TW202305124A - 具有腦特異性靶向模體的新穎構成物及含有其之組成物 - Google Patents

具有腦特異性靶向模體的新穎構成物及含有其之組成物 Download PDF

Info

Publication number
TW202305124A
TW202305124A TW111115414A TW111115414A TW202305124A TW 202305124 A TW202305124 A TW 202305124A TW 111115414 A TW111115414 A TW 111115414A TW 111115414 A TW111115414 A TW 111115414A TW 202305124 A TW202305124 A TW 202305124A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
seq
aav9
capsid
protein
aav
Prior art date
Application number
TW111115414A
Other languages
English (en)
Inventor
約書亞喬伊納 西姆斯
袁圓
詹姆士Ｍ 威爾森
Original Assignee
賓州大學委員會
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 賓州大學委員會 filed Critical 賓州大學委員會
Publication of TW202305124A publication Critical patent/TW202305124A/zh

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14145—Special targeting system for viral vectors

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本文提供組成物，該組成物包含與其連接或插入至重組載體的靶向蛋白的腦-毛細管結合及/或血腦障壁通過(BBB)組織-靶向肽，該重組載體具有至少一種外源性肽，該外源性肽包含Y-G/A/R/K-Y/H-GNPA-T/R/H-RYFD-V/K之胺基酸序列。提供了提供具有突變體衣殼或套膜蛋白的此種結合物、靶向肽、或重組載體的組成物，正如其用途。

Description

具有腦特異性靶向模體的新穎構成物及含有其之組成物
本發明係關於具有腦特異性靶向模體的新穎構成物及含有其之組成物。
腺相關病毒(adeno-associated virus，AAV)是當前基因治療所選擇的載體。AAV可遞送從非整合基因體長期穩定表現的轉基因，而且因為AAV無關於任何人類疾病。然而，由於遞送及向性(tropism)的挑戰，AAV基因治療目前僅限於少數疾病。對於中樞神經系統(CNS)病症尤其如此。藉由將載體直接注射到腦脊液(CSF)中，可直接遞送AAV基因治療載體，但這種方法通常僅轉導1%或更少的腦細胞。此外，大部分轉導集中在與CSF直接接觸的細胞上。「深層腦部(deep brain)」中的細胞很少被轉導。此限制了可藉由基因治療而治療的CNS病症的數量。
與CSF網絡相比，腦血管系統幾乎會到達CNS的每個細胞。這是因為這些組織對葡萄糖、氧氣和其它營養物質的需求很高。然而，腦和脊髓中的細胞受到血腦障壁(Blood Brain Barrier，BBB)這個專門的血管單元保護，不受循環系統的影響。BBB限制了病毒載體和蛋白質等大分子，甚至是許多小分子藥物通過圍繞於腦和脊髓血管的緊密連接之複雜細胞網絡的擴散。因此，將基因治療遞送至CNS的一個巨大挑戰是工程化一種能夠高效穿過BBB並轉導深層腦部中的細胞的AAV變異體。
加州理工學院(California Institute of Technology，CalTech)開發的一種AAV衣殼是在AAV9衣殼上的高度變異環8(HVR8)中插入7個胺基酸的肽，以生成一種稱為AAV9-PHP.B的rAAV，據報導其介導與Ly6a(一些小鼠品系腦血管系統上的GPI錨定受體)的相互作用。美國公開專利申請號2017/0166926A1。這種相互作用驅動AAV9-PHP.B通過BBB的運輸，導致腦細胞轉導比AAV9高約50倍。然而，此發現並未轉至更大的動物或人類。
對於可特異性靶向所選擇之組織及細胞類型的載體仍有需求。
在某些具體實施例中，提供一種重組腺相關病毒顆粒(rAAV)，其具有包含胺基酸序列之衣殼，該胺基酸序列包含被插入至高度變異區的外源性靶向肽，其中該外源性靶向肽包含可選擇的N端連接子-Y-X’-X”-GNPA-X”’-RYFD-X”” (SEQ ID NO：14)-可選擇的C端連接子，其中X’為G、A、R、或K，X”為Y或H，X”’為T、R或H，且X””為V或K(亦稱為YGY-GNPA-T/R/H-RYFD-V/K)。適合地，胺基酸序列是至少在衣殼中AAV VP3蛋白和包裝在衣殼中的載體基因體的一部分，其包含在指導其表現的序列的控制下編碼基因產物的核酸序列。在某些具體實施例中，該外源性靶向肽被插入至親代衣殼的高度變異區VIII或IV。在一些具體實施例中，親代衣殼選自AAV9、AAV8、AAV7、AAV6、AAV5、AAV4、AAV3、AAV1、AAVhu68、及AAVrh.91。在一些具體實施例中，被插入的適合位置是高度變異區VIII。在另外的具體實施例中，被插入的適合位置是如基於SEQ ID NO：9(AAV9)的VP1胺基酸序列的編號所確定的胺基酸588及589之間。
在某些具體實施例中，被插入至衣殼中的外源性靶向肽序列包含Y-X’-X”-GNPA-X”’-RYFD-X””肽模體(SEQ ID NO：14)，其中X’為G、A、R、或K，X”為Y或H，X”’為T、R或H，且X””為V或K(亦稱為YGY-GNPA-T/R/H-RYFD-V/K)。在一些具體實施例中，外源性靶向肽包含：(a) YGYGNPATRYFDV (SEQ ID NO：1)；(b) YGYGNPARRYFDV (SEQ ID NO：6)；(c) YGYGNPAHRYFDV (SEQ ID NO：7)；或(d) YGYGNPATRYFDK (SEQ ID NO：8)。在其它具體實施例中，外源性靶向肽包含：(a) YAYGNPATRYFDV (SEQ ID NO：2)；(b) YKYGNPATRYFDV (SEQ ID NO：3)；(c) YRYGNPATRYFDV (SEQ ID NO：4)；或(d) YGHGNPATRYFDV (SEQ ID NO：5)。
在某些具體實施例中，組成物包含具有外源性靶向肽及可選擇的側接序列的rAAV及一種或多種生理學上可相容的載劑、賦形劑及/或水性懸浮液基質。
在某些具體實施例中，提供一種重組腦細胞-靶向肽，該肽包含Y-X’-X”-GNPA-X”’-RYFD-X””肽模體(SEQ ID NO：14)，其中X’為G、A、R、或K，X”為Y或H，X”’為T、R或H，且X””為V或K(亦稱為Y-G/A/R/K-Y/H-GNPA-T/R/H-RYFD-V/K)，其可選擇地在SEQ ID NO：14的胺基端及/或羧基端處側接二個胺基酸至七個胺基酸，且可選擇地該肽或具一個或多個連接子的肽與奈米顆粒、第二分子、或重組病毒衣殼蛋白結合。在某些具體實施例中，該腦細胞-靶向肽包含：(a) YGYGNPATRYFDV (SEQ ID NO：1)；(b) YAYGNPATRYFDV (SEQ ID NO：2)；(c) YKYGNPATRYFDV (SEQ ID NO：3)；(d) YRYGNPATRYFDV (SEQ ID NO：4)；(e) YGHGNPATRYFDV (SEQ ID NO：5)；(f) YGYGNPARRYFDV (SEQ ID NO：6)；(g) YGYGNPAHRYFDV (SEQ ID NO：7)；或(h) YGYGNPATRYFDK (SEQ ID NO：8)。在一些具體實施例中，腦細胞-靶向肽為YGYGNPATRYFDV。在其它具體實施例中，腦細胞-靶向肽為YAYGNPATRYFDV。在某些具體實施例中，提供一種組成物，其包含包含內皮細胞靶向肽及一種或多種生理學上可相容的載劑、賦形劑、及/或水性懸浮液基質。
在某些具體實施例中，本文提供一種包含腦細胞-靶向肽及融合配偶體(fusion partner)的融合多肽或蛋白質，該融合配偶體包含至少一種多肽或蛋白質。在某些具體實施例中，本文提供一種組成物，包含如本文提供的融合多肽或蛋白質及一種或多種生理學上可相容的載劑、賦形劑、及/或水性懸浮液基質。
本文提供使用rAAV、內皮細胞靶向肽、融合多肽或蛋白質之組成物及方法，及/或如本文所述用於向有需要的患者遞送治療劑的組成物。在某些具體實施例中，治療劑靶向腦內皮細胞。
在某些具體實施例中，提供一種組成物及/或方法，用於藉由對有需要的受試者遞送如本文所述之rAAV來治療艾倫-赫恩登-達得利(Allan-Herndon-Dudley)病，其中編碼的基因產物為MCT8蛋白質。
在某些具體實施例中，提供一種用於腦標靶治療的方法，包含對有需要的患者投予如本文所述之rAAV。在某些具體實施例中，提供一種治療一種或多種認知、神經退化、及/或中樞神經系統疾病之方法，藉由對有需要的受試者遞送如本文所述的rAAV的儲料(stock)。在一些具體實施例中，提供一種治療中樞神經系統之各種感染的方法。
在某些具體實施例中，提供一種在活體外增加AAV生產細胞轉導的方法，包含將Y-X’-X”-GNPA-X”’-RYFD-X””肽模體(SEQ ID NO：14)插入至AAV衣殼，其中X’為G、A、R、或K，X”為Y或H，X”’為T、R或H，且X””為V或K(亦稱為Y-G/A/R/K-Y/H-GNPA-T/R/H-RYFD-V/K)肽核模體。在某些具體實施例中，生產細胞為293細胞。
本發明的這些和其它具體實施例及優點將從說明書中顯而易見，包括但不限於本發明的詳細說明。
在某些具體實施例中，本文提供靶向肽及編碼其之核酸序列。本文亦提供融合蛋白、修飾蛋白質、突變體病毒衣殼及可操作地連接至外源性靶向肽模體Y-G/A/R/K-Y/H-GNPA-T/R/H-RYFD-V/K模體的其它部分。關於SEQ ID NO：14，模體可表示為Y-X’-X”-GNPA-X’’-RYFD-X’”模體(SEQ ID NO：14)，其中X’為G、A、R、K，X”為Y或H，X’”為T、R或H，且X””為V或K。在某些具體實施例中，X”為Y且X’為G(YGY)或A(YAY，亦稱為YGY2A)。本文亦提供編碼其之核酸序列。在某些具體實施例中，此外源的模體修飾來源(親代)蛋白質、病毒載體或其它部分的天然組織特異性。在某些具體實施例中，具有一種或多種此等靶向肽的組成物增強或改變血腦障壁(BBB)靶向。在某些具體實施例中，具有一種或多種此等靶向肽的組成物增強或改變腦微血管靶向。在某些具體實施例中，具有帶有此模體的修飾衣殼的病毒載體在活體外表現出增加的AAV生產細胞的轉導。
有利地，在某些具體實施例中，突變體rAAV衣殼包含Y-X’-X”-GNPA-X’’-RYFD-X’”模體(SEQ ID NO：14)，其中X’為G、A、R、K，X”為Y或H，X’”為T、R或H，且X””為V或K (SEQ ID NO：14)，與親代衣殼(例如，AAV9或另外的分支群F衣殼)相比，本文提供的靶向肽提供在中樞神經系統中顯著的轉導優勢，包括腦及/或脊髓。在某些具體實施例中，突變體rAAV衣殼包含Y-X’-X”-GNPA-X’’-RYFD-X’”模體(SEQ ID NO：14)，其中X’為G、A、R、K，X”為Y或H，X’”為T、R或H，且X””為V或K (SEQ ID NO：14)，更具體而言，其中X’為G或A，靶向肽提供在中樞神經系統中顯著的轉導優勢，包括腦及/或脊髓，與親代衣殼相比。在某些具體實施例中，如本文提供的突變體rAAV衣殼包含靶向肽證實對心臟、肺臟、肝臟及/或腎臟減少轉導(即，脫靶)，與其親代衣殼(例如，AAV9或其它分支群F衣殼或其之其它修飾(例如，AAV9-PHP.B))相比。在某些具體實施例中，此等靶向肽提供與本文所述的其它突變病毒載體或非病毒構築體相似的功能。
靶向肽可連接至重組蛋白(例如，用於酶替代療法(enzyme replacement therapy))或多肽(例如，免疫球蛋白)以形成融合蛋白或結合物以靶向所需的組織(例如，CNS)。此外，靶向肽可連接至微脂體及/或奈米顆粒(脂質奈米顆粒，LNP)，形成肽被包覆的微脂體及/或LNP以靶向所需的組織。編碼至少一個拷貝的靶向肽的序列及可選擇的連接續列可與重組蛋白的編碼序列在框內融合並與蛋白質或多肽共表現，以提供融合蛋白或結合物。或者，其它和成方法可用於與蛋白質、多肽或其它部分(例如，DNA、RNA或小分子)形成結合物。在某些具體實施例中，融合蛋白/結合物中存在靶向肽的多個拷貝。用於結合靶向肽與重組蛋白的適合方法包括使用第一交聯劑修飾重組人類蛋白質(例如酶)上的胺基(N)端和一個或多個殘基以產生第一交聯劑修飾的重組人類蛋白質，使用第二交聯劑修飾位在靶向肽之前的短延伸連接子的胺基(N)端以產生第二交聯劑修飾的變異靶向肽，然後將第一交聯劑修飾的重組人蛋白質與含有短延伸連接子的第二交聯劑修飾的變異體靶向肽結合。結合靶向肽與重組蛋白的其它適合方法包括結合第一交聯劑修飾重組人類蛋白質與一種或多種第二交聯劑修飾變異體靶向肽，其中該第一交聯劑修飾重組蛋白包含重組蛋白，其特徵在於具有化學修飾的N端及一個或多個修飾的離胺酸殘基，且該一種或多種第二交聯劑修飾變異體靶向肽包含含有位在靶向肽之前的短延伸連接子之修飾的N端胺基酸的一種或多種變異體靶向肽。可選擇將靶向肽結合蛋白質、多肽、奈米顆粒或另一生物學上有用的化學部分的其它適合方法。參見，例如美國專利號9,545,450 B2(NHS-膦交聯劑；NHS-疊氮化物交聯劑)；美國公開專利申請號No. US 2018/0185503 A1 (醛-醯肼交聯)。
在某些具體實施例中，靶向肽可被插入至蛋白質或多肽(例如病毒衣殼蛋白)內的適合位點。在某些具體實施例中，靶向肽可在其羧基(COO-)及/或胺基(N-)端側接短延伸連接子。此類連接子的長度可為約1至約20個胺基酸殘基、或約2至約20個胺基酸殘基、或約1至約15個胺基酸殘基、或約2至約12個胺基酸殘基、或約2至約7個胺基酸殘基。短延伸連接子的長度亦可為約10個胺基酸。在N端處之連接子的存在及長度係獨立地選自於羧基端處的連接子，而在羧基端處之連接子的存在及長度係獨立地選自於N端處的連接子。可使用約5-胺基酸可撓性GS延伸連接子(甘胺酸-甘胺酸-甘胺酸-甘胺酸-絲胺酸)、含2個可撓性GS連接子的約10個胺基酸延伸連接子、含3個可撓性GS連接子的約15個胺基酸延伸連接子、含4個可撓性GS連接子的約20個胺基酸延伸連接子、或其等之任何組合來提供適合的短延伸連接子。
在某具體實施例中，提供有用於靶向腦細胞的組成物。該組成物為突變體衣殼、融合蛋白或另一結合物，其包含至少一種外源性靶向肽，包含：YGYGNPATRYFDV之核心胺基酸序列(SEQ ID NO：1)，其可選擇在其核心序列的胺基端及/或羧基端側接二個胺基酸至七個胺基酸，且可選擇地進一步結合奈米顆粒、第二分子或病毒衣殼蛋白。在某些具體實施例中，組成物為突變體衣殼、融合蛋白或另一結合物，包含至少一個外源性靶向肽，該靶向肽包含：YAYGNPATRYFDV之核心胺基酸序列(SEQ ID NO：2)，其可選擇在其核心序列的胺基端及/或羧基端側接二個胺基酸至七個胺基酸，且可選擇進一步結合奈米顆粒、第二分子、或病毒衣殼蛋白。靶向肽包含具有可選擇的連接序列之下列核心胺基酸序列： (a)YAYGNPATRYFDV (SEQ ID NO：2)； (b)YKYGNPATRYFDV (SEQ ID NO：3)； (c)YRYGNPATRYFDV (SEQ ID NO：4)； (d)YGHGNPATRYFDV (SEQ ID NO：5)； (e)YGYGNPARRYFDV (SEQ ID NO：6)； (f)YGYGNPAHRYFDV (SEQ ID NO：7)；或 (g)YGYGNPATRYFDK (SEQ ID NO：8)。
在某些具體實施例中，靶向肽核心胺基酸序列由選自以下的核酸序列編碼： (a)tacggctacg gcaaccccgc cacccgctac ttcgacgtg (SEQ ID NO：25)；或 (b)tatgcgtatg gcaacccggc gacccgttat tttgatgtg (SEQ ID NO：24)。
在某些具體實施例中，靶向肽核心胺基酸序列由SEQ ID NO：25之核酸序列、或與其至少約70%相同之序列編碼。在某些具體實施例中，靶向肽核心由SEQ ID NO：24之核酸序列、或與其至少約70%相同之序列編碼。在一些具體實施例中，編碼靶向肽核心的核酸序列可選擇地在核心肽序列的核酸序列的5’及/或3’末端處側接延伸連接子的六個至二十一個核苷酸。
在某些具體實施例中，靶向肽核心為YGYGNPATRYFDV (SEQ ID NO：1)。在某些具體實施例中，靶向肽核心為YAYGNPATRYFDV (SEQ ID NO：2)。在某些具體實施例中，靶向肽核心為YKYGNPATRYFDV (SEQ ID NO：3)。在某些具體實施例中，靶向肽核心為YRYGNPATRYFDV (SEQ ID NO：4)。在某些具體實施例中，靶向肽核心為YGHGNPATRYFDV (SEQ ID NO：5)。在某些具體實施例中，靶向肽核心為YGYGNPARRYFDV (SEQ ID NO：6)。在某些具體實施例中，靶向肽核心為YGYGNPAHRYFDV (SEQ ID NO：7)。在某些具體實施例中，靶向肽核心為YGYGNPATRYFDK (SEQ ID NO：8)。在某具體實施例中，在結合物或修飾蛋白質(例如，微小病毒(parvovirus)衣殼)中提供此模體內靶向肽的一個以上拷貝。在某些具體實施例中，存在二個或多個不同的靶向肽核心。
在某具體實施例中，提供有用於靶向腦細胞及/或與腦脊液(CSF)直接接觸的細胞的組成物。在某具體實施例中，提供有用於靶向深部腦中的細胞的組成物。在某具體實施例中，提供有用於靶向脊髓中的細胞的組成物。在某具體實施例中，提供有用於靶向腦及/或脊髓中的細胞同時亦脫靶向於心臟、肺臟、肝臟及/或腎臟組織中的細胞的組成物。在某具體實施例中，提供有用於靶向腦及/或脊髓中的細胞同時亦脫靶向肝臟中的細胞的組成物。此組成物為一種突變體衣殼、融合蛋白或另一結合物，包含至少一個外源性靶向肽，該靶向肽包含：Y-X’-X”-GNPA-X’’-RYFD-X’”模體之胺基酸核心序列(SEQ ID NO：14)，其中X’為G、A、R、K，X”為Y或H，X’”為T、R或H，且X””為V或K，其中靶向肽可選擇在模體的胺基端及/或羧基端處側接二個胺基酸至七個胺基酸，且可選擇進一步結合奈米顆粒、第二分子、或病毒衣殼蛋白。在某些具體實施例中，組成物為突變體衣殼、融合蛋白或另一結合物，包含至少一個外源性靶向肽，該靶向肽包含：YGYGNPATRYFDV之胺基酸核心序列(SEQ ID NO：1)，可選擇在模體的胺基端及/或羧基端處側接二個胺基酸至七個胺基酸，且可選擇進一步結合奈米顆粒、第二分子、或病毒衣殼蛋白。在某些具體實施例中，組成物為突變體衣殼、融合蛋白或另一結合物，包含至少一個外源性靶向肽，該靶向肽包含：YAYGNPATRYFDV之胺基酸核心序列(SEQ ID NO：2)，可選擇在模體的胺基端及/或羧基端處側接二個胺基酸至七個胺基酸，且可選擇進一步結合奈米顆粒、第二分子、或病毒衣殼蛋白。靶向肽包含：(a) YAYGNPATRYFDV (SEQ ID NO：2)；(b) YKYGNPATRYFDV (SEQ ID NO：3)；(c) YRYGNPATRYFDV (SEQ ID NO：4)；(d) YGHGNPATRYFDV (SEQ ID NO：5)；(e) YGYGNPARRYFDV (SEQ ID NO：6)；(f) YGYGNPAHRYFDV (SEQ ID NO：7)；或(g) YGYGNPATRYFDK (SEQ ID NO：8)之核心序列。
下文更詳細地描述用於靶向的適合蛋白質之例，該適合蛋白質包括酶、免疫球蛋白、治療性蛋白質、免疫性多肽、奈米顆粒、DNA、RNA和其它部分(例如，小分子等)。此等及其它生物部分和化學部分適合與本文提供的一個或多個靶向肽使用。
在某些具體實施例中，組成物為核酸序列分子，其中該核酸序列為DNA分子或RNA分子，例如裸DNA(naked DNA)、裸質體DNA、傳訊RNA(mRNA)，含有與核酸分子連接的靶向肽序列模體。在一些具體實施例中，核酸分子進一步與各種組成物及奈米顆粒偶合，包括例如微胞、微脂體、陽離子脂質-核酸組成物、多聚醣組成物及其它聚合物、脂質及/或膽固醇系-核酸結合物、及其它構築體，例如本文所述。參見，例如，WO2014/089486、US 2018/0353616A1、US2013/0037977A1、WO2015/074085A1、US9670152B2、及US 8,853,377B2、X. Su、et al., Mol. Pharmaceutics, 2011, 8 (3), pp 774-787；網路公開出版：2011年3月21日；WO2013/182683、WO 2010/053572及WO 2012/170930，其所有皆藉由引用併入本文。在某些具體實施例中，靶向肽模體化學連接至奈米顆粒表面，其中該奈米顆粒包裹核酸分子。在一些具體實施例中，包含連接至表面的靶向肽的奈米顆粒被設計用於靶向組織特異性遞送。在一些具體實施例中，二個或多個不同的靶向肽與奈米顆粒之表面連接。適合的化學連接或交聯包括彼等本領域技術人員所已知者。 [衣殼]
在某些具體實施例中，提供具有修飾的微小病毒衣殼之重組微小病毒，該衣殼具有至少來自Y-G/A/R/K-Y/H-GNPA-T/R/H-RYFD-V/K (SEQ ID NO：14)核心靶向模體的外源性肽。SEQ ID NO：14中的模體可表示為Y-X’-X”-GNPA-X’’-RYFD-X’”模體，其中X’為G、A、R、K，X”為Y或H，X’”為T、R或H，且X””為V或K。此種重組微小病毒可以是雜交博卡病毒(bocavirus)/AAV或重組AAV載體(rAAV)。在其它具體實施例中，可生產其它病毒載體，具有來自暴露的衣殼蛋白中的Y-G/A/R/K-Y/H-GNPA-T/R/H-RYFD-V/K(SEQ ID NO：14)核心靶向模體(其可相同或不同，或為其組合)的一種或多種外源性靶向肽，與親代載體相比，可調節及/或改變病毒載體的靶向特異性。
靶向肽可在任何適合的位置被插入至高度可變環(HVR) VIII(亦稱為HVR8)中，例如，基於AAV9衣殼的編號，肽在AAV9衣殼蛋白的胺基酸588和589 (Q-A)之間被插入不同長度的連接子，基於AAV9 VP1 (亦稱為Vp1或vp1)胺基酸序列：SEQ ID NO：9之編號。亦參見，WO 2019/168961，於2019年9月6日公開，包括提供AAV9之脫醯胺樣式之表G，及WO 2020/160582，於2018年9月7日申請。胺基酸殘基位置(即，胺基酸編號參考)與AAVhu68 (SEQ ID NO：10)相同。然而，可選擇HVRVIII中的另一位點。或者，可選擇另一外露環HVR(例如，HVRIV)用於插入。可在其它衣殼中選擇可相比的HVR區域。在某些具體實施例中，HVRVIII和HVRIV的位置係使用如美國專利號US 9,737,618 B2 (第15欄第3-23行)及美國專利號US 10,308,958 B2 (第15欄第46行–第16欄第6行)中所述的演算法及/或比對技術確定，其全部內容藉由引用併入本文。在某些具體實施例中，靶向肽可被插入至高度可變環HVRVIII，如美國臨時專利申請號63/119,863中所述，2020年12月1日申請，及國際專利申請號PCT/US2021/061312，2022年12月1日申請，其全部內容藉由引用併入本文。在某些具體實施例中，選擇AAV1衣殼蛋白作為親代衣殼，其中將具有不同長度連接子的靶向肽插入基於vp1編號的胺基酸582至585的HVRVIII區域、或胺基酸456至459的HVRIV區域的適合位置(Gurda, BL., et al., Capsid Antibodies to Different Adeno-Associated Virus Serotypes Bind Common Regions, 2012, Journal of Virology, June 12, 2013, 87(16): 9111-91114)。在某些具體實施例中，選擇AAV8作為親代衣殼，其中將具有不同長度連接子的靶向肽插入基於vp1編號的胺基酸586至591的HVRIV區域的適合位置、或基於vp1編號的胺基酸456至460的HVRIV區域的適合位置(Gurda, BL., et al., Mapping a Neutralizing epitope onto the Capsid of Adeno-Associated Virus Serotype 8, 2012, Journal of Virology, May 16, 2012, 86(15):7739-7751)。
在某些具體實施例中，選擇AAV9作為親代衣殼，其中將具有不同長度連接子的靶向肽插入基於vp1編號的胺基酸588和589(Q-A)之HVRVIII區域的適合位置。在其它具體實施例中，選擇AAVhu68或另一分支群F衣殼作為親代衣殼。在某些具體實施例中，選擇AAV8作為親代衣殼，其中將具有不同長度連接子的靶向肽插入基於vp1編號的胺基酸590及591(N-T)之HVRVIII區域的適合位置。在某些具體實施例中，選擇AAV7作為親代衣殼，其中將具有不同長度連接子的靶向肽插入基於vp1編號的胺基酸589和590 (N-T)之HVRVIII區域的適合位置。在某些具體實施例中，選擇AAV6作為親代衣殼，其中將具有不同長度連接子的靶向肽插入至基於vp1編號的胺基酸588及589之HVRVIII區域的適合位置(S-T)。在某些具體實施例中，選擇AAV5作為親代衣殼，其中將具有不同長度連接子的靶向肽插入至基於vp1編號的胺基酸577及578(T-T)的HVRVIII區域的適合位置。在某些具體實施例中，選擇 AAV4作為親代衣殼，其中將具有不同長度連接子的靶向肽插入至胺基酸586及587(S-N)之HVRVIII區域的適合位置，基於vp1編號。在某些具體實施例中，AAV3/3B選擇作為親代衣殼，其中將具有不同長度連接子的靶向肽插入至胺基酸588及589(N-T)之HVRVIII區域的適合位置，基於vp1編號。在某些具體實施例中，選擇AAV2作為親代衣殼，其中將具有不同長度連接子的靶向肽插入至胺基酸587及589 (N-R)之HVRVIII區域的適合位置，基於vp1編號。在某些具體實施例中，選擇AAV1作為親代衣殼，其中將具有不同長度連接子的靶向肽插入至基於vp1編號的胺基酸588及589(S-T)的HVRVIII區域的適合位置。亦參見圖13，其顯示AA9 (AAV9衣殼的胺基酸566至615；SEQ ID NO：30)、AAV8 (AAV8衣殼的胺基酸565至614；SEQ ID NO：31)、AAV7 (AAV7的胺基酸567至616；SEQ ID NO：32)、AAV6 (AAV6衣殼的胺基酸550至599；SEQ ID NO：33)、AAV5 (AAV5的胺基酸556至605；SEQ ID NO：34)、AAV4 (AAV4衣殼的胺基酸558至607；SEQ ID NO：35)、AAV3B (AAV3B衣殼的胺基酸564至613；SEQ ID NO：36)、AAV2 (AAV2衣殼的胺基酸566至615；SEQ ID NO：37)、及AAV1 (AAV1衣殼的胺基酸566至615；SEQ ID NO：38)之各種AAV衣殼蛋白之胺基酸序列的特定區域的比對，其集中於可以插入靶向肽的區域HVRVIII(基於結構分析)。
在某些具體實施例中，為了增強表現及/或以其它方式調節CNS靶向細胞的類型，親代衣殼修飾成含有Y-G/A/R/K-Y/H-GNPA-T/R/H-RYFD-V/K (SEQ ID NO：14；亦稱為Y-X’-X”-GNPA-X’’-RYFD-X’”，其中X’為G、A、R、K，X”為Y或H，X’”為T、R或H，且X””為V或K)核心靶向模體(具有可選擇的側接序列)選自天然靶向CNS的微小病毒(例如，分支群F AAV (例如，AAVhu68或AAV9)、分支群E (例如，AAV8)、或某些分支群A AAV (例如，AAV1、AAVrh91))衣殼、或非微小病毒衣殼(例如，單純皰疹病毒(herpes simplex virus)等)。在其它具體實施例中，衣殼係選自天生就不靶向CNS的微小病毒(例如，分支群F AAV，例如，AAVhu68或AAV9、或某些分支群A AAV，例如，AAV1、AAVrh91)衣殼、或非微小病毒衣殼(例如，單純皰疹病毒(HSV)等)。參見，例如，WO 2020/223231，2020年11月5日公開(rh91，包括具有脫醯胺樣式的表)、美國臨時專利申請號63/065,616，2020年8月14日申請、美國臨時專利申請號63/109734，2020年11月4日申請、及國際專利申請號 PCT/US21/45945，2021年8月13日申請，現在被公開為WO 2022/036220，其所有皆藉由引用併入本文。在某些具體實施例中，可選擇具有減少的衣殼脫醯胺的AAV衣殼。參見，例如，PCT/US19/19804及PCT/US18/19861，均於2019年2月27日申請，其所有皆藉由引用併入。
在某些具體實施例中，重組腺相關病毒顆粒(rAAV)包含AAV衣殼，其中AAV衣殼不為AAV2衣殼。在某些具體實施例中，rAAV包含AAV衣殼，其中AAV衣殼不為包含NDVRAVS (SEQ ID NO：12)序列的突變的AAV2衣殼。在某些具體實施例中，rAAV包含AAV2衣殼，其中該AAV2衣殼蛋白包含至少一種或多種之外源性肽，具有YGY-GNPA-T/R/H-RYFD-V/K (SEQ ID NO：14；亦稱為Y-X’-X”-GNPA-X’’-RYFD-X’”，其中X’為G、A、R、K，X”為Y或H，X’”為T、R或H，且X””為V或K)核心靶向模體。在某些具體實施例中，rAAV包含AAV2衣殼，其中AAV2衣殼蛋白包含至少一種或多種之外源性肽，具有YGY-GNPA-T/R/H-RYFD-V/K (SEQ ID NO：14)核心靶向模體，其中核心靶向模體可選擇側接N端及/或C端連接子序列。在某些具體實施例中，rAAV包含AAV9衣殼，其中AAV9衣殼蛋白包含至少一種或多種之外源性肽，具有YGY-GNPA-T/R/H-RYFD-V/K (SEQ ID NO：14)核心靶向模體。在某些具體實施例中，rAAV包含AAV9衣殼，其中AAV9衣殼蛋白包含至少一種或多種之外源性肽，具有YGY-GNPA-T/R/H-RYFD-V/K (SEQ ID NO：14)核心靶向模體，其中核心靶向模體可選擇側接N端及/或C端連接子序列。在某些具體實施例中，rAAV包含AAVhu68衣殼，其中AAVhu68衣殼蛋白包含至少一種或多種之外源性肽，具有YGY-GNPA-T/R/H-RYFD-V/K (SEQ ID NO：14)核心靶向模體。在某些具體實施例中，rAAV包含AAVhu68衣殼，其中AAVhu68衣殼蛋白包含至少一種或多種之外源性肽，具有YGY-GNPA-T/R/H-RYFD-V/K (SEQ ID NO：14)核心靶向模體，其中核心靶向模體可選擇側接N端及/或C端連接子序列。
在某些具體實施例中，rAAV包含AAV9衣殼，其中AAV9衣殼蛋白包含至少一種或多種之外源性肽，具有YGYGNPATRYFDV (「YGY」；SEQ ID NO：1)核心靶向模體。在某些具體實施例中，rAAV包含AAV9衣殼，其中AAV9衣殼蛋白包含至少一種或多種之外源性肽，具有YGYGNPATRYFDV (「YGY」；SEQ ID NO：1)核心靶向模體，其中核心靶向模體可選擇側接N端及/或C端連接子序列。
在某些具體實施例中，rAAV包含AAV9衣殼，其中AAV9衣殼蛋白包含至少一種或多種之外源性肽，具有YAYGNPATRYFDV (「YGY2A」；SEQ ID NO：2)核心靶向模體。在某些具體實施例中，rAAV包含AAV9衣殼，其中AAV9衣殼蛋白包含至少一種或多種之外源性肽，具有YAYGNPATRYFDV (「YGY2A」；SEQ ID NO：2)核心靶向模體，其中核心靶向模體可選擇側接N端及/或C端連接子序列。
如此，本文提供經工程化的AAV-9衣殼，包括例如，AAV9-YGY衣殼，其由SEQ ID NO：28之核酸序列、或編碼SEQ ID NO：29之胺基酸序列之與SEQ ID NO：28至少約70%相同之序列表現。在某些具體實施例中，衣殼為AAV9-YGY2A衣殼，其由SEQ ID NO：26之核酸序列、或編碼SEQ ID NO：27之胺基酸序列之與SEQ ID NO：26至少約70%相同之序列表現。
例如，可選擇來自分支群F AAV的衣殼，諸如來自AAVhu68或AAV9。產生具有AAV9衣殼或AAVhu68衣殼及/或源自AAV9的嵌合衣殼之載體的方法已被描述。參見，例如，US 7,906,111，其藉由引用併入本文。亦參見，美國臨時專利申請號63/093,275，2020年10月18日申請，其藉由引用併入本文。可選擇轉導鼻細胞或另一適合標靶(例如肌肉或肺臟)的其它AAV血清型作為 AAV病毒載體衣殼的來源，包括例如，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、rh10、AAVrh64R1、AAVrh64R2、rh8、AAVrh32.33 (參見，例如，美國公開專利申請號2007-0036760-A1；美國公開專利申請號2009-0197338-A1；及EP 1310571)。亦參見，WO 2003/042397 (AAV7及其它猴AAV)、美國專利號7790449及美國專利號7282199 (AAV8)、WO 2005/033321 (AAV9)、及WO 2006/110689、或有待發現，或基於其等之重組AAV，可用作AAV衣殼的來源。參見，例如，WO 2020/223232 A1 (AAV rh90)、WO 2020/223231 A1國際申請號PCT/US21/45945，2021年8月13日申請(AAV rh91)、及WO 2020/223236 A1 (AAV rh92、AAV rh93、AAV rh91.93)，其全部內容藉由引用併入本文。這些文件亦描述了可選擇用於生成AAV的其它AAV，並藉由引用併入。在一些具體實施例中，用於病毒載體的AAV衣殼(cap)可藉由上述AAV cap之一或其編碼核酸的誘變(即，藉由插入、缺失或取代)產生。在一些具體實施例中，AAV衣殼是嵌合的，包含來自上述AAV衣殼蛋白中的二個或三個或四個或更多個的結構域。在一些具體實施例中，AAV衣殼為來自二種或三種不同AAV或重組AAV之Vpl、Vp2及Vp3單體的鑲嵌體。在一些具體實施例中，rAAV組成物包含超過一種的前述cap。
如本文所使用，術語「分支群」係指在譜系上彼此相關的一組AAV，如使用鄰位連接(Neighbor-Joining)演算法藉由至少75% (至少1000次重複)的自助重抽法(bootstrap)數值，及基於AAV vp1胺基酸序列的比對，泊松(Poisson)校正距離測量值不超過0.05來確定。鄰位連接演算已敘述於文獻中。參見，例如，M. Nei and S. Kumar, Molecular Evolution and Phylogenetics (Oxford University Press, New York (2000) 。可使用電腦程式來實現該演算法。例如，MEGA v2.1程式實現修改後的Nei-Gojobori方法。使用這些技術和電腦程式，以及AAV vp1衣殼蛋白的序列，本領域技術人員可容易地確定選定的AAV是否包含在本文鑑定的一個分支群中、另一個分支群中，或在這些分支群之外。參見，例如，G Gao, et al, J Virol, 2004 Jun；78(12): 6381-6388，其識別分支群A、B、C、D、E及F，提供新穎的AAV的核酸序列，GenBank登錄號AY530553至AY530629。亦參見，WO 2005/033321。
如本文所使用，「AAV9衣殼」是一種由多種AAV9 vp蛋白構成的自組裝AAV衣殼。AAV9 vp蛋白通常表現為可供選擇的剪接變異體，該剪接變異體藉由編碼GenBank登錄號：AAS99264之vp1胺基酸序列的核酸序列所編碼。此等剪接變異體產生不同長度的蛋白質。在某些具體實施例中，「AAV9衣殼」包括具有與AAS99264 99%相同的胺基酸序列或與其99%相同之的胺基酸序列的AAV。亦參見，WO 2019/168961，公開於2019年9月6日，包括提供AAV9脫醯胺樣式的表G。亦參見，US7906111及WO 2005/033321。當指定時，「AAV9變異體」可包括例如於WO2016/049230、US 8,927,514、US 2015/0344911及US 8,734,809中所描述的彼等。
rAAVhu68由AAVhu68衣殼及載體基因體構成。AAVhu68衣殼為vp1蛋白異源群體、vp2蛋白異源群體和vp3蛋白異源群體的組件。如本文所使用，當用於指稱vp衣殼蛋白時，術語「異源」或其任何語法上的變化係指由不同元件組成的群體，例如具有不同修飾胺基酸序列的vp1、vp2或vp3單體(蛋白質)。亦參見，PCT/US2018/019992、WO 2018/160582，標題為「Adeno-Associated Virus (AAV) Clade F Vector and Uses Therefor」，且其等全部內容藉由引用併入本文。
對於其它重組病毒載體，選擇負責靶向特異性的病毒衣殼或套膜蛋白的適合暴露部分以插入靶向肽。例如，在腺病毒中，可能需要修飾六鄰體蛋白(hexon protein)。在慢病毒(lentivirus)中，套膜融合蛋白可經修飾包含靶向模體的一個或多個拷貝。對於牛痘病毒(vaccinia virus)，主要的醣蛋白可經修飾包含靶向模體的一個或多個拷貝。適當地，出於安全目的，此等重組病毒載體為複製缺陷型的。 [表現匣及載體]
包裝於AAV衣殼中並遞送到宿主細胞的載體基因體序列通常由(最低限度)轉基因及其調控序列和AAV反向末端重複(ITR)組成。單股AAV及自我互補(self-complementary；sc) AAV二者皆包含在rAAV中。轉基因為一種與載體序列異源之核酸編碼序列，其編碼目的多肽、蛋白質、功能性RNA分子(例如，miRNA、miRNA抑制劑)或其它基因產物。核酸編碼序列係以允許轉基因在目標組織的細胞中轉錄、轉譯及/或表現的方式與調節成分可操作地連接。
載體的AAV序列通常包含順式作用的AAV5’及AAV3’反向末端重複(ITR)序列(參見，例如，B. J. Carter, in “Handbook of Parvoviruses”, ed., P. Tijsser, CRC Press, pp. 155 168 (1990))。ITR序列長度為約145個鹼基對(bp)。較佳地，實質上編碼ITR的整個序列都被使用在分子中，儘管此等序列的某些程度上的微小修飾是允許的。修飾此等ITR序列的能力為本領域的技術範圍內(參見，例如，如下列文本：Sambrook et al, “Molecular Cloning. A Laboratory Manual”, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989)；及K. Fisher et al., J. Virol., 70：520 532 (1996))。在本發明中使用的這種分子的一例為含有轉基因的「順式作用」質體，其中所選擇的轉基因序列和相關的調節元件側接5’和3’ AAV ITR序列。在一具體實施例中，ITR來自與提供衣殼的AAV不同的AAV。在一具體實施例中，ITR序列來自AAV2。然而，可選擇來自其它AAV來源的ITR。已經描述被稱為ΔITR的5’ ITR的縮短版本，其中刪除了D-序列和末端解析位點(terminal resolution site；trs)。在某些具體實施例中，載體基因體包括縮短的130個鹼基對之AAV2 ITR，其中外部A元件被刪除。不欲受理論束縛，咸信使用內部(A’)元件作為模板進行載體DNA擴增的過程中，縮短的ITR可能會恢復成145個鹼基對的野生型長度。在其它具體實施例中，使用全長AAV 5’及3’ ITR。當ITR的來源是AAV2，而AAV衣殼來自另一AAV來源時，所生成的載體可稱為假型化的(pseudotyped)。然而，此等元件的其它配置可能是適當的。
除了上述確定的重組AAV載體的主要元件外，該載體亦包括必需的習知控制元件，其以允許轉基因在用質體載體轉染或用本發明所生產的病毒感染的細胞中轉錄、轉譯及/或表現的方式與轉基因可操作地連接。如本文所使用，「可操作地連接的」序列包括與目的基因相鄰的表現控制序列、及反向或遠距離起作用以控制目的基因的表現控制序列。
調節控制元件通常含有啟動子序列作為表現控制序列的一部分，例如，位於所選擇的5’ ITR序列及編碼序列之間。可以使用組成型啟動子、調節型啟動子[參見例如，WO2011/126808及WO2013/04943]、組織特異性啟動子或對生理提示有反應的啟動子可被用於本文所述的載體。
適用於控制治療產物表現的組成型啟動子之例包括但不限於雞β-肌動蛋白(CB)啟動子、CB7啟動子(包含CMV IE增強子及CB啟動子，可選擇以連接子序列連接)、人類巨細胞病毒(CMV)啟動子、泛蛋白C啟動子(UbC)、猴病毒40(SV40)的早期及晚期啟動子、U6啟動子、金屬硫蛋白啟動子、EFlα啟動子、泛蛋白啟動子、次黃嘌呤磷醣基核苷轉移酶(HPRT)啟動子、二氫葉酸還原酶(DHFR)啟動子(Scharfmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4626-4630 (1991)、腺苷脫胺酶啟動子、磷甘油激酶(phosphoglycerol kinase)(PGK)啟動子、丙酮酸激酶啟動子、磷甘油變位酶啟動子、β-肌動蛋白啟動子(Lai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10006-10010 (1989))、莫洛尼(Moloney)白血病病毒及其它反轉錄病毒之末端長重複序列(LTR)、單純皰疹病毒的胸苷激酶啟動子和本領域技術人員已知的其它組成型啟動子。適用於本發明的組織或細胞特異性啟動子之例包括但不限於內皮素-I(endothelin-I)(ET-I)和Flt-I，其對內皮細胞、FoxJ1 (靶向纖毛細胞)具有特異性。適用於本發明的組織特異性啟動子的其它例包括但不限於肝臟特異性啟動子。肝臟特異性啟動子之例可包括例如，甲狀腺素結合球蛋白(TBG)、白蛋白，Miyatake et al., (1997) J. Virol., 71:5124 32；B型肝炎病毒核心啟動子，Sandig et al., (1996) Gene Ther., 3:1002 9；或人類α1-抗胰蛋白酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase)(PECK)、或α胎兒蛋白(alpha fetoprotein)(AFP)，Arbuthnot et al., (1996) Hum. Gene Ther., 7:1503 14)。在某些具體實施例中，啟動子為組織特異性(例如，神經元特異性)啟動子。在某些具體實施例中，適合的啟動子可無限制而包括延伸因子1α(EF1 alpha)啟動子(參見，例如，Kim DW et al, Use of the human elongation factor 1 alpha promoter as a versatile and efficient expression system. Gene. 1990 Jul 16；91(2):217-23)、突觸素1(Synapsin 1)啟動子(參見，例如，Kügler S et al, Human synapsin 1 gene promoter confers highly neuron-specific long-term transgene expression from an adenoviral vector in the adult rat brain depending on the transduced area. Gene Ther. 2003 Feb；10(4):337-47)、縮短的突觸素啟動子、神經元特異性烯醇酶(NSE)啟動子(參見，例如，Kim J et al, Involvement of cholesterol-rich lipid rafts in interleukin-6-induced neuroendocrine differentiation of LNCaP prostate cancer cells. Endocrinology. 2004 Feb；145(2):613-9. Epub 2003 Oct 16)、或CB6啟動子(參見，例如，Large-Scale Production of Adeno-Associated Viral Vector Serotype-9 Carrying the Human Survival Motor Neuron Gene, Mol. Biotechnol. 2016 Jan；58(1):30-6. doi: 10.1007/s12033-015-9899-5)。較佳地，此類啟動子為人類來源。
適用於控制治療性產物表現的誘導型啟動子包括對外源性試劑(例如，藥理學試劑)或生理信號有反應的啟動子。此等反應元件包括但不限於結合HIF-1α和β的缺氧反應元件(HRE)，金屬離子反應元件，諸如Mayo et al. (1982, Cell 29:99-108)；Brinster et al. (1982, Nature 296:39-42)及Searle et al .(1985, Mol. Cell. Biol. 5:1480-1489)所述者；或熱休克反應元件，諸如 Nouer et al .(in: Heat Shock Response, ed. Nouer, L., CRC, Boca Raton, Fla., ppI67-220, 1991)所述者。
在一具體實施例中，基因產物的表現由調節型啟動子控制，該啟動子提供對編碼基因產物之序列的轉錄的嚴格控制，例如，藥理學試劑，或由藥理學試劑活化的轉錄因子，或在替代的具體實施例中，為生理信號。較佳為無洩漏且可嚴格控制的啟動子系統。可用於本發明作為配體依賴性轉錄因子複合物的調節型啟動子之例包括但不限於由其各自配體(例如糖皮質激素、雌激素、助孕素、維生素A酸、蛻皮激素及其等類似物和模擬物)活化的核受體超家族的成員和被四環素活化的rTTA。在本發明的一態樣，基因開關係基於EcR的基因開關。此種系統之例包括但不限於敘述於美國專利號6,258,603、7,045,315、美國公開專利申請號2006/0014711、2007/0161086、及國際公開申請號WO 01/70816。嵌合蛻皮激素受體系統之例敘述於美國專利號7,091,038、美國公開專利申請號2002/0110861、2004/0033600、2004/0096942、2005/0266457、及2006/0100416、及國際公開申請號WO 01/70816、WO 02/066612、WO 02/066613、WO 02/066614、WO 02/066615、WO 02/29075、及WO 2005/108617，其每一者皆藉由引用而整體併入。非類固醇型蛻皮激素激動劑調節系統之例為RheoSwitch® Mammalian Inducible Expression System (New England Biolabs, Ipswich, MA)。
又其它啟動子系統可包括反應元件，該反應元件包括但不限於四環素(tet)反應元件(諸如敘述於Gossen & Bujard (1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-551)；或荷爾蒙反應元件，諸如Lee et al. (1981, Nature 294:228-232)；Hynes et al. (1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2038-2042)；Klock et al. (1987, Nature 329:734-736)；及Israel & Kaufman (1989, Nucl. Acids Res. 17:2589-2604)所述及本技術領域已知的其它誘導型啟動子。使用此類啟動子，可溶性hACE2構築體的表現可例如藉由以下控制：Tet-on/off系統(Gossen et al., 1995, Science 268:1766-9；Gossen et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 89(12):5547-51)；TetR-KRAB系統 (Urrutia R., 2003, Genome Biol., 4(10):231；Deuschle U et al., 1995, Mol Cell Biol. (4):1907-14)；美服培酮(mifepristone)(RU486)可調節系統(Geneswitch；Wang Y et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91(17):8180-4；Schillinger et al., 2005, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A.102(39):13789-94)；及人源化泰莫西芬(tamoxifen)依賴性調節系統(Roscilli et al., 2002, Mol. Ther. 6(5):653-63)。
於另一態樣，基因開關基於FK506結合蛋白(FKBP)與FKBP雷帕黴素(rapamycin)相關蛋白(FRAP)的異二聚化，且藉由雷帕黴素或其非免疫抑制類似物進行調節。此類系統之例包括但不限於 ARGENT™轉錄技術(ARIAD Pharmaceuticals, Cambridge, Mass.)及敘述於下列中之系統：美國專利號6,015,709、6,117,680、6,479,653、6,187,757、及6,649,595、美國公開號2002/0173474、美國公開號200910100535、美國專利號5,834,266、美國專利號7,109,317、美國專利號7,485,441、美國專利號5,830,462、美國專利號5,869,337、美國專利號5,871,753、美國專利號6,011,018、美國專利號6,043,082、美國專利號6,046,047、美國專利號6,063,625、美國專利號6,140,120、美國專利號6,165,787、美國專利號6,972,193、美國專利號6,326,166、美國專利號7,008,780、美國專利號6,133,456、美國專利號6,150,527、美國專利號6,506,379、美國專利號6,258,823、美國專利號6,693,189、美國專利號6,127,521、美國專利號6,150,137、美國專利號6,464,974、美國專利號6,509,152、美國專利號6,015,709、美國專利號6,117,680、美國專利號6,479,653、美國專利號6,187,757、美國專利號6,649,595、美國專利號6,984,635、美國專利號7,067,526、美國專利號7,196,192、美國專利號6,476,200、美國專利號6,492,106、WO 94/18347、WO 96/20951、WO 96/06097、WO 97/31898、WO 96/41865、WO 98/02441、WO 95/33052、WO 99110508、WO 99110510、WO 99/36553、WO 99/41258、WO 01114387、ARGENT™調節轉錄反轉錄病毒套組，2.0版(9109102)、及ARGENT™調節轉錄質體套組，2.0版(9109/02)，其全部內容各藉由引用併入本文。Ariad系統被設計為由雷帕黴素及其稱為「雷帕黴素類似物(rapalogs)」的類似物誘導。與ARGENT™系統的描述相關的上述文件中提供適合的雷帕黴素之例。在一具體實施例中，分子為雷帕黴素[例如 ，Pfizer以Rapamune™銷售]。在另一具體實施例中，使用稱為AP21967 [ARIAD]之雷帕黴素類似物。可用於本發明的這些二聚體分子之例包括但不限於雷帕黴素、FK506、FK1012 (FK506的同型二聚體)、雷帕黴素類似物(「rapalogs」)，其等很容易藉由天然產物的化學修飾來製備以增加「凸起(bump)」，其減少或消除對內源性FKBP及/或FRAP的親和力。雷帕黴素類似物之例包括但不限於諸如AP26113 (Ariad)、AP1510 (Amara, J.F., et al., 1997, Proc Natl Acad Sci USA, 94(20): 10618-23) AP22660、AP22594、AP21370、AP22594、AP23054、AP1855、AP1856、AP1701、AP1861、AP1692及AP1889，具有設計的「凸起」，可最小化與內源性FKBP的相互作用。可以選擇另外其它雷帕黴素類似物，例如 ，AP23573 [Merck]。在某些具體實施例中，可將雷帕黴素或適合的類似物局部遞送至鼻咽的經AAV轉染的細胞。這種局部遞送可藉由鼻內注射，經由推注、乳膏或凝膠局部遞送至細胞。參見美國專利申請號US2019/0216841 A1，其藉由引用併入本文。
其它適當的增強子包括彼等適於所欲目標組織適應症者。在一具體實施例中，表現匣包含一種或多種表現增強子。在一具體實施例中，表現匣含有二或多個表現增強子。此等增強子可彼此相同或相異。例如，增強子可包括CMV立即早期增強子。此增強子可存在於彼此相鄰的二個拷貝中。或者，增強子的雙重拷貝可藉由一或多序列分開。在另外的具體實施例中，表現匣進一步含有內含子，例如，雞β-肌動蛋白內含子。其它適當的內含子包括技術領域中所知者，例如，諸如WO 2011/126808中所述者。適合的多腺苷酸化(polyA)序列之例包括例如，兔β球蛋白(rBG)、SV40、SV50、牛生長激素(bGH)、人類生長激素及合成polyA。可選擇地，可選擇一或多種序列以穩定mRNA。此種序列之例為經修飾之WPRE序列，其可被工程化於polyA序列的上游及編碼序列之下游[參見例如，MA Zanta-Boussif, et al, Gene Therapy (2009) 16: 605-619)。
在某些具體實施例中，表現匣可包括一個或多個表現增強子，如來自土撥鼠的肝炎病毒之轉錄後調節元件(WPRE)、來自人類的肝炎病毒之轉錄後調節元件(HPRE)、來自地松鼠的肝炎病毒之轉錄後調節元件(GPRE)或來自北極地松鼠的肝炎病毒之轉錄後調節元件(AGSPRE)；或合成的轉錄後調節元件。當置於3' UTR時此等表現強化元件特別有利且可顯著地增加mRNA穩定性及/或蛋白質產量。在某些具體實施例中，提供的表現匣包括為土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件(WPRE)或其變異體的調控序列。適合的WPRE序列被提供於本文所述的載體基因體且為本技術領域已知(例如，如彼等描述於美國專利號6,136,597、6,287,814、及7,419,829，其藉由引用而併入)。在某些具體實施例中，WPRE為一種變異體，其經突變以消除土撥鼠B型肝炎病毒X(WHX)蛋白質的表現，包括例如WHX基因之起始密碼子的突變。在某些具體實施例中，經修飾的WPRE元件被工程化以消除WHX蛋白質的表現，其中經修飾的WPRE為於WHX基因的推定的啟動子區域中含有5點突變且與WHX基因的起始密碼子中的另外的突變(ATG突變成TTG)一起的突變版。基於用含有WPRE-GFP融合構築體的慢病毒轉導的各種人類細胞系的敏感性流式細胞術分析，認為這種突變WPRE足以消除截短的WHX蛋白質的表現(Zanta-Boussif et al., 2009)。亦參見，Kingsman S.M., Mitrophanous K., & Olsen J.C. (2005), Potential Oncogene Activity of the Woodchuck Hepatitis Post-Transcriptional Regulatory Element (Wpre)." Gene Ther. 12(1):3-4；及Zanta-Boussif M.A., Charrier S., Brice-Ouzet A., Martin S., Opolon P., Thrasher A.J., Hope T.J., & Galy A. (2009), Validation of a Mutated Pre-Sequence Allowing High and Sustained Transgene Expression While Abrogating Whv-X Protein Synthesis: Application to the Gene Therapy of Was, Gene Ther. 16(5):605-19，其兩者內容藉由引用併入本文。在某些具體實施例中，WPRE元件包含GenBank: J02442.1之核苷酸1093至1683(591個核苷酸；SEQ ID NO：40)。在某些具體實施例中，WPRE元件包含SEQ ID NO：39之核酸序列。在其它具體實施例中，從非病毒來源選擇增強子。在某些具體實施例中，無WPRE序列存在。
AAV病毒載體可包括多個轉基因。在某些具體實施例中，轉基因可用於改正或改善基因缺陷，其可包括正常基因表現低於正常水平的缺陷或功能基因產物不被表現的缺陷。或者，轉基因可向細胞提供在細胞類型或宿主中不會天然表現的產物。較佳類型的轉基因序列編碼在宿主細胞中表現的治療性蛋白質或多肽。本發明進一步包括使用多種轉基因。在某些情況下，不同的轉基因可用於編碼蛋白質的每個次單元，或編碼不同的肽或蛋白質。當編碼蛋白質次單元的DNA的大小很大時，例如對於免疫球蛋白、血小板衍生的生長因子或肌肉萎縮蛋白(dystrophin)蛋白質，此為理想的。在某些情形，不同的轉基因可用於編碼蛋白質的各個次單元 (例如，免疫球蛋白域、免疫球蛋白重鏈、免疫球蛋白輕鏈)。在一具體實施例中，在以含有各個不同次單元的病毒感染/轉染後，細胞產生多種次單元蛋白。在另一具體實施例中，蛋白質的不同次單元可能由相同的轉基因編碼。當編碼各個次單元的DNA的大小很小時，IRES是理想的，例如，編碼次單元和IRES的DNA的總體大小小於5 kbp。作為IRES的替代方案，DNA可被編碼2A肽之序列分離，該2A肽在轉譯後事件中自我切割。參見，例如，ML Donnelly, et al, (Jan 1997) J. Gen. Virol ., 78(Pt 1):13-21；S. Furler, S et al, (June 2001) Gene Ther., 8(11):864-873；H. Klump, et al., (May 2001) Gene Ther., 8(10):811-817。此2A肽顯著地小於IRES，因此非常適合在當空間為一個限制因子的情況下使用。更常見的是，當轉基因較大，由多個次單元組成、或二個轉基因被共同遞送時，攜帶所需轉基因(一個或多個)或次單元(多個)的rAAV被共同投予以允許它們在活體內鏈聯化以形成單個載體基因體。在此種具體實施例中，第一AAV可攜帶表現單個轉基因的表現匣，第二AAV可攜帶表現不同轉基因的表現匣，用於在宿主細胞中共表現。然而，選擇的轉基因可編碼任何生物活性產物或其它產物，例如研究所需的產物。然而，選擇的轉基因可編碼任何生物活性產物或其它產物，例如研究所需的產物。
除了用於表現匣的上述定義之元件外，載體亦包括習知控制元件，該習知控制元件以允許編碼產物(例如，UBE3A構築體、在Angelman小鼠模型中的基因替代療法；參見，美國臨時專利申請號63/119,860，2020年12月1日申請，其藉由引用併入本文)在用體載體轉染或用本發明產生的病毒感染的細胞中轉錄、轉譯及/或表現的方式可操作地連接編碼序列。本文提供其它適合轉基因的示例。如本文中所使用，「可操作地連接的」序列包括與目的基因相鄰的表現控制序列、及反向或遠距離起作用以控制目的基因的表現控制序列。
表現控制序列包括適當的增強子；轉錄因子；轉錄終止子；啟動子；高效RNA處理訊息，例如剪接和多腺苷酸化(polyA)訊息；穩定細胞質mRNA之序列，例如土撥鼠肝炎病毒(WHP)轉錄後調節元件(WPRE)；提高轉譯效率之序列(即，Kozak共通序列)；增強蛋白質穩定性之序列；及當需要時，增強編碼產物分泌的序列。在一具體實施例中，選擇調控序列以使總rAAV載體基因體大小為約2.0至約5.5kb。在一具體實施例中，期望之rAAV載體基因體的大小是接近天然AAV基因體的大小。如此，在一具體實施例中，選擇調控序列以使總rAAV載體基因體的大小為約4.7kb。在另一具體實施例中，總rAAV載體基因體大小小於約5.2kb。載體基因體的大小可基於包括啟動子、增強子、內含子、poly A等調控序列的大小而進行操作。參見，Wu et al, Mol Ther, Jan 2010 18(1):80-6，其藉由引用併入本文。
因此，在一具體實施例中，內含子包含於載體中。適合的內含子包括雞β-肌動蛋白內含子、人類β球蛋白IVS2(Kelly et al, Nucleic Acids Research, 43(9):4721-32 (2015))；Promega嵌合內含子(Almond, B. and Schenborn, E. T. A Comparison of pCI-neo Vector and pcDNA4/HisMax Vector)；及hFIX內含子。適用於本文的各種內含子為本領域已知的，且包括但不限於在bpg.utoledo.edu/~afedorov/lab/eid.html中所發現的那些，其藉由引用併入本文。亦參見，Shepelev V., Fedorov A. Advances in the Exon-Intron Database. Briefings in Bioinformatics 2006, 7: 178-185，其藉由引用併入本文。
在某些具體實施例中，選擇地在其3’ UTR及/或其5’ UTR，突變體rAAV包含表現匣，該表現匣進一步包含至少一個miRNA標的序列，其可操作地連接至選擇的轉基因。在某些具體實施例中，miRNA為背根神經節(drg)-特異性miRNA標的序列。在某些具體實施例中，核酸序列進一步包含背根神經節(drg)特異性miRNA標的序列之至少一個、至少二個、至少三個或較佳至少四個縱排重複序列(tandem repeats)。在某些具體實施例中，該核酸序列進一步包含背根神經節(drg)-特異性miRNA標的序列之至少一個、至少二個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個或至少八個縱排重複序列。參見，例如，PCT/US19/67872，2019年12月20日申請，及現已公開為WO 2020/132455，其藉由引用而併入本文。亦參見，國際專利申請號PCT/US21/32003，2021年5月12日申請，及現已公開為WO2021/231579A1，其藉由引用而併入本文。亦參見，美國臨時專利申請號63/279,561，2021年11月15日申請，其藉由引用完整併入本文。
在本文所述的研究中產生數種不同的病毒基因體。然而，本領域技術人員將理解包括其它調控序列的其它基因體構型可替代啟動子、增強子，並可選擇其它編碼序列。 [rAAV載體生產]
為了用於生產AAV病毒載體(例如，重組(r)AAV)，可將表現匣攜帶在遞送至包裝宿主細胞(packaging host cell)的任何適當的載體，例如質體。有用於本發明的質體可被工程化，從而使其適於在原核細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞等活體外複製及包裝。適當的轉染技術和包裝宿主細胞為已知，及/或可被熟悉技術者容易地設計。
在某些具體實施例中，包含至少一個拷貝之Y-G/A/R/K-Y/H-GNPA-T/R/H-RYFD-V/K核心靶向模體(亦稱為Y-X’-X”-GNPA-X’’-RYFD-X’”模體，其中X’為G、A、R、K，X”為Y或H，X’”為T、R或H，且X””為V或K；SEQ ID NO：14)至AAV衣殼中提供生產上的優點，與未包含至少一個拷貝之模體至AAV衣殼中的方法相比，其中生產細胞為293細胞。在某些具體實施例中，用於生產包含rep序列及cap序列的重組AAV之編碼AAV衣殼的核酸序列包含SEQ ID NO：18或至少90%、95%、98%、99%、99.9%、100% (或它們之間的任何值)與SEQ ID NO：18相同的序列(即，包含AAV2 rep及AAV9-YGY-修飾的cap)。在某些具體實施例中，用於生產包含rep序列及cap序列的重組AAV之編碼AAV衣殼的核酸序列包含SEQ ID NO：21或與SEQ ID NO：21至少90%、95%、98%、99%、99.9%、100% (或它們之間的任何值)相同的序列(即，包含AAV2 rep及AAV9-YGY2A-修飾的cap)。
製備基於AAV之載體(例如，具有AAV9或另一AAV衣殼)的方法為已知。參見，例如，美國公開專利申請號2007/0036760 (2007年2月15日)，其藉由引用併入本文。本發明不限於使用AAV9或其它分支群F AAV胺基酸序列，而是包括藉由本技術領域已知的其它方法產生的含有末端β-半乳糖結合的肽及/或蛋白質，包括，例如，藉由化學合成、藉由其它合成技術或藉由其它方法。本文提供的任何AAV衣殼的序列可使用多種技術容易地產生。適合的生產技術為本領域技術人員所熟知。參見，例如，Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor, NY)。或者，肽亦可藉由熟知的固相肽合成方法合成(Merrifield, (1962) J. Am. Chem. Soc ., 85:2149；Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis (Freeman, San Francisco, 1969) pp. 27-62)。此等方法可涉及例如，培養宿主細胞，該宿主細胞含有編碼AAV衣殼之核酸序列；功能性rep基因；至少由AAV反向末端重複(ITR)和轉基因所構成的袖珍基因；及足夠的輔助功能以允許將袖珍基因包裝至AAV衣殼蛋白中。此等及其它適合的生產方法是在本領域技術人員的知識範圍內且並不對本發明構成限制。
需要在宿主細胞中培養以將AAV袖珍基因包裝在AAV衣殼中的組分可以反式提供給宿主細胞。或者，任何一種或多種所需組分(例如，袖珍基因、rep序列、cap序列及/或輔助功能)可由穩定的宿主細胞提供，該宿主細胞已使用本領域技術人員已知的方法工程化為含有一種或多種所需組分。最適合地，此種穩定的宿主細胞將包含在誘導型啟動子控制下的所需組分。然而，所需的組分可能在組成型啟動子的控制之下。在討論適用於轉基因的調控元件時，本文提供適合的誘導型和組成型啟動子之例。在另一個替代方案中，選定的穩定宿主細胞可包含在組成型啟動子控制下的選定組分和在一種或多種誘導型啟動子控制下的其它選定組分。例如，可產生穩定的宿主細胞，其衍生自293細胞(其包含在組成型啟動子控制下的E1輔助功能)，但其包含在誘導型啟動子控制下的rep及/或cap蛋白。本領域技術人員亦可產生其它穩定的宿主細胞。
此等rAAV特別適合用於治療目的和預防感染的基因遞送。此外，本發明的組成物亦可用於活體外生產所需的基因產物。對於活體外生產，在以含有編碼所需產物之分子的rAAV轉染宿主細胞，並在允許表現的條件下培養細胞培養物後，可從所需培養物獲得所需產物(例如蛋白質)。然後可根據需要純化及分離表現的產物。用於轉染、細胞培養、純化及分離的適合技術為本領域技術人員已知。用於產生和分離適合用作載體的AAV的方法為本領域已知。一般參見，例如，Grieger & Samulski, 2005, " Adeno-associated virus as a gene therapy vector: Vector development, production and clinical applications," Adv. Biochem. Engin/Biotechnol. 99: 119-145；Buning et al., 2008, "Recent developments in adeno-associated virus vector technology," J. Gene Med. 10:717-733；及以下所引用的參考文獻，其全部內容各藉由引用併入本文。為了將轉基因包裝到病毒體中，ITR是與包含表現匣之核酸分子在同一構築體中順式所需的唯一AAV成分。cap及rep基因可反式提供。
在一具體實施例中，本文所述之表現匣被工程化至遺傳元件(例如穿梭質體(shuttle plasmid))中，其將其上攜帶的免疫球蛋白構築體序列轉移至包裝宿主細胞中以產生病毒載體。在一具體實施例中，可藉由任何適合的方法將選定的遺傳元件遞送至AAV包裝細胞，包括轉染、電穿孔、微脂體遞送、膜融合技術、高速DNA包覆的小丸、病毒感染和原生質體融合。也可以製造穩定的AAV包裝細胞。或者，表現匣可用於產生除AAV之外的病毒載體，或用於活體外產生抗體混合物。用於製造此類構築體的方法是核酸操作技術人員已知的，包括基因工程、重組工程和合成技術。參見，例如 ，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ed. Green and Sambrook, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2012)。
術語「AAV中間體」或「AAV載體中間體」係指組裝的rAAV衣殼，其缺少包裝在其中的所需基因體序列。此等亦可稱為「空」衣殼。此類衣殼可不包含表現匣的可檢測基因體序列，或僅包含不足以達到基因產物之表現的部分包裝之基因體序列。這些空衣殼無法將感興趣的基因轉移至宿主細胞中。
本文所述之重組AAV可使用已知技術產生。參見，例如，WO 2003/042397；WO 2005/033321、WO 2006/110689；US 7588772 B2。此類方法涉及培養宿主細胞，其含有編碼AAV衣殼之核酸序列；功能性rep基因；至少由AAV反向末端重複(ITR)和轉基因所構成的表現匣；及足夠的輔助功能以允許將表現匣包裝至AAV衣殼蛋白中。產生衣殼的方法、編碼序列，因而生產rAAV病毒載體的方法已被描述。參見，例如，Gao, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (10), 6081-6086 (2003)及US 2013/0045186A1。
在一具體實施例中，細胞在適合的細胞培養物中製造(例如，HEK 293細胞)。用於製造本文所述之基因治療載體的方法包括本技術領域熟知的方法，例如用於生產基因治療載體的質體DNA的產生、載體的產生和載體的純化。在一些具體實施例中，基因治療載體為AAV載體且產生的質體為編碼AAV基因體和用於 包裝至衣殼中的目的基因的AAV順式質體、含有AAV rep和cap基因的AAV反式質體和腺病毒輔助質體。載體產生製程可包括方法步驟諸如細胞培養的開始、細胞繼代、細胞接種、以質體DNA轉染細胞、轉染後培養基更換為無血清培養基、及收穫含載體之細胞和培養基。收穫的含有載體的細胞和培養基在本文中稱為粗細胞收穫物。在另一系統中，基因治療載體藉由以基於桿狀病毒的載體感染而被引入昆蟲細胞中。有關這些生產系統的評論，一般參見，例如，Zhang et al., 2009, " Adenovirus-adeno-associated virus hybrid for large-scale recombinant adeno-associated virus production," Human Gene Therapy 20:922-929，其藉由引用以其整體併入本文。以下美國專利亦描述製造和使用這些和其它AAV生產系統的方法，其各自內容藉由引用以其整體併入本文：5,139,941；5,741,683；6,057,152；6,204,059；6,268,213；6,491,907；6,660,514；6,951,753；7,094,604；7,172,893；7,201,898；7,229,823；及7,439,065。
此後，粗細胞收穫物可為對象方法步驟，如載體收穫物的濃縮、載體收穫物的滲濾、載體收穫物的微流體化、載體收穫物的核酸酶消化、經過微流化的中間體的過濾、藉由層析的粗純化、藉由超速離心法的粗純化、藉由切向流過濾進行緩衝液交換及/或調配和過濾以製備大量載體。
在高鹽濃度下進行兩步驟親和性層析純化，然後使用陰離子交換樹脂層析來純化載體藥物產物並去除空衣殼。此等方法更詳盡的敘述於國際專利申請號 PCT/US2016/065970，2016年12月9日申請，標題為「AAV9的可擴展純化方法(Scalable Purification Method for AAV9)」，其藉由引用併入。關於AAV8的純化方法，於國際專利申請號PCT/US2016/065976，2016年12月9日申請，以及rh10，國際專利申請號 PCT/US16/066013，2016年12月9日申請，標題為「AAVrh10 的可擴展純化方法(Scalable Purification Method for AAVrh10)」，亦於2015年12月11日申請，及關於AAV1，於國際專利申請號 PCT/US2016/065974，2016年12月9日申請，以「AAV1 的可擴展純化方法(Scalable Purification Method for AAV1)」，於2015年12月11日申請，其等藉由引用全部併入本文。
為了計算空顆粒和完整顆粒的含量，將所選樣品(例如，在本文的實例中經過碘克沙醇(iodixanol)梯度純化的製劑，其中GC=顆粒號)的vp3帶體積相對於加載的GC顆粒進行繪製。所得線性等式(y=mx+c)用於計算測試品峰值的帶狀體積中的顆粒的數量。然後將加載的每20 μL顆粒數量(pt)乘以50，以得到顆粒(pt)/mL。將Pt/mL除以GC/mL得到顆粒與基因體拷貝的比率(pt/GC)。Pt/mL–GC/mL得到空pt/mL。空pt/mL除以pt/mL並且×100得到空顆粒的百分比。
一般而言，用於測定具有包裝的基因體的空衣殼和AAV載體顆粒的方法為本技術領域已知。參見，例如，Grimm et al., Gene Therapy (1999) 6:1322-1330；及Sommer et al., Molec. Ther. (2003) 7:122-128。為了測試變性的衣殼，該方法包含使經過處理的AAV儲料經受SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(由能夠分離三種衣殼蛋白的任何凝膠組成，例如在緩衝液中含有3-8% Tris-乙酸鹽的梯度凝膠)，然後運行凝膠直到分離出樣品材料，並且將凝膠印漬到尼龍或硝酸纖維素膜(較佳為尼龍)上。然後，將抗AAV衣殼抗體用作與變性的衣殼蛋白結合的初級抗體，較佳為抗AAV衣殼單株抗體，最佳為B1抗AAV2單株抗體(Wobus et al., J. Virol. (2000) 74:9281-9293)。然後使用次級抗體，該次級抗體與初級抗體結合並含有一種用於檢測與初級抗體的結合的裝置，更佳為含有與其共價結合的檢測分子的抗IgG抗體，最佳為與辣根過氧化物酶共價連接的綿羊抗小鼠IgG抗體。用於檢測結合之方法用於半定量地確定初級抗體與次級抗體之間的結合，較佳為能夠檢測放射性同位素發射、電磁輻射或比色變化的檢測方法，最佳為化學發光檢測套組。例如，對於SDS-PAGE，可從管柱濾分中提取樣品並在含有還原劑(例如，DTT)的SDS-PAGE上樣緩衝液中加熱，並且在預製的梯度聚丙烯醯胺凝膠(例如，Novex)上解析衣殼蛋白。可根據製造商的說明使用SilverXpress (Invitrogen，CA)或其它適合的染色方法(即SYPRO紅寶石色或考馬斯染色)進行銀染色。在一具體實施例中，可藉由定量即時PCR (Q-PCR)測量管柱濾分中的AAV載體基因體(vg)的濃度。將樣品稀釋並用DNase I (或另一種適合的核酸酶)消化以去除外源性DNA。在核酸酶去活化後，使用引子和對引子之間的DNA序列具有特異性的TaqMan™螢光探針進一步稀釋和擴增樣品。在Applied Biosystems Prism 7700序列檢測系統上測量每種樣品達到定義的螢光水平所需的週期的數量(閾值週期，Ct)。含有與AAV載體中所含序列相同的序列的質體DNA用於在Q-PCR反應中產生標準曲線。從樣品獲得的週期閾值(Ct)的值用於藉由相對於質粒標準曲線的Ct值對其進行標準化來確定載體基因體力價。亦可使用基於數字PCR的端點測定。
此外，測量空顆粒與完整顆粒的比率的另一例在本領域中亦已知。在分析型超速離心機(AUC)中測量的沉降速度可檢測凝集體、其它微量成分，並根據它們不同的沉降係數提供不同顆粒種類的相對量的良好定量。此係一種基於長度和時間基本單位的絕對方法，不需要標準分子作為參考。將載體樣品加載到具有2個通路碳環氧類樹脂中心部件(charcoal-epon centerpieces)的槽中，該中心部件具有12 mm光路徑長度。將提供的稀釋緩衝液加載到每個槽的參考通路中。然後將加載的槽置於AN-60Ti分析轉子中，並加載到配備吸光度和RI檢測器的Beckman-Coulter ProteomeLab XL-I分析型超速離心機中。在20°C完全溫度平衡後，轉子達到12,000 rpm的最終運行速度。A 280掃描大約每3分鐘記錄一次，持續約5.5小時(每個樣品總共掃描110次)。使用c(s)方法分析原始數據並在分析程式SEDFIT中實施。繪製所得的尺寸分布及積分峰值。與每個峰相關的百分比值代表所有峰下總面積的峰面積分數，並基於在280 nm處生成的原始數據；許多實驗室使用這些值來計算空顆粒：完整顆粒比率。然而，由於空顆粒和完整顆粒在該波長下具有不同的吸光係數，因此可對原始數據進行相應調整。吸光係數調整前後的空顆粒和完整單體峰值之比用於確定空-完整顆粒比。
於一態樣，使用優化的q-PCR方法，其利用廣譜絲胺酸蛋白酶，例如蛋白酶K (諸如從Qiagen商購可獲得)。更具體而言，優化的qPCR基因體力價分析與標準分析相似，除了在DNase I消化之後，將樣品以蛋白酶K緩衝液稀釋並以蛋白酶K處理，然後加熱去活化。適當地，將樣品以等量於樣品大小的蛋白酶K緩衝液稀釋。蛋白酶K緩衝液可濃縮至2倍或更高。通常，蛋白酶K處理約為0.2 mg/mL，但可在0.1 mg/mL至約1 mg/mL之間變化。處理步驟通常在約55℃下進行約15分鐘，但可在較低溫度(例如，約37℃至約50℃)下進行較長一段時間(例如，約20分鐘至約30分鐘)，或在較高溫度(例如，高至約60℃)下進行較短一段時間(例如，約5至10分鐘)。類似地，加熱去活化通常在約95℃下保持約15分鐘，但溫度可降低(例如，約70℃至約90℃)並延長時間(例如，約20分鐘至約30分鐘)。然後將樣品稀釋(例如，1000倍)並如標準分析中所述進行TaqMan分析。亦可使用ViroCyt或流式細胞儀進行定量。
另外或可替代地，可使用微滴數位化PCR(ddPCR)。例如，藉由ddPCR確定單股及自我互補AAV載體基因體力價的方法已被敘述。參見，例如，M. Lock et al, Hu Gene Therapy Methods, Hum Gene Ther Methods. 2014 Apr；25(2):115-25. doi: 10.1089/hgtb.2013.131. Epub 2014 Feb 14。 [治療性蛋白質及遞送系統]
含有本文提供的靶向模體的融合配偶體(fusion partner)、結合物配偶體(conjugate partner)和重組載體，其中該靶向模體為Y-G/A/R/K-Y/H-GNPA-T/R/H-RYFD-V/K(亦稱為Y-X’-X”-GNPA-X’’-RYFD-X’”，其中X’為G、A、R、K，X”為Y或H，X’”為T、R或H，且X””為V或K；SEQ ID NO” 14)核心靶向模體，可用於多種不同的治療性蛋白質、多肽、奈米顆粒和遞送系統。可用於本文提供的組成物和靶向遞送的蛋白質及化合物之例包括如下。應了解病毒載體、奈米顆粒及其它遞送系統用於活體內表現之含有編碼所選定的蛋白質(或結合物)的序列。
在一些具體實施例中，具有修飾的衣殼與至少一種或多種核心Y-G/A/R/K-Y/H-GNPA-T/R/H-RYFD-V/K (亦稱為Y-X’-X”-GNPA-X’’-RYFD-X’”，其中X’為G、A、R、K，X”為Y或H，X’”為T、R或H，且X””為V或K；SEQ ID NO” 14)肽的rAAV，包含用於如上述在目標細胞中的載體基因體，該載體基因體包含期待的轉基因及啟動子，可選擇地藉由常規方法評估污染，然後將其調製成藥物組成物，而被意圖用於投予至有需要的受試者。這種調配劑涉及醫藥上及/或生理學上可接受的媒劑或載劑，如緩衝鹽水或其它緩衝劑，例如，HEPES，以維持pH於適當生理學上的水平，可選擇其它藥物、藥劑、穩定劑、緩衝劑、載劑、佐藥、稀釋劑等。於注射，載劑通常為液體。
有用於本文提供的組成物及靶向遞送中的蛋白質及化合物之例包括如下。應了解rAAV包含編碼所選的於活體內表現的蛋白質的序列。
在某些具體實施例中，包括包含本文所提供的靶向模體之病毒載體及奈米顆粒的蛋白質、多肽、奈米顆粒、及/或遞送系統，有用於治療一種或多種之認知障礙及/或神經退化性疾患。此種疾患可包括(但未限於)傳染性海綿狀腦病(例如，庫傑二氏病(Creutzfeld-Jacob disease))、帕金森氏病(Parkinson’s disease)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(amyotropic lateral sclerosis (ALS))、多發性硬化症、阿滋海默氏症(Alzheimer’s Disease)、亨汀頓氏舞蹈症、康納丸氏病(Canavan’s disease)、創傷性腦損傷、脊髓損傷(ATI335、Novartis公司的anti-nogo1)、偏頭痛(Alder Biopharmaceuticals公司的ALD403；Eli公司的LY2951742；Labrys Biologics公司的RN307)、牛海綿狀腦病(bovine spongiform encephalopathy)、吉斯曼-史特斯勤-先克症候群(Gerstmann-Sträussler-Scheinker syndrome)、致死性家族性失眠症(fatal familial insomnia)、庫魯胞溶體貯積症(kuruysosomal storage diseases)、中風、及影響中樞神經系統的傳染病。
在某些具體實施例中，包括包含本文所提供的靶向模體之病毒載體及奈米顆粒的蛋白質、多肽、奈米顆粒、及/或遞送系統，有用於遞送抗各種中樞神經感染的抗體。此種傳染病可包括真菌性疾病，如隱球菌性腦膜炎、腦膿瘍、脊髓硬膜外感染，其由下列引起，例如新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、毛黴目(order Mucorales)、麴菌屬(Aspergillus spp)及念珠菌屬(Candida spp)；原蟲性疾病，如弓蟲症、瘧疾及原發性阿米巴腦膜腦炎(其由病原體所引起，如弓蟲( Toxoplasma gondii)、有鉤絛蟲( Taenia solium)、惡性瘧原蟲( Plasmodium falciparus)、曼森裂頭絛蟲( Spirometra mansonoides)(裂頭絛蟲症(sparaganoisis))、胞蟲屬( Echinococcus spp)(引起神經胞蟲囊病)、及腦阿米巴病(cerebral amoebiasis)；細菌性疾病，諸如，例如肺結核、麻風、神經梅毒、細菌性腦炎、萊姆病(lyme disease)(博氏疏螺旋體( Borrelia burgdorferi))、落磯山斑疹熱(Rocky Mountain spotted fever)(立克次氏立克次體( Rickettsia rickettsia))、CNS奴卡菌病(CNS nocardiosis)(奴卡菌屬( Nocardia app))、CNS結核病(結核分枝桿菌( Mycobacterium tuberculosis))、CNS李氏菌症(CNS listeriosis)(李斯特單胞菌( Listeria monocytogenes))、腦膿瘍、及神經螺旋體病(neuroborreliosis)；病毒感染，諸如，例如病毒性腦膜炎、東部馬腦炎(EEE)、聖路易腦炎、西尼羅病毒及/或腦炎、狂犬病、加州腦炎病毒、拉克羅斯腦炎(La Crosse encepthalitis)、麻疹腦炎、脊髓灰白質炎(poliomyelitis)，其由下列引起，例如，疱疹家族病毒(HSV)、HSV-1、HSV-2(新生兒的單純疱疹病毒性腦炎)、水痘帶狀疱疹病毒(VZV)、畢氏腦炎(Bickerstaff encephalitis)、艾司坦氏-巴爾氏病毒(Epstein-Barr virus，EBV)、巨細胞病毒(CMV，如正由Theraclone Sciences開發的TCN-202)、人類疱疹病毒6 (HHV-6)、B病毒(猴疱疹病毒)、黃病毒腦炎(Flavivirus encephalitis)、日本腦炎、墨累山谷熱(Murray valley fever)、JC病毒(進行性多部腦白質病(progressive multifocal leukoencephalopathy))、立百病毒(Nipah Virus)(NiV)、麻疹(亞急性硬化泛腦炎(subacute sclerosing panencephalitis))；及其它感染，諸如，例如亞急性硬化泛腦炎、進行性多部腦白質病；人類免疫不全病毒(後天性免疫不全症候群(AIDS))；化膿鏈球菌( streptococcus pyogenes)及其它β-溶血性鏈球菌(例如，與鏈球菌感染有關的兒童自體免疫神經精神異常(Pediatric Autoimmune Neuropsychiatric Disorders Associated with Streptococcal Infection，PANDAS))及/或席登罕氏舞蹈症(Syndenham’s chorea)、及格巴二氏症候群、及普里昂蛋白(prion)。
在某些具體實施例中，此蛋白質為治療艾倫-赫恩登-達得利病及其症候的MCT8蛋白質(SLC16A2 gene)及其它化合物。
在某些具體實施例中，此蛋白質為選自與轉運缺陷有關的疾病，諸如例如，囊腫纖維化(cystic fibrosis)(囊腫纖維化跨膜傳導調節蛋白(cystic fibrosis transmembrane regulator))、α-1-抗胰蛋白酶(遺傳性氣胸)、FE(遺傳性血鐵沉積症(hereditary hemaochromatosis))、酪胺酸酶(眼皮膚白化症(oculocutaneous albinism))、蛋白質C(蛋白質C缺乏症)、補體C抑制劑(第一型遺傳性血管性水腫(hereditary angioedema))、α-D-半乳糖苷酶(法布瑞氏病(Fabry disease))、β-己醣胺酶(β-hexosaminidase)(Tay-Sachs)、蔗糖酶-異麥芽糖酶(sucrase-isomaltase)(先天性蔗糖酶-異麥芽糖酶缺乏症)、UDP-葡萄糖醛酸基-轉移酶(第二型克-納二氏病(Crigler-Najjar type II))、胰島素受體(糖尿病)、生長基素受體(萊倫氏症候群(laron syndrome))等。與彼等有關的其它基因及蛋白質之例，例如脊髓性肌肉萎縮症(SMA、SMN1)、亨汀頓氏舞蹈症、雷特氏症候群(Rett Syndrome)(例如，甲基-CpG-結合蛋白質2(MeCP2)；UniProtKB-P51608)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(Amyotrophic Lateral Sclerosis，ALS)、裘馨氏肌肉萎縮症(Duchenne Type Muscular dystrophy)、弗裡德里希共濟失調(Friedrichs Ataxia)(例如，共濟蛋白(frataxin))、與脊髓小腦性共濟失調2型(SCA2)/ALS相關之ATXN2；與ALS有關的TDP-43、顆粒蛋白前體(progranulin)(PRGN)(與非阿滋海默氏症腦退化相關，包括額顳葉失智症(FTD)、進行性非流利性失語症(PNFA)及語義性失智症)、CDKL5缺乏症、安格曼症候群(Angelman syndrome)、N-聚糖酶1缺乏症、阿滋海默氏症、脆弱X染色體症候群(Fragile X syndrome)、尼曼匹克氏病(Niemann-Pick disease)(包括A及B型(ASMD或酸性神經鞘磷脂酶缺乏(Acid Sphingomyelinase Deficiency))、及c型(NPC)，黏多醣症(mucopolysaccharidoses，MPS)、伍爾曼氏病(Wolman disease)等。參見，例如，orpha.net/consor/cgi-bin/Disease_Search_List.php；rarediseases.info.nih.gov/diseases。可以經由rAAV遞送的另外的示例性基因包括但不限於與肝醣貯積症或缺乏性1A型(GSD1)有關的葡萄糖-6-磷酸酶、與PEPCK缺乏症有關的磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶(phosphoenolpyruvate-carboxykinase，PEPCK)；與癲癇發作和嚴重的神經發展障礙(neurodevelopmental impairment)有關之第五型類週期蛋白依賴型激酶(cyclin-dependent kinase-like 5，CDKL5)，亦稱為絲胺酸/蘇胺酸激酶9(STK9)；與半乳糖血症有關之半乳糖-1-磷酸尿苷醯基轉移酶(galactose-1 phosphate uridyl transferase)；與苯酮尿症(PKU)有關之苯丙胺酸羥化酶；與第一型原發性高草酸尿症相關的基因產物，包括羥基酸氧化酶1(GO/HAO1)和AGXT，與楓糖漿尿病相關之支鏈α-酮酸脫氫酶，包括BCKDH、BCKDH-E2、BAKDH-E1a和BAKDH-E1b；與第一型酪胺酸血症有關之延胡索醯乙醯乙酸水解酶(fumarylacetoacetate hydrolase)；與甲基丙二酸血症有關的甲基丙二醯輔酶A變位酶；與中鏈醯基輔酶A缺乏症有關的中鏈醯基輔酶A脫氫酶(medium chain acyl CoA dehydrogenase)；與鳥胺酸胺甲醯基轉移酶缺乏症有關的鳥胺酸胺甲醯基轉移酶(OTC)；與瓜胺酸血症(citrullinemia)有關的精胺琥珀酸合成酶(ASS1)；卵磷脂-膽固醇醯基轉移酶(lecithin-cholesterol acyltransferase，LCAT)缺乏症；甲基丙二酸血症(MMA)；與尼曼匹克氏症C1型有關的NPC1；丙酸血症(PA)；與轉甲狀腺素蛋白(TTR)相關的遺傳性澱粉樣變性相關的TTR；與家族性高膽固醇血症(FH)有關的低密度脂蛋白受體(LDLR)蛋白，LDLR變異體，諸如彼等描述於WO 2015/164778者；PCSK9；與失智症相關之ApoE和ApoC蛋白；與克-納二氏病相關之UDP-葡萄糖醛酸轉移酶；與嚴重合併性免疫不全病有關的腺苷脫胺酶(adenosine deaminase)；與痛風及萊希-尼亨症候群(Lesch-Nyan syndrome)有關的次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase)；與生物素酶缺乏症有關的生物素酶(biotimidase)；與法布瑞氏病(Fabry disease)有關的α半乳糖苷酶A(a-Gal A)；與GM1神經節苷脂沉積症相關的β-半乳糖苷酶(GLB1)；與威爾森氏病(Wilson’s Disease)有關的ATP7B；與第2型和3型戈謝氏(Gaucher)病相關之β-葡萄糖腦苷脂酶；與柴爾維格氏(Zellweger)症候群相關之過氧化體膜蛋白70 kDa；與異染性腦白質營養不良相關的芳基硫酸酯酶A (ARSA)、與克拉伯氏(Krabbe)病相關的半乳糖腦苷脂酶(GALC)、與龐貝氏(Pompe)病相關的α-葡萄糖苷酶(GAA)；與尼曼匹克氏病A型相關之鞘磷脂酶(SMPD1)基因；與成人發病的第II型瓜胺酸血症(CTLN2)相關之精胺酸琥珀酸合酶；與尿素循環障礙相關之胺基甲醯磷酸合酶1 (CPS1)；與脊髓性肌萎縮相關之生存運動神經元(SMN)蛋白；與法伯氏(Farber)脂肪肉芽腫病相關的神經醯胺酶；與GM2神經節苷脂沉積症和戴-薩克斯氏(Tay-Sachs)病及山多夫氏(Sandhoff)病相關之b-己醣胺酶；與天冬胺醯葡萄糖胺尿症相關之天冬胺醯葡萄糖胺酶；與岩藻糖苷沉積症相關之α-岩藻糖苷酶；與α-甘露糖苷沉積症相關之α-甘露糖苷酶；與急性間歇性卟啉症(AIP)相關之紫質膽素原脫胺基酶；用於治療α-1抗胰蛋白酶缺乏症(肺氣腫)之 α-1抗胰蛋白酶；用於治療由於地中海貧血或腎功能衰竭引起的貧血之促紅細胞生成素；用於治療缺血性疾病的血管內皮生長因子、血管生成素-1和纖維母細胞生長因子；用於治療例如動脈粥樣硬化、血栓形成或栓塞中所見的血管閉塞之血栓調節蛋白和組織因子途徑抑制劑；用於治療帕金森氏(Parkinson)病之芳族胺基酸脫羧酶(AADC)和酪胺酸羥化酶(TH)。
在某些具體實施例中，由轉基因序列編碼的蛋白質包括荷爾蒙及生長及分化因子，包括但不限於胰島素、升糖素、類升糖素肽-1(GLP1)、生長激素(GH)、副甲狀腺素(PTH)、生長激素釋放因子(GRF)、促濾泡素(FSH)、黃體激素(LH)、人類絨毛膜促性腺激素(hCG)、血管內皮生長因子(VEGF)、血管生成素、血管抑制素、顆粒性白血球群落刺激因子(GCSF)、紅血球生成素(EPO)、結締組織生長因子(CTGF)、鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)、酸性纖維母細胞生長因子(aFGF)、表皮生長因子(EGF)、轉形生長因子(transforming growth factor α，TGFα)、血小板衍生生長因子(PDGF)、胰島素生長因子I及II(IGF-I及IGF-II)、轉形生長因子β超家族之任一者，包括TGF β，活化素(activin)、抑制素(inhibin)、或骨形態發生蛋白蛋白(bone morphogenic protein，BMP) BMPs 1-15之任一者、生長因子之調蛋白(heregluin)/神經調節蛋白(neuregulin)/ARIA/neu分化因子(NDF)家族之任一者、神經生長因子(NGF)、腦源性神經營養因子(BDNF)、神經營養蛋白(neurotrophin)NT-3及NT-4/5、睫狀神經營養因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)、神經膠細胞株衍生的神經營養因子(GDNF)、溶酶體酸性脂肪酶(lysosomal acid lipase)(LIPA或LAL)、神經營養素(neurturin)、集聚蛋白(agrin)、腦信號蛋白(semaphorin)/腦衰蛋白(collapsin)家族之任一者、軸突導向分子-1(netrin-1)及軸突導向分子-2、肝細胞生長因子(HGF)、ephrins、noggin、音蝟因子(sonic hedgehog)及酪胺酸羥化酶。其它有用的轉基因編碼引起黏多醣症(MPS)的溶酶體酵素，包括α-L-艾杜糖醛酸酶(α-L-iduronidase)(MPSI)、艾杜糖醛酸硫酸酯酶(iduronate sulfatase)(MPSII)、乙醯肝素N－硫酸酯酶(heparan N-sulfatase)(磺醯胺酶(sulfaminidase))(MPS IIIA，聖菲利柏氏症A(Sanfilippo A))、α-N-乙醯基-氨基葡萄糖苷酶(MPS IIIB，聖菲利柏氏症B)、乙醯基-CoA：α-葡萄胺糖苷乙醯基轉移酶(MPS IIIC，聖菲利柏氏症C)、N-乙醯基葡萄糖胺6-硫酸酯酶(MPS IIID，聖菲利柏氏症D)、半乳糖6-硫酸酯酶(MPS IVA，莫奎歐氏症A(Morquio A))、β-半乳糖苷酶(MPS IVB，莫奎歐氏症B)、N-乙醯基-半乳胺糖4-硫酸酯酶(MPS VI，馬-拉二氏(Maroteaux-Lamy))、β-葡萄醣醛酸酶(MPS VII，Sly)、及玻尿酸酶(MPS IX)。
在某些具體實施例中，蛋白質由轉基因序列編碼，包括報導子序列，其表現產生可偵測到的信號。此種報導子序列包括，但未限於，編碼下列的DNA序列：β-內醯胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、鹼性磷酸酶、胸苷激酶、綠色螢光蛋白(GFP)、增強的GFP(EGFP)、氯黴素乙醯基轉移酶(chloramphenicol acetyltransferase，CAT)、蟲螢光素酶、膜結合蛋白，包括例如，CD2、CD4、CD8、流感血球凝集素蛋白、及所屬技術領域中其它熟知者，存在或可以通過常規方法產生針對其的高親和力抗體、及融合蛋白，包含適當融合至抗原標籤域的膜結合蛋白，其中抗原標籤域來自如血球凝集素或Myc。
在某些具體實施例中，該蛋白質選自與指定的神經性疾病、疾患、症候群及/或病況相關的疾病，包括但未脊髓性肌萎縮症(SMA)(與存活運動神經元蛋白(SMN2)基因相關)、SMN1、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)(超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD1))、FUS RNA結合蛋白(FUS)、微RNA-155、9號染色體開放閱讀框72(chromosome 9 open reading frame 72 (C9或f72))、或共濟失調蛋白-2(ataxin-2)(ATXN2)基因)、亨汀頓氏舞蹈症(與亨汀頓氏(HTT)基因有關)、hATTR多發性神經病變(與轉甲狀腺素蛋白(transthyretin，TTR)基因有關)、阿滋海默氏症(與MAP-tau(MAPT)基因有關)、多發性系統退化症(Multiple System Atrophy)(與α-突觸核蛋白(SNCA)有關)、帕金森氏病(與α-突觸核蛋白(α-synuclein)(SNCA)有關，富白胺酸重複激酶2(leucine rich repeat kinase 2，LRRK2)基因)、中央核肌肉病變(centronuclear myopathy)(與發動蛋白2(dynamin 2，DNM2)基因有關)、安格曼症候群(與泛蛋白蛋白質連接酶E3A(UBE3A)基因有關)、癲癇(與肝醣合成酶1(GYS1)基因有關)、卓飛症候群(Dravet Syndrome)(與鈉電位閘控通道α次單元1(SNC1A)基因有關)、腦白質失養症(Leukodystrophy)(與膠質原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)基因有關)、普里昂疾病(prion disease)(與普里昂蛋白(PRNP)基因有關)、及遺傳性腦出血伴澱粉樣變性-荷蘭型(HCHWA-D)(與前類澱粉蛋白質(amyloid beta precursor protein)(APP)基因有關)。
如本文提供的具有突變體rAAV衣殼的rAAV具有載體基因體，其包含編碼蛋白質的核酸序列，例如作用為轉錄抑制蛋白(transcriptional repressor)、反義分子(antisense molecule)、核糖酵素(ribozyme)、小抑制性核酸序列，例如但未限於RNAi、shRNAi、siRNA、微RNAi (mRNAi或miRNA)、反義寡核苷酸等。此等可為附加於或替代待遞送的蛋白質。 [組成物及用途]
本文提供含有至少一種rAAV儲料(例如，rAAV9突變體儲料或rAAVhu68突變體儲料，其中突變體包含如本文所述的核心靶向模體)及可選擇之載劑、賦形劑及/或防腐劑的組成物。rAAV儲料係指例如在以下討論濃度和劑量單位時所述之量的多個相同的rAAV載體。
本文亦提供含有至少一種包含如本文提供的靶向模體之治療性蛋白質、多肽、奈米顆粒及/或遞送系統及可選擇之載劑、賦形劑及/或防腐劑的組成物。
本文亦提供如此處所述的組成物之使用方法。在某些具體實施例中，對腦細胞靶向的治療之方法包含對有需要的患者投予如本文所述的rAAV之儲料，其中治療劑被靶向遞送至腦及/或脊髓中的細胞，且被脫靶向於肝臟、心臟及/或肺臟的細胞。
此外，本文提供一種遞送轉基因至受試者中的中樞神經系統(CNS)的一種或多種目標細胞之方法，包含投予受試者重組腺相關病毒(AAV)載體，該載體包含具有至少一個或多個核Y-G/A/R/K-Y/H-GNPA-T/R/H-RYFD-V/K(亦稱為Y-X’-X”-GNPA-X’’-RYFD-X’”，其中X’為G、A、R、K，X”為Y或H，X’”為T、R或H，且X””為V或K；SEQ ID NO” 14)肽之經修飾的衣殼、及載體基因體，該載體基因體包含可操作地連接至調控序列的轉基因，該調控序列指導轉基因在CNS之目標細胞中的表現。在某些具體實施例中，CNS的目標細胞為實質細胞、脈絡叢細胞、室管膜細胞、星狀細胞、及/或神經元，可選擇皮質、海馬及/或紋狀體的神經元。在某些具體實施例中，轉基因編碼分泌的基因產物。在某些具體實施例中，AAV載體被鞘内遞送，可選擇經由腦大池內(ICM)注射。在某些具體實施例中，AAV載體經由腦實質內投予而遞送。在某些具體實施例中，AAV載體經由Ommaya Reservoir遞送而遞送。
本文亦提供一種具有經修飾衣殼的rAAV之用途，該衣殼具有至少一個或多個核Y-G/A/R/K-Y/H-GNPA-T/R/H-RYFD-V/K(亦稱為Y-X’-X”-GNPA-X’’-RYFD-X’”，其中X’為G、A、R、K，X”為Y或H，X’”為T、R或H，且X””為V或K；SEQ ID NO” 14)肽，針對腦的目標細胞，諸如星狀細胞，比使用AAV9載體達成更高水平之轉導。在某些具體實施例中，在大腦的尾部，包括額葉及顳葉皮質，可達成更高的轉導水平。在某些具體實施例中，具有經修飾衣殼的rAAV，該衣殼具有至少一個或多個核Y-G/A/R/K-Y/H-GNPA-T/R/H-RYFD-V/K肽(亦稱為Y-X’-X”-GNPA-X’’-RYFD-X’”，其中X’為G、A、R、K，X”為Y或H，X’”為T、R或H，且X””為V或K；SEQ ID NO” 14)在皮質、海馬及/或紋狀體的神經元達成較高水平的轉導，例如相對於AAV9。
在某些具體實施例中，組成物可含有至少第二種不同的rAAV儲料。第二載體儲料可與第一載體不同，因為它具有不同的AAV衣殼及/或不同的載體基因體。在某些具體實施例中，如本文所述之組成物可含有表現如本文所述之表現匣之不同載體，或另一種活性組分(例如，抗體構築體、另一種生物製品及/或小分子藥物)。
如本文所使用，「載劑」包括任何及所有的溶劑、分散介質、媒劑、塗料、稀釋劑、抗細菌及抗真菌劑、等滲及吸收延遲劑、緩衝劑、載劑溶液、懸浮液、膠體等。此類用於醫藥活性物質的介質及試劑的用途為技術領域中所熟知的。補充性活性成分亦可被併入組成物中。短語「醫藥上可接受的」係指當投予宿主時不會產生過敏或類似不良反應的分子實體及組成物。遞送媒劑，例如脂質體、奈米膠囊、微粒、微球、脂質顆粒、囊泡等可用於將本發明之組成物導入適當的宿主細胞中。特別是，可將rAAV載體遞送轉基因調配用於遞送包封在脂質顆粒、脂質體、囊泡、奈米球或奈米顆粒等之中。
在一具體實施例中，組成物包括適於遞送至受試者的最終調配物，例如，為緩衝至生理學上可相容的pH及鹽濃度的水性液體懸浮劑。適合地，最終調配物被調整至生理學上可接受的pH，例如，該pH可為範圍在pH 6至9、或pH 6.5至7.5、pH 7.0至7.7、或pH 7.2至7.8。由於腦脊液的pH為約7.28至約7.32，對於鞘內遞送，可能需要在此範圍內的pH；而對於靜脈內遞送，可能需要約pH 6.8至約7.2。然而，可選擇最寬之範圍和這些子範圍內的其它pH用於其它遞送途徑。可選擇地，一或多種表面活性劑可存在於調配物中。在另一具體實施例中，組成物可作為濃縮物輸送，將其稀釋後投予受試者。在其它具體實施例中，組成物可被凍乾並在投予時還原(reconstituted)。
適當的表面活性劑或表面活性劑之組成物可選自無毒非離子表面活性劑。在一具體實施例中，選擇終止於一級羥基的雙官能嵌段共聚物表面活性劑，例如，諸如Pluronic® F68 [BASF]，亦稱為泊洛沙姆(Poloxamer)188，其具有中性pH，平均分子量為8400。可選擇其它表面活性劑和其它泊洛沙姆，即，由兩側是二個聚氧乙烯(聚(環氧乙烷))親水鏈的聚氧丙烯(聚(環氧丙烷))中央疏水鏈所構成的非離子三嵌段共聚物、SOLUTOL HS 15 (聚乙烯二醇(Macrogol)-15羥基硬脂酸酯)、LABRASOL (聚氧基辛基甘油酯(Polyoxy capryllic glyceride))、聚氧基10油基醚、TWEEN(聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯)、乙醇和聚乙二醇。在一具體實施例中，調配物包含泊洛沙姆。這些共聚物通常用字母「P」(用於泊洛沙姆)跟三個數字命名：前二個數字x100給出聚氧丙烯核心的近似分子量，最後一個數字x10給出聚氧乙烯含量百分比。在一個具體實施例中，選擇泊洛沙姆188。表面活性劑可以懸浮液的高至約0.0005%至約0.001%的量存在。
在一具體實施例中，使用本文所述組成物用以製備治療中樞神經系統疾患及疾病之藥劑。可選擇地，本文所述組成物在沒有額外的外在藥理學或化學劑或血腦障壁的其它物理破壞的情況下被投予。
在一具體實施例中，調配物緩衝液為具有總鹽濃度為200 mM、0.001% (w/v) pluronic F68的磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)(最終調配物緩衝液(FFB))。
在某些具體實施例中，組成物包含病毒載體(即，rAAV載體)。以足夠的量將載體投予轉染細胞並提供足夠程度的基因轉移和表現，以提供治療益處而沒有不適當的副作用，或具有醫學上可接受的生理作用，這可由醫學領域的技術人員確定。在某些具體實施例中，載體被配製用於經由鼻內遞送裝置遞送。在某些具體實施例中，載體載體被配製用於氣溶膠遞送裝置，例如，經由噴霧器或通過其它適合的裝置。在某具體實施例中，載體被配製用於鞘内遞送。在一些具體實施例中，鞘内遞送包含注射至椎管，例如，蜘蛛膜下腔。在一些具體實施例中，可選擇其它遞送途徑，例如，顱內、鼻內、腦池內、腦脊液遞送，以及其它適合的直接 或全身途徑，即Ommaya reservoir。在某些具體實施例中，載體被配製用於靜脈內遞送。其它習知和醫藥上可接受的投予途徑包括，但不限於直接遞送至所需器官(例如，肺臟)、經口吸入、鞘內、氣管內、動脈內、眼內、靜脈內、肌肉內、皮下、皮內和其它腸胃外投予途徑。在一具體實施例中，使用鼻內黏膜霧化裝置(LMA® MAD Nasal™-MAD110)鼻內投予載體。在另一具體實施例中，使用Vibrating Mesh Nebulizer (Aerogen® Solo)或MADgic™ Laryngeal Mucosal Atomizer，肺內投予霧化形式的載體。若需要，可合併投予途徑。在以下公開的美國專利申請案中亦描述用於遞送rAAV載體的投予及利用途徑，其每一內容通過引用以其整體併入本文：US 2018/0155412A1、US 2018/0243416A1、US 2014/0031418 A1、及US 2019/0216841A1。
病毒載體的劑量將主要取決於諸如所治療的病症、患者的年齡、體重和健康等因素，因此可能因患者而異。例如，病毒載體的治療有效人類劑量範圍通常為約25至約1000微升至約5 mL水性懸浮液，其含有約10 9至4x10 14GC之AAV載體。將調整劑量以平衡治療益處與任何副作用，並且此類劑量可以根據使用重組載體的治療應用而變化。可監測轉基因的表現水平以確定產生病毒載體(較佳為含有袖珍基因之AAV載體)的投予頻率。可選擇地，類似於為治療目的而描述的那些劑量方案可用於使用本發明的組成物進行免疫。
可將組成物配製成劑量單位以含有在每公克腦質量約1 x 10 9GC至每公克(g)腦質量約1 x 10 13基因體拷貝(GC)範圍內的量的rAAV，包括範圍和端點內的所有整數或小數。在另一具體實施例中，劑量為1 x 10 10GC每公克腦質量至約1 x 10 13GC每公克腦質量。在特定具體實施例中，投予至患者的載體劑量為至少約1.0 x 10 9GC/g、約1.5 x 10 9GC/g、約2.0 x 10 9GC/g、約2.5 x 10 9GC/g、約3.0 x 10 9GC/g、約3.5 x 10 9GC/g、約4.0 x 10 9GC/g、約4.5 x 10 9GC/g、約5.0 x 10 9GC/g、約5.5 x 10 9GC/g、約6.0 x 10 9GC/g、約6.5 x 10 9GC/g、約7.0 x 10 9GC/g、約7.5 x 10 9GC/g、約8.0 x 10 9GC/g、約8.5 x 10 9GC/g、約9.0 x 10 9GC/g、約9.5 x 10 9GC/g、約1.0 x 10 10GC/g、約1.5 x 10 10GC/g、約2.0 x 10 10GC/g、約2.5 x 10 10GC/g、約3.0 x 10 10GC/g、約3.5 x 10 10GC/g、約4.0 x 10 10GC/g、約4.5 x 10 10GC/g、約5.0 x 10 10GC/g、約5.5 x 10 10GC/g、約6.0 x 10 10GC/g、約6.5 x 10 10GC/g、約7.0 x 10 10GC/g、約7.5 x 10 10GC/g、約8.0 x 10 10GC/g、約8.5 x 10 10GC/g、約9.0 x 10 10GC/g、約9.5 x 10 10GC/g、約1.0 x 10 11GC/g、約1.5 x 10 11GC/g、約2.0 x 10 11GC/g、約2.5 x 10 11GC/g、約3.0 x 10 11GC/g、約3.5 x 10 11GC/g、約4.0 x 10 11GC/g、約4.5 x 10 11GC/g、約5.0 x 10 11GC/g、約5.5 x 10 11GC/g、約6.0 x 10 11GC/g、約6.5 x 10 11GC/g、約7.0 x 10 11GC/g、約7.5 x 10 11GC/g、約8.0 x 10 11GC/g、約8.5 x 10 11GC/g、約9.0 x 10 11GC/g、約9.5 x 10 11GC/g、約1.0 x 10 12GC/g、約1.5 x 10 12GC/g、約2.0 x 10 12GC/g、約2.5 x 10 12GC/g、約3.0 x 10 12GC/g、約3.5 x 10 12GC/g、約4.0 x 10 12GC/g、約4.5 x 10 12GC/g、約5.0 x 10 12GC/g、約5.5 x 10 12GC/g、約6.0 x 10 12GC/g、約6.5 x 10 12GC/g、約7.0 x 10 12GC/g、約7.5 x 10 12GC/g、約8.0 x 10 12GC/g、約8.5 x 10 12GC/g、約9.0 x 10 12GC/g、約9.5 x 10 12GC/g、約1.0 x 10 13GC/g、約1.5 x 10 13GC/g、約2.0 x 10 13GC/g、約2.5 x 10 13GC/g、約3.0 x 10 13GC/g、約3.5 x 10 13GC/g、約4.0 x 10 13GC/g、約4.5 x 10 13GC/g、約5.0 x 10 13GC/g、約5.5 x 10 13GC/g、約6.0 x 10 13GC/g、約6.5 x 10 13GC/g、約7.0 x 10 13GC/g、約7.5 x 10 13GC/g、約8.0 x 10 13GC/g、約8.5 x 10 13GC/g、約9.0 x 10 13GC/g、約9.5 x 10 13GC/g、或約1.0 x 10 14GC/g腦質量。
可將複製缺陷型病毒組成物配製成劑量單位以含有在約10 9GC至約10 16GC範圍內的複製缺陷型病毒的量(以治療平均體重為70 kg的受試者)，包括在該範圍內的所有整數或分數量，且對於人類患者較佳為10 12GC至10 14GC。在一具體實施例中，組成物被調配成每劑含有至少10 9、2x10 9、3x10 9、4x10 9、5x10 9、6x10 9、7x10 9、8x10 9、或9x10 9GC，包括在該範圍內的所有整數或分數量。在另一具體實施例中，組成物被調配成每劑含有至少10 10、2x10 10、3x10 10、4x10 10、5x10 10、6x10 10、7x10 10、8x10 10、或9x10 10GC，包括在該範圍內的所有整數或分數量。在另一具體實施例中，組成物被調配成每劑含有至少10 11、2x10 11、3x10 11、4x10 11、5x10 11、6x10 11、7x10 11、8x10 11、或9x10 11GC，包括在該範圍內的所有整數或分數量。在另一具體實施例中，組成物被調配成每劑含有至少10 12、2x10 12、3x10 12、4x10 12、5x10 12、6x10 12、7x10 12、8x10 12、或9x10 12GC，包括在該範圍內的所有整數或分數量。在另一具體實施例中，組成物被調配成每劑含有至少10 13、2x10 13、3x10 13、4x10 13、5x10 13、6x10 13、7x10 13、8x10 13、或9x10 13GC，包括在該範圍內的所有整數或分數量。在另一具體實施例中，組成物被調配成每劑含有至少10 14、2x10 14、3x10 14、4x10 14、5x10 14、6x10 14、7x10 14、8x10 14、或9x10 14GC，包括在該範圍內的所有整數或分數量。在另一具體實施例中，組成物被調配成每劑含有至少10 15、2x10 15、3x10 15、4x10 15、5x10 15、6x10 15、7x10 15、8x10 15、或9x10 15GC，包括在該範圍內的所有整數或分數量。在一具體實施例中，對於人類施用，劑量可在範圍為每劑10 10至約10 12GC，包括在該範圍內的所有整數或分數量。在一具體實施例中，對於人類施用，劑量可在範圍為10 9至約7x10 13GC每劑，包括在該範圍內的所有整數或分數量。在一具體實施例中，對於人類施用，劑量範圍為6.25x10 12GC至5.00x10 13GC。在另一具體實施例中，劑量為約6.25x10 12GC、約1.25x10 13GC、約2.50x10 13GC、或約5.00x10 13GC。在某具體實施例中，將劑量平均分成一半並施用於每個鼻孔。在某些具體實施例中，對於人類施用，劑量可在範圍為6.25x10 12GC至5.00x10 13GC，作為每個鼻孔0.2 ml的二個等分試樣投予，每個受試者遞送的總體積為0.8 ml。
依據待治療區域的大小、使用的病毒力價、投予途徑和方法的預期效果，此等上述劑量可以各種體積的載劑、賦形劑或緩衝劑調配物投予，範圍從約25至約1000微升，或更高的體積，包括在該範圍內的所有數量。在一具體實施例中，載劑、賦形劑或緩衝劑之體積為至少約25 µL。在一具體實施例中，體積為約50 µL。在另一具體實施例中，體積為約75 µL。在另一具體實施例中，體積為約100 µL。在另一具體實施例中，體積為約125 µL。在另一具體實施例中，體積為約150 µL。在另一具體實施例中，體積為約175 µL。又一具體實施例中，體積為約200 µL。在另一具體實施例中，體積為約225 µL。又一具體實施例中，體積為約250 µL。又一具體實施例中，體積為約275 µL。又一具體實施例中，體積為約300 µL。又一具體實施例中，體積為約325 µL。在另一具體實施例中，體積為約350 µL。在另一具體實施例中，體積為約375 µL。在另一具體實施例中，體積為約400 µL。在另一具體實施例中，體積為約450 µL。在另一具體實施例中，體積為約500 µL。在另一具體實施例中，體積為約550 µL。在另一具體實施例中，體積為約600 µL。在另一具體實施例中，體積為約650 µL。在另一具體實施例中，體積為約700 µL。在另一具體實施例中，體積介於約700至1000 µL之間。
在某些具體實施例中，劑量範圍可為在約1 x 10 9GC/g腦質量至約1 x 10 12GC/g腦質量。在某些具體實施例中，劑量範圍可為在約3 x 10 10GC/g腦質量至約3 x 10 11GC/g腦質量。在某些具體實施例中，劑量範圍可為在約5 x 10 10GC/g腦質量至約1.85x 10 11GC/g腦質量。
在一具體實施例中，病毒構築體可以從至少約最少1x10 9GCs至約1 x 10 15、或約1 x 10 11至5 x 10 13GC的劑量遞送。遞送此等劑量及濃度的適合體積可由本領域技術人員確定。例如，可選擇約1 μL至150 mL的體積，對於成人選擇較高量體積。通常，對於新生兒，適當的體積為約0.5 mL至約10 mL，對於較大的嬰兒，可選擇約0.5 mL至約15 mL。對於幼兒，可選擇約0.5 mL至約20 mL的體積。對於兒童，可選擇最高至約30 mL的體積。對於前青少年期和青少年，可以選擇最高至約50 mL。在另外其它實施方式中，患者可選擇接受鞘內投予的量約5 mL至約15 mL，或約7.5 mL至約10 mL。可確定其它適當的體積及劑量。調整劑量以平衡治療效益與任何副作用，且這種劑量可根據所採用重組載體的治療應用而變化。
根據本發明之組成物可包含諸如上述定義之醫藥上可接受的載劑。適合地，本文所述組成物包含有效量之一種或多種AAV，其懸浮於醫藥上適合的載劑及/或與適合佐劑混合，被設計用於經由注射、滲透泵、鞘内導管、Ommaya reservoir裝置遞送至患者，或藉由另一種裝置或途徑遞送。於一例中，組成物被調配用於鞘内遞送。
本文所述組成物、懸浮液或醫藥組成物被設計藉由任何適當途徑遞送至需要其之受試者。在一具體實施例中，醫藥組成物包含適合經由腦室內(ICV)、鞘内(IT)、腦池內遞送的調配緩衝劑，藉由直接注射至黑質及/或腹側蓋區(ventral tegmental area)投予，或靜脈內(IV)途徑投予。在某些具體實施例中，rAAV或醫藥組成物包含適合靜脈內、腦實質內(齒狀核(dentate nucleus))及/或鞘内投予至需要的患者中之調配緩衝劑。
如本文所使用，術語「鞘內遞送」或「鞘內投予」係指藥物藉由注射入椎管的投予途徑，更具體而言為進入蜘蛛膜下腔以使其到達腦脊液(CSF)。鞘內遞送可包括腰椎穿刺、室內(包括腦室內(icv))、枕骨下/腦池內及/或C1-2穿刺。例如，可以藉由腰椎穿刺方法導入物質以在整個蜘蛛膜下腔擴散。在另一例中，注射可進入大池(腦大池內(intracisternal magna；ICM))。腦池內遞送可增加載體擴散及/或減少由投予引起的毒性及炎症。參見，例如，Christian Hinderer et al, Widespread gene transfer in the central nervous system of cynomolgus macaques following deliveryof AAV9 into the cisterna magna, Mol Ther Methods Clin Dev. 2014；1: 14051. Published online 2014 Dec 10. doi:  10.1038/mtm.2014.51。
如本文所使用，術語「腦池內遞送」或「腦池內投予」係指藥物直接進入小腦延髓池(cisterna magna cerebellomedularis)之腦脊液中的投予途徑，更具體而言為經由枕骨下穿刺或藉由直接注射進入腦大池，或者經由永久定位的管子。
如本文所使用，術語「腦實質內(齒狀核)」或IDN係指組成物直接投予至齒狀核的途徑。IDN能夠靶向齒狀核及/或小腦。在某些具體實施例中，IDN投予使用ClearPoint® Neuro Navigation System (MRI Interventions, Inc., Memphis, TN)及心室插管進行，其允許MRI引導的可視化及投予。或者，可以選擇其它裝置設備和方法。
在一具體實施例中，提供一種冷凍組成物，其以冷凍型式在如本文所述的緩衝劑溶液中含有rAAV。可選擇地，一種或多種表面活性劑(例如，Pluronic F68)、穩定劑或防腐劑存在於此組成物中。適合地，為了使用，將組成物解凍並以例如無菌鹽水或緩衝鹽水的適合稀釋劑滴定至所需劑量。
在一具體實施例中，提供一種組成物，其包含一種或多種外源的腦細胞-靶向肽，該肽選自核：Y-G/A/R/K-Y/H-GNPA-T/R/H-RYFD-V/K (亦稱為Y-X’-X”-GNPA-X’’-RYFD-X’”模體，其中X’為G、A、R、K，X”為Y或H，X’”為T、R或H，且X””為V或K；SEQ ID NO：14)且可選擇的側接連接子序列，同時包含一種或多種生理學上可相容的載劑、賦形劑、及/或水性懸浮液基質。進一步提供包含編碼其之核酸序列的組成物。在某些具體實施例中，靶向肽核心胺基酸序列為SEQ ID NO：1且由SEQ ID NO：25之核酸序列、或與其至少約70%相同之序列編碼。在某些具體實施例中，靶向肽核心胺基酸序列為SEQ ID NO：2且由SEQ ID NO：24之核酸序列、或與其至少約70%相同之序列編碼。
在另一具體實施例中，提供一種融合多肽或蛋白質，其包含一種或多種外源的腦細胞-靶向肽核心，該肽核心來自靶向模體：Y-G/A/R/K-Y/H-GNPA-T/R/H-RYFD-V/K (SEQ ID NO：14)及包含融合配偶體(fusion partner)，該融合配偶體包含至少一種多肽或蛋白質。進一步提供編碼其等之核酸序列。
在某些具體實施例中，提供包含融合多肽或蛋白質、或編碼該融合多肽或蛋白質的核酸序列、或含有其等之奈米顆粒的組成物。該組成物可進一步包含一種或多種生理學上可相容的載劑、賦形劑及/或水性懸浮液基質。
在某些具體實施例中，編碼融合多肽蛋白的核酸序列被包封於脂質奈米顆粒(LNP)中。如本文所使用，短語「脂質奈米顆粒」或「奈米顆粒」係指包含一種或多種脂質(例如，陽離子脂質、非陽離子脂質和PEG修飾的脂質)的轉移媒劑。較佳地，脂質奈米顆粒被調配成將一種或多種核酸序列遞送至一種或多種目標細胞(例如，CNS組織及/或肌肉)。適合的脂質之例包括，例如，磷脂醯化合物(例如，磷脂醯甘油、磷脂醯膽鹼、磷脂醯絲胺酸、磷脂醯乙醇胺、神經鞘值、腦苷脂和神經節苷脂)。亦考慮使用聚合物作為轉移媒劑，無論是單獨使用還是與其它轉移媒劑結合使用。適合的聚合物可包括例如聚丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚丙交酯、聚丙交酯-聚乙交酯共聚物、聚己內酯、葡聚醣、白蛋白、明膠、藻酸鹽、膠原蛋白、幾丁聚醣、環糊精、樹枝狀聚合物和聚乙烯亞胺。在一具體實施例中，轉移媒劑的選擇基於其促進包封在其中的核酸序列轉染至目標細胞的能力。用於核酸序列的有用脂質奈米顆粒包含陽離子脂質以包封及/或增強此類核酸序列向目標細胞的遞送，該目標細胞將充當蛋白質生產的貯庫。如本文所使用，短語「陽離子脂質」係指在選定的pH (例如生理pH)下攜帶淨正電荷的多種脂質種類中的任何一種。可藉由包括採用一種或多種陽離子脂質、非陽離子脂質和PEG修飾之脂質的不同比例的多組分脂質混合物來製備所考量的脂質奈米顆粒。文獻中已描述幾種陽離子脂質，其中許多是可商購的。參見，例如，WO2014/089486、US 2018/0353616A1、及US 8,853,377B2，其藉由引用而併入。在某些具體實施例中，使用常規程序進行LNP調配，包含膽固醇、可離子化脂質、輔助脂質、PEG-脂質和在包封的核酸序列周圍形成脂質雙層的聚合物(Kowalski et al., 2019, Mol. Ther. 27(4):710-728)。在一些具體實施例中，LNP包含陽離子脂質(即，N-[1-(2,3-二油醯基氧基)丙基]-N,N,N-氯化三甲銨(DOTMA)、或1,2-二油醯基-3-三甲基銨-丙烷(DOTAP))與輔助脂質DOPE。在一些具體實施例中，LNP包含可離子化脂質Dlin-MC3-DMA可離子化脂質、或基於二酮哌
Figure 111115414-A0304-1
的可離子化脂質(cKK-E12)。在一些具體實施例中，聚合物包含聚乙烯亞胺(PEI)或聚(β-胺基)酯(PBAE)。參見，例如，WO2014/089486、US 2018/0353616A1、US2013/0037977A1、WO2015/074085A1、US9670152B2、及US 8,853,377B2，其藉由引用而併入。在某些具體實施例中，脂質奈米顆粒(LNP)包含至少一個核Y-G/A/R/K-Y/H-GNPA-T/R/H-RYFD-V/K (亦稱為Y-X’-X”-GNPA-X’’-RYFD-X’”，其中X’為G、A、R、K，X”為Y或H，X’”為T、R或H，且X””為V或K；SEQ ID NO：14)肽。即，以靶向肽修飾表面。在某些具體實施例中，脂質奈米顆粒(LNP)包含至少一個核肽YGYGNPATRYFDV (SEQ ID NO：1)。在某些具體實施例中，脂質奈米顆粒(LNP)包含至少一個核肽YAYGNPATRYFDV (SEQ ID NO：2)。
在某些具體實施例中，組成物，例如，具有以至少一個核Y-G/A/R/K-Y/H-GNPA-T/R/H-RYFD-V/K (SEQ ID NO：14)肽及可選擇的連接子序列修飾的衣殼的rAAV、融合多肽或蛋白質、或包含奈米顆粒或化學部分的結合物，有用於遞送治療劑至有需要的患者。在某些具體實施例中，組成物包含具有以至少一個核YGYGNPATRYFDV (SEQ ID NO：1)肽及可選擇的連接子序列修飾的衣殼的rAAV、融合多肽或蛋白質、或包含奈米顆粒或化學部分的結合物，有用於遞送治療劑至有需要的患者，其中該治療劑靶向遞送於CNS(腦及/或脊髓)。在某些具體實施例中，組成物包含具有以至少一個核YAYGNPATRYFDV (SEQ ID NO：2)肽及可選擇的連接子序列修飾的衣殼的rAAV、融合多肽或蛋白質、或包含奈米顆粒或化學部分的結合物，有用於遞送治療劑至有需要的患者，其中該治療劑靶向遞送於CNS(腦及/或脊髓)。
在某些具體實施例中，組成物包含具有以至少一個核YGYGNPATRYFDV (SEQ ID NO：1)肽及可選擇的連接子序列修飾的衣殼的rAAV、融合多肽或蛋白質、或包含奈米顆粒或化學部分的結合物，有用於遞送治療劑至有需要的患者，其中該治療劑靶向遞送於CNS(腦及/或脊髓)，且對於肝臟、心臟及/或肺臟細胞脫靶。在某些具體實施例中，組成物包含具有以至少一個核YAYGNPATRYFDV (SEQ ID NO：2)肽及可選擇的連接子序列修飾的衣殼的rAAV、融合多肽或蛋白質、或包含奈米顆粒或化學部分的結合物，有用於遞送治療劑至有需要的患者，其中，對於肝臟、心臟及/或肺臟細胞脫靶。
在某些具體實施例中，具有如本文所述之修飾衣殼的rAAV可在進一步包含一種或多種其它活性成分的聯合治療方案中遞送。在某些具體實施例中，該方案可涉及免疫調節組分的共同投予。此種免疫調節方案可包括，例如，但不限於免疫抑制劑諸如諸如糖皮質素、類固醇、抗代謝物、T細胞抑制劑、巨環內酯(例如，雷帕黴素或雷帕黴素類似物)、及細胞抑制劑(cytostatic agent)，包括烷化劑、抗代謝物、細胞毒性抗生素、抗體或對免疫親和素(immunophilin)有活性之藥劑。免疫抑制劑可包括氮芥(nitrogen mustard)、亞硝脲(nitrosourea)、鉑化合物、胺甲喋呤(methotrexate)、硫唑嘌呤(azathioprine)、巰嘌呤(mercaptopurine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、放線菌素(dactinomycin)、蒽環類(anthracycline)、絲裂黴素C(mitomycin C)、博來黴素(bleomycin)、光輝黴素(mithramycin)、IL-2受體-(CD25-)或CD3-導向的抗體、抗IL-2抗體、環孢素(cyclosporin)、他克莫司(tacrolimus)、西羅莫司(sirolimus)、IFN-β、IFN-γ、類鴉片(opioid)、或TNF-α(腫瘤壞死因子-α)結合劑。在某些具體實施例中，免疫抑制治療可在基因治療投予之前開始。此種治療可涉及於同一天共同投予二種或以上的藥物(例如，強體松(prednelisone)、嗎替麥考酚酯(micophenolate mofetil，MMF)及/或西羅莫司(即，雷帕黴素))。於基因治療投予後能以相同劑量或調整劑量繼續使用一種或多種這些藥物。根據需要，此種治療可持續約1週、約15日、約30日、約45日、60日或更長時間。其它共同治療可包括，例如，抗IgG酶，其已被描述為可用於消耗抗AAV抗體(因此可允許對檢測到所選擇之AAV衣殼抗體閾值水平以上的患者給藥)、及/或抗FcRN抗體的遞送，其敘述於例如，WO 2021/257668，2021年12月23日申請(主張下列優先權：美國臨時專利申請號63/040,381，於2020年6月17日申請；美國臨時專利申請號62/135,998，於2021年1月11日申請；及美國臨時專利申請號63/152,085，2021年2月22日申請)標題為「Compositions and Methods for Treatment of Gene Therapy Patients」、及/或a)類固醇或類固醇之組合及/或(b)IgG切割酶、(c) Fc-IgE結合抑制劑；(d) Fc-IgM結合抑制劑；(e) Fc-IgA結合抑制劑；及/或(f) γ干擾素中的一種或多種。
抗體「Fc區」係指可結晶的片段，其是與細胞表面受體(Fc受體)相互作用的抗體區域。在一具體實施例中，Fc區域為人類IgG1 Fc。在一具體實施例中，Fc區域為人類IgG2 Fc。在一具體實施例中，Fc區域為人類IgG4 Fc。在一具體實施例中，Fc區域為工程化Fc片段。參見，例如，Lobner, Elisabeth, et al. "Engineered IgG1‐Fc–one fragment to bind them all." Immunological reviews 270.1 (2016): 113-131；Saxena, Abhishek, and Donghui Wu. "Advances in therapeutic Fc engineering–modulation of IgG-Associated effector functions and serum half-life." Frontiers in immunology 7 (2016)；Irani, Vashti, et al. "Molecular properties of human IgG subclasses and their implications for designing therapeutic monoclonal antibodies against infectious diseases." Molecular immunology 67.2 (2015): 171-182；Rath, Timo, et al. "Fc-fusion proteins and FcRn: structural insights for longer-lasting and more effective therapeutics." Critical reviews in biotechnology 35.2 (2015): 235-254；and Invivogen, IgG-Fc Engineering For Therapeutic Use, invivogen.com/docs/Insight200605.pdf, April 2006；其各藉由引用併入本文。
抗體「鉸鏈區」為IgG和IgA免疫球蛋白類之重鏈的可撓性胺基酸部分，其藉由雙硫鍵連接此兩條鏈。
「免疫球蛋白分子」是含有共價偶合在一起的免疫球蛋白重鏈和免疫球蛋白輕鏈的免疫活性部分並能與抗原特異性結合的蛋白質。免疫球蛋白分子是任何類型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及 IgY)、類別(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或子類。術語「抗體」和「免疫球蛋白」在本文中可互換使用。
「免疫球蛋白重鏈」為一種多肽，其含有免疫球蛋白之抗原結合域之至少一部分及免疫球蛋白重鏈可變區之至少一部分或免疫球蛋白重鏈恆定區之至少一部分。如此，免疫球蛋白衍生的重鏈與免疫球蛋白基因超家族的成員具有顯著的胺基酸序列同源性區域。例如，Fab片段中的重鏈為免疫球蛋白衍生的重鏈。
「免疫球蛋白輕鏈」為一種多肽，其含有免疫球蛋白之抗原結合域之至少一部分及免疫球蛋白輕鏈可變區之至少一部分或免疫球蛋白輕鏈恆定區之至少一部分。如此，免疫球蛋白衍生的輕鏈與免疫球蛋白基因超家族的成員具有顯著的胺基酸同源性區域。
「中和抗體力價」(NAb力價)係產生多少中和其靶向抗原決定位(例如AAV)的生理作用的中和抗體(例如，抗AAV NAb)的量度。抗AAV NAb力價可如以下所述測量，例如，Calcedo, R., et al., Worldwide Epidemiology of Neutralizing Antibodies to Adeno-Associated Viruses. Journal of Infectious Diseases, 2009, 199 (3): p. 381-390，其藉由引用併入本文。
如本文所使用，當用於指vp衣殼蛋白時，術語「異源」或其任何語法變體係指由不同元件組成的群體，例如具有不同修飾胺基酸序列的vp1、vp2或vp3單體(蛋白質)。SEQ ID NO：10提供AAVhu68 vp1蛋白的經編碼的胺基酸序列。術語「異源」，如與vp1、vp2及vp3蛋白有關聯所使用(或者稱為同功型)係指於衣殼中vp1、vp2及vp3蛋白的胺基酸序列中的差異。AAV衣殼含有在vp1蛋白、vp2蛋白和vp3蛋白內的亞群，其具有從預測的胺基酸殘基的修飾。此等亞群最少包括某些脫醯胺的天冬醯胺酸(N或Asn)殘基。例如，某些亞群包含在天冬醯胺酸-甘胺酸(N-G)對中至少一個、二個、三個或四個高度被脫醯胺的天冬醯胺酸(N)位置且可選擇進一步包含其它被脫醯胺的胺基酸，其中此脫醯胺造成胺基酸改變及其它選擇性的修飾。
如本文所使用，vp蛋白之「亞群」係指一群vp蛋白，其具有至少一個確定的共同特徵，且由參考組的至少一個組成員到少於全部的成員所組成，除非另有說明。例如，在組裝的AAV殼體中，vp1蛋白之「亞群」可為至少一個(1) vp1蛋白至少於全部的vp1蛋白，除非另有說明。在組裝的AAV殼體中，vp3蛋白之「亞群」可為一個(1) vp3蛋白至少於全部的vp3蛋白，除非另有說明。例如，vp1蛋白可為vp蛋白之亞群；在組裝的AAV殼體中，vp2蛋白可為vp蛋白之一獨立的亞群，vp3為vp蛋白之又另一亞群。於另一例中，vp1、vp2及vp3蛋白可含有具有不同修飾的亞群，例如，至少一個、二個、三個或四個高度脫醯胺的天冬醯胺酸，例如，在天冬醯胺酸-甘胺酸對。除非另有指出，高度脫醯胺係指與參考胺基酸位置的所預測的胺基酸序列相比，在參考胺基酸位置處至少45%脫醯胺、至少50%脫醯胺、至少60%脫醯胺、至少65%脫醯胺、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、97%、99%、至多約100%脫醯胺。此種百分比可以使用2D-凝膠、質譜技術或其它適當技術來確定。
如本文所使用，rAAV的「儲料」係指rAAV的總體。儘管由於脫醯胺化作用，其等之衣殼蛋白存在異質性，但預計儲料中的rAAV將共享相同的載體基因體。儲料可包括具有衣殼的rAAV，例如該衣殼具有所選擇之AAV衣殼蛋白和所選擇之生產系統的異質脫醯胺化模式特徵。儲料可從單一生產系統生產或從生產系統的多次運行中匯集。可選擇多種生產系統，包括但不限於本文所述的那些。參見，例如，WO 2019/168961，2019年9月6日公開，包括表G提供AAV9的脫醯胺化樣式，及WO 2020/160582，2018年9月7日申請。亦參見，例如，WO 2020/223231，2020年11月5日公開(rh91，包括帶有脫醯胺化樣式的表)、美國臨時專利申請號63/065,616，2020年8月14日申請，及美國臨時專利申請號63/109,734，2020年11月4日申請及國際專利申請號PCT/US21/45945，2021年8月13日申請，其等全部藉由引用整體併入本文中。
本文所述的組成物可用於涉及共同投予其它活性劑的方案中。可以使用任何適合的方法或途徑來投予此類其它藥劑。投予途徑包括例如全身、口服、靜脈內、腹膜內、皮下或肌肉內投予。可選擇地，本文所述的AAV組成物亦可藉由此等途徑之一者投予。
縮寫「sc」係指自我互補。「自我互補的AAV」係指其中由重組AAV核酸序列攜帶的編碼區被設計形成分子內雙股DNA模板的構築體。在感染時，並非等待細胞媒介的第二股的合成，而是scAAV的二個互補半部將結合形成一個準備立即複製及轉錄的雙股DNA(dsDNA)單元。參見，例如，D M McCarty et al, “Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis”, Gene Therapy, (August 2001), Vol 8, Number 16, Pages 1248-1254。自我互補AAV描述於例如，例如，美國專利號6,596,535；7,125,717；及7,456,683，其每一者藉由引用整體併入本文。
當涉及蛋白質或核酸使用時，術語「異源的」表示蛋白質或核酸包含在自然界中彼此之間沒有相同關係的二個或更多個序列或子序列。舉例而言，核酸通常是重組產生的，具有二或多個來自無關基因的序列，其排列以產生新的功能性核酸。例如，在一個具體實施例中，該核酸具有來自一個基因的啟動子，其被安排為指導來自不同基因的編碼序列的表現。因此，參照編碼序列，啟動子是異源的。
「複製缺陷病毒」或「病毒載體」係指一合成或人工的病毒顆粒，其中含有感興趣基因的表現盒被包裝於病毒殼體或套膜中，其中任何病毒基因體序列亦被包裝於病毒衣殼或套膜內為複製缺陷的，即它們不能產生子代病毒體但保留感染目標細胞的能力。在一具體實施例中，病毒載體的基因體不包括編碼複製所需的酶的基因(基因體可被工程化為「怯懦的(gutless)」-僅含目標轉基因，側接人工基因體擴增和包裝所需的訊息)，但這些基因可在生產過程中提供。因此，其被認為用於基因治療是安全的，因為除非存在複製所需的病毒酶，否則不會發生子代病毒顆粒的複製和感染。
「重組AAV」或「rAAV」為一種DNAse抗性病毒顆粒，包含AAV衣殼及載體基因體二個元件，該載體基因體至少含有包裝在AAV衣殼內的非AAV編碼序列。在某些具體實施例中，衣殼含有約60種由vp1蛋白、vp2蛋白和vp3蛋白組成的蛋白質，其等自組裝形成衣殼。除非另有說明，否則「重組AAV」或「rAAV」可與短語「rAAV載體」互換使用。rAAV為一種「複製缺陷型病毒」或「病毒載體」，因為其缺少任何功能性AAV rep基因或功能性AAV cap基因且不能產生子代。在某些具體實施例中，唯一的AAV序列是AAV反向末端重複序列(ITR)，其通常位於載體基因體的5’和3’末端，以使位於ITR之間的基因和調控序列包裝在AAV衣殼內。
術語「核酸酶抗性」表示AAV衣殼已組裝在表現匣周圍，該表現匣旨在將轉基因遞送至宿主細胞，並在核酸酶培育步驟中保護這些包裝的基因體序列免於降解(消化)，旨在去除生產過程中可能存在的污染核酸。
如本文所使用，術語「宿主細胞」可指包裝細胞系，其中rAAV由質體產生。或者，術語「宿主細胞」可指需要在其中表現轉基因的目標細胞。
如本文所使用，「載體基因體」係指包裝在形成病毒顆粒的rAAV衣殼內部的核酸序列。此核酸序列含有AAV反向末端重複序列(ITR)。在本文實施例中，載體基因體最低限度地由5’至3’含有AAV 5’ ITR、編碼序列(一個或多個)(即，轉基因(一個或多個))及AAV 3’ ITR。在某些具體實施例中，ITR來自AAV2，可選擇與衣殼不同來源的AAV、或可選擇除了全長ITR以外者。在某些具體實施例中，ITR係來自與生產過程中提供rep功能的AAV相同的AAV來源或反式互補AAV。再者，可使用其它ITR，例如，自我互補(scAAV) ITR。單股AAV及自我互補(sc) AAV二者皆包含在rAAV中。轉基因為一種與載體序列異源之核酸編碼序列，其編碼目的多肽、蛋白質、功能性RNA分子(例如，miRNA、miRNA抑制劑)或其它基因產物。核酸編碼序列係以允許轉基因在目標組織的細胞中轉錄、轉譯及/或表現的方式與調節成分可操作地連接。載體基因體的適合組分在本文中更詳細地討論。在一實施例中，「載體基因體」從5'到3'至少包含載體特異性序列、編碼感興趣之蛋白質的核酸序列，其可操作地連接到調節控制序列(指導它們在目標細胞中的表現)，其中該載體特異性序列可為末端重複序列，其將載體基因體特異性地包裝至病毒載體衣殼或包膜蛋白中。例如，AAV反向末端重複用於包裝至AAV和某些其它微小病毒的衣殼中。
如本文所使用，「可操作地連接的」序列包括與目的基因相鄰的表現控制序列、及反向或遠距離起作用以控制目的基因的表現控制序列。
在某些具體實施例中，用於製造rAAV的非病毒遺傳元件將被稱為載體(例如，生產載體)。在某些具體實施例中，此等載體為質體，但考慮使用其它適合的遺傳元件。此類生產質體可編碼在rAAV生產過程中表現的序列，例如生產rAAV所需的AAV衣殼或rep蛋白，其等不被包裝至rAAV中。或者，此類生產質體可攜帶包裝至rAAV中的載體基因體。
如本文所使用，「親代衣殼」係指選自微小病毒或其它病毒(例如，AAV、腺病毒、HSV、RSV等)的非突變或非修飾衣殼。在某些具體實施例中，親代衣殼包括包含編碼衣殼蛋白(即，vp蛋白)的野生型基因體的任何天然存在的AAV衣殼，其中該衣殼蛋白指導AAV轉導及/或組織特異性向性。在一些具體實施例中，親代衣殼選自天然靶向CNS的AAV。在其它具體實施例中，親代衣殼選自非天然靶向CNS的AAV。
如本文所使用，術語「目標細胞」和「目標組織」可指旨在被對象AAV載體轉導的任何細胞或組織。該術語可指肌肉、肝臟、肺臟、呼吸道上皮、中樞神經系統、神經元、眼睛(眼細胞)或心臟中的任何一種或多種。在一具體實施例中，目標組織為腦。在某些具體實施例中，目標細胞是一種或多種CNS細胞類型(例如腦細胞)，包括但不限於星狀細胞、神經元、神經膠質細胞、室管膜細胞、及脈絡叢細胞。
如本文所使用，「變異體衣殼」或「變異體AAV」或「變異體AAV衣殼」係指修飾的衣殼或突變衣殼，其中該衣殼蛋白包含組織特異性靶向肽的插入。
如本文所使用，「表現匣」係指包含生物學上有用的核酸序列(例如，編碼蛋白質、酶或其它有用的基因產物的基因cDNA、mRNA等)和與其可操作地連接的調控序列的核酸分子，該調控序列指導或調節核酸序列及其基因產物的轉錄、轉譯及/或表現。如本文所使用，「可操作地連接的」序列包括與核酸序列鄰接或不鄰接的調控序列和以反式或順式核酸序列作用的調控序列。此類調控序列通常包括例如啟動子、增強子、內含子、科札克(Kozak)序列、多腺苷酸化序列和TATA訊息中的一種或多種。表現匣可包含基因序列上游(5'至)的調控序列，例如啟動子、增強子、內含子等中的一種或多種，以及一種或多種增強子、或基因序列下游(3 '至)調控序列，例如，包含多腺苷酸化位點的3'非轉譯區(3' UTR)，以及其它元件。在某些具體實施例中，調控序列與基因產物的核酸序列可操作地連接，其中該調控序列與基因產物的核酸序列藉由插入核酸序列，即5'-非轉譯區(5'UTR)分開。在某些具體實施例中，表現匣包含一種或多種基因產物的核酸序列。在一些具體實施例中，表現匣可為單順反子或雙順反子表現匣。在其它具體實施例中，術語「轉基因」係指插入目標細胞的一種或多種來自外源的DNA序列。通常，此種表現匣可用於產生病毒載體並含有本文所述基因產物的編碼序列，其兩側為病毒基因體的包裝訊息和其它表現控制序列，如本文所述的彼等序列。在某些具體實施例中，載體基因體可含有二個或多個表現匣。
在本發明的上下文中，術語「轉譯」係關於在核醣體的一處理，其中mRNA股控制胺基酸序列的組裝以產生蛋白質或肽。
術語「表現」在本文中以其最廣泛的含義使用，且包含RNA的產生或RNA及蛋白質的產生。表現可為短暫的，也可為穩定的。
當提及核酸或其片段時，術語「實質上同源」或「實質上相似」表示當利用適當的核苷酸插入或刪除與另一核酸(或其互補股)最佳比對時，經比對的序列中存在至少約95%至99%的核苷酸序列同一性。較佳地，同源是在全長序列、或其開讀框、或長度為至少15個核苷酸的另一適當片段上。本文描述了適當片段之例。
在核酸序列的上下文中，術語「序列同一性」、「序列同一性百分比」或「同一性百分比」係指二個序列中的殘基在最大對應比對時為相同。序列同一性比較的長度可為涵蓋整個基因體的全長、基因編碼序列的全長或至少約500至5000個核苷酸的片段是受期望的。然而，亦受期望的是較小片段之間的同一性，例如至少約九個核苷酸、通常至少約20至24個核苷酸、至少約28至32個核苷酸、至少約36個或更多個核苷酸。類似地，對於胺基酸序列，可在蛋白質的全長或其片段上容易地確定「序列同一性百分比」。適當地，片段長度為至少約8個胺基酸，並可多至約700個胺基酸。本文描述了適當片段之例。
術語「高度保守的」意指至少80%同一性，較佳為至少90%同一性，更佳為大於97%同一性。藉由本領域技術人員已知的運算法和電腦程式，本領域技術人員可易於確定同一性。
一般而言，當於兩不同腺相關病毒之間指「同一性」、「同源性」或「相似性」時，參照「比對的(aligned)」序列來測定「同一性」、「同源性」或「相似性」。「比對的」序列或「比對」係指多個核酸序列或蛋白質(胺基酸)序列，與參考序列相比，通常包含缺失或額外的鹼基或胺基酸的校正。使用許多公開或市售多序列比對程式(Multiple Sequence Alignment Programs)進行比對。這類程式之例包括「Clustal Omega」、「Clustal W」、「CAP Sequence Assembly」、「MAP」及「MEME」，其等可透過網際網路上的Web伺服器進行訪問。此類程式的其它來源是本領域技術人員已知的。或者，亦可使用Vector NTI公用程式。還有許多技術領域中已知可用於測量核苷酸序列同一性的演算法，包括上述程序中包含的演算法。作為另一例，可使用Fasta™(GCG版本6.1中的程序)比較多核苷酸序列，Fasta™提供在查詢和搜尋序列之間最佳重疊區域的排列比對和百分比序列同一性。例如，核酸序列之間的百分比序列同一性可使用Fasta™及其默認參數決定(字組大小為6及用於得分矩陣的NOPAM因數)，如GCG版本6.1中所提供，藉由引用併入本文。多序列比對程式亦可用於胺基酸序列，例如，「Clustal Omega」、「Clustal X」、「MAP」、「PIMA」、「MSA」、「BLOCKMAKER」、「MEME」及「Match-Box」程式。一般而言，此等程式之任一者皆於內定值下使用，儘管本項技術領域中具通常知識者可根據需要改變這些設定。或者，熟悉技術者可以利用提供至少由參考的算法及程式提供的同一性的程度或排列比對之另一算法或電腦程式。參見，例如，J. D. Thomson et al, Nucl. Acids. Res., “A comprehensive comparison of multiple sequence alignments”, 27(13):2682-2690 (1999)。
在某些具體實施例中，可基於動物模型而不是人類患者來確定有效量。
如上所述，除非另有指明，術語「約」在用於修飾數值時是指相對於給定參考值的±10%的變化(±10%，例如，±1、±2、±3、±4、±5、±6、±7、±8、±9、±10，或其等之間的值)。
在某些情況下，術語「E+#」或術語「e+#」用於引用指數。例如，「5E10」或「5e10」為5x10 10。這些術語可互換使用。
如本說明書上下文和申請專利範圍所使用的，術語「包含」及「含有」及其變體包括「包含(comprises、comprising)」、「含有(contains、containing)」以及其它變異體，包括其它組件、元件、整數、步驟等。術語「由…組成(consists of或consisting of)」為排除其它組件、元素、整數、步驟等。
應注意的是，術語「一」或「一個」係指一個(種)或多個(種)，例如「一種增強子」被理解為代表一種或多種增強子。從而，術語「一(或一種)」、「一種或多種」及「至少一種」在本文中可互換使用。
關於此等發明之敘述，在另一具體實施例中，本文所述的每一種組成物旨在用於本發明的方法中。此外，在另一具體實施例中，本文所述的可用於該方法的每種組成物亦旨在其本身即為本發明的具體實施例。
除非在本說明書中另有定義，本文使用的技術和科學術語具有與本發明所屬領域中具有普通技術人員通常理解的含義相同的含義，並參考已公開內容，這些內容為本領域技術人員提供對本案說明書中使用的許多術語的一般指導。 [實施例]
以下實施例僅為說明性的，並非意圖限制本文所述之發明。
腺相關病毒(AAV)衣殼可在靜脈內(IV)遞送後安全地將基因校正遞送至許多組織。然而，由於血腦障壁(BBB)，即使是所謂的「親神經性」天然血清型亦顯示出基因轉移到中樞神經系統的效率低下。在這裡，我們提出了一種新穎的AAV庫策略以發現能夠引導AAV9通過BBB的肽。我們首先確定了數百種可能與腦毛細管上的蛋白質相互作用的候選肽。我們製備一AAV9變異體庫，在各種結構環境中在衣殼表面展示此等肽。對腦組織衣殼基因的次世代定序(NGS)分析揭示了變異體「YGY」的顯著腦轉導活性，該變體在HVRVIII處具有13個胺基酸插入(YGYGNPATRYFDV；SEQ ID NO：1)。接著，我們部署了一個基於 NGS的優化管道，以同時提高AAV9-YGY中的載體產出率和通過BBB。與C57BL/6J 小鼠中的基準點工程化衣殼AAV9-PHP.B相比，優化的AAV9-YGY變體顯示出從IV遞送的優異腦轉導。然而，不像AAV9-PHP.B，YGY變異體也在不允許AAV9-PHP.B的菌株中產生作用，例如Balb/c。我們討論了這工作對將AAV衣殼靶向組織特異性受體的意義，並將其與更典型的、無偏見的、大型庫篩選方法進行對比，此等方法在大型動物模型中通常被證明是無效的。 [實施例1.在小鼠的初步篩選]
已顯示，小型肽插入AAV衣殼表面的可撓性環可介導與新細胞受體的相互作用。在CalTech (AAV9-PHP.B)發現的一個案例中，插入AAV9上的HVRVIII環的七個胺基酸肽介導與Ly6a的相互作用，Ly6a是一些小鼠品系腦血管系統上的GPI錨定受體。此相互作用驅動AAV9-PHP.B跨越血腦障壁(BBB)的運輸，導致腦細胞轉導比AAV9高約50倍。在這項工作中，我們尋找可結合BBB上的細胞膜標靶的肽插入物，從而有可能驅動AAV9衣殼穿過BBB。
我們試圖藉由先調查可能與腦中的血管細胞相互作用的肽序列的現有學術和專利文獻來解決AAV-BBB問題。我們發現此等肽的下列來源： • 噬菌體顯示實驗的已發表結果，其中噬菌體顯示庫針對初代腦內皮細胞進行淘選； • 已知BBB駐留膜蛋白的天然配體肽； • 靶向BBB駐留膜蛋白之抗體的CDR； • 引起腦炎的黃病毒(flaviviruses)的病毒外殼蛋白；及 • 具有針對GPI錨定的細胞結合活性的細菌毒素。
我們生成一個AAV9插入突變體庫，其中含有來自此等來源的數百種肽，所有肽均個別插入HVRVIII基因座(基於SEQ ID NO：9的AAV9衣殼的胺基酸序列編號，在位置588與589之間)。另請參見各種AAV衣殼蛋白片段中HVRIII區域的比對以供參考。圖13顯示AA9 (AAV9衣殼的胺基酸566至615；SEQ ID NO：30)、AAV8 (AAV8衣殼的胺基酸565至614；SEQ ID NO：31)、AAV7 (AAV7的胺基酸567至616；SEQ ID NO：32)、AAV6 (AAV6衣殼的胺基酸550至599；SEQ ID NO：33)、AAV5 (AAV5的胺基酸556至605；SEQ ID NO：34)、AAV4 (AAV4衣殼的胺基酸558至607；SEQ ID NO：35)、AAV3B (AAV3B衣殼的胺基酸564至613；SEQ ID NO：36)、AAV2 (AAV2衣殼的胺基酸566至615；SEQ ID NO：37)、及AAV1 (AAV1衣殼的胺基酸566至615；SEQ ID NO：38)之各種AAV衣殼蛋白的胺基酸序列的比對區域，其集中於可被插入靶向肽的區域HVRVIII(基於結構分析)。
各個肽通常以多種形式存在於庫中，其不同之處在於1)插入的肽的長度，2)在肽的兩側存在可撓性的GSG或GG連接子序列。肽亦使用多個同義密碼子編碼，以便我們可獨立觀察篩選中的複製活性。
作為對照，還包括PHP.B肽 (C57/BL6的陽性對照和Balb/c & NHP的陰性對照)。每個肽都以多種方式編碼(具有和不具有連接子，以及在幾個同義DNA序列中)。
AAV BBB-特異性衣殼選擇的工程策略，經由BBB候選物迷你庫的篩選技術，該庫包含來自文獻和專利的約10 3種肽變異體(圖未顯示)。生成了一個BBB候選物最小庫(~10 3)，包含數百個肽。我們將這個庫以高劑量靜脈內(IV)注射至2種小鼠品系和一種非人類靈長類動物中。在2-3週的生命週期後，對動物進行屍檢，並收集組織。我們從CNS和其它組織中萃取出AAV載體的DNA基因體，並對其進行次世代定序(NGS)。載體變異體包封它們自己的衣殼基因變異體，使我們能夠通過在感興趣組織中衣殼基因變異體的相對豐度來追踪衣殼活性。我們藉由計算其在CNS中的豐度，標準化為其在注入的庫混合物中的豐度，來對庫中每個變異體的BBB活性(「富集分數」)進行評分。在C57/BL6小鼠(圖1A、6A)、Balb/c小鼠(圖1B、6B)及NHP腦(圖8A及8B)中檢查注射庫的富集分數。
在小鼠研究中，C57/BL6小鼠(圖1A)及Balb/c小鼠(圖1B)的頂部腦富集的HVRVIII插入為： TLAVPFK (SEQ ID NO：11) (PHP.B)、YGYGNPATRYFDV (SEQ ID NO：1)、及HYLGYAWVGG (SEQ ID NO：15), EFSSNTVKLTS (SEQ ID NO：16)、及SANFIKPTSY (SEQ ID NO：17)。陽性對照PHP.B作為最豐集的命中獨立出現3次。三個具有同義密碼子的PHP.B肽為獨立富集的。其它幾種肽亦富集於腦中。圖6A及6B顯示篩選中最佳小鼠腦命中的富集分數，以及參考肽(圖6A為C57BL/6J小鼠；且圖6B為Balb/c小鼠)。 [實施例2.小數命中的二次驗證]
接著，我們藉由為數個命中的衣殼生成GFP報導子載體在小鼠中追蹤初步篩選。將載體以高劑量IV注射C57BL/6J小鼠。2週後，我們對小鼠進行屍檢並收集腦切片的GFP圖像(數據未顯示)。在GFP研究中所測試之所有命中載體都從肝臟中脫離，從肝臟GFP染色中可以看出(數據未顯示)。
我們在條碼載體(barcoded vector)研究中證實這些BBB通過和腦定位的活性。簡而言之，各衣殼用於個別地生產含有GFP報導子基因的載體，其中包括獨特的DNA條碼。將條碼衣殼製劑以等比例混合，並注射C57BL/6J小鼠或Balb/c小鼠(圖9A-9B及10A-10C)。在生命期結束時，犧牲小鼠，屍檢並將組織進行NGS定序，以計算從組織中萃取出的載體基因體中每個條碼的豐度。結果證實了初步篩選中所確定的所有命中衣殼的載體基因體的腦定位。在Balb/c小鼠中，二次驗證篩選顯示針對初步篩選中發現的所有命中序列的腦靶向，尤其是「YGY」(圖9A)。在C576BL/6小鼠中，二次驗證篩選顯示針對初步篩選中發現的所有命中序列的腦靶向(圖10A)。在Balb/c和C57BL/6小鼠中，相對於AVA9，所有命中序列的肝臟脫靶向與腦血管系統的親和力一致(圖9B和10C)。對AAV衣殼中表現最佳的肽命中的轉導水平進行二次驗證，包括皮質、海馬迴、視丘、小腦和肝臟中的GFP報導子轉基因(顯微鏡影像未顯示)。簡言之，在肝臟組織中AAV-PHP.B (1x10 12)及AAV9-YGY (7x10 11)顯示較低GFP表現水平，相較於AAV9 (1x10 12)(即，肝臟脫靶)。在小腦組織中AAV-PHP.B (1x10 12)顯示中等程度增高且AAV9-YGY (7x10 11)顯示稍高GFP表現水平，相較於AAV9(1x10 12)。在海馬迴組織中AAV-PHP.B (1x10 12)顯示及AAV9-YGY (7x10 11)顯示較高GFP表現水平，相較於AAV9。在皮質組織中AAV-PHP.B (1x10 12)顯示及AAV9-YGY (7x10 11)顯示較高GFP表現水平，相較於AAV9 (1x10 12)。此等結果證實YGY為一種有效的BBB通過衣殼。此外，顯示小腦為一個例外(與AAV-YGY及AAV-PHP.B的視丘、海馬迴和皮質相比，觀察到較低表現水平)，證明BBB的異質性。 [實施例3.命中最適化]
於此研究，我們生成了用於最適化庫的載體，其中包含插入序列中所有可能的單點突變，以及插入序列的截短。對於基於截短的庫，使用了一個包含約150個截短版本的「YGY」核肽的迷你庫，其中包括13個胺基酸插入片段的所有可能截短(N端和C端)。然後將基於截短和基於單點突變的載體庫注入小鼠體內。在2週的生命期後，對小鼠進行屍檢，並收集腦組織。我們從腦組織中提取衣殼mRNA，並對其進行次世代定序(NGS)。每個變異體都相對於原始的「YGY」核肽進行評分。檢查產量分數及BBB分數。
基於截短的庫的檢查分數顯示，雖然幾乎所有「YGY」截短皆提高了產量，但皆損害了大腦局限性(圖2A)。然而，廣泛的單一位點「YGY」核肽突變庫的檢查分數顯示，與在AAV9中觀察到的相比，一些「YGY」核肽變異體可提高產量水平，同時亦保留BBB活性(圖2B)。在「YGY」 (SEQ ID NO：1)原始核肽的檢查中，與原生AAV9相比，在大規模檢查時產量下降了90%，在小規模檢查時產量下降了80%。 選定的前7個候選「YGY」核肽變異體，其提高AAV9的產量並保留BBB活性，如下表1所示。
表1.
胺基酸位置   
名稱 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 SEQ ID NOs
YGY Y G Y G N P A T R Y F D V 1
YGY2A Y A Y G N P A T R Y F D V 2
YGY2K Y K Y G N P A T R Y F D V 3
YGY2R Y R Y G N P A T R Y F D V 4
YGY3H Y G H G N P A T R Y F D V 5
YGY8R Y G Y G N P A R R Y F D V 6
YGY8H Y G Y G N P A H R Y F D V 7
YGY13K Y G Y G N P A T R Y F D K 8
下表2顯示對上述前7個「YGY」核肽變異體測量的產量分數、腦mRNA分數、及腦DNA分數的摘述。
表2.
AA AA位置 產量分數 腦mRNA分數 腦DNA分數
K 2 10.4 0.9 0.9
R 2 7.0 1.5 1.7
K 13 6.1 1.0 0.8
R 8 4.7 1.2 2.0
H 3 4.6 1.5 1.5
A 2 2.4 4.2 2.2
H 8 2.3 1.8 2.2
原始YGY    1.0 1.0 1.0
接著，我們檢查上述前7個「YGY」核肽變異體插入物在包含GFP轉基因的AAV9變異體衣殼中的小型及中型規模生產的產量，並將所得產量與天然AAV9及AAV9變異體的產量進行比較，包括原始「YGY」核肽插入物(圖3A)。此結果顯示，與原始「YGY」核肽插入物相比，YGY2A插入物及YGY13K插入物將AAV9的產量提高至多65%。此外，我們檢查了包含「YGY」在小鼠中表現最佳的7個肽插入物的AAV變異體的功能(轉基因：GFP；小鼠：C57BL/6J)。於此研究，以1x10 12GC的劑量靜脈內遞送天然AAV9或特定AAV9變異體。圖4A顯示在小鼠(C57BL/6J)腦中的天然AAV9或AAV9-變異體生物分布，繪製為GC/μg DNA。圖4B顯示在小鼠(C57BL/6J)肝臟中的天然AAV9或AAV9-變異體生物分布，繪製為GC/μg DNA。此結果顯示所有前7種「YGY」核肽變異體都保留強大的腦細胞靶向性。此外，當全身地(即，靜脈內地)遞送時，所有AAV9變異體皆顯示出肝臟脫靶，如生物分布所示，儘管程度不同。圖3B顯示在小鼠(C57BL/6J)腦中用各種AAV9-GFP載體進行的初步轉導試驗，其中將轉導試驗的結果繪製為mRNA拷貝數與微克總mRNA的比率。一些變異體AAV9插入物，包括原始的「YGY」核肽，顯示出優於AAV9-PHP.B的轉導功效。圖在靜脈內遞送AAV9、AAV9-PHP.B、AAV9-YGY及AAV9-YGY變異體後，在從小鼠(C57BL/6J)收集的腦及肝臟組織的細胞中檢查GFP表現(數據未顯示)。簡而言之，在腦組織中，與AAV9-PHP.B相比，AAV9-YGY2R產生的GFP表現水平相似，而與AAV9相比更高。在肝臟組織中，與AAV9-PHP.B相比，AAV9-YGY2R的GFP表現水平略高，而與AAV9相比則顯著降低。在腦組織中，AAV9-YGY2A (包含肽核YAYGNPATRYFDV；SEQ ID NO：2)產生的GFP表現水平與AAV9-PHP.B相比更高，且與AAV9相比顯著更高。
在肝臟組織中，與AAV9-PHP.B相比，AAV9-YGY2A產生的GFP表現水平相似且與AAV9相比則顯著較低。在腦組織中，與AAV9-PHP.B相比，AAV9-YGY8H產生的GFP表現水平相似且與AAV9相比則較高。在肝臟組織中，與AAV9-PHP.B相比，AAV9-YGY8H產生的GFP表現水平較高且與AAV9相比類似。在腦組織中，與AAV9-PHP.B相比，AAV9-YGY13K產生的GFP表現水平稍高且與AAV9相比則顯著較高。在肝臟組織中，與AAV9-PHP.B相比，AAV9-YGY13K產生的GFP表現水平相似且與AAV9相比則顯著較低。在腦組織中，與AAV9-PHP.B相比，AAV9-YGY2K產生的GFP表現水平相似且與AAV9相比則稍高。在肝臟組織中，與AAV9-PHP.B相比，AAV9-YGY2K產生的GFP表現水平較高且與AAV9相比相似。在腦組織中，與AAV9-PHP.B相比，AAV9-YGY3H產生的GFP表現水平稍低且與AAV9相比則相似。在肝臟組織中，與AAV9-PHP.B相比，AAV9-YGY3H產生的GFP表現水平稍高且與AAV9相比則稍較低。在腦組織中，與AAV9-PHP.B相比，AV9-YGY8R產生的GFP表現水平相似且與AAV9相比為稍高。在肝臟組織中，與AAV9-PHP.B相比，AAV9-YGY8R產生的GFP表現水平相似且與AAV9相比則較低。在腦組織中，與AAV9-PHP.B相比，AAV9-YGY產生的GFP表現水平稍高且與AAV9相比則顯著較高。在肝臟組織中，與AAV9-PHP.B相比，AAV9-YGY產生的GFP表現水平較高且與AAV9相比則相似。靜脈遞送AAV9、AAV9-PHP.B、AAV9-YGY、及AAV9-YGY2A變異體(數據未呈現)後，GFP表現於來自從小鼠(C57BL/6J)收集的組織的各自腦區域(即，皮質、視丘、海馬迴、小腦)。簡言之，在海馬迴及視丘中，與AAV9-PHP.B相比，AAV9-YGY及AAV9-YGY2A造成稍高GFP表現水平且與AAV9相比為中等-顯著較高GFP表現水平。在皮質中，與AAV9-PHP.B相比，AAV9-YGY及AAV9-YGY2A產生相似GFP表現水平且與AAV9相比為中等-顯著較高GFP表現水平。在小腦中，與AAV9-PHP.B相比，AAV9-YGY及AAV9-YGY2A產生稍 為較低的GFP表現水平且與AAV9相比為相似GFP表現水平。此結果顯示「YGY」核肽-包含AAV9載體變異體，在腦的所有檢查區域中(除了小腦)，與AAV9-PHP.B相比，具有優異的轉導效力。當於Balb/c小鼠中檢查AAV9及AAV9-變異體載體時觀察到相似結果。圖5A顯示在小鼠(Balb/c)腦中以AA9V-GFP載體的轉導試驗，其中將轉導試驗的結果繪製為mRNA拷貝數與微克總mRNA的比率。圖5B顯示在小鼠肝臟中以GFP載體的轉導試驗，其中將轉導試驗的結果繪製為mRNA拷貝數與微克總mRNA的比率。靜脈遞送AAV9、AAV9-YGY、及AAV9-YGY2A(數據未顯示)後在來自小鼠(Balb/c)收集的組織之各種腦區域(即，皮質、視丘、海馬迴)的細胞中檢查GFP表現。簡而言之，與AAV9相比，在皮質中AAV9-YGY及AAV9-YGY2A產生較高表現水平且在視丘及海馬迴中產生顯著較高表現水平。
此處，我們鑑定出一組多樣化的生物活性、BBB靶向(腦細胞靶向)肽，並證明將此等肽輸入至AAV環境以生成富含 BBB交互能力的迷你庫的潛力。我們鑑定出一種新穎插入物「YGY」，可用於在多種小鼠品系中有效通過BBB的AAV 載體。此外，我們部署了一個基於NGS的優化管道，以進一步增強此主要命中載體的產量特徵及BBB靶向活性。 [實施例4.在各種組織中載體生物分布]
在此研究中，對C57BL/6小鼠(每組5隻小鼠)投予1 x 10 12(1E12) GC (GC/小鼠)之AAV2/9-YGY、AAV2/9-YGY2A、或AAV2/9。檢查小鼠14天(14天壽命)，隨後將小鼠安樂死，收集組織用於載體生物分布分析。
圖11A至11H顯示與AAV9載體相比，在C57BL/6J小鼠中AAV2/9-YGY及AAV2/9-YGY2A載體在各種組織中的生物分布(繪製為拷貝/µg gDNA (qPCR))。圖11A顯示與AAV9載體相比，在C57BL/6J小鼠中AAV2/9-YGY及AAV2/9-YGY2A載體在腦中的生物分布(繪製為拷貝/µg gDNA (qPCR))。圖11B顯示與AAV9載體相比，在C57BL/6J小鼠中AAV2/9-YGY及AAV2/9-YGY2A載體在心臟的生物分布(繪製為拷貝/µg gDNA (qPCR))。圖11C顯示與AAV9載體相比，在C57BL/6J小鼠中AAV2/9-YGY及AAV2/9-YGY2A載體在肝臟的生物分布(繪製為拷貝/ug gDNA (qPCR))。圖11D顯示與AAV9載體相比，在C57BL/6J小鼠中AAV2/9-YGY及AAV2/9-YGY2A載體在肌肉的生物分布(繪製為拷貝/µg gDNA (qPCR))。圖11E顯示與AAV9載體相比，在C57BL/6J小鼠中AAV2/9-YGY及AAV2/9-YGY2A載體在脊髓的生物分布(繪製為拷貝/µg gDNA (qPCR))。圖11F顯示與AAV9載體相比，在C57BL/6J小鼠中AAV2/9-YGY及AAV2/9-YGY2A載體在肺臟的生物分布(繪製為拷貝/µg gDNA (qPCR))。圖11G顯示與AAV9載體相比，在C57BL/6J小鼠中AAV2/9-YGY及AAV2/9-YGY2A載體在腎臟的生物分布(繪製為拷貝/µg gDNA (qPCR))。圖11H顯示與AAV9載體相比，在C57BL/6J小鼠中AAV2/9-YGY及AAV2/9-YGY2A載體在脾臟的生物分布(繪製為拷貝/µg gDNA (qPCR))。
圖12A至12H顯示與AAV9載體相比，在C57BL/6J小鼠中AAV2/9-YGY及AAV2/9-YGY2A載體在各種組織中的生物分布(繪製為相對於AAV2/9的拷貝)。圖12A顯示與AAV9載體相比，在C57BL/6J小鼠中AAV2/9-YGY及AAV2/9-YGY2A載體在腦中的生物分布(繪製為相對於AAV2/9的拷貝)。圖12B顯示與AAV9載體相比，在C57BL/6J小鼠中AAV2/9-YGY及AAV2/9-YGY2A載體在心臟中的生物分布(繪製為相對於AAV2/9的拷貝)。圖12C顯示與AAV9載體相比，在C57BL/6J小鼠中AAV2/9-YGY及AAV2/9-YGY2A載體在肝臟中的生物分布(繪製為相對於AAV2/9的拷貝)。圖12D顯示與AAV9載體相比，在C57BL/6J小鼠中AAV2/9-YGY及AAV2/9-YGY2A載體在肌肉的生物分布(繪製為相對於AAV2/9的拷貝)。圖12E顯示與AAV9載體相比，在C57BL/6J小鼠中AAV2/9-YGY及AAV2/9-YGY2A載體在脊髓的生物分布(繪製為相對於AAV2/9的拷貝)。圖12F顯示與AAV9載體相比，在C57BL/6J小鼠中AAV2/9-YGY及AAV2/9-YGY2A載體在肺臟的生物分布(繪製為相對於AAV2/9的拷貝)。圖12G顯示與AAV9載體相比，在C57BL/6J小鼠中AAV2/9-YGY及AAV2/9-YGY2A載體在腎臟的生物分布(繪製為相對於AAV2/9的拷貝)。圖12H顯示與AAV9載體相比，在C57BL/6J小鼠中AAV2/9-YGY及AAV2/9-YGY2A載體在脾臟的生物分布(繪製為相對於AAV2/9的拷貝)。
此等數據確認與AAV9相比，AAV9-YGY及AAV9-YGY2A在大腦中具有比AAV9大的轉導優勢且為肝臟脫靶。此外，此等數據亦顯示與AAV9相比，AAV9-YGY及AAV9-YGY2A在脊髓具有大的轉導優勢，而在肌肉中具有中度的轉導優勢，且在心臟中脫靶。
(序列表非關鍵詞文字) 以下資訊是為在數字識別碼＜223＞下包含非關鍵詞文字的序列提供的。
SEQ ID NO： 在＜223＞下之非關鍵詞文字
1 ＜223＞  YGY肽序列
2 ＜223＞  YGY2A肽序列
3 ＜223＞  YGY2K肽序列
4 ＜223＞  YGY2R肽序列
5 ＜223＞  YGY3H肽序列
6 ＜223＞  YGY8R肽 序列
7 ＜223＞  YGY8H肽序列
8 ＜223＞  YGY13K肽序列
11 ＜223＞  PHP.B肽序列
12 ＜223＞  AAV2變異體肽序列
14 ＜223＞  Y-G/A/R/K-Y/H-GNPA-T/R/H-RYFD-V/K模體    ＜220＞ ＜221＞  MISC_FEATURE ＜222＞  (2)..(2) ＜223＞  Xaa係選自甘胺酸(G)、丙胺酸(A)、精胺酸(R)、或離胺酸(K)    ＜220＞ ＜221＞  MISC_FEATURE ＜222＞  (3)..(3) ＜223＞  Xaa係選自酪胺酸(Y)、或組胺酸(H)    ＜220＞ ＜221＞  MISC_FEATURE ＜222＞  (8)..(8) ＜223＞  Xaa係選自蘇胺酸(T)、精胺酸 (R)、或組胺酸(H)    ＜220＞ ＜221＞  MISC_FEATURE ＜222＞  (13)..(13) ＜223＞  Xaa係選自纈胺酸(V)、或離胺酸(K)
15 ＜223＞  HYL肽
16 ＜223＞  EFS肽
17 ＜223＞  SAN肽
18 ＜223＞  AAV2/9 n588 YGY2A核酸序列表現匣    ＜220＞ ＜221＞  misc_feature ＜222＞  (1)..(36) ＜223＞  截短的啟動子    ＜220＞ ＜221＞  misc_feature ＜222＞  (1)..(7) ＜223＞  p5 啟動子    ＜220＞ ＜221＞  CDS ＜222＞  (37)..(1902) ＜223＞  AAV2 rep    ＜220＞ ＜221＞  CDS ＜222＞  (1919)..(4168) ＜223＞  AAV9-YGY2A Cap    ＜220＞ ＜221＞  misc_feature ＜222＞  (3683)..(3721) ＜223＞  YGY2A    ＜220＞ ＜221＞  misc_feature ＜222＞  (4258)..(4389) ＜223＞  P5 啟動子    ＜220＞ ＜221＞  misc_feature ＜222＞  (4437)..(4731) ＜223＞  LacZ啟動子
19 ＜223＞  合成構築體
20 ＜223＞  合成構築體
21 ＜223＞  AAV2/9 n588 YGY核酸序列表現匣    ＜220＞ ＜221＞  misc_feature ＜222＞  (1)..(36) ＜223＞  截短的啟動子    ＜220＞ ＜221＞  misc_feature ＜222＞  (1)..(7) ＜223＞  p5啟動子    ＜220＞ ＜221＞  CDS ＜222＞  (37)..(1902) ＜223＞  AAV2 rep    ＜220＞ ＜221＞  CDS ＜222＞  (1919)..(4168) ＜223＞  AAV9-YGY cap    ＜220＞ ＜221＞  misc_feature ＜222＞  (3683)..(3721) ＜223＞  YGY    ＜220＞ ＜221＞  misc_feature ＜222＞  (4259)..(4389) ＜223＞  P5啟動子    ＜220＞ ＜221＞  misc_feature ＜222＞  (4517)..(4731) ＜223＞  LacZ 啟動子
22 ＜223＞  合成構築體
23 ＜223＞  合成構築體
24 ＜223＞  核酸序列YGY2A
25 ＜223＞  核酸序列YGY
26 ＜223＞  AAV9 cap n588 YGY2A核酸序列    ＜220＞ ＜221＞  misc_feature ＜222＞  (1765)..(1803) ＜223＞  YGY2A
27 ＜223＞  AAV9 cap n588 YGY2A胺基酸序列    ＜220＞ ＜221＞  MISC_FEATURE ＜222＞  (589)..(601) ＜223＞  YGY2A
28 ＜223＞  AAV9 cap n588 YGY 核酸序列    ＜220＞ ＜221＞  misc_feature ＜222＞  (1765)..(1803) ＜223＞  YGY
29 ＜223＞  AAV9 cap n588 YGY胺基酸序列    ＜220＞ ＜221＞  MISC_FEATURE ＜222＞  (589)..(601) ＜223＞  YGY
30 ＜223＞  腺相關病毒9衣殼之胺基酸566至615
31 ＜223＞  腺相關病毒8衣殼之胺基酸565至614
32 ＜223＞  腺相關病毒7衣殼之胺基酸567至616
33 ＜223＞  腺相關病毒6衣殼之胺基酸550至599
34 ＜223＞  腺相關病毒5衣殼之胺基酸556至605
35 ＜223＞  腺相關病毒4衣殼之胺基酸558至607
36 ＜223＞  腺相關病毒3B衣殼之胺基酸564至613
37 ＜223＞  腺相關病毒2衣殼之胺基酸566至615
38 ＜223＞  腺相關病毒1衣殼之胺基酸566至615
39 ＜223＞  WPRE元件(mut)
40 ＜223＞  野生型WPRE元件(GenBank: J02442.1，nt 1093-1683)
本說明書中引用的所有文件均藉由引用併入本文。2021年4月23日申請之美國臨時專利申請號63/178,881，藉由引用其整體併入本文。在此一併申請之名稱為「21-9637TW_Sequences_ST25」的序列表和其中的序列和正文藉由引用併入。儘管已參照特定具體實施例描述本發明，但應理解，可在不背離本發明之精神的情況下進行修改。此種修改意圖落入所附申請專利權利的範疇內。
無
圖1A及1B顯示在小鼠(C57BL/6J及Balb/c)腦中表現最佳的肽命中的富集。圖1A顯示來自C57BL/6J小鼠的初級篩選中腦中表現最佳的肽命中的富集。圖1B顯示來自Balb/c小鼠的初級篩選中腦中表現最佳的肽命中的富集。 圖2A及2B顯示來自基於「YGY」的變異體庫的篩選的產量及BBB分數。圖2A顯示來自具有基於截短的「YGY」變異體庫的篩選的產量及BBB分數。圖2B顯示來自具有單點突變體「YGY」變異體庫的篩選的產量及BBB分數。 圖3A及3B顯示AAV9-YGY-變異體的功能研究的結果。圖3A顯示包含GFP轉基因的AAV9-變異體衣殼中的前7個執行插入物的小規模和中等規模生產的產量，且與包含原始YGY肽插入物的AAV9及AAV9-變異體的產量作比較。圖3B顯示以GFP載體在小鼠(C57BL/6J)腦中的初步轉導試驗，繪製為mRNA拷貝數與微克總mRNA的比率。 圖4A及4B顯示小鼠中AAV9或AAV9變異體生物分布。圖4A顯示在小鼠(C57BL/6J)腦中AAV9或AAV9變異體生物分布，繪製為GC/μg DNA。圖4B顯示在小鼠(C57BL/6J)肝臟中AAV9或AAV9變異體生物分布，繪製為GC/μg DNA。 圖5A及5B顯示在小鼠中以AAV-GFP載體進行轉導試驗的結果。圖5A顯示在小鼠(Balb/c)腦中以GFP載體進行轉導試驗，繪製為mRNA拷貝數與微克總mRNA的比率。圖5B顯示在小鼠肝臟以GFP載體進行轉導試驗，繪製為mRNA拷貝數與微克總mRNA的比率。 圖6A及6B顯示在小鼠腦中表現最佳的肽命中的富集分數，與參考肽。圖6A顯示C57BL/6J小鼠的富集分數。圖6B顯示Balb/c小鼠的富集分數。 圖7顯示AAV9-YGY及AAV9-YGY2A的樣品產出率(繪製為GC/細胞堆疊)。 圖8A及8B顯示在篩選中NHP組織中對於表現最佳的肽命中之富集分數。圖8A顯示對於NHP腦的富集分數。圖8B顯示對於NHP脊髓組織的富集分數。 圖9A及9B顯示在Balb/c小鼠中包含GFP報導子轉基因的AAV衣殼中表現最佳的肽命中的轉導水平的二次驗證。相對於AAV9轉導繪製結果。圖9A顯示在Balb/c小鼠中腦組織的選定肽靶向之二次驗證篩選。圖9B顯示在Balb/c小鼠中肝臟組織的選定肽靶向之二次驗證篩選。 圖10A至10C顯示在C57BL/6J小鼠中包含GFP報導子轉基因的AAV衣殼中表現最佳的肽命中的轉導水平的二次驗證。相對於AAV9轉導繪製結果。圖10A顯示在C57BL/6J小鼠(DNA)中腦組織的選定肽靶向之二次驗證篩選。圖10B顯示在C57BL/6J小鼠(RNA)中腦組織的選定肽靶向之二次驗證篩選。圖10C顯示在C57BL/6J小鼠中肝臟組織的選定肽靶向之二次驗證篩選。 圖11A至11H顯示在C57BL/6J小鼠中AAV2/9-YGY及AAV2/9-YGY2A載體於各種組織的生物分布(繪製為拷貝/µg gDNA (qPCR))，與AAV9載體相比。圖11A顯示在C57BL/6J小鼠中AAV2/9-YGY及AAV2/9-YGY2A載體在腦的生物分布(繪製為拷貝/µg gDNA (qPCR))，與AAV9載體相比。圖11B顯示在C57BL/6J小鼠中AAV2/9-YGY及AAV2/9-YGY2A載體在心臟的生物分布(繪製為拷貝/µg gDNA (qPCR))，與AAV9載體相比。圖11C顯示在C57BL/6J小鼠中AAV2/9-YGY及AAV2/9-YGY2A載體在肝臟的生物分布(繪製為拷貝/µg gDNA (qPCR))，與AAV9載體相比。圖11D顯示在C57BL/6J小鼠中AAV2/9-YGY及AAV2/9-YGY2A載體在肌肉的生物分布(繪製為拷貝/µg gDNA (qPCR))，與AAV9載體相比。圖11E顯示在C57BL/6J小鼠中AAV2/9-YGY及AAV2/9-YGY2A載體在脊髓的生物分布(繪製為拷貝/µg gDNA (qPCR))，與AAV9載體相比。圖11F顯示在C57BL/6J小鼠中AAV2/9-YGY及AAV2/9-YGY2A載體在肺臟的生物分布(繪製為拷貝/µg gDNA (qPCR))，與AAV9載體相比。圖11G顯示在C57BL/6J小鼠中AAV2/9-YGY及AAV2/9-YGY2A載體在腎臟的生物分布(繪製為拷貝/µg gDNA (qPCR))，與AAV9載體相比。圖11H顯示在C57BL/6J小鼠中AAV2/9-YGY及AAV2/9-YGY2A載體在脾臟的生物分布(繪製為拷貝/µg gDNA (qPCR))，與AAV9載體相比。 圖12A至12H顯示在C57BL/6J小鼠中AAV2/9-YGY及AAV2/9-YGY2A載體在各種組織中的生物分布(繪製為相對於AAV2/9的拷貝)，與AAV9載體相比。圖12A顯示在C57BL/6J小鼠中AAV2/9-YGY及AAV2/9-YGY2A載體在腦的生物分布(繪製為相對於AAV2/9的拷貝)，與AAV9載體相比。圖12B顯示在C57BL/6J小鼠中AAV2/9-YGY及AAV2/9-YGY2A載體在心臟的生物分布(繪製為相對於AAV2/9的拷貝)，與AAV9載體相比。圖12C顯示在C57BL/6J小鼠中AAV2/9-YGY及AAV2/9-YGY2A載體在肝臟的生物分布(繪製為相對於AAV2/9的拷貝)，與AAV9載體相比。圖12D顯示在C57BL/6J小鼠中AAV2/9-YGY及AAV2/9-YGY2A載體在肌肉的生物分布(繪製為相對於AAV2/9的拷貝)，與AAV9載體相比。圖12E顯示在C57BL/6J小鼠中AAV2/9-YGY及AAV2/9-YGY2A載體在脊髓的生物分布(繪製為相對於AAV2/9的拷貝)，與AAV9載體相比。圖12F顯示在C57BL/6J小鼠中AAV2/9-YGY及AAV2/9-YGY2A載體在肺臟的生物分布(繪製為相對於AAV2/9的拷貝)，與AAV9載體相比。圖12G顯示在C57BL/6J小鼠中AAV2/9-YGY及AAV2/9-YGY2A載體在腎臟的生物分布(繪製為相對於AAV2/9的拷貝)，與AAV9載體相比。圖12H顯示在C57BL/6J小鼠中AAV2/9-YGY及AAV2/9-YGY2A載體在脾臟的生物分布(繪製為相對於AAV2/9的拷貝)，與AAV9載體相比。 圖13顯示AA9 (AAV9衣殼的胺基酸566至615；SEQ ID NO：30)、AAV8 (AAV8衣殼的胺基酸565至614；SEQ ID NO：31)、AAV7 (AAV7的胺基酸567至616；SEQ ID NO：32)、AAV6 (AAV6衣殼的胺基酸550至599；SEQ ID NO：33)、AAV5 (AAV5的胺基酸556至605；SEQ ID NO：34)、AAV4 (AAV4衣殼的胺基酸558至607；SEQ ID NO：35)、AAV3B (AAV3B衣殼的胺基酸564至613；SEQ ID NO：36)、AAV2 (AAV2衣殼的胺基酸566至615；SEQ ID NO：37)、及AAV1 (AAV1衣殼的胺基酸566至615；SEQ ID NO：38)之各種AAV衣殼蛋白的胺基酸序列之特定區域的比對，其集中在HVRVIII區域，其中可能插入靶向肽(基於結構分析)。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018
Figure 12_A0101_SEQ_0019
Figure 12_A0101_SEQ_0020
Figure 12_A0101_SEQ_0021
Figure 12_A0101_SEQ_0022
Figure 12_A0101_SEQ_0023
Figure 12_A0101_SEQ_0024
Figure 12_A0101_SEQ_0025
Figure 12_A0101_SEQ_0026
Figure 12_A0101_SEQ_0027
Figure 12_A0101_SEQ_0028
Figure 12_A0101_SEQ_0029
Figure 12_A0101_SEQ_0030
Figure 12_A0101_SEQ_0031
Figure 12_A0101_SEQ_0032
Figure 12_A0101_SEQ_0033
Figure 12_A0101_SEQ_0034
Figure 12_A0101_SEQ_0035
Figure 12_A0101_SEQ_0036
Figure 12_A0101_SEQ_0037
Figure 12_A0101_SEQ_0038
Figure 12_A0101_SEQ_0039
Figure 12_A0101_SEQ_0040
Figure 12_A0101_SEQ_0041
Figure 12_A0101_SEQ_0042
Figure 12_A0101_SEQ_0043
Figure 12_A0101_SEQ_0044
Figure 12_A0101_SEQ_0045
Figure 12_A0101_SEQ_0046
Figure 12_A0101_SEQ_0047
Figure 12_A0101_SEQ_0048
Figure 12_A0101_SEQ_0049
Figure 12_A0101_SEQ_0050
Figure 12_A0101_SEQ_0051
Figure 12_A0101_SEQ_0052
Figure 12_A0101_SEQ_0053
Figure 12_A0101_SEQ_0054
Figure 12_A0101_SEQ_0055
Figure 12_A0101_SEQ_0056
Figure 12_A0101_SEQ_0057
Figure 12_A0101_SEQ_0058
無。

Claims (22)

  1. 一種重組腺相關病毒顆粒(rAAV)，其包含： (a) AAV衣殼，其包含VP1蛋白、VP2蛋白及VP3蛋白，其中VP3蛋白具有包含高度變異區的胺基酸序列，該高度變異區包含具有下列序列的外源性靶向肽： 可選擇的N端連接子-Y-X’-X”-GNPA-X”’-RYFD-X””，其中X’為G、A、R、K，X”為Y或H，X’”為T、R或H，且X””為V或K(SEQ ID NO：14) -可選擇的C端連接子；及 (b) 包裝於AAV衣殼中的載體基因體，其中載體基因體包含在指導其表現的序列的控制下編碼基因產物的核酸序列。
  2. 如請求項1之rAAV，其中可選擇的N端連接子及/或可選擇的C端連接子之至少一者存在且獨立選自二個胺基酸至七個胺基酸連接子。
  3. 如請求項1之rAAV，其中將SEQ ID NO：14之靶向肽及可選擇的一個或多個連接子插入至親代衣殼之適合位置的高度變異區VIII (HVRVIII)或IV (HVRIV)。
  4. 如請求項3之rAAV，其中親代衣殼選自AAV9、AAV8、AAV7、AAV6、AAV5、AAV4、AAV3、AAV1、AAVhu68、及AAVrh.91。
  5. 如請求項1之rAAV，其中將SEQ ID NO：14之靶向肽及可選擇的一個或多個連接子插入至在如基於SEQ ID NO：9(AAV9)的VP1胺基酸序列的編號所確定之胺基酸588及589之間的高度變異區。
  6. 如請求項1至5中任一項之rAAV，其中外源性靶向肽包含：Y-X’-X”-GNPA-X”’-RYFD-X””，其中X’為G、A、R、K，X”為Y或H，X’”為T、R或H，且X””為V或K(SEQ ID NO：14)。
  7. 如請求項1至6中任一項之rAAV，其中外源性靶向肽選自： (a) YGYGNPATRYFDV (SEQ ID NO：1)；或 (b) YAYGNPATRYFDV (SEQ ID NO：2)。
  8. 如請求項1至6中任一項之rAAV，其中外源性靶向肽選自： (a) YKYGNPATRYFDV (SEQ ID NO：3)； (b) YRYGNPATRYFDV (SEQ ID NO：4)； (c) YGHGNPATRYFDV (SEQ ID NO：5)； (d) YGYGNPARRYFDV (SEQ ID NO：6)； (e) YGYGNPAHRYFDV (SEQ ID NO：7)；或 (f) YGYGNPATRYFDK (SEQ ID NO：8)。
  9. 一種包含如請求項1至8中任一項之rAAV的儲料及一種或多種生理學上可相容的載劑、賦形劑、及/或水性懸浮液基質之組成物。
  10. 一種重組腦細胞-靶向肽，其中 肽包含Y-X’-X”-GNPA-X”’-RYFD-X””之胺基酸序列的核心靶向模體且可選擇地在SEQ ID NO：14的胺基端及/或羧基端處側接二個胺基酸至七個胺基酸，其中X’為G、A、R、K，X”為Y或H，X’”為T、R或H，且X””為V或K(SEQ ID NO：14)，且 可選擇地，肽或具有一個或多個連接子之肽被結合成為奈米顆粒、第二分子、或重組病毒衣殼蛋白。
  11. 如請求項10之重組腦細胞-靶向肽，其中 肽包含：Y-X’-X”-GNPA-X”’-RYFD-X””，其中X’為G、A、R、K，X”為Y或H，X’”為T、R或H，且X””為V或K(SEQ ID NO：14)。
  12. 如請求項10之重組腦細胞-靶向肽、奈米顆粒、第二分子或重組病毒衣殼蛋白，其包含胺基酸序列： (a) YGYGNPATRYFDV (SEQ ID NO：1)；或 (b) YAYGNPATRYFDV (SEQ ID NO：2)。
  13. 如請求項10之重組腦細胞-靶向肽、奈米顆粒、第二分子或重組病毒衣殼蛋白，其包含胺基酸序列： (a) YKYGNPATRYFDV (SEQ ID NO：3)； (b) YRYGNPATRYFDV (SEQ ID NO：4)； (c) YGHGNPATRYFDV (SEQ ID NO：5)； (d) YGYGNPARRYFDV (SEQ ID NO：6)； (e) YGYGNPAHRYFDV (SEQ ID NO：7)；或 (f) YGYGNPATRYFDK (SEQ ID NO：8)。
  14. 如請求項10至12中任一項之重組腦細胞-靶向肽，其中核心靶向模體之胺基酸序列為YGYGNPATRYFDV (SEQ ID NO：1)。
  15. 如請求項10至12中任一項之重組腦細胞-靶向肽，其中核心靶向模體之胺基酸序列為YAYGNPATRYFDV (SEQ ID NO：2)。
  16. 一種核酸分子，其編碼如請求項10至15中任一項之重組腦細胞-靶向肽。
  17. 一種包含如請求項10至15中任一項之重組腦細胞-靶向肽或如請求項16之核酸分子、及一種或多種生理學上可相容的載劑、賦形劑、及/或水性懸浮液基質之組成物。
  18. 一種融合多肽或蛋白質，其包含如請求項10至15中任一項之重組腦細胞-靶向肽及包含至少一種多肽或蛋白質的融合配偶體(fusion partner)。
  19. 一種包含如請求項18之融合多肽或蛋白質及一種或多種生理學上可相容的載劑、賦形劑、及/或水性懸浮液基質之組成物。
  20. 一種如請求項1至8中任一項之rAAV的儲料、如請求項10至15中任一項之重組腦細胞-靶向肽、或如請求項18之融合多肽或蛋白質、或如請求項9、17或19之組成物之用途，其係用於遞送治療劑至有需要的患者。
  21. 一種用於在活體外增加AAV生產細胞轉導之方法，其包含以編碼AAV衣殼的核酸序列將細胞轉導，該AAV衣殼包含Y-X’-X”-GNPA-X”’-RYFD-X””之外源性靶向肽，其中X’為G、A、R、K，X”為Y或H，X’”為T、R或H，且X””為V或K(SEQ ID NO：14)核模體。
  22. 如請求項21之方法，其中生產細胞為293細胞。
TW111115414A 2021-04-23 2022-04-22 具有腦特異性靶向模體的新穎構成物及含有其之組成物 TW202305124A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163178881P 2021-04-23 2021-04-23
US63/178,881 2021-04-23

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202305124A true TW202305124A (zh) 2023-02-01

Family

ID=81585505

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW111115414A TW202305124A (zh) 2021-04-23 2022-04-22 具有腦特異性靶向模體的新穎構成物及含有其之組成物

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20240207452A1 (zh)
EP (1) EP4334334A1 (zh)
AR (1) AR125406A1 (zh)
AU (1) AU2022262771A1 (zh)
BR (1) BR112023021971A2 (zh)
CA (1) CA3216004A1 (zh)
CO (1) CO2023014723A2 (zh)
MX (1) MX2023012513A (zh)
TW (1) TW202305124A (zh)
WO (1) WO2022226263A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG11202110607WA (en) 2019-04-01 2021-10-28 Tenaya Therapeutics Inc Adeno-associated virus with engineered capsid
WO2024130067A2 (en) 2022-12-17 2024-06-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Recombinant aav mutant vectors with cardiac and skeletal muscle-specific targeting motifs and compositions containing same
WO2024130070A2 (en) 2022-12-17 2024-06-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Recombinant aav capsids with cardiac- and skeletal muscle- specific targeting motifs and uses thereof
CN116693633B (zh) * 2023-02-21 2023-12-22 广州派真生物技术有限公司 腺相关病毒突变体及其应用

Family Cites Families (80)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH08506144A (ja) 1993-02-05 1996-07-02 ラポート グループ オーストラリア リミティド スラグ脱泡複合材料
WO1994018317A1 (en) 1993-02-12 1994-08-18 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Regulated transcription of targeted genes and other biological events
US5834266A (en) 1993-02-12 1998-11-10 President & Fellows Of Harvard College Regulated apoptosis
US20020173474A1 (en) 1993-02-12 2002-11-21 President And Fellows Of Harvard College Methods & materials involving dimerization-mediated regulation of biological events
US5869337A (en) 1993-02-12 1999-02-09 President And Fellows Of Harvard College Regulated transcription of targeted genes and other biological events
US5830462A (en) 1993-02-12 1998-11-03 President & Fellows Of Harvard College Regulated transcription of targeted genes and other biological events
US6972193B1 (en) 1993-02-12 2005-12-06 Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University Regulated transcription of targeted genes and other biological events
US6063625A (en) 1993-02-12 2000-05-16 Board Of Trustees Of Leland S, Stanford, Jr. University Regulated transcription of targeted genes and other biological events
US6150137A (en) 1994-05-27 2000-11-21 Ariad Pharmaceuticals, Inc. Immunosuppressant target proteins
US6492106B1 (en) 1994-06-27 2002-12-10 The Johns Hopkins University Mammalian proteins that bind to FKBP12 in a rapamycin-dependent fashion
US6476200B1 (en) 1994-06-27 2002-11-05 The Johns Hopkins University Mammalian proteins that bind to FKBP12 in a rapamycin-dependent fashion
US6133456A (en) 1994-08-18 2000-10-17 Ariad Gene Therapeutics, Inc. Synthetic multimerizing agents
AU3367995A (en) 1994-08-18 1996-03-14 Ariad Pharmaceuticals, Inc. New multimerizing agents
US6150527A (en) 1994-08-18 2000-11-21 Ariad Pharmaceuticals, Inc. Synthetic multimerizing agents
US6326166B1 (en) 1995-12-29 2001-12-04 Massachusetts Institute Of Technology Chimeric DNA-binding proteins
ATE544776T1 (de) 1994-12-29 2012-02-15 Massachusetts Inst Technology Chimäre dna-bindeproteine
WO1996041865A1 (en) 1995-06-07 1996-12-27 Ariad Gene Therapeutics, Inc. Rapamcycin-based regulation of biological events
US6506379B1 (en) 1995-06-07 2003-01-14 Ariad Gene Therapeutics, Inc. Intramuscular delivery of recombinant AAV
US6187757B1 (en) 1995-06-07 2001-02-13 Ariad Pharmaceuticals, Inc. Regulation of biological events using novel compounds
ATE465149T1 (de) 1996-02-28 2010-05-15 Ariad Pharma Inc Synthetische rapamycinderivate als multimerisierende wirkstoffe für chimere proteine mit von immunophilin abgeleiteten domänen
US6723531B2 (en) 1996-04-05 2004-04-20 The Salk Institute For Biological Studies Method for modulating expression of exogenous genes in mammalian systems, and products related thereto
EP0937082A2 (en) 1996-07-12 1999-08-25 Ariad Pharmaceuticals, Inc. Materials and method for treating or preventing pathogenic fungal infection
WO1999010508A1 (en) 1997-08-27 1999-03-04 Ariad Gene Therapeutics, Inc. Chimeric transcriptional activators and compositions and uses related thereto
JP2003524368A (ja) 1997-08-26 2003-08-19 アリアド ジーン セラピューティクス インコーポレイテッド ニ量化ドメイン、三量化ドメインまたは四量化ドメインおよび補足的非相同転写活性化ドメイン、転写抑制ドメイン、ｄｎａ結合ドメインまたはリガンド結合ドメインを含む融合蛋白
US6015709A (en) 1997-08-26 2000-01-18 Ariad Pharmaceuticals, Inc. Transcriptional activators, and compositions and uses related thereto
US6479653B1 (en) 1997-08-26 2002-11-12 Ariad Gene Therapeutics, Inc. Compositions and method for regulation of transcription
US6136597A (en) 1997-09-18 2000-10-24 The Salk Institute For Biological Studies RNA export element
WO1999036553A2 (en) 1998-01-15 1999-07-22 Ariad Gene Therapeutics, Inc. Regulation of biological events using multimeric chimeric proteins
US6984635B1 (en) 1998-02-13 2006-01-10 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University Dimerizing agents, their production and use
AU766513B2 (en) 1998-02-13 2003-10-16 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Novel dimerizing agents, their production and use
US6333318B1 (en) 1998-05-14 2001-12-25 The Salk Institute For Biological Studies Formulations useful for modulating expression of exogenous genes in mammalian systems, and products related thereto
US6258603B1 (en) 1998-06-17 2001-07-10 Rohm And Haas Company Ligands for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex
US7109317B1 (en) 1998-11-06 2006-09-19 President And Fellows Of Harvard College FK506-based regulation of biological events
ES2308989T3 (es) 1999-08-09 2008-12-16 Targeted Genetics Corporation Aumento de la expresion de una secuencia nucleotidica heterologa a partir de vectores viricos recombinantes que contienen una secuencia que forman pares de bases intracatenarios.
ES2219388T3 (es) 1999-08-24 2004-12-01 Ariad Gene Therapeutics, Inc. 28-epi-rapalogos.
US7067526B1 (en) 1999-08-24 2006-06-27 Ariad Gene Therapeutics, Inc. 28-epirapalogs
US20040033600A1 (en) 2001-03-21 2004-02-19 Palli Subba Reddy Ecdysone receptor-based inducible gene expression system
ATE338135T1 (de) 2000-03-22 2006-09-15 Rheogene Holdings Inc Induziertes genexpressionssystem basierend auf ecdysonrezeptoren
US8105825B2 (en) 2000-10-03 2012-01-31 Intrexon Corporation Multiple inducible gene regulation system
US7419829B2 (en) 2000-10-06 2008-09-02 Oxford Biomedica (Uk) Limited Vector system
MXPA03007493A (es) 2001-02-20 2004-10-15 Rheogene Holdings Inc Nuevo sistema de expresion genetica inducible a base de receptor de ecdisona/receptor x retinoide de invertebrado.
US8715959B2 (en) 2001-02-20 2014-05-06 Intrexon Corporation Substitution mutant receptors and their use in a nuclear receptor-based inducible gene expression system
ES2392508T3 (es) 2001-02-20 2012-12-11 Intrexon Corporation Receptores X retinoides quiméricos y su uso en un sistema inducible de expresión génica basado en receptores de ecdisona novedoso
WO2002066615A2 (en) 2001-02-20 2002-08-29 Rheogene, Inc. Novel substitution mutant receptors and their use in a nuclear receptor-based inducible gene expression system
NZ578982A (en) 2001-11-13 2011-03-31 Univ Pennsylvania A method of detecting and/or identifying adeno-associated virus (AAV) sequences and isolating novel sequences identified thereby
ES2975413T3 (es) 2001-12-17 2024-07-05 Univ Pennsylvania Secuencias de serotipo 8 de virus adenoasociado (AAV), vectores que las contienen y usos de las mismas
ES2648241T3 (es) 2003-09-30 2017-12-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Clados de virus adenoasociados (AAV), secuencias, vectores que contienen el mismo, y usos de los mismos
US7935510B2 (en) 2004-04-30 2011-05-03 Intrexon Corporation Mutant receptors and their use in a nuclear receptor-based inducible gene expression system
US8999678B2 (en) 2005-04-07 2015-04-07 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method of increasing the function of an AAV vector
US7456683B2 (en) 2005-06-09 2008-11-25 Panasonic Corporation Amplitude error compensating device and quadrature skew error compensating device
US7588772B2 (en) 2006-03-30 2009-09-15 Board Of Trustees Of The Leland Stamford Junior University AAV capsid library and AAV capsid proteins
AU2009311667B2 (en) 2008-11-07 2016-04-14 Massachusetts Institute Of Technology Aminoalcohol lipidoids and uses thereof
US8734809B2 (en) 2009-05-28 2014-05-27 University Of Massachusetts AAV's and uses thereof
CA2793633A1 (en) 2010-03-29 2011-10-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Pharmacologically induced transgene ablation system
EP2558074B1 (en) 2010-04-08 2018-06-06 The Trustees of Princeton University Preparation of lipid nanoparticles
US8927514B2 (en) 2010-04-30 2015-01-06 City Of Hope Recombinant adeno-associated vectors for targeted treatment
US8853377B2 (en) 2010-11-30 2014-10-07 Shire Human Genetic Therapies, Inc. mRNA for use in treatment of human genetic diseases
WO2012145572A1 (en) 2011-04-20 2012-10-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Regimens and compositions for aav-mediated passive immunization of airborne pathogens
CN108586621A (zh) 2011-05-27 2018-09-28 阿米库斯治疗学公司 将靶向肽偶联于重组溶酶体酶上的方法
AU2012267531B2 (en) 2011-06-08 2017-06-22 Translate Bio, Inc. Lipid nanoparticle compositions and methods for mRNA delivery
FR2977562B1 (fr) 2011-07-06 2016-12-23 Gaztransport Et Technigaz Cuve etanche et thermiquement isolante integree dans une structure porteuse
EP3800254A1 (en) 2012-06-08 2021-04-07 Ethris GmbH Pulmonary delivery of messenger rna
WO2014089486A1 (en) 2012-12-07 2014-06-12 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Lipidic nanoparticles for mrna delivering
WO2014143701A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Amicus Therapeutics, Inc. Chemical crosslinkers
PE20151926A1 (es) * 2013-05-20 2016-01-07 Genentech Inc Anticuerpos de receptores de antitransferrina y metodos de uso
CA2930602C (en) 2013-11-18 2019-05-28 Arcturus Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipid for rna delivery
JP6741590B2 (ja) 2014-04-25 2020-08-19 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア コレステロールレベルを低下させるためのｌｄｌｒ変異体および組成物中でのそれらの使用
KR102526711B1 (ko) 2014-09-24 2023-04-27 시티 오브 호프 고효율 게놈 편집을 위한 아데노-관련 바이러스 벡터 변이체 및 이의 방법
WO2016200543A2 (en) 2015-05-13 2016-12-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Aav-mediated expression of anti-inluenza antibodies and methods of use thereof
WO2017100671A1 (en) 2015-12-11 2017-06-15 California Institute Of Technology TARGETING PEPTIDES FOR DIRECTING ADENO-ASSOCIATED VIRUSES (AAVs)
LT3589730T (lt) 2017-02-28 2024-03-12 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adenoasocijuoto viruso (aav) monofiletinės grupės f vektorius, ir jo panaudojimo būdai
AU2018229293A1 (en) 2017-02-28 2019-08-29 Janssen Biotech, Inc. Influenza vaccines based on AAV vectors
EP3758724A4 (en) 2018-02-27 2022-07-06 The Trustees of The University of Pennsylvania NOVEL ADENO-ASSOCIATED VIRUS (AAV) VECTORS, AAV VECTORS WITH REDUCED CAPSID DEAMIDATION AND USES THEREOF
KR20210107037A (ko) 2018-12-21 2021-08-31 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 이식유전자 발현의 drg-특이적 감소를 위한 조성물
US11867060B2 (en) 2019-02-04 2024-01-09 Technische Universität Wien Reinforced concrete tubbing segment
CN113853207A (zh) 2019-04-29 2021-12-28 宾夕法尼亚州大学信托人 新型aav衣壳和含有其的组合物
CN115175991A (zh) * 2019-10-16 2022-10-11 博德研究所 工程化肌肉靶向组合物
CA3177407A1 (en) 2020-05-12 2021-11-18 James M. Wilson Compositions for drg-specific reduction of transgene expression
JP2023531451A (ja) 2020-06-17 2023-07-24 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア 遺伝子療法患者の治療のための組成物及び方法
AU2021325954A1 (en) 2020-08-14 2023-03-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Novel AAV capsids and compositions containing same

Also Published As

Publication number Publication date
AU2022262771A1 (en) 2023-11-02
EP4334334A1 (en) 2024-03-13
BR112023021971A2 (pt) 2024-02-20
CA3216004A1 (en) 2022-10-27
MX2023012513A (es) 2023-12-15
WO2022226263A1 (en) 2022-10-27
AR125406A1 (es) 2023-07-12
US20240207452A1 (en) 2024-06-27
CO2023014723A2 (es) 2023-11-20
AU2022262771A9 (en) 2023-11-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240207452A1 (en) Novel compositions with brain-specific targeting motifs and compositions containing same
IL297919A (en) Modified Aav and preparations, methods and uses for gene transfer to cells, organs and tissues
US20240024507A1 (en) Novel compositions with tissue-specific targeting motifs and compositions containing same
US20230054144A1 (en) Gene therapy for treating cdkl5 deficiency disorder
EP4069263A1 (en) Transgene cassettes designed to express a human mecp2 gene
WO2023122804A1 (en) Compositions and methods comprising a cardiac-specific promoter
CA3195553A1 (en) Improved adeno-associated virus (aav) vector and uses therefor
US20220370638A1 (en) Compositions and methods for treatment of maple syrup urine disease
EP4384196A1 (en) Compositions and methods for treating a muscular dystrophy
US20230374541A1 (en) Recombinant adeno-associated viruses for cns or muscle delivery
JP2023551911A (ja) アンジェルマン症候群の治療のための組成物及びその使用
JP2023522883A (ja) 神経学的障害を処置するための組成物および方法
TW202325845A (zh) 新穎aav衣殼及含其之組成物
US20240115733A1 (en) Compositions and methods for treatment of niemann pick type a disease
WO2024130070A2 (en) Recombinant aav capsids with cardiac- and skeletal muscle- specific targeting motifs and uses thereof
US20230167464A1 (en) Compositions and methods for reducing nuclease expression and off-target activity using a promoter with low transcriptional activity
AU2023211652A9 (en) Aav capsids for improved heart transduction and detargeting of liver
WO2024130067A2 (en) Recombinant aav mutant vectors with cardiac and skeletal muscle-specific targeting motifs and compositions containing same
JP2024515612A (ja) 球脊髄性筋萎縮症（ｓｂｍａ）の治療に有用な組成物
WO2024216244A2 (en) Targeting aav capsids, methods of manufacturing and using same
JP2024515626A (ja) 血液脳関門を横断し低減された液性応答を惹起する合理的ポリプロイドａａｖビリオン