TR201802230T4 - Lizozomal depo hastalıklarının gelişmiş tedavileri için hedefleyici peptitlerin rekombinan lizozomal enzimler üzerine kenetlenmesi için yöntemler. - Google Patents

Lizozomal depo hastalıklarının gelişmiş tedavileri için hedefleyici peptitlerin rekombinan lizozomal enzimler üzerine kenetlenmesi için yöntemler. Download PDF

Info

Publication number
TR201802230T4
TR201802230T4 TR2018/02230T TR201802230T TR201802230T4 TR 201802230 T4 TR201802230 T4 TR 201802230T4 TR 2018/02230 T TR2018/02230 T TR 2018/02230T TR 201802230 T TR201802230 T TR 201802230T TR 201802230 T4 TR201802230 T4 TR 201802230T4
Authority
TR
Turkey
Prior art keywords
recombinant human
modified
enzyme
peptide
iisosomal
Prior art date
Application number
TR2018/02230T
Other languages
English (en)
Inventor
Do Hung
Original Assignee
Amicus Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Amicus Therapeutics Inc filed Critical Amicus Therapeutics Inc
Publication of TR201802230T4 publication Critical patent/TR201802230T4/tr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6847—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a hormone or a hormone-releasing or -inhibiting factor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/642—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the peptide or protein in the drug conjugate being a cytokine, e.g. IL2, chemokine, growth factors or interferons being the inactive part of the conjugate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/18—Ion-exchange chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/30—Extraction; Separation; Purification by precipitation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/30—Extraction; Separation; Purification by precipitation
    • C07K1/306—Extraction; Separation; Purification by precipitation by crystallization
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/65—Insulin-like growth factors, i.e. somatomedins, e.g. IGF-1, IGF-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

Burada, birinci çapraz bağlayıcı ajanla modifiye edilmiş rekombinant insan lizozomlarına neden olmak için bir birinci çapraz bağlayıcı ajan kullanılarak rekombinant insan lizozomal enzimler üzerindeki amino (N)-ucunun ve bir veya daha fazla lizin kalıntısının modifiye edilmesiyle, bir ikinci çapraz bağlayıcı ajanla modifiye edilmş varyant IGF-2 peptidine neden olmak için bir ikinci çapraz bağlayıcı ajan kullanılarak bir varyant IGF-2 peptit üzerindeki amin (N)-ucundaki bir kısa bağlayıcı içerisindeki birinci amino asidin modifiye edilmesiyle ve daha sonra birinci çapraz bağlayıcı ajanla modifiye edilmiş rekombinant insan lizozomal enzimin bir kısa bağlayıcı ihtiva eden, ikinci çapraz bağlayıcı ajanla modifiye edilmiş varyant IGF-2 peptidine konjuge edilmesiyle, rekombinant lizozomal enzimlere konjuge hedefleyici peptitlerin yapılmasının yöntemleri tarif edilmektedir. Ayrıca burada, IGF2/CI-MPR reseptörü için daha yüksek afinitelere ve hücresel alıma sahip olarak karakterize edilen, burada açıklanan yöntemler kullanılarak sentezlenen konjugatlar tarif edilmektedir. Ayrıca burada, açıklanan konjugatlar kullanılarak tedavi yöntemleri tarif edilmektedir.

Description

TARIFNAME LIZOZOMAL DEPO HASTALIKLARININ GELISMIS TEDAVILERI içiN HEDEFLEYICI PEPTITLERIN REKOMBINAN LIZOZOMAL ENZIMLER ÜZERINE KENETLENMESI IÇIN YÖNTEMLER BULUSUN TEKNIK SAHASI Teknik alan peptit kimyasiyla ilgilidir. Teknik alan ayrica, rekombinant bir Iizozomal enzime konjuge bir hedefleme peptidinin bu yöntemle elde edilen bir konjugat haline getirilmesinin bir yöntemiyle ve Iizozomal depo hastaliklarinin tedavisinde kullanimiyla BULUSUN ALT YAPISI Lizozomlar, proteinlerin, (glikolipitler ve kolesterol dahil olmak üzere) çesitli Iipitlerin ve karbonhidratlarin bozundugu ve yeni proteinlerin, membran bilesenlerinin ve diger moleküllerin sentezini saglayan primer yapitaslarina dönüstürüldügü, özellestirilmis hücreiçi organellerdir. Lizozomlar ayrica hücreler tarafindan, çesitli proteinlerin (örnegin, antikorlarin ve interferonlarin) artan biyosentezi için ilave amino asitleri saglamak ve viral enfeksiyonlarin veya besin yoksunlugunun stresli periyotlariyla bas etmek amaciyla enerji üretimi için besinler tedarik etmek için Iizozomal aktiviteyi arttiran, otofaji olarak bilinen uyarlamali bir hücresel islem üzerinden homeostazin ve hücresel sagligin muhafaza edilmesine yardimci olmalari için de kullanilirlar. Her bir metabolik islemi, spesifik bir yerlesik Iizozomal enzim katalize eder. Genetik mutasyonlar lizozomal biyolojik aktivitelerde, metabolik süreçleri degistiren ve klinik hastaliklara yol açan eksikliklere neden olabilir. Lizozomal depo bozukluklari (LSD'Ier). spesifik Iizozomal proteinler için, endozomaI/Iizozomal bölmeler içerisinde çesitli maddelerin birikmesiyle sonuçlanan bir eksikligin neden oldugu yaklasik 50 farkli Insan metabolik hastaliklarin bir sinifidir. Bu hastaliklarin birçogu, eksik Iizozomal proteinin ve ortaya çikan metabolik kusurun anlasilmasi için iyi-karakterize edilmistir. Örnegin, degistirilmis glikolipit katabolizmanin, Gaucher, Fabry ve Tay-Sachs/Sandhoff gibi çesitli LSD'Ieri bulunmaktadir. Neimann-Pick C, bozulmus Iipit ve kolesterol metabolizmasiyla karakterizeyken, glikojen depo hastaliklari tip II (Pompe) ve tip III (Corey-Forbes) gibi degistirilmis karbonhidrat metabolizmasi hastaliklari da karakterize edilmistir. Diger LSD'ler kemik ve hücre disi anayapilarin metabolizmasini [örnegin, mukopolisakkaridozlar (MPS I-VII) Gaucher] ve protein dönüsümünü (nöronal seroid sekilde tedavi edilmezlerse ciddi kronik hastaliga ve siklikla ölüme neden olabilirler.
Lizozomal depo hastaliklari için bilinen bir tedavi bulunmamaktadir ancak çesitli LSD'Ier için, kemik iligi ve göbek kordonu kan nakli, enzim replasman tedavisi (ERT), substrat indirgeme tedavisi (SRT) ve farmakolojik saperon tedavisi dahil olmak üzere birtakim farkli tedavi yaklasimlari incelenmistir. Gen tedavisi de gelistirilmektedir ancak klinik olarak test edilmemistir. Bu tedavi yaklasimlarinin arasindan, Gaucher, Fabry, Pompe, MP8 l, MPS Il ve MP8 VI dahil olmak üzere çesitli LSD'lerin tedavisi için birden fazla onaylanmis ERT'nin varligiyla ERT en oturmus tedaviyken, bir adet SRT ilaci Gaucher hastaliginin tedavisi için onaylidir.
Bir Iizozomal depo hastaliginin tedavisi için ERT kavrami, bir rekombinant insan iyilestirilmesi için hastalara verildigi sekilde oldukça basittir. Ancak, temel olarak hücre yüzeyinde veya hücrelerin disinda islev gören (örnegin, anti-VEGF ve diger antikorlar, eritropoietin, pihtilasma faktörleri vb.) diger protein terapötik tedavilerin aksine, nedenle hücrelere disaridan girmek ve bu iç bölmelere müteakip aktarim için bir mekanizma gerektirmektedir. Memelilerde, birçok çözünür Iizozomal enzim için belirli asparajin kalintilarinin (N-bagli oligosakkaritler; N-glikanlar) üzerindeki protein omurgasindaki dalli karbonhidrat yapilari, manoz 6-fosfat (M6P) olarak adlandirilan özellestirilmis bir karbonhidrat yapisi olusturmak için post-translasyonel olarak modifiye edilir. M6P, yeni sentezlenmis Iizozomal proteinlerin tanimlanmasi ve Golgi aygitindan sinyaldir. M6P reseptörlerinin bir sinifi da (katyon-bagimsiz M6P reseptörü, CI-MPR) plazma membranina devridaim yapar ve eksojen Iizozomal proteinlerin baglanmasi ve özümsenmesi için islevsel olarak aktiftir. CI-MRP'nin, (hücrelerin disina salgilama vasitasiyla) hücrelerden kaçmis olan Iizozomal proteinlerin yeniden ele geçirilmesi için evrimlesmis olduguna ve böylelikle eksojen Iizozomal proteinlerin özümsenmesi için bir hedefleme mekanizmasi sagladigina ve çesitli LSD'Ier için enzim replasman tedavisinin temeli olduguna inanilmaktadir.
Rekombinant Iizozomal enzim replasman tedavilerinin genellikle güvenli oldugu kanitlanmistir ancak klinik semptomlarin azaltilmasi için etkililikleri oldukça degiskendir. Örnegin, iki haftada bir 1 mg/kg vücut agirliginda dozajli FabrazymeTM (rekombinant asit d-galaktosidaz, A; Genzyme Corp.) ERT, Fabry hastaliginda endotelyal hücrelerden birikmis substratin temizlenmesi için yeterliyken, iki haftada bir 40 mg/kg dozajli MyozymeT'V' (rekombinant insan asit oi-glukosidaz, rhGAA; Genzyme Corp.) Pompe hastaligi için yalnizca bir dereceye kadar etkilidir. Benzesmeyen etkinlik temel olarak, M6P'nin düsük seviyelerinin kötü ilaç hedeflemeyle ve düsük etkinlikle iliskili oldugu sekilde MGP içerigindeki farkliliklara baglanir. Rekombinant Iizozomal enzimlerin üretimi oldukça zorludur çünkü memeli ekspresyon sistemlerinde karbonhidrat islenmesini, özellikle MGP seviyesini kontrol etmek son derece güçtür. Iki özellestirilmis Golgi enzimi M6P modifikasyonunu katalize eder; N-asetilglukosamin fosfotransferaz, belirli terminal manoz kalintilarinin üzerine fosfat-bagli N- asetilglukosamin eklerken, (Örtmesiz Enzim olarak da bilinen) N-Asetilglukosamin-1- fosfodiester a-N-asetilglukosaminidaz, M6P sinyalini açiga çikarmak için örten N- asetilglukosamini yok eder. Ancak, N-asetilglukosamin fosfotransferaz, hücrelerde sinirlayicidir ve bu biyokimyasal tepkime dogasi geregi çesitli Iizozomal proteinleri için etkisizdir. Üretim süreci esnasinda Iizozomal proteinlerin asiri-ekspresyonu bu sorunu epeyce daha kötü hale getirir ve oldukça degisken miktarlarda M6P'ye yol açar.
Dolayisiyla, karbonhidrat isleme çogunlukla tamamlanmaz ve rekombinant Iizozomal enzimlerin, M6P ihtiva eden N-glikanlarin, yüksek-manoz tipi N-glikanlarin M6P- olmayan yapilarinin ve (tipik olarak salgilayici proteinler için) kompleks-tip N-glikanlarin karisimlariyla üretimine yol açar. Konuyu daha da karmasiklastirmak için; ölü veya hasar görmüs hücreler hücre kültürü vasatinin için, MöP'yi yok eden fosfatazlar gibi enzimler salar. Dolayisiyla, indirgenmis M6P içerigi bir rekombinant lizozomal enzimin MGP reseptörleri için baglanma afinitesini düsürür ve hücresel alimini azaltir ve böylelikle ilaç etkinligini indirger. Ölü veya zarar görmüs hücreler, çogunlukla açiga çikarilmayan iç karbonhidratlari açiga çikarmak Için diger karbonhidratlari (örnegin, sialik asitler, galaktoz, vb.) yok eden diger glikosidazlari salar ve bu N-glikanlar kolaylikla anormal olarak tanimlanir. Bu tamamlanmamis N-glikan yapilari, rekombinant Iizozomal proteinlerin dolasimdan klerans hizini, ilaç etkinligini de indirgeyebilen sekilde arttirir. Bu nedenle, azalmis etkinligin telafi edilmesi için daha yüksek ilaç dozlari gereklidir. Ancak daha yüksek ilaç dozlari gereksinimi birden fazla olumsuz sonuca sahiptir: (1) daha yüksek ilaç dozu, zaten pahali olan bir tedaviyi arttirarak fahis-fiyatli olabilir; (2) yüksek ilaç dozlari uzun infüzyon süreleri gerektirir; (3) dolasimdaki yüksek ilaç miktarlari (birçok Pompe hastasinda görülen) kayda deger antikor yanitlariyla sonuçlanir ve sayisiz hasta ayrica infüzyonlar esnasinda alerjik reaksiyonlar deneyimlemistir. FDA, Myozyme için bir “siyah-etiket uyarisi" yayinlamistir ve ilaç çogunlukla baslangiçta çok yavas sekilde verilir ancak infüzyon süresince arttirilir. Bu strateji alerjik tepkilerin hafifletilmesine yardimci olur ancak 12-saatlik infüzyonlarin alisilmamis olmadigi sekilde infüzyon sürelerini kayda deger sekilde uzatir. Çesitli Iizozomal ERT'Ier için ilaç hedefleme gelistirme amaçli potansiyel bir strateji, geleneksel M6P karbonhidrat yapilarini gerektirmeden ERT'Ieri Iizozomlara hedeflemek için hedefleyici bir peptit kullanir. Katyon-bagimsiz MSP reseptörü, insülin-benzeri büyüme faktörü 2 (IGF-2) olarak adlandirilan bir küçük peptit için ayri bir baglanma alani içerdiginden bu kavramsal olarak makuldür ve bu reseptör bu nedenle IGF-2/ (IGF-2/CI-MPR) olarak bilinir. Bu reseptör aslinda sadece eksojen M6P-tasiyan yüzeyinde mevcuttur ve biyolojik olarak aktiftir. MGP reseptörlerini diger sinifi olan katyon-bagimli M6P reseptörü (CD-MPR) sadece Iizozomal proteinlerin hücreler içerisinde tasinmasina dahil olur çünkü hücre yüzeylerinde biyolojik olarak aktif degildir ve IGF-2 peptit baglanma alanindan yoksundur. lGF-2/CI-MPR, bir mono-MGP N- glikani (N-glikan üzerindeki 1 M6P kalintisi) hafif afiniteyle veya bir bis-MGP N-glikani (ayni N-glikan üzerindeki iki M6P kalintisi) yaklasik 3000-kat daha yüksek afiniteyle bagladigi sekilde, M6P için iki ayri baglanma alanina sahiptir (sirasiyla, alanlar 1-3 ve 7-9). Lizozomal proteinler kompleks (sifir M6P), mono- ve bis-MGP N-glikanlarin karisimlarini ihtiva ettiginden, IGF-2/CI-MPR için afiniteleri, M6P-tasiyan N-glikanlarin tipine ve miktarina bagli olarak oldukça degisir. IGF-2 peptidi IGF-2/CI-MPR için, m0n0-M6P N-glikandan yaklasik 230.000-kat daha yüksek sekilde en yüksek afiniteye sahiptir. Çesitli Iigandlarin lGF-2/CI-MPR için baglanma afinitelerinin bir özeti, asagidaki Tablo 17de verilmektedir.
Tablo 1. IGF-2/CI-MPR için Ligand Afinitesi Ligand Baglanma Afinitesi (Görünür Kd; nM) serbest MGP a 7000 pentamanoz-MBP a 6000 bis-MGP N-Glikan a 2 Ligand Baglanma Afinitesi (Görünür Kd; nM) beta-galaktosidaz a 20 WT hIGF-2 b' ° 0,03-0,2 Memelilerde, IGF-2 embriyonik gelisim esnasindaki temel büyüme hormonudur.
Dogumdan sonra, lGF-2 seviyeleri, artik büyümeye (yasam boyunca insan büyüme hormonu tarafindan uyarilma vasitasiyla IGF-1 aracili büyüme) aracilik etmese de nispeten sabit kalir. IGF-2'nin dogumdan sonraki rolü iyi anlasilamamaktadir ancak bu peptidin yara iyilesmesine ve doku tamirine yardimci olduguna inanilmaktadir. IGF-2 çogunlukla dolasimda, serbest IGF-2 peptidinin seviyelerine aracilik eden serum IGF baglayici proteinler (IGFBP'Ier 1-6) tarafindan baglanir. Bu IGFBP'Ier ayrica insülini ve peptidi için dogal klerans yolakidir. IGF-2 yapisal olarak insüline ve IGF-1'e benzer oldugundan, IGF-2/CI-MPR'ye kiyasla insülin reseptörü (~100-kat daha düsük) ve IGF- 1 reseptörü (~230-kat daha düsük) için düsük afiniteye sahiptir. Bu özgüllük, lGF-2/CI- MPR'ye yüksek-afinite baglanmanin muhafaza edilmesi için çesitli amino asitlerin yok edilmesiyle veya spesifik amino asit kalintilarinin (örnegin, [Leu27] IGF-2 & [Leu43] reseptörlerine baglanmayi azaltir veya yok eder. Benzer sekilde, ilk alti amino asit kalintisindan veya 6 konumunda glutamik asit için arjininin bir ikamesinden yoksun olan indirgedigi kanitlanmistir. Önemli sekilde, lGF-2 peptidinin klinik deneylerde güvenli oldugu kanitlanmistir ve belirli gelisme geriliklerinin tedavi edilmesine yardimci olmasi için klinik olarak faydalanilmaktadir. Bu toplu veriler, hücresel alimi ve rekombinant karbonhidrat yapilarinin yerine bir hedefleme motifi olarak IGF-2 peptidinin potansiyel olarak kullanilabilecegini ortaya koymaktadir.
Bir yandan gelismis protein hedefleme için IGF-2-bagli proteinler olustururken diger yandan karbonhidrat isleme hususlarinin üstesinden gelmek için stratejilerin gelistirilmesine yönelik bir ihtiyaç devam etmektedir.
BULUSUN KISA AÇIKLAMASI Burada, bir rekombinant Iizozomal enzime konjuge bir hedefleyici peptidin yapilmasi için, (a)(i) bir birinci çapraz baglayici ajanla modifiye edilmis rekombinant insan rekombinant insan Iizozomal enzim üzerindeki amino (N)-ucunun ve bir veya daha fazla Iizin kalintisinin modifiye edilmesini; (ii) bir ikinci çapraz baglayici ajanla modifiye edilen varyant IGF-2 peptidine neden olmak için bir ikinci çapraz baglayici ajan kullanarak bir varyant IGF-2 peptit üzerindeki amino (N)-ucundaki bir kisa uzatma baglayicisinin birinci amino asidinin modifiye edilmesini ve (iii) birinci çapraz baglayici ajanla modifiye edilmis rekombinant insan Iizozomal enziminin bir kisa uzatma baglayici ihtiva eden, ikinci çapraz baglayici ajanla modifiye edilmis varyant IGF-2 peptide konjuge edilmesini veya (b) bir heterobifonksiyonel çapraz baglayici ajanin bir varyant IGF-2 peptide konjuge edilmesi ve daha sonra heterobifonksiyonel çapraz baglayici ajanla modifiye edilmis varyant IGF-2 peptidin, rekombinant insan Iizozomal enzim üzerindeki N-ucu ve bir veya daha fazla Iizin kalintisiyla tepkimeyle bir rekombinant insan Iizozomal enzime konjuge edilmesini veya (C) bir heterobifonksiyonel çapraz baglayici ajanin, rekombinant insan Iizozomal enzim üzerindeki N-ucu ve bir veya daha fazla Iizin kalintisiyla tepkimeyle bir rekombinant insan Iizozomal enzime konjuge edilmesini ve heterobifonksiyonel çapraz baglayici ajanla modifiye edilmis rekombinant insan Iizozomal enzimin bir varyant IGF-2 peptide konjuge edilmesini içeren bir yöntem saglanmaktadir, burada rekombinant insan Iizozomal enzim sunlardan seçilir; rekombinant insan 0r- glukosidaz (rhGAA), rekombinant insan a-galaktosidaz A (GLA), rekombinant insan asit ß-glukuronidaz (GUS), rekombinant insan d-iduronidaz A (lduA), rekombinant insan isuronidat 2-sülfataz (I28), rekombinant insan ß-heksosaminidaz A (HexA), rekombinant insan ß-heksosaminidaz B (HexB), rekombinant insan oi-manosidaz A, rekombinant insan ß-glukoserebrosidaz (GIcCerase), rekombinant insan asit Iipaz (LPA) veya bunlarin herhangi bir kombinasyonu ve burada birinci çapraz baglayici ajan sunlardan seçilir; N- süksinimidil 6- hidrazinonikotinat aseton (S-Hynic), sülfo-süksinimidil 6-hidrazonikotinat aseton (sülfo- S-HyNic), CG-süksinimidil 6-hidrazin0-nikotinamid (C6-S-Hynic), süksinimidil 4- hidrazitotereftalat hidroklorür (SHTH) süksinimidil 4-hidrazinyum nikotinat hidroklorür (SHNH) veya N-hidroksisüksinimid ester-(PEG)n-hidrazittir, burada n 3-24 PEG birimidir; ve ikinci çapraz baglayici ajan sunlardan seçilir; PEG4-pentafl0robenzen-4- formilbenzoat (PEG4-PFB), süksinimidil 4-formilbenzoat (SFB) and CG-süksinimidil 4- formilbenzoat (CG-SFB) veya birinci çapraz baglayici ajan sunlardan seçilir; N-hidroksisüksinimid ester fosfin (NHS- fosfin), sülfo-N-hidroksisüksinimid ester-fosfin (sülfo-NHS-fosfin), N-hidroksisüksinimid ester-tetraoksapentadekan asetilen (NHS-PEG4-asetilen) veya N-hidroksisüksinimid ester-(PEG)n asetilendir, burada n 3-24 PEG birimidir, NHS-PEG3-S-S-asetilen gibi yarilabilir heterobifonksiyonel çapraz baglayicilar veya diflorosiklooktin (DIFO) ve dibenzosiklooktin (DIBO) gibi siklooktinler ihtiva eden heterobifonksiyonel çapraz baglayicilar; ve ikinci çapraz baglayici ajan sunlardan seçilir; N-hidroksisüksinimid ester-PEG4-azid (HS-PEG4-azid), N-hidroksisüksinimid ester azid (NHS-azid), N- hidroksisüksinimid ester-(PEG)ri aziddir, burada 3-24 PEG birimdir, veya NHS-PEGS-S- S-azid veya heterobifonksiyonel çapraz baglayici ajan sunlardan seçilir; m-maleimidobenzioI-N- hidroksisüksinimid ester (MBS), sülfo-m-maleimidobenziol-N-hidroksisüksinimid ester (sülfo-MBS) ve sülfosüksinimidiI-4-(N-maleimidometil)sikl0heksan-1-karboksilat burada varyant IGF-2 peptit, natif insan IGF-2 dizisine göre asagidaki modifikasyonlardan birini veya daha fazlasini içerir: arjininin 6 konumundaki glutamik asit için ikamesi; 1-4 ve 6 amino asitlerin silinmesi; 1-4, 6 ve 7 amino asitlerin silinmesi; 1-4 ve 6 amino asitlerin silinmesi ve Iizinin 7 konumunda treonin için ikamesi; 1-4 amino asitlerin silinmesi ve glizinin 6 konumunda glutamik asit için ikamesi ve arjininin 65 konumunda Iizin için ikamesi; ve/veya varyant IGF-2 peptit bir afinite etiketi ve/veya IGF-2`yi geçen en az 5 amino asitlik bir baglayici uzatma bölgesi içerir.
Burada ayrica, bir rekombinant insan lizozomal enzime kimyasal olarak konjuge edilmis bir veya daha fazla varyant IGF-2 peptit içeren konjugatlar da saglanmaktadir.
Bir rekombinant insan Iizozomal enzime konjuge edilmis bir heterobifonksiyonel çapraz baglayici ajanla modifiye edilmis varyant IGF-2 peptit içeren konjugatlar da saglanmaktadir.
Ayrica burada, Pompe, Fabry, Gaucher, MPS I, MPS II, MPS VII, Tay Sachs, Sandhoff, oi-mannozidaz veya Wohlman hastaligindan seçilen bir Iizozomal depo hastaliginin tedavisinde kullanim için burada tanimlandigi sekilde bir konjugat da saglanmaktadir.
Varyant IGF-2 peptit SEO ID NO: 2 içerebilir.
Bir uzatma baglayiciyi temsil eden amino asit dizileri SEO ID NO: 3 içerebilir.
SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI Mevcut bulusun yukarida bahsedilen ve diger yönleri, ekteki sekillerle birlikte ele alindiginda, bulusun asagidaki ayrintili tarifnamesinden anlasilmaktadir. Bulusun örneklenmesi amaciyla, sekillerde burada tercih edilen uygulamalar gösterilmektedir, ancak, bulusun açiklanan spesifik araçlarla sinirli olmadigi anlasilmalidir. Sekillerin ölçekli olarak çizilmis olmalari gerekli degildir. Sekillerde: Sekil 1 (A), bir hidrazitle-modifiye Iizozomal enzimin bir benzaldehit-modifiye varyant lGF-2 peptitle konjugasyonu için bir sematigi göstermektedir. Bu konjugasyon tepkimesi öncesinde, Iizozomal enzimler, kimyasal olarak aktif hidrazit fonksiyonel gruplarin eklenmesi için Iizozomal enzimler üzerindeki amino ucunu ve bir veya daha fazla Iizin kalintisini modifiye eden N-süksinimidil 6-hidrazinonikotinamid aseton (S- Hynic) gibi bir birinci çapraz baglayici ajanla kimyasal olarak modifiye edilir. Ayri bir tepkimede, bir varyant IGF2 peptidindeki bir kisa uzatma baglayici bölgesi içerisindeki N-uç amino asit kalintisi, patent basvurusunda tarif edildigi üzere bir benzaldehit fonksiyon grubunu eklemek için PEG4-pentaflorobenzin benzoat (PEG4-PFB) gibi bir ikinci çapraz baglayici ajanla kimyasal olarak modifiye edilir. HidrazitIe-modifiye saflastirilmasindan sonra, bu proteinler, IGF2 peptit-konjuge Iizozomal enzimlerin olusturulmasi için anilin ihtiva eden bir asitli tamponda birlikte inkübe edilir. Bu konjugasyon tepkimesinde, kimyasal olarak aktif hidrazit kimyasal gruplari, stabil esdegerli (hidrazon) baglantilari olusturmak için aldehit gruplariyla tepkimeye girer.
Sekil 1 (B), kullanilabilecek diger uygun birinci çapraz baglayici ajanlari (süksinimidil 6- hidrazinonikotinat aseton (S-Hynic), süksinimidil 4-hidrazitotereftalat hidroklorür (SHTH), süksinimidil 4-hidrazinyum nikotinat hidroklorür (SHNH) ve N- hidroksisüksinimid ester-(PEG)n-hidrazit; burada n= ve ikinci çapraz baglayici ajanlari (PEG4-pentaflor0benzin benzoat (PEG4-PFB), süksinimidil 4- formilbenzoat (SFB) ve 06- süksinimidil 4-formilbenzoat (C6-SFB)) göstermektedir.
Sekil 2 (A), fosfinle-modifiye Iizozomal enzimin, Staudinger ligasyon tepkimesi vasitasiyla azidIe-modifiye varyant IGF2 peptitle konjugasyonu için bir sematigi göstermektedir. Bu konjugasyon tepkimesi öncesinde, Iizozomal enzimler, kimyasal olarak aktif fosfin fonksiyonel gruplarin eklenmesi için Iizozomal enzimler üzerindeki amino ucunu ve bir veya daha fazla lizin kalintisini modifiye eden sülfo- NHS-fosfin gibi bir birinci çapraz baglayici ajanla kimyasal olarak modifiye edilir. Ayri bir tepkimede, bir varyant IGF2 peptidindeki bir kisa uzatma baglayici bölgesi içerisindeki N-uç amino asit kalintisi, bir azid fonksiyonel grubunu eklemek için NHS-(PEG)n-azid gibi bir ikinci çapraz baglayici ajanla kimyasal olarak modifiye edilir. Fosfinle-modifiye Iizozomal enzimlerin ve azidIe-modifiye varyant IGF2 peptidin saflastirilmasindan sonra, bu proteinler, IGF2 peptit-konjuge Iizozomal enzimlerin olusturulmasi için hafifçe asitli bir tamponda birlikte inkübe edilir. Bu konjugasyon tepkimesinde, kimyasal olarak aktif azid kimyasal gruplari, stabil esdegerli (amid) baglantilari olusturmak Için fosfin gruplariyla tepkimeye girer. Sekil 2 (B), kullanilabilecek diger uygun birinci çapraz baglayici ajanlari (N-hidroksisüksinimid ester-fosfin (NHS-fosfin) ve Sülfo-N- hidroksisüksinimid ester-fosfin (Sülfo-NHS-fosfin) ve ikinci çapraz baglayici ajanlari (N- hidroksisüksinimid ester-azid (NHS-azid), N-hidroksisüksinimid ester-(PEG)n-azid; burada n= göstermektedir.
Sekil 3 (A), asetilen-modifiye Iizozomal enzimin, Click kimyasi vasitasiyla azidle- modifiye varyant lGF2 peptitle konjugasyonu için bir sematigi göstermektedir. Bu konjugasyon tepkimesi öncesinde, Iizozomal enzimler, kimyasal olarak aktif asetilen fonksiyonel gruplarin eklenmesi için Iizozomal enzimler üzerindeki amino ucunu ve bir veya daha fazla lizin kalintisini modifiye eden NHS-(PEG)n-asetilen gibi bir birinci çapraz baglayici ajanla kimyasal olarak modifiye edilir. Ayri bir tepkimede, bir varyant kalintisi, bir azid fonksiyonel grubunu eklemek için NHS-(PEG)n-azid gibi bir ikinci çapraz baglayici ajanla kimyasal olarak modifiye edilir. Asetilen-modifiye Iizozomal enzimlerin ve azidIe-modifiye varyant IGF2 peptidin saflastirilmasindan sonra, bu proteinler, IGF2 peptit-konjuge Iizozomal enzimlerin olusturulmasi için bakir (I) iyonlari içeren hafifçe asitli bir tamponda birlikte inkübe edilir. Bu konjugasyon tepkimesinde, kimyasal olarak aktif azid kimyasal gruplari, stabil esdegerli (triazol) baglantilari olusturmak için alkin gruplariyla tepkimeye girer. Sekil 3 (B), kullanilabilecek diger uygun birinci çapraz baglayici ajanlari (N-hidroksisüksinimid ester- tetraoksapentadekan asetilen (NHS-PEG4-asetilen), N-hidroksisüksinimid ester- (PEG)n-asetilen; burada n= ve ikinci çapraz baglayici ajanlari (N-hidroksisüksinimid ester-azid (NHS-azid), N- hidroksisüksinimid ester-(PEG)n-azid; burada n=3-24 PEG birim ve NHS-PEGB-S-S- azid) göstermektedir.
Sekil 4 (A), m-maleimidobenzioI-N-hidroksisüksinimid ester (MBS) gibi bir tekli çapraz baglayici ajan kullanilarak Iizozomal enzimlerin ve IGF2 peptidin konjugasyonunun bir sematigini göstermektedir. Birinci tepkimede, kimyasal olarak reaktif maleimid grubu, bir lGF2 peptit varyantindaki bir C-uç sistein kalintisinin serbest sülfhidril grubuyla tepkimeye girer. MBS-modifiye IGF2 peptit daha sonra saflastirilir ve daha sonra kimyasal olarak reaktif N-hidroksisüksinimid ester grubunun, stabil esdegerli (amid) baglantilarinin olusturulmasi için Iizozomal enzimler üzerindeki amino ucuyla ve bir veya daha fazla lizin kalintisiyla çapraz baglanmasi vasitasiyla Iizozomal enzimlere konjuge edilir. Sekil 4 (B), kullanilabilecek diger uygun çapraz baglayici ajanlari (m- MaleimidobenzioI-N-hidroksisüksinimid ester (MBS), SüIfo-m-maleImidobenzioI-N- hidroksisüksinimid ester (sülfo-MBS) ve SülfosüksinimidiI-4-(N- maleimidometil)sikloheksan-1-karboksilat (SMCC)) göstermektedir.
Sekil 5, IGF2 peptitlerin C4 ters faz kromatografiyle karakterizasyonunu göstermektedir. Dogal sus ve varyant IGF2 peptitlerin safliginin ve protein yapisinin degerlendirilmesi Için bir 4,6 X 150 mm C4 ters farz analitik kolon kullanildi. Peptit numuneleri, %O,1 triflorasetik asit (TFA) ve %25 asetonitril ile dengelenmis C4 kolonu üzerine yüklendi. 2 dakika sonra, kolon 10 dakika süreyle bir %25-35 asetonitril dogrusal gradyan kullanilarak gelistirildi. Sekil 5 (A), %30 asetonitrile karsilik gelen yaklasik 7,5 dakikada rekombinant dogal sus insan IGF2 peptit ayrisimlarini göstermektedir. Sekil 5 (B), %30 asetonitrile karsilik gelen yaklasik 7,5 dakikada rekombinant varyant insan IGF2 peptit ayrisimlarini göstermektedir. Sekil 5 (C), %31 asetonitrile karsilik gelen yaklasik 8 dakikada PEG4-PFB modifiye varyant insan IGF2 peptit ayrisimlarini göstermektedir. Bu veriler, dogal sus ve varyant IGF2 peptitlerin, C4 ters faz kromatografide neredeyse özdes davrandiklari için çok benzer protein yapilarina sahip oldugunu isaret etmektedir. PEG4-PFB modifiye insan lGF2 peptit için tutulum zamanindaki degisim, varyant IGF2 peptidin, C4 kolonu üzerindeki etkilesimini degistirmis olan kimyasal çapraz baglayiciliyla tamamen modifiye edilmis oldugunu isaret etmektedir.
Sekil 6, reseptör baglanmasi ve hücresel alim için varyant IGF2-peptitIe-konjuge rhGAA”nin degerlendirilmesini göstermektedir. Varyant IGF2 peptit çapraz baglayici PEG4-PFB ile modifiye edildi ve müteakiben S-Hynic-modifiye rhGAA'ya kenetlendi.
Ortaya çikan (vIGF2-rhGAA olarak tayin edilen) varyant IGF2 peptitle-konjuge rhGAA daha sonra boyut dislama kromatografisiyle saflastirildi. Varyant IGF2 peptidin kimyasal konjugasyonunun lGF2/CI-MPR reseptörü için rhGAA afinitesini gelistirip gelistirmedigini belirlemek için, konjuge edilmemis rhGAA'nin ve vIGF2-rhGAA'nin baglanmasi dogrudan degisen protein konsantrasyonlarinda (0.012-42 nM rhGAA'ya karsilik gelen 0,003-10 pg/ml) reseptör plakasi baglama tayinlerinde karsilastirildi (Sekil 6 (A)). Bu IGF2/CI-MPR reseptör plakasi baglanma tayinlerinde test edilen tüm protein konsantrasyonlarinda, yakalanan enzim aktivitesinin konjuge edilmemis rhGAA”dan vIGF2-rhGAA için kayda deger sekilde daha yüksek miktarlari gözlemlendi.
Bu sonuçlar, IGF2 peptidinin konjugasyonunun lGF2/Cl-MPR için rhGAA afinitesini arttirdigini onaylamaktadir. Dahasi, serbest dogal sus IGF2 peptidin eklenmesi bu plaka tayinlerinde, baglanmanin IGF2 peptidine bagli oldugunu isaret eder sekilde vIGF2-rhGAA yakalanmasini büyük ölçüde indirgemistir. Serbest dogal sus IGF2 peptidinin çok daha yüksek miktarlari muhtemelen, bu reseptör plakasi tayinlerinde vIGF2-rhGAA baglanmasini tamamen ortadan kaldirmak için gereklidir. Artan reseptör afinitesinin vIGF2-rhGAA için gelismis hücresel alima yol açip açmadigini belirlemek için, hücre disi konjuge edilmemis rhGAA ve vIGF2-rhGAA'nin özümsenmesi, L6 siçan iskelet kas miyoblastlarinda degerlendirildi (Sekil 6 (8)). vIGF2-rhGAA'nin, test edilen tüm protein konsantrasyonlarinda L6 miyoblastlarinda, konjuge edilmemis rhGAA'dan büyük ölçüde daha iyi özümsendigi gösterilmistir. Bu sonuçlar, hedef hücrelerde eksojen Iizozomal enzimlerin özümsenmesinin ve aktarilmasinin güçlendirilmesi için reseptör baglanma afinitesinin gelistirilmesinin fonksiyonel faydasini ortaya kanitlamaktadir.
Sekil 7, varyant IGF2 peptit-konjuge I2S'nin karakterizasyonunu göstermektedir.
Varyant IGF2 peptidi çapraz baglayici NHS-PEG4-azid ile modifiye edildi ve müteakiben fosfinle-modifiye I28'ye kenetlendi. Ortaya çikan (vIGF2-I28 olarak tayin edilen) varyant IGF2 peptit-konjuge l2S, boyut dislama kromatografisiyle saflastirildi.
Varyant IGF2 peptidin kimyasal konjugasyonunun IGF2/CI-MPR reseptör için IZS afinitesini gelistirip gelistirmedigini belirlemek için, konjuge edilmemis IZS ve vIGF2- konsantrasyonlarinda (0,03-10 ug/ml) karsilastirildi (Sekil 7 (A)). Bu lGF2/Cl-MPR reseptör plakasi baglanma tayinlerinde, test edilen tüm protein konsantrasyonlarindaki konjuge edilmemis I28'den, vIGF2-l28'nin kayda deger sekilde daha yüksek miktarlari yakalandi. Bu reseptör baglanma sonuçlari, vIGF2-rhGAA ile olanlarla tutarlidir ve lGF2/Cl-MPR reseptörü için baglanma afinitelerini arttirmak amaciyla ayni varyant göstermektedir. Birden fazla varyant IGF2 peptidinin Iizozomal enzimlere kimyasal olarak konjuge edilip edilemeyecegini belirlemek için, konjuge edilmemis I28 ve vIGF2- l28'nin moleküler kütlesi, sodyum dodesilsülfat poliakrilamid jel elektroforez (SDS- PAGE) tarafindan karsilastirildi (Sekil 7(B)). Konjuge edilmemis IZS, SDS-PAGEtde yaklasik 80 kDa'Iik bir görünür moleküler agirliga sahipken (kulvar 1) vIGF2-I28 yaklasik 120 kDa'Iik çok daha yüksek bir görünür moleküler agirliga sahip olmustur (kulvar 2). Bu veriler, birden fazla varyant IGF2 peptidin, varyant IGF2 peptit için moleküler kütle yalnizca ~8 kDa (kulvar 3) oldugundan, yaklasik 40 kDa”lik bir artis için l28 üzerine kimyasal olarak konjuge edilmis olmasi gerektigini isaret etmektedir. Bu sonuçlar ayrica, SDS-PAGE'deki genis protein bandiyla kanitlandigi üzere, l28'nin degisen varyant IGF2 peptitleriyle birlikte tamamen vIGF2-I28'ye dönüstügünü göstermektedir. ÖRNEKLEYICI UYGULAMALARIN DETAYLI AÇIKLAMASI Mevcut konu, bu açiklamanin bir parçasini olusturan ekteki sekiller ve örneklerle birlikte ele alinan asagidaki ayrintili tarifnameye istinaden daha kolayca anlasilabilir.
Ayrica, ekli istemler dahil olmak üzere spesifikasyonda kullanildigi sekilde, tekil formlar sekilde belirtmedigi sürece, en azindan o belirli degeri içerir. Burada kullanildigi sekliyle, “birden fazla" terimi, birden fazla anlamina gelmektedir. Degerlerin bir araligi ifade edildiginde, bir baska uygulama bir belirli degerden ve/veya diger belirli degere olan kismi içerir. Benzer sekilde, degerler “yaklasik” öncülünün kullanilmasiyla yaklasik olarak ifade edildiginde, belirli degerin bir baska uygulamayi olusturdugu anlasilmaktadir. Tüm araliklar kapsayicidir ve birlestirilebilir.
Buluslarin daha iyi anlasilmasina yardimci olmak için örnekler saglanmaktadir.
Bir hedefleyici peptidin bir rekombinant Iizozomal enzime konjuge edilmesi için uygun yöntemler, bir birinci çapraz baglayici ajanla modifiye edilmis rekombinant insan rekombinant insan Iizozomal enzim üzerindeki amino (N)-ucunun ve bir veya daha fazla Iizin kalintisinin modifiye edilmesini, bir iknci çapraz baglayici ajanla modifiye edilmis varyant IGF-2 peptidine neden olmak için bir ikinci çapraz baglayici ajan kullanlarak bir varyant IGF-2 peptidinden önceki bir kisa uzatma baglayici bölgesinin amino (N)-ucundaki birinci amino asidin modifiye edilmesini ve daha sonra birinci çapraz baglayici ajanla modifiye edilmis rekombinant insan Iizozomal enzimin, bir kisa uzatma baglayici ihtiva eden, ikinci çapraz baglahyici ajanla modifiye edilmis varyant Uygun kisa uzatma baglayicilari 5 ila 20 amino asit kalintisi uzunlugunda olabilir. Kisa uzatma baglayici ayrica, yaklasik 10 amino asit uzunlugunda da olabilir. Uygun kisa uzatma baglayicilari, SEQ ID NO:3'teki amino asit dizisiyle temsil edilebilir. Diger uygun kisa uzatma baglayicilari, bir 5-amin0 asitlik esnek GS uzatma baglayici (glizin- glizin-glizin-glizin-serin), 2 esnek GS baglayicisi içeren bir 10-amino asitlik uzatma baglayici, 3 esnek GS baglayicisi içeren bir 15-amino asitlik uzatma baglayici, 4 esnek GS baglayicisi içeren bir 20-amino asitlik uzatma baglayici veya bunlarin herhangi bir kombinasyonu kullanilarak saglanabilir.
Birinci çapraz baglayici ajanla modifiye edilmis rekombinant Iizozomal enzim olan rekombinant Iizozomal enzime konjuge edilmis bir hedeflenmis peptidin yapilmasinin uygun yöntemleri, kimyasal olarak modifiye edilmis bir N-ucuna ve bir birinci çapraz baglayici ajan kullanilarak modifiye edilen bir veya daha fazla modifiye lizin kalintisina sahip olarak karakterize edilen bir rekombinant insan Iizozomal enziminin kullanilmasini içerir. Uygun rekombinant insan Iizozomal enzimlerine, insan asit oi- glukosidaz (rhGAA), insan asit oi-galaktosidaz A (GLA), insan asit ß-glukuronidaz (GUS), insan asit oi-iduronidaz A (IduA), insan asit iduronidat 2-sülfataz (IZS), insan [3- heksosaminidaz A (HexA), insan ß-heksosaminidaz B (HexB), insan asit oi-manosidaz A, insan ß-glukoserebrosidaz (GIcCerase), insan asit Iipaz (LPA) ve bunlarin herhangi bir kombinasyonu dahildir. Bir veya daha fazla Iizin kalintisi ayrica, rekombinant insan hedefleyici peptitlere kimyasal kenetlenme için Iizozomal enzimler üzerinde hidrazit kesitlerinin eklenmesi için uygun birinci çapraz baglayici ajanlara, süksinimidil 6- hidrazinonikotinat aseton (S-Hynic), sülfo- süksinimidil 6-hidrazinonik0tinat aseton (sülfo-S-HyNic), veya Cö-süksinimidil 6-hidrazin0-nikotinamid (Cö-S-Hynic), veya süksinimidil 4-hidrazitotereftalat hidroklorür (SHTH), veya süksinimidil 4-hidrazinyum nikotinat hidroklorür (SHNH) veya N-hidroksisüksinimid ester-(PEG)n-hidrazit, burada ri 3-24 PEG birimdir, dahildir. Alternatif olarak, Iizozomal enzimler, N-hidroksisüksinimid ester-fosfin (NHS-fosfin), sülfo-NHS-fosfin, N-hidroksisüksinimid ester- tetraoksapentadekan asetilen (NHS-PEG4-asetilen) diger NHS-(PEG)n-asetilen heterobifonksiyonel çapraz baglayicilar, burada “n” 3 ila 24 arasinda ayri PEG birimi araligindadir, veya NHS-PEGß-S-S-asetilen gibi yarilabilir heterobifonksiyonel çapraz baglayicilar veya diflorosiklooktin (DIFO) and dibenzosiklooktin (DlBO) gibi siklooktinler ihtiva eden heterobifonksiyonel çapraz baglayicilarla veya bunlarin herhangi bir kombinasyonuyla, kimyasal olarak modifiye eidlmis Iizozomal enzimlerin reaktif azid gruplari ihtiva eden kimyasal olarak modifiye edilmis hedefleyici peptitlere kenetlenmesi için modifiye edilebilir. Reaktif hidrazit gruplari ihtiva eden Iizozomal enzimlere konjugasyon için hedefleyici peptitlerin üzerine reaktif aldehit gruplarinin eklenmesi amaciyla hedefleyici peptitlerin modifikasyonu için uygun ikinci çapraz baglayici ajanlara, PEG4-pentaflorobezen-4-formilbenzoat (PEG4-PFB), veya süksinimidil 4- formilbenzoat (SFB), veya 06- süksinimidil 4-formilbenzoat (Cö-SFB) dahildir. Reaktif fosfinler veya alkinler veya siklooktin gruplari ihtiva eden Iizozomal enzimlere konjugasyon için hedefleyici peptitlerin üzerine reaktif azid gruplarinin eklenmesi amaciyla, hedefleyici peptitler ayrica, n`nin 3 ila 24 arasinda ayri PEG birimi araliginda degisebildigi N-hidroksisüksinimid ester-azid (NHS-azid) veya N-hidroksisüksinimid ester-tetraoksapentadekan-azid (NHS-PEG4-azid) veya diger NHS-(PEG)n-azid çapraz baglayicilar gibi heterobifonksiyonel çapraz baglayicilarla veya NHS-PEGS-S- S-azid gibi yarilabilir heterobifonksiyonel çapraz baglayicilarla da modifiye edilebilir.
Tercih edilen bir uygulamada, birinci çapraz baglayici ajan N-süksinimidil 6- hidrazinonikotinat aseton (S-Hynic) olabilir ve ikinci çapraz baglayici ajan PEG4- pentaflorobezen-4-formilbenzoat (PEG4-PFB) olabilir.
Rekombinant insan Iizozomal enzim üzerindeki N-ucu ve bir veya daha fazla Iizin kalintisi, primer aminlerin yoklugunda yaklasik 7,3 pH'ta yaklasik oda sicakliginda yaklasik 30 dakika süreyle bir tamponda modifiye edilebilir. Rekombinant insan kalintilari modifiye edildikten sonra asitli bir tamponun içine hizlica degistirilebilir. Örnegin, asitli tampon, yaklasik 5,0 pH'ta 50 mM sodyum asetat olabilir. Asitli tampon yaklasik 5,0 pH'ta 0,1M sodyum asetat, potasyum asetat, sodyum sitrat, MES, sodyum fosfat veya potasyum fosfat olabilir. Asitli bir tamponun içine degistirme, boyut dislamali kromatografi kullanilarak gerçeklestirilebilir ve asitli bir tampon içine degistirme diyaliz kullanilarak gerçeklestirilebilir.
Bir kisa baglayici ihtiva eden, ikinci çapraz baglayici ajanla modifiye edilmis varyant veya ters faz kromatografi kullanilarak gerçeklestirilebilir.
HidrazitIe-modifiye rekombinant insan lizozomal enzimin kisa bir baglayici ihtiva eden aldehitIe-modifiye varyant IGF-2 peptide konjugasyonu, asitli tamponda yaklasik 5,0 pH'ta anilin varliginda gerçeklestirilebilir. Fosfinle- veya asetilenle- veya siklooktinle- modifiye rekombinant insan Iizozomal enzimin kisa bir baglayici ihtiva eden azidle- modifiye varyant lGF-2 peptide konjugasyonu, 5,0 - 7,0 pH arasinda degisen tamponlarda gerçeklestirilebilir. Kisa bir baglayici ihtiva eden, rekombinant insan diyaliz kullanilarak saflastirilabilir.
Reaktif aldehit gruplari ihtiva eden hedefleyici peptitlere kimyasal kenetlenme için baglayici ajana, süksinimidil ö-hidrazinonikotinat aseton (S-Hynic), sülfo- süksinimidil 8- hidrazinonikotinat aseton (sülfo-S-HyNic), veya Cö-süksinimidil 6-hidrazin0-nikotinamid (CG-S-Hynic), veya süksinimidil 4-hidrazitotereftalat hidroklorür (SHTH), veya süksinimidil 4-hidrazinyum nikotinat hidroklorür (SHNH) veya N-hidroksisüksinimid ester-(PEG)n-hidrazit dahildir, burada n 3-24 PEG birimdir. Alternatif olarak, Iizozomal enzimler, bu kimyasal olarak modifiye edilmis lizozomal enzimlerin reaktif azid gruplari ihtiva eden hedefleyici peptitlere kenetlenmesi için, N-hidroksisüksinimid ester-fosfin (NHS-fosfin), @NHS-fosfin, N-hidroksisüksinimid ester-tetraoksapentadekan asetilen (NHS-PEG4-asetilen), “n”nin 3 ila 24 arasinda ayri PEG birimleri araliginda oldugu diger NHS-(PEG)n-asetilen heterobifonksiyonel çapraz baglayicilarla veya NHS-PEGS-S-S-asetilen gibi yarilabilir heterobifonksiyonel çapraz baglayicilarla veya diflorosiklooktin (DIFO) ve dibenzosiklooktin (DIBO) gibi siklooktinler ihtiva eden heterobifonksiyonel çapraz baglayicilarla veya bunlarin herhangi bir kombinasyonuyla modifiye edilebilir. Hedefleyici peptitlerin modifiye edilmesi için uygun ikinci çapraz baglayici ajanlara, PEG4-pentaflorobenzen-4-formiIbenzoat (PEG4-PFB), veya süksinimidil 4-f0rmilbenzoat (SFB), veya 06- süksinimidil 4-formilbenzoat (Cö-SFB), veya N-hidroksisüksinimid ester-tetraoksapentadekan-azid (NHS-PEG4-azid), veya heterobifonksiyonel çapraz baglayicilar veya NHS-PEGS-S-S-azid gibi yarilabilir heterobifonksiyonel çapraz baglayicilar dahildir. Bir baska uygun uygulamada, birinci çapraz baglayici ajan N-hidroksisüksinimid ester-fosfin (NHS-fosfin) veya sülfo-NHS- fosfin olabilir ve ikinci çapraz baglayici ajan N-hidroksisüksinimid ester- tetraoksapentadekan-azid (NHS-PEG4-azid) olabilir. Bir baska uygun uygulamada, birinci çapraz baglayici ajan N-hidroksisüksinimid ester-tetraoksapentadekan asetilen (NHS-PEG4-asetilen) veya “n"nin 3 ila 24 arasinda ayri PEG birimleri araliginda oldugu diger NHS-(PEG)n-asetilen heterobifonksiyonel çapraz baglayicilar veya NHS-PEGS- S-S-asetilen gibi yarilabilir heterobifonksiyonel çapraz baglayicilar olabilir ve ikinci çapraz baglayici ajan N-hidroksisüksinimid ester-tetraoksapentadekan-azid (NHS- PEG4-azid) olabilir. Bir baska uygun uygulamada, birinci çapraz baglayici ajan, diflorosiklooktin (DIFO) ve dibenzosiklooktin (DIBO) gibi siklooktinler olabilir ve ikinci çapraz baglayici ajan N-hidroksisüksinimid ester-tetraoksapentadekan-azid (NHS- PEG4-azid) olabilir.
Rekombinant insan Iizozomal enzim üzerindeki N-ucu ve bir veya daha fazla Iizin kalintisi, primer aminlerden yoksun bir tamponda, yaklasik 7,3 pH'ta yaklasik oda sicakliginda yaklasik 30 dakika süreyle modifiye edilebilir. Rekombinant insan kalintilari modifiye edildikten sonra asitli bir tamponun içine hizlica degistirilebilir.
Uygun bir asitli tampon, yaklasik 5,0 pH'ta 50 mM sodyum asetat içerir. Asitli tampon yaklasik 5 pH`ta 0,1M sodyum asetat, potasyum asetat, sodyum sitrat, MES, sodyum fosfat veya potasyum fosfat olabilir. Asitli bir tamponun içine degistirme, boyut dislamali kromatografi kullanilarak veya diyaliz kullanilarak uygun sekilde gerçeklestirilebilir. Önceden kisa bir baglayici ihtiva eden ikinci çapraz baglayici ajanla modifiye edilmis varyant IGF-2 peptidi, birinci çapraz baglayici ajanla modifiye edilmis rekombinant insan Iizozomal enzime konjugasyon öncesinde, jel filtrasyon, diyaliz veya ters faz kromatografi kullanilarak saflastirilabilir. HidrazitIe-modifiye rekombinant insan peptidine konjugasyonu, anilinin varliginda yaklasik 5,0 pH'ta bir asitli tampon içinde gerçeklestirilebilir. Fosfinle- veya asetilenle- veya siklooktinle-modifiye rekombinant insan Iizozomal enzimin kisa bir baglayici ihtiva eden azidIe-modifiye varyant IGF-2 peptide konjugasyonu, 5,0 - 7,0 pH arasinda degisen tamponlarda gerçeklestirilebilir.
Kisa bir baglayici ihtiva eden, rekombinant insan Iizozomal enzimle-modifiye IGF-2 peptidi konjugati, boyut dislamali kromatografi veya diyaliz kullanilarak saflastirilabilir.
Konjugasyondan sonra, kisa bir baglayici ihtiva eden, rekombinant insan Iizozomal enzim-varyanti IGF-2 peptidi, boyut dislamali kromatografi veya diyaliz kullanilarak saflastirilabilir.
Birinci çapraz baglayici ajanla (NHS-PEG4-asetilen) modifiye edilmis rekombinant insan Iizozomal enzimin, kisa bir baglayici ihtiva eden, ikinci çapraz baglayici ajanla (NHS-PEG4-azid) modifiye edilmis varyant lGF-2 peptide konjugasyonu, bakir (Cu”) varliginda asidik bir tamponda yaklasik pH 5.0'da gerçeklestirilebilir. Bu konjugasyon adimini takiben, bir kisa baglayici ihtiva eden, rekombinant insan lizozomal enzimle- modifiye edilmis lGF-2 peptidi konjugatinin bir saflastirma adimi, boyut dislamali kromatografi veya diyaliz kullanilarak gerçeklestirilebilir.
Birinci çapraz baglayici ajanla (diflorosiklooktin; DIFO gibi siklooktin) modifiye edilmis rekombinant insan Iizozomal enzimin, kisa bir baglayici ihtiva eden, ikinci çapraz baglayici ajanla (NHS-PEG4-azid) modifiye edilmis varyant IGF-2 peptidine konjugasyonu, yaklasik 6,0 pH'taki bir asitli tamponda gerçeklestirilebilir. Bu konjugasyon adimini takiben, bir kisa baglayici ihtiva eden, rekombinant insan boyut dislamali kromatografi veya diyaliz kullanilarak gerçeklestirilebilir.
Enzim replasman tedavisi için moleküller, bir heterobifonksiyonel çapraz baglayici ajanin bir varyant lGF-2 peptidine konjuge edilmesiyle ve daha sonra heterobifonksiyonel çapraz baglayici ajanla modifiye edilmis varyant IGF-2 peptidinin bir rekombinant insan Iizozomal enzime konjuge edilmesiyle olusturulabilir. Enzim replasman tedavisi için molekül ayrica, bir heterobifonksiyonel çapraz baglayici ajanin bir rekombinant insan Iizozomal enzimine konjuge edilmesiyle ve daha sonra heterobifonksiyonel çapraz baglayici ajanla modifiye edilmis rekombinant insan Uygun rekombinant insan Iizozomal enzimlerine, insan asit oi-glukosidaz (rhGAA), insan asit a-galaktosidaz A (GLA), insan asit ß-glukuronidaz (GUS), insan asit 0t- idur0nidaz A (IduA), insan asit iduronidat 2-sülfataz (I2S), insan ß-heksosaminidaz A (HexA), insan ß-heksosaminidaz B (HexB), insan asit a-manosidaz A, insan [3- glukoserebrosidaz (GlcCerase), insan asit lipaz (LPA) veya bunlarin herhangi bir kombinasyonu dahildir. Uygun heterobifonksiyonel çapraz baglayici ajanlara, m- maleimidobenziol-N-hidroksisüksinimid ester (MBS), Sülfo- m-maleimidobenzioI-N- hidroksisüksinimid ester (sülfo-MBS) veya bunlarin herhangi bir kombinasyonu dahildir.
Varyant IGF-2 peptit-rekombinant insan Iizozomal enzim konjugati opsiyonel olarak, jel filtrasyon veya diyaliz kullanilarak saflastirilabilir.
Uygun rekombinant insan Iizozomal enzimleri, maya kullanilarak yapilabilir. Mayadan yapilan rekombinant insan Iizozomal enzimi, N-glikanlarin yok edilmesi için endoglikosidaz F (EndoF) veya endoglikosidaz H (EndoH) kullanilarak muamele edilebilir. Bir baska uygun uygulamada, endoglikosidaz F (EndoF) veya endoglikosidaz H (EndoH) kullanilarak muamele, asitli pH tamponunda meydana gelebilir. Uygun asitli pH tamponlari 0,1 M sodyum asetat, 5,0 pH içerir. Tepkimeler yaklasik oda sicakliginda gerçeklestirilebilir. Endoglikosidaz F (EndoF) veya endoglikosidaz H (EndoH) kullanilarak kullanilarak muameleden sonra, rekombinant insan Iizozomal enzimi opsiyonel olarak, boyut dislamali kromatografi veya diyaliz kullanilarak saflastirilabilir.
Bir rekombinant Insan Iizozomal enzimine kimyasal olarak bagli bir veya daha fazla varyant IGF-2 peptidinin konjugatlari da saglanmaktadir. Bu uygulamalarda, birinci çapraz baglayici ajanla modifiye edilmis rekombinant Iizozomal enzim, bir rekombinant insan Iizozomal enzimi olabilir ve rekombinant insan Iizozomal enzimi bir veya daha fazla modifiye Iizin kalintisina sahip olabilir, örnegin N-ucu kimyasal olarak modifiye edilebilir. Uygun varyant IGF-2 peptitleri, natif insan IGF-2 dizisine göre asagidaki modifikasyonlarin birini veya daha fazlasini içerir: 6 konumunda glutamik asit için arjininin ikamesi; 1-4 ve 6 amino asitlerinin silinmesi; 1-4, 6 ve 7 amino asitlerinin silinmesi; 1-4 ve 6 amino asitlerinin silinmesi ve 7 konumunda treonin için Iizinin ikamesi; 1-4 amino asitlerinin silinmesi ve 6 konumunda glutamik asit için glizinin ikamesi ve 7 konumunda treoinin için Iizinin ikamesi; 27 konumunda tirosin için Iösinin ikamesi; 43 konumunda valin için Iösinin ikamesi; 65 konumunda Iizin için arjininin ikamesi; ve/veya IGF-2 peptidi bir afinite etiketi ve/veya lGF-2`den önceki en az 5 amino asitlik bir baglayici uzatma bölgesi içerir.
Uygun bir modifiye edilmis IGF-2 peptidi, yaklasik 7,5 pH'ta bir tamponda N-ucunda modifiye edilebiliyor olmasiyla karakterizedir.
Uygun bir rekombinant insan Iizozomal enzimi bir Insan asit ci-glukosidaz (rhGAA) içerir. Bu yöntemlerde kullanilabilen diger uygun rekombinant insan Iizozomal enzimlere, insan asit a-galaktosidaz A (GLA), insan asit ß-glukuronidaz (GUS), insan asit ci-iduronidaz A (IduA), insan asit isuronidat 2-sülfataz (IZS), insan [3- heksosaminidaz A (HexA), insan ß-heksosaminidaz B (HexB), insan asit d-manosidaz A, insan ß-glukoserebrosidaz (GICCerase), insan asit Iipaz (LPA) veya bunlarin herhangi bir kombinasyonu dahildir. Uygun rekombinant insan Iizozomal enzimleri, modifiye edilmis bir N-ucuna ve en az bir modifiye edilmis Iizin kalintisina sahip olmasiyla karakterizedir.
Uygun birinci çapraz baglayici ajanla modifiye edilmis rekombinant Iizozomal enzimleri, bir amino-reaktif bifonksiyonel çapraz baglayicidan türetilen bir çapraz baglayici ajana sahip olmasiyla karakterize edilebilir. Uygun bir birinci çapraz baglayici ajanla modifiye edilms rekombinant Iizozomal enzimi, hidrazit kesitlerinin eklenmesi için, süksinimidil 6- hidrazinonikotinat aseton (S-Hynic), sülfo- süksinimidil 6-hidrazin0nikotinat aseton (sülfo-S-HyNic), veya Cö-süksinimidil 6-hidrazin0-nikotinamid (CG-S-Hynic), veya süksinimidil 4-hidrazit0tereftalat hidroklorür (SHTH), veya süksinimidil 4-hidrazinyum nikotinat hidroklorür (SHNH) veya bunlarin herhangi bir kombinasyonundan türetilen bir çapraz baglayici ajana sahip olmasiyla karakterize edilebilir. Alternatif olarak, Iizozomal enzimler, bu kimyasal olarak modifiye edilmis lizozomal enzimlerin reaktif azid gruplari ihtiva eden hedefleyici peptitlere kenetlenmesi için, N-hidroksisüksinimid ester-fosfin (NHS-fosfin), sülfo-NHS-fosfin,_N-hidroksisüksinimid ester-tetraoksapentadekan asetilen (NHS-PEG4-asetilen), “n”nin 3 ila 24 arasinda ayri PEG birimi araliginda degisebildigi diger NHS-(PEG)n-asetilen heterobifonksiyonel çapraz baglayicilar veya NHS-PEGS-S-S-asetilen gibi klevaj edilebilir heterobifonksiyonel çapraz baglayicilar veya diflorosiklooktin (DIFO) ve dibenzosiklooktin (DIBO) gibi siklooktinler ihtiva eden heterobifonksiyonel çapraz baglayicilar veya bunlarin herhangi bir kombinasyonuyla modifiye edilebilir. Rekombinant insan Iizozomal enzimi üzerindeki N-ucu ve Iizin kalintilari, primer aminlerden yoksun yaklasik 7,3 pHita bir tamponda yaklasik oda sicakliginda yaklasik 30 dakika süreyle modifiye edilmis birinci (N-uç) amino asit ve lizin kalintilarindaki primer aminden türetilmis olmasiyla karakterize edilebilir. Varyant uzatma baglayicisi içerebilir. Süksinimidil 6-hidrazin0nik0tinat aseton (S-Hynic)- modifiye Iizozomal enzimlere konjugasyon için uygun bir ikinci çapraz baglayici ajan, PEG4-pentaflorobezen-4-f0rmilbenzoat (PEG4-PFB) olabilir. Farkli bir uygulamada, ikinci çapraz baglayici ajan, fosfinIe-modifiye Iizozomal enzimlere konjugasyon için NHS-PEG4-azid içerebilir. Bir baska uygulamada, ikinci çapraz baglayhici ajan, asetilenle-modifiye Iizozomal enzimlere konjugasyon için N-hidroksisüksinimid ester- PEG4-azid (NHS-PEG4-azid) içerebilir. Yine bir baska uygulamada, ikinci çapraz baglayici ajan, siklooktinIe-modifiye Iizozomal enzimlere konjugasyon için N- hidroksisüksinimid ester-PEG4-azid (NHS-PEG4-azid) içerebilir.
Bir rekombinant insan Iizozomal enzimine konjuge edilms bir heterobifonksiyonel çapraz baglayici ajanla modifiye edilmis varyant IGF-2 peptidi de saglanmaktadir.
Uygun heterobifonksiyonel çapraz baglayici ajanla modifiye edilmis varyant IGF-2 peptitler, bir varyant IGF-2 peptidine konjuge edilmis bir heterobifonksiyonel çapraz baglayici ajandan türetilmis olmalariyla karakterizedir. Uygun bir rekombinant insan lizozomal enzimi, insan asit oi-glukosidaz (rhGAA). insan asit a-galaktosidaz A (GLA), insan asit ß-glukuronidaz (GUS), insan asit cx-iduronidaz A (lduA), insan asit iduronidat 2-sülfataz (I28), insan ß-heksosaminidaz A (HexA), insan ß-heksosaminidaz B (HexB), insan asit a-manosidaz A, insan ß-glukoserebrosidaz (GIcCerase), insan asit Iipaz (LPA) olabilir. Uygun bir heterobifonksiyonel çapraz baglayici ajana m- maleimidobenzioI-N-hidroksisüksinimid ester (MBS ve süIfo-m-maleimidobenziol-N- hidroksisüksinimid ester (sülfo-MBS), SülfosüksinimidiI-4-(N- maleimidometil)sikloheksan-1-karboksilat (sülfo-SMCC) dahildir. Konjugatlar. yüzde 10ldan daha az serbest, konjuge edilmemis IGF2 peptidine sahip sekilde büyük ölçüde saf olabilir. Konjugatin safligi, 280 nm'de Iizozomal proteinle ve 214 nm'de serbest sodyum dodesilsülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SBS-PAGE) kullanilarak boyanmis protein jelleriyle veya SDS-PAGE'den sonra Western Iekelemeyle ve Iizozomal enzimlerin veya IGF2 peptidinin saptanmasi için spesifik antikorlarla ölçülebilir.
Konjugat ayrica, yüzde 0,1'den az serbest, konjuge edilmemis IGF2 peptidine veya diger kontaminantlara sahip sekilde büyük ölçüde saf olabilir. Rekombinant insan sekilde türetilebilir. Kompleks-tip N-glikanlara sahip mayadan türetilen uygun rekombinant insan Iizozomal enzimleri, IGF2 peptidine konjugasyon için dogrudan kullanilabilir. Yüksek-manoz tipi N-glikanlara sahip uygun rekombinant insan lizozomal enzimleri de, kimyasal konjugasyon öncesinde ve sonrasinda bu harici N-glikanlarin yok edilmesi için endoglikosidaz F (EndoF) veya endoglikosidaz H (EndoH) kullanilarak muamele edilebilir. Rekombinant insan Iizozomal enzimi, böcek hücreleri, bitki hücreleri, mantar, transjenik hayvanlar ve in vitro translasyon sistemleri dahil olmak üzere diger protein ekspresyon sistemlerinden de uygun sekilde türetilebilir.
Bulus ayrica, asagidakilerden seçilen bir Iizozomal depo hastaliginin tedavisinde kullanim için, bir varyant IGF-2 peptidi içeren ve yukarida tarif edildigi sekilde hazirlanan bir konjugatla ilgilidir: Pompe Hastaligi, Fabry Hastaligi ve Gaucher Hastaligi, MP8 l, MPSII, MPS Vll, Tay Sachs, Sandhoff, a-mannozidaz ve Wohlman hastaligi.
Bulus ayrica, yukarida tarif edildigi üzere bir yöntemle elde edilen bir rekombinant peptidinin ve farmakolojik olarak kabul edilen bir tasiyicinin bir bilesimini saglamaktadir. Uygun bir modifiye rekombinant insan Iizozomal enzimi. Pompe hastaliginin tedavisi için asit d-glukosidaz içerir. Modifiye rekombinant insan Iizozomal enzimi ayrica, Fabry hastaliginin tedavisi için asit oi-galaktosidaz A olabilir. Modifiye rekombinant insan Iizozomal enzimi ayrica, Gaucher hastaliginin tedavisi için asit ß- glukoserebrosidaz olabilir. Modifiye rekombinant insan Iizozomal enzimi ayrica, mukopolisakkaridoz I'in (MPS I) tedavisi için asit d-iduronidaz olabilir. Modifiye rekombinant insan Iizozomal enzimi ayrica, mukopolisakkaridoz Il'nin (MP8 II) tedavisi için asit iduronidat 2-sülfataz olabilir. Modifiye rekombinant insan Iizozomal enzimi ayrica, mukopolisakkaridoz VII”nin (MPS VII) tedavisi için asit ß-glukuronidaz olabilir.
Alternatif olarak, modifiye rekombinant insan lizozomal enzimi, GM2 gangliosidozun (Tay-Sachs) tedavisi için ß-heksosaminidaz A olabilir. Bir baska uygun uygulamada, modifiye rekombinant insan lizozomal enzimi, GM2 gangliosidozun (Sandhoff) tedavisi için ß-heksosaminidaz B olabilir. Bir baska uygulamada, modifiye rekombinant insan lizozomal enzimi, Wohlman hastaliginin tedavisi için asit Iipaz olabilir. Modifiye rekombinant insan lizozomal enzimi ayrica, d-mannozidazin tedavisi için asit 0t- manosidaz olabilir. Burada saglanan bilesimler, konjugatin ayda bir hasta kilogrami basina yaklasik 0,1 ila yaklasik 1000 miligrami arasinda bir miktarda verilebilir. Bir baska uygun uygulamada bilesim, konjugatin ayda bir hasta kilogrami basina yaklasik 1 ila yaklasik 500 miligrami arasinda bir miktarda verilebilir.
E. co/i'de ekspresyon için optimize edilmis bir varyant IGF-2 peptidini kodlayan uygun bir DNA dizisi, SEQ ID NO: 1 olarak saglanmaktadir. Bir varyant IGF-peptidini temsil eden uygun bir amino asit dizisi, SEQ ID NO: 2 olarak saglanmaktadir. Bir uzatma baglayicisini temsil eden uygun bir amino asit dizisi, SEQ ID NO: 3 olarak saglanmaktadir. Yöntemlerde kullanilan varyant IGF2 peptidi, SEO ID NO: 2'nin amino asit dizisine sahip olabilir. Bir baska uygulamada, konjugatlardaki varyant IGF2 peptidi, SEO ID NO: 2'nin amino asit dizisine sahip olabilir. ÖRNEKLER VE DIGER ÖRNEKLEYICI UYGULAMALAR Çesitli lizozomal depo hastaliklarinin (LSDler) tedavisi için yeni ve üstün ERTler gelistirmek amaciyla, varyant insan IGF-2 peptitlerinin lizozomal enzimlere konjuge edilmesi için bir kimyasal çapraz baglama yöntemi kullanilir. Bu stratejinin, IGF2 peptitle-konjuge ERT'Ierin IGF-2/CI-MPR için baglanma afinitesini arttirmasi ve bu rekombinant enzimlerin lizozomlara hücresel alimini ve aktarilmasini gelistirmesi beklenmektedir. Bunu yaparak, bu IGF2 peptitIe-konjuge ERT'Ierin, etkilenen hücrelerde birikmis substrati temizlemede daha etkili olmasi beklenmektedir.
Insan IGF-2 peptitlerinin çesitli farkli varyantlari, sentezlenebilir veya (memeli hücrelerinde veya diger organizmalarda) eksprese edilebilir ve müteakiben lizozomal enzimlere konjugasyon için heterobifonksiyonel çapraz baglayicilarla kimyasal olarak modifiye edilebilir. Bir varyant IGF-2 peptidi, asagidaki modifikasyonlarin birinini veya bunlarin kombinasyonlarini ihtiva edebilir: 6 konumunda glutamik asit için arjininin ikamesi; 1-4 ve 6 amino asitlerinin silinmesi; 1-4, 6 ve 7 amino asitlerinin silinmesi; 1-4 ve 6 amino asitlerinin silinmesi ve 7 konumunda treonin için Iizinin ikamesi; 1-4 amino asitlerinin silinmesi ve 6 konumunda glutamik asit için glizinin ikamesi ve 7 konumunda treoinin için Iizinin ikamesi; 27 konumunda tirosin için Iösinin ikamesi; 43 konumunda valin için Iösinin ikamesi; 65 konumunda lizin için arjininin ikamesi. Bu modifikasyonlarin çogunlugu, IGF-2 peptitlerinin insülin ve IGF-1 reseptörleri için ve serum IGF baglayici proteinler (IGFBPiler) için baglanma afinitesini indirgerken IGF- 2/CI-MPR için yüksek afiniteyi muhafaza etmek için tasarlanir. Modifiye IGF-2 peptitleri ayrica, modifiye IGF-2 peptitlerinin hizli saflastirilmasi için bir afinite etiketi (örnegin, polihistidin; His etiketi) ihtiva edebilir, çözünür protein partnerlerine sahip füzyon proteinleri olarak eksprese edilebilir, afinite etiketinin veya füzyon protein partnerinin yok edilmesi için bir proteaz alani (örnegin, güçlendirilms tütün asindirma virüsü (TEV) proteaz alani), IGF-2'den önceki en az bes amino asitlik bir baglayici uzatma bölgesi ihtiva edebilir.
Varyant IGF-2 peptitleri ve rekombinant Iizozomal enzimler kimyasal olarak iki temel stratejiyle kenetlenebilir. (A) (Örnekler 1-3'te tarif edildigi sekilde) IGF-2 peptidinin bir heterobifonksiyonel çapraz baglayiciyla ve rekombinant Iizozomal enzimin farkli bir heterobifonksiyonel çapraz baglayiciyla bagimsiz olarak modifiye edilmesi. Fazla, konjuge edilmemis çapraz baglayicinin ve kimyasal yan ürünlerin yok edilmesi için saflastirmadan sonra, kimyasal olarak-modifiye edilmis IGF2 peptidi ve kimyasal olarak-modifiye edilmis Iizozomal enzim müteakiben, IGF2 peptit-Iizozomal enzim konjugatinin olusturulmasi için bir nihai kimyasal tepkimede birlikte konjuge edilir ve saflastirilir ve enzim aktivitesinin muhafaza edilmesi için bir asitli pH tamponunda saklanir. (B) (Örnek 4'te tarif edildigi sekilde) IGF2 peptidinin ve Iizozomal enzimin, bir tekli heterobifonksiyonel çapraz baglayici kullanilarak kimyasal olarak konjuge edilmesi. IGF-2 peptidi heterobifonksiyonel çapraz baglayiciyla bir adet pH tepkime kosulunda kimyasal olarak modifiye edilir. Kimyasal olarak modifiye edilms Iizozomal enzim daha sonra eklenir ve IGF2 peptidinin Iizozomal enzime konjuge edilmesi için pH bir ikinci pH tepkimesi kosuluna ayarlanir. Konjugat daha sonra, fazla, konjuge edilmemis heterobifonksiyonel çapraz baglayicinin ve kimyasal yan ürünlerin yok edilmesi için saflastirilir ve enzim aktivitesinin muhafaza edilmesi için bir asitli pH tamponunda muhafaza edilir.
Yukaridaki kimyasal kenetleme yaklasimi, Iizozomal enzim replasman tedavileri için protein hedeflemenin gelistirilmesi açisindan belirgin avantajlara sahiptir. Birincisi, modifiye edilmis IGF-2 peptitlerinin konjugasyonu, özellestirilmis M6P karbonhidrat yapilari gerektirmeden, lizozomal enzimlerin IGF-2/CI-MPR için baglanma afinitesini arttirir. Ikincisi, lizozomal enzim basina bir tekli IGF-2 peptidi ihtiva eden IGF-2 füzyon proteinlerinin aksine, bu strateji. lGF-2/Cl-MPR için daha yüksek afinite için lizozomal enzimlere birden fazla modifiye edilmis IGF-2 peptidi ekleyebilir. Üçüncüsü, bu yaklasim, diger dokulara (örnegin, beyin) ilaç hedeflemenin gelistirilmesi için karisik peptitlerin (IGF peptidi ve diger peptitler) konjuge edilmesi için kullanilabilir.
Dördüncüsü, bu yaklasim, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla memeli hücreleri, maya, böcek hücreleri, bitki hücreleri, transjenik hayvanlar (örnegin, tavuk yumurtalari, süt vb.) dahil olmak üzere birçok ökaryotik ekspresyon sistemlerinden üretilen rekombinant lizozomal enzimleri kullanabilir. Kompleks-tip N-glikanlar ihtiva eden (yani, memeli ekspresyon sistemlerinden, kompleks N-glikanlar saglayan modifiye N-glikan isleme sahip mayadan, transjenik hayvanlardan vb. türetilen) rekombinant lizozomal enzimler, kenetlenme için dogrudan kullanilabilir. Yüksek-manoz tipi N-glikanlar tasiyan (yani, mayadan, Lecl memeli hücre çizgilerinden vb. türetilen) enzimler, (örnek 5'te tarif edildigi sekilde) modifiye lGF-2 peptitlerine kimyasal kenetleme öncesinde veya sonrasinda (EndoF veya EndoH gibi endoglikosidazlar vasitasiyla) deglikosilasyona tabi tutulabilir. Besincisi, modifiye IGF-2 peptitleri, bakteriler, maya veya diger mantar sistemleri dahil olmak üzere, islemin büyütülmesi için maliyet-etkin bir yaklasim saglayan birçok ekspresyon sisteminde üretilebilir. Altincisi, ayni modifiye IGF-2 peptitleri, IGF-2 lizozomal enzimin münferit füzyon proteinlerinin olusturulmasi zorunlulugu olmadan protein hedeflemeyi gelistirmek için herhangi bir lizozomal enzime konjuge edilebilir. Yedincisi, bu strateji, potansiyel olarak ilaç gereksinimlerini indirgeyebilen, infüzyon süresini azaltabilen ve immünojenesiteyi indirgeyebilen yeni, üstün ERT bilesimleri olusturabilir.
Birçok memeli hücre üretim sisteminden türetilen rekombinant insan asit d-glukosidaz (rhGAA), rhGAAlnin IGF-2/CI-MPR'ye yüksek afinite baglanmasi için yeterli olmayan, çogunlukla kompleks-tip N-glikanlara sahip çok düsük miktarlarda MöP ihtiva eder. Bu N-glikan profili serum proteinleri için olani andirir ve böylelikle rhGAA'nin dolasimda uygun bir farmakokinetik profile (yani, daha yavas kleranse) sahip olmasina olanak saglar. Bu nedenle rhGAA, üstün bir rhGAA ERT'si gelistirmek amaciyla protein hedefleme ve hücresel alimin gelistirilmesi için IGF-2/Cl-MPR için afinitesini arttirmak amaciyla modifiye IGF-2 peptitlerine konjugasyon için kullanilabilir. Spesifik olarak, rhGAA 8-10 mg/ml'lik bir protein konsantrasyonuna konsantre edilebilir ve yaklasik 7,3 pH'ta, primer aminlerden yoksun (örnegin, 50 mM sodyum fosfat, pH 7,3/100 mM NaCI) tamponlarin içine degistirilebilir ve müteakiben oda sicakliginda yaklasik 30 dakika süreyle heterobifonksiyonel çapraz baglayici süksinimidil 6-hidrazin0nikotinat asetonun (S-Hynio) bir 12- ila 20-kat molar fazlasiyla modifiye edilebilir. Bu tepkimede, S-Hynic'ten kimyasal olarak reaktif N-hidroksisüksinimid ester (NHS) grubu, bu modifiye edilmis amino asit kalintilarinda yeni, kimyasal olarak aktif hidrazit fruplarinin eklenmesi için rhGAA üzerindeki (N)-ucundaki birinci amino asit kalintisinin a-amino grubuyla ve Iizinlerin s-amino gruplariyla tepkimeye girer. S-Hynic-modifiye rhGAA daha sonra, fazla çapraz baglayici ve kimyasal yari ürünlerin yok edilmesi ve enzimatik aktivitenin muhafaza edilmesi için boyut dislamali kromatografi veya diyaliz vasitasiyla asitli tampon (örnegin, 50mM NaOAc, pH 4, içine hizlica degistirilir. Bu kimyasal tepkime, rhGAA üzerinde 1-4 kimyasal olarak-aktif hidrazit gruplarini yinelenebilir sekilde saglayan S-Hynic/rhGAA oraninin anlasilmasi için degisen miktarlarda S-Hynic (örnegin, 5-4OX molar fazlalik) ile titre edilebilir. Daha sonra, rhGAA'nin S-Hynic modifikasyon tepkimesini büyütmek için optimal kosullar kullanilir.
Ayri bir tepkimede, (N-ucunda) bir kisa uzatma baglayicisi ihtiva eden [del(1-4), Argß, Leu27, Ar965] IGF-2 gibi bir varyant IGF2 peptidi, heterobifonksiyonel çapraz baglayici PEG4-pentaflorobezen-4-formilbenzoat (PEG4-PFB) kullanilarak ~7,5 pH'ta oda sicakliginda 2-3 saat süreyle kimyasal olarak modifiye edilir. Bu tepkimede, PEG4- PFB, amino ucunda yeni bir reaktif aldehit kimyasal grubun eklenmesi için kisa uzatma baglayici bölgesinden birinci amino asit glizininin ci-amino grubunu modifiye eder.
Varyant IGF2 peptidinin kimyasal modifikasyonu, Sekil 5'te gösterildigi üzere kimyasal modifikasyonun gelisimini ve tamligini degerlendirmek için C4 ters faz kromatografi ile gözlemlenebilir. PEG4-benzaldehitIe-modifiye IGF-2 peptidi daha sonra, fazla çapraz baglayici ve kimyasal yan ürünlerin yok edilmesi için, konjugasyon için uygun bir tampon (örnegin, 50mM NaOAc, pH 4. içinde jel filtrasyon kromatografi veya diyalizle saflastirilir. Daha sonra, S-Hynic-modifiye rhGAA'nin PEG4-benzaldehit-modified IGF-2 peptidine konjuge edilmesi için, 50mM saatlik bir süre boyunca nihai bir tepkime gerçeklestirilir. Bu kimya, stabil esdegerli (hidrazon) baglarinin olusturulmasi için, S-Hynic-modifiye rhGAA'dan hidrazit gruplarini, PEG4-benzaldehitle-modifiye IGF2 peptitlerinden kimyasal olarak-aktif aldehit gruplarina kenetler. Bu tepkime, kenetlenmenin optimize edilmesi için degisen miktarlarda PEG4-benzaldehitle-modifiye IGF-2 peptidine (örnegin, 1-10X molar fazlalik) sahip anilin (örnegin, 10 mM) varliginda gerçeklestirilebilir. lGF-2 peptidiyle- konjuge rhGAA daha sonra, fazla PEG4-benzaldehitIe-modifiye IGF-2 peptitlerinin yok boyut dislama kromatografisi veya diyalizle saflastirilir ve varyant IGF2 peptitIe-konjuge rhGAA (vlGF2-rhGAA) ayni tampon içinde 4°C'de saklanir veya -20°C'de veya - 70°C`de dondurulur.
Memeli üretim sistemlerinden türetilen rekombinant insan asit a-glukosidaz (rhGAA), üstün bir rhGAA ERT'si gelistirmek amaciyla gelismis protein hedefleme ve hücresel alim için IGF-2/CI-MPR için afiniteyi arttirmak amaciyla, varyant IGF-2 peptitlerinin konjugasyonu için kullanilir. Spesifik olarak, gelismis ilaç hedefleme için bir IGF2 peptidi-rhGAA konjugati olusturmak amaciyla IGF2 peptitlerinin rhGAA'ya kenetlenmesi için, Staudinger Ligati'on (azid-fosfin) tepkime kimyasi kullanilir. Bu örnekte, rhGAA (5-10 mg/ml), yaklasik 7,3 pH'ta, primer aminlerden yoksun (örnegin, 50 mM sodyum fosfat (pH 7,3)/ tamponlarin içine degistirilir ve müteakiben oda sicakliginda yaklasik 30 dakika süreyle heterobifonksiyonel çapraz baglayici sülfo-N-hidroksisüksinimid ester-fosfinin (sülfo-NHS-fosfin) 10- ila 20-kat molar fazlasiyla modifiye edilir. Bu kimyasal tepkimede, sülfo-NHS-fosfinden kimyasal olarak reaktif NHS grubu, bu modifiye edilmis amino asit kalintilarinda yeni, kimyasal olarak aktif fosfin gruplarinin eklenmesi için, rhGAA üzerindeki N-ucundaki birinci amino asit kalintisinin a-amino grubuyla ve Iizinlerin a-amino gruplariyla tepkimeye girer. Fosfin-ihtiva eden rhGAA daha sonra hizlica, fazla çapraz baglayicinin ve kimyasal yan ürünlerin yok edilmesi ve enzimatik aktivitenin korunmasi için boyut dislamali kromatografi veya diyaliz vasitasiyla hafifçe asitli tampon (örnegin, 50 mM sodyum fosfat, pH 6, içine degistirilir. Bu kimyasal tepkime, rhGAA üzerinde 1-4 kimyasal olarak-aktif fosfin gruplarini yinelenebilir sekilde saglayan sülfo- NHS-fosfin ila rhGAA oraninin anlasilmasi için degisen miktarlarda sülfo-NHS-fosfin (örnegin, 5-40X molar fazlalik) ile titre edilebilir. Daha sonra, rhGAA'nin sülfo-NHS- fosfin modifikasyon tepkimesini büyütmek için optimal kosullar kullanilabilir.
Ayri bir tepkimede, (N-ucunda) bir kisa uzatma baglayicisi ihtiva eden [del(1-4), Argö, Leu27, Arg65] IGF-2 gibi bir varyant IGF-2 peptidi, heterobifonksiyonel çapraz baglayici N-hidroksisüksinimid ester-PEG4-azidin (NHS-PEG4-azid) bir 30-kat molar fazlasi kullanilarak ~7,5 pH'ta primer aminlerden yoksun (örnegin, 50 mM sodyum fosfat/50 mM NaCI, pH 7,5) bir tamponda oda sicakliginda 1-3 saat süreyle kimyasal olarak modifiye edilir. Bu tepkimede, NHS-PEG4-azidin reaktif NHS grubu, N-ucunda yeni bir azid kimyasal grubun eklenmesi için kisa uzatma baglayici bölgesinden glizinin a-amino grubuyla tepkimeye girer. Varyant IGF2 peptidinin kimyasal modifikasyonu, kimyasal modifikasyonun gelisimini ve tamligini degerlendirmek için C4 ters faz kromatografi ile gözlemlenebilir. PEG4-azidle-modifiye IGF-2 peptidi daha sonra C4 ters faz kromatografiyle saflastirilir ve modifiye edilmis peptit, çözücülerin yok edilmesi için Iiyofilize edilir ve bir kuru toz olarak saklanir.
Daha sonra, fosfinIe-modifiye rhGAA*nin PEG4-azidIe-modifiye IGF-2 peptidine konjuge edilmesi için, (50 mM sodyum fosfat, pH 6, fosfinIe-modifiye rhGAA'nin, dondurularak kurutulmus PEG4-azidIe-modifiye IGF-2 peptidine 1 parça rhGAA'ya karsilik 5 parça lGF2 peptitlik bir molar oranda, oda sicakliginda 24 saatlik bir süre boyunca inkübasyonla dogrudan eklenmesiyle nihai bir tepkime gerçeklestirilir. Bu kimya, stabil esdegerli (amid) baglarin olusturulmasi için azidIe-modifiye IGF-2 peptidinden azid kimyasal grubunu fosfinIe-modifiye rhGAA'ya kenetler. Varyant IGF-2 peptitle-konjuge rhGAA (vIGF2-rhGAA) daha sonra, fazla PEG4-azidIe-modifiye lGF-2 peptitlerinin yok edilmesi için boyut dislamali kromatografi veya diyalizle saflastirilir ve hafifçe asitli pH tamponu (50 mM sodyum fosfat, pH 6, içinde 4°C`de saklanir.
Memeli üretim sistemlerinden türetilen rekombinant insan asit iduronidat 2-sülfataz (I2S), üstün bir !28 ERT'si gelistirmek amaciyla gelismis protein hedefleme ve hücresel alim için lGF-2/CI-MPR için enzim afinitesini arttirmak amaciyla, varyant IGF-2 peptitlerine konjugasyon için kullanilir. Spesifik olarak, gelismis ilaç hedefleme için bir için, Staudi'nger Ligati'on (azid-fosfin) tepkime kimyasi kullanilir. Bu örnekte, IZS (yaklasik 3 mg/ml), ~7,3 pH'ta, primer aminlerden yoksun (örnegin, 50 mMM sodyum fosfat/ bir tamponda oda sicakliginda yaklasik 30 dakika süreyle heterobifonksiyonel çapraz baglayici sülfo-N-hidroksisüksinimid ester-fosfinin (sülfo- NHS-fosfin) 20-kat molar fazlasiyla modifiye edilir. Bu kimyasal tepkimede, sülfo-NHS- fosfinden kimyasal olarak reaktif NHS grubu, bu modifiye edilmis amino asit kalintilarinda yeni, kimyasal olarak aktif fosfin gruplarinin eklenmesi için, IZS üzerindeki N-ucundaki birinci amino asit kalintisinin a-amino grubuyla ve Iizinlerin s-amino gruplariyla tepkimeye girer. Fosfin-ihtiva eden I28 daha sonra hizlica, fazla çapraz baglayicinin ve kimyasal yan ürünlerin yok edilmesi ve enzimatik aktivitenin korunmasi için boyut dislamali kromatografi veya diyaliz vasitasiyla hafifçe asitli tampon (örnegin, 50 mM sodyum fosfat, pH 6, içine degistirilir. Bu kimyasal tepkime, I2S üzerinde 1-4 kimyasal olarak-aktif fosfin gruplarini yinelenebilir sekilde saglayan sülfo- NHS-fosfin ila I28 oraninin anlasilmasi için degisen miktarlarda sülfo-NHS-fosfin (örnegin, 5-4OX molar fazlalik) ile titre edilebilir. I28'nin sülfo-NHS-fosfin modifikasyon tepkimesini büyütmek için optimal kosullar kullanilabilir.
Ayri bir tepkimede, (N-ucunda) bir kisa uzatma baglayicisi ihtiva eden [del(1-4), Argö, Leu27, Ar965] IGF-2 gibi bir varyant IGF2 peptidi, heterobifonksiyonel çapraz baglayici N-hidroksisüksinimid ester-PEG4-azidin (NHS-PEG4-azid) bir 30-kat molar fazlasi kullanilarak ~7,5 pH'ta primer aminlerden yoksun (örnegin, 50 mM sodyum fosfat/50 mM NaCl, pH 7,5) bir tamponda oda sicakliginda 1-3 saat süreyle kimyasal olarak modifiye edilir. Bu tepkimede, NHS-PEG4-azidin reaktif NHS grubu, N-ucunda yeni bir azid kimyasal grubun eklenmesi için kisa uzatma baglayici bölgesinden glizinin 0t- amino grubuyla tepkimeye girer. Varyant IGF2 peptidinin kimyasal modifikasyonu, kimyasal modifikasyonun gelisimini ve tamligini degerlendirmek için C4 ters faz kromatografi ile gözlemlenebilir. PEG4-azidle-modifiye lGF-2 peptidi daha sonra C4 ters faz kromatografiyle saflastirilir ve peptit Iiyofilize edilir ve bir kuru toz olarak saklanir.
Daha sonra, fosfinIe-modifiye I28'nin PEG4-azidle-modifiye IGF-2 peptidine konjuge edilmesi için, (50 mM sodyum fosfat, pH 6, fosfinle- modifiye I28`nin, dondurularak kurutulmus PEG4-azidIe-modifiye IGF-2 peptidine 1 parça I2Siye karsilik 5 parça IGF2 peptitlik bir molar oranda, oda sicakliginda 24 saatlik bir süre boyunca inkübasyonla dogrudan eklenmesiyle nihai bir tepkime gerçeklestirilir. Bu kimya, stabil esdegerli (amid) baglarin olusturulmasi için azidle- modifiye IGF-2 peptidinden azid kimyasal grubunu fosfinle-modifiye I28'ye kenetler.
Varyant IGF-2 peptitIe-konjuge I2S (vIGF2-I2S) daha sonra, fazla PEG4-azidle- modifiye IGF-2 peptitlerinin yok edilmesi için boyut dislamali kromatografi veya diyalizle saflastirilir ve hafifçe asitli pH tamponu (50 mM sodyum fosfat, pH 6,5/100 mM NaCl tamponu) içinde 4°C'de saklanir.
Memeli üretim sistemlerinden türetilen rekombinant insan asit oi-glukosidaz (rhGAA), üstün bir rhGAA ERT'si gelistirmek amaciyla gelismis protein hedefleme ve hücresel alim için IGF-2/CI-MPR için afiniteyi arttirmak amaciyla, modifiye IGF-2 peptitlerine konjugasyon için kullanilacaktir. Bu örnekte, N-ucunda bir sistein kalintisina sahip bir kisa uzatma baglayicisi bölgesi ihtiva eden, [del(1-4), Argö, Leu27, ArgBS] IGF-2 gibi bir varyant IGF2 peptidi, heterobifonksiyonel çapraz baglayici m-maleimidobenzioI-N- hidroksisüksinimid esterle (MBS) yaklasik 6 pH'ta ve oda sicakliginda 30-60 dakika süreyle modifiye edilir. Bu tepkimede, MBS'den kimyasal olarak reaktif maleimid grubu, N-ucu sisteinden serbest sülfhidril grubuyla tepkimeye girerken, rhGAA'ya kenetlenme için N-hidroksisüksinimid ester grubunu koruyacaktir. MBS-modifiye IGF-2 peptidi, fazla MBS'nin yok edilmesi için jel filtrasyon kromatografisiyle veya diyalizle hizlica saflastirilacaktir. Daha sonra, MBS-modifiye lGF-2 peptidine kenetlenme için oda sicakliginda, amin-içermeyen tamponda 7,3 pH'ta 30 dakika süreyle rhGAA eklenir. Bu kimyasal tepkimede, (MBS-modifiye lGF-2 peptidinden) kimyasal olarak reaktif N- hidroksisüksinimid ester grubu, stabil esdegerli baglar olusturmak için rhGAA üzerindeki N-ucundaki birinci amino asit kalintisinin oi-amino grubuyla ve lizinlerin s- amino gruplariyla tepkimeye girer. Bu tepkime, 1-4 IGF-2 peptitlerinin rhGAA üzerine kenetlenmesi için MBS-modifiye lGF-2 peptidinin molar fazlasinin belirlenmesi amaciyla degisen miktarlarda MBS-modifiye lGF-2 peptidi (örnegin, 1-20X molar fazlalik) kullanilarak titre edilecektir. Daha sonra, bu islemin büyütülmesi için optimal kenetleme kosullari kullanilir. lGF-2-konjuge rhGAA, fazla lGF-2 peptitlerinin yok edilmesi için jel filtrasyon kromatografisiyle veya diyalizle saflastirilacak ve asitli pH tamponunda (0,1M sodyum sitrat, pH 5,5 tampon) saklanacaktir.
Yüksek-manoz tipi N-glikan yapilarina sahip rhGAA gibi (mayadan, GNT-1 kusurlu Leci memeli hücrelerinden vb. türetilen) rekombinant insan Iizozomal enzimleri, üstün bir rhGAA ERT'si gelistirmek amaciyla gelismis protein hedefleme ve hücresel alim için lGF-2/CI-MPR için afiniteyi arttirmak amaciyla, varyant IGF-2 peptitlerine konjugasyon için kullanilabilir. Bu örnekte, (8-10 mg/ml'de) rhGAA, yaklasik 7,3 pH'ta, primer aminlerden yoksun (örnegin, 50 mM sodyum fosfat (pH 7,3)/ tamponlarin içine degistirilir ve müteakiben N- süksinimidil 6-hidrazinonikotinat aseton (S-Hynic) gibi bir heterobifonksiyonel çapraz baglayiciyla, primer aminlerden yoksun, ~7,3 pH'ta bir tamponda (örnegin, 50 mM sodyum fosfat/0,1 M NaCI, pH 7,3) oda sicakliginda 30 dakika süreyle modifiye edilir. HidrazitIe-modifiye rhGAA daha sonra, fazla çapraz baglayicinin ve kimyasal yan ürünlerin yok edilmesi ve enzimatik aktivitenin korunmasi için boyut dislamali kromatografi veya diyaliz vasitasiyla asitli tampon (örnegin, 50mM NaOAc, pH 4, içine hizlica degistirilir.
Ayri bir tepkimede, (N-ucunda) bir kisa uzatma baglayicisi ihtiva eden [del(1-4), Argß, Leu27, Arg65] IGF-2 gibi bir varyant IGF-2 peptidi, heterobifonksiyonel çapraz baglayici PEG4-pentaflorobezen-4-f0rmilbenzoatin (PEG4-PFB) bir 30-kat molar fazlasi kullanilarak ~7,5 pH'ta primer aminlerden yoksun (örnegin, 50 mM sodyum fosfat/50 mM NaCI, pH 7,5) bir tamponda oda sicakliginda 1-3 saat süreyle kimyasal olarak modifiye edilir. Bu tepkimede, PEG4-PFB, N-ucunda yeni bir aldehit kimyasal grubun eklenmesi için kisa uzatma baglayici bölgesinden glizinin d-amino grubuyla tepkimeye girer. Varyant IGF2 peptidinin kimyasal modifikasyonu, kimyasal modifikasyonun gelisimini ve tamligini degerlendirmek için C4 ters faz kromatografi ile gözlemlenebilir. PEG4-benzaldehitIe-modifiye IGF-2 peptidi daha sonra, fazla çapraz baglayicinin ve kimyasal yan Ürünlerin yok edilmesi için, konjugasyona uygun bir tampon (örnegin, 50mM NaOAc, pH 4, içinde jel filtrasyon kromatografisiyle veya diyalizle saflastirilir.
Daha sonra, S-Hynic-modifiye rhGAA'nin PEG4-benzaldehitle-modifiye lGF-2 peptidine tampon içinde 24 saatlik bir süre boyunca oda sicakliginda nihai bir tepkime gerçeklestirilir. Bu kimya, stabil esdegerli (hidrazon) baglarin olusturulmasi için 8- Hynic-modifiye rhGAA'dan hidrazit gruplarini, PEG4-benzaldehitle-modifiye IGF2 peptitlerinden kimyasal olarak-aktif aldehit gruplarina kenetler. Bu tepkime, kenetlenmenin optimize edilmesi için degisen miktarlarda PEG4-benzaldehitle-modifiye gerçeklestirilebilir. Varyant IGF-2 peptitIe-konjuge rhGAA (vIGF2-rhGAA) daha sonra, fazla PEG4-azidle-m0difiye lGF-2 peptitlerinin yok edilmesi için, asitli pH tamponu (50mM NaOAc, pH 4, içinde boyut dislamali kromatografiyle veya diyalizle saflastirilir. rhGAA üzerindeki yüksek-manoz tipi N-glikanlar sorunludur çünkü bu karbonhidratlarin, proteinin dolasimdan makrofaj ve splenik manoz reseptörleri vasitasiyla hizlica temizlenmesine neden oldugunan inanilmaktadir. Ancak, yüksek-manoz tipi N-glikanlar Polisorbat-BO) oda sicakliginda, endoglikosidaz F (EndoF) veya endoglikosidaz H (EndoH) kullanilarak natif (yani, katalitik aktiviteyi koruyan denistirmeyen) kosullar altinda yok edilebilir. rhGAA'nin, N-glikanlarin yok edilmesi sonrasinda sonra çözünür kaldigi ve tamamen aktif oldugu deneysel olarak kanitlanmistir (veriler gösterilmemektedir). rhGAA'nin deglikosilasyonu, enzim S-Hynic ile modifiye edildikten ve (fazla çapraz baglayicinin yok edilmesi için boyut dislamali kromatografi veya diyaliz vasitasiyl) saflastirildiktan sonra gerçeklestirilebilir. Bu strateji, enzim aktivitesini etkilemeden EndoF veya EndoH kullanilarak 1-5 günde rhGAA'nin tam deglikosilasyonuna olanak saglar. Deglikosilatlanmis hidrazitIe-modifiye rhGAA daha sonra, PEG4-benzaldehitIe-modifiye IGF-2 peptitlerine konjuge edilir. Alternatif olarak, rhGAA deglikosilasyonu, PEG4-benzaldehitIe-modifiye IGF-2 peptidinin hidrazitle- modifiye rhGAA'ya yüksek konsantrasyonlarda EndoF veya EndoH kullanilarak konjugasyonu esnasinda eszamanli olarak gerçeklestirilebilir. Deglikosilatlanmis, IGF2 peptitIe-konjuge rhGAA daha sonra, fazla fosfinIe-modifiye IGF-2 peptitlerinin yok edilmesi için jel filtrasyon kromatografisiyle veya diyalizle saflastirilir ve asitli pH tamponunda (50 mM sodyum fosfat, pH 6, saklanir. Mayadan-türetilen rhGAA`dan yüksek-manoz N-glikanlarin yok edilmesi için ideal yöntem, rhGAA'nin protein saflastirmasi öncesinde i'n vivo deglikosilasyon için EndoH'nin lizozomal enzimle es-eksprese edilmesi olabilir. Bu, dogrudan modifiye edilebilen ve herhangi bir ilave islem olmadan varyant hedefleyici peptitlere kenetlenebilen deglikosilatlanmis rhGAA olusturabilir.
Yukaridaki stratejiler, alerjenik tepkilerin engellenmesi ve hizli protein kleransinin engellenmesi için rhGAA'dan istenmeyen N-glikanlarin yok edilmesini saglarken, IGF2 peptitIe-konjuge lizozomal enzimlerin gelismis protein hedeflemesi ve hücresel alimi için IGF-2/CI-MPR için baglanma afinitesini kayda deger sekilde gelistirir. Önemli olarak, bu strateji, memeli-olmayan sistemlerden üretilen lizozomal enzimleri kullanabilir ve üstün ERT'Ier gelistirmek için çok daha maliyet-etkin bir yaklasimi temsil etmektedir.
Yukaridaki örnekler, modifiye edilmis IGF-2 peptitlerinin kimyasal konjugasyonu vasitasiyla IGF-2/CI-MPR için farkli Iizozomal enzimlerin afinitesinin arttirilmasi için tasarlanir. Bu strateji, LSD'Ier için üstün tedaviler gelistirmek amaciyla mevcut ve gelecekteki ERT'Ier için protein hedeflemeyi gelistirir. reseptör afinitesi üzerindeki etkilerinin degerlendirilmesi için bir IGF-2/CI-MPR reseptör baglanma tayini kullanildi. Bu tayin, IGF-2/CI-MPR için yüksek baglanma afinitesine sahip Iizozomal enzimlerin, baglanmamis Iizozomal enzimler islem esnasinda temizlendiginden düsükle ilimli arasinda olanlardan ayirt edilmesi için tasarlanir.
Dahasi, Iizozomal enzimlerin degisen protein konsantrasyonlari baglanmanin degerlendirilmesi için kullanildigindan, bu tayin baglanma reseptörü için gereken, her bir Iizozomal enzim preparati için baglanma afinitesini hesaplamak için kullanilabilen protein konsantrasyonlarini belirleyebilir. Spesifik olarak, modifiye edilmemis Iizozomal enzimler ve IGF2 peptidier-konjuge Iizozomal enzimler seri olarak 40 mM HEPES (pH 6,7)/150 mM NaCl/10 mM EDTA içinde seyreltildi ve daha sonra 1 saat süreyle °C'de, lGF2/CI-MPR reseptörüyle kaplanmis 96-gözlü ELISA plakalarinda (göz basina fosfat tamponlu salin içinde 6 ug/ml'de 50 ul reseptör; daha sonra fosfat tamponlu salin içinde %2 BSA ile bloke edildi) inkübe edildi. Plakalar akabinde, baglanmayan proteinlerin yok edilmesi için üç kez, %0,1 Tween-20 ihtiva eden ayni tamponla yikandi. Baglanan Iizozomal enzimler daha sonra, uygun florojenik substratlar (örnegin, rhGAA için 4-metilumbelliferiI-oi-D-glukopiranosid (4-MU-0i-Glc)) kullanilarak tayin tamponunda (50 mM NaOAc, pH 37°C'de 1 saat süreyle enzim aktivitesiyle ölçüldü. Numuneler daha sonra yeni 98- gözlü plakalara aktarildi, solüsyonun pH'inin yaklasik 10,5'e yükseltilmesi için 0,1M NaOH eklendi ve plakalar bir floresan plaka okuyucuda eksitasyon ve emisyon dalga boylarinda (yani, 4-MU için 370 nm eksitasyon & 460 nm emisyon) okundu.
Sonuçlarimiz, Sekil 6A'da gösterildigi üzere test edilen tüm protein konsantrasyonlarinda vIGF2-rhGAA için, konjuge edilmemis rhGAA'dan çok daha yüksek baglanan enzim aktivitesinin gözlemlendigini göstermektedir. vIGF2-rhGAA'nin edilmesiyle kayda deger sekilde azalmistir ve bu da bu baglanmanin IGF2 peptidine bagli oldugunu isaret etmektedir. vIGF2-rhGAA'nin lGF2/Cl-MPR'ye tam blokaji için muhtemelen çok daha yüksek miktarlarda serbest WT insan IGF2 peptidi gerekmektedir. IGF2 peptidinin I28 üzerine kimyasal konjugasyonunun da, enzimin 7A). Dahasi, baglanan I28 aktivitelerinin benzer miktarlari da lGF2 peptidier-konjuge l28 (vIGF2-I2S) için 1 ve 3 pg/ml olarak gözlemlenmistir ve bu da reseptör baglanmanin doymus oldugunu göstermektedir.
Bu toplu veriler, varyant IGF2 peptidiyle-konjugasyon yaklasiminin birçok önemli özelligini açiga çikarmistir. (1) Varyant IGF2 peptidinin protein yapisi, IGF2/CI-MPR reseptörüne yüksek afiniteli baglanma için uygundur. Bu fonksiyonel degerlendirme, Sekil 5,te gösterildigi üzere dogal sus ve varyant IGF2 peptitlerinin neredeyse özdes kosullarda baglandigini ve ayristigini gösteren C4 ters faz kromatografi verilerimizle tutarlidir. Bu iki IGF2 peptidinin “parmak izleri" C4 ters faz kromatografi üzerinde neredeyse ayirt edilemez oldugundan, bunlar protein yapilari açisindan çok benzer olmalidir. (2) Varyant IGF2 peptidinin kimyasal konjugasyonu ne rhGAA ne I28 için enzim aktivitesini etkilememistir (veriler gösterilmemistir). Peptidin Iizozomal enzimlere kimyasal kenetlenmesi için bir uzatma baglayici bölgesinin kullanilmasi muhtelemel, lGF2 peptit baglanmasi için yeterli olurken enzim aktivitesini muhafaza eden bir baglama saglamistir. (3) Konjuge varyant IGF2 peptidi stabildir ve Iizozomal enzim aktivitelerinin muhafaza edilmesi için gereken asitli tamponlarda uygun protein yapisini muhafaza etmektedir.
Bu nedenle toplu veriler, IGF2 peptidinin Iizozomal enzimler (örnegin, rhGAA ve !28) üzerine kimyasal konjugasyonunun gerçekten de bunlarin lGF2/Cl-MPR reseptörü için baglanma afinitelerini kayda deger sekilde arttirabildigini göstermektedir. Bu yaklasim teorik olarak, IGF2/CI-MPR için baglanma afinitelerini gelistirmek için varyant IGF2 peptitlerinin herhangi bir Iizozomal protein ve diger Iizozomal-olmayan proteinler üzerine kimyasal konjugasyonu için genis çapli olarak uygulanabilmelidir. tayin etmek amaciyla, IGF2-konjuge rhGAA'nin (vIGF2-rhGAA) özümsenmesi, L6 siçan iskelet kasi miyoblastlarinda degerlendirildi. Kisaca. L6 miyoblastlari %10 fetal bovin serum (FBS) ihtiva eden DMEM vasatinda birlesme için 37C'de ve %5 CO2 ortaminda T-75 siselerinde genisletildi. Hücreler tripsin/EDTA vasitasiyla hasat edildi ve göz basina 3 x 105 hücrelik bir hücre yogunlugunda 6-gözlü doku kültürü plakalarina yerlestirildi ve DMEM/%10 FBS vasatinda inkübe edildi. Lizozomal enzimlerin eklenmesinden 2 saat önce, harcanan DMEM/%10 FBS vasati 2,5 ml alim vasatiyla (Ham'in F-12/%10 FBS/2 mM PIPES, pH 6,7) degistirildi. Konjuge olmamis rhGAA and mg/ml'ye seyreltildi ve bir 0.2 um'lik filtre döndürme cihazi (Costar) yoluyla sterilize edildi. Konjuge olmamis rhGAA münferit gözlere 10-200 nM'Iik nihai protein konsantrasyonlarinda eklenirken, vIGF2-rhGAA 2-25 nM”de eklendi. Tüm gözlerin ayni hacme ve dogru protein konsantrasyonuna sahip oldugunun temin edilmesi için, 50 mM enzim ve tamponun toplam hacmi her bir numune için 0,2 ml oldu. Sekil GB'de gösterildigi üzere, vIGF2-rhGAA'nin özümsenmesi, test edilen tüm protein konsantrasyonlarinda konjuge olmamis rhGAA'dan kayda deger sekilde daha iyi gerçeklesti. Bu sonuçlar, vIGF2-rhGAA hakkinda birçok önemli hususu ortaya çikarmistir: (1) varyant IGF2 peptidinin protein yapisi, hücre yüzeyi lGF2/Cl-MPR reseptörlerine yüksek afiniteli baglanma için yeterlidir; (2) hücre içi organeller bu protokolle izole edildiginden, vIGF2-rhGAA L6 miyoblastlari içinde etkin bir sekilde özümsenmistir; (3) varyant IGF2 peptidi, vIGF2-rhGAA vasattaki IGBP'Iere baglanmaktansa L6 miyoblastlari içinde özümsendiginden, öngörüldügü üzere serum Bu sonuçlar, varyant IGF2 peptitlerin rhGAA üzerine kimyasal kenetlenmesinin, büyük ölçüde gelismis hücresel alimi olarak yorumlanan biçimde kayda deger sekilde gelistirebildigini açikça göstermektedir. Bu veriler, vIGF2-rhGAAinin, Pompe hastaliginin tedavisi için üstün bir ERT olabilecegini ortaya koymaktadir.
Birden fazla IGF2 peptidinin Iizocomal enzimlere kimyasal olarak kojuge edilip edilmediginin belirlenmesi için, proteinlerin boyutlarina dayali olarak ayrilmasi amaciyla sodyum dodesilsülfat poliakrilamid protein jel elektroforezi (SDS-PAGE) kullanildi ve jel akabinde, protein bantlarinin görsellestirilmesi için modifiye edilmis bir Coomassie mavi boyayla boyandi. Sekil ?8'de gösterildigi üzere, rekombinant dogal sus insan iduronidat 2-sülfatazin (I28) moleküler agirligi, varyant IGF2 peptidinin kimyasal konjugasyonundan sonra ~80 kDa'dan yaklasik 120 kDa'ya kayda deger sekilde artti.
Bu veriler, varyant IGF2 peptidinin moleküler agirligi yaklasik olarak sadece 8 kDa oldugundan, birden fazla varyant IGF2 peptidinin I28'ye kenetlenmis olmasi gerektigini açikça göstermektedir. Boyanan SDS-PAGE jeli, I2S'nin molekülü basina (jel üzerinde yaklasik 5 adet ekli peptit ortalamasiyla ekli varyant IGF2 peptidinin degisen miktarlariyla vlGF2- bu yaklasimin, birden fazla, farkli peptidi ayni Iizozomal enzim üzerine kenetleme potansiyelini de vurgulamaktadir. Örnegin, varyant IGF2 peptitleri ve diger hedefleyioi peptitler (örnegin, kan beyin bariyeri (888) üzerinden nakledildigi bilinen peptitler), peptitler vasitasiyla) beyine ve merkezi sinir sistemine hedeflemek için kimyasal olarak ayni Iizozomal enzime baglanabilir. Dolayisiyla bu yaklasim, mevcut ERT'lerin baslica sinirlamalarinin üstesinden gelme potansiyeline sahiptir.
SEQ lD NO: 1, bir N-ucu uzatma baglayici bölgeye ve (E. coliide ekspresyon için optimize edilmis) bir TEV proteaz tanima alanina sahip 8XHis-etiketli [(del 1-4)-Argö- Leu27-Ar965] lGF-2 peptidi için cDNA dizisini temsil etmektedir.
SEQ ID No:1: SEQ ID NO: 2, uzatma dizisine sahip varyant IGF2 peptidi için amino asit dizisini temsil etmektedir.
SEO ID No:2: i-iiiiiixiii'kiiis-'CTI l (ii-EZ.\'DTI (ng'iziiîJRiiFl Fle-Z-hRVxRRxRiil\`FFi: i. FRSi; DI A SEQ ID NO: 2, N-ucu 8X His etiketinin TEV proteazi vasitasiyla yok edilmesinden sonraki bir varyant IGF2 peptidine karsilik gelmektedir. Bu varyant IGF2 peptidi, N-ucu serin kalintisinin, WT lGF2'nin 5 kalintisina karsilik geldigi sekilde 1-4 kalintilardan yoksundur. 6 konumunda glutamik asit için ikame edilen arjininin, IGF2 peptidinin serum lGF baglayici proteinler (lGFBP'Ier) için baglanma afinitesini büyük ölçüde düsürdügü bilinmektedir. 27 konumunda tirosin için Iösin ikamesinin, IGF2 peptidinin insülin ve IGF1 reseptörleri için baglanma afinitesini büyük ölçüde düsürdügü bilinmektedir. 65 konumunda Iizin için arjininin konservatif bir ikamesi, Iizozomal enzimlere konjugasyon için N-ucunda sadece uzatma baglayici bölgenin kimyasal modifikasyonunun saglanmasi için kullanildi. N-ucu uzatma bölgesi SEQ ID NO: 3 tarafindan temsil edilmektedir.
SEQ ID No:3: SEO ID NO: 3'teki N-ucu glizin kalintisi, Iizozomal enzimlere kenetlenme amaciyla kimyasal modifikasyon için kullanilmaktadir.
*@(NMYvw-s benzaldeiiiI-modifiye edilmis IGFZ hedefleme peptidi (ilana. çapraz~baglama :gam-modifiye. edilmis IGF2 pepudii *ßi/V& »b &ww m vaiynut IGI-'Z peptidi-koujuge edilmis lizozomzil enzim l'vguii birinci capmz-bnglamn ajanlni'i: süksinimidil Ü-hidrazinomkotinat aseton [S-Hsnicîi süksinimidil 4-hidrazidoteeftalat hidroldorür (SHTHji süksinimidil 4-hidrazins11m nikotinat hidroi-:lorür (SI-!Mil X-Mdroksisüksinimid ester- [PEG'i-n hidrazit; burada n=_ -24 PEG birimi l`vguii ikinci caprapbaglama ajanlai'i: PEG4-pentaflor0benzin benzoat (PE G-i-PFBJ Süksinimidil 4-f0rmi1benzoat (SFB) CÖ- süksinimidil 4-formi1benzoat [CG-SFB) Liiouiinul + _ m1/ J 6 Ç“ add-modifiye edilmis IGFZ hedefleiiie peptidi (ilana çapraz-baglama &jam-modifiye edilmis IGFZ psptidiji fosfm-modifiye edilmis lizozoiual enzim (birgnci çapraz-baglama ajam~m0difiye edilmis iizozomaî snzim) _ _ 2 m ›4 . vni'ynnt IGFZ pepiidI-koujuge edilmis lizozomnl enzim l`vgun biii'nci capmpbnglamn ajanlni'i: N-hidroksisüksinimid ester-fosfin (ÄHS-fosfmji Sülfo-N-hidroksisüksimmid ester fosfin (Sülfo-NHS-fostînji l`vgun ikinci capraz'baglamn aj anlam: N-hidroksisüksimnn'd astar-and [NHS-azidgi N-hidroksisüksimnnd ester-[PEGIin-:izidg burada n=3-24 PEG birimi NHSPEGLS-S-azid hanimi + ?2:9=n "q L :mim l :Yâ/Oh "i`m/W"m aserilen-modil'iye edilm IS “101011131 enzim (ikinci çapraz-baglan a ajam-modifiye edilmis iGFZ peptidi'j lizozomaienzinû _ . konjuga ?yon Lizommiil tuzun bin'nci çapraz-baglama njanlnn: N-hidroksisüksinimid ester~tetraoksapentadekan smile:) (KHS-PEG4-aseu`lenjji NMdroksisüksinimid öter-[PE Gjiin-aseul-en; burada n=3-24 PEG birimi .\`HS~PEG3-S-S-ak*tilen N-hidroksisüksinimid ester-azid LNHS-azidîi N-hidroksisüksinimid öter-[PE Gjin-azid; burada n=3-24 PEG birimi NHS-PEGB-S-S-azid Limwnul + 0 . 4` MBS-modiüye edilmis IGFZ hedefleme pqitidi li'zozomal enzim üzoioiml enzim l`vgiin çapraz-b aglama :ij anlari: m-Maleimidobenziol-N-Iüdroksisüksi'nimid ester (MES) Sülfo-m-malei'midobenzio -.\'- hidroksisi'iksgmniid ester (sülfo-MBSJ Sülfosûksinimidil-4-(.\'-maleimidome[i1jisikloheliczan-I-karboksilat [SMCC] Zaman (dakika)

Claims (2)

ISTEMLER Bir rekombinant Iizozomal enzime konjuge edilmis bir hedefleyici peptidin yapilmasini bir yöntemidir, yöntem asagidakileri içermektedir: i. bir birinci çapraz baglayici ajanla modifiye edilmis rekombinant insan bir rekombinant insan Iizozomal enzim üzerindeki amino (N)-ucunun ve bir veya daha fazla Iizin kalintisinin modifiye edilmesi; ii. bir ikinci çapraz baglayici ajanla modifiye edilen varyant IGF-2 peptide neden olmak için bir birinci çapraz baglayici ajan kullanarak bir varyant IGF-2 peptit üzerindeki amino (N)-ucundaki bir kisa uzatma baglayicisinin birinci amino iii. birinci çapraz baglayici ajanla modifiye edilmis rekombinant Insan Iizozomal enziminin bir kisa uzatma baglayici ihtiva eden, ikinci çapraz baglayici ajanla modifiye edilmis varyant IGF-2 peptide konjuge edilmesi; veya (b) bir heterobifonksiyonel çapraz baglayici ajanin bir varyant IGF-2'ye konjuge edilmesi; ve heterobifonksiyonel çapraz baglayici ajanla modifiye edilmis varyant IGF-2 peptidin, rekombinant insan Iizozomal enzim üzerindeki N-ucu ve bir veya daha fazla lizin kalintisiyla tepkimeyle bir rekombinant insan Iizozomal enzime konjuge edilmesi; veya (o) bir heterobifonksiyonel çapraz baglayici ajanin, rekombinant insan Iizozomal enzim üzerindeki N-ucu ve bir veya daha fazla Iizin kalintisiyla tepkimeyle bir rekombinant insan Iizozomal enzime konjuge edilmesi; ve heterobifonksiyonel çapraz baglayici ajanla modifiye edilmis rekombinant insan Iizozomal enzimin bir varyant IGF-2 peptide konjuge edilmesidir; burada rekombinant insan Iizozomal enzim sunlardan seçilir; rekombinant insan a-glukosidaz (rhGAA), rekombinant insan oi-galaktosidaz A (GLA), rekombinant insan asit ß-glukuronidaz (GUS), rekombinant insan oi-iduronidaz A (IduA), rekombinant insan isuronidat 2-sülfataz (I2S), rekombinant insan [3- heksosaminidaz A (HexA), rekombinant insan ß-heksosaminidaz B (HexB), rekombinant insan a-manosidaz A, rekombinant insan ß-glukoserebrosidaz (GIcCerase), rekombinant insan asit Iipaz (LPA) veya bunlarin herhangi bir kombinasyonu; ve burada birinci çapraz baglayici ajan sunlardan seçilir; N- süksinimidil 6- hidrazinonikotinat aseton (S-Hynic), sülfo-süksinimidil 6-hidrazonikotinat aseton (sülfo-S-HyNic), C6-süksinimidil 6-hidrazino-nikotinamid (Cö-S-Hynic), süksinimidil 4-hidrazitotereftalat hidroklorür (SHTH) süksinimidil 4-hidrazinyum nikotinat hidroklorür (SHNH) veya N-hidroksisüksinimid ester-(PEG)n-hidrazittir, burada n 3-24 PEG birimidir; ve ikinci çapraz baglayici ajan sunlardan seçilir; PEG4-pentafl0robenzen-4-f0rmilbenzoat (PEG4-PFB), süksinimidil 4- formilbenzoat (SFB) and Cö-süksinimidil 4-formilbenzoat (Cö-SFB); veya birinci çapraz baglayici ajan sunlardan seçilir; N-hidroksisüksinimid ester fosfin (NHS-fosfin), sülfo-N-hidroksisüksinimid ester-fosfin (sülfo-NHS-fosfin), N- hidroksisüksinimid ester-tetraoksapentadekari asetilen (NHS-PEG4-asetilen) veya N-hidroksisüksinimid ester-(PEG)n asetilendir, burada n 3-24 PEG birimidir, NHS-PEGB-S-S-asetilen gibi yarilabilir heterobifonksiyonel çapraz baglayicilar veya diflorosiklooktin (DIFO) ve dibenzosiklooktin (DIBO) gibi siklooktinler ihtiva eden heterobifonksiyonel çapraz baglayicilar; ve ikinci çapraz baglayici ajan sunlardan seçilir; N-hidroksisüksinimid ester-PEG4-azid (HS- PEG4-azid), N-hidroksisüksinimid ester azid (NHS-azid), N-hidroksisüksinimid ester-(PEG)n aziddir, burada 3-24 PEG birimdir, veya NHS-PEG3-S-S-azid; heterobifonksiyonel çapraz baglayici ajan sunlardan seçilir; m- maleimidobenzioI-N-hidroksisüksinimid ester (MBS), sülfo-m-maIeimidobenziol- N-hidroksisüksinimid ester (sülfo-MBS) ve sülfosüksinimidiI-4-(N- maleimidometil)sikloheksan-1-karboksilat (SMCC); ve burada varyant IGF-2 peptit, natif insan IGF-2 dizisine göre asagidaki modifikasyonlardan birini veya daha fazlasini içerir: arjininin 6 konumundaki glutamik asit için ikamesi; 1-4 ve 6 amino asitlerin silinmesi; 1-4, 6 ve 7 amino asitlerin silinmesi; 1-4 ve 6 amino asitlerin silinmesi ve Iizinin 7 konumunda treonin için ikamesi;
1-4 amino asitlerin silinmesi ve glizinin 6 konumunda glutamik asit için ikamesi ve lizinin 7 konumunda treonin için ikamesi; arjininin 65 konumunda lizin için ikamesi; ve/veya varyant IGF-2 peptit bir afinite etiketi ve/veya IGF-2'yi geçen en az 5 amino asitlik bir baglayici uzatma bölgesi içerir. istem 1'e göre bir yöntemdir, burada varyant IGF2 peptidi, SEQ ID NO: 2'nin amino asit dizisini içerir. Istem 1 veya 2”ye göre yöntemdir, burada kisa uzatma baglayici, 5 ila 20 arasinda amino asit kalintisi içerir. istem 1 veya istem 2'ye göre yöntemdir, burada kisa uzatma baglayici SEQ ID NO: 3 içerir. Istemler 1 - 4'ten herhangi birine göre yöntemdir, burada iki Iizin kalintisi, rekombinant insan Iizozomal enzim üzerinde modifiye edilir. Istemler 1 ila 5'ten herhangi birine göre yöntemdir, burada rekombinant insan hayvanlar ve in vitro translasyon sistemleri kullanilarak yapilir. Bir rekombinant insan Iizozomal enzimine kimyasal olarak konjuge edilmis bir veya daha fazla varyant lGF-2 peptidi içeren bir konjugattir, burada konjugat, istemler 1 ila Siten herhangi birine göre bir yöntemle elde edilebilir ve asagidakileri içerir: bir baglayiciya konjugasyonla amino (N)-ucunda ve bir veya daha fazla Iizin kalintisinda modifiye edilmis bir insan Iizozomal enzimi; ve amino ucunda bir kisa uzatma baglayicisi içeren bir varyant IGF-2 peptididir; burada kisa uzatma baglayicinin birinci amino asidi baglayiciya konjuge edilir; burada rekombinant insan Iizozomal enzimi istem 1'de tanimlandigi sekildedir; burada varyant IGF-2 peptidi istem 1`de tanimlandigi sekildedir; burada baglayici, istem 1'de tanimlandigi sekilde birinci ve ikinci çapraz baglayici ajanlarin veya istem 1'de tanimlandigi sekilde bir heterobifonksiyonel çapraz baglayicinin tepkimelerinin ürünüdür. istem 7'ye göre bir konjugattir, Pompe Hastaligi, Fabry Hastaligi ve Gaucher Hastaligi, MPS I, MPS Il, MP8 VII, Tay Sachs, Sandhoff, d-mannozidaz ve Wohlman hastaligindan seçilen bir Iizozomal depo hastaliginin tedavisinde kullanim içindir; burada: modifiye rekombinant insan Iizozomal enzimi, Pompe hastaliginin tedavisi için asit d-glukosidazdir; veya modifiye rekombinant insan Iizozomal enzimi, Fabry hastaliginin tedavisi için modifiye rekombinant insan Iizozomal enzimi, Gaucher hastaliginin tedavisi için asit ß-glukoserebrosidazdir; veya modifiye rekombinant insan Iizozomal enzimi, mukopolisakkaridoz Iiin (MPS I) tedavisi için asit d-iduronidazdir; veya modifiye rekombinant insan Iizozomal enzimi, mukopolisakkaridoz Il'in (MPS II) tedavisi için asit iduronidat
2-sülfatazdir (I28): veya modifiye rekombinant insan Iizozomal enzimi, mukopolisakkaridoz Vll'nin (MPS VII) tedavisi için asit ß-glukuronidazdir; veya modifiye rekombinant insan Iizozomal enzimi, GM2 gangliosidozun (T ay- Sachs) tedavisi için ß-heksosaminidaz A'dir; veya modifiye rekombinant insan Iizozomal enzimi, GM2 gangliosidozun (Sandhoff) tedavisi için ß-heksosaminidaz B'dir; veya modifiye rekombinant insan Iizozomal enzimi, Wohlman hastaliginin tedavisi için asit lipazdir; veya modifiye rekombinant insan Iizozomal enzimi, a-mannozidazun tedavisi için asit cc-manosidazdir. 9. Istem 7'ye göre bir konjugat ve farmakolojik olarak kabul edilen bir tasiyici içeren farmasötik bir bilesimdir.
TR2018/02230T 2011-05-27 2012-05-25 Lizozomal depo hastalıklarının gelişmiş tedavileri için hedefleyici peptitlerin rekombinan lizozomal enzimler üzerine kenetlenmesi için yöntemler. TR201802230T4 (tr)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161490957P 2011-05-27 2011-05-27

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TR201802230T4 true TR201802230T4 (tr) 2018-03-21

Family

ID=47260229

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2018/02230T TR201802230T4 (tr) 2011-05-27 2012-05-25 Lizozomal depo hastalıklarının gelişmiş tedavileri için hedefleyici peptitlerin rekombinan lizozomal enzimler üzerine kenetlenmesi için yöntemler.

Country Status (20)

Country Link
US (2) US9545450B2 (tr)
EP (1) EP2714752B1 (tr)
JP (2) JP6300720B2 (tr)
KR (2) KR101955054B1 (tr)
CN (2) CN104160033B (tr)
BR (1) BR112013030432A2 (tr)
CA (1) CA2836318C (tr)
CY (1) CY1120485T1 (tr)
DK (1) DK2714752T3 (tr)
ES (1) ES2660185T3 (tr)
HR (1) HRP20180291T1 (tr)
HU (1) HUE038172T2 (tr)
LT (1) LT2714752T (tr)
NO (1) NO2820016T3 (tr)
PL (1) PL2714752T3 (tr)
PT (1) PT2714752T (tr)
RS (1) RS56913B1 (tr)
SI (1) SI2714752T1 (tr)
TR (1) TR201802230T4 (tr)
WO (1) WO2012166653A2 (tr)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9925303B2 (en) * 2012-11-13 2018-03-27 Edwards Lifesciences Corporation Methods for cross-linking bioprosthetic tissue using bio-orthogonal binding pairs
EP2976092B1 (en) * 2013-03-15 2020-04-22 Amicus Therapeutics, Inc. Chemical crosslinkers
US20170121377A1 (en) * 2014-04-04 2017-05-04 Vestaron Corporation Artificially activated toxic peptides
US10722559B2 (en) * 2014-08-11 2020-07-28 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Mannose-6-phosphate bearing peptides fused to lysosomal enzymes
EA038986B1 (ru) * 2014-09-30 2021-11-18 Амикус Терапьютикс, Инк. Высокоактивная кислая альфа-глюкозидаза с повышенным содержанием углеводов
CN104356238B (zh) * 2014-10-15 2018-01-09 大连理工大学 一种重组蛋白a亲和配基的定点固定化方法
CA2978093C (en) * 2015-03-11 2023-04-04 Ocv Intellectual Capital, Llc Methods and systems for filling mufflers with fibrous material
MX2018005258A (es) * 2015-11-06 2019-09-04 Biomarin Pharm Inc Ensayos basados en células para la detección de anticuerpos u otros factores que neutralizan la absorción de enzimas lisosómicas.
SG11201804375WA (en) * 2015-12-08 2018-06-28 Regeneron Pharma Compositions and methods for internalizing enzymes
CN110809583A (zh) 2017-06-07 2020-02-18 瑞泽恩制药公司 用于内化酶的组合物和方法
MX2019014719A (es) 2017-06-14 2020-08-03 Virometix Ag Peptidos ciclicos para proteccion contra el virus sincitial respiratorio.
JP2021500857A (ja) 2017-10-02 2021-01-14 デナリ セラピューティクス インコーポレイテッドＤｅｎａｌｉ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ． 酵素補充療法用酵素を含む融合タンパク質
US11492610B2 (en) 2018-03-08 2022-11-08 California Institute Of Technology Sample multiplexing for single-cell RNA sequencing
TWI808169B (zh) 2018-04-30 2023-07-11 美商阿米庫斯醫療股份有限公司 基因治療構築體及使用方法
EP3863663A2 (en) 2018-10-10 2021-08-18 Amicus Therapeutics, Inc. Disulfide bond stabilized polypeptide compositions and methods of use
AU2019404061A1 (en) 2018-12-19 2021-07-22 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Bifunctional molecules for lysosomal targeting and related compositions and methods
CA3121724A1 (en) 2018-12-20 2020-06-25 Virometix Ag Lipopeptide building blocks and synthetic virus-like particles
MX2021013365A (es) * 2019-04-30 2022-01-26 Univ Pennsylvania Composiciones utiles para el tratamiento de la enfermedad de pompe.
CN110373405B (zh) * 2019-07-24 2023-12-15 杭州恩和生物科技有限公司 一种接枝聚合物的生物酶及其制备方法和固定方法
TW202128740A (zh) * 2019-10-10 2021-08-01 美商阿米庫斯醫療股份有限公司 變體ｉｇｆ２構築體
WO2022063990A1 (en) 2020-09-28 2022-03-31 Dbv Technologies Particle comprising an rsv-f protein for use in rsv vaccination
EP4256065A2 (en) 2020-12-01 2023-10-11 The Trustees of The University of Pennsylvania Novel compositions with tissue-specific targeting motifs and compositions containing same
WO2022226263A1 (en) 2021-04-23 2022-10-27 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Novel compositions with brain-specific targeting motifs and compositions containing same

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1118334A1 (en) * 2000-01-11 2001-07-25 Aventis Behring Gesellschaft mit beschränkter Haftung Method for the production of conjugates and uses thereof for the prevention and treatment of allergic reactions and autoimmune diseases
US7560424B2 (en) * 2001-04-30 2009-07-14 Zystor Therapeutics, Inc. Targeted therapeutic proteins
US20030072761A1 (en) * 2001-10-16 2003-04-17 Lebowitz Jonathan Methods and compositions for targeting proteins across the blood brain barrier
US7355018B2 (en) 2003-09-30 2008-04-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Modified IGF1 polypeptides with increased stability and potency
US20110223147A1 (en) * 2008-05-07 2011-09-15 Zystor Therapeutics, Inc. Lysosomal targeting peptides and uses thereof
DK3912643T3 (da) * 2009-02-13 2022-10-17 Immunomedics Inc Immunokonjugater med en intracellulært-spaltelig binding

Also Published As

Publication number Publication date
PL2714752T3 (pl) 2018-04-30
LT2714752T (lt) 2018-03-12
RS56913B1 (sr) 2018-05-31
CA2836318A1 (en) 2012-12-06
HRP20180291T1 (hr) 2018-03-23
EP2714752B1 (en) 2017-11-22
KR20140033155A (ko) 2014-03-17
EP2714752A2 (en) 2014-04-09
US20170319710A1 (en) 2017-11-09
CY1120485T1 (el) 2019-07-10
PT2714752T (pt) 2018-02-26
NO2820016T3 (tr) 2017-12-30
CN108586621A (zh) 2018-09-28
WO2012166653A2 (en) 2012-12-06
US9545450B2 (en) 2017-01-17
EP2714752A4 (en) 2015-08-26
JP6300720B2 (ja) 2018-03-28
ES2660185T3 (es) 2018-03-21
DK2714752T3 (en) 2018-02-26
US20140302001A1 (en) 2014-10-09
CN104160033B (zh) 2018-06-01
WO2012166653A3 (en) 2014-05-01
CN104160033A (zh) 2014-11-19
SI2714752T1 (en) 2018-03-30
KR101955054B1 (ko) 2019-03-07
JP2017225444A (ja) 2017-12-28
BR112013030432A2 (pt) 2016-12-13
CA2836318C (en) 2018-11-27
KR20190022943A (ko) 2019-03-06
JP2014518063A (ja) 2014-07-28
US10660972B2 (en) 2020-05-26
HUE038172T2 (hu) 2018-09-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TR201802230T4 (tr) Lizozomal depo hastalıklarının gelişmiş tedavileri için hedefleyici peptitlerin rekombinan lizozomal enzimler üzerine kenetlenmesi için yöntemler.
US10814008B2 (en) Chemical crosslinkers
DK2457920T3 (en) Oligosaccharides comprising an amino oxy group and conjugates thereof
JP5871999B2 (ja) 安定化α−ガラクトシダーゼおよびその使用
KR101763047B1 (ko) 미분화 세포 제거 방법
DE69823501T2 (de) Verwendung von wolinella succinogenes asparaginase zur behandlung von asparagin-abhängiger krankheiten
WO2014082080A2 (en) Methods for coupling targeting peptides onto recombinant lysosomal enzymes for improved treatments of lysosomal storage diseases