリン、インスリン様増殖因子１および２、血小板由来増殖因子、上皮増殖因子、線維芽細胞増殖因子、神経成長因子、神経栄養因子－３および－４、脳由来神経栄養因子、骨形態形成タンパク質［ＲＡＮＫＬおよびＶＥＧＦを含む］、グリア細胞由来増殖因子、トランスフォーミング増殖因子－αおよび－βなど）、リソソーム酸性α－グルコシダーゼ、α－ガラクトシダーゼＡ、受容体（例えば、腫瘍壊死因子－α可溶性受容体）、Ｓ１００Ａ１、パルブアルブミン、アデニリルシクラーゼ６型、カルシウム処理をモジュレートする分子（例えば、ＳＥＲＣＡ_２Ａ、ＰＰ１のインヒビター１およびその断片［例えば、ＷＯ２００６／０２９３１９およびＷＯ２００７／１００４６５］）、Ｇタンパク質共役受容体キナーゼ２型ノックダウンを生じさせる分子、例えば、短縮された構成的に活性なｂＡＲＫｃｔ、抗炎症因子、例えばＩＲＡＰ、抗ミオスタチンタンパク質、アスパルトアシラーゼ、モノクローナル抗体（一本鎖モノクローナル抗体を含み、例示的なＭａｂは、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）Ｍａｂである）、ニューロペプチドおよびその断片（例えば、ガラニン、ニューロペプチドＹ（例えば、米国特許第７，０７１，１７２号を参照されたい））、血管新生阻害剤、例えば、バソヒビンおよび他のＶＥＧＦ阻害剤（例えば、バソヒビン２［ＷＯＪＰ２００６／０７３０５２を参照されたい］）。他の説明に役立つ異種核酸配列は、自殺遺伝子産物（例えば、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素、および腫瘍壊死因子）、がん治療の際に使用される薬物に対する耐性を付与するタンパク質、腫瘍抑制遺伝子産物（例えば、ｐ５３、Ｒｂ、Ｗｔ－１）、ＴＲＡＩＬ、ＦＡＳ－リガンド、およびそれを必要とする対象において治療効果がある任意の他のポリペプチドを、コードする。ＡＡＶベクターを使用して、モノクローナル抗体および抗体断片、例えば、ミオスタチンに対する抗体または抗体断片（例えば、Fang et al., Nature Biotechnology 23:584-590 (2005)を参照されたい）を送達することもできる。

ポリペプチドをコードする異種核酸配列は、レポーターポリペプチド（例えば、酵素）をコードするものを含む。レポーターポリペプチドは、当技術分野において公知であり、これらに限定されないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含む。

必要に応じて、異種核酸分子は、分泌ポリペプチド（例えば、そのネイティブな状態で分泌ポリペプチドであるポリペプチド、または分泌されるように、例えば当技術分野において公知であるような分泌シグナル配列との作動可能な会合によって、操作されたポリペプチド）をコードする。

あるいは、本発明の特定の実施形態では、異種核酸分子は、アンチセンス核酸分子、リボザイム（例えば、米国特許第５，８７７，０２２号に記載されているような）、スプライソソーム媒介トランススプライシングを生じさせるＲＮＡ（例えば、Puttaraju et al., (1999) Nature Biotech. 17:246；米国特許第６，０１３，４８７号、同第６，０８３，７０２号を参照されたい）、遺伝子サイレンシングを媒介するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡをはじめとする干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）（Sharp et al., (2000) Science 287:2431 を参照されたい）、および他の非翻訳ＲＮＡ、例えば、「ガイド」ＲＮＡ（Gorman et al., (1998) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95:4929；Ｙｕａｎらの米国特許第５，８６９，２４８号）などをコードし得る。

一態様では、合理的ポリプロイドベクターは、ＲＮＡｉ剤ペイロードをコードするウイルスゲノムを含み、例えば、ＲＮＡｉ剤は、これらに限定されないが、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、またはｓｎｏＲＮＡであり得る。ＲＮＡｉ剤は、発現されると、細胞における目的の遺伝子の発現を阻害または抑制し、目的の遺伝子は、これらに限定されないが、ＳＯＤ１、ＭＡＰＴ、ＡＰＯＥ、ＨＴＴ、Ｃ９０ＲＦ７２、ＴＤＰ－４３、ＡＰＰ、ＢＡＣＥ、ＳＮＣＡ、ＡＴＸＮ１、ＡＴＸＮ２、ＡＴＸＮ３、ＡＴＸＮ７、ＳＣＮ１Ａ－ＳＣＮ５Ａ、またはＳＣＮ８Ａ－ＳＣＮ１１Ａであり得る。

一態様では、本明細書で開示される合理的ポリプロイドベクターは、ポリペプチドペイロードをコードするウイルスゲノムを含む。ポリペプチドは、これらに限定されないが、抗体、芳香族Ｌ－アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）、生存運動ニューロン１（ＳＭＮ１）、フラタキシン（ＦＸＮ）、ＡＰＯＥ（ＡＰＯＥ２、ＡＰＯＥ３もしくはＡＰＯＥ４）、ＧＢＡ１、ＧＲＮ、ＡＳＰＡ、ＣＬＮ２、ＧＬＢ１、ＳＧＳＨ、ＮＡＧＬＵ、ＩＤＳ、ＮＰＣ１、またはＧＡＮであり得る。

例示的な非翻訳ＲＮＡとしては、多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子産物に対するＲＮＡｉ（例えば、腫瘍を処置および／もしくは予防するための、ならびに／または化学療法による損傷を予防するために心臓に投与するためのもの）；ミオスタチンに対するＲＮＡｉ（例えば、デュセンヌ型筋ジストロフィーのためのもの）；ＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ（例えば、腫瘍を治療および／または予防するためのもの）；ホスホランバンに対するＲＮＡｉ（例えば、心血管疾患を処置するためのもの；例えば、Andino et al., J. Gene Med. 10:132-142 (2008)およびLi et al., Acta Pharmacol Sin. 26:51-55 (2005)を参照されたい）；ホスホランバン阻害またはドミナントネガティブ分子、例えばホスホランバンＳ１６Ｅ（例えば、心血管疾患を処置するためのもの；例えば、Hoshijima et al. Nat. Med. 8:864-871 (2002)を参照されたい）、アデノシンキナーゼに対するＲＮＡｉ（例えば、癲癇のためのもの）、ならびに病原性生物およびウイルス（例えば、Ｂおよび／またはＣ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ＣＭＶ、単純ヘルペスウイルス、ヒトパピローマウイルスなど）に対するＲＮＡｉが挙げられる。

さらに、選択的スプライシングを指令する核酸配列を送達することができる。例を挙げて説明すると、ジストロフィンの第５１番エクソンの５’および／または３’スプライス部位と相補的なアンチセンス配列（または他の阻害配列）を、このエクソンのスキッピングを誘導するためのＵ１またはＵ７核内低分子（ｓｎ）ＲＮＡプロモーターとともに送達することができる。例えば、アンチセンス／阻害配列の５’側に位置するＵ１またはＵ７ｓｎＲＮＡプロモーターを含むＤＮＡ配列を本発明の改変カプシドにパッケージングし、送達することができる。

ウイルスベクターは、宿主細胞染色体上の遺伝子座と相同性を共有しそれと組み換わる、異種核酸分子も含み得る。この手法を利用して、例えば、宿主細胞における遺伝子欠損を修正することができる。

本発明は、例えばワクチン接種用の、免疫原性ポリペプチド、ペプチドおよび／またはエピトープを発現するｒＡＶＶハプロイドベクターも提供する。核酸分子は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、インフルエンザウイルス、ＨＩＶまたはＳＩＶｇａｇタンパク質、腫瘍抗原、がん抗原、細菌抗原、ウイルス抗原などからの免疫原を含むがこれらに限定されない、当技術分野において公知の、目的の任意の免疫原をコードし得る。

ワクチンベクターとしてのパルボウイルスの使用は、当技術分野において公知である（例えば、Miyamura et al., (1994) Proc. Nat. Acad. Sci USA 91:8507；Ｙｏｕｎｇらの米国特許第５，９１６，５６３号；Ｍａｚｚａｒａらの米国特許第５，９０５，０４０号；米国特許第５，８８２，６５２号；およびＳａｍｕｌｓｋｉらの米国特許第５，８６３，５４１号を参照されたい）。抗原は、パルボウイルスカプシド内に提示され得る。あるいは、免疫原または抗原は、組換えベクターゲノムに導入された異種核酸分子から発現され得る。本明細書に記載の、および／または当技術分野において公知であるような、目的の任意の免疫原または抗原を、本発明のウイルスベクターによって提供することができる。

本明細書で開示のワクチンとして使用するためのｒＡＡＶハプロイドベクターによる送達のための免疫原性ポリペプチドは、微生物、細菌、原生動物、寄生虫、真菌および／もしくはウイルス感染症、ならびに微生物性、細菌性、原生動物性、寄生虫性、真菌性および／もしくはウイルス性疾患を含むがこれらに限定されない、感染症および／もしくは疾患に対する免疫応答を惹起するのに好適な、ならびに／または感染症および／もしくは疾患から対象を守るのに好適な、任意のポリペプチド、ペプチドおよび／またはエピトープであり得る。例えば、免疫原性ポリペプチドは、オルソミクソウイルス免疫原（例えば、インフルエンザウイルス免疫原、例えば、インフルエンザウイルス血球凝集素（ＨＡ）表面タンパク質もしくはインフルエンザウイルス核タンパク質、またはウマインフルエンザウイルス免疫原）、またはレンチウイルス免疫原（例えば、ウマ伝染性貧血ウイルス免疫原、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）免疫原、またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）免疫原、例えば、ＨＩＶもしくはＳＩＶエンベロープＧＰ１６０タンパク質、ＨＩＶもしくはＳＷマトリックス／カプシドタンパク質、ならびにＨＩＶもしくはＳＩＶｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子産物）であり得る。免疫原性ポリペプチドはまた、アレナウイルス免疫原（例えば、ラッサ熱ウイルス免疫原、例えば、ラッサ熱ウイルスヌクレオカプシドタンパク質およびラッサ熱ウイルスエンベロープ糖タンパク質）、ポックスウイルス免疫原（例えば、ワクシニアウイルス免疫原、例えば、ワクシニアＬ１またはＬ８遺伝子産物）、フラビウイルス免疫原（例えば、黄熱病ウイルス免疫原または日本脳炎ウイルス免疫原）、フィロウイルス免疫原（例えば、エボラウイルス免疫原、またはマールブルグウイルス免疫原、例えばＮＰおよびＧＰ遺伝子産物）、ブニヤウイルス免疫原（例えば、ＲＶＦＶ、ＣＣＨＦおよび／またはＳＦＳウイルス免疫原）、またはコロナウイルス免疫原（例えば、感染性ヒトコロナウイルス免疫原、例えばヒトコロナウイルスエンベロープ糖タンパク質、またはブタ伝染性胃腸炎ウイルス免疫原、またはトリ伝染性気管支炎ウイルス免疫原）であり得る。免疫原性ポリペプチドは、さらに、ポリオ免疫原、ヘルペス免疫原（例えば、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＨＳＶ免疫原）、流行性耳下腺炎免疫原、麻疹免疫原、風疹免疫原、ジフテリア毒素もしくは他のジフテリア免疫原、百日咳抗原、肝炎（例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎など）免疫原、および／または当技術分野において現在公知のもしくは後に免疫原として同定される任意の他のワクチン免疫原であり得る。

あるいは、免疫原性ポリペプチドは、任意の腫瘍またはがん細胞抗原であり得る。必要に応じて、腫瘍またはがん抗原は、がん細胞の表面に発現される。例示的ながんおよび腫瘍細胞抗原は、S. A. Rosenberg (Immunity 10:281 (1991))に記載されている。他の説明に役立つがんおよび腫瘍抗原には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：ＢＲＣＡ１遺伝子産物、ＢＲＣＡ２遺伝子産物、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＧＡＧＥ－１／２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＤＫ－４、β－カテニン、ＭＵＭ－１、カスパーゼ－８、ＫＩＡＡ０２０５、ＨＰＶＥ、ＳＡＲＴ－１、ＰＲＡＭＥ、ｐ１５、黒色腫腫瘍抗原（Kawakami et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3515；Kawakami et al., (1994) J. Exp. Med., 180:347；Kawakami et al., (1994) Cancer Res. 54:3124）、ＭＡＲＴ－１、ｇｐ１００ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－２、ＭＡＧＥ－３、ＣＥＡ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、Ｐ－１５、チロシナーゼ（Brichard et al., (1993) J. Exp. Med. 178:489）；ＨＥＲ－２／ｎｅｕ遺伝子産物（米国特許第４，９６８，６０３号）、ＣＡ１２５、ＬＫ２６、ＦＢ５（エンドシアリン）、ＴＡＧ７２、ＡＦＰ、ＣＡ１９－９、ＮＳＥ、ＤＵ－ＰＡＮ－２、ＣＡ５０、ＳＰａｎ－１、ＣＡ７２－４、ＨＣＧ、ＳＴＮ（シアリルＴｎ抗原）、ｃ－ｅｒｂＢ－２タンパク質、ＰＳＡ、Ｌ－ＣａｎＡｇ、エストロゲン受容体、乳脂肪グロブリン、ｐ５３腫瘍抑制タンパク質（Levine, (1993) Ann. Rev. Biochem. 62:623）；ムチン抗原（国際特許公開番号ＷＯ９０／０５１４２）；テロメラーゼ；核マトリックスタンパク質；前立腺性酸性ホスファターゼ；パピローマウイルス抗原；ならびに／または以下のがんに関連することが現在公知のもしくは後に発見される抗原：黒色腫、腺癌、胸腺腫、リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫）、肉腫、肺がん、肝臓がん、結腸がん、白血病、子宮がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、膀胱がん、腎臓がん、膵臓がん、脳がん、および現在公知のもしくは後に同定される任意の他のがんもしくは悪性状態（例えば、Rosenberg, (1996) Ann. Rev. Med. 47:481-91を参照されたい）。

さらなる代替案として、異種核酸分子は、望ましくは細胞においてｉｎｖｉｔｒｏ、ｅｘｖｉｖｏ、またはｉｎｖｉｖｏで産生される、任意のポリペプチド、ペプチドおよび／またはエピトープをコードし得る。例えば、ＡＡＶハプロイドベクターを、培養細胞およびそれらから単離された発現遺伝子産物に、導入することができる。

目的の異種核酸分子を適切な制御配列と作動可能に会合させることができることが、当業者には理解されるであろう。例えば、異種核酸分子を、発現制御エレメント、例えば、転写／翻訳制御シグナル、複製起点、ポリアデニル化シグナル、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、プロモーター、および／またはエンハンサーなどと作動可能に会合させることができる。

さらに、目的の異種核酸分子の調節された発現を、転写後レベルで、例えば、特異的部位におけるスプライシング活性を選択的に遮断するオリゴヌクレオチド、小分子および／または他の化合物（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００６／１１９１３７に記載されているような）の存在または非存在により、異なるイントロンの選択的スプライシングを調節することにより達成することができる。

様々なプロモーター／エンハンサーエレメントを所望されるレベルおよび組織特異的発現に依存して使用することができることが、当業者には理解されるであろう。プロモーター／エンハンサーは、所望される発現のパターンに依存して、構成的であることもあり、または誘導性であることもある。プロモーター／エンハンサーは、ネイティブのものであることもあり、または外来のものであることもあり、天然配列であることもあり、または合成配列であることもある。外来のものとは、転写開始領域が、その転写開始領域が導入される野生型宿主に見られないことが、意図されている。

特定の実施形態では、プロモーター／エンハンサーエレメントは、処置されることになる標的細胞または対象にネイティブのものであり得る。代表的な実施形態では、プロモーター／エンハンサーエレメントは、異種核酸配列にネイティブのものであり得る。一部の実施形態では、プロモーター配列または調節配列は、ＣＮＳ特異的プロモーターである。一部の実施形態では、ＣＮＳ特異的プロモーターは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる英国特許出願ＧＢ２００７５３９．６において開示されている。プロモーター／エンハンサーエレメントは、一般に、それがＣＮＳまたはＰＮＳにおける神経および非神経細胞をはじめとする目的の標的細胞、例えばＣＮＳ組織、において機能するように、選択される。さらに、特定の実施形態では、プロモーター／エンハンサーエレメントは、哺乳動物プロモーター／エンハンサーエレメントである。プロモーター／エンハンサーエレメントは、構成的であることもあり、または誘導性であることもある。

誘導性発現制御エレメントは、異種核酸配列の発現に対する調節をもたらすことが望ましい用途において概して有利である。遺伝子送達のための誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、組織特異的または優先的プロモーター／エンハンサーエレメントであり得、筋肉特異的または優先的（心筋、骨格筋および／または平滑筋特異的または優先的、を含む）、神経組織特異的または優先的（脳特異的または優先的、を含む）、眼特異的または優先的（網膜特異的または角膜特異的、を含む）、肝臓特異的または優先的、骨髄特異的または優先的、膵臓特異的または優先的、脾臓特異的または優先的、および肺特異的または優先的プロモーター／エンハンサーエレメントを含み得る。他の誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントには、ホルモン誘導性および金属誘導性エレメントが含まれる。例示的な誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントとしては、Ｔｅｔｏｎ／ｏｆｆエレメント、ＲＵ４８６誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーター、およびメタロチオネインプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。

異種核酸配列が標的細胞に転写され次いでそこで翻訳される実施形態では、一般に、特異的開始シグナルが、挿入されたタンパク質コード配列の効率的翻訳のために含まれる。ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含み得るこれらの外来性翻訳制御配列は、天然のものおよび合成のもの両方の、様々な起源のものであり得る。

本発明によるＡＡＶハプロイドベクターは、分裂細胞および非分裂細胞を含む広範な細胞に異種核酸分子を送達する手段を提供する。ＡＡＶハプロイドベクターを利用して、例えば、ポリペプチドをｉｎｖｉｔｒｏで産生するためにまたはｅｘｖｉｖｏもしくはｉｎｖｉｖｏ遺伝子治療のために、目的の核酸分子をｉｎｖｉｔｒｏで細胞に送達することができる。ウイルスベクターは、例えば、免疫原性もしくは治療用ポリペプチドまたは機能的ＲＮＡを発現させるために、それを必要とする対象に核酸を送達する方法においてさらに有用であり得る。このようにして、ポリペプチドまたは機能的ＲＮＡを対象においてｉｎｖｉｖｏで産生することができる。対象はポリペプチドが欠損しているため、対象はポリペプチドを必要としていることがある。

さらに、方法は、対象におけるポリペプチドまたは機能的ＲＮＡの産生が何らかの有益な効果をもたらし得るため、実行され得る。

ウイルスベクターを使用して、目的のポリペプチドまたは機能的ＲＮＡを培養細胞においてまたは対象において（例えば、ポリペプチドを産生するためのバイオリアクターとして対象を使用して、もしくは例えばスクリーニング方法に関連して、対象に対する機能的ＲＮＡの効果を観察するために対象を使用して）産生することもできる。

一般に、本発明のウイルスベクターを利用して、ポリペプチドまたは機能的ＲＮＡをコードする異種核酸分子を送達して、治療用ポリペプチドまたは機能的ＲＮＡを送達することが有益である任意の障害状態または病状を処置および／または予防することができる。説明に役立つ病状には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：嚢胞性線維症（嚢胞性線維症膜貫通調節タンパク質）および肺の他の疾患、血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子）、血友病Ｂ（第ＩＸ因子）、サラセミア（β－グロビン）、貧血（エリスロポエチン）および他の血液障害、アルツハイマー病（ＧＤＦ；ネプリライシン）、多発性硬化症（β－インターフェロン）、パーキンソン病（グリア細胞系由来神経栄養因子［ＧＤＮＦ］）、ハンチントン病（リピートを除去するためのＲＮＡｉ）、筋萎縮性側索硬化症、癲癇（ガラニン、神経栄養因子）、および他の神経学的障害、がん（エンドスタチン；アンジオスタチン；ＴＲＡＩＬ；ＦＡＳ－リガンド；インターフェロンをはじめとするサイトカイン；ＶＥＧＦに対するＲＮＡｉをはじめとするＲＮＡｉ；または多剤耐性遺伝子産物、ｍｉｒ－２６ａ［例えば、肝細胞癌のための］）、糖尿病（インスリン）；デュセンヌ型（ジストロフィン、ミニジストロフィン、インスリン様増殖因子Ｉ、サルコグリカン［例えば、α、β、γ］、ミオスタチンに対するＲＮＡｉ、ミオスタチンプロペプチド、フォリスタチン、アクチビンＩＩ型可溶性受容体、抗炎症性ポリペプチド、例えばＩκＢドミナント変異体、サルコスパン、ユートロフィン、ミニユートロフィン、エクソンスキッピングを誘導するためのジストロフィン遺伝子におけるスプライスジャンクションに対してアンチセンスのものまたはＲＮＡｉ［例えば、ＷＯ２００３／０９５６４７を参照されたい］、エクソンスキッピングを誘導するためのＵ７ｓｎＲＮＡに対してアンチセンスのもの［例えば、ＷＯ２００６／０２１７２４を参照されたい］、およびミオスタチンまたはミオスタチンプロペプチドに対する抗体または抗体断片）およびベッカー型を含む、筋ジストロフィー；ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ）、ハーラー病（α－Ｌ－イズロニダーゼ）、アデノシンデアミナーゼ欠損症（アデノシンデアミナーゼ）、糖原病（例えば、ファブリー病［α－ガラクトシダーゼ］およびポンペ病［リソソーム酸性α－グルコシダーゼ］）および他の代謝障害、先天性肺気腫（α１－アンチトリプシン）、レッシュ・ナイハン症候群（ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）、ニーマン・ピック病（スフィンゴミエリナーゼ）、テイ・サックス病（リソソームヘキソサミニダーゼＡ）、メープルシロップ尿症（分岐鎖ケト酸性デヒドロゲナーゼ）、網膜変性疾患（ならびに眼および網膜の他の疾患；例えば、黄斑変性のためのＰＤＧＦ、および／または網膜障害、例えばＩ型糖尿病における網膜障害、を処置／予防するための、バソヒビン、もしくはＶＥＧＦの他の阻害剤、もしくは他の血管新生阻害剤）、固形臓器の疾患、例えば、脳の疾患（パーキンソン病［ＧＤＮＦ］、星状細胞腫［エンドスタチン、アンジオスタチン、および／またはＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ］、神経膠芽種［エンドスタチン、アンジオスタチン、および／またはＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ］）、肝臓の疾患、腎臓の疾患、うっ血性心不全または末梢動脈疾患（ＰＡＤ）をはじめとする心臓の疾患（例えば、プロテインホスファターゼ阻害剤Ｉ（Ｉ－１）およびその断片（例えば、Ｉ１Ｃ）、ｓｅｒｃａ２ａ、ホスホランバン遺伝子を調節するジンクフィンガータンパク質、Ｂａｒｋｃｔ、β２－アドレナリン受容体、β２－アドレナリン受容体キナーゼ（ＢＡＲＫ）、ホスホイノシチド－３キナーゼ（ＰＩ３キナーゼ）、Ｓ１００Ａ１Ｓ１００Ａ１、パルブアルブミン、アデニリルシクラーゼ６型、Ｇタンパク質共役受容体キナーゼ２型ノックダウンを生じさせる分子、例えば短縮された構成的に活性なｂＡＲＫｃｔ；カルサルシン、ホスホランバンに対するＲＮＡｉ；ホスホランバン阻害またはドミナントネガティブ分子、例えばホスホランバンＳ１６Ｅなどにより、送達される）、関節炎（インスリン様増殖因子）、関節障害（インスリン様増殖因子１および／または２）、内膜過形成（例えば、ｅｎｏｓ、ｉｎｏｓを送達することによる）、心臓移植の生存率向上（スーパーオキシドジスムターゼ）、ＡＩＤＳ（可溶性ＣＤ４）、筋消耗（インスリン様増殖因子Ｉ）、腎臓欠損症（エリスロポエチン）、貧血（エリスロポエチン）、関節炎（抗炎症性因子、例えば、ＩＲＡＰおよびＴＮＦα可溶性受容体）、肝炎（α－インターフェロン）、ＬＤＬ受容体欠損症（ＬＤＬ受容体）、高アンモニア血症（オルニチントランスカルバミラーゼ）、クラッベ病（ガラクトセレブロシダーゼ）、バッテン病；ＳＣＡ１、ＳＣＡ２およびＳＣＡ３を含む脊髄性大脳性運動失調症；フェニルケトン尿症（フェニルアラニンヒドロキシラーゼ）、自己免疫疾患など。さらに、臓器移植に続き本発明を使用して（例えば、免疫抑制剤または阻害核酸を投与してサイトカイン産生を遮断することにより）移植の成功率を上昇させることおよび／または臓器移植もしくは補助療法の負の副作用を低減させることができる。別の例として、骨形態形成タンパク質（ＢＮＰ２、７など、ＲＡＮＫＬおよび／またはＶＥＧＦを含む）を、例えば、がん患者において骨折または外科的除去後に、骨同種移植片と共に投与することができる。

本発明を使用して、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）を産生することもできる。例えば、本発明のＡＶＶハプロイドベクターを使用して、非多能性細胞、例えば、成人線維芽細胞、皮膚細胞、肝臓細胞、腎細胞、脂肪細胞、心臓細胞、神経細胞、上皮細胞、内皮細胞などに、幹細胞関連核酸を送達することができる。幹細胞に関連する因子をコードする核酸は、当技術分野において公知である。幹細胞および多能性に関連するそのような因子の非限定的な例としては、Ｏｃｔ－３／４、ＳＯＸファミリー（例えば、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３および／またはＳＯＸ１５）、Ｋｌｆファミリー（例えば、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４および／またはＫｌｆ５）、Ｍｙｃファミリー（例えば、Ｃ－ｍｙｃ、Ｌ－ｍｙｃおよび／またはＮ－ｍｙｃ）、ＮＡＮＯＧおよび／またはＬＩＮ２８が挙げられる。

本発明を実行して、代謝障害、例えば、糖尿病（例えば、インスリン）、血友病（例えば、第ＩＸ因子または第ＶＩＩＩ因子）、リソソーム蓄積障害、例えば、ムコ多糖症障害（例えば、スライ症候群［β－グルクロニダーゼ］、ハーラー症候群［α－Ｌ－イズロニダーゼ］、シャイエ症候群［α－Ｌ－イズロニダーゼ］、ハーラー・シャイエ症候群［α－Ｌ－イズロニダーゼ］、ハンター症候群［イズロン酸スルファターゼ］、サンフィリッポ症候群Ａ［ヘパランスルファミダーゼ］、Ｂ［Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ］、Ｃ［アセチル－ＣｏＡ；α－グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼ］、Ｄ［Ｎ－アセチルグルコサミン６－スルファターゼ］、モルキオ症候群Ａ［ガラクトース－６－硫酸スルファターゼ］、Ｂ［β－ガラクトシダーゼ］、マロトー・ラミー症候群［Ｎ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼ］など）、ファブリー病（α－ガラクトシダーゼ）、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ）、または糖原貯蔵障害（例えば、ポンペ病；リソソーム酸性α－グルコシダーゼ）を処置および／または予防することもできる。

遺伝子移入は、病状に対する治療を理解するためにおよび施すために使用される可能性がかなりある。欠損遺伝子が既知でありクローニングされているいくつかの遺伝性疾患が存在する。一般に、上記の病状は次の２つのクラスに分類される：一般に劣性様式で遺伝する欠損状態、通常は酵素の欠損状態；および調節タンパク質または構造タンパク質が関与し得、典型的には優性様式で遺伝する、バランスを欠いている状態。欠損状態の疾患については、遺伝子移入を、補充療法のために罹患組織に正常な遺伝子を入れるためにはもちろん、アンチセンス変異を使用して疾患の動物モデルを作出するためにも、使用することができる。バランスを欠いている病状については、遺伝子移入を、モデル系において病状を生じさせるために使用することができ、次いで、そのモデル系を、その病状に対抗するための試みに使用することができる。したがって、本発明によるＡＡＶハプロイドベクターは、遺伝疾患の処置および／または予防を可能にする。

本発明によるＡＶＶハプロイドベクターを利用して、機能的ＲＮＡをｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏで細胞に提供することもできる。細胞における機能的ＲＮＡの発現は、例えば、細胞による特定の標的タンパク質の発現を低下させ得る。したがって、機能的ＲＮＡを投与して、それを必要とする対象において特定のタンパク質の発現を減少させることができる。機能的ＲＮＡを細胞にｉｎｖｉｔｒｏで投与して、例えば、細胞もしくは組織培養系を最適化するために、またはスクリーニング方法において、遺伝子発現および／または細胞生理機能を調節することもできる。

加えて、本発明によるＡＡＶハプロイドベクターは、目的の核酸を細胞培養系においてまたは代替的にトランスジェニック動物モデルにおいて一過性にまたは安定的に発現させる、診断およびスクリーニング方法において使用される。

本発明のＡＶＶハプロイドベクターは、当業者には明らかであるように、遺伝子標的化、クリアランス、転写、翻訳などを評価するためのプロトコールにおける使用を含むがこれらに限定されない、様々な非治療的目的で使用することもできる。ＡＡＶハプロイドベクターは、安全性（伝播、毒性、免疫原性など）を評価する目的で使用することもできる。そのようなデータは、例えば、臨床的有効性の評価の前に、規制当局の承認プロセスの一部として米国食品医薬品局（ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＦｏｏｄａｎｄＤｒｕｇＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によって考慮される。

さらなる態様として、本発明のＡＶＶハプロイドベクターを使用して、対象において免疫応答を生じさせることができる。この実施形態によると、免疫原性ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含むＡＡＶハプロイドベクターを対象に投与することができ、免疫原性ポリペプチドに対する能動免疫応答が対象によって開始される。免疫原性ポリペプチドは、本明細書における上記の通りである。一部の実施形態では、防御免疫応答が惹起される。

あるいは、ＡＶＶハプロイドベクターをｅｘｖｉｖｏで細胞に投与することができ、変更された細胞が対象に投与される。異種核酸を含むＡＶＶハプロイドベクターが細胞に導入され、その細胞が対象に投与され、免疫原をコードする異種核酸が、対象において発現され、免疫原に対する免疫応答を誘導し得る。特定の実施形態では、細胞は、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）である。

「能動免疫応答」または「能動免疫」は、「免疫原との遭遇後の宿主組織および細胞の関与」を特徴とする。それは、「抗体の合成もしくは細胞媒介反応性の発生またはこれら両方につながる、リンパ細網組織における免疫担当細胞の分化および増殖」に関わる。Herbert B. Herscowitz, Immunophysiology: Cell Function and Cellular Interactions in Antibody Formation, in IMMUNOLOGY: BASIC PROCESSES 117 (Joseph A. Bellanti ed., 1985)。別の言い方をすれば、能動免疫応答は、感染によるまたはワクチン接種による免疫原への曝露後に宿主によって開始される。能動免疫は、「能動免疫された宿主から非免疫宿主への既成物質（抗体、トランスファー因子、胸腺移植片、インターロイキン－２）の移入」を介して獲得される受動免疫と対比され得る。同書。

「防御」免疫応答または「防御」免疫は、本明細書で使用される場合、免疫応答が疾患を予防するまたはその発生率を低下させる上で対象に何らかの恩恵をもたらすことを示す。あるいは、防御免疫応答または防御免疫は、疾患、特にがんまたは腫瘍、の処置および／または予防（例えば、がんもしくは腫瘍の形成を予防することによる、がんもしくは腫瘍の退縮を引き起こすことによる、および／または転移を予防することによる、および／または転移性小結節の成長を予防することによる）に有用であり得る。防御効果は、処置の恩恵がその一切の不利益を上回るのであれば、完全なものであってもよく、または部分的なものであってもよい。

特定の実施形態では、異種核酸分子を含むＡＡＶハプロイドベクターまたは細胞は、下で説明されるような免疫原的に有効な量で投与することができる。

本発明のＡＡＶハプロイドベクターは、１つまたは複数のがん細胞抗原（もしくは免疫学的に同様の分子）を発現するまたはがん細胞に対する免疫応答を生じさせる任意の他の免疫原を発現するＡＡＶハプロイドベクターの投与により、がん免疫療法のために投与することもできる。説明すると、例えば、がんを有する患者を処置するために、および／または対象においてがんの発生を予防するために、がん細胞抗原をコードする異種核酸を含むＡＡＶハプロイドベクターを投与することにより、対象においてがん細胞抗原に対する免疫応答を生じさせることができる。ＡＡＶハプロイドベクターは、本明細書に記載されるように、ｉｎｖｉｖｏでまたはｅｘｖｉｖｏ法を使用することにより、対象に投与することができる。あるいは、がん抗原は、ウイルスカプシドの一部として発現されることがあり、または別様にウイルスカプシドと会合していることがある（例えば、上記のように）。

別の代替案として、当技術分野において公知の任意の他の治療用核酸（例えば、ＲＮＡｉ）またはポリペプチド（例えば、サイトカイン）を、がんを処置および／または予防するために投与することができる。

本明細書で使用される場合、用語「がん」は、腫瘍形成性がんを包含する。

同様に、用語「がん性組織」は、腫瘍を包含する。「がん細胞抗原」は、腫瘍抗原を包含する。

用語「がん」は、当技術分野におけるその理解されている意味、例えば、身体の遠位部位に広がる（すなわち、転移する）能力を有する組織の無制御増殖という意味を有する。例示的ながんとしては、黒色腫、腺癌、胸腺腫、リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫）、肉腫、肺がん、肝臓がん、結腸がん、白血病、子宮がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頚がん、膀胱がん、腎臓がん、膵臓がん、脳がんならびに現在公知のまたは後に同定される任意の他のがんまたは悪性状態が挙げられるが、これらに限定されない。代表的な実施形態では、本発明は、腫瘍形成性のがんを処置および／または予防する方法を提供する。

用語「腫瘍」もまた、当技術分野において、例えば、多細胞生物体内の未分化細胞の異常な塊として、理解されている。腫瘍は、悪性であることもあり、または良性であることもある。代表的な実施形態では、本明細書で開示される方法は、悪性腫瘍を予防および処置するために使用される。

用語「がんを処置すること」、「がんの処置」および同義語は、がんの重症度を低下もしくは少なくとも部分的に消失させること、ならびに／または疾患の進行を緩徐化および／もしくは制御すること、ならびに／または疾患を安定させることを意図する。特定の実施形態では、これらの用語は、がんの転移を予防するもしくは低減させるもしくは少なくとも部分的に消失させること、ならびに／または転移性小結節の成長を予防するもしくは低減させるもしくは少なくとも部分的に消失させることを示す。

用語「がんの予防」または「がんを予防すること」および同義語は、方法が、がんの発生率および／またはその発症の重症度を少なくとも部分的に消失または低下および／または遅延させることが意図されている。別の言い方をすれば、対象におけるがんの発症を可能性もしくは確率に関して低下させることができ、および／または遅延させることができる。

特定の実施形態では、細胞を、がんを有する対象から除去し、本発明によるがん細胞抗原を発現するＡＡＶハプロイドベクターと接触させることができる。次いで、改変された細胞が対象に投与され、それによって、がん細胞抗原に対する免疫応答が惹起される。有利には、この方法は、ｉｎｖｉｖｏで十分な免疫応答を開始できない（すなわち、十分な量の促進抗体を産生することができない）免疫不全対象に関して利用することができる。

免疫応答は、免疫調節性サイトカイン（例えば、α－インターフェロン、β－インターフェロン、γ－インターフェロン、ω－インターフェロン、ｒτ－インターフェロン、インターロイキン－１α、インターロイキン－１β、インターロイキン－２、インターロイキン－３、インターロイキン－４、インターロイキン－５、インターロイキン－６、インターロイキン－７、インターロイキン－８、インターロイキン－９、インターロイキン－１０、インターロイキン－１１、インターロイキン－１２、インターロイキン－１３、インターロイキン－１４、インターロイキン－１８、Ｂ細胞増殖因子、ＣＤ４０リガンド、腫瘍壊死因子－α、腫瘍壊死因子－β、単球走化性タンパク質－１、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、およびリンホカイン）により増強することができることが、当技術分野において公知である。したがって、免疫調節性サイトカイン（好ましくは、ＣＴＬ誘導性サイトカイン）が、ＡＡＶハプロイドベクターとともに対象に投与され得る。

サイトカインは、当技術分野で公知の方法により投与することができる。外因性サイトカインを対象に投与することができ、または代替的に、サイトカインをコードする核酸を、好適なベクターを使用して対象に送達し、サイトカインをｉｎｖｉｖｏで生じさせることができる。
ＸＩ．対象、医薬製剤、および投与方式

本明細書で開示の投与方法における使用のための本明細書で開示のＡＡＶハプロイドウイルスベクターおよび／または合理的ポリプロイドＡＡＶベクターは、医薬組成物の場合、薬学的に許容される賦形剤、すなわち、１つまたは複数の薬学的に許容される担体物質および／または添加剤、例えば、緩衝剤、担体、賦形剤、安定剤などを用いて製剤化され得る。医薬組成物は、キットの形態で提供されることもある。本明細書で開示の投与方法における使用のための本明細書で開示のＡＡＶハプロイドウイルスベクターおよび／または合理的ポリプロイドＡＡＶベクターを含む医薬組成物、およびその使用は、当技術分野において公知である。

したがって、本発明のさらなる態様は、本明細書で開示の投与方法における使用のための本明細書で開示のＡＡＶハプロイドベクターを含む医薬組成物を提供する。本開示による医薬組成物中の活性成分（例えば、本明細書で開示されるＡＡＶハプロイドウイルスベクターおよび／または合理的ポリプロイドＡＡＶベクターａａ）、薬学的に許容される賦形剤および／または任意の追加の成分の相対量は、処置される対象の正体、サイズおよび／または状態に依存して、さらに、組成物が投与されることになる経路に依存して、変わり得る。例えば、組成物は、０．１パーセント～９９パーセント（ｗ／ｗ）の間の活性成分を含み得る。例として、組成物は、０．１パーセント～１００パーセントの間、例えば、．５～５０パーセントの間、１～３０パーセントの間、５～８０パーセントの間、少なくとも８０パーセント（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。

医薬組成物を、１つまたは複数の賦形剤または希釈剤を使用して（１）安定性を増大させるように、（２）細胞トランスフェクションもしくは形質導入を増加させるように、（３）ペイロードの持続放出もしくは遅延放出を可能にするように、（４）生体内分布を変更する（例えば、ウイルス粒子を特定の組織もしくは細胞型に標的化する）ように、（５）コードされたタンパク質の翻訳を増加させるように、（６）コードされたタンパク質の放出プロファイルを変更するように、および／または（７）本発明のペイロードの調節可能な発現を可能にするように、製剤化することができる。一部の実施形態では、薬学的に許容される塩賦形剤は、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセントまたは１００パーセント純粋であり得る。一部の実施形態では、賦形剤は、ヒトへの使用および獣医学的使用が認可されている。一部の実施形態では、賦形剤は、米国食品医薬品局により認可されていることがある。一部の実施形態では、賦形剤は、医薬品グレードのものであり得る。一部の実施形態では、賦形剤は、米国薬局方（ＵＳＰ）、欧州薬局方（ＥＰ）、英国薬局方、および／または国際薬局方の基準を満たし得る。賦形剤は、本明細書で使用される場合、所望される特定の剤形に適しているような、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散または懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘または乳化剤、保存薬などを含むが、これらに限定されない。医薬組成物を製剤化するための様々な賦形剤、および組成物を調製するための技法は、当技術分野において公知である（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21 st Edition, A. R. Gennaro, Lippincott, Williams and Wilkins, Baltimore, MD, 2006を参照されたい）。従来の賦形剤媒体の使用は、本開示の範囲内で企図され得るが、ただし、任意の従来の賦形剤媒体が、例えば、何らかの望ましくない生物学的効果を生じさせることまたは別様に医薬組成物の他のいずれかの化合物と有害な形で相互作用することから、物質またはその誘導体と配合不可であり得る場合を除く。

本明細書で開示の投与方法における使用のための本明細書で開示のＡＡＶハプロイドウイルスベクターおよび／または合理的ポリプロイドＡＡＶベクターは、１つまたは複数の他の治療剤、予防剤、研究用薬剤または診断剤と組み合わせて使用することができる。「と組み合わせて」には、薬剤を同じ時に投与しなければならない、および／または送達のために一緒に製剤化しなければならないことを含意する意図はないが、これらの送達方法は本発明の範囲内である。組成物は、１つもしくは複数の他の所望の治療薬もしくは医療手順と並行して、その前に、またはその後に、投与することができる。一部の実施形態では、１つの処置（例えば、遺伝子治療ベクター）の送達は、第２の処置（例えば、１つまたは複数の治療薬）の送達を開始するときにまだ行われていることがあり、したがって、投与期間にオーバーラップがある。これは、本明細書では「同時」または「並行送達」と呼ばれることもある。他の実施形態では、１つの処置の送達は、他の処置の送達が始まる前に終わる。どちらの場合の一部の実施形態でも、併用投与のため、処置は、より有効である。例えば、第２の処置がより有効であり、例えば、同等の効果が、より少ない第２の処置で見られるか、または第２の処置によって、症状が、第２の処置が第１の処置の非存在下で投与された場合に見られる症状より大幅に低減されるか、または類似の状況が、第１の処置に伴って見られる。一部の実施形態では、送達は、症状の低減、または障害に関連する他のパラメーターの低減が、他の処置の非存在下で送達される１つの処置に伴って観察されるものより大きくなるような送達である。２つの処置の効果は、部分的に相加効果であることもあり、完全な相加効果であることもあり、または相加効果より大きいこともある。送達は、送達される第１の処置の効果が、第２の処置が送達されたときにまだ検出可能であるような送達であることもある。本明細書に記載される組成物と少なくとも１つの追加の治療とは、同じ組成物または別々の組成物で同時にまたは連続的に投与することができる。連続投与の場合、本明細書に記載される遺伝子治療ベクターを最初に投与することができ、１つもしくは複数の治療薬を２番目に投与することができ、または投与の順序を逆にすることができる。遺伝子治療ベクターおよび１つまたは複数の治療薬は、活動性障害の期間中に、または寛解期もしくは疾患の活動性がより低い期間中に投与することができる。遺伝子治療ベクターは、別の処置の前に、その処置と並行して、処置後に、または障害の寛解中に投与することができる。

組み合わせて投与される場合、本明細書で開示の投与方法における使用のための本明細書で開示のＡＡＶハプロイドウイルスベクターおよび／もしくは合理的ポリプロイドＡＡＶベクター、ならびに１つもしくは複数の治療薬（例えば、第２もしくは第３の治療薬）、または全ては、個々に使用される、例えば単剤療法として使用される、各々についての量もしくは投薬量より多い、それより少ない、またはそれと同じである量または用量で、投与することができる。ある特定の実施形態では、本明細書で開示の投与方法における使用のための本明細書で開示のＡＡＶハプロイドベクター、および１つもしくは複数の治療薬（例えば、第２もしくは第３の薬剤）、または全てについての投与される量または投薬量は、個々に使用される各々についての量または投薬量より（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％）少ない。他の実施形態では、所望の効果（例えば、心血管疾患または心臓疾患の処置）を生じさせる結果となる、本明細書で開示の投与方法における使用のための本明細書で開示のＡＡＶハプロイドベクター、および１つもしくは複数の治療薬（例えば、第２もしくは第３の薬剤）、または全てについての量または投薬量は、同じ治療効果を達成するために個々に必要とされる各々についての量または投薬量より（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％）少ない。

一部の実施形態では、本明細書で開示のＡＡＶハプロイドベクターの投与方法は、本明細書で開示されるｒＡＶＶベクターを単独で、または追加の薬剤、例えば本明細書で開示の免疫モジュレーター、と組み合わせて、送達することができる。

本発明によるＡＡＶハプロイドベクター、ＡＡＶ粒子およびカプシドは、獣医学的応用と医学的応用の両方に使用される。好適な対象には、トリと哺乳動物の両方が含まれる。用語「トリ」は、本明細書で使用される場合、これらに限定されないが、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、シチメンチョウ、キジ、オウム、インコなどを含む。用語「哺乳動物」は、本明細書で使用される場合、これらに限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ亜科動物、ヒツジ、ヤギ亜科の動物、ウマ科動物、ネコ科動物、イヌ科動物、ウサギ目動物などを含む。

ヒト対象は、新生児、乳児、若年、成人および老人対象を含む。

代表的な実施形態では、対象は、本発明の方法「を必要とする」。

特定の実施形態では、本発明は、薬学的に許容される担体中の本発明のＡＡＶハプロイドウイルスベクターおよび／または合理的ポリプロイドＡＡＶベクターおよび／またはＡＡＶハプロイド粒子と、必要に応じて、他の薬剤、医薬品、安定化剤、緩衝剤、担体、アジュバント、希釈剤などとを含む、医薬組成物を提供する。注射の場合は、担体は、典型的には液体である。他の投与方法の場合は、担体は、固体または液体のどちらかであり得る。吸入投与の場合は、担体は、呼吸用のものであり、必要に応じて、固体または液体粒状形態であり得る。対象への投与の場合は、または他の薬学的使用の場合は、担体は、無菌および／または生理学的に適合性のものとなる。

「薬学的に許容される」とは、毒性でも別様に望ましくないものでもない材料を意味し、すなわち、材料は、望ましくない生物学的効果を一切引き起こすことなく、対象に投与することができる。

本発明の一態様は、核酸分子をｉｎｖｉｔｒｏで細胞に移入する方法である。ＡＡＶハプロイドベクターを、特定の標的細胞に好適な標準的な形質導入法に従って適切な感染多重度で細胞に導入することができる。投与するＡＡＶハプロイドベクターの力価は、標的細胞型および数、ならびに特定のＡＡＶハプロイドベクターに依存して変わり得るものであり、当業者は過度の実験なしにその力価を決定することができる。代表的な実施形態では、少なくとも約１０^３感染単位、必要に応じて、少なくとも約１０^５感染単位が、細胞に導入される。

ＡＡＶハプロイドベクターが導入される細胞は、神経細胞（末梢神経系および中枢神経系の細胞、特に、脳細胞、例えば、ニューロンおよび乏突起膠細胞を含む）、肺細胞、眼の細胞（網膜細胞、網膜色素上皮および角膜細胞を含む）、上皮細胞（例えば、腸および呼吸器上皮細胞）、筋細胞（例えば、骨格筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞および／または横隔膜筋細胞）、樹状細胞、膵臓細胞（島細胞を含む）、肝細胞、心筋細胞、骨細胞（例えば、骨髄幹細胞）、造血幹細胞、脾臓細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、内皮細胞、前立腺細胞、胚細胞などを含むがこれらに限定されない、任意の型のものであり得る。代表的な実施形態では、細胞は、任意の前駆細胞であり得る。さらなる可能性として、細胞は、幹細胞（例えば、神経幹細胞、肝臓幹細胞）であり得る。なおさらなる代替案として、細胞は、がんまたは腫瘍細胞であり得る。さらに、細胞は、上で示されたような任意の種起源のものであり得る。

ＡＡＶハプロイドベクターは、改変細胞を対象に投与することを目的として、ｉｎｖｉｔｒｏで細胞に導入することができる。特定の実施形態では、細胞は、対象から除去されたものであり、ＡＡＶハプロイドベクターがそれらの細胞に導入され、次いで、それらの細胞が対象に投与されて戻される。ｅｘｖｉｖｏでのマニピュレーションのために対象から細胞を除去し、その後対象に導入して戻す方法は、当技術分野において公知である（例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照されたい）。あるいは、組換えＡＡＶハプロイドベクターを、ドナー対象からの細胞に、培養細胞に、または任意の他の適切な供給源からの細胞に導入することができ、これらの細胞が、それを必要とする対象（すなわち、「レシピエント」対象）に投与される。

ｅｘｖｉｖｏ核酸送達に好適な細胞は、上記の通りである。対象に投与する細胞の投薬量は、対象の年齢、状態および種、細胞の型、細胞により発現される核酸、投与方式などによって変わることになる。典型的には、１用量当たり薬学的に許容される担体中、少なくとも約１０^２～約１０^８細胞または少なくとも約１０^３～約１０^６細胞が投与される。特定の実施形態では、ＡＡＶハプロイドベクターで形質導入された細胞は、医薬担体と組み合わせて、処置有効量または予防有効量で対象に投与される。

一部の実施形態では、ＡＡＶハプロイドベクターが細胞に導入され、その細胞が、送達されたポリペプチド（例えば、導入遺伝子として発現されたまたはカプシド内の）に対する免疫原性応答を惹起するために対象に投与され得る。典型的には、薬学的に許容される担体と組み合わせて、免疫原的に有効な量のポリペプチドを発現する細胞の量が、投与される。「免疫原的に有効な量」は、発現されるポリペプチドの量であって、医薬製剤が投与される対象においてそのポリペプチドに対する能動免疫応答を引き起こすのに十分な量である。特定の実施形態では、投薬量は、防御免疫応答（上で定義されている通りの）を生じさせるのに十分なものである。

もたらされる防御の程度は、免疫原性ポリペプチドの投与の恩恵がその一切の不利益を上回るのであれば、完全なものである必要も永続的なものである必要もない。

本発明のさらなる態様は、ＡＡＶハプロイドベクターおよび／またはハプロイドウイルスカプシドを対象に投与する方法である。それを必要とするヒト対象または動物への本発明によるＡＡＶハプロイドベクターおよび／またはカプシドの投与は、当技術分野において公知の任意の手段により得る。必要に応じて、ＡＡＶハプロイドベクターおよび／またはハプロイドカプシドは、薬学的に許容される担体中の処置有効量または予防有効用量で送達される。

本発明のＡＡＶハプロイドベクターおよび／またはハプロイドカプシドは、さらに、免疫原性応答を惹起するために（例えば、ワクチンとして）投与することができる。典型的には、本発明の免疫原性組成物は、薬学的に許容される担体と組み合わせてＡＡＶハプロイドベクターおよび／またはカプシドの免疫原的に有効な量を含む。必要に応じて、投薬量は、防御免疫応答（上で定義されている通りの）を生じさせるのに十分なものである。もたらされる防御の程度は、免疫原性ポリペプチドの投与の恩恵がその一切の不利益を上回るのであれば、完全なものである必要も永続的なものである必要もない。対象および免疫原は、上記の通りである。

対象に投与されることになるＡＡＶ合理的ポリプロイド、例えばハプロイドベクターおよび／またはカプシド、の投薬量は、投与方式、処置および／または予防されることになる疾患または状態、個々の対象の状態、特定のＡＡＶハプロイドベクターまたはハプロイドカプシド、および送達されることになる核酸などに依存し、常套的に決定され得る。治療効果を達成するための例示的な用量は、少なくとも約１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、１０^１４、１０^１５形質導入単位、必要に応じて、約１０^８～約１０^１３形質導入単位の力価である。

一部の実施形態では、１用量当たり薬学的に許容される担体中、少なくとも約１．６×１０^１２～約４．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇが、投与されることになる。さらなる実施形態では、対象に投与されることになる本明細書で開示のハプロイドＡＡＶベクターの投薬量は、投与方式、処置および／または予防されることになる疾患の重症度およびタイプ、個々の対象の状態、年齢および性別、ポリプロイドＡＡＶベクター中に存在する特定のＶＰ３構造タンパク質ならびにＶＰ１および／またはＶＰ２構造タンパク質、送達される導入遺伝子、ならびに導入遺伝子発現を制御するプロモーターなどに依存し、常套的に決定され得る。治療効果を達成するための例示的な用量は、少なくとも約１．５×１０^１１ｖｇ／ｋｇ、または少なくとも約１．５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、または少なくとも約４．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇの力価である。本明細書で開示の治療効果を達成するための用量は、導入遺伝子をコードする核酸に動作可能に連結された脳およびニューロンプロモーターをはじめとする特定のプロモーターの強度、ならびに任意のシグナル配列の存在、および細胞から分泌されたときにシグナル配列を切断するその細胞の能力によっても決定され得ることが、包含される。

一部の実施形態では、本明細書で開示されるポリプロイドＡＡＶベクターは、ＶＰ１またはＡＡＶＶＰ２構造タンパク質の親ＡＡＶ血清型により惹起される液性応答と比較してそれほど液性免疫応答を惹起しないので、ポリプロイドＡＡＶベクターの用量は、１．６×１０^１２ｖｇ／ｋｇより高いか、または約４．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇより高い。

一部の実施形態では、本明細書で開示のポリプロイドＡＡＶベクターの治療効果を達成するための例示的な用量は、１．０Ｅ^９ｖｇ／ｋｇ～５．０Ｅ^１１ｖｇ／ｋｇの範囲内である。一部の実施形態では、対象に投与される用量は、少なくとも約１．０Ｅ^９ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１．０Ｅ^１０ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１．０Ｅ１１ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１．０Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約１．１Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約１．２Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約１．３Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約１．４Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約１．５Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約１．６Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約１．７Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約１．８Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約１．９Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約２．０Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約３．０Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約４．０Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約５．０Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約６．０Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約７．０Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約８．０Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約９．０Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約１．０Ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約１．２Ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約１．２Ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約１．２Ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約１．３Ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約１．４Ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約１．５Ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約１．６Ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約１．７Ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約１．８Ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約１．９Ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約２．０Ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約３．０Ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約４．０Ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約５．０Ｅ１３ｖｇ／ｋｇである。

一部の実施形態では、本明細書で開示の方法に従って治療効果を達成するための例示的な用量は、１．２Ｅ１２～４．０Ｅ１２ｖｇ／ｋｇの間、例えば、少なくとも約１．０Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約１．１Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約１．２Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約１．３Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約１．４Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約１．５Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約１．６Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約１．７Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約１．８Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約１．９Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約２．０Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約２．１Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約２．２Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約２．３Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約２．４Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約２．５Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約２．６Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約２．７Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約２．８Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約２．９Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約３．０Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約３．１Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約３．２Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約３．３Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約３．４Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約３．５Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約３．６Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約３．７Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約３．８Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約３．９Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約４．０Ｅ１２ｖｇ／ｋｇの力価である。

一部の実施形態、脳もしくは脊髄の疾患もしくは障害またはニューロンもしくは神経変性疾患を処置するための方法に有用な本明細書で開示のポリプロイドＡＡＶベクター、では、治療効果を発揮するための例示的な用量は、少なくとも約１．０Ｅ１２～４．０Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、または約１．２Ｅ１２～３．０Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、または約１．２Ｅ１２～２．５Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、または約２．５Ｅ１２～４．０Ｅ１２ｖｇ／ｋｇの力価である。

特定の実施形態では、１回より多い投与（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回など、またはそれより多くの投与）が、様々な間隔、例えば、毎時、毎日、毎週、毎月、毎年など、の一定期間にわたって所望の遺伝子発現レベルを達成するために利用され得る。投薬は、単回投薬または累積（連続投薬）であり得、当業者によって容易に決定され得る。例えば、疾患または障害の処置は、本明細書で開示される医薬組成物ＡＡＶハプロイドの有効用量の１回の投与を含み得る。あるいは、疾患または障害の処置は、例えば、１日１回、１日２回、１日３回、数日に１回、または週１回などの、様々な期間にわたって行われるＡＡＶハプロイドベクターの有効用量の複数回の投与を含み得る。投与のタイミングは、個体の症状の重症度などの因子に依存して、個体によって異なり得る。例えば、本明細書で開示されるＡＡＶハプロイドベクターの有効用量は、６ヵ月に１回、無期限に、または個体がもはや治療を必要としなくなるまで、個体に投与され得る。個体の状態を、処置の過程全体を通してモニターすることができること、および投与される本明細書で開示されるＡＡＶハプロイドベクターの有効量を、それに基づいて調整することができることが、当業者には分かるであろう。

ある実施形態では、ＡＡＶハプロイドベクターの投与の期間は、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、４ヵ月、５ヵ月、６ヵ月、７ヵ月、８ヵ月、９ヵ月、１０ヵ月、１１ヵ月、１２ヵ月であるか、またはそれより長い。さらなる実施形態では、投与が中止される期間は、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、４ヵ月、５ヵ月、６ヵ月、７ヵ月、８ヵ月、９ヵ月、１０ヵ月、１１ヵ月、１２ヵ月であるか、またはそれより長い。

例示的な投与様式としては、経口、直腸、経粘膜、鼻腔内、吸入（例えば、エアロゾルによる）、頬側（例えば、舌下）、膣、くも膜下腔内、眼内、経皮、子宮内（または卵内）、非経口（例えば、静脈内、皮下、皮内、筋内［骨格筋、横隔膜筋および／または心筋への投与を含む］、皮内、胸膜内、脳内および関節内）、局所的（例えば、皮膚表面と、気道表面を含む、粘膜表面との両方への、および経皮投与）、リンパ内など、ならびに直接的な組織または臓器への注射（例えば、肝臓、骨格筋、心筋、横隔膜筋または脳への）が挙げられる。投与は、腫瘍（例えば、腫瘍またはリンパ節の中または付近）への投与であることもある。任意の所与の症例における最も好適な経路は、処置および／または予防される状態の性質および重症度に、ならびに使用されることになる特定のベクターの性質に依存することになる。

注射剤を、従来の形態で、溶液もしくは懸濁液のどちらかとして、注射前に液体に溶解もしくは懸濁するのに好適な固体形態、またはエマルジョンとして、調製することができる。あるいは、本発明のＡＡＶハプロイドベクターおよび／またはウイルスカプシドを、全身様式ではなく局所様式で、例えば、デポー製剤または徐放性製剤で、投与することができる。さらに、ＡＡＶハプロイドベクターおよび／またはウイルスカプシドを、外科的に移植可能なマトリックスに付着させて送達することができる（例えば、米国特許出願公開第２００４／００１３６４５号に記載されているように）。本明細書で開示されるＡＡＶハプロイドベクターおよび／またはウイルスカプシドは、対象が吸入する、ＡＡＶハプロイドベクターおよび／またはウイルスカプシドで構成された呼吸用粒子のエアロゾル懸濁液を必要に応じて投与することにより、任意の適切な手段により対象の肺に投与することができる。呼吸用粒子は、液体であることもあり、または固体であることもある。ＡＡＶハプロイドベクターおよび／またはウイルスカプシドを含む液体粒子のエアロゾルを、当業者に公知であるような圧力駆動式エアロゾルネブライザーまたは超音波ネブライザーなどの任意の適切な手段により、生成することができる。例えば、米国特許第４，５０１，７２９号を参照されたい。ＡＡＶハプロイドベクターおよび／またはカプシドを含む固体粒子のエアロゾルも同様に、製薬技術分野で公知の技法により任意の固体粒状医薬エアロゾル発生器を用いて生成することができる。

ＡＡＶハプロイドベクターおよびウイルスカプシドをＣＮＳ（例えば、脳、眼）の組織に投与することができ、有利なことに、ＡＡＶハプロイドベクターまたはカプシドについて本発明の非存在下で観察されることになるものより広い分布をもたらすことができる。

特定の実施形態では、本発明の送達ベクターを投与して、遺伝障害、神経変性障害、精神障害および腫瘍をはじめとするＣＮＳの疾患を処置することができる。説明に役立つＣＮＳ疾患としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、カナバン病、リー病、レフサム病、トゥレット症候群、原発性側索硬化症、筋萎縮性側索硬化症、進行性筋萎縮症、ピック病、筋ジストロフィー、多発性硬化症、重症筋無力症、ビンスワンガー病、脊髄または頭部損傷に起因する外傷、テイ・サックス病、レッシュ・ナイハン病、癲癇、脳梗塞；次のものを含む精神障害：気分障害（例えば、うつ病、双極性感情障害、持続性感情障害、二次性気分障害）、統合失調症、薬物依存症（例えば、アルコール依存症および他の物質の依存症）、神経症（例えば、不安、強迫障害、身体表現性障害、解離性障害、悲嘆、産後うつ病）、精神病（例えば、幻覚および妄想）、認知症、パラノイア、注意欠陥障害、精神性的障害、睡眠障害、疼痛性障害、摂食障害もしくは体重障害（例えば、肥満症、悪液質、神経性食欲不振症、および過食症（bulemia））；ならびにＣＮＳのがんおよび腫瘍（例えば、下垂体腫瘍）が挙げられるが、これらに限定されない。

ＣＮＳの障害には、網膜、後方路および視神経に関与する眼科障害（例えば、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症および他の網膜変性疾患、ブドウ膜炎、加齢性黄斑変性症、緑内障）が含まれる。

全てではないがほとんどの眼科疾患および障害は、（１）血管新生、（２）炎症および（３）変性という３つのタイプの兆候のうちの１つまたは複数を伴う。本発明の送達ベクターを利用して、抗血管新生因子、抗炎症因子、細胞変性を遅延させる因子、細胞温存を促進する因子、または細胞成長を促進する因子、および前述のものの組合せを送達することができる。

例えば、糖尿病性網膜症は、血管新生を特徴とする。糖尿病性網膜症を、眼内（例えば、硝子体領域内）または眼窩周囲（例えば、テノン嚢下領域内）のどちらかに１つまたは複数の抗血管新生因子を送達することにより処置することができる。１つまたは複数の神経栄養因子を、眼内（例えば、硝子体内）または眼窩周囲のいずれかに共送達することもできる。

ブドウ膜炎は、炎症を伴う。１つまたは複数の抗炎症因子を、本発明の送達ベクターの眼内（例えば、硝子体または前房）投与により、投与することができる。

比較して、網膜色素変性症は、網膜変性を特徴とする。代表的な実施形態では、網膜色素変性症を、１つまたは複数の神経栄養因子をコードする送達ベクターの眼内（例えば、硝子体投与）により処置することができる。

加齢性黄斑変性症は、血管新生と網膜変性の両方を伴う。この障害は、１つもしくは複数の神経栄養因子をコードする本発明の送達ベクターを眼内に（例えば、硝子体）に、および／または１つもしくは複数の抗血管新生因子をコードする本発明の送達ベクターを眼内にもしくは眼窩周囲に（例えば、テノン嚢下領域内に）投与することにより、処置することができる。

緑内障は、眼圧の上昇および網膜神経節細胞の喪失を特徴とする。緑内障の処置は、本発明の送達ベクターを使用する、興奮毒性損傷から細胞を保護する１つまたは複数の神経保護剤の投与を含む。そのような薬剤には、眼内に、必要に応じて硝子体内に、送達されるＮ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）アンタゴニスト、サイトカインおよび神経栄養因子が含まれる。

他の実施形態では、本発明を使用して、発作を処置することができ、例えば、発作の発症を低減させることができ、発作の発生率または重症度を低下させることができる。発作の治療的処置の有効性を行動学的手段（例えば、眼もしくは口の震え、チック（ticks））および／または電気記録手段（ほとんどの発作は、特徴的な電気記録の異常を有する）により評価することができる。したがって、本発明を使用して、経時的な複数の発作を特徴とする癲癇を処置することもできる。

１つの代表的な実施形態では、ソマトスタチン（またはその活性断片）が、下垂体腫瘍を治療するために本発明の送達ベクターを使用して脳に投与される。この実施形態によると、ソマトスタチン（またはその活性断片）をコードする送達ベクターは、微量注入により下垂体に投与される。同様に、このような処置を使用して先端巨大症（下垂体からの異常な成長ホルモン分泌）を処置することができる。ソマトスタチンの核酸配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ００３０６）およびアミノ酸配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ０１１６６；プロセシングされた活性ペプチドであるソマトスタチン－２８およびソマトスタチン－１４を含有する）は、当技術分野において公知である。

特定の実施形態では、ベクターは、米国特許第７，０７１，１７２号に記載されているような分泌シグナルを含み得る。

本発明の代表的な実施形態では、ＡＡＶハプロイドベクターおよび／またはウイルスカプシドは、ＣＮＳに（例えば、脳に、または眼に）投与される。ＡＡＶハプロイドベクターおよび／またはカプシドを、脊髄、脳幹（延髄、脳橋）、中脳（視床下部、視床、視床上部、下垂体、黒質、松果体）、小脳、終脳（線条体、次のものを含む大脳：後頭葉皮質、側頭葉皮質、頭頂葉皮質および前頭葉皮質、基底核、海馬ならびに扁桃門部（ｐｏｒｔａａｍｙｇｄａｌａ））、辺縁系、新皮質、線条体、大脳および下丘に導入することができる。ＡＡＶハプロイドベクターおよび／またはカプシドを、眼の種々の領域、例えば、網膜、角膜および／または視神経に投与することもできる。

ＡＡＶハプロイドベクターおよび／またはカプシドを、送達ベクターのより分散した投与のために、脳脊髄液に（例えば、腰椎穿刺によって）送達することができる。

ＡＡＶハプロイドベクターおよび／またはカプシドを、さらに、血液脳関門が乱された状況（例えば、脳腫瘍または脳梗塞）でＣＮＳに血管内投与することができる。

ＡＡＶハプロイドベクターおよび／またはカプシドを、くも膜下腔内、眼内、脳内、脳室内、静脈内（例えば、マンニトールなどの糖の存在下）、鼻腔内、耳内、眼内（例えば、硝子体内、網膜下、前房）および眼窩周囲（例えば、テノン嚢下領域）送達、ならびに運動ニューロンへの逆行性送達を伴う筋肉内送達を含むがこれらに限定されない、当技術分野において公知の任意の経路により、ＣＮＳの所望の領域に投与することができる。

特定の実施形態では、ＡＡＶハプロイドベクターおよび／またはカプシドは、液体製剤でＣＮＳ内の所望の領域または区画への直接注射（例えば、定位注射）により投与される。他の実施形態では、ＡＡＶハプロイドベクターおよび／またはカプシドを、所望の領域への局所的適用により、またはエアロゾル製剤の鼻腔内投与により提供することができる。眼への投与は、液滴の局所的適用により得る。さらなる代替案として、ＡＡＶハプロイドベクターおよび／またはカプシドを、固体の持続放出性製剤として投与することができる（例えば、米国特許第７，２０１，８９８号を参照されたい）。

さらに追加の実施形態では、ＡＡＶハプロイドベクターを逆行性輸送に使用して、運動ニューロンに関わる疾患および障害（例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）など）を処置および／または予防することができる。例えば、ＡＡＶハプロイドベクターを筋肉組織に送達することができ、ＡＡＶハプロイドベクターは、そこからニューロンに移動することができる。

本明細書の態様は、一部は、疾患または障害を患っている個体を処置することを開示する。本明細書で使用される場合、用語「処置すること」は、個体において疾患もしくは障害の臨床症状を低減もしくは消失させること、または個体において疾患もしくは障害の臨床症状の発症を遅延もしくは予防することを指す。例えば、用語「処置すること」は、疾患または障害を特徴とする状態の症状を、例えば、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％、低減させることを意味し得る。特定の疾患または障害に関連する実際の症状は周知であり、当業者は、それらの症状を、疾患もしくは障害の位置、疾患もしくは障害の原因、疾患もしくは障害の重症度、および／または疾患もしくは障害に罹患している組織もしくは臓器を含むがこれらに限定されない因子を考慮することにより決定することができる。当業者は、特定のタイプの疾患または障害に関連する適切な症状または兆候を知っているであろうし、個体が本明細書で開示の処置の候補であるかどうかを判定する方法を知っているであろう。

この実施形態の態様では、本明細書で開示されるＡＡＶハプロイドベクターの治療有効量は、疾患または障害に関連する症状を、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％、低減させる。この実施形態の他の態様では、本明細書で開示されるＡＡＶハプロイドベクターの治療有効量は、疾患または障害に関連する症状を、例えば、最大で１０％、最大で１５％、最大で２０％、最大で２５％、最大で３０％、最大で３５％、最大で４０％、最大で４５％、最大で５０％、最大で５５％、最大で６０％、最大で６５％、最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％、最大で９５％、または最大で１００％、低減させる。この実施形態のさらに他の態様では、本明細書で開示されるＡＡＶハプロイドベクターの治療有効量は、疾患または障害に関連する症状を、例えば、約１０％～約１００％、約１０％～約９０％、約１０％～約８０％、約１０％～約７０％、約１０％～約６０％、約１０％～約５０％、約１０％～約４０％、約２０％～約１００％、約２０％～約９０％、約２０％～約８０％、約２０％～約２０％、約２０％～約６０％、約２０％～約５０％、約２０％～約４０％、約３０％～約１００％、約３０％～約９０％、約３０％～約８０％、約３０％～約７０％、約３０％～約６０％、または約３０％～約５０％、低減させる。

一実施形態では、本明細書で開示されるＡＡＶハプロイドベクターは、患者に投与されるＡＡＶハプロイドベクターにコードされているタンパク質のレベルおよび／または量を、例えば、同じ処置を受けていない患者と比較して少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％、増加させることができる。この実施形態の他の態様では、ＡＡＶハプロイドベクターは、疾患または障害を患っている個体において疾患または障害の重症度を、例えば、同じ処置を受けていない患者と比較して約１０％～約１００％、約２０％～約１００％、約３０％～約１００％、約４０％～約１００％、約５０％～約１００％、約６０％～約１００％、約７０％～約１００％、約８０％～約１００％、約１０％～約９０％、約２０％～約９０％、約３０％～約９０％、約４０％～約９０％、約５０％～約９０％、約６０％～約９０％、約７０％～約９０％、約１０％～約８０％、約２０％～約８０％、約３０％～約８０％、約４０％～約８０％、約５０％～約８０％、または約６０％～約８０％、約１０％～約７０％、約２０％～約７０％、約３０％～約７０％、約４０％～約７０％、または約５０％～約７０％、低下させることができる。

この実施形態の態様では、本明細書で開示されるＡＡＶハプロイドベクターの治療有効量は、個体におけるＡＡＶハプロイドベクター内にコードされているタンパク質の量を、例えば、同じ処置を受けていない個体と比較して少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％、増加させる。この実施形態の他の態様では、本明細書で開示されるＡＡＶハプロイドベクターの治療有効量は、個体において、例えば、最大で１０％、最大で１５％、最大で２０％、最大で２５％、最大で３０％、最大で３５％、最大で４０％、最大で４５％、最大で５０％、最大で５５％、最大で６０％、最大で６５％、最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％、最大で９５％、または最大で１００％、疾患もしくは障害の重症度を低下させる、または疾患もしくは障害の重症度を維持する。この実施形態のさらに他の態様では、本明細書で開示されるＡＡＶハプロイドベクターの治療有効量は、個体における疾患または障害の重症度を、例えば、約１０％～約１００％、約１０％～約９０％、約１０％～約８０％、約１０％～約７０％、約１０％～約６０％、約１０％～約５０％、約１０％～約４０％、約２０％～約１００％、約２０％～約９０％、約２０％～約８０％、約２０％～約２０％、約２０％～約６０％、約２０％～約５０％、約２０％～約４０％、約３０％～約１００％、約３０％～約９０％、約３０％～約８０％、約３０％～約７０％、約３０％～約６０％、または約３０％～約５０％、低下させる、または維持する。

ＡＡＶハプロイドベクターは、個体または患者に投与される。個体または患者は、典型的には人間であるが、動物であることもあり、動物には、これらに限定されないが、飼い慣らされているか否かを問わず、イヌ、ネコ、鳥、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、爬虫類および他の動物が含まれる。

ある実施形態では、本発明のＡＡＶハプロイドベクターを使用して、中枢神経系、網膜、心臓、肺、骨格筋および肝臓を含むがこれらに限定されない特定の組織を標的とするＡＡＶを作出することができる。これらの標的化されたＡＡＶハプロイドベクターを使用して、組織特異的である疾患を処置することができ、または特定の正常な組織において内因的に産生されるタンパク質、例えば、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩＩ因子、第ＦＶＩＩＩ因子、および当技術分野において公知の他のタンパク質の産生することができる。
Ｘ．免疫モジュレーション

本明細書で開示の方法および組成物のいずれかの実施形態では、本明細書で開示のｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶゲノムを投与される対象には、免疫抑制剤も投与される。ＡＡＶの投与を受けている患者の免疫応答の免疫抑制をもたらすための様々な方法が公知である。当技術分野において公知の方法は、プロテアソーム阻害剤などの免疫抑制剤を患者に投与するステップを含む。当技術分野において公知の、例えば米国特許第９，１６９，４９２号および米国特許出願第１５／７９６，１３７号において開示されているような、１つのそのようなプロテアソーム阻害剤は、ボルテゾミブであり、前記参考特許文献は両方とも、参照により本明細書に組み込まれる。別の実施形態では、免疫抑制剤は、免疫応答を、例えば抗体産生細胞の消失または抑制によって、抑制することができるポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ｓｃｆｖまたは他の抗体由来分子を含む抗体であり得る。さらなる実施形態では、免疫抑制エレメントは、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であり得る。そのような実施形態では、ｓｈＲＮＡのコード領域は、ｒＡＡＶカセットに含まれており、一般に、ポリＡテールの下流側、３’側、に位置する。ｓｈＲＮＡは、免疫賦活剤、例えば、サイトカイン、増殖因子（トランスフォーミング増殖因子β１およびβ２、ＴＮＦ、ならびに公知である他のもの）の発現を低減または消失させるために標的化され得る。

一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶハプロイドベクターおよびＡＡＶゲノムを使用する方法および組成物は、さらに、免疫モジュレーターを投与することを含む。一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、ＡＡＶハプロイドベクター投与と同時に、ｒＡＡＶハプロイドベクター投与の前に、またはｒＡＡＶハプロイドベクター投与の後に、投与され得る。

一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、免疫グロブリン分解酵素、例えば、ＩｄｅＳ、ＩｄｅＺ、ＩｄｅＳ／Ｚ、ＥｎｄｏＳ、またはそれらの機能的バリアントである。米国特許第７，６６６，５８２号、米国特許第８，１３３，４８３号、米国特許出願公開第２０１８００３７９６２号、米国特許出願公開第２０１８００２３０７０号、米国特許出願公開第２０１７０２０９５５０号、米国特許第８，８８９，１２８号、ＷＯ２０１０／０５７６２６、米国特許第９，７０７，２７９号、米国特許第８，３２３，９０８号、米国特許出願公開第２０１９０３４５５３３号、米国特許出願公開第２０１９０２６２４３４号、およびＷＯ２０２０／０１６３１８（これらの各々は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているような免疫グロブリン分解酵素およびそれらの使用についての参考文献の非限定的な例。

一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、プロテアソーム阻害剤である。ある特定の態様では、プロテアソーム阻害剤は、ボルテゾミブである。実施形態の一部の態様では、免疫モジュレーターは、ボルテゾミブおよび抗ＣＤ２０抗体、リツキシマブ、を含む。実施形態の他の態様では、免疫モジュレーターは、ボルテゾミブ、リツキシマブ、メトトレキサート、および静注用ガンマグロブリンを含む。米国特許第１０，０２８，９９３号、米国特許第９，５９２，２４７号、および米国特許第８，８０９，２８２号（これらの各々は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているような、プロテアソーム阻害剤ならびにリツキシマブ、メトトレキサートおよび静注用ガンマグロブリンとプロテアソーム阻害剤の組合せを開示している、参考文献の非限定的な例。

代替実施形態では、免疫モジュレーターは、ＮＦ－ｋＢ経路の阻害剤である。実施形態のある特定の態様では、免疫モジュレーターは、ラパマイシンまたは機能的バリアントである。米国特許第１０，０７１，１１４号、米国特許出願公開第２０１６００６７２２８号、米国特許出願公開第２０１６００７４５３１号、米国特許出願公開第２０１６００７４５３２号、米国特許出願公開第２０１９００７６４５８号、米国特許第１０，０４６，０６４号に記載されているラパマイシンおよびその使用を開示している参考文献の非限定的な例は、それらの全体が本明細書に組み込まれる。実施形態の他の態様では、免疫モジュレーターは、免疫抑制薬を含む合成ナノ担体である。米国特許出願公開第２０１５０３２０７２８号、米国特許出願公開第２０１８０１９３４８２号、米国特許出願公開第２０１９０１４２９７４号、米国特許出願公開第２０１５０３２８３３３号、米国特許出願公開第２０１６０２４３２５３号、米国特許第１０，０３９，８２２号、米国特許出願公開第２０１９００７６５２２号、米国特許出願公開第２０１６００２２６５０号、米国特許第１０，４４１，６５１号、米国特許第１０，４２０，８３５号、米国特許出願公開第２０１５０３２０８７０号、米国特許出願公開第２０１４０３５６３６号、米国特許第１０，４３４，０８８号、米国特許第１０，３３５，３９５号、米国特許出願公開第２０２０００６９６５９号、米国特許第１０，３５７，４８３号、米国特許出願公開第２０１４０３３５１８６号、米国特許第１０，６６８，０５３号、米国特許第１０，３５７，４８２号、米国特許出願公開第２０１６０１２８９８６号、米国特許出願公開第２０１６０１２８９８７号、米国特許出願公開第２０２０００３８４６２号、米国特許出願公開第２０２０００３８４６３号（これらの各々は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているような、免疫抑制薬、合成ナノ担体とカップリングされた免疫抑制薬、ラパマイシンを含む合成ナノ担体、および／または寛容原性合成ナノ担体、それらの用量、投与および使用についての参考文献の非限定的な例。

一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、米国特許出願公開第２０２０００３８４６３号、米国特許第９，００６，２５４号において開示されているような、ラパマイシンを含む合成ナノ担体（ＩｍｍＴＯＲ（商標）ナノ粒子）（Kishimoto, et al., 2016, Nat Nanotechnol, 11(10): 890-899；Maldonado, et al., 2015, PNAS, 112(2): E156-165）であり、これらの参考文献の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、操作された細胞、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７１９２７８６において開示されているようなＳＱＺ技術を使用して改変された免疫細胞である。

一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、ポリＩＣＬＣ、１０１８ＩＳＳ、アルミニウム塩、Ａｍｐｌｉｖａｘ、ＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ－８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ｄＳＬＩＭ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、イミキモド、ＩｍｕＦａｃｔＩＭＰ３２１、ＩＳＰａｔｃｈ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、Ｊｕｖｌｍｍｕｎｅ、ＬｉｐｏＶａｃ、ＭＦ５９、モノホスホリルリピドＡ、ＭｏｎｔａｎｉｄｅＩＭＳ１３１２、ＭｏｎｔａｎｉｄｅＩＳＡ２０６、ＭｏｎｔａｎｉｄｅＩＳＡ５０Ｖ、ＭｏｎｔａｎｉｄｅＩＳＡ－５１、ＯＫ－４３２、ＯＭ－１７４、ＯＭ－１９７－ＭＰ－ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＰＥＰＴＥＬ、ベクター系、ＰＬＧＡマイクロ粒子、レシキモド、ＳＲＬ１７２、ビロソームおよび他のウイルス様粒子、ＹＦ－１７Ｄ、ＶＥＧＦトラップ、Ｒ８４８、ベータ－グルカン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、およびＡｑｕｉｌａのＱＳ２１スティミュロンからなる群から選択される。別のさらなる実施形態では、免疫調節物質またはアジュバントは、ポリＩＣＬＣである。

一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、細胞における自然免疫応答を阻害する小分子、例えば、クロロキン（ＴＬＲシグナル伝達阻害剤）および２－アミノプリン（ＰＫＲ阻害剤）であり、本明細書で開示の少なくとも１つのｒＡＡＶを含む組成物と組み合わせて投与することもできる。市販のＴＬＲシグナル伝達阻害剤の一部の非限定的な例としては、ＢＸ７９５、クロロキン、ＣＬＩ－０９５、ＯｘＰＡＰＣ、ポリミキシンＢおよびラパマイシン（全て、ＩＮＶＩＶＯＧＥＮ（商標）から購入可能）が挙げられる。加えて、パターン認識受容体（ＰＲＲ）（これらは自然免疫シグナル伝達に関与する）の阻害剤、例えば、２－アミノプリン、ＢＸ７９５、クロロキンおよびＨ－８９も、本明細書で開示のｉｎｖｉｖｏタンパク質発現のために本明細書で開示の少なくとも１つのｒＡＡＶベクターを含む組成物および方法において使用することができる。

一部の実施形態では、ＡＡＶハプロイドベクターは、ＮＬＲＸ１などの自然免疫の負の制御因子もコードし得る。したがって、一部の実施形態では、ＡＡＶハプロイドベクターは、必要に応じて、ＮＬＲＸ１、ＮＳ１、ＮＳ３／４ＡまたはＡ４６Ｒの１つもしくは複数または任意の組合せもコードし得る。加えて、一部の実施形態では、本明細書で開示の少なくとも１つのＡＡＶハプロイドベクターを含む組成物は、組織または対象により生成される自然免疫応答を回避するために、自然免疫系の阻害剤をコードする合成の改変ＲＮＡも含み得る。

一部の実施形態では、本明細書で開示の投与方法における使用のための免疫モジュレーターは、免疫抑制剤である。本明細書で使用される場合、用語「免疫抑制薬または免疫抑制剤」は、正常な免疫機能を阻害するまたはそれに干渉する医薬品を含むように意図されている。本明細書で開示される方法で好適な免疫抑制剤の例としては、Ｔ細胞／Ｂ細胞共刺激経路を阻害する薬剤、例えば、米国特許出願公開第２００２／０１８２２１１号において開示されているような、ＣＴＬＡ４およびＢ７経路経由でのＴ細胞とＢ細胞のカップリングに干渉する薬剤が挙げられる。一実施形態では、免疫抑制剤は、シクロスポリンＡである。他の例としては、ミコフェノール酸モフェチル（myophenylate mofetil）、ラパマイシン、および抗胸腺細胞グロブリンが挙げられる。一実施形態では、免疫抑制薬は、本明細書で開示の少なくとも１つのｒＡＡＶベクターを含む組成物で投与され、または別々の組成物で、本明細書で開示の投与方法に従って少なくとも１つのＡＡＶハプロイドベクターを含む組成物の投与と同時に、もしくはその前に、もしくはその後に、投与され得る。免疫抑制薬は、投与経路に適合する製剤で投与され、所望の治療効果を達成するのに十分な用量で対象に投与される。一部の実施形態では、免疫抑制薬は、本明細書で開示のｒＡＡＶベクターに対する耐性を誘導するのに十分な時間、一過性に投与される。

本明細書で開示の方法および組成物のいずれかの実施形態では、本明細書で開示のＡＡＶハプロイドベクターまたはｒＡＡＶゲノムを投与される対象には、免疫抑制剤も投与される。ＡＡＶの投与を受けている患者の免疫応答の免疫抑制をもたらすための様々な方法が公知である。当技術分野において公知の方法は、プロテアソーム阻害剤などの免疫抑制剤を患者に投与するステップを含む。当技術分野において公知の、例えば米国特許第９，１６９，４９２号および米国特許出願第１５／７９６，１３７号において開示されているような、１つのそのようなプロテアソーム阻害剤は、ボルテゾミブであり、前記参考特許文献は両方とも、参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、免疫抑制剤は、免疫応答を、例えば抗体産生細胞の消失または抑制によって、抑制することができる、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ｓｃｆｖまたは他の抗体由来分子をはじめとする、抗体であり得る。さらなる実施形態では、免疫抑制エレメントは、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であり得る。そのような実施形態では、ｓｈＲＮＡのコード領域は、ｒＡＡＶカセットに含まれており、一般に、ポリＡテールの下流側、３’側、に位置する。ｓｈＲＮＡは、免疫賦活剤、例えば、サイトカイン、増殖因子（トランスフォーミング増殖因子β１およびβ２、ＴＮＦ、ならびに公知である他のもの）の発現を低減または消失させるために標的化され得る。

このような免疫調節剤の使用によって、何ヵ月にもおよび／または何年にもわたって複数回の投薬（例えば、複数回の投与）を容易に使用できるようになる。これは、下で論じられるような複数の薬剤、例えば、複数の遺伝子をコードするＡＡＶハプロイドベクター、の使用、または対象への複数回の投与を可能にする。

一部の実施形態では、本願は、以下の項のいずれかで定義され得る。
１．血液脳関門を横断する際の使用に好適な合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団であって、合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンが、ＡＡＶＶＰ１またはＶＰ２ウイルス構造タンパク質の少なくとも一方とＡＡＶＶＰ３ウイルス構造タンパク質とを含み；
ＶＰ１またはＶＰ２ウイルス構造タンパク質の少なくとも一方が、各々、任意のＡＡＶ血清型からのものであり、ＶＰ３ウイルス構造タンパク質が、血液脳関門を効率的に横断する、ＶＰ１またはＶＰ２の少なくとも一方の血清型とは異なるＡＡＶ血清型からのものであり；
合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団が、全身またはくも膜下腔内投与時に、血液脳関門（ＢＢＢ）を横断することができる、ならびに／またはＢＢＢの内皮細胞におよび／もしくはＢＢＢを横断する血液成分に形質導入することができる、合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団。
２．血液脳関門を横断する能力を欠いている非合理的ポリプロイドＡＡＶ粒子と比べて、血液脳関門（ＢＢＢ）を越える形質導入活性の増強を示す、第１項の集団。
３．ＶＰ３ウイルス構造タンパク質が、ＡＡＶアカゲザル血清型である、第１～２項のいずれかの集団。
４．ＶＰ３ウイルス構造タンパク質が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶｒｈ３９、およびＡＡＶｒｈ４３からなる群から選択される、血液脳関門を効率的に横断する血清型からのものである、第１～３項のいずれかの集団。
５．血液脳関門を効率的に横断する能力を欠いている非合理的ポリプロイドＡＡＶ粒子と比べて、対象の皮質、線条体、視床、髄質、海馬、小脳および脊髄のうちの１つまたは複数への増強された形質導入を示す、第１～４項のいずれかの集団。
６．髄質神経叢、頸神経叢、胸神経叢、腰神経叢および脈絡叢からなる群から選択されるＣＮＳ領域の１つまたは複数においてＡＡＶ２と比べて増強された形質導入を示す、第１～５項のいずれかの集団。
７．ＡＡＶ８と比べて脳微小血管内皮細胞（ＢＭＶＥＣ）への増強された結合を示す、第１～６項のいずれかの集団。
８．ＣＮＳにおける生体内分布を有する、第１～７項のいずれかの集団。
９．少なくとも０．０５ｖｇ／細胞、０．１ｖｇ／細胞、少なくとも０．２ｖｇ／細胞、少なくとも０．４ｖｇ／細胞、少なくとも０．６ｖｇ／細胞、少なくとも０．８ｖｇ／細胞、少なくとも１ｖｇ／細胞、少なくとも５ｖｇ／細胞、少なくとも１０ｖｇ／細胞、少なくとも２０ｖｇ／細胞、少なくとも２５ｖｇ／細胞のまたは好ましくはそれより多いＣＮＳ生体内分布を有する、第１～８項のいずれかの集団。
１０．ＶＰ１またはＶＰ２の少なくとも一方が、血液脳関門を横断するＡＡＶ血清型から選択される、第１～９項のいずれかの集団。
１１．ＶＰ１またはＶＰ２の少なくとも一方が、血液脳関門を横断しないＡＡＶ血清型から選択される、第１～９項のいずれかの集団。
１２．ＶＰ１またはＶＰ２のその少なくとも一方が、ＡＡＶアカゲザル血清型から選択されない、第１～１１項のいずれかの集団。
１３．ＶＰ１またはＶＰ２の少なくとも一方が、ＡＡＶアカゲザル血清型から選択される、第１～１１項のいずれかの集団。
１４．対象に投与されたとき、ＶＰ１またはＶＰ２構造タンパク質のサブタイプの親ＡＡＶベクターにより惹起される液性応答と比較して低い液性免疫応答を惹起する、第１～１３項のいずれかの集団。
１５．ＡＡＶＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３ウイルス構造タンパク質の親血清型に対する中和抗体から逃れる、第１～１４項のいずれかの集団。
１６．対象の血液脳関門を越えて導入遺伝子を送達するための方法であって、第１～１５項のいずれかの合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団を対象に投与するステップを含む方法。
１７．対象へのＡＡＶの反復投薬のための方法であって、第１から１６項のいずれかからの合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団を対象に投与することにより行われる第１の投与、およびＶＰ１またはＶＰ２ウイルス構造タンパク質の少なくとも一方の親ＡＡＶ血清型を対象に投与することにより行われる第２の投与を含み、合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団が、ＶＰ１またはＶＰ２ウイルス構造タンパク質の親ＡＡＶ血清型により惹起される液性応答と比較して低減された液性応答を対象において惹起し、ＶＰ１またはＶＰ２の少なくとも一方が、ＲｈｅｓｕｓＡＡＶ血清型ではない、方法。
１８．反復投薬を可能にする合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団であって、合理的ＡＡＶＶＰ１またはＶＰ２ウイルス構造タンパク質の少なくとも一方と、ＡＡＶＶＰ３ウイルス構造タンパク質とを含むポリプロイドＡＡＶビリオンを含み；ＶＰ１またはＶＰ２ウイルス構造タンパク質の少なくとも一方が、各々、任意のＡＡＶウイルス血清型からのものであり、ＶＰ３ウイルス構造タンパク質が、アカゲザルＡＡＶ血清型から選択され；合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団が、ＶＰ１またはＶＰ２ウイルス構造タンパク質の親ＡＡＶ血清型により惹起される液性応答と比較して低減された液性応答を惹起し；ＶＰ１またはＶＰ２の少なくとも一方が、ＲｈｅｓｕｓＡＡＶ血清型からのものではなく、反復投薬が、合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団の第１の投与、およびＶＰ１構造ウイルスタンパク質またはＶＰ２構造ウイルスタンパク質の親ＡＡＶ血清型の第２の投与を含む、集団。
１９．合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団であって、（ａ）ＡＡＶ８ウイルス血清型から選択されるＶＰ１およびＶＰ２ＡＡＶウイルス構造タンパク質と、（ｂ）ＡＡＶアカゲザル血清型ＡＡＶｒｈ１０またはＡＡＶｒｈ７４から選択されるＶＰ３とを含み、対象に投与されたとき、親ＡＡＶ８血清型により惹起される対応する液性応答と比べて低減された液性応答を惹起する、合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団。
２０．対象への第１および第２のＡＡＶ投与を含む反復投薬のための方法であって、第１～１６または１８～１９項のいずれかからの合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団を対象に投与することにより行われる第１の投与、およびＶＰ１またはＶＰ２ウイルス構造タンパク質の親ＡＡＶ血清型を投与することにより行われる第２の投与を含み、第１の投与が、ＶＰ１またはＶＰ２ウイルス構造タンパク質の親ＡＡＶ血清型により惹起される対応する液性応答と比較して低減された液性応答を対象において惹起し、ＶＰ１またはＶＰ２が、ＲｈｅｓｕｓＡＡＶ血清型ではない、方法。
２１．ＡＡＶＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３ウイルス構造タンパク質の親血清型に対する中和抗体から逃れる、第１８～２０項のいずれかの集団。
２２．対象の血液脳関門を越えて導入遺伝子を送達するための方法であって、第１８～２１項のいずれかの合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団を対象に投与するステップを含む方法。
２３．ＶＰ３タンパク質が、ＡＡＶｒｈ１０またはＡＡＶｒｈ７４血清型からの変異ＶＰ３タンパク質である、前項のいずれかの集団。
２４．変異ＡＡＶｒｈ７４ＶＰ３タンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列、もしくは配列番号２に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するタンパク質のアミノ酸配列を有し、または変異ＡＡＶｒｈ７４ＶＰ３が、配列番号２の以下の改変：Ｎ２６３Ｓ、Ｇ２６４Ａ、Ｔ２６５Ｓ、Ｓ２６６Ｔ、Ｇ２６８Ａ、Ｔ２７０ｄｅｌ、Ｔ２７４Ｈ、Ｅ５３３Ｋ、Ｒ７２６Ｈ、Ｎ７３６Ｐのうちの少なくとも１つを含む、第２３項の集団。
２５．変異ＡＡＶｒｈ１０ＶＰ３タンパク質が、配列番号５のＡＡＶｒｈ１０＿ＶＰ３核酸と比較してＱ２１４Ｎ、Ｓ４６２ＮおよびＤ５１７Ｅ変異のうちの少なくとも１つまたは複数を含む配列番号５の核酸によりコードされる、またはＱ２１４Ｎ、Ｓ４６２ＮおよびＤ５１７Ｅから選択される少なくとも１つの変異を含む配列番号５に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する核酸配列を含む配列番号５の核酸によりコードされる、第２４項の集団。
２６．ＶＰ３タンパク質が、配列番号２もしくは３のアミノ酸配列、または配列番号２もしくは３に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するタンパク質のアミノ酸配列を含むＡＡＶｒｈ７４ＶＰ３タンパク質であり、あるいは配列番号２のＮ２６３Ｓ、Ｇ２６４Ａ、Ｔ２６５Ｓ、Ｓ２６６Ｔ、Ｇ２６８Ａ、Ｔ２７０ｄｅｌ、Ｔ２７４Ｈ、Ｅ５３３Ｋ、Ｒ７２６Ｈ、Ｎ７３６Ｐのアミノ酸改変のうちの少なくとも１つを含む、第２５項の集団。
２７．少なくとも１０^１個のビリオンである、第１～２６項のいずれかのビリオンの実質的に均一な集団。
２８．５’から３’の方向に、ａ．第１のプロモーターに動作可能に連結されたＡＡＶｒｈ１０ＶＰ３カプシドタンパク質をコードする第１の核酸；ｂ．第１のポリＡ配列；ｃ．ｒｅｐタンパク質をコードする第２の核酸；ｄ．ＡＡＶ８ＶＰ１およびＶＰ２ウイルス構造タンパク質をコードする第３の核酸であって、第３の核酸配列がＡＡＶ８ＶＰ３ウイルス構造タンパク質を発現することができない、第３の核酸；ならびにｅ．第２のポリＡ配列を含む核酸。
２９．５’から３’の方向に、ａ．第１のプロモーターに動作可能に連結されたＡＡＶｒｈ７４ＶＰ３カプシドタンパク質をコードする第１の核酸；ｂ．第１のポリＡ配列；ｃ．ｒｅｐタンパク質をコードする第２の核酸；ｄ．ＡＡＶ８ＶＰ１およびＶＰ２ウイルス構造タンパク質をコードする第３の核酸であって、第３の核酸配列がＡＡＶ８ＶＰ３ウイルス構造タンパク質を発現することができない、第３の核酸；およびｅ．第２のポリＡ配列を含む核酸。
３０．ａ．前項のいずれかの集団からのＡＡＶビリオン；およびｂ．少なくとも１つの末端反復配列と異種遺伝子とを含む核酸を含み、核酸がＡＡＶビリオンに封入されている、ウイルスベクター。
３１．キメラまたは改変ウイルス構造タンパク質を含み、改変ウイルス構造タンパク質が、１個または複数個のアミノ酸の挿入、欠失または置換を含む、前項のいずれかの集団。
３２．親ＡＡＶ血清型を含むビリオンの実質的に均一な集団と比較して、ｉｎｖｉｖｏで血清中のＶＰ１またはＶＰ２構造タンパク質の親ＡＡＶ血清型に対する有意に少ない抗ＡＡＶＩｇＧ抗体を惹起する、第２７項の実質的に均一な集団。
３３．親ＡＡＶ血清型がＡＡＶ８である、第３２項の実質的に均一な集団。
３４．反復投薬を可能にする合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団であって、
ＡＡＶＶＰ１またはＶＰ２ウイルス構造タンパク質の少なくとも一方と、ＡＡＶＶＰ３ウイルス構造タンパク質とを含み；
ＶＰ１およびＶＰ２ウイルス構造タンパク質が、各々、ＲｈｅｓｕｓＡＡＶ血清型を除く任意のＡＡＶウイルス血清型からのものであり、ＶＰ３ウイルス構造タンパク質が、アカゲザルＡＡＶ血清型から選択され；
合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団が、ＶＰ３ウイルス構造タンパク質の親ＡＡＶアカゲザル血清型に対する中和抗体から逃れ、反復投薬が、ＶＰ３構造タンパク質の親ＡＡＶアカゲザル血清型の第１の投与、および合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団の第２の投与を含み、合理的ポリプロイドビリオンのＶＰ３構造タンパク質が、ＡＡＶアカゲザル変異ウイルス構造タンパク質ＶＰ３である、合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団。
３５．ＡＡＶアカゲザル変異ウイルス構造タンパク質ＶＰ３が、変異ＡＡＶｒｈ１０ＶＰ３ウイルス構造タンパク質からのものであるか、または変異ＡＡＶｒｈ７４ＶＰ３ウイルス構造タンパク質からのものである、第３４項の合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団。
３６．変異ウイルス構造タンパク質ＶＰ３が、Ｎ２６３、Ｇ２６４、Ｔ２６５、Ｓ２６６Ｔ、Ｇ２６８、Ｔ２７０、Ｔ２７４、およびＥ５３３からなる群から選択されるアミノ酸に対応するアミノ酸における変異を含み、アミノ酸位置の全てが、ＡＡＶｒｈ１０またはＡＡＶｒｈ７４のネイティブＶＰ１配列番号付けに対応する、第３４～３５項のいずれかの合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団。
３７．変異が、Ｎ２６３Ｓ、Ｇ２６４Ａ、Ｔ２６５Ｓ、Ｓ２６６Ｔ、Ｇ２６８Ａ、Ｔ２７０ｄｅｌ、Ｔ２７４Ｈ、およびＥ５３３Ｋからなる群から選択される、第３６項の集団。
３８．変異ウイルス構造タンパク質ＶＰ３が、Ｒ７２７およびＮ７３７からなる群から選択されるアミノ酸に対応するアミノ酸における変異をさらに含み、アミノ酸位置の全てが、ＡＡＶｒｈ１０のネイティブＶＰ１配列番号付けに対応する、第３４～３７項のいずれかの合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団。
３９．変異が、Ｒ７２７ＨおよびＮ７３７Ｐからなる群から選択される、第３８項の合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団。
４０．変異ウイルス構造タンパク質ＶＰ３が、Ｒ７２６およびＮ７３６からなる群から選択されるアミノ酸に対応するアミノ酸における変異をさらに含み、アミノ酸位置の全てが、ＡＡＶｒｈ７４のネイティブＶＰ１配列番号付けに対応する、第３４～３７項のいずれかの合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団。
４１．変異が、Ｒ７２６ＨおよびＮ７３６Ｐからなる群から選択される、第４０項の合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団。
４２．変異ウイルス構造タンパク質ＶＰ３が、５８１におけるＷに対応するアミノ酸における変異をさらに含み、Ｗが２個の後続のＶ残基（ＶＶ）に置き換えられ、アミノ酸位置の全てが、ＡＡＶｒｈ７４のネイティブＶＰ１配列番号付けに対応する、第４１項の合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団。
４３．ＡＡＶＶＰ１またはＶＰ２ウイルス構造タンパク質が、表１から選択される任意のＡＡＶ血清型である、第３４～４２項のいずれかの合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団。
４４．ＡＡＶＶＰ１またはＶＰ２ウイルス構造タンパク質が、ＡＡＶ８である、第３４～４３項のいずれかの合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団。
４５．血液脳関門を越えて導入遺伝子を送達するために使用するための医薬の製造における合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団の使用であって、医薬が、第１～１５、または１８～１９、２１、２３～２７、３１～４４項のいずれかの合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団を含む、使用。
４６．合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団が、ＡＡＶ８ウイルス血清型から選択されるＶＰ１およびＶＰ２ＡＡＶウイルス構造タンパク質、ならびにＡＡＶアカゲザル血清型ＡＡＶｒｈ１０またはＡＡＶｒｈ７４から選択されるＶＰ３ウイルス構造タンパク質を含む、第４５項の使用。
４７．合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団が、ＡＡＶ８ウイルス血清型から選択されるＶＰ１およびＶＰ２ＡＡＶウイルス構造タンパク質、ならびにＡＡＶアカゲザル血清型ＡＡＶｒｈ７４から選択されるＶＰ３構造タンパク質を含む、第４５項の使用。
４８．医薬が、脳疾患、または脳障害、または神経変性疾患、または神経学的疾患の処置に有用である、第４５項の使用。
４９．医薬が、中枢神経系（ＣＮＳ）または末梢神経系（ＰＮＳ）の疾患の処置に有用である、第４５項の使用。
５０．医薬が、脳がんまたは脳のがんを有する対象の処置に有用である、第４５項の使用。
５１．医薬が、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）およびドーパミントランスポーター欠損症候群から選択される疾患または障害を有する対象の処置に有用である、第４５項の使用。
５２．血液脳関門を越えて導入遺伝子を送達するために使用するための合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団を含む医薬の製造における核酸の使用であって、核酸が第２８または２９項のいずれかを含む、使用。
５３．第１の医薬の第１の投与および第２の医薬の第２の投与の反復投薬のための方法における使用のための第１の医薬および第２の医薬の調製における合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団の使用であって、反復投薬が、第１～１５または１８～１９項のいずれかからの合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンを含む第１の医薬の第１の投与と、ＶＰ１またはＶＰ２ウイルス構造タンパク質の少なくとも一方の親ＡＡＶ血清型を含む第２の医薬の第２の投与とを含み、合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団が、ＶＰ１またはＶＰ２ウイルス構造タンパク質の少なくとも一方の親ＡＡＶ血清型により惹起される液性応答と比較して低減された液性応答を惹起し、ＶＰ１またはＶＰ２が、ＲｈｅｓｕｓＡＡＶ血清型からのものではない、使用。
５４．ＡＡＶＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３の親血清型に対する中和抗体から逃れるための医薬の調製における合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団の使用であって、医薬が、第１～１５、または１８～１９、２１、２３～２７、および３１～４４項のいずれかの合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団を含む、使用。
５５．小腸への導入遺伝子の送達のための医薬の調製における合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団の使用であって、医薬が、第１～１５、または１８～１９、２１、２３～２７、および３１～４４項のいずれかの合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団を含む、使用。
５６．消化管疾患または障害の処置のための医薬の調製における合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団の使用であって、医薬が、第１～１５、または１８～１９、２１、２３～２７、および３１～４４項のいずれかの合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団を含む、使用。

例えば、限定することなく、本出願人らは、現在のもしくは将来補正された場合の、本願の任意の請求項、またはそれから導出される任意の特許から、下記の主題のいずれか１つまたは複数を権利放棄する権利を留保する：

改変ウイルスカプシドを、例えば米国特許第５，８６３，５４１号に記載されているような、「カプシドビヒクル」として使用することができる。改変ウイルスカプシドによりパッケージングされ細胞に移入され得る分子は、異種ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、小有機分子、金属、またはこれらの組合せを含む。

材料および方法
細胞系。

Ｐｒｏ１０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｈｕｈ７細胞およびＣ２Ｃ１２細胞を、３７℃で、５％ＣＯ_２で、１０％ウシ胎孔血清および１０％ペニシリン－ストレプトマイシンを含有するダルベッコ変性イーグル培地中で維持した。
組換えハプロイドＡＡＶ８ウイルス産生。

組換えＡＡＶをトリプルプラスミドトランスフェクション系により産生した。ＨＥＫ２９３細胞の１５ｃｍ皿に、９μｇのＡＡＶ導入遺伝子プラスミドｐＴＲ／ＣＢＡ－Ｌｕｃ、１２μｇのＡＡＶヘルパープラスミド、および１５μｇのＡｄヘルパープラスミドＸＸ６８０をトランスフェクトした。ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０およびＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドビリオンを生成するために、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０産生のためのｒｈ１０ＶＰ３核酸、またはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイド産生のためのｒｈ７４ＶＰ３核酸、どちらかを含む、図１に示されているプラスミドを、コトランスフェクトした。トランスフェクションの６０時間後に、ＨＥＫ２９３細胞を収集し、溶解した。上清をＣｓＣｌ勾配超遠心分離に供した。ウイルス力価を定量的ＰＣＲにより決定した。

一部の実施形態では、ｒＡＡＶ産生細胞系を使用して、ｒＡＡＶゲノムをハプロイドＡＡＶカプシドにパッケージングしてハプロイドｒＡＡＶベクターを生成した。もっぱらｒＡＡＶベクター構築物の原理証明のために使用したカプシドは、ＡＡＶ８ハプロイドカプシドであった。

ｒＡＡＶ産生細胞系におけるｒＡＡＶの作製：臨床グレードのベクターを作製するために規模拡大することができる、懸濁ｒＡＡＶプロデューサー細胞系でのトリプルトランスフェクション技法を使用して、ｒＡＡＶを作製した。あるいは、異なるプラスミド、例えば、１）ｐＸＸ６８０－ａｄヘルパーならびに２）ｐＸＲ３そのＲｅｐおよびＣａｐ３）ならびに導入遺伝子プラスミド（ＩＴＲ－導入遺伝子－ＩＴＲ）を使用することができる。

ｒＡＡＶ産生細胞系を使用してｒＡＶＶポリプロイド、例えば合理的ポリプロイドベクター、を生成する方法は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，４４１，２０６号に記載されているような方法を使用して行うことができる。具体的には、ｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶビリオンを、（ａ）ＡＡＶ発現系をｒＡＡＶ産生細胞系に提供するステップ、（ｂ）ＡＡＶ粒子が産生される条件下で細胞を培養するステップ、および（ｃ）必要に応じて、ＡＡＶ粒子を単離するステップを含む方法を使用して産生する。ＸＸ６８０、ＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐヘルパーおよびＴＲプラスミドのプラスミドの比を変えてｒＡＡＶベクター産生に最適なプラスミドの比を決定することで、プラスミドのトリプルトランスフェクションの比率およびトランスフェクションカクテルの体積を最適化することができる。

一部の例では、細胞を、ＡＡＶ８ハプロイド粒子が産生される条件下、浮遊状態で培養する。別の実施形態では、細胞を動物由来成分不含条件で培養する。動物由来成分不含培地は、ｒＡＡＶプロデューサー細胞系に適合するいずれの動物由来成分不含培地（例えば、無血清培地）であってもよい。例としては、ＳＦＭ４Ｔｒａｎｓｆｘ－２９３（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、Ｅｘ－Ｃｅｌｌ２９３（ＪＲＨＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＬＣ－ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＰｒｏ１０細胞、またはＰｒｏ２９３－Ｓ（Ｌｏｎｚａ）が挙げられるが、これらに限定されない。ＡＡＶ粒子の複製およびパッケージングに十分な条件は、例えば、本明細書に記載するｒＡＡＶゲノムの複製およびＡＡＶカプシドへのカプシド内封入に十分なＡＡＶ配列（例えば、ＡＡＶｒｅｐ配列およびＡＡＶｃａｐ配列）ならびにアデノウイルスおよび／またはヘルペスウイルスからのヘルパー配列の存在であり得る。

プラスミド骨格からの細菌ＤＮＡ配列は、組換えＡＡＶベクターの製造中にＡＡＶ８ハプロイドカプシドにパッケージングされ、その結果、ＴＬＲ９とのその相互作用によって自然免疫系の活性化に至ることがある（Akira, 2006；Chadeuf, 2005；Wright, 2014）。

一部の実施形態では、様々な技術、例えば、限られたスケーラビリティーを有するミニサークル（Schnodt, 2016）を使用して、組換えＡＡＶハプロイド調製物中のプラスミド骨格配列を消失させることができる。プラスミド骨格中の細菌ＤＮＡ配列を回避するための別の方法は、組換えＡＡＶベクターの特異的製造のための、ドギーボーンＤＮＡ（ｄｂＤＮＡ（商標））を含むがこれらに限定されない様々なＤＮＡ複製技術を含む、末端が閉じた線状の二重鎖ＤＮＡの使用である。ｄｂＤＮＡ（商標）などの末端が閉じた線状の二重鎖ＤＮＡの使用は、細菌骨格を消失させ、ワクチンおよびレンチウイルスを生産するために使用されており（Walters et al, 2014；Scott et al, 2015；Karda et al, 2019）、ＤＮＡワクチン開発者によりＴＬＲ９応答を誘発できないことが示された。

したがって、代替実施形態では、例えば、本明細書で開示の方法および組成物における使用のための、本明細書で開示するｒＡＡＶ合理的ポリプロイドベクター、例えば、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０またはＡＡＶ８－８－ｒｈ１０ハプロイドの生成は、米国特許出願公開第２０１８／００３７９４３号およびKarbowniczek et al., Bioinsights, 2017において開示されているような、Ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ技術（ｄｂＤＮＡ（商標））を含むがこれに限定されない、末端が閉じた線状の二重鎖ＤＮＡを使用して行うことができ、前記参考文献の両方は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。手短に言えば、末端が閉じた線状の二重鎖ＤＮＡ技術を使用するＡＡＶ産生のためのプラスミドは、ＩＴＲを含み、プロモーターおよび目的の遺伝子が、５６ｂｐパリンドロームプロテロメラーゼ認識配列と隣接している。実施形態の一部の態様では、ＩＴＲは、１４５ｂｐまたはそれ未満である。実施形態のある特定の態様では、ＩＴＲは、１３０ｂｐである。プラスミドを変性させ、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ、および適切なプライマーの存在下で、Ｐｈｉ２９がローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を開始し、その結果、元の構築物の二本鎖コンカテマーリピートが作出される。プロテロメラーゼを添加すると、パリンドロームプロテロメラーゼ認識配列の結合が起こり、切断－結合反応が起こって、単量体の二本鎖（ｄｓ）線状の共有結合で閉じたＤＮＡ構築物が生じる結果となる。共通の制限酵素の付加によって、望ましくないＤＮＡプラスミド骨格配列、およびエキソヌクレアーゼ活性による消化が除去され、その結果、バーベル型ＤＮＡが得られ、これをサイズ分画して、ＩＴＲとプロモーターと目的の遺伝子とをコードするバーベル型のＤＮＡ配列を単離することができる。バーベル型ＤＮＡをはじめとする末端が閉じた線状の二重鎖ＤＮＡを使用するｒＡＡＶベクターの生成のための例示的なプラスミドは、以下の５’から３’への方向で、５’－プロテロメラーゼＲＳ、５’ＩＴＲ、ＬＳＰプロモーター、ｈＧＡＡ、３’ＵＴＲ、ｈＧＨポリ（Ａ）、３’ＩＴＲ、３’－プロテロメラーゼＲＳ（センス鎖）を含み、このセンス鎖は、鎖状（ｄｓ）の線状の共有結合で閉じたＤＮＡ構築物の場合は相補アンチセンス鎖に連結されている。本明細書で開示の方法および組成物における使用のためのＡＡＶベクターを製造するための出発材料としての、末端が閉じた線状の二重鎖ＤＮＡ、例えばバーベル型ＤＮＡ、の使用により、ＡＡＶベクターを含有するプラスミドを増殖させるために使用される細菌骨格が排除され、その産物は、Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）応答を誘発することができない。

ウェスタンおよび免疫ブロット。

ウイルス力価に従って、同量のビリオンを各レーンに負荷し、続いて、ＮｕＰａｇｅ４－１０％ポリアクリルアミドＢｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）での電気泳動を行い、次いで、ｉＢｌｏｔ（登録商標）２ＤｒｙＢｌｏｔｔｉｎｇＳｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）によってＰＶＤＦ膜に転写した。膜をＡＡＶカプシドタンパク質に特異的な抗Ｃａｐ抗体とともにインキュベートした。

ネイティブ免疫ブロットアッセイを、以前に記載されたように行った。手短に述べると、精製カプシドを、真空ドット・ブロッターを使用することにより、Ｈｙｂｏｎｄ－ＥＣＬ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）に転写した。膜を、１時間、１０％ミルク含有ＰＢＳでブロックし、次いでモノクローナル抗体ＡＤＫ８とともにインキュベートした。膜をペルオキシダーゼ共役ヤギ抗マウス抗体とともに１時間インキュベートした。タンパク質をＡｍｅｒｓｈａｍＩｍａｇｅｒ６００（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、Ｐａ．）により可視化した。

ｉｎｖｉｔｒｏ形質導入アッセイ。

Ｈｕｈ７、Ｃ２Ｃ１２細胞およびＧＭ１６０９５細胞に平底２４ウェルプレートにおいて組換えウイルスにより１×１０^４ｖｇ／細胞で形質導入した。４８時間後、細胞を回収し、ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）により評価した。

動物研究。

この研究で実施した動物実験は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを用いて行った。ＮＩＨガイドラインに従って、ＵＮＣＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＡｎｉｍａｌＣａｒｅａｎｄＵｓｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）により承認された通りにマウスを維持した。６または７週齢雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、尾静脈経由で５×１０^１０ｖｇ／マウスまたは２．５×１０^１２ｖｇ／マウスどちらかの合理的ポリプロイドベクターＡＡＶ８－Ｌｕｃ（親対照）、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０－Ｌｕｃ、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４－ＬｕｃおよびＡＡＶｒｈ１０－Ｌｕｃ（親対照）ウイルス（ｎ＝４）を、静脈内（ｉｖ）注射した。１匹の追加の食塩水注射マウスを、各群（ｎ＝７）において陰性対照として使用した。ベクターを製剤用緩衝液（ＦＢ；１０ｍＭリン酸塩、２．７ｍＭＫＣｌ、３５０ｍＭＮａＣｌ、５％ソルビトール、０．００１％プルロニック（登録商標）Ｆ６８、ｐＨ７．４）で希釈した。ビヒクル（ＦＢ）を施した１匹の追加のマウスを、各群に陰性対照として含めた。

ｉｎｖｉｖｏ期の取扱い：動物の全身の状態、体位、交流する能力、および刺激に対する応答を観察した。あらゆる異常を記録した。研究中はマウスの体重を毎週モニターした（データ未記載）。ルシフェラーゼ測定前に、キシラジン（xylacine）（Ｒｏｍｐｕｎ（登録商標）２０ｍｇ／ｍＬ、ＢａｙｅｒＡｎｉｍａｌＨｅａｌｔｈＧｍｂＨ）と混合したケタミン（Ｋｅｔａｍｉｄｏｒ（登録商標）１００ｍｇ／ｍＬ、ＲｉｃｈｔｅｒＰｈａｒｍａＡＧ）の、ケタミン７５ｍｇ／ｋｇおよびキシラジン１５ｍｇ／ｋｇの用量での、腹腔内注射で、動物を麻酔した。

注射の１週間後、Ｄ－ルシフェリン基質（ＮａｎｏｌｉｇｈｔＰｉｎｅｔｏｐ、Ａｒｉｚ．）のｉ．ｐ．注射後にＸｅｎｏｇｅｎＩＶＩＳＬｕｍｉｎａ（ＣａｌｉｐｅｒＬｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓ．）を使用してルシフェラーゼ発現をイメージングした。ＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓ．）を使用して、生物発光画像を解析した。示されている時点でマウスをイメージングした。

次に、マウスの脳、脊髄および小腸におけるＡＡＶ８－８－ｒｈ１０およびＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドウイルスの形質導入効率を評価した。ＡＡＶ８およびＡＡＶｒｈ１０ウイルスも、対照として注射した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの用量を３×１０^１０ｖｇの組換えウイルスとともに尾静脈経由で注射し、ＡＡＶ注射後３日目にイメージングを行った。

導入遺伝子発現

導入遺伝子発現を決定するために、Ｍａｘｗｅｌｌ（登録商標）１６ＬＥＶｓｉｍｐｌｙＲＮＡＣｅｌｌｓ／ＴｉｓｓｕｅＫｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者の使用説明書に従って用いて、組織から全ＲＮＡを抽出した。次いで、ＲＮＡをＤＮａｓｅＩで処理し、Ｍ－ＭＬＶレトロトランスクリプターゼ酵素およびランダムプライマーを使用してｃＤＮＡに逆転写した。手順をＣ１０００ＴｏｕｃｈＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）で行った。

ＣＦＸＣｏｎｎｅｃｔＲｅａｌ－ｔｉｍｅＳｙｓｔｅｍにおいてＴａｑＭａｎＦａｓｔＡｄｖａｎｃｅｄＭａｓｔｅｒＭｉｘを使用する逆転写（ＲＴ）－ｑＰＣＲにより、定量解析を行った。ｃＤＮＡを、ルシフェラーゼ（Ｍｒ０３９８７５８７＿ｍｒ）またはマウスｇａｐｄｈハウスキーピング遺伝子（Ｍｍ９９９９９９１５＿ｇ１；両方ともＡｓｋｂｉｏにより選択され、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した）の検出のための特異的アッセイを使用するリアルタイムｑＰＣＲにより定量化し、ルシフェラーゼデータの正規化のための参照遺伝子として使用した。２－ΔＣｔ法を使用して、相対定量化を行った。

統計解析。

データを平均±ＳＤとして表した。スチューデントｔ検定を使用して、全ての統計解析を行った。Ｐ値＜０．０５を、統計的有意差と見なした。
（実施例１）

合理的設計方法論を使用するハプロイドＡＡＶ８ビリオンの生成－合理的ポリプロイド方法論の応用によるＡＡＶ８ベクターからのＶＰ１／ＶＰ２と１つのアカゲザルＡＡＶ（ＡＡＶｒｈ）血清型のみからのＶＰ３とを有するＡＡＶ８ハプロイドビリオンを組み立てることによるハプロイドＡＡＶ８ベクターからのＡＡＶ形質導入の増強

実施例１は、任意の順序での、それぞれ、ＡＡＶ８、およびＢＢＢを横断する任意の血清型、例えばアカゲザルＡＡＶ（ＡＡＶｒｈ）血清型、からのＶＰ１およびＶＰ３カプシドタンパク質、ならびに必要に応じて、ＡＡＶ８からのＶＰ２カプシドタンパク質、またはアカゲザルＡＡＶ（ＡＡＶｒｈ）血清型を含むがこれに限定されない、ＢＢＢを横断する任意の血清型からのＶＰ２カプシドタンパク質の、例示的な組合せを開示する、説明に役立つ例である。ＡＡＶｒｈ１０およびＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質を、ＢＢＢを横断する（およびＡＡＶｒｈ血清型でもある）例示的な血清型として示すが、これらを、ＢＢＢを横断する任意の他の血清型（これらに限定されないが、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ｒＡＡＶｒｈ１０、ｒＡＡＶｒｈ７４、ｒＡＡＶｒｈ３９、ｒＡＡＶｒｈ４３または他のＡＡＶｒｈ血清型を含む）からのＶＰ３タンパク質で容易に置き換えることまたは置換することができる。同様に、ＡＡＶ８をＶＰ１および／またはＶＰ２タンパク質についての例示的血清型として示すが、ＡＡＶ８からのＶＰ１および／またはＶＰ２タンパク質で、任意の血清型、例えば、ＡＡＶ２もしくは本明細書において表１で開示する任意の他の血清型を置き換えることまたは置換することができることが、本明細書では包含される。

本明細書において、本発明者らは、ＣＮＳ（および／またはＰＮＳ）における形質導入の増強を、ＡＡＶ８ベクターカプシドからのＶＰ１／ＶＰ２と、ＢＢＢを横断する代替のもの、例えばｒｈＡＡＶ１０もしくはｒｈＡＡＶ７４、からのＶＰ３、またはｒｈＡＡＶ１０もしくはｒｈＡＡＶ７４からの改変ＶＰ３タンパク質とを有するハプロイドベクターから達成することができることを、実証する。

異なるＡＡＶ血清型からのＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の生成は、これらの異なるタンパク質を産生するための２つの異なる戦略を提供する。興味深いことに、ＶＰタンパク質は、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の配列がオーバーラップしている単一のＣＡＰヌクレオチド配列から翻訳される。

Ｃａｐ遺伝子は、３つのタンパク質－ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３－をコードする。ＶＰ１遺伝子は、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３タンパク質を含有し、ＶＰ２は、ＶＰ２およびＶＰ３タンパク質を含有する。したがって、Ｃａｐ遺伝子は、３つのセグメント、ＶＰ１の開始－ＶＰ２の開始－ＶＰ３の開始－３つ全てのＶＰタンパク質の終了、を有する。

合理的ハプロイドの実施形態では、Ｃａｐ遺伝子の調達は、２つの異なるＡＡＶ血清型（血清型ＸまたはＹ（例えば、表１から選択される任意の血清型、例えばＡＡＶ８、について）および血清型Ｚ（ＡＡＶｒｈを含むがこれに限定されない、ＢＢＢを横断するＡＡＶ血清型について）と名付けた）に端を発するものであり得、３つのＣａｐタンパク質の６つの可能な組合せがある。１つのケースでは、血清型ＡＡＶ８（またはキメラもしくは他の天然に存在しないＡＡＶ８）として同定されたＶＰ１は、ＡＡＶ８のみからのものであり、血清型Ｙとして同定されたＶＰ２／ＶＰ３は、血清型Ｙのみからのものであり、ＶＰ１の血清型（またはキメラもしくは他の天然に存在しないＡＡＶ）とは異なる血清型である。１つのケースでは、ＶＰ１とＶＰ２の両方がＡＡＶ８のみからのものであり、ＶＰ３は、血清型Ｚのみからのものであり、血清型Ｚは、ＢＢＢを横断するＡＡＶ血清型であり、および／または非ヒト霊長類ＡＡＶ血清型である。ＡＡＶ８のＶＰ１および血清型ＺのＶＰ２／ＶＰ３を作出する方法、またはＡＡＶ８血清型からのＶＰ１／ＶＰ２および血清型ＺからのＶＰ３を作出する方法を、本明細書で示す実施例において開示する。１つのケースでは、ＶＰ１およびＶＰ３は、第１の血清型のみからのものであり、ＶＰ２は、第２の血清型のみからのものである。

表5: 血清型Zが、BBBを横断する任意のAAV血清型であり、または代替的に、アカゲザルAAV血清型(AAVrh)をはじめとする非ヒト霊長類からのものであり、血清型Xが、AAV8でも血清型Zでもない第3のAAV血清型であり、血清型Xが、アカゲザルAAV血清型(AAVrh)である任意のAAV血清型であり得るか、AAV8でも血清型Zでもない、任意の血清型またはキメラもしくは天然に存在しない血清型であり得る、AAV8ハプロイドまたはAAV8ポリプロイドベクターの例示的な組合せ。

一部の実施形態では、ＡＡＶ８ハプロイドがＡＡＶ８からのＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３の少なくとも１つを含む場合には、ＶＰ１はＡＡＶ８ではなく、次の組合せを表６に示す：

表6: VP1がAAV8でなく、AAV8からのVP1、VP2またはVP3のうちの少なくとも1つを含み、血清型Zが、BBBを横断するまたは代替的に任意のアカゲザルAAV血清型(AAVrh)からのものであり、AAV8ではない、任意の血清型からのものである、例示的なAAV8ハプロイドベクター。

一部の実施形態では、３つのＣａｐタンパク質の６つの可能な組合せがある、３つの異なるＡＡＶ遺伝子（ＡＡＶ８、ＸおよびＺと名付けた）からのＣａｐ遺伝子の調達。このケースでは、ＶＰ２およびＶＰ３の血清型とは異なるＡＡＶ８（またはＡＡＶ８のキメラもしくは他の天然に存在しないＡＡＶ）から同定されるＶＰ１；ＶＰ１およびＶＰ３の血清型とは異なる血清型からのものであり、第２の血清型からのものである、血清型Ｘとして同定されるＶＰ２；ならびにＶＰ１の血清型およびＶＰ２の血清型とは異なる血清型であり、第３の血清型からのものである、血清型Ｚとして同定されるＶＰ３の血清型。第１の血清型のＶＰ１、第２の血清型のＶＰ２、および第３の血清型のＶＰ３を作出するための方法を、本明細書で示す実施例において開示する。

表7: AAV8からの少なくとも1つのVPタンパク質を含み、VP1、VP2またはVP3が、各々、異なる血清型からのものであり、血清型Zが、BBBを横断するおよび/または非ヒト霊長類AAV血清型であり、AAV8ではない、任意のAAV血清型であり、血清型Xが、BBBを横断するおよび/または非ヒト霊長類AAV血清型である、任意のAAV血清型であり得るか、またはAAV8でも血清型Yでもない任意の血清型またはキメラもしくは天然に存在しない血清型であり得る、例示的なAAV8ハプロイドベクター。

ある実施形態では、ＶＰ１が、ＡＡＶ８であり、ＶＰ２およびＶＰ３が、第２の血清型Ｚとして同定された場合、一実施形態では、これは、ＶＰ１がＡＡＶ８のみからのものであること、ならびにＶＰ２およびＶＰ３が、血清型Ｚのみからのものであり、血清型Ｚが、ＢＢＢを横断する任意の血清型からのものであることを意味することになると解される。別の実施形態では、ＶＰ１がＡＡＶ８として同定され、ＶＰ２が第２の血清型Ｘとして同定され、ＶＰ３が第３の血清型Ｚとして同定された場合、一実施形態では、これは、ＶＰ１がＡＡＶ８のみからのものであること、ＶＰ２が血清型Ｘのみからのものであること、およびＶＰ３が血清型Ｚのみからのものであることを意味することになると解される。より詳細に下の実施例で説明するように、一実施形態では、２つの異なる血清型を使用してハプロイドベクターを作出するために、ＡＡＶ８からのＶＰ１のみを発現するＡＡＶ８（またはキメラもしくは天然に存在しないＡＡＶ）からのＶＰ１のヌクレオチド配列と、第２の血清型のみからのＶＰ２および／もしくはＶＰ３のヌクレオチド配列、または代替的に、第２の血清型のみからのＶＰ２のヌクレオチド配列および第３の血清型のみからのＶＰ３の第２のヌクレオチド配列とを、含めることができよう。一実施形態では、ＶＰ１／ＶＰ２は、ＡＡＶ８血清型のみからのものであり、ＶＰ３は、第２の血清型、例えば、ＢＢＢを横断するおよび／または非ヒト霊長類ＡＡＶ血清型であり、ＡＡＶ８ではない血清型、のみからのものである。

３つの異なるＣａｐ遺伝子のケースでは、３つのＡＡＶ血清型からの特定のＶＰタンパク質のヌクレオチド配列の完全コピーを用いて、ヘルパープラスミドを生成することができる。個々のＣａｐ遺伝子は、その特定のＡＡＶ血清型（ＡＡＶ８、ＸおよびＺと名付けた）に関連するＶＰタンパク質を生成することになる。これらのヌクレオチド配列を、非機能的または不活性化開始部位で、本明細書における実施例３～４において本明細書で開示するように、好ましいＶＰタンパク質のみの発現を可能にするように改変することができる。

表8: VPタンパク質のヌクレオチド配列を有する単一の構築物。

ある実施形態では、ＶＰ１がＡＡＶ８として同定され、ＶＰ２が第２の血清型Ｘとして同定され、ＶＰ３が第３の血清型Ｚとして同定された場合、一実施形態では、これは、ＶＰ１がＡＡＶ８のみからのものであること、ＶＰ２が血清型Ｘのみからのものであること、およびＶＰ３が血清型Ｚのみからのものであることを意味することになると解される。より詳細に下の実施例で説明するように、そのようなハプロイドベクターを作出することは、ＡＡＶ８からのＶＰ１のみを発現し、ＡＡＶ８からのＶＰ２もＶＰ３も発現しない、ＡＡＶ８からのＶＰ１のヌクレオチド配列と、血清型ＸのＶＰ２を発現し、血清型ＸのＶＰ３を発現しない、第２のヌクレオチド配列と、血清型ＺのＶＰ３を発現する第３のヌクレオチド配列とを含むことになる。

ある特定の実施形態では、ハプロイドビリオンは、ＶＰ１およびＶＰ３カプシドタンパク質のみを含む。一部の実施形態では、ハプロイドは、ＡＡＶ８からのＶＰ１と、ＢＢＢを横断するおよび／または非ヒト霊長類ＡＡＶ血清型であるおよびＡＡＶ８ではない、任意の血清型からのＶＰ３とを含む。ある特定の実施形態では、ハプロイドビリオンは、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３カプシドタンパク質を含む。一部の実施形態では、ハプロイドは、ＡＡＶ８からのＶＰ１と、ＢＢＢを横断するおよび／またはＡＡＶ８ではない非ヒト霊長類ＡＡＶ血清型である、任意の血清型からのＶＰ２および／またはＶＰ３とを含む。

ハプロイドＡＡＶ８ビリオンを形成するためのＶＰ１とＶＰ３の様々な組合せについての、またはハプロイドＡＡＶ８ビリオンを形成するためのＶＰ１／ＶＰ２／ＶＰ３の様々な血清型の組合せについての、これらの実施形態の各々において、カプシドタンパク質を発現するヌクレオチド配列が１つまたは複数のベクター、例えばプラスミド、から発現され得ることに、留意されたい。一実施形態では、ＶＰ１またはＶＰ２またはＶＰ３を発現する核酸配列をコドン最適化し、その結果、ヌクレオチド配列間の組換えが、特に１つのベクター、例えばプラスミドなど、からの発現時に、有意に低減される。
（実施例２）

合理的ポリプロイド、例えば、ＡＡＶ８からのＶＰ１／ＶＰ２とＢＢＢを横断する血清型および／または非ヒト霊長類ＡＡＶ血清型からのＶＰ３とを有する合理的ポリプロイドベクターは、ＡＡＶ形質増入を増強する。

実施例２は、任意の順序での、それぞれ、ＡＡＶ８、およびＢＢＢを横断する任意の血清型、例えばアカゲザルＡＡＶ（ＡＡＶｒｈ）血清型、からのＶＰ１およびＶＰ３カプシドタンパク質、ならびに必要に応じて、ＡＡＶ８からのＶＰ２カプシドタンパク質、またはアカゲザルＡＡＶ（ＡＡＶｒｈ）血清型を含むがこれに限定されない、ＢＢＢを横断する任意の血清型からのＶＰ２カプシドタンパク質の、例示的な組合せを開示する、説明に役立つ例である。ＡＡＶｒｈ１０およびＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質が、ＢＢＢを横断する（およびＡＡＶｒｈ血清型でもある）例示的な血清型として示されるが、これらを、ＢＢＢを横断する任意の他の血清型（これらに限定されないが、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ｒＡＡＶｒｈ１０、ｒＡＡＶｒｈ７４、ｒＡＡＶｒｈ３９、ｒＡＡＶｒｈ４３または他のＡＡＶｒｈ血清型を含む）からのＶＰ３タンパク質で容易に置き換えることまたは置換することができる。同様に、ＡＡＶ８は、ＶＰ１および／またはＶＰ２タンパク質についての例示的血清型として示すものであり、当業者は、ＡＡＶ８からのＶＰ１および／またはＶＰ２タンパク質で、本明細書において表１で開示する任意の他の血清型を容易に置き換えることまたは置換することができる。

個々の合理的ポリプロイド、例えばハプロイドＡＡＶ８ベクター中のどのＡＡＶサブユニットが、ＡＡＶ８より高度な形質導入の一因となるのかを明らかにするために、異なる構築物を次のように作製した：ＡＡＶ８ＶＰ１／ＶＰ２のみを発現するＡＡＶ８－８－ｒｈ１０およびＡＡＶ８－８－ｒｈ７４、ならびにＡＡＶｒｈ１０またはＡＡＶｒｈ７４のみからのＶＰ３。これらのプラスミドを使用してハプロイドＡＡＶ８ベクターを産生した。例示的な構築物を図１および図２８に示す。

尾静脈注射による静脈内投与によるマウス１匹当たり５×１０^１０ｖｇのこれらのハプロイドＡＡＶ８ベクターの注射後、生体内分布を、毎週、ＩＶＩＳイメージングにより評価した。ハプロイドＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ベクターは、ＡＡＶ８またはＡＡＶｒｈ１０より高度な全身性形質導入を誘導し（図２１Ａ～２１Ｄを参照されたい）、したがって、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ１０と比較してＢＢＢを横断する予想外の能力を示した。
（実施例３）

ＡＡＶ８および第２の血清型（例えば、ＡＡＶｒｈ１０またはＡＡＶｒｈ７４）からのＡＡＶ８－８－Ｚ合理的ポリプロイドカプシドの作出およびスタートコドンの変異

実施例３は、任意の順序での、それぞれ、ＡＡＶ８、およびＢＢＢを横断する任意の血清型、例えばアカゲザルＡＡＶ（ＡＡＶｒｈ）血清型、からのＶＰ１およびＶＰ３カプシドタンパク質、ならびに必要に応じて、ＡＡＶ８からのＶＰ２カプシドタンパク質、またはアカゲザルＡＡＶ（ＡＡＶｒｈ）血清型を含むがこれに限定されない、ＢＢＢを横断する任意の血清型からのＶＰ２カプシドタンパク質の、例示的な組合せを開示する、説明に役立つ例である。ＡＡＶｒｈ１０およびＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質を、ＢＢＢを横断する（およびＡＡＶｒｈ血清型でもある）例示的な血清型として示すが、これらを、ＢＢＢを横断する任意の他の血清型（これらに限定されないが、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ｒＡＡＶｒｈ１０、ｒＡＡＶｒｈ７４、ｒＡＡＶｒｈ３９、ｒＡＡＶｒｈ４３または他のＡＡＶｒｈ血清型を含む）からのＶＰ３タンパク質で容易に置き換えることまたは置換することができる。同様に、ＡＡＶ８は、ＶＰ１および／またはＶＰ２タンパク質についての例示的血清型として示すものであり、当業者は、ＡＡＶ８からのＶＰ１および／またはＶＰ２タンパク質で、本明細書において表１で開示する任意の他の血清型を容易に置き換えることまたは置換することができる。

この例では、合理的ポリプロイドＡＡＶ８ビリオン、例えば、ハプロイドＡＡＶ８ビリオンを、図１および図２８に示されているように２つの異なる血清型のカプシドから組み立てた。この例は、例示的なＡＡＶ８－８－ｒｈ１０またはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドビリオンの産生を論じる。しかし、当業者は、ＢＢＢを横断するおよび／または非ヒト霊長類ＡＡＶ血清型である、任意のＡＡＶ血清型からのＶＰ３を、容易に使用することができるであろう。加えて、ＡＡＶ８ＶＰ２タンパク質を、ＶＰ３カプシドタンパク質に使用したものと同じ血清型であることもありまたは異なる血清型であることもある、ＢＢＢを横断するおよび／または非ヒト霊長類ＡＡＶ血清型である、任意のＡＡＶ血清型の代わりに容易に用いることができよう。

この実験は、ヘルパープラスミドが２つの異なる血清型からのＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３カプシドタンパク質を含むように、ＡＡＶ８血清型のみからのＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３のヌクレオチド配列をヘルパープラスミドにライゲーションし、第２のＡＡＶ血清型（例えば、ＢＢＢを横断する、および／または非ヒト霊長類ＡＡＶ血清型からのものである、ＡＡＶ血清型）のみからのＶＰ３を、同じまたは異なるヘルパープラスミドにライゲーションする。ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３カプシドタンパク質をコードする第１および第２の血清型ヌクレオチド配列のヘルパープラスミドへのライゲーション前またはライゲーション後のどちらかに、カプシドヌクレオチド配列を、ＡＡＶ８血清型のみからのＶＰ１およびＶＰ２と第２の血清型のみからのＶＰ３とを備えるように変更する。この例では、ＡＡＶ８のＶＰ３の２つのＡＣＧ開始部位を、これらのスタートコドンがＡＡＶ８血清型からのＶＰ３カプシドタンパク質のヌクレオチド配列から転写されたＲＮＡの翻訳を開始することができないように、変異させる。具体的には、ＡＡＶ８ヌクレオチド配列について、２つのＡＴＧ開始コドンを、アミノ酸置換Ｍ２０３ＶおよびＭ２１１Ｖに至るようにＧＴＧに変化させ、それによってＶＰ３ＡＡＶ８カプシドタンパク質の翻訳および発現を防止する。同様に、一部の実施形態では、ヘルパープラスミドは、他の血清型（例えば、ＡＡＶｒｈ１０またはＡＡＶｒｈ７４）のＶＰ３遺伝子のみを含む。代替実施形態では、第２の血清型（例えば、ＡＡＶｒｈ１０またはＡＡＶｒｈ７４）のカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列において、ＶＰ１およびＶＰ２のＡＴＧ開始部位を、これらのコドンが、ＶＰ１およびＶＰ２をコードするＲＮＡの翻訳を開始することができるが、両方のＶＰ３について翻訳を開始することができないように、変異させることができる。したがって、この例では、ＡＡＶ８血清型のみからの、ＶＰ３ではない、ＶＰ１およびＶＰ２と、第２の血清型（例えば、ＡＡＶｒｈ１０またはＡＡＶｒｈ７４）のみからの、ＶＰ１およびＶＰ２ではない、ＶＰ３とを含む、ハプロイドＡＡＶ８ビリオンを作出する。

スタートコドンの変異によってハプロイドＡＡＶ８ビリオンを作出するこの合理的方法論の技法の応用する中で、ＶＰ１およびＶＰ２が、図１および図６に示されているプラスミドから転写されたＲＮＡから翻訳されるように、ＡＡＶ８のＶＰ３のスタートコドンを、図５に強調して示されているように変異させた。結果として、スタートコドンの変異は、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３のうちの１つまたは複数の発現をノックダウンする方法を提供する。したがって、この例では、ＡＡＶ８血清型のみからの、ＶＰ３ではない、ＶＰ１およびＶＰ２と、第２のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶｒｈ１０またはＡＡＶｒｈ７４）のみからの、ＶＰ１でもＶＰ２でもない、ＶＰ３とを含む、ハプロイドＡＡＶ８ビリオンを作出する。代表的なハプロイドＡＡＶ８ベクターは、例えば、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０およびＡＡＶ８－８－ｒｈ７４であり得る。

２つの異なる血清型（ＡＡＶ８およびＡＡＶｒｈ１０またはＡＡＶｒｈ７４）からのおよびスプライスアクセプター部位の変異によるＡＡＶ８－Ｙ－Ｚハプロイドカプシドの作出

この例では、ポリプロイドＡＡＶビリオンを２つの異なる血清型のカプシドから組み立てる。ヘルパープラスミドが２つの異なる血清型からのＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３カプシドタンパク質を含むように、ＡＡＶ８血清型からのＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３のヌクレオチド配列をヘルパープラスミドのみにライゲーションし、第２のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶｒｈ１０またはＡＡＶｒｈ７４）のみからのＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３を同じまたは異なるヘルパープラスミドにライゲーションする。ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３カプシドタンパク質をコードする第１および第２の血清型ヌクレオチド配列のヘルパープラスミドへのライゲーション前またはライゲーション後のどちらかに、カプシドヌクレオチド配列を、ＡＡＶ８血清型のみからのＶＰ１と第２のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶｒｈ１０またはＡＡＶｒｈ７４）のみからのＶＰ２およびＶＰ３とを備えるように変更する。この例では、第１の血清型のヌクレオチド配列を、図１に示されているようにＡ２スプライスアクセプター部位を変異させることにより変更した。この例では、Ａ２スプライスアクセプター部位を変異させることにより、ＡＡＶ８からのＶＰ２およびＶＰ３カプシドタンパク質は産生されない。同様に、Ａ１スプライスアクセプター部位を変異させることにより、第２のＡＡＶ血清型からのＶＰ１カプシドタンパク質は産生されないが、ＶＰ２およびＶＰ３カプシドタンパク質は産生される。したがって、この例では、ＡＡＶ８血清型のみからの、ＶＰ２でもＶＰ３でもない、ＶＰ１と、第２のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶｒｈ１０またはＡＡＶｒｈ７４）のみからの、ＶＰ１ではない、ＶＰ２およびＶＰ３とを含む、ハプロイドＡＡＶ８ビリオンを作出する。代表的なハプロイドＡＡＶ８ベクターは、例えば、ＡＡＶ８－ｒｈ１０－ｒｈ１０およびＡＡＶ８－ｒｈ７４－ｒｈ７４であり得る。

３つの異なる血清型（ＡＡＶ８；ＸおよびＹにより表される血清型）からのならびにスタートコドンおよびスプライスアクセプター部位の変異によるＡＡＶ８－Ｘ－Ｙポリプロイドカプシドの作出

この例では、ポリプロイドＡＡＶビリオンを３つの異なる血清型のカプシドから組み立てる。ＡＡＶ８血清型のみからのＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３と、第２のＡＡＶ血清型（「Ｘ」ＡＡＶ血清型と呼ばれる）のみからのＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３と、第３のＡＡＶ血清型（「Ｚ」ＡＡＶ血清型と呼ばれる；例えば、本明細書でＡＡＶｒｈ１０またはＡＡＶｒｈ１０により例示される、ＢＢＢを横断する血清型）のみからのＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３とのヌクレオチド配列を、ヘルパープラスミドにライゲーションし、その結果、ヘルパープラスミドが、３つの異なる血清型からのＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３カプシドタンパク質の核酸配列を含むように、ヘルパープラスミドを構築する。３つの異なる血清型の各々からのＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列のヘルパープラスミドへのライゲーション前またはライゲーション後のどちらかに、カプシドヌクレオチド配列を、ＡＡＶ８血清型のみからのＶＰ１、ＸＡＡＶ血清型のみからのＶＰ２、およびＺ血清型のみ（例えば、ＢＢＢ血清型、ＡＡＶｒｈ１０またはＡＡＶｒｈ７４）からのＶＰ３を備えるように変更する。この例では、ＡＡＶ８血清型のＶＰ１ヌクレオチド配列を、ＶＰ２およびＶＰ３カプシドタンパク質のスタートコドンを変異させることにより変更した。この例では、ＶＰ２のＡＣＧスタートコドンおよびＶＰ３の２つのＡＴＧスタートコドンを、これらのコドンが第１の血清型からのＶＰ２およびＶＰ３カプシドタンパク質のヌクレオチド配列から転写されたＲＮＡの翻訳を開始することができないように、変異させる。同様に、第２のＸ血清型のＶＰ１およびＶＰ３ヌクレオチド配列を、ＶＰ１およびＶＰ３カプシドタンパク質のスタートコドンを変異させることにより変更した。この例では、ＶＰ１のＡＴＧ開始部位およびＶＰ３の２つまたは３つのＡＴＧスタートコドンを、これらのコドンがＸ血清型ＶＰ１およびＶＰ３カプシドタンパク質のヌクレオチド配列から転写されたＲＮＡの翻訳を開始することができないように、変異させる。さらに、第３のＺ血清型（例えば、ＡＡＶｒｈ１０またはＡＡＶｒｈ７４）のＶＰ１およびＶＰ２ヌクレオチド配列を、ＶＰ１およびＶＰ２カプシドタンパク質のスタートコドンを変異させることにより変更した。この例では、ＶＰ１のＡＴＧスタートコドンおよびＶＰ２のＡＣＧスタートコドンを、これらのコドンが血清型Ｚ（例えば、ＢＢＢを横断する血清型、例えば、例示的な血清型ＡＡＶｒｈ１０またはＡＡＶｒｈ７４）からのＶＰ１およびＶＰ２カプシドタンパク質のヌクレオチド配列から転写されたＲＮＡの翻訳を開始することができないように、変異させる。あるいは、ヘルパープラスミドは、第３のＺ血清型（例えば、ＡＡＶｒｈ１０またはＡＡＶｒｈ７４）からのＶＰ３をコードする核酸のみを含む。したがって、この例では、ＡＡＶ８血清型のみからの、ＶＰ２でもＶＰ３でもない、ＶＰ１と、第２のＺ血清型のみからの、ＶＰ１でもＶＰ２でもない、ＶＰ２と、第３のＺ血清型のみ（ＡＡＶｒｈ１０またはＡＡＶｒｈ７４）からのＶＰ１でもＶＰ２でもない、ＶＰ３とを含む、ポリプロイドＡＡＶビリオンを作出する。この方法論により産生される代表的なハプロイドＡＡＶ８ベクターは、例えば、Ｘが、任意のＡＡＶ血清型、しかし特に、ＢＢＢを横断するおよび／または非ヒト霊長類ＡＡＶ血清型であるＡＡＶ血清型、からのＶＰ２タンパク質である、ＡＡＶ８－Ｘ－ｒｈ１０およびＡＡＶ８－Ｘ－ｒｈ７４である。

ＡＡＶ８合理的ポリプロイド、例えば、２つのプラスミドを使用する２つの異なる血清型からのＡＡＶ８ハプロイドカプシドの作出

この例では、ＡＡＶ８からのＶＰ１／ＶＰ２とＡＡＶＲｈ１０またはＡＡＶｒｈ７４からのＶＰ３とを含むハプロイドＡＡＶ８ビリオンを、２つのプラスミドを使用して作出する。Ａｄ初期遺伝子およびＲｅｐ（例えば、ＡＡＶ２からの）とともにプラスミド骨格を含むヘルパープラスミドを作出する。このヘルパープラスミドには、ＡＡＶ８のみからのカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列、およびＡＡＶｒｈ１０またはＡＡＶｒｈ７４のみからのカプシドタンパク質をコードする別のヌクレオチド配列がライゲーションされている。ＡＡＶ８のカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列に関して、このヌクレオチド配列は、ＶＰ３の翻訳を防止するように変異されたＶＰ３のスタートコドン、および／またはスプライシングを防止するように変異されているＡ２スプライスアクセプター部位、いずれかを有している。ＡＡＶｒｈ１０またはＡＡＶｒｈ７４のカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列に関して、このヌクレオチド配列は、翻訳を防止するように変異されたＶＰ１およびＶＰ２のスタートコドン、および／またはスプライシングを防止するように変異されているＡ１スプライスアクセプター部位、いずれかを有しており、またはＶＰ３カプシドタンパク質をコードする核酸配列の一部分のみを含む。２つのＩＴＲを有する導入遺伝子をコードするプラスミドとともにヘルパープラスミドを、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ１３２７４を有するＨＥＫ２９３細胞系にトランスフェクトする（米国特許第９，４４１，２０６号を参照されたい）。ウイルスは上清から精製し、特徴付ける。

３つのプラスミドを使用する２つの異なる血清型からのハプロイドカプシドの作出

この例では、ＡＡＶ８からのＶＰ１／ＶＰ２とＡＡＶｒｈ１０またはＡＡＶｔｈ７４からのＶＰ３とを含むハプロイドＡＡＶ８ビリオンを、３つのプラスミドを使用して作出する。Ａｄ初期遺伝子を含む第１のプラスミドを作出する。Ｒｅｐ（例えば、ＡＡＶ２）とともにプラスミド骨格を含む第２のヘルパープラスミドを作出する。この第２のヘルパープラスミドには、ＡＡＶ８のみからのカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列、およびＡＡＶｒｈ１０またはＡＡＶｒｈ７４のみからのカプシドタンパク質をコードする別のヌクレオチド配列がライゲーションされている。ＡＡＶ８のカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列に関して、このヌクレオチド配列は、翻訳を防止するように変異されたＶＰ３のスタートコドン、および／またはスプライシングを防止するように変異されているＡ２スプライスアクセプター部位、いずれかを有している。ＡＡＶｒｈ１０またはＡＡＶｒｈ７４のカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列に関して、このヌクレオチド配列は、翻訳を防止するように変異されたＶＰ１およびＶＰ２のスタートコドン、および／もしくはスプライシングを防止するように変異されているＡ１スプライスアクセプター部位、いずれかを有しており、またはヌクレオチド配列は、ＡＡＶｒｈ１０もしくはＡＡＶｒｈ７４のＶＰ３カプシドタンパク質だけをコードする。２つのＩＴＲを有する導入遺伝子をコードするプラスミドとともにヘルパープラスミドを、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ１３２７４を有するＨＥＫ２９３細胞系にトランスフェクトする（米国特許第９，４４１，２０６号を参照されたい）。

ＡＡＶ８ハプロイド、例えば、本明細書で例示的なハプロイドＡＡＶ８－８－ｒｈ１０またはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４が論じられる、本明細書で開示のＡＡＶ－８－Ｘ－ＹまたはＡＡＶ８－Ｙ－Ｙ、を生成するための他の方法であって、ＶＰ１、ＶＰ２もしくはＶＰ３のうちのいずれか１つもしくは複数のＡＴＧスタートコドンの変異誘発を伴う１、２、３もしくは４つのプラスミドを使用する、またはＤＮＡシャフリングを使用する方法を、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第１０，５５０，４０５号において開示されているように使用することができる。
（実施例４）

ＡＡＶ８－８－Ｒｈ１０およびＡＡＶ８－８－ｒｈ７４合理的ポリプロイドの産生、精製および解析

実施例４は、それぞれ、ＡＡＶ８、およびＢＢＢを横断する任意の血清型、例えばアカゲザルＡＡＶ（ＡＡＶｒｈ）血清型、からのＶＰ１およびＶＰ３カプシドタンパク質、ならびに必要に応じて、ＡＡＶ８からのＶＰ２カプシドタンパク質、またはアカゲザルＡＡＶ（ＡＡＶｒｈ）血清型を含むがこれに限定されない、ＢＢＢを横断する任意の血清型からのＶＰ２カプシドタンパク質の、例示的な組合せを開示する、説明に役立つ例である。ＡＡＶｒｈ１０およびＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質を、ＢＢＢを横断する（およびＡＡＶｒｈ血清型でもある）例示的な血清型として示すが、これらを、ＢＢＢを横断する任意の他の血清型（これらに限定されないが、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ｒＡＡＶｒｈ１０、ｒＡＡＶｒｈ７４、ｒＡＡＶｒｈ３９、ｒＡＡＶｒｈ４３または他のＡＡＶｒｈ血清型を含む）からのＶＰ３タンパク質で容易に置き換えることまたは置換することができる。同様に、ＡＡＶ８をＶＰ１および／またはＶＰ２タンパク質についての例示的血清型として示すが、当業者は、ＡＡＶ８からのＶＰ１および／またはＶＰ２タンパク質で、本明細書において表１で開示する任意の他の血清型を容易に置き換えることまたは置換することができる。

本発明者らは、ＡＡＶ８およびＡＡＶｒｈ１０ビリオンの収率および生産と比較して、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０またはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドの収率を、そのバリアント、例えば、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ｖｖ、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０ＬＰ２、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ＬＰ２、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ｖｖＬＰ２の収率も含めて、評価した。図６は、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０またはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドからの、ウェスタンブロットにより検出されたＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３タンパク質の発現を示す。産生は、ｑＰＣＲおよびＥＬＩＳＡにより判定して細胞の比生産性により評価し、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０生産性がＡＡＶ８およびＡＡＶｒｈ１０対照に匹敵するが、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４が、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０および対照と比較して低い生産性レベルであることを実証した。統計学的に有意でない平均値の比較（図８を参照されたい）。親和性クロマトグラフィーおよびアニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）結果も示した（図９Ａ～９Ｂを参照されたい）。

ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０の産生および精製は、ＡＡＶ８およびＡＡＶｒｈ１０対照と同様であり、匹敵する回収率プロファイルであった（図１０Ｃ）。ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４産生および精製は、上流の産生ではＡＡＶ８およびＡＡＶｒｈ１０対照と比較してわずかに低く、下流の単位操作では回収率不良であった（図１０Ｄを参照されたい）。ＡＡＶ８およびＡＡＶｒｈ１０対照は、予想通りに機能した（図１０Ａ～１０Ｂ）。ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ＬＰ２は、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０ＬＰ２（６．１１Ｅ＋１２ｖｇ／ｍｌ）より有意に低い生産収率または産生力価（５．０２Ｅ＋０９ｖｇ／ｍｌ）を有した。

ＣＥ－ＳＤＳ法からの結果を、ＡＡＶ８最終ベクター材料を使用して展開した（図１１Ｂを参照されたい）。６：２：１の比は、何百もの調製／解析を通じてベクターと非常に一致していた。しかし、これらの比は、他の血清型についてはわずかに変化した（ＡＡＶ９は、９：１：１により近い）（図１２Ｂを参照されたい）。これらの比を合否基準として使用するが、これらの比は、ＡＡＶ８ハプロイド血清型に限定される。興味深いことに、本発明者らは、これらのＡＡＶ８－８－ｒｈ７４およびＡＡＶ８－８－ｒｈ１０試料におけるＶＰ３タンパク質が小さい前方ピーク（ＶＰ３ｂとしてコールアウトされる）と重なるように移動しているが、ＶＰ２およびＶＰ１がＡＡＶ８標準と完璧にアラインすることを発見した（図１２Ａを参照されたい）。
（実施例５）

ｒｈ７４ＶＰ３最適化－ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ｖｖの産生

実施例５は、任意の順序での、それぞれ、ＡＡＶ８、およびＢＢＢを横断する任意の血清型、例えばアカゲザルＡＡＶ（ＡＡＶｒｈ）血清型、からのＶＰ１およびＶＰ３カプシドタンパク質、ならびに必要に応じて、ＡＡＶ８からのＶＰ２カプシドタンパク質、またはアカゲザルＡＡＶ（ＡＡＶｒｈ）血清型を含むがこれに限定されない、ＢＢＢを横断する任意の血清型からのＶＰ２カプシドタンパク質の、例示的な組合せを開示する、説明に役立つ例である。ＡＡＶｒｈ１０およびＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質を、ＢＢＢを横断する（およびＡＡＶｒｈ血清型でもある）例示的な血清型として示すが、これらを、ＢＢＢを横断する任意の他の血清型（これらに限定されないが、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ｒＡＡＶｒｈ１０、ｒＡＡＶｒｈ７４、ｒＡＡＶｒｈ３９、ｒＡＡＶｒｈ４３または他のＡＡＶｒｈ血清型を含む）からのＶＰ３タンパク質で容易に置き換えることまたは置換することができる。同様に、ＡＡＶ８をＶＰ１および／またはＶＰ２タンパク質についての例示的血清型として示すが、当業者は、ＡＡＶ８からのＶＰ１および／またはＶＰ２タンパク質で、本明細書において表１で開示する任意の他の血清型を容易に置き換えることまたは置換することができる。

前の実施例１～４は、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４が、親ＡＡＶ８と比較してまたはＡＡＶ８－８－ｒｈ１０ハプロイドと比較して低い生産収率を有することを実証したので、本発明者らは、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ３カプシドタンパク質の配列とＡＡＶｒｈ１０のＶＰ３カプシドタンパク質の配列を比較した。図２２に示されているように、ＡＡＶｒｈ１０のＶＰ３タンパク質（配列番号１）とＡＡＶｒｈ７４のＶＰ３タンパク質（配列番号３）にはアミノ酸４個の差がある。具体的には、参照配列として配列番号１（ＡＡＶｒｈ１０ＶＰ３）を使用すると、配列番号１（ＡＡＶｒｈ１０－ＶＰ３）を、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ３カプシドタンパク質（すなわち、ＡＡＶｒｈ７４－ＶＰ３）についてのアミノ酸配列である配列番号３に変化させるために、次のアミノ酸変化が存在する：Ｑ４１７Ｎ、ＶＶ５８１Ｗ、Ｓ６６５ＮおよびＤ７２０Ｅ（図２３Ａ～２３Ｃおよび図２８を参照されたい）。

ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドベクターは、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０より有意に低い生産収率を有したので、本発明者らは、各変異を個々に評価した。具体的には、本発明者らは、個々のｒｈ７４からｒｈ１０への（ｒｈ７４＞ｒｈ１０）アミノ酸改変を行い、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ベクターを、配列番号３のＮ４１７Ｑ改変、Ｗ５８１ＶＶ改変、Ｎ６６４ＳまたはＥ７１９Ｄ改変（ＡＡＶｒｈ７４からのＶＰ１カプシドタンパク質のアミノ酸配列からの命名法／番号付けを使用する）から選択される１つの改変を含むように変化させ、未改変ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０およびＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドカプシドに対する生産倍率を比較した（図２９Ａを参照されたい）。図２９Ａに示されているように、ＶＰ３ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質のアミノ酸を、－Ｗ５８１ＶＶ変異を有するように変化させることによって、生産収率が、未改変ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０収率のものと同様に、有意に４倍上昇した。つまり、配列番号３の５８１位におけるＷのＶＶへの置換は生産収率を有意に上昇させるが、他の変異にはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドカプシドの生産収率の上昇に対する有意な効果がなかった。このことを確認するために、本発明者らは、ＶＰ３ＡＡＶｒｈ７４のアミノ酸の相違をＡＡＶｒｈ１０のＶＰ３カプシド（配列番号１）に導入する－具体的には、Ｑ４１７Ｎ、Ｖ５８１ｄｅｌ、Ｖ５８２Ｗ、Ｓ６６５ＮおよびＤ７２０Ｅ置換をＡＡＶｒｈ１０のＶＰ３カプシドタンパク質（配列番号１）に導入する、ＡＡＶｒｈ１０のＶＰ３カプシドタンパク質（配列番号１）における対応するアミノ酸置換（すなわち、ＶＰ３ｒｈ１０＞ＶＰ３ｒｈ７４のための個々の改変）を行った。図２９Ｂに示されているように、Ｖ５８１ｄｅｌおよびＶ５８２Ｗ改変のみが、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０ベクターの生産収率を有意に低下させた。このことを、ＤＮａｓｅおよびプロテイナーゼＫ処理後のｑＰＣＲ解析によって確認する（図２９Ｃを参照されたい）。一部の代替実施形態では、本明細書で開示の合理的ポリプロイド集団は、変異ＡＡＶｒｈ１０ＶＰ３タンパク質を含み、この変異ＡＡＶｒｈ１０ＶＰ３は、ＶＰ３変異を含み、このＶＰ３変異は、Ｑ２１４Ｎ、Ｓ４６２Ｎ、Ｄ５１７Ｅ、Ｖ３７８ｄｅｌ、Ｖ３７９Ｗ（番号付けは、ＡＡＶｒｈ１０ＶＰ３番号付けに基づく）からなる群から選択される。さらに別の代替実施形態では、合理的ポリプロイド集団は、変異ＡＡＶｒｈ１０ＶＰ３タンパク質を含み、この変異ＡＡＶｒｈ１０ＶＰ３は、ＶＰ３変異を含み、このＶＰ３変異は、Ｑ２１４Ｎ、Ｓ４６２Ｎ、Ｄ５１７Ｅ、Ｖ３７８ｄｅｌ、Ｖ３７９Ｗ（番号付けは、ＡＡＶｒｈ１０ＶＰ３番号付けに基づく）の全てから本質的になっている。一部の実施形態では、合理的ポリプロイド集団は、変異ＡＡＶｒｈ１０ＶＰ３タンパク質を含み、この変異ＡＡＶｒｈ１０ＶＰ３は、ＶＰ３変異を含み、このＶＰ３変異は、Ｑ４１７Ｎ、Ｓ６６５Ｎ、Ｄ７２０Ｅ、Ｖ５８１ｄｅｌ、Ｖ５８２Ｗ（番号付けは、ＡＡＶｒｈ１０ＶＰ１番号付けに基づく）からなる群から選択される。一部の実施形態では、合理的ポリプロイド集団は、変異ＡＡＶｒｈ１０ＶＰ３タンパク質を含み、この変異ＡＡＶｒｈ１０ＶＰ３は、ＶＰ３変異を含み、このＶＰ３変異は、Ｑ４１７Ｎ、Ｓ６６５Ｎ、Ｄ７２０Ｅ、Ｖ５８１ｄｅｌ、Ｖ５８２Ｗ（番号付けは、ＡＡＶｒｈ１０ＶＰ１番号付けに基づく）の全てから本質的になっている。

あるいは、本発明者らは、個々のｒｈ７４からｒｈ１０への（ｒｈ７４＞ｒｈ１０）アミノ酸改変を行い、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ベクターを、配列番号３のＮ２１４Ｑ改変、３７８－Ｗ３７９Ｖ（もしくは３７８ｄｅｌ－Ｗ３７９ＶＶ）改変、Ｎ４６１ＳまたはＥ５１６Ｄ改変から選択される１つの改変を（特定のアミノ酸を、ＶＰ３ＡＡＶｒｈ１０カプシドタンパク質と同様のものに変化させるために）含むように変化させ、未改変ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０およびＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドカプシドに対する生産倍率を比較した（図２９Ａを参照されたい）。つまり、配列番号３の３７８位におけるＷのＶＶへの置換は生産収率を有意に上昇させるが、他の変異にはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドカプシドの生産収率の上昇に対する有意な効果がなかった。このことを確認するために、本発明者らは、ＶＰ３ＡＡＶｒｈ７４のアミノ酸の相違をＡＡＶｒｈ１０のＶＰ３カプシドタンパク質（配列番号１）に導入する－具体的には、Ｑ２１４Ｎ、Ｖ３７８ｄｅｌ、Ｖ３７９Ｗ、Ｓ４６２ＮおよびＤ５１７Ｅ置換をＡＡＶｒｈ１０のＶＰ３カプシドタンパク質（配列番号１）に導入する、ＡＡＶｒｈ１０のＶＰ３カプシドタンパク質（配列番号１）における対応するアミノ酸置換（すなわち、ＶＰ３ｒｈ１０＞ＶＰ３ｒｈ７４のための個々の改変）を行った。ここでの番号付けは、ＡＡＶｒｈ１０ＶＰ３番号付けに基づく。Ｖ３７８ｄｅｌおよびＶ３７９Ｗ改変のみが、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０ベクターの生産収率を有意に低下させた。このことを、ＤＮａｓｅおよびプロテイナーゼＫ処理後にｑＰＣＲ解析により確認する（図２９Ｃを参照されたい）。一部の代替実施形態では、本明細書で開示の合理的ポリプロイド集団は、変異ＡＡＶｒｈ７４ＶＰ３タンパク質を含み、この変異ＡＡＶｒｈ７４ＶＰ３は、ＶＰ３変異を含み、このＶＰ３変異は、Ｎ２１４Ｑ、Ｎ４６１Ｓ、Ｅ５１６Ｄ、Ｗ３７８ＶＶ（番号付けは、ＡＡＶｒｈ７４ＶＰ３番号付けに基づく）からなる群から選択される。さらに別の代替実施形態では、合理的ポリプロイド集団は、変異ＡＡＶｒｈ７４ＶＰ３タンパク質を含み、この変異ＡＡＶｒｈ７４ＶＰ３は、ＶＰ３変異を含み、このＶＰ３変異は、Ｎ２１４Ｑ、Ｎ４６１Ｓ、Ｅ５１６Ｄ、Ｗ３７８ＶＶ（番号付けは、ＡＡＶｒｈ７４ＶＰ３番号付けに基づく）の全てから本質的になっている。一部の実施形態では、合理的ポリプロイド集団は、変異ＡＡＶｒｈ７４ＶＰ３タンパク質を含み、この変異ＡＡＶｒｈ７４ＶＰ３は、ＶＰ３変異を含み、このＶＰ３変異は、Ｎ４１７Ｑ、Ｎ６６４Ｓ、Ｅ７１９Ｄ、Ｗ５８１ＶＶ（番号付けは、ＡＡＶｒｈ７４ＶＰ１番号付けに基づく）からなる群から選択される。一部の実施形態では、合理的ポリプロイド集団は、変異ＡＡＶｒｈ７４ＶＰ３タンパク質を含み、この変異ＡＡＶｒｈ７４ＶＰ３は、ＶＰ３変異を含み、このＶＰ３変異は、Ｎ４１７Ｑ、Ｎ６６４Ｓ、Ｅ７１９Ｄ、Ｗ５８１ＶＶ（番号付けは、ＡＡＶｒｈ７４ＶＰ１番号付けに基づく）の全てから本質的になっている。それに基づいて、本発明者らは、配列番号３（ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ３カプシドタンパク質）のアミノ酸５８１位におけるアミノ酸ＷのＶＶへの単純な改変が、生産収率を有意に上昇させ、さらに、増大した全身バイオアベイラビリティ、ならびに低減された液性応答および／もしくは抗原性、ならびに／またはｉｎｖｉｖｏでＡＡＶ８中和抗体から逃れる能力を維持することを発見した。したがって、一部の実施形態では、ＡＡＶ８ハプロイドは、ＶＰ３タンパク質が、配列番号２に対応するＶＰ３－ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質（Ｗ５８１がＶＶに置き換えられている）を含む、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ｖｖハプロイドである。一部の実施形態では、ＡＡＶ８ハプロイドは、ＶＰ３タンパク質が、配列番号２に対応するＶＰ３－ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質（ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ３が、Ｗ５８１がＶＶに置き換えられている変異、および次の変異の全てを含む：Ｎ２６３Ｓ、Ｇ２６４Ａ、Ｔ２６５Ｓ、Ｓ２６６Ｔ、Ｇ２６８Ａ、Ｔ２７０ｄｅｌ、Ｔ２７４Ｈ、Ｅ５３３Ｋ、Ｒ７２６Ｈ、Ｎ７３６Ｐ（番号付けは、ＡＡＶｒｈ７４ＶＰ１番号付けに基づく））を含むＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ｖｖＬＰ２ハプロイドである。一部の実施形態では、ＡＡＶ８ハプロイドは、ＶＰ３タンパク質が、配列番号５に対応するＶＰ３－ＡＡＶｒｈ１０カプシドタンパク質（ｒｈ１０のＶＰ３が、変異Ｎ２６３Ｓ、Ｇ２６４Ａ、Ｔ２６５Ｓ、Ｓ２６６Ｔ、Ｇ２６８Ａ、Ｔ２７０ｄｅｌ、Ｔ２７４Ｈ、Ｅ５３３Ｋ、Ｒ７２７Ｈ、Ｎ７３７Ｐを含み、番号付けがＡＡＶｒｈ１０ＶＰ１番号付けに基づく）を含む、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０ＬＰ２ハプロイドである。ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ｖｖＬＰ２の生産収率は、表９に示すように、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ＬＰ２より改善され、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０ＬＰ２またはＡＡＶ８－８－ｒｈ１０のものに匹敵する。

表9: AAV 8-8-rh10LP2およびAAV 8-8-rh74LP2およびAAV 8-8-rh74vv合理的ポリプロイドベクターの生産収率。

したがって、一部の実施形態では、本明細書で開示されるＡＡＶハプロイドは、少なくとも１つまたは複数のアミノ酸改変を含む改変ＶＰ３タンパク質であるｒｈ７４ＶＰ３カプシドタンパク質を含み、例えば、ＡＡＶｒｈ７４ＶＰ３カプシドタンパク質は、配列番号３のアミノ酸５８１位におけるトリプトファン（ＷまたはＴｒｐ）で２個のバリン（Ｖまたはｖａｌ）アミノ酸が置換されている、Ｗ５８１ＶＶ改変を含む改変ＶＰ３タンパク質である。したがって、一部の実施形態では、ＡＡＶハプロイドベクターは、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２に対して少なくとも８５％、もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％、もしくは少なくとも９８％の配列同一性のアミノ酸配列を有する、ＶＰ３カプシドタンパク質を含むＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ｖｖハプロイドベクターであって、配列番号２が、Ｗ５８１ＶＶ改変を含むｒｈ７４ｖｖ－ＶＰ３カプシドタンパク質のアミノ酸である、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ｖｖハプロイドベクターである。

ｒｈ７４ｖｖ－ＶＰ３カプシドタンパク質のアミノ酸を含む配列番号２は、配列番号４の核酸配列によりコードされる。
（実施例６）
ｉｎｖｉｔｒｏでのＡＡＶ８ハプロイドウイルスの特徴付け。

実施例６は、任意の順序での、それぞれ、ＡＡＶ８、およびＢＢＢを横断する任意の血清型、例えばアカゲザルＡＡＶ（ＡＡＶｒｈ）血清型、からのＶＰ１およびＶＰ３カプシドタンパク質、ならびに必要に応じて、ＡＡＶ８からのＶＰ２カプシドタンパク質、またはアカゲザルＡＡＶ（ＡＡＶｒｈ）血清型を含むがこれに限定されない、ＢＢＢを横断する任意の血清型からのＶＰ２カプシドタンパク質の、例示的な組合せを開示する、説明に役立つ例である。ＡＡＶｒｈ１０およびＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質を、ＢＢＢを横断する（およびＡＡＶｒｈ血清型でもある）例示的な血清型として示すが、これらを、ＢＢＢを横断する任意の他の血清型（これらに限定されないが、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ｒＡＡＶｒｈ１０、ｒＡＡＶｒｈ７４、ｒＡＡＶｒｈ３９、ｒＡＡＶｒｈ４３または他のＡＡＶｒｈ血清型を含む）からのＶＰ３タンパク質で容易に置き換えることまたは置換することができる。同様に、ＡＡＶ８をＶＰ１および／またはＶＰ２タンパク質についての例示的血清型として示すが、当業者は、ＡＡＶ８からのＶＰ１および／またはＶＰ２タンパク質で、本明細書において表１で開示する任意の他の血清型を容易に置き換えることまたは置換することができる。

ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０またはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドの形質導入効率をＰｒｏ１０細胞で評価し、それによって、Ｐｒｏ１０細胞に形質導入するハプロイドベクターの能力に差があることが明らかになった：ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドは、ＡＡＶ８対照と同様にＰｒｏ１０細胞に形質導入したが、ＡＡＶｒｈ１０およびＡＡＶ８－８－Ｒｈ１０ベクターは、この細胞系においてＡＡＶ８より効率が低く、ＡＡＶ８－８－Ｒｈ１０ハプロイドは、ＡＡＶ８およびＡＡＶＲｈ１０のどちらよりも有意に効率が低かった（図１３Ｂを参照されたい）。加えて、ＧＭ１６０９５細胞に形質導入するＡＡＶ８－８－ｒｈ１０またはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドの効率（図１７Ｂ）を評価し、この効率によって、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドが、ＡＡＶ８またはＡＡＶｒｈ１０対照よりも有意に効率よくＧＭ１６０９５細胞に形質導入するが、ＡＡＶｒｈ１０は、このＧＭ１６０９５細胞系においてＡＡＶ８より効率が高く、ＡＡＶ８－８－Ｒｈ１０ハプロイドは、ＡＡＶ８およびＡＡＶＲｈ１０のどちらよりも有意に効率が低いことが実証された。
（実施例７）

ｉｎｖｉｖｏでのＡＡＶ８ハプロイドウイルスの特徴付けは、ＡＡＶ８ハプロイドウイルスによるＣＮＳ形質導入の増加を示す。

実施例７は、任意の順序での、それぞれ、ＡＡＶ８、およびＢＢＢを横断する任意の血清型、例えばアカゲザルＡＡＶ（ＡＡＶｒｈ）血清型、からのＶＰ１およびＶＰ３カプシドタンパク質、ならびに必要に応じて、ＡＡＶ８からのＶＰ２カプシドタンパク質、またはアカゲザルＡＡＶ（ＡＡＶｒｈ）血清型を含むがこれに限定されない、ＢＢＢを横断する任意の血清型からのＶＰ２カプシドタンパク質の、例示的な組合せを開示する、説明に役立つ例である。ＡＡＶｒｈ１０およびＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質を、ＢＢＢを横断する（およびＡＡＶｒｈ血清型でもある）例示的な血清型として示すが、これらを、ＢＢＢを横断する任意の他の血清型（これらに限定されないが、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ｒＡＡＶｒｈ１０、ｒＡＡＶｒｈ７４、ｒＡＡＶｒｈ３９、ｒＡＡＶｒｈ４３または他のＡＡＶｒｈ血清型を含む）からのＶＰ３タンパク質で容易に置き換えることまたは置換することができる。同様に、ＡＡＶ８をＶＰ１および／またはＶＰ２タンパク質についての例示的血清型として示すが、当業者は、ＡＡＶ８からのＶＰ１および／またはＶＰ２タンパク質で、本明細書において表１で開示する任意の他の血清型を容易に置き換えることまたは置換することができる。

上記の通り、ハプロイドウイルスＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドの形質導入効率は、Ｐｒｏ１０細胞またはＧＭ１６０９５細胞系において、ＡＡＶ親血清型のものより高い。次に、ｉｎｖｉｔｒｏでのＡＡＶ８－８－ｒｈ７４の高度な形質導入がｉｎｖｉｖｏでマウスに翻訳されるかどうかを研究した。ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０またはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドおよび親ベクター（ＡＡＶ８およびＡＡＶｒｈ１０）を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに（尾静脈注射によって）静脈内注射した。各ウイルスについて合計５×１０^１０ｖｇのベクターをマウスごとに投与した。ＡＡＶ８と比較して、ＡＡＶ８－８－Ｒｈ７４の有意な分布をｉｎｖｉｖｏで決定し、それはＡＡＶ８またはＡＡＶｒｈ１０より大きかった（図２１Ａ～２１Ｄ）。

さらに、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４、またはＡＡＶ８ゲノムコピー数（ｑＰＣＲにより測定される）をマウスの脳において測定し、この場合、全てのビリオンを全身投与し、結果は、８－８－ｒｈ１０と８－８－ｒｈ７４の両方が有意な脳への形質導入を示すが、脳におけるＡＡＶ８の形質導入が最少であることを示す。

十分に定義されたシステムにおいてＢＢＢｈＣＥＭＣ／Ｄ３内皮細胞を使用するｉｎｖｉｔｒｏ内皮細胞透過性解析では、内皮細胞透過性の有意な増大が、ＡＡＶ８の内皮細胞透過性と比較してＡＡＶ８－８－ｔｈ１０でまたはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４で観察される。これらの観察は、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０またはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４の合理的ポリプロイド（例えば、合理的ハプロイド）集団がＡＡＶ８のＢＢＢを横断する能力より増大されたＢＢＢ横断能力を有することを示す。さらに、ＣＮＳへのベクターの形質導入効率を評価するために、いくつかの脳領域、脊髄および網膜のＧＦＰ免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）および／またはネイティブｅＧＦＰ蛍光法を行う。ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４またはＡＡＶ８－８－ｒｈ１０は、成人ＣＮＳ全体への高い効率での形質導入を示す。

別の例では、合理的ポリプロイドＡＡＶ２－２－９を国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０２２７２５および米国特許第１０，５５０，４０５号に記載されているような方法論に従って生成し、これらの参考特許文献の両方は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。合理的ポリプロイドＡＡＶ２－２－９では、ＶＰ１およびＶＰ２は、血液脳関門を横断することができないＡＡＶ２血清型からのものであり、ＶＰ３は、血液脳関門を効率的に横断することができるＡＡＶ９血清型からのものである。結果として得られる合理的ポリプロイドＡＡＶ２－２－９ビリオンは、結果により示される通り血液脳関門を横断することができる。ＣＮＳ領域において、例えば脳領域において、ＡＡＶ２のルシフェラーゼ形質導入と比較してＡＡＶ２－２－９で増強されたルシフェラーゼ形質導入（イメージング解析により測定される）が、両方のビリオンを全身投与した場合に観察される。さらに、脳におけるＡＡＶ２－２－９ゲノムコピー数は、ＡＡＶ２のものより有意に多く、このことにより、両方のビリオンを全身投与したときにＡＡＶ２－２－９は脳においてＡＡＶ２の形質導入より有意に高度な形質導入を示すことが確認される。十分に定義されたシステムにおいてＢＢＢｈＣＥＭＣ／Ｄ３内皮細胞を使用するｉｎｖｉｔｒｏ内皮細胞透過性解析では、内皮細胞透過性の有意な増大が、ＡＡＶ２のものと比較してＡＡＶ２－２－９で観察される。これらの観察は、ＡＡＶ２－２－９の合理的ポリプロイド（例えば、合理的ハプロイド）集団がＡＡＶ２のＢＢＢを横断する能力より増大されたＢＢＢ横断能力を有することを示す。さらに、ＣＮＳへのベクターの形質導入効率を評価するために、いくつかの脳領域、脊髄および網膜のＧＦＰ免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）および／またはネイティブｅＧＦＰ蛍光法を行う。ＡＡＶ２－２－９は、成人ＣＮＳ全体への高い効率での形質導入を示す。

注目すべきことに、ＡＡＶ８－８－Ｒｈ７４の有意な分布が、背側および腹側像（図２１Ｄ；図２１Ａ～２１Ｃが腹側像）により評価した分布によって実証されるように、ＣＮＳ領域、例えば、脳および脊髄において同定された。

本明細書で開示される合理的ハプロイドＡＡＶベクターのｉｎｖｉｖｏ生体内分布をさらに評価するために、マウス（ｎ＝４／群）に尾静脈経由で２．５Ｅ^１２ｖｇ／ｋｇの用量を注射した（図３０Ａ）。導入遺伝子発現を、ベクター注射後Ｄ２８に様々な臓器における転写レベルによって評価した（図３０Ａ）。ＲＮＡ抽出後、導入遺伝子発現レベルをＲＴ－ｑＰＣＲにより評価した。

図３０Ｂは、ＡＡＶ８で処置したマウスが脳内にほとんど転写物を有さないことを示し、これは、ＡＡＶ８がＢＢＢを横断しないことを示す。その一方で、ＡＡＶ８－８－Ｒｈ７４は、脳内で検出される多くの転写物をもたらした。投与が静脈内投与であったため、データは、ＡＡＶ８ＶＰ３をＡＡＶＲｈ７４ＶＰ３に置き換えることによって、ＢＢＢを横断し、脳を標的とし、本明細書で開示の脳の疾患もしくは障害または中枢神経系（ＣＮＳ）障害または神経学的疾患の処置に有用である、ハプロイドベクターが得られることを実証する。Ｒｈ７４もまたＢＢＢを横断する（データ未記載）。同様の結果が、脊髄で検出され、図３０Ｃは、ＡＡＶ８が脊髄を標的としないことを示す。しかし、ＡＡＶ８－８－Ｒｈ７４は、脊髄を標的とする。したがって、図３０Ｃは、ＡＡＶ８ＶＰ３をＡＡＶＲｈ７４ＶＰ３に置き換えることが、脊髄に対するトロピズムを有するハプロイドベクターを生じさせる結果となり、脊髄の疾患もしくは障害または末梢神経系（ＰＮＳ）障害の処置に有用であることを示す。加えて、図３１は、ＡＡＶ８が小腸を標的としないが、ＡＡＶ８－８－Ｒｈ７４が小腸を標的とすることを示す。したがって、図３１は、ＡＡＶ８ＶＰ３をＡＡＶＲｈ７４ＶＰ３に置き換えることが、小腸に対するトロピズムを有するハプロイドベクターを生じさせる結果となり、消化管障害または小腸の障害の処置に有用であることを示す。

脳（図３０Ｂ）、脊髄（図３０Ｃ）および小腸（図３１）において、ＡＡＶ８もしくはＡＡＶＲｈ１０親ベクターまたは食塩水対照と比較して新規ベクターＡＡＶ８－８－Ｒｈ７４で有意性が達成された。ＡＡＶ８－８－Ｒｈ７４は、ＡＡＶ８－８－Ｒｈ１０より有効にＢＢＢを横断することができ、ＡＡＶ８－８－Ｒｈ１０および親ベクターＡＡＶ８またはＡＡＶＲｈ１０と比較して小腸に形質導入する上でより有効であった。

これらの結果は、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドウイルスが、静脈内（または全身）投与時にＢＢＢを横断することができることを実証し、さらに、合理的設計から生じたポリプロイドまたはハプロイドビリオンが、ＡＡＶ８からのＶＰ１／ＶＰ２とＡＡＶｒｈ１０またはＡＡＶｒｈ７４のどちらかからのＶＰ３とを含む１つの構築物であったことをさらに支持する。
（実施例８）

中和抗体から逃避するハプロイドウイルスＡＡＶ８－８－ｒｈ１０およびＡＡＶ８－８－ｒｈ７４の能力。

実施例８は、任意の順序での、それぞれ、ＡＡＶ８、およびＢＢＢを横断する任意の血清型、例えばアカゲザルＡＡＶ（ＡＡＶｒｈ）血清型、からのＶＰ１およびＶＰ３カプシドタンパク質、ならびに必要に応じて、ＡＡＶ８からのＶＰ２カプシドタンパク質、またはアカゲザルＡＡＶ（ＡＡＶｒｈ）血清型を含むがこれに限定されない、ＢＢＢを横断する任意の血清型からのＶＰ２カプシドタンパク質の、例示的な組合せを開示する、説明に役立つ例である。ＡＡＶｒｈ１０およびＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質を、ＢＢＢを横断する（およびＡＡＶｒｈ血清型でもある）例示的な血清型として示すが、これらを、ＢＢＢを横断する任意の他の血清型（これらに限定されないが、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ｒＡＡＶｒｈ１０、ｒＡＡＶｒｈ７４、ｒＡＡＶｒｈ３９、ｒＡＡＶｒｈ４３または他のＡＡＶｒｈ血清型を含む）からのＶＰ３タンパク質で容易に置き換えることまたは置換することができる。同様に、ＡＡＶ８をＶＰ１および／またはＶＰ２タンパク質についての例示的血清型として示すが、当業者は、ＡＡＶ８からのＶＰ１および／またはＶＰ２タンパク質で、本明細書において表１で開示する任意の他の血清型を容易に置き換えることまたは置換することができる。

血液疾患および盲障害を有する患者においてアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを使用する臨床試験で治療効果を達成した。しかし、ＡＡＶカプシド特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）および中和抗体（Ｎａｂ）という２つの懸念が、ＡＡＶベクター応用の拡大を制限する。低用量のＡＡＶベクターでのＡＡＶ形質導入の増強は、カプシド抗原負荷量を減少させる可能性があり、導入遺伝子発現を損なうことなくＡＡＶ形質導入標的細胞のカプシドＣＴＬ媒介クリアランスを除去することが期待される。現在、１２の血清型および１００より多くのバリアントまたは変異体が、それらの異なる組織トロピズムおよび形質導入効率に起因して、遺伝子送達用に詳しく調査されている。ＡＡＶ血清型間のカプシドには適合性があること、およびある血清型の特定のアミノ酸の別のＡＡＶカプシドへの組込みはＡＡＶ形質導入を増強することが、実証されている。異なる血清型からの有効なＡＡＶ形質導入のための異なる機序を活用することにより、ＡＡＶカプシドサブユニットが異なる血清型に由来するモザイクウイルスを使用してｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏで増強されたＡＡＶ形質導入を達成することができる。ＡＡＶベクターとモノクローナル中和抗体の相互作用に関する最近の構造研究は、Ｎａｂが１つのビリオン表面のいくつかの異なるサブユニット上の残基に結合することを実証しており、これは、ＡＡＶビリオンのサブユニット組み立てを変化させることで、ＡＡＶＮａｂ結合部位を除去することができ、ひいてはＮａｂ活性から逃避することができることを示唆する。本発明者らは、モザイクＡＡＶベクターがＮａｂ活性から逃れることができることを実証した。これらの結果は、ＡＡＶカプシドサブユニットの置換には、ＡＡＶ形質導入を増強する可能性および中和抗体から逃れる能力を増強する可能性があることを示す。

本明細書において、本発明者らは、これらのＡＡＶ８－８－ｒｈ１０およびＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ｖｖハプロイドウイルスが、ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏでの形質導入効率を向上させること、ならびにさらに、親ベクター免疫化血清からの中和を逃避することを実証する。個々のハプロイドウイルスビリオン各々は、異なるＡＡＶ血清型カプシドからの６０のサブユニットで構成されている。１つの血清型からの一部のカプシドサブユニットを異なる血清型からの他のカプシドサブユニットに挿入することで、ビリオン表面構造を変化させることができる。大部分のＡＡＶモノクローナル抗体が１つの単一ビリオンの異なるサブユニット上の残基を認識することは、周知である。

Ｎａｂから逃避するＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドの能力。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、血友病を有する患者および失明している患者における臨床試験での使用に成功している。ＡＡＶ形質導入を増強し、中和抗体活性から逃避するために有効な戦略の詳しい調査は、それでもやはり不可欠である。以前の研究は、ＡＡＶ血清型からのカプシドの適合性、および１つのビリオンの異なるカプシドサブユニット上に位置するＡＡＶＮａｂの認識部位を示した。この研究では、本発明者らは、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０およびＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドカプシドのＮａｂ逃避活性、続いて、形質導入を評価した（例えば、図１４Ａ～図１６および１８Ａ～１８Ｂ、１９Ａ～１９Ｂを参照されたい）。これらのハプロイドベクターのトロピズムが、合理的ポリプロイドベクターにおいて変化され得るかどうかを判定するために、ハプロイドウイルスの形質導入の有効性を、ヒトＰｒｏ１０細胞およびＧＭ１６０９５細胞系への形質導入により解析した（図１３Ａ～１３Ｂおよび１７Ａ～１７Ｂ）。

したがって、本発明者らは、ＡＡＶ免疫化マウスからの血清に対するハプロイドＡＡＶ８－８－ｒｈ１０またはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドウイルスの免疫学的プロファイルを解析した。Ｎａｂ力価を使用して、ベクター形質導入を阻害する血清の能力を評価した。親ウイルスで処置したマウスから注射後４週間目に血清を収集した。

図１８Ａ～１８Ｂは、ＡＡＶ８－８－Ｒｈ７４ハプロイドベクターは抗ＡＡＶ８ＮＡｂから逃避することができたがＡＡＶ８－８－ｒｈ１０ハプロイドベクターはできなかったこと、およびＮａｂの存在下と非存在下でルシフェラーゼ導入遺伝子発現に差が見られなかったことを実証する。加えて、ｉｎｖｉｔｒｏでＰｒｏ１０細胞へのトランスフェクションから、１／１００および１／２００濃度での抗血清ＡＡＶ８（ａＡＡＶ８）の存在下で評価し、ＡＡＶ８－８－Ｒｈ７４ハプロイドベクターは、抗ＡＡＶ８ＮＡｂから逃避することができたが、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０ハプロイドベクターはできなかったこと、およびＮａｂの存在下と非存在下でルシフェラーゼ導入遺伝子発現に差が見られなかったことを実証した（図１９Ａ～１９Ｂ）。

興味深いことには、ＡＡＶ８免疫化マウスの血清が、ＡＡＶ８カプシドの組込み量にかかわらず、ＡＡＶ８およびＡＡＶｒｈ１０ウイルスに対して同様の中和活性を有した。

静脈内注射後、ハプロイドウイルスの全てが、親ＡＡＶベクターより高度な形質導入（ＡＡＶ８またはＡＡＶｒｈ１０の２～９倍）を誘導し、ハプロイドベクターＡＡＶ８－８ｒｈ７４がこれらのうち最高であった（図２１Ａ～２１Ｄ）。注目すべきことに、ハプロイドベクターＡＡＶ８－８－ｒｈ７４の全身性形質導入は、ＡＡＶ８の全身性形質導入の４倍を超えていた。加えて、ハプロイドウイルスＡＡＶ８－８ｒｈ７４は、ＡＡＶ８中和を逃避することができ、ＡＡＶ８との非常に低いＮａｂ交差反応性を有した。中和抗体解析は、ＡＡＶ８－８ｒｈ７４ハプロイドベクターが、親血清型で免疫されたマウス血清からの中和抗体活性から逃避することができることを実証した。これらの結果は、アカゲザルＡＡＶ血清型（ＡＡＶｒｈ）を含むＡＡＶ８ハプロイドウイルスが、形質導入を増強する利点およびＮａｂ認識から逃れる利点を親血清型から獲得する可能性があり得ることを示す。この戦略は、中和抗体陽性である患者での将来の臨床試験において詳しく調査したいと思う。

ＮＡｂから逃避するＡＡＶ８－８－ｒｈ１０ＬＰ２およびＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ＬＰ２の能力
ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０ＬＰ２およびＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ＬＰ２またはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ｖｖＬＰ２は、ＡＡＶｒｈ１０またはＡＡＶｒｈ７４血清型の中和抗体認識から効率的に逃避することができると予想される。ＣＮＳにおける導入遺伝子発現につながる、ルシフェラーゼ導入遺伝子を含むＡＡＶｒｈ１０またはＡＡＶｒｈ７４を、マウスに静脈内注射する。次いで、マウスに、ルシフェラーゼ導入遺伝子を各々が含む、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０ＬＰ２、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ＬＰ２、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ｖｖＬＰ２、ＡＡＶｒｈ１０、またはＡＡＶｒｈ７４のいずれかを注射する。この反復投与では、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０ＬＰ２、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ＬＰ２、またはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ｖｖＬＰ２のみが、ＣＮＳにおける形質導入およびルシフェラーゼ発現の成功に至り、これは、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０ＬＰ２、ＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ＬＰ２、またはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ｖｖＬＰ２のみが、ｒｈ１０またはｒｈ７４ＡＡＶ血清型に対する中和抗体を逃避することができ、他の群はできないことを支持する。

低減された液性免疫を有するＡＡＶ８－８－ｒｈ１０またはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ハプロイドの能力

ＡＡＶ８ハプロイド、例えばＡＡＶ８－８－ｒｈ１０またはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４、の抗原性または能力を、図２５に示されているように、ハプロイドベクターを接種したときのマウスにおけるＩｇＧレベルを測定することにより評価した。図２５Ａは、抗ＡＡＶ８ＩｇＧレベル（１／１０００の血清希釈度）を示し、図２５Ｂは、抗ＡＡＶ８ＩｇＧレベル（１／５０００の血清希釈度）を示し、これらは、例えば、ＡＡＶ８を注射したマウスと比較して両方のハプロイドベクターを接種したマウスの血清において検出される低下した抗ＡＡＶ８ＩｇＧレベルにより示される通り、有意に低減された液性応答を示す。ＡＡＶ８に対する交差反応性は、試験した血清希釈度でＡＡＶｒｈ１０を接種したマウスからの血清では見られなかった。図２５Ｃは、抗ＡＡＶｒｈ１０ＩｇＧレベル（１／１０００の血清希釈度）を示し、図２５Ｄは、抗ＡＡＶｒｈ１０ＩｇＧレベル（１／５０００の血清希釈度）を示し、ＡＡＶｒｈ１０の免疫原性がＡＡＶ８より有意に低かったこと、および試験した血清希釈度でＡＡＶｒｈ１０を接種したマウスと実験群の残部との間に抗ＡＡＶｒｈ１０ＩｇＧレベルの有意差が認められなかったことを示す。

結果は、Ｒｈ血清型（例えば、ＡＡＶ８－８－ｒｈ１０またはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４）からのＶＰ３を有するこれらのＡＡＶ８ハプロイドベクターを、それらがより低い液性応答を示すので、ｉｎｖｉｖｏでまたは臨床応用に使用することができることを実証する。
（実施例９）

疾患の処置

例えばパーキンソン病、アルツハイマー病、ＡＬＳを含む、例えば中枢神経系、心臓、肺、骨格筋および肝臓の、疾患の処置についての以下の実施例９の各々において、そこに記載するＡＡＶ８ハプロイドカプシドビリオンであって、指定のＡＡＶ血清型を使用して生成され、実施例１の合理的ポリプロイド法を使用して、ＶＰ１およびＶＰ２がＡＡＶ８からのものであり、ＶＰ３のみが、ＢＢＢを横断する任意の血清型、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ｒＡＡＶｒｈ１０、ｒＡＡＶｒｈ７４、ｒＡＡＶｒｈ３９、ｒＡＡＶｒｈ４３、または他のアカゲザルＡＡＶ（ＡＡＶｒｈ）血清型からのものである、ハプロイドカプシドを生成するように生成されるＡＡＶ８ハプロイドカプシドビリオン。理論により限定されることを望まないが、実施例９は、任意の順序での、それぞれ、ＡＡＶ８、ＢＢＢを横断する任意の血清型、例えばアカゲザルＡＡＶ（ＡＡＶｒｈ）血清型、からの、ＶＰ１およびＶＰ３カプシドタンパク質、ならびに必要に応じて、ＡＡＶ８からのＶＰ２カプシドタンパク質、またはアカゲザルＡＡＶ（ＡＡＶｒｈ）血清型を含むがこれに限定されない、ＢＢＢを横断する任意の血清型からのＶＰ２カプシドタンパク質の、例示的な組合せを開示する、説明に役立つ例である。ＡＡＶｒｈ１０およびＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質を、ＢＢＢを横断する（およびＡＡＶｒｈ血清型でもある）例示的な血清型として示すが、これらを、ＢＢＢを横断する任意の他の血清型（これらに限定されないが、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ｒＡＡＶｒｈ１０、ｒＡＡＶｒｈ７４、ｒＡＡＶｒｈ３９、ｒＡＡＶｒｈ４３または他のＡＡＶｒｈ血清型を含む）からのＶＰ３タンパク質で容易に置き換えることまたは置換することができる。同様に、ＡＡＶ８がＶＰ１および／またはＶＰ２タンパク質についての例示的血清型として示されているが、ＡＡＶ８からのＶＰ１および／またはＶＰ２タンパク質で、本明細書において表１で開示する任意の他の血清型を置き換えることまたは置換することができることを想定している。

ハプロイドベクターＡＡＶ８－８Ｒｈ１０またはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４の全身性形質導入

次に、実施例１からのハプロイドＡＡＶを、マウス１匹当たり５×１０^１０ｖｇのＡＡＶ／ｌｕｃの用量で静脈内注射した。注射後３週間目に、図２１Ａに見られるように３０秒分の期間、図２１Ｂに見られるように１分露出、または図２１Ｃに示されているように自動露出の、イメージングを行った。図２１Ｄは、ＩＶ注射後の４匹のマウスからのデータを、親ＡＡＶ８またはＡＡＶｒｈ１０からのそれと比較した形質導入によって計算した形質導入の増加倍数とともに提供する。

ハプロイドベクターの肝臓形質導入

この実験では、ハプロイドＡＡＶ８－８Ｒｈ１０またはＡＡＶ８－８－ｒｈ７４ベクターを、粒子３×１０^１０の用量で、後眼窩静脈経由で、Ｃ５７ＢＬ６マウスに注射した。イメージングを１週間後に行った。肝臓形質導入を、平均５匹のマウスを代表するデータおよび標準偏差に基づいて定量した。

キメラカプシドタンパク質およびＡＡＶハプロイドウイルスベクター形質導入

上で説明したように、１つだけまたは２つのウイルスＶＰタンパク質が発現されることになる、カプシドＯＲＦの開始コードの変異体を用いて、ＡＡＶヘルパープラスミドの一連の構築物を作製する。ＶＰ１／２タンパク質が２つの異なる血清型（ＡＡＶ８およびＡＡＶ９）に由来するキメラＡＡＶヘルパー構築物も作製する。これらの構築物は、一群のハプロイドウイルスベクターを生じさせることになり得、マウスにおけるそれらの形質導入の有効性を評価することができる。ＡＡＶ８のみおよびＡＡＶｒｈ１０のみのベクターと比較して増強された形質導入が、血清型８からのＶＰ１／ＶＰ２とＡＡＶｒｈ１０またはｒｈ７４からのＶＰ３とを有するハプロイドベクターから達成されることが判明した。ＡＡＶ８からのＮ末端およびＡＡＶ９からのＣ末端を有するキメラＶＰ１／ＶＰ２カプシド、ならびにＡＡＶｒｈ１０またはｒｈ７４からのＶＰ３から作製した、ＡＡＶベクターが、よりいっそう高度な形質導入を誘導するかどうかを、さらに評価する。これは、ＡＡＶ形質導入およびさらにＡＡＶハプロイドベクターを増強する単純で有効な方法があることを実証する。

締めくくりに、本明細書の態様を特定の実施形態に言及することによって強調するが、当業者には、これらの開示される実施形態が、本明細書で開示される主題の原理の説明に役立つものに過ぎないことが容易に分かるであろうことを、理解されたい。それ故、開示される主題は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコールおよび／または試薬などにいかなる点においても限定されないことを、理解されたい。したがって、本明細書の趣旨から逸脱することなく本明細書における教示に従って、開示される主題に様々な修飾もしくは変化を加えることができ、または開示される主題の代替構造を作製することができる。最後に、本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態を記載することを目的にしたものに過ぎず、特許請求の範囲によってもっぱら定義される本発明を限定することを意図したものでない。したがって、本発明は、示されているおよび記載されている正にその通りのものに限定されない。

本発明のある特定の実施形態が、本発明を行うための本発明者らが知っている最良の方法を含めて、本明細書に記載されている。当然のことながら、当業者には、上述の説明を読むことで、記載されているこれらの実施形態の変形形態が明らかになるであろう。本発明者は、当業者が必要に応じてそのような変形形態を利用することを予期しており、本発明者らは、本発明が本明細書に具体的に記載されるのとは別の方法で実施されることを視野に入れている。したがって、本発明は、本明細書に添付の特許請求の範囲において述べられる主題のあらゆる修飾形態および均等物を、準拠法により許可される場合、包含する。さらに、本明細書中で別段の指示がない限り、または文脈上別段の明らかな矛盾がない限り、上記実施形態のあらゆる可能な変形形態での任意の組合せを包含する。

本発明の代替実施形態、要素またはステップの群別化を限定と解釈すべきでない。各群の構成員は、個々に言及され、請求項に記載されることもあり、または本明細書で開示される他の群の構成員との任意の組合せで言及され、請求項に記載されることもある。群の１つまたはそれより多くの構成員が、適便性および／または特許性の理由で、群に組入れられることもあり、群から削除されることもあると予想される。何らかのそのような組入れまたは削除が行われた場合、本明細書は、添付の特許請求の範囲において使用される全てのマーカッシュ群の文章化した記述を満たすように修飾された群を含有すると考えられる。

別段の指示がない限り、本明細書および特許請求の範囲において使用される特徴、事項、量、パラメーター、特性、期間などを表す全ての数は、いかなる場合も、用語「約」によって修飾されていると解されたい。本明細書で使用される場合、用語「約」は、それにより修飾される特徴、事項、量、パラメーター、特性または期間が、述べられている特徴、事項、量、パラメーター、特性または期間の値よりプラスまたはマイナス１０パーセント上および下の範囲を包含することを意味する。したがって、そうでない旨の指示がない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲で示される数値パラメーターは、変動し得る近似値である。最低でも、および請求項の範囲への均等論の適用を制限する試みとしてではなく、少なくとも、報告有効桁数に照らして、および通常の丸め技法を適用することにより、各数値表示を解釈されたい。本発明の広い範囲を示す数値範囲および値は、近似値であるものの、特定の例で示す数値範囲および値は、できる限り正確に報告する。しかし、いずれの数値範囲または値も、それらのそれぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的に生じるある程度の誤差を本質的に含む。本明細書における値の数値範囲の記述は、範囲内に入る別々の数値範囲各々に個々に言及するための省略表現法としての役割を果たすことを目的としたものに過ぎない。本明細書中で別段の指示がない限り、数値範囲の個々の値各々は、それが本明細書で個々に述べられているかのごとく本明細書に組み込まれる。

本明細書に記載される全ての方法は、本明細書中で別段の指示がない限り、または文脈上別段の明らかな矛盾がない限り、任意の好適な順序で行うことができる。本明細書で提供される任意のおよび全ての例、または例示的な言葉（例えば、「～などの」）の使用は、本発明の理解をより容易にすることを意図したものに過ぎず、別様に請求項に記載された本発明の範囲に対して制限を課さない。本発明の実施に不可欠な何らかの請求項不記載要素を示すと解釈すべき言葉は、本明細書中に存在しない。

本明細書で開示される特定の実施形態は、からなるという言葉、またはから本質的になるという言葉を使用してさらに限定されることがある。出願されるときであろうと、補正ごとに加えられるときであろうと、特許請求の範囲において使用される場合、移行句「からなる」は、特許請求の範囲で指定されていない任意の要素、ステップまたは成分を除外する。接続句「から本質的になる」は、請求項の範囲を、指定材料またはステップ、ならびに基本および新規特徴に実質的に影響を与えないものに限定する。そのように請求項に記載される本発明の実施形態は、本質的にまたは明示的に、本明細書に記載され、可能にされる。

本明細書で参照および特定される全ての特許、特許公報、および他の刊行物は、例えば、本発明に関連して使用され得るそのような刊行物に記載されている組成物および方法論を、記載および開示することを目的として、それらの全体が参照により本明細書に個々におよび明示的に組み込まれる。これらの刊行物は、本願の出願日より前のそれらの開示についてもっぱら提供される。このことに関して、先行発明を理由にまたは何らかの他の理由でそのような開示に時間的に先行する権利が本発明者らにないことを認めるものと解釈すべきものは何もない。日付についての記載またはこれらの文献の内容についての表示は全て、本出願人らが入手可能な情報に基づいており、これらの文献の日付または内容の正確さについてのいかなる自認にもならない。

表1: AAV血清型および例示的な公開されている対応するカプシド配列

Claims

血液脳関門を横断する際の使用に好適な合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団であって、前記合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンが、ＡＡＶＶＰ１またはＶＰ２ウイルス構造タンパク質の少なくとも一方とＡＡＶＶＰ３ウイルス構造タンパク質とを含み；
ＶＰ１またはＶＰ２ウイルス構造タンパク質の前記少なくとも一方が、各々、任意のＡＡＶ血清型からのものであり、前記ＶＰ３ウイルス構造タンパク質が、前記血液脳関門を効率的に横断する、ＶＰ１またはＶＰ２の少なくとも一方の前記血清型とは異なる、ＡＡＶ血清型からのものであり；
合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの前記集団が、全身またはくも膜下腔内投与時に、前記血液脳関門（ＢＢＢ）を横断することができる、ならびに／または前記ＢＢＢの内皮細胞におよび／もしくは前記ＢＢＢを横断する血液成分に形質導入することができる、
合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団。
前記血液脳関門を横断する能力を欠いている非合理的ポリプロイドＡＡＶ粒子と比べて、前記集団が、前記血液脳関門（ＢＢＢ）を越える、増強された形質導入活性を示す、請求項１に記載の集団。
前記ＶＰ３ウイルス構造タンパク質が、ＡＡＶアカゲザル血清型である、請求項１から２のいずれかに記載の集団。
前記ＶＰ３ウイルス構造タンパク質が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶｒｈ３９、およびＡＡＶｒｈ４３からなる群から選択される、前記血液脳関門を効率的に横断する血清型からのものである、請求項１から３のいずれかに記載の集団。
前記血液脳関門を効率的に横断する能力を欠いている非合理的ポリプロイドＡＡＶ粒子と比べて、前記集団が、対象の皮質、線条体、視床、髄質、海馬、小脳および脊髄のうちの１つまたは複数への増強された形質導入を示す、請求項１から４のいずれかに記載の集団。
前記集団が、髄質神経叢、頸神経叢、胸神経叢、腰神経叢および脈絡叢からなる群から選択されるＣＮＳ領域の１つまたは複数においてＡＡＶ２と比べて増強された形質導入を示す、請求項１から５のいずれかに記載の集団。
前記集団が、ＡＡＶ８と比べて脳微小血管内皮細胞（ＢＭＶＥＣ）への増給された結合を示す、請求項１から６のいずれかに記載の集団。
前記集団が、前記ＣＮＳにおける生体内分布を有する、請求項１から７のいずれかに記載の集団。
前記集団が、少なくとも０．０５ｖｇ／細胞、０．１ｖｇ／細胞、少なくとも０．２ｖｇ／細胞、少なくとも０．４ｖｇ／細胞、少なくとも０．６ｖｇ／細胞、少なくとも０．８ｖｇ／細胞、少なくとも１ｖｇ／細胞、少なくとも５ｖｇ／細胞、少なくとも１０ｖｇ／細胞、少なくとも２０ｖｇ／細胞、少なくとも２５ｖｇ／細胞のまたは好ましくはそれより多いＣＮＳ生体内分布を有する、請求項１から８のいずれかに記載の集団。
ＶＰ１またはＶＰ２の前記少なくとも一方が、血液脳関門を横断するＡＡＶ血清型から選択される、請求項１から９のいずれかに記載の集団。
ＶＰ１またはＶＰ２の前記少なくとも一方が、血液脳関門を横断しないＡＡＶ血清型から選択される、請求項１から９のいずれかに記載の集団。
ＶＰ１またはＶＰ２のその少なくとも一方が、ＡＡＶアカゲザル血清型から選択されない、請求項１から１１のいずれかに記載の集団。
ＶＰ１またはＶＰ２の前記少なくとも一方が、ＡＡＶアカゲザル血清型から選択される、請求項１から１１のいずれかに記載の集団。
対象に投与されたとき、前記集団が、前記ＶＰ１またはＶＰ２構造タンパク質のサブタイプの親ＡＡＶベクターにより惹起される液性応答と比較して低い液性免疫応答を惹起する、請求項１から１３のいずれかに記載の集団。
前記集団が、ＡＡＶＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３ウイルス構造タンパク質の親血清型に対する中和抗体から逃れる、請求項１から１４のいずれかに記載の集団。
対象の血液脳関門を越えて導入遺伝子を送達するための方法であって、請求項１から１５のいずれかに記載の合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団を前記対象に投与するステップを含む方法。
対象へのＡＡＶの反復投薬のための方法であって、請求項１から１６のいずれかからの合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団を前記対象に投与することにより行われる第１の投与、およびＶＰ１またはＶＰ２ウイルス構造タンパク質の少なくとも一方の親ＡＡＶ血清型を前記対象に投与することにより行われる第２の投与を含み、
合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの前記集団が、前記ＶＰ１またはＶＰ２ウイルス構造タンパク質の前記親ＡＡＶ血清型により惹起される液性応答と比較して低減された液性応答を前記対象において惹起し、
前記ＶＰ１またはＶＰ２の前記少なくとも一方が、ＲｈｅｓｕｓＡＡＶ血清型ではない、
方法。
反復投薬を可能にする合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団であって、
ＡＡＶＶＰ１またはＶＰ２ウイルス構造タンパク質の少なくとも一方と、ＡＡＶＶＰ３ウイルス構造タンパク質とを含む合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンを含み；
ＶＰ１またはＶＰ２ウイルス構造タンパク質の前記少なくとも一方が、各々、任意のＡＡＶウイルス血清型からのものであり、前記ＶＰ３ウイルス構造タンパク質が、アカゲザルＡＡＶ血清型から選択され；
合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの前記集団が、前記ＶＰ１またはＶＰ２ウイルス構造タンパク質の親ＡＡＶ血清型により惹起される液性応答と比較して低減された液性応答を惹起し；
ＶＰ１またはＶＰ２の前記少なくとも一方が、ＲｈｅｓｕｓＡＡＶ血清型からのものではなく、
前記反復投薬が、合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの前記集団の第１の投与、およびＶＰ１構造ウイルスタンパク質またはＶＰ２構造ウイルスタンパク質の親ＡＡＶ血清型の第２の投与を含む、
集団。
合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団であって、
ａ．ＡＡＶ８ウイルス血清型から選択されるＶＰ１およびＶＰ２ＡＡＶウイルス構造タンパク質と、
ｂ．ＡＡＶアカゲザル血清型ＡＡＶｒｈ１０またはＡＡＶｒｈ７４から選択されるＶＰ３と
を含み、
対象に投与されたとき、親ＡＡＶ８血清型により惹起される対応する液性応答と比べて低減された液性応答を惹起する、合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団。
対象への第１および第２のＡＡＶ投与を含む反復投薬のための方法であって、
請求項１から１６または１８から１９のいずれかからの合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団を前記対象に投与することにより行われる第１の投与、および
ＶＰ１またはＶＰ２ウイルス構造タンパク質の親ＡＡＶ血清型を投与することにより行われる第２の投与
を含み、
前記第１の投与が、ＶＰ１またはＶＰ２ウイルス構造タンパク質の前記親ＡＡＶ血清型により惹起される対応する液性応答と比較して低減された液性応答を前記対象において惹起し、
ＶＰ１またはＶＰ２が、ＲｈｅｓｕｓＡＡＶ血清型ではない、
方法。
ＡＡＶＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３ウイルス構造タンパク質の親血清型に対する中和抗体から逃れる、請求項１８から２０のいずれかに記載の集団。
対象の血液脳関門を越えて導入遺伝子を送達するための方法であって、請求項１８から２１のいずれかに記載の合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団を前記対象に投与するステップを含む方法。
前記ＶＰ３タンパク質が、ＡＡＶｒｈ１０またはＡＡＶｒｈ７４血清型からの変異ＶＰ３タンパク質である、前記請求項のいずれかに記載の集団。
変異ＡＡＶｒｈ７４ＶＰ３タンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列、もしくは配列番号２に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するタンパク質のアミノ酸配列を有し、または前記変異ＡＡＶｒｈ７４ＶＰ３が、配列番号２の以下の改変：Ｎ２６３Ｓ、Ｇ２６４Ａ、Ｔ２６５Ｓ、Ｓ２６６Ｔ、Ｇ２６８Ａ、Ｔ２７０ｄｅｌ、Ｔ２７４Ｈ、Ｅ５３３Ｋ、Ｒ７２６Ｈ、Ｎ７３６Ｐのうちの少なくとも１つを含む、請求項２３に記載の集団。
変異ＡＡＶｒｈ１０ＶＰ３タンパク質が、配列番号５のＡＡＶｒｈ１０＿ＶＰ３核酸と比較してＱ２１４Ｎ、Ｓ４６２ＮおよびＤ５１７Ｅ変異のうちの少なくとも１つまたは複数を含む配列番号５の核酸によりコードされる、またはＱ２１４Ｎ、Ｓ４６２ＮおよびＤ５１７Ｅから選択される少なくとも１つの変異を含む配列番号５に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する核酸配列を含む配列番号５の核酸によりコードされる、請求項２４に記載の集団。
前記ＶＰ３タンパク質が、配列番号２もしくは３のアミノ酸配列、または配列番号２もしくは配列番号３に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するタンパク質のアミノ酸配列を含むＡＡＶｒｈ７４ＶＰ３タンパク質であり、あるいは配列番号２のＮ２６３Ｓ、Ｇ２６４Ａ、Ｔ２６５Ｓ、Ｓ２６６Ｔ、Ｇ２６８Ａ、Ｔ２７０ｄｅｌ、Ｔ２７４Ｈ、Ｅ５３３Ｋ、Ｒ７２６Ｈ、Ｎ７３６Ｐのアミノ酸改変のうちの少なくとも１つを含む、請求項２５に記載の集団。
少なくとも１０^１個のビリオンである、請求項１から２６のいずれかに記載のビリオンの実質的に均一な集団。
５’から３’の方向に、
ａ．第１のプロモーターに動作可能に連結されたＡＡＶｒｈ１０ＶＰ３カプシドタンパク質をコードする第１の核酸；
ｂ．第１のポリＡ配列；
ｃ．ｒｅｐタンパク質をコードする第２の核酸；
ｄ．ＡＡＶ８ＶＰ１およびＶＰ２ウイルス構造タンパク質をコードする第３の核酸であって、第３の核酸配列がＡＡＶ８ＶＰ３ウイルス構造タンパク質を発現することができない、第３の核酸；ならびに
ｅ．第２のポリＡ配列
を含む核酸。
５’から３’の方向に、
ａ．第１のプロモーターに動作可能に連結されたＡＡＶｒｈ７４ＶＰ３カプシドタンパク質をコードする第１の核酸；
ｂ．第１のポリＡ配列；
ｃ．ｒｅｐタンパク質をコードする第２の核酸；
ｄ．ＡＡＶ８ＶＰ１およびＶＰ２ウイルス構造タンパク質をコードする第３の核酸であって、第３の核酸配列がＡＡＶ８ＶＰ３ウイルス構造タンパク質を発現することができない、第３の核酸；および
ｅ．第２のポリＡ配列
を含む核酸。
ａ．前記請求項のいずれかに記載の集団からのＡＡＶビリオン；および
ｂ．少なくとも１つの末端反復配列と異種遺伝子とを含む核酸
を含み、
前記核酸が、前記ＡＡＶビリオンに封入されている、
ウイルスベクター。
キメラまたは改変ウイルス構造タンパク質を含み、前記改変ウイルス構造タンパク質が、１個または複数個のアミノ酸の挿入、欠失または置換を含む、前記請求項のいずれかに記載の集団。
親ＡＡＶ血清型を含むビリオンの実質的に均一な集団と比較して、ｉｎｖｉｖｏで血清中のＶＰ１またはＶＰ２構造タンパク質の親ＡＡＶ血清型に対する有意に少ない抗ＡＡＶＩｇＧ抗体を惹起する、請求項２７に記載の実質的に均一な集団。
前記親ＡＡＶ血清型がＡＡＶ８である、請求項３２に記載の実質的に均一な集団。
反復投薬を可能にする合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団であって、
ＡＡＶＶＰ１またはＶＰ２ウイルス構造タンパク質の少なくとも一方と、ＡＡＶＶＰ３ウイルス構造タンパク質とを含み；
前記ＶＰ１およびＶＰ２ウイルス構造タンパク質が、各々、ＲｈｅｓｕｓＡＡＶ血清型を除く任意のＡＡＶウイルス血清型からのものであり、前記ＶＰ３ウイルス構造タンパク質が、アカゲザルＡＡＶ血清型から選択され；
合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの前記集団が、前記ＶＰ３ウイルス構造タンパク質の親ＡＡＶアカゲザル血清型に対する中和抗体から逃れ、
前記反復投薬が、前記ＶＰ３構造タンパク質の前記親ＡＡＶアカゲザル血清型の第１の投与、および合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの前記集団の第２の投与を含み、
前記合理的ポリプロイドビリオンの前記ＶＰ３構造タンパク質が、ＡＡＶアカゲザル変異ウイルス構造タンパク質ＶＰ３である、
合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団。
前記ＡＡＶアカゲザル変異ウイルス構造タンパク質ＶＰ３が、変異ＡＡＶｒｈ１０ＶＰ３ウイルス構造タンパク質からのものであるか、または変異ＡＡＶｒｈ７４ＶＰ３ウイルス構造タンパク質からのものである、請求項３４に記載の合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団。
前記変異ウイルス構造タンパク質ＶＰ３が、Ｎ２６３、Ｇ２６４、Ｔ２６５、Ｓ２６６Ｔ、Ｇ２６８、Ｔ２７０、Ｔ２７４、およびＥ５３３からなる群から選択されるアミノ酸に対応するアミノ酸における変異を含み、前記アミノ酸位置の全てが、ＡＡＶｒｈ１０またはＡＡＶｒｈ７４のネイティブＶＰ１配列番号付けに対応する、請求項３４から３５のいずれかに記載の合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団。
前記変異が、Ｎ２６３Ｓ、Ｇ２６４Ａ、Ｔ２６５Ｓ、Ｓ２６６Ｔ、Ｇ２６８Ａ、Ｔ２７０ｄｅｌ、Ｔ２７４Ｈ、およびＥ５３３Ｋからなる群から選択される、請求項３６に記載の集団。
前記変異ウイルス構造タンパク質ＶＰ３が、Ｒ７２７およびＮ７３７からなる群から選択されるアミノ酸に対応するアミノ酸における変異をさらに含み、前記アミノ酸位置の全てが、ＡＡＶｒｈ１０のネイティブＶＰ１配列番号付けに対応する、請求項３４から３７のいずれかに記載の合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団。
前記変異が、Ｒ７２７ＨおよびＮ７３７Ｐからなる群から選択される、請求項３８に記載の合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団。
前記変異ウイルス構造タンパク質ＶＰ３が、Ｒ７２６およびＮ７３６からなる群から選択されるアミノ酸に対応するアミノ酸における変異をさらに含み、前記アミノ酸位置の全てが、ＡＡＶｒｈ７４のネイティブＶＰ１配列番号付けに対応する、請求項３４から３７のいずれかに記載の合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団。
前記変異が、Ｒ７２６ＨおよびＮ７３６Ｐからなる群から選択される、請求項４０に記載の合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団。
前記変異ウイルス構造タンパク質ＶＰ３が、５８１におけるＷに対応するアミノ酸における変異をさらに含み、前記Ｗが２個の後続のＶ残基（ＶＶ）に置き換えられ、アミノ酸位置の全てが、ＡＡＶｒｈ７４のネイティブＶＰ１配列番号付けに対応する、請求項４１に記載の合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団。
前記ＡＡＶＶＰ１またはＶＰ２ウイルス構造タンパク質が、表１から選択される任意のＡＡＶ血清型である、請求項３４から４２のいずれかに記載の合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団。
前記ＡＡＶＶＰ１またはＶＰ２ウイルス構造タンパク質が、ＡＡＶ８である、請求項３４から４３のいずれかに記載の合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団。
血液脳関門を越えて導入遺伝子を送達するために使用するための医薬の製造における合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団の使用であって、前記医薬が、請求項１から１５、または１８から１９、２１、２３から２７、３１から４４のいずれかに記載の合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団を含む、使用。
合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの前記集団が、ＡＡＶ８ウイルス血清型から選択されるＶＰ１およびＶＰ２ＡＡＶウイルス構造タンパク質、ならびにＡＡＶアカゲザル血清型ＡＡＶｒｈ１０またはＡＡＶｒｈ７４から選択されるＶＰ３ウイルス構造タンパク質を含む、請求項４５に記載の使用。
合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの前記集団が、ＡＡＶ８ウイルス血清型から選択されるＶＰ１およびＶＰ２ＡＡＶウイルス構造タンパク質、ならびにＡＡＶアカゲザル血清型ＡＡＶｒｈ７４から選択されるＶＰ３構造タンパク質を含む、請求項４５に記載の使用。
前記医薬が、脳疾患、または脳障害、または神経変性疾患、または神経学的疾患の処置に有用である、請求項４５に記載の使用。
前記医薬が、中枢神経系（ＣＮＳ）または末梢神経系（ＰＮＳ）の疾患の処置に有用である、請求項４５に記載の使用。
前記医薬が、脳がんまたは脳のがんを有する対象の処置に有用である、請求項４５に記載の使用。
前記医薬が、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）およびドーパミントランスポーター欠損症候群から選択される疾患または障害を有する対象の処置に有用である、請求項４５に記載の使用。
血液脳関門を越えて導入遺伝子を送達するために使用するための合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団を含む医薬の製造における核酸の使用であって、前記核酸が請求項２８または２９に記載のいずれかを含む、使用。
第１の医薬の第１の投与および第２の医薬の第２の投与の反復投薬のための方法における使用のための前記第１の医薬および前記第２の医薬の調製における合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団の使用であって、前記反復投薬が、請求項１から１５または１８から１９のいずれかからの合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンを含む前記第１の医薬の前記第１の投与と、ＶＰ１またはＶＰ２ウイルス構造タンパク質の少なくとも一方の親ＡＡＶ血清型を含む前記第２の医薬の前記第２の投与とを含み、
合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの前記集団が、前記ＶＰ１またはＶＰ２ウイルス構造タンパク質の前記少なくとも一方の前記親ＡＡＶ血清型により惹起される液性応答と比較して低減された液性応答を惹起し、前記ＶＰ１またはＶＰ２が、ＲｈｅｓｕｓＡＡＶ血清型からのものではない、使用。
ＡＡＶＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３の親血清型に対する中和抗体から逃れるための医薬の調製における合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団の使用であって、前記医薬が、請求項１から１５、または１８から１９、２１、２３から２７、および３１から４４のいずれかに記載の合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団を含む、使用。
小腸への導入遺伝子の送達のための医薬の調製における合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団の使用であって、前記医薬が、請求項１から１５、または１８から１９、２１、２３から２７、および３１から４４のいずれかに記載の合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団を含む、使用。
消化管疾患または障害の処置のための医薬の調製における合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団の使用であって、前記医薬が、請求項１から１５、または１８から１９、２１、２３から２７、および３１から４４のいずれかに記載の合理的ポリプロイドＡＡＶビリオンの集団を含む、使用。