JP6300720B2 - リソソーム蓄積症の改善された治療のための組換えリソソーム酵素にターゲティングペプチドをカップリングするための方法 - Google Patents

Description

関連する出願との相互参照
[0001]本出願は、その全てが参考文献として本明細書中に援用される２０１１年５月２７日に出願された米国特許仮出願６１／４９０，９５７の利益を主張するものである。

技術分野
[0002]技術の分野は、ペプチド化学に関連する。技術分野は、更にリソソーム蓄積症の治療におけるリソソームへの組換えリソソーム酵素のターゲティングに関する。

[0003]リソソームは、タンパク質、各種の脂質（糖脂質及びコレステロールを含む）及び炭水化物が分解され、そして新しいタンパク質、膜成分及び他の分子の合成を可能にするその主要成分に再循環される特定化された細胞内小器官である。リソソームは、オートファジーとして知られる適応性の細胞過程により恒常性及び細胞の健康を維持することを援助するためにも細胞によって使用され、オートファジーは、リソソーム活性を増加させ、各種のタンパク質（例えば、抗体及びインターフェロン）の生合成を増加させるための更なるアミノ酸を提供し、そして栄養素欠乏又はウイルス感染のストレスの多い期間に対応するエネルギー産生のための栄養を供給する。それぞれの代謝過程は、特異的常在性リソソーム酵素によって触媒される。遺伝子変異は、代謝過程を変更し、そして臨床性疾病に導く、リソソームの生物学的活性の欠失を起こしうる。リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）は、エンドソーム／リソソーム区画内の各種の物質の蓄積をもたらす特異的リソソームタンパク質の欠失によって起こされる概略５０種の異なったヒトの代謝性疾病の一群である。これらの疾病の多くは、リソソームタンパク質の欠失及び結果としての代謝性異常を理解するために十分に特徴付けられている。例えば、ゴーシェ、ファブリー、及びテイ・サック／サンドホフのような、変更された糖脂質異化の幾つかのＬＳＤが存在する。ニーマン・ピック病Ｃ型は、脂質及びコレステロール代謝の障害によって特徴付けられ、一方、グリコーゲン貯蔵障害ＩＩ型（ポンペ）及びＩＩＩ型（Ｃｏｒｅｙ−Ｆｏｒｂｅｓ）のような、変更された炭水化物代謝の疾病も、特徴付けられている。他のＬＳＤは、骨又は細胞外基質の代謝［例えば、ムコ多糖症（ＭＰＳ Ｉ−ＶＩＩ）、ゴーシェ］及びタンパク質代謝回転（神経セロイドリポフスチン症；バッテン、等）を変更する。ＬＳＤは、比較的稀であるが、これらは、重度の慢性病を、そして有効に治療されなかった場合にはしばしば死亡を、起こしうる。

[0004]リソソーム蓄積症に対する既知の治療法はないが、しかし骨髄及び臍帯血移植、酵素置換療法（ＥＲＴ）、基質抑制療法（substrate reduction therapy）（ＳＲＴ）及び薬理学的シャペロン療法を含む各種のＬＳＤに対する多くの異なった治療法が調査されている。遺伝子療法も開発されているが、しかし臨床的に試験されていない。これらの治療法の中で、ＥＲＴが最も確立され、多重ＥＲＴは、ゴーシェ、ファブリー、ポンペ、ＭＰＳ Ｉ、ＭＰＳ ＩＩ及びＭＰＳ ＶＩを含む各種のＬＳＤの治療に対して承認され、一方、ＳＲＴ薬物は、ゴーシェ病の治療のために承認されている。

[0005]リソソーム蓄積症の治療のためのＥＲＴの概念は、かなり直接的であり、ここで組換えヒトリソソーム酵素が患者に投与され、不十分な生物学的活性を補い、そして臨床徴候を改善する。然しながら、細胞表面又は細胞外で主として機能する他のタンパク質療法的治療と異なり（例えば、抗ＶＥＧＦ及び他の抗体、エリスロポイエチン、凝固因子、等）、リソソーム酵素は、細胞内部で、リソソーム内で機能しなければならず、そして従って外部から細胞への進入、そしてその後のこれらの内部区画への送達のための機構を必要とする。哺乳動物において、殆どの可溶性リソソーム酵素について特定のアスパラギン残基上のタンパク質骨格上の分枝糖鎖構造（Ｎ−結合オリゴサッカリド；Ｎ−グリカン）は、翻訳後修飾されて、マンノース６−リン酸（Ｍ６Ｐ）と呼ばれる特定化された糖鎖構造を形成する。Ｍ６Ｐは、新しく合成されたリソソームタンパク質の識別及び膜結合性Ｍ６Ｐ受容体によるゴルジ体からリソソームへの輸送のための天然の生物学的シグナルである。Ｍ６Ｐ受容体の一群（カチオン非依存性Ｍ６Ｐ受容体；ＣＩ−ＭＲＰ）は、更に細胞膜に再循環し、そして外因性リソソームタンパク質の結合及び内部移行に対して機能的に活性である。ＣＩ−ＭＰＲは、細胞から逃げた（細胞からの分泌による）リソソームタンパク質を再捕捉し、そして従って、外因性リソソームタンパク質を内部移行させるためのターゲティング機構を提供するために進化したと信じられており、そして各種のＬＳＤのための酵素置換療法のための基礎である。

[0006]組換えリソソーム酵素置換療法は、一般的に安全であることが示されているが、しかし臨床徴候を軽減するためのこれらの有効性は、広く変化する。例えば：１週間おきに１ｍｇ／ｋｇ体重で投与されるファブラザイム^ＴＭ（組換え酸性α−ガラクトシダーゼＡ；Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐ．）ＥＲＴは、蓄積した基質をファブリー病の内皮細胞から排除するために十分であるが、一方、１週間おきに投与される４０ｍｇ／ｋｇのミオザイム^ＴＭ（組換えヒト酸性α−グルコシダーゼ、ｒｈＧＡＡ；Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐ．）は、ポンペ病に対して中程度にのみ有効である。異なった効力は、主としてＭ６Ｐ含量の差に起因し、低いレベルのＭ６Ｐは、不良な薬物ターゲティング及び低い効力と相関する。組換えリソソーム酵素の製造は、糖鎖プロセシング、特に哺乳動物の発現系におけるＭ６Ｐのレベルを制御することが極度に困難であるために非常に困難である。二つの特定化されたゴルジ酵素は、Ｍ６Ｐ修飾を触媒する；Ｎ−アセチルグルコサミンホスホトランスフェラーゼは、リン酸結合Ｎ−アセチルグルコサミンをある種の末端マンノース残基に付加し、一方、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホジエステルα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（脱被覆酵素（Ｕｎｃｏｖｅｒｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ）としても知られる）は、被覆Ｎ−アセチルグルコサミンを除去して、Ｍ６Ｐシグナルを明らかにする。然しながら、Ｎ−アセチルグルコサミンホスホトランスフェラーゼは、細胞内に制約され、そしてこの生化学的反応は、各種のリソソームタンパク質に対して本質的に非効率的である。製造過程中のリソソームタンパク質の過剰発現は、この問題を非常に悪化させ、そしてＭ６Ｐの非常に変化する量につながる。従って、糖鎖プロセシングは、典型的には不完全であり、そして高マンノース型のＮ−グリカン及び複合型Ｎ−グリカン（分泌型タンパク質において典型的）の、Ｍ６Ｐ、非Ｍ６Ｐ構造を含有するＮ−グリカンの混合物を伴う組換えリソソーム酵素の産生につながる。厄介なことに、死細胞又は損傷した細胞は、ホスファターゼのような酵素を細胞培養培地に放出し、これはＭ６Ｐを除去する。従って、減少したＭ６Ｐ含量は、Ｍ６Ｐ受容体に対する組換えリソソーム酵素の結合親和性を低下させ、そしてその細胞取込みを減少させ、そしてこれによって薬物の効力を減少させる。死細胞又は損傷した細胞は、他の糖（例えば、シアル酸、ガラクトース、等）を除去する他のグリコシダーゼを放出して、典型的には暴露されない内部の糖を明らかにし、そしてこれらのＮ−グリカンは、異常として容易に確認される。これらの不完全なＮ−グリカン構造は、循環からの組換えリソソームタンパク質のクリアランス速度を増加させ、これは、薬物の効力も減少させうる。従って減少した効力を相殺するために、高い薬物投与量が必要である。然しながら、高い薬物投与量の必要性は、多数の負の意味を有する：（１）高い薬物投与量は、既に高価な治療を増加させることにより法外な費用がかかりうる；（２）高い薬物投与量は長い注入時間を要する；（３）大量の循環薬物は顕著な抗体反応をもたらし（殆どのポンペ病患者において見られる）、そして多くの患者は注入中にアレルギー反応も経験している。ＦＤＡは、ミオザイムに対して“黒枠警告”を発行し、そしてこの薬物は、典型的には最初非常にゆっくりと投与され、しかし注入の過程で徐々に増加される。この戦略は、アレルギー反応を緩和することを援助するが、しかし注入時間を顕著に伸長し、１２時間の注入は普通である。

[0007]各種のリソソームＥＲＴのための薬物ターゲティングを改善するための一つの潜在的戦略は、伝統的なＭ６Ｐ糖鎖構造を必要とせずにリソソームに対してＥＲＴを効率的にターゲティングするためのターゲティングペプチドを使用する。これは、カチオン非依存性Ｍ６Ｐ受容体がインスリン様成長因子２（ＩＧＦ−２）と呼ばれる小さいペプチドのための別個の結合ドメインを含有していることから、概念的には実行可能であり、そして従ってこの受容体は、ＩＧＦ−２／（ＩＧＦ−２／ＣＩ−ＭＰＲ）として知られている。この受容体は、実際、ＩＧＦ−２／ＣＩ−ＭＰＲが細胞表面に存在し、そして生物学的に活性であるために、外因性Ｍ６Ｐ保有リソソームタンパク質の内部移行に対して単独で責任がある。Ｍ６Ｐ受容体の他の群、カチオン依存性Ｍ６Ｐ受容体（ＣＤ−ＭＰＲ）は、これが細胞表面で生物学的に活性でなく、そしてＩＧＦ−２ペプチド結合ドメインを欠くために、細胞内のリソソームタンパク質の輸送に関係するのみである。ＩＧＦ−２／ＣＩ−ＭＰＲは、Ｍ６Ｐに対する二つの別個の結合部位（それぞれドメイン１−３及び７−９）を有し、これは、モノ−Ｍ６Ｐ Ｎ−グリカン（Ｎ−グリカン上の１個のＭ６Ｐ残基）と中程度の親和性で、又はビス−Ｍ６Ｐ Ｎ−グリカン（同一Ｍ６Ｐ上の二つのＭ６Ｐ残基）と概略３０００倍高い親和性で結合する。リソソームタンパク質が複合（Ｍ６Ｐ無し）、モノ−及びビス−Ｍ６Ｐ Ｎ−グリカンの混合物を含有するために、ＩＧＦ−２／ＣＩ−ＭＰＲに対するこれらの親和性は、Ｍ６Ｐ保有Ｎ−グリカンの種類及び量によって幅広く変化する。ＩＧＦ−２ペプチドは、ＩＧＦ−２／ＣＩ−ＭＰＲに対して最も高い親和性を有し、これは、モノ−Ｍ６Ｐ Ｎ−グリカンより概略２３０，０００倍高い。ＩＧＦ−２／ＣＩ−ＭＰＲに対する各種のリガンドの結合親和性の概要を、以下の表１に要約する。

[0008]哺乳動物において、ＩＧＦ−２は、胚発生中の主要な成長ホルモンである。誕生後、それはもはや成長を媒介しないが、ＩＧＦ−２レベルは、比較的一定のままである（成長は、生涯を通してヒト成長ホルモンによる刺激により、ＩＧＦ−１によって媒介される）。誕生後のＩＧＦ−２の役割は、十分に理解されていないが、しかしこのペプチドは、創傷治癒及び組織修復を援助すると信じられている。ＩＧＦ−２は、遊離のＩＧＦ−２ペプチドのレベルを媒介する血清ＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ１−６）によって循環中に殆ど結合されている。これらのＩＧＦＢＰは、インスリン及びＩＧＦ−１も結合し、そしてこれらの循環レベルを制御する。ＩＧＦ−２／ＣＩ−ＭＰＲは、遊離のＩＧＦ−２ペプチドのための天然のクリアランス経路である。ＩＧＦ−２はインスリン及びＩＧＦ−１と構造的に類似であるために、これは、ＩＧＦ−２／ＣＩ−ＭＰＲと比較して、インスリン受容体（約１００倍低い）及びＩＧＦ−１受容体（約２３０倍低い）に対する低い親和性を有する。この特異性は、各種のアミノ酸を除去するか、又は特異的なアミノ酸残基（例えば、［Ｌｅｕ２７］ＩＧＦ−２＆［Ｌｅｕ４３］ＩＧＦ−２）を置換して、ＩＧＦ−２／ＣＩ−ＭＲＰに対する高親和性結合（表１）を維持し、しかしインスリン及びＩＧＦ−１受容体に対する結合を有意に減少させるか、又は排除することによって、著しく改善することができる。同様に、最初の６個のアミノ酸残基を欠くＩＧＦ２の変異型又は６位におけるグルタミン酸のアルギニンへの置換は、ＩＧＦＢＰに対するＩＧＦ２ペプチドの親和性を有意に減少させることが示されている。重要なことには、ＩＧＦ−２ペプチドは、臨床試験において安全であることが示されており、そしてある種の成長障害を治療することを援助するために臨床的に使用されている。これらの集合的データは、ＩＧＦ−２ペプチドを、組換えリソソーム酵素の細胞取込み及びリソソームへの輸送を容易にするために、伝統的なＭ６Ｐ糖鎖構造の代わりのターゲティングモチーフとして使用することができることを示唆する。

[0009]糖鎖プロセシングの問題を克服する一方、タンパク質ターゲティングを改善するためのＩＧＦ−２結合タンパク質を作成するための戦略を開発する必要性が残っている。

概要
[0010]本明細書中で提供されるものは、組換えヒトリソソーム酵素上のアミノ（Ｎ）末端及び一つ又はそれより多いリシン残基を、第１の架橋剤を使用して修飾して、第１の架橋剤で修飾された組換えヒトリソソーム酵素を得ること、変異型ＩＧＦ−２ペプチド上のアミノ（Ｎ）末端における短い伸長リンカーの第１アミノ酸を、第２の架橋剤を使用して修飾して、第２の架橋剤で修飾された変異型ＩＧＦ−２ペプチドを得ること、そして次いで第１の架橋剤で修飾された組換えヒトリソソーム酵素を、短い伸長リンカーを含有する第２の架橋剤で修飾された変異型ＩＧＦ−２ペプチドに結合させること、を含んでなる、組換えリソソーム酵素に結合したターゲティングペプチドを製造する方法である。

[0011]更に本明細書中で提供されるものは、組換えリソソーム酵素に結合されたターゲティングペプチドを製造する方法であって、第１の架橋剤で修飾された組換えヒトリソソーム酵素を、一つ又はそれより多い第２の架橋剤で修飾された変異型ＩＧＦ−２ペプチドに結合させることを含んでなり、ここで、第１の架橋剤で修飾された組換えリソソーム酵素は、化学的に修飾されたＮ−末端及び一つ又はそれより多い修飾されたリシン残基を有するとして特徴付けられる組換えリソソーム酵素を含んでなり、そして一つ又はそれより多い第２の架橋剤で修飾された変異型ＩＧＦ−２ペプチドは、アミノ（Ｎ）−末端の短いリンカー中に修飾されたアミノ酸を含んでなる一つ又はそれより多い変異型ＩＧＦ−２ペプチドを含んでなる、前記方法である。

[0012]本明細書中に提供されるものは、ヘテロ二官能性架橋剤を、変異型ＩＧＦ−２ペプチドに結合させ、そして次いでヘテロ二官能性架橋剤で修飾された変異型ＩＧＦ−２ペプチドを、組換えヒトリソソーム酵素に結合させることを含んでなる、酵素置換療法のための分子を製造する方法である。

[0013]更に本明細書中で提供されるものは、ヘテロ二官能性架橋剤を、組換えヒトリソソーム酵素に結合させ、そして次いでヘテロ二官能性架橋剤で修飾された組換えヒトリソソーム酵素を、変異型ＩＧＦ−２ペプチドに結合させることを含んでなる、酵素置換療法のための分子を製造する方法である。

[0014]本明細書中で提供されるものは、更に組換えヒトリソソーム酵素に化学的に結合された一つ又はそれより多い変異型ＩＧＦ−２ペプチドを含んでなる複合体である。
[0015]組換えヒトリソソーム酵素に結合されたヘテロ二官能性架橋剤で修飾された変異型ＩＧＦ−２ペプチドを含んでなる複合体も、提供される。

[0016]本明細書中に提供されるものは、修飾された組換えヒトリソソーム酵素に化学的に結合された一つ又はそれより多い変異型ＩＧＦ−２ペプチドを含んでなる複合体を、対象に投与することを含んでなる、リソソーム蓄積症に罹った対象を治療するための方法である。

[0017]更に本明細書中に提供されるものは、組換えヒトリソソーム酵素に結合されたヘテロ二官能性架橋剤で修飾された変異型ＩＧＦ−２ペプチドを含んでなる複合体を、対象に投与することを含んでなる、リソソーム蓄積症に罹った対象を治療するための方法である。

[0018]更に本明細書中に提供されるものは、ポンペ、ファブリー、ゴーシェ、ＭＰＳ Ｉ、ＭＰＳ ＩＩ、ＭＰＳ ＶＩＩ、テイ・サックス、サンドホフ、α−マンノシドーシス、又はウォルマン（Ｗｏｈｌｍａｎ）病に罹った患者を治療する方法であって、組換えリソソーム酵素に化学的に結合された一つ又はそれより多い変異型ＩＧＦ−２ペプチド及び医薬的に受容可能な担体を含んでなる組成物を、前記疾病を治療するために十分な量で、それを必要とする患者に投与することを含んでなる、前記方法である。

[0019]ポンペ、ファブリー、ゴーシェ、ＭＰＳ Ｉ、ＭＰＳ ＩＩ、ＭＰＳ ＶＩＩ、テイ・サックス、サンドホフ、α−マンノシドーシス、又はウォルマン病に罹った患者の適切な治療方法であって、組換えヒトリソソーム酵素に結合されたヘテロ二官能性架橋剤で修飾された変異型ＩＧＦ−２ペプチド及び医薬的に受容可能な担体を含んでなる組成物を、前記疾病を治療するために十分な量で、それを必要とする患者に投与することを含んでなる、前記方法も、提供される。

[0020]本明細書中に提供されるものは、配列番号：１を含んでなる、Ｅ．ｃｏｌｉ中の発現のために最適化された変異型ＩＧＦ−２ペプチドをコードするＤＮＡ配列である。
[0021]更に本明細書中に提供されるものは、配列番号：２を含んでなる、変異型ＩＧＦ−２ペプチドを表すアミノ酸配列である。

[0022]配列番号：３を含んでなる、伸長リンカーを表すアミノ酸配列も、提供される。
図面の簡単な説明
[0023]前記の及び他の本発明の側面は、付属する図面と関連して考慮される場合、本発明の以下の詳細な説明から明白である。本発明を例示する目的で、現時点で好ましい態様が図面に示されているが、然しながら、本発明が、特定の開示された手段に制約されるものではないことは理解されるものである。図面は、必ずしも寸法通りではない。図中：

[0024]図１（Ａ）は、ヒドラジド修飾リソソーム酵素の、ベンズアルデヒド修飾変異型ＩＧＦ−２ペプチドとの結合に対する略図を示す。この結合反応に先立ち、リソソーム酵素は、Ｎ−スクシンイミジル６−ヒドラジノニコチンアミドアセトン（Ｓ−Ｈｙｎｉｃ）のような第１の架橋剤で化学的に修飾され、これは、リソソーム酵素上のアミノ末端及び一つ又はそれより多いリシン残基を修飾して、化学的に活性なヒドラジド官能基を導入する。別の反応において、変異型ＩＧＦ２ペプチド中の短い伸長リンカー領域内のＮ−末端アミノ酸残基を、ＰＥＧ４−ペンタフルオロベンゼン（pentafluorobenzyne）安息香酸（ＰＥＧ４−ＰＦＢ）のような第２の架橋剤で化学的に修飾して、特許出願中に記載されているようにベンズアルデヒド官能基を導入する。ヒドラジド修飾リソソーム酵素及びベンズアルデヒド修飾変異型ＩＧＦ２ペプチドの精製後、これらのタンパク質は、アニリンを含有する酸性緩衝液中で一緒にインキュベートされて、ＩＧＦ２ペプチド結合リソソーム酵素を形成する。この結合反応において、化学的に活性なヒドラジド化学基は、アルデヒド基と反応して、安定した共有（ヒドラゾン）結合を形成する。図１（Ｂ）は、使用することができる他の適した第１の架橋剤（スクシンイミジル６−ヒドラジノニコチン酸アセトン（Ｓ−Ｈｙｎｉｃ）、スクシンイミジル４−ヒドラジドテレフタル酸塩酸塩（ＳＨＴＨ）、スクシンイミジル４−ヒドラジニウムニコチン酸塩酸塩（ＳＨＮＨ）、及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル−（ＰＥＧ）ｎ−ヒドラジド；ここで、ｎ＝３−２４ＰＥＧ単位）及び第２の架橋剤（ＰＥＧ４−ペンタフルオロベンゼン安息香酸（ＰＥＧ４−ＰＦＢ）、スクシンイミジル４−ホルミル安息香酸（ＳＦＢ）、及びＣ６−スクシンイミジル４−ホルミル安息香酸（Ｃ６−ＳＦＢ））を示す。 [0025]図２（Ａ）は、ホスフィン修飾リソソーム酵素の、アジド修飾異種ＩＧＦ２ペプチドとの、シュタウジンガーライゲーション反応による結合のための略図を示す。この結合反応に先立ち、リソソーム酵素は、スルホ−ＮＨＳ−ホスフィンのような第１の架橋剤で化学的に修飾され、これは、リソソーム酵素上のアミノ末端及び一つ又はそれより多いリシン残基を修飾して、化学的に活性なホスフィン官能基を導入する。別の反応において、変異型ＩＧＦ２ペプチド中の短い伸長リンカー領域内のＮ−末端アミノ酸残基は、ＮＨＳ−（ＰＥＧ）ｎ−アジドのような第２の架橋剤で化学的に修飾されて、アジド官能基を導入する。ホスフィン修飾リソソーム酵素及びアジド修飾変異型ＩＧＦ２ペプチドの精製後、これらのタンパク質は、僅かに酸性の緩衝液中で一緒にインキュベートされて、ＩＧＦ２ペプチド結合リソソーム酵素を形成する。この結合反応において、化学的に活性なアジド化学基は、ホスフィン基と反応して、安定した共有（アミド）結合を形成する。図２（Ｂ）は、使用することができる他の適した第１の架橋剤（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル−ホスフィン（ＮＨＳ−ホスフィン）及びスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル−ホスフィン（スルホ−ＮＨＳ−ホスフィン）及び第２の架橋剤（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル−アジド（ＮＨＳ−アジド）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル−（ＰＥＧ）ｎ−アジド；ここで、ｎ＝３−２４ＰＥＧ単位、そしてＮＨＳ−ＰＥＧ３−Ｓ−Ｓ−アジド）を示す。 [0026]図３（Ａ）は、アセチレン修飾リソソーム酵素のアジド修飾ＩＧＦ２ペプチドとのクリックケミストリーによる結合のための略図を示す。この結合反応に先立ち、リソソーム酵素は、ＮＨＳ−（ＰＥＧ）ｎ−アセチレンのような第１の架橋剤で化学的に修飾され、これは、リソソーム酵素上のアミノ末端及び一つ又はそれより多いリシン残基を修飾して、化学的に活性なアセチレン官能基を導入する。別の反応において、変異型ＩＧＦ２ペプチド中の短い伸長リンカー領域内のＮ−末端アミノ酸残基を、ＮＨＳ−（ＰＥＧ）ｎ−アジドのような第２の架橋剤で化学的に修飾して、アジド官能基を導入する。アセチレン修飾リソソーム酵素及びアジド修飾ＩＧＦ２ペプチドの精製後、これらのタンパク質を、銅（Ｉ）イオンを伴う僅かに酸性の緩衝液中で一緒にインキュベートして、ＩＧＦ２ペプチド結合リソソーム酵素を形成させる。この結合反応において、化学的に活性なアジド化学基は、アルキン基と反応して、安定した共有（トリアゾール）結合を形成する。図３（Ｂ）は、使用することができる他の適した第１の架橋剤（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル−テトラオキサペンタデカンアセチレン（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−アセチレン）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル−（ＰＥＧ）ｎ−アセチレン；ここで、ｎ＝３−２４ＰＥＧ単位、そしてＮＨＳ−ＰＥＧ３−Ｓ−Ｓ−アセチレン）及び第２の架橋剤（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル−アジド（ＮＨＳ−アジド）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル−（ＰＥＧ）ｎ−アジド；ここで、ｎ＝３−２４ＰＥＧ単位、そしてＮＨＳ−ＰＥＧ３−Ｓ−Ｓ−アジド）を示す。 [0027]図４（Ａ）は、ｍ−マレイミドベンゾイル（ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｚｙｏｌ）−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）のような単一の架橋剤を使用するリソソーム酵素及びＩＧＦ２ペプチドの結合の略図を示す。第１の反応において、化学的に反応性のマレイミド基は、ＩＧＦ２ペプチド変異型中のＣ−末端システイン残基の遊離のスルフヒドリル基と反応する。次いでＭＢＳ修飾ＩＧＦ２ペプチドは、精製され、そして次いで化学的に反応性のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基の、リソソーム酵素上のアミノ末端及び一つ又はそれより多いリシン残基との架橋によってリソソーム酵素に結合して、安定した共有（アミド）結合を形成する。図４（Ｂ）は、使用することができる他の適した架橋剤（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、スルホ−ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（スルホ−ＭＢＳ）、及びスルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ））を示す。 [0028]図５は、Ｃ４逆相クロマトグラフィーによるＩＧＦ２ペプチドの特徴付けを示す。４．６×１５０ｍｍのＣ４逆相分析用カラムを、野生型及び変異型ＩＧＦ２ペプチドの純度及びタンパク質の立体構造を評価するために使用した。ペプチド試料を、０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）及び２５％のアセトニトリルで平衡化したＣ４カラムに付加した。２分後、カラムを、１０分かけた２５−３５％のアセトニトリルの直線勾配を使用して展開した。図５（Ａ）は、組換え野生型ヒトＩＧＦ２ペプチドが、３０％アセトニトリルに対応する概略７．５分に溶出することを示す。図５（Ｂ）は、組換え変異型ヒトＩＧＦ２ペプチドも、３０％アセトニトリルに対応する概略７．５分に溶出することを示す。図５（Ｃ）は、ＰＥＧ４−ＰＦＢ修飾変異型ヒトＩＧＦ２ペプチドが、３１％アセトニトリルに対応する概略８分に溶出することを示す。これらのデータは、野生型及び変異型ＩＧＦ２ペプチドがＣ４逆相クロマトグラフィーにおいて殆ど同一の挙動を示すことから、これらが非常に類似したタンパク質高次構造を有することを示す。ＰＥＧ４−ＰＦＢ修飾変異型ヒトＩＧＦ２ペプチドについての滞留時間のシフトは、変異型ＩＧＦ２ペプチドが、化学的架橋剤で完全に修飾され、これがＣ４カラム上のその相互作用を変化させたことを示す。 [0029]図６は、受容体結合及び細胞取込みについての変異型ＩＧＦ２ペプチド結合ｒｈＧＡＡの評価を示す。変異型ＩＧＦ２ペプチドは、架橋剤ＰＥＧ４−ＰＦＢで修飾され、そしてその後、Ｓ−Ｈｙｎｉｃ修飾ｒｈＧＡＡにカップリングされた。得られた変異型ＩＧＦ２ペプチド結合ｒｈＧＡＡ（ｖＩＧＦ２−ｒｈＧＡＡと命名）は、次いでサイズ排除クロマトグラフィーによって精製された。変異型ＩＧＦ２ペプチドの化学的結合が、ＩＧＦ２／ＣＩ−ＭＰＲ受容体に対するｒｈＧＡＡの親和性を改善するか否かを決定するために、非結合ｒｈＧＡＡ及びｖＩＧＦ２−ｒｈＧＡＡの結合を、各種のタンパク質濃度（０．０１２−４２ｎＭのｒｈＧＡＡに対応する０．００３−１０μｇ／ｍｌ）で、図６（Ａ）の受容体プレート結合アッセイで直接比較した。これらのＩＧＦ２／ＣＩ−ＭＰＲ受容体プレート結合アッセイで試験された全てのタンパク質濃度において、非結合ｒｈＧＡＡより有意に高い量の捕捉された酵素活性が、ｖＩＧＦ２−ｒｈＧＡＡについて観察された。これらの結果は、ＩＧＦ２ペプチドの結合が、ＩＧＦ２／ＣＩ−ＭＰＲ受容体に対するｒｈＧＡＡの親和性を増加させることを確認する。更に、遊離の野生型ＩＧＦ２ペプチドの包含は、これらのプレートアッセイにおけるｖＩＧＦ２−ｒｈＧＡＡ捕捉を大きく減少させ、結合がＩＧＦ２ペプチドに依存することを示した。はるかに高い量の遊離の野生型ＩＧＦ２ペプチドが、これらの受容体プレートアッセイにおけるｖＩＧＦ２−ｒｈＧＡＡ結合を完全に排除するために必要である可能性がある。増加した受容体親和性がｖＩＧＦ２−ｒｈＧＡＡに対する改善された細胞取込みにつながるか否かを決定するために、細胞外の非結合ｒｈＧＡＡ及びｖＩＧＦ２−ｒｈＧＡＡの内部移行を、図６（Ｂ）のＬ６ラットの骨格筋筋芽細胞で評価した。ｖＩＧＦ２−ｒｈＧＡＡは、試験された全てのタンパク質濃度におけるＬ６筋芽細胞において非結合ｒｈＧＡＡより実質的に良好に内部移行されることが示された。これらの結果は、標的細胞における外因性リソソーム酵素の内部移行及び送達を向上させるための受容体結合親和性を改善することの機能上の利益を証明する。 [0030]図７は、変異型ＩＧＦ２ペプチド結合Ｉ２Ｓの特徴付けを示す。変異型ＩＧＦ２ペプチドは、架橋剤ＮＨＳ−ＰＥＧ４−アジドで修飾され、そしてその後、ホスフィン修飾Ｉ２Ｓにカップリングされた。得られた変異型ＩＧＦ２ペプチド結合Ｉ２Ｓ（ｖＩＧＦ２−Ｉ２Ｓと命名）は、サイズ排除クロマトグラフィーによって精製された。変異型ＩＧＦ２ペプチドの化学的結合が、ＩＧＦ２／ＣＩ−ＭＰＲ受容体に対するＩ２Ｓの親和性を改善するか否かを決定するために、非結合Ｉ２Ｓ及びｖＩＧＦ２−Ｉ２Ｓの結合を、図７（Ａ）の受容体プレート結合アッセイにおいて様々なタンパク質濃度（０．０３−１０μｇ／ｍｌ）で直接比較した。試験された全てのタンパク質濃度において、非結合Ｉ２Ｓより実質的に高い量のｖＩＧＦ２−Ｉ２Ｓが、これらのＩＧＦ２／ＣＩ−ＭＰＲ受容体プレート結合アッセイにおいて捕捉された。これらの受容体結合の結果は、ｖＩＧＦ２−ｒｈＧＡＡに対するものと一致しており、同一の変異型ＩＧＦ２ペプチドを異なったリソソーム酵素に化学的にカップリングさせて、ＩＧＦ２／ＣＩ−ＭＰＲ受容体に対するその結合親和性を増加させることができることを示す。複数の変異型ＩＧＦ２ペプチドをリソソーム酵素に化学的に結合させることができるか否かを決定するために、非結合Ｉ２Ｓ及びｖＩＧＦ２−Ｉ２Ｓの分子量を、図７（Ｂ）のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって比較した。非結合Ｉ２Ｓは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて概略８０ｋＤａの見掛け分子量（レーン１）を有し、一方、ｖＩＧＦ２−Ｉ２Ｓは、概略１２０ｋＤａのはるかに高い見掛け分子量（レーン２）を有していた。これらのデータは、変異型ＩＧＦ２ペプチドの分子量が僅か約８ｋＤａ（レーン３）であるために、複数の変異型ＩＧＦ２ペプチドが、概略４０ｋＤａの増加のためにＩ２Ｓに化学的に結合したに違いないことを示す。これらの結果は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの幅広いタンパク質バンドによって示されるように、Ｉ２Ｓが、様々な量の変異型ＩＧＦ２ペプチドで、ｖＩＧＦ２−Ｉ２Ｓに完全に転換されたことも示す。

[0031]本発明の主題は、本開示の一部を形成する付属する図面及び実施例と関連して解釈される以下の詳細な説明を参照することによって更に容易に理解することができる。本発明が、本明細書中に記載及び／又は示される特定のデバイス、方法、適用、条件又はパラメーターに制約されず、そして本明細書中で使用される専門用語は、特定の態様を例示によってのみ記載する目的のためであり、そして特許請求される本発明を限定することを意図するものではないことは理解されることである。

[0032]更に、付属する特許請求の範囲を含む本明細書中で使用する場合、単数形の“一つ（a）”、“一つの（an）”、及び“その（the）”は、複数を含み、そして特定の数値に対する言及は、文脈が明確に異なって指示しない限り、少なくともその特定の値を含む。用語“複数”は、本明細書中で使用する場合、一つより多くを意味する。数値の範囲が表示される場合、もう一つの態様は、一つの特定の数値から及び／又は他の特定の数値までを含む。同様に、数値が先行詞“約”の使用によって概数として表示される場合、これは、特定の数値がもう一つの態様を形成するものと理解される。全ての範囲は、包含的であり、そして組合せ可能である。

[0033]実施例は、本発明の更なる理解を補助するために提供される。使用される特定の物質、プロトコル及び条件は、本発明の更なる例示を意図し、そしてその妥当な範囲を限定すると解釈されるべきではない。

[0034]ターゲティングペプチドを組換えリソソーム酵素に結合させるための適した方法は、組換えヒトリソソーム酵素上のアミノ（Ｎ）末端及び一つ又はそれより多いリシン残基を、第１の架橋剤を使用して修飾して、第１の架橋剤で修飾された組換えヒトリソソーム酵素を得て、変異型ＩＧＦ−２ペプチドに先行する短い伸長リンカー領域のアミノ（Ｎ）末端を、第２の架橋剤を使用して修飾して、第２の架橋剤で修飾された変異型ＩＧＦ−２ペプチドを得て、そして次いで第１の架橋剤で修飾された組換えヒトリソソーム酵素を、第２の架橋剤で修飾された短い伸長リンカーを含有する変異型ＩＧＦ−２ペプチドに結合させることを含む。

[0035]ターゲティングペプチドを、組換えリソソーム酵素に結合させる他の適した方法は、第１の架橋剤で修飾された組換えヒトリソソーム酵素を、一つ又はそれより多い第２の架橋剤で修飾された変異型ＩＧＦ−２ペプチドに結合させることを含み、ここで、第１の架橋剤で修飾された組換えリソソーム酵素は、化学的に修飾されたＮ末端及び一つ又はそれより多い修飾されたリシン残基を有するとして特徴付けられる組換えリソソーム酵素を含んでなり、そして一つ又はそれより多い第２の架橋剤で修飾された変異型ＩＧＦ−２ペプチドは、ＩＧＦ２ペプチドに先行する短い伸長リンカーの修飾されたＮ末端アミノ酸を含んでなる一つ又はそれより多い変異型ＩＧＦ−２ペプチドを含んでなる。

[0036]適した短い伸長リンカーは、５ないし２０個のアミノ酸残基の長さであることができる。短い伸長リンカーは、約１０個のアミノ酸の長さであることもできる。適した短い伸長リンカーは、配列番号：３のアミノ酸配列によって表すことができる。他の適した短い伸長リンカーは、５個のアミノ酸の可動性ＧＳ伸長リンカー（グリシン−グリシン−グリシン−グリシン−セリン）、２個の可動性ＧＳリンカーを含んでなる１０個のアミノ酸の伸長リンカー、３個の可動性ＧＳリンカーを含んでなる１５個のアミノ酸の伸長リンカー、４個の可動性ＧＳリンカーを含んでなる２０個のアミノ酸の伸長リンカー、又はこれらのいずれもの組合せを使用して提供することができる。

[0037]組換えリソソーム酵素に結合したターゲティングペプチドを製造する適切な方法であって、第１の架橋剤で修飾された組換えリソソーム酵素が、第１の架橋剤を使用して修飾された化学的に修飾されたＮ末端及び一つ又はそれより多い修飾されたリシン残基を有するとして特徴付けられる組換えヒトリソソーム酵素を使用することを含む、前記方法。適した組換えヒトリソソーム酵素は、ヒト酸性α−グルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）、ヒト酸性α−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）、ヒト酸性β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ヒト酸性α−イズロニダーゼＡ（ＩｄｕＡ）、ヒト酸性イズロニデート（ｉｄｕｒｏｎｉｄａｔｅ）２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）、ヒトβ−ヘキソサミニダーゼＡ（ＨｅｘＡ）、ヒトβ−ヘキソサミニダーゼＢ（ＨｅｘＢ）、ヒト酸性α−マンノシダーゼＡ、ヒトβ−グルコセレブロシダーゼ（ＧｌｃＣｅｒａｓｅ）、ヒト酸性リパーゼ（ＬＰＡ）、及びこれらのいずれもの組合せを含む。一つ又はそれより多いリシン残基も、組換えヒトリソソーム酵素上で修飾することができる。適した第１の架橋剤は、スクシンイミジル６−ヒドラジノニコチン酸アセトン（Ｓ−Ｈｙｎｉｃ）、スルホ−スクシンイミジル６−ヒドラジノニコチン酸アセトン（スルホ−Ｓ−ＨｙＮｉｃ）、又はＣ６−スクシンイミジル６−ヒドラジノ−ニコチンアミド（Ｃ６−Ｓ−Ｈｙｎｉｃ）、又はスクシンイミジル４−ヒドラジドテレフタル酸塩酸塩（ＳＨＴＨ）、又はスクシンイミジル４−ヒドラジニウムニコチン酸塩酸塩（ＳＨＮＨ）或いはこれらのいずれもの組合せを含み、反応性アルデヒド基を含有するターゲティングペプチドへの化学的カップリングのために、リソソーム酵素上にヒドラジド部分を導入する。或いは、リソソーム酵素は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル−ホスフィン（ＮＨＳ−ホスフィン）、スルホ−ＮＨＳ−ホスフィン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル−テトラオキサペンタデカンアセチレン（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−アセチレン）、“ｎ”が３から２４までの範囲の個別のＰＥＧ単位であることができる他のＮＨＳ−（ＰＥＧ）ｎ−アセチレンヘテロ二官能性架橋剤、又はＮＨＳ−ＰＥＧ３−Ｓ−Ｓ−アセチレンのような開裂可能なヘテロ二官能性架橋剤、又はジフルオロシクロオクチン（ＤＩＦＯ）及びジベンゾシクロオクチン（ＤＩＢＯ）のようなシクロオクチンを含有するヘテロ二官能性架橋剤、或いはこれらのいずれもの組合せで、化学的に修飾されたリソソーム酵素を反応性アジド基を含有する化学的に修飾されたターゲティングペプチドにカップリングするために、修飾することができる。ターゲティングペプチドの修飾のために適した第２の架橋剤は、ＰＥＧ４−ペンタフルオロベンゼン−４−ホルミル安息香酸（ＰＥＧ４−ＰＦＢ）、又はスクシンイミジル４−ホルミル安息香酸（ＳＦＢ）、或いはＣ６−スクシンイミジル４−ホルミル安息香酸（Ｃ６−ＳＦＢ）を含み、反応性ヒドラジド基を含有するリソソーム酵素に結合するためにターゲティングペプチドに反応性アルデヒド基を導入する。ターゲティングペプチドは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル−アジド（ＮＨＳ−アジド）又は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル−テトラオキサペンタデカン−アジド（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−アジド）又はｎが３から２４までの範囲の別個のＰＥＧ単位であることができる他のＮＨＳ−（ＰＥＧ）ｎ−アジド架橋剤のようなヘテロ二官能性架橋剤、又はＮＨＳ−ＰＥＧ３−Ｓ−Ｓ−アジドのような開裂可能なヘテロ二官能性架橋剤、或いはこれらのいずれもの組合せで修飾し、反応性ホスフィン、或いはアルキン又はシクロオクチン基を含有するリソソーム酵素への結合のためにターゲティングペプチド上に反応性アジド基を導入することができる。好ましい態様において、第１の架橋剤は、Ｎ−スクシンイミジル６−ヒドラジノニコチン酸アセトン（Ｓ−Ｈｙｎｉｃ）であることができ、そして第２の架橋剤は、ＰＥＧ４−ペンタフルオロベンゼン−４−ホルミル安息香酸（ＰＥＧ４−ＰＦＢ）であることができる。

[0038]組換えヒトリソソーム酵素上のＮ−末端及び一つ又はそれより多いリシン残基は、第一アミンの非存在下、ｐＨ約７．３の緩衝液中で、約３０分間概略室温で修飾することができる。組換えヒトリソソーム酵素は、組換えヒトリソソーム酵素上のＮ−末端及びリシン残基が修飾された後、酸性緩衝液中に急速に交換することができる。例えば、酸性緩衝液は、ｐＨ約５．０の５０ｍＭ酢酸ナトリウムであることができる。酸性緩衝液は、ｐＨ約５．０の０．１Ｍ酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、クエン酸ナトリウム、ＭＥＳ、リン酸ナトリウム又はリン酸カリウムであることができる。酸性緩衝液中への交換は、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して行うことができ、そして酸性緩衝液中への交換は、透析を使用して行うことができる。

[0039]第２の架橋剤で修飾された短いリンカーを含有する変異型ＩＧＦ−２ペプチドは、第１の架橋剤で修飾された組換えヒトリソソーム酵素への結合の前に精製することができる。精製は、ゲル濾過、透析又は逆相クロマトグラフィーを使用して行うことができる。

[0040]ヒドラジド修飾組換えヒトリソソーム酵素の、短いリンカーを含有するアルデヒド修飾変異型ＩＧＦ−２ペプチドへの結合は、ｐＨ約５．０の酸性の緩衝液中でアニリンの存在下で行うことができる。ホスフィン−又はアセチレン−又はシクロオクチン修飾組換えヒトリソソーム酵素の、短いリンカーを含有するアジド修飾変異型ＩＧＦ−２ペプチドへの結合は、ｐＨ５．０−７．０の間の範囲の緩衝液中で行うことができる。組換えヒトリソソーム酵素で修飾された短いリンカーを含有するＩＧＦ−２ペプチド複合体は、サイズ排除クロマトグラフィー又は透析を使用して精製することができる。

[0041]適した第１の架橋剤は、スクシンイミジル６−ヒドラジノニコチン酸アセトン（Ｓ−Ｈｙｎｉｃ）、スルホ−スクシンイミジル６−ヒドラジノニコチン酸アセトン（スルホ−Ｓ−ＨｙＮｉｃ）、又はＣ６−スクシンイミジル６−ヒドラジノ−ニコチンアミド（Ｃ６−Ｓ−Ｈｙｎｉｃ）、又はスクシンイミジル４−ヒドラジドテレフタル酸塩酸塩（ＳＨＴＨ）、又はスクシンイミジル４−ヒドラジニウムニコチン酸塩酸塩（ＳＨＮＨ）或いはこれらのいずれもの組合せを含み、反応性アルデヒド基を含有するターゲティングペプチドに化学的にカップリングするためにリソソーム酵素上にヒドラジド部分を導入する。或いは、リソソーム酵素は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル−ホスフィン（ＮＨＳ−ホスフィン）、スルホ−ＮＨＳ−ホスフィン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルテトラオキサペンタデカンアセチレン（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−アセチレン）、“ｎ”が３から２４までの範囲の別個のＰＥＧ単位であることができる他のＮＨＳ−（ＰＥＧ）ｎ−アセチレンヘテロ二官能性架橋剤、又はＮＨＳ−ＰＥＧ３−Ｓ−Ｓ−アセチレンのような開裂可能なヘテロ二官能性架橋剤、又はジフルオロシクロオクチン（ＤＩＦＯ）及びジベンゾシクロオクチン（ＤＩＢＯ）のようなシクロオクチンを含有するヘテロ二官能性架橋剤、或いはこれらのいずれもの組合せで修飾し、反応性アジド基を含有するターゲティングペプチドにこれらの化学的に修飾されたリソソーム酵素をカップリングすることができる。ターゲティングペプチドを修飾するために適した第２の架橋剤は、ＰＥＧ４−ペンタフルオロベンゼン−４−ホルミル安息香酸（ＰＥＧ４−ＰＦＢ）、又はスクシンイミジル４−ホルミル安息香酸（ＳＦＢ）、或いはＣ６−スクシンイミジル４−ホルミル安息香酸（Ｃ６−ＳＦＢ）、又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル−テトラオキサペンタデカン−アジド（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−アジド）又は“ｎ”が３から２４までの範囲の別個のＰＥＧ単位であることができる他のＮＨＳ−（ＰＥＧ）ｎ−アジドヘテロ二官能性架橋剤、又はＮＨＳ−ＰＥＧ３−Ｓ−Ｓ−アジドのような開裂可能なヘテロ二官能性架橋剤を含む。もう一つの適した態様において、第１の架橋剤は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル−ホスフィン（ＮＨＳ−ホスフィン）、又はスルホ−ＮＨＳ−ホスフィンであることができ、そして第２の架橋剤は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル−テトラオキサペンタデカン−アジド（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−アジド）であることができる。もう一つの適した態様において、第１の架橋剤は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル−テトラオキサペンタデカン−アセチレン（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−アセチレン）又は“ｎ”が３から２４までの範囲のＰＥＧ単位であることができる他のＮＨＳ−（ＰＥＧ）ｎ−アセチレンヘテロ二官能性架橋剤、又はＮＨＳ−ＰＥＧ３−Ｓ−Ｓ−アセチレンのような開裂可能なヘテロ二官能性架橋剤であることができ、そして第２の架橋剤は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル−テトラオキサペンタデカン−アジド（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−アジド）であることができる。もう一つの適した態様において、第１の架橋は、ジフルオロシクロオクチン（ＤＩＦＯ）及びジベンゾシクロオクチン（ＤＩＢＯ）のようなシクロオクチンであることができ、そして第２の架橋剤は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル−テトラオキサペンタデカン−アジド（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−アジド）であることができる。

[0042]組換えヒトリソソーム酵素上のＮ−末端及び一つ又はそれより多いリシン残基は、第一アミンを欠くｐＨ約７．３の緩衝液中で、約３０分間概略室温で修飾することができる。組換えヒトリソソーム酵素は、組換えヒトリソソーム酵素上のＮ−末端及びリシン残基が修飾された後、酸性緩衝液中に急速に交換することができる。適した酸性緩衝液は、ｐＨ約５．０の５０ｍＭ酢酸ナトリウムを含む。酸性緩衝液は、ｐＨ約５．０の０．１Ｍ酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、クエン酸ナトリウム、ＭＥＳ、リン酸ナトリウム又はリン酸カリウムであることができる。酸性緩衝液中への交換は、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して又は透析を使用して適当に行うことができる。

[0043]第２の架橋剤で修飾された前記の短いリンカーを含有する変異型ＩＧＦ−２ペプチドは、第１の架橋剤で修飾された組換えヒトリソソーム酵素への結合に先立って、ゲル濾過、透析又は逆相クロマトグラフィーを使用して精製することができる。ヒドラジド修飾組換えヒトリソソーム酵素の、短いリンカーを含有するアルデヒド修飾変異型ＩＧＦ−２ペプチドへの結合は、ｐＨ約５．０の酸性の緩衝液中で、アニリンの存在下で行うことができる。ホスフィン−又はアセチレン−又はシクロオクチン修飾組換えヒトリソソーム酵素の、短いリンカーを含有するアジド修飾変異型ＩＧＦ−２ペプチドへの結合は、ｐＨ５．０−７．０間の範囲の緩衝液中で行うことができる。組換えヒトリソソーム酵素で修飾された、短いリンカーを含有するＩＧＦ−２ペプチド複合体は、サイズ排除クロマトグラフィー又は透析を使用して精製することができる。

[0044]結合後、組換えヒトリソソーム酵素−短いリンカーを含有する変異型ＩＧＦ−２ペプチドは、サイズ排除クロマトグラフィー又は透析を使用して精製することができる。
[0045]第１の架橋剤（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−アセチレン）で修飾された組換えヒトリソソーム酵素の、第２の架橋剤（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−アジド）で修飾された短いリンカーを含有する変異型ＩＧＦ−２ペプチドへの、ｐＨ約５．０の酸性緩衝液中での結合は、銅（Ｃｕ^＋１）の存在下で行うことができる。この結合工程後、組換えヒトリソソーム酵素で修飾された短いリンカーを含有する変異型ＩＧＦ−２ペプチド複合体の精製工程を、サイズ排除クロマトグラフィー又は透析を使用して行うことができる。

[0046]第１の架橋剤（ジフルオロシクロオクチン；ＤＩＦＯのようなシクロオクチン）で修飾された組換えヒトリソソーム酵素の、第２の架橋剤（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−アジド）で修飾された短いリンカーを含有する変異型ＩＧＦ−２ペプチドへの、ｐＨ約６．０の酸性緩衝液中での結合。この結合工程後、組換えヒトリソソーム酵素で修飾された短いリンカーを含有するＩＧＦ−２ペプチド複合体の精製工程を、サイズ排除クロマトグラフィー又は透析を使用して行うことができる。

[0047]酵素置換療法のための分子は、ヘテロ二官能性架橋剤を変異型ＩＧＦ−２ペプチドに結合させ、そして次いでヘテロ二官能性架橋剤で修飾された変異型ＩＧＦ−２ペプチドを、組換えヒトリソソーム酵素に結合させることによって作成することができる。酵素置換療法のための分子は、ヘテロ二官能性架橋剤を組換えヒトリソソーム酵素に結合させ、そして次いでヘテロ二官能性架橋剤で修飾された組換えヒトリソソーム酵素を、変異型ＩＧＦ−２ペプチドに結合させることによって製造することもできる。適した組換えヒトリソソーム酵素は、ヒト酸性α−グルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）、ヒト酸性α−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）、ヒト酸性β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ヒト酸性α−イズロニダーゼＡ（ＩｄｕＡ）、ヒト酸性イズロニデート２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）、ヒトβ−ヘキソサミニダーゼＡ（ＨｅｘＡ）、ヒトβ−ヘキソサミニダーゼＢ（ＨｅｘＢ）、ヒト酸性α−マンノシダーゼＡ、ヒトβ−グルコセレブロシダーゼ（ＧｌｃＣｅｒａｓｅ）、ヒト酸性リパーゼ（ＬＰＡ）、又はこれらのいずれもの組合せを含む。適したヘテロ二官能性架橋剤は、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、スルホ−ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（スルホ−ＭＢＳ）又はこれらのいずれもの組合せを含む。変異型ＩＧＦ−２ペプチド−組換えヒトリソソーム酵素複合体は、所望により、ゲル濾過又は透析を使用して精製することができる。

[0048]適した組換えヒトリソソーム酵素は、酵母を使用して製造することができる。酵母から製造された組換えヒトリソソーム酵素は、Ｎ−グリカンを除去するために、エンドグリコシダーゼＦ（ＥｎｄｏＦ）又はエンドグリコシダーゼＨ（ＥｎｄｏＨ）を使用して処理することができる。もう一つの適した態様において、エンドグリコシダーゼＦ（ＥｎｄｏＦ）又はエンドグリコシダーゼＨ（ＥｎｄｏＨ）を使用する処理は、酸性のｐＨの緩衝液中で起こすことができる。適した酸性のｐＨの緩衝液は、０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０を含む。反応は、概略室温で行うことができる。エンドグリコシダーゼＦ（ＥｎｄｏＦ）又はエンドグリコシダーゼＨ（ＥｎｄｏＨ）を使用する処理後、組換えヒトリソソーム酵素は、所望により、サイズ排除クロマトグラフィー又は透析を使用して精製することができる。

[0049]組換えヒトリソソーム酵素に化学的に結合した一つ又はそれより多い変異型ＩＧＦ−２ペプチドの複合体も、提供される。これらの態様において、第１の架橋剤で修飾された組換えリソソーム酵素は、組換えヒトリソソーム酵素であることができ、そして組換えヒトリソソーム酵素は、一つ又はそれより多い修飾されたリシン残基を有することができ、例えば、Ｎ−末端を、化学的に修飾することができる。適した変異型ＩＧＦ−２ペプチドは、ＩＧＦ−２ペプチド類似体及びＮ−末端を伴う短いリンカーであることができる。少なくとも一つの変異型ＩＧＦ−２ペプチドは、適当には、短いリンカー内に修飾されたＮ−末端を有するＩＧＦ−２ペプチドである。適した修飾されたＩＧＦ−２ペプチドは、ｐＨ約７．５の緩衝液中でＮ−末端において修飾されることが可能であるとして特徴付けられる。適した変異型ＩＧＦ−２ペプチドは、適当な反応性化学基を伴う短いリンカーをＮ−又はＣ−末端に含有する合成のＩＧＦ−２ペプチド類似体を含む。適した変異型ＩＧＦ−２ペプチドは、ＩＧＦ−２ペプチド類似体を含んでなり、Ｎ−末端の短いリンカーは、組換えタンパク質として作成することができ、そしてＮ−末端アミノ酸は、その後二官能性架橋剤で化学的に修飾することができる。

[0050]適した組換えヒトリソソーム酵素は、ヒト酸性α−グルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）を含む。これらの方法において使用することができる他の適した組換えヒトリソソーム酵素は、ヒト酸性α−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）、ヒト酸性β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ヒト酸性α−イズロニダーゼＡ（ＩｄｕＡ）、ヒト酸性イズロニデート（ｉｓｕｒｏｎｉｄａｔｅ）２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）、ヒトβ−ヘキソサミニダーゼＡ（ＨｅｘＡ）、ヒトβ−ヘキソサミニダーゼＢ（ＨｅｘＢ）、ヒト酸性α−マンノシダーゼＡ、ヒトβ−グルコセレブロシダーゼ（ＧｌｃＣｅｒａｓｅ）、ヒト酸性リパーゼ（ＬＰＡ）、又はこれらのいずれもの組合せを含む。適した組換えヒトリソソーム酵素は、修飾されたＮ−末端及び少なくとも一つの修飾されたリシン残基を有するとして特徴付けられる。

[0051]適した第１の架橋剤で修飾された組換えリソソーム酵素は、アミノ反応性二官能性架橋剤から誘導された架橋剤を有するとして特徴付けることができる。適した第１の架橋剤で修飾された組換えリソソーム酵素は、ヒドラジド部分を導入するために、スクシンイミジル６−ヒドラジノニコチン酸アセトン（Ｓ−Ｈｙｎｉｃ）、スルホ−スクシンイミジル６−ヒドラジノニコチン酸アセトン（スルホ−Ｓ−ＨｙＮｉｃ）、又はＣ６−スクシンイミジル６−ヒドラジノ−ニコチンアミド（Ｃ６−Ｓ−Ｈｙｎｉｃ）、又はスクシンイミジル４−ヒドラジドテレフタル酸塩酸塩（ＳＨＴＨ）、又はスクシンイミジル４−ヒドラジニウムニコチン酸塩酸塩（ＳＨＮＨ）或いはこれらのいずれもの組合せから誘導された架橋剤を含んでなるとして特徴付けることができる。或いは、リソソーム酵素は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル−ホスフィン（ＮＨＳ−ホスフィン）、スルホ−ＮＨＳ−ホスフィン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルテトラオキサペンタデカンアセチレン（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−アセチレン）、“ｎ”が３から２４までの範囲の別個のＰＥＧ単位であることができる他のＮＨＳ−（ＰＥＧ）ｎ−アセチレンヘテロ二官能性架橋剤、又はＮＨＳ−ＰＥＧ３−Ｓ−Ｓ−アセチレンのような開裂可能なヘテロ二官能性架橋剤、又はジフルオロシクロオクチン（ＤＩＦＯ）及びジベンゾシクロオクチン（ＤＩＢＯ）のようなシクロオクチンを含有するヘテロ二官能性架橋剤或いはこれらのいずれもの組合せで修飾し、反応性アジド基を含有するターゲティングペプチドにこれらの化学的に修飾されたリソソーム酵素をカップリングすることができる。組換えヒトリソソーム酵素上の修飾されたＮ−末端及びリシン残基は、第一アミンを欠くｐＨ約７．３の緩衝液中で、約３０分間概略室温で修飾された第１の（Ｎ−末端）アミノ酸及びリシン残基上の第一アミンから誘導されるとして特徴付けることができる。変異型ＩＧＦ−２ペプチドは、更に、ＩＧＦ−２ペプチド及び第２の架橋剤にカップリングした短い伸長リンカーを含むことができる。スクシンイミジル６−ヒドラジノニコチン酸アセトン（Ｓ−Ｈｙｎｉｃ）で修飾されたリソソーム酵素への結合のために適した第２の架橋剤は、ＰＥＧ４−ペンタフルオロベンゼン−４−ホルミル安息香酸（ＰＥＧ４−ＰＦＢ）であることができる。異なった態様において、第２の架橋剤は、ホスフィン修飾リソソーム酵素への結合のためにＮＨＳ−ＰＥＧ４−アジドを含んでなることができる。もう一つの態様において、第２の架橋剤は、アセチレン修飾リソソーム酵素への結合のために、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル−ＰＥＧ４−アジド（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−アジド）を含んでなることができる。なおもう一つの態様において、第２の架橋剤は、シクロオクチン修飾リソソーム酵素への結合のために、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル−ＰＥＧ４−アジド（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−アジド）を含んでなることができる。

[0052]組換えヒトリソソーム酵素に結合されたヘテロ二官能性架橋剤で修飾された変異型ＩＧＦ−２ペプチドも提供される。適したヘテロ二官能性架橋剤で修飾された変異型ＩＧＦ−２ペプチドは、変異型ＩＧＦ−２ペプチドに結合したヘテロ二官能性架橋剤から誘導されるとして特徴付けられる。適した組換えヒトリソソーム酵素は、ヒト酸性α−グルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）、ヒト酸性α−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）、ヒト酸性β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ヒト酸性α−イズロニダーゼＡ（ＩｄｕＡ）、ヒト酸性イズロニデート２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）、ヒトβ−ヘキソサミニダーゼＡ（ＨｅｘＡ）、ヒトβ−ヘキソサミニダーゼＢ（ＨｅｘＢ）、ヒト酸性α−マンノシダーゼＡ、ヒトβ−グルコセレブロシダーゼ（ＧｌｃＣｅｒａｓｅ）、ヒト酸性リパーゼ（ＬＰＡ）であることができる。適したヘテロ二官能性架橋剤は、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ及びスルホ−ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（スルホ−ＭＢＳ）、スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）を含む。複合体は、１０パーセントより少ない遊離の非結合ＩＧＦ２ペプチドを伴って、実質的に純粋であることができる。複合体の純度は、サイズ排除クロマトグラフィーからの画分中の、２８０ｎｍにおけるリソソームタンパク質の、及び２１４ｎｍにおける遊離ＩＧＦ２ペプチドの吸光度により、或いはドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を使用する染色されたタンパク質ゲルにより、或いはＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のウェスタンブロッティング及びリソソーム酵素又はＩＧＦ２ペプチドの検出のための特異的抗体により、測定することができる。複合体は、更に０．１パーセントより少ない遊離の非結合ＩＧＦ２ペプチド又は他の汚染物質を伴って、実質的に純粋であることができる。組換えヒトリソソーム酵素は、好適には、高マンノース又は複合型Ｎ−グリカンを有し、酵母由来であることができる。複合型Ｎ−グリカンを有し、酵母由来である、適した組換えヒトリソソーム酵素は、ＩＧＦ２ペプチドへの結合のために直接使用することができる。高マンノース型のＮ−グリカンを有する適した組換えヒトリソソーム酵素は、エンドグリコシダーゼＦ（ＥｎｄｏＦ）又はエンドグリコシダーゼＨ（ＥｎｄｏＨ）を使用して処理して、これらの外来性のＮ−グリカンを、化学的結合の前又は後で除去することもできる。組換えヒトリソソーム酵素は、好適には、昆虫細胞、植物細胞、真菌、遺伝子導入動物及びｉｎ ｖｉｔｒｏの翻訳系を含む他のタンパク質発現系由来であることができる。

[0053]リソソーム蓄積症に罹った対象を治療するための方法は、化学的に修飾された組換えヒトリソソーム酵素に化学的に結合された一つ又はそれより多い変異型ＩＧＦ−２ペプチドの複合体を対象に投与することによって行われる。次の疾病：ポンペ病、ファブリー病、及びゴーシェ病、ＭＰＳ Ｉ、ＭＰＳ ＩＩ、ＭＰＳ ＶＩＩ、テイ・サックス、サンドホフ、α−マンノシドーシス、並びにウォルマンの少なくとも一つを含む各種のリソソーム蓄積症のいずれかは、この方法で治療することができる。

[0054]リソソーム蓄積症に罹った対象を治療するための方法は、組換えヒトリソソーム酵素に結合されたヘテロ二官能性架橋剤で修飾された変異型ＩＧＦ−２ペプチドの複合体を、対象に投与することによって行われる。次の疾病：ポンペ病、ファブリー病、及びゴーシェ病、ＭＰＳ Ｉ、ＭＰＳ ＩＩ、ＭＰＳ ＶＩＩ、テイ・サックス、サンドホフ、α−マンノシドーシス、並びにウォルマンの少なくとも一つを含む、各種のリソソーム蓄積症のいずれかは、この方法で治療することができる。

[0055]ポンペ、ファブリー、ゴーシェ、ＭＰＳ Ｉ、ＭＰＳ ＩＩ、ＭＰＳ ＶＩＩ、テイ・サックス、サンドホフ、α−マンノシドーシス、又はウォルマン病に罹った患者を治療する方法が、組換えリソソーム酵素に化学的に結合された一つ又はそれより多い変異型ＩＧＦ−２ペプチド及び医薬的に受容可能な担体の組成物を、該疾病を治療するために十分な量で、それを必要とする患者に投与することによって更に提供される。適した修飾された組換えヒトリソソーム酵素は、ポンペ病の治療のための酸性α−グルコシダーゼを含む。修飾された組換えヒトリソソーム酵素は、ファブリー病の治療のための酸性α−ガラクトシダーゼＡであることもできる。修飾された組換えヒトリソソーム酵素は、ゴーシェ病の治療のための酸性β−グルコセレブロシダーゼであることができる。修飾された組換えヒトリソソーム酵素は、ムコポリサッカリドーシスＩ（ＭＰＳ Ｉ）の治療のための酸性α−イズロニダーゼであることができる。修飾された組換えヒトリソソーム酵素は、ムコポリサッカリドーシスＩＩ（ＭＰＳ ＩＩ）の治療のための酸性イズロニデート２−スルファターゼであることができる。修飾された組換えヒトリソソーム酵素は、ムコポリサッカリドーシスＶＩＩ（ＭＰＳ ＶＩＩ）の治療のための酸性β−グルクロニダーゼであることもできる。或いは、修飾された組換えヒトリソソーム酵素は、ＧＭ２ガングリオシドーシス（テイ−サックス）の治療のためのβ−ヘキソサミニダーゼＡであることができる。もう一つの適した態様において、修飾された組換えヒトリソソーム酵素は、ＧＭ２ガングリオシドーシス（サンドホフ）の治療のためのβ−ヘキソサミニダーゼＢであることができる。もう一つの態様において、修飾された組換えヒトリソソーム酵素は、ウォルマン病の治療のための酸性リパーゼであることができる。修飾された組換えヒトリソソーム酵素は、α−マンノシドーシスの治療のための酸性α−マンノシダーゼであることもできる。本明細書中に提供される組成物は、組換えリソソーム酵素に化学的に結合した一つ又はそれより多い変異型ＩＧＦ−２ペプチドの、一月当たり、患者のキログラム当たり約０．１から約１０００ミリグラムまでの量で投与することができる。もう一つの適した態様において、組成物は、組換えリソソーム酵素に化学的に結合した一つ又はそれより多い変異型ＩＧＦ−２ペプチドの、一月当たり、患者のキログラム当たり約１から約５００ミリグラムまでの量で投与することができる。

[0056]ポンペ、ファブリー、ゴーシェ、ＭＰＳ Ｉ、ＭＰＳ ＩＩ、ＭＰＳ ＶＩＩ、テイ・サックス、サンドホフ、α−マンノシドーシス、ウォルマン病に罹った患者を治療する方法が、組換えヒトリソソーム酵素に結合されたヘテロ二官能性架橋剤で修飾された変異型ＩＧＦ−２ペプチド及び医薬的に受容可能な担体の組成物を、該疾病を治療するために十分な量で、それを必要とする患者に投与することによって更に提供される。組成物は、組換えヒトリソソーム酵素に結合されたヘテロ二官能性架橋剤で修飾された変異型ＩＧＦ−２ペプチドの、一月当たり５０キログラムの患者当たり約０．１から約１０００ミリグラムまでの量で投与することができる。もう一つの適した態様において、組成物は、組換えヒトリソソーム酵素に結合されたヘテロ二官能性架橋剤で修飾された変異型ＩＧＦ−２ペプチドの、一月当たり５０キログラムの患者当たり約１から約５００ミリグラムまでの量で投与することができる。

[0057]Ｅ．ｃｏｌｉ中の発現のために最適化された変異型ＩＧＦ−２ペプチドをコードする適したＤＮＡ配列は、配列番号：１として提供される。変異型ＩＧＦ−２ペプチドを表す適したアミノ酸配列は、配列番号：２として提供される。伸長リンカーを表す適したアミノ酸配列は、配列番号：３として提供される。この方法中で使用される変異型ＩＧＦ−２ペプチドは、配列番号：２のアミノ酸配列を有することができる。もう一つの態様において、複合体中の変異型ＩＧＦ−２ペプチドは、配列番号：２のアミノ酸配列を有することができる。

実施例及び他の例示的態様
[0058]化学的架橋法を、各種のリソソーム蓄積症（ＬＳＤ）の治療のための新規な、そして優れたＥＲＴを開発するために、変異型ヒトＩＧＦ−２ペプチドをリソソーム酵素に結合させるために使用する。この戦略は、ＩＧＦ−２／ＣＩ−ＭＰＲに対するＩＧＦ−２ペプチド結合ＥＲＴの結合親和性を増加させ、そしてこれらの組換え酵素の細胞取込み及びリソソームへの送達を改善することが期待される。このようにすることによって、これらのＩＧＦ−２ペプチド結合ＥＲＴは、影響された細胞中に蓄積された物質の排除において、より有効であることが期待される。

[0059]ヒトＩＧＦ−２ペプチドの幾つかの異なった変異型は、合成するか又は発現させ（哺乳動物細胞中又は他の生物中で）、精製し、そしてその後リソソーム酵素への結合のためにヘテロ二官能性架橋剤で化学的に修飾することができる。変異型ＩＧＦ−２ペプチドは、以下の修飾：６位におけるグルタミン酸のアルギニンへの置換；アミノ酸１−４及び６の削除；アミノ酸１−４及び６、７の削除；アミノ酸１−４及び６の削除並びに７位におけるトレオニンのリシンへの置換；アミノ酸１−４の削除及び６位におけるグルタミン酸のグリシンへの置換及び７位におけるトレオニンのリシンへの置換；２７位におけるチロシンのロイシンへの置換；４３位におけるバリンのロイシンへの置換；６５位におけるリシンのアルギニンへの置換の一つ又は組合せを含有することができる。これらの修飾の大部分は、インスリン及びＩＧＦ−１受容体並びに血清のＩＧＦ結合性タンパク質（ＩＧＦＢＰ）に対するＩＧＦ−２ペプチドの結合親和性を減少させ、一方、ＩＧＦ−２／ＣＩ−ＭＰＲに対する高い親和性を維持するために設計される。修飾されたＩＧＦ−２ペプチドは、修飾されたＩＧＦ−２ペプチドの迅速な精製のために、親和性標識（例えば、ポリヒスチジン；Ｈｉｓ標識）を含有することもでき、可溶性タンパク質パートナー、親和性標識又は融合タンパク質パートナーの除去のためのプロテアーゼ部位（例えば、強化タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ部位）、ＩＧＦ−２に先行する少なくとも五つのアミノ酸のリンカー伸長領域を有する融合タンパク質として発現することができる。

[0060]変異型ＩＧＦ−２ペプチド及び組換えリソソーム酵素は、二つの主要な戦略によって化学的にカップリングすることができる。（Ａ）ＩＧＦ−２ペプチドをヘテロ二官能性架橋剤で、そして組換えリソソーム酵素を異なったヘテロ二官能性架橋剤で、独立に修飾する（実施例１−３に記載するように）。過剰の非結合架橋剤及び化学的副産物を除去するための精製の後、化学的に修飾されたＩＧＦ−２ペプチド及び化学的に修飾されたリソソーム酵素を、最終化学反応においてその後一緒に結合させて、ＩＧＦ−２ペプチド−リソソーム酵素複合体を形成させ、そして精製し、そして酵素活性を維持するために、酸性のｐＨの緩衝液中で保存する。（Ｂ）ＩＧＦ−２ペプチド及びリソソーム酵素を、単一のヘテロ二官能性架橋剤を使用して化学的に結合させる（実施例４に記載するように）。ＩＧＦ−２ペプチドを、ヘテロ二官能性架橋剤で一つのｐＨ反応条件で化学的に修飾する。次いで化学的に修飾されたリソソーム酵素を加え、そしてｐＨを第２のｐＨ反応条件に調節して、ＩＧＦ−２ペプチドをリソソーム酵素に結合させる。次いで複合体を、過剰の非結合ヘテロ二官能性架橋剤及び化学的副産物を除去するために精製し、そして酵素活性を維持するために、酸性のｐＨの緩衝液中で保存する。

[0061]上記の化学的カップリング法は、リソソーム酵素置換療法のためのタンパク質のターゲティングを改善するために、明確な利益がある。第１に、修飾されたＩＧＦ−２ペプチドの結合は、特異化されたＭ６Ｐ糖鎖構造を必要とせずにＩＧＦ−２／ＣＩ−ＭＰＲに対するリソソーム酵素の結合親和性を増加させる。第２に、リソソーム酵素当たり一つのＩＧＦ−２ペプチドを含有するＩＧＦ−２融合タンパク質とは異なり、この戦略は、ＩＧＦ−２／ＣＩ−ＭＰＲに対する高い親和性のために、リソソーム酵素に多数の修飾されたＩＧＦ−２ペプチドを付加することができる。第３に、この方法は、他の組織（例えば、脳）への薬物のターゲティングを改善するために、混合ペプチド（ＩＧＦ−２ペプチド及び他のペプチド）を結合させるために使用することができる。第４に、この方法は、制約されるものではないが、哺乳動物細胞、酵母、昆虫細胞、植物細胞、遺伝子導入動物（例えば、鶏卵、牛乳、等）を含む、殆どの真核生物発現系から産生される組換えリソソーム酵素を使用することができる。複合型Ｎ−グリカンを含有する（即ち、哺乳動物発現系、複合Ｎ−グリカンをもたらす修飾されたＮ−グリカンプロセシングを伴う酵母、遺伝子導入動物等に由来する）組換えリソソーム酵素を、カップリングのために直接使用することができる。高マンノース型Ｎ−グリカンを保有する（即ち、酵母、Ｌｅｃ１哺乳動物細胞株、等に由来する）酵素は、修飾されたＩＧＦ−２ペプチドへの化学的カップリングの前又は後で脱グリコシル化（ＥｎｄｏＦ又はＥｎｄｏＨのようなエンドグリコシダーゼによる）に供することができる（実施例５に記載するように）。第５に、修飾されたＩＧＦ−２ペプチドは、細菌、酵母又は他の真菌系を含む殆どの発現系中で製造することができ、これは、過程のスケールアップのための対費用効果の高い方法を可能にする。第６に、同一の修飾されたＩＧＦ−２ペプチドを、いずれものリソソーム酵素に結合させ、ＩＧＦ２−リソソーム酵素の個別の融合タンパク質を作成することなく、タンパク質のターゲティングを改善することができる。第７に、この戦略は、潜在的に、薬物必要量を減少させ、注入時間を減少させ、そして免疫原性を減少させることができる新規の、優れたＥＲＴ組成物を作成することができる。

実施例１
[0062]殆どの哺乳動物細胞製造系から誘導される組換えヒト酸性α−グルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）は、主として複合型Ｎ−グリカンを伴う非常に低い量のＭ６Ｐを含有し、これは、ＩＧＦ−２／ＣＩ−ＭＰＲへのｒｈＧＡＡの高い親和性結合のために十分ではない。このＮ−グリカンプロファイルは、血清タンパク質のそれに類似し、そして従って、ｒｈＧＡＡが、血液循環中で好ましい薬物動態学的プロファイル（即ち、遅いクリアランス）を有することを可能にする。従って、ｒｈＧＡＡは、修飾されたＩＧＦ−２ペプチドへの結合のために使用することができ、優れたｒｈＧＡＡのＥＲＴを開発するために、改善されたタンパク質ターゲティング及び細胞取込みのためにＩＧＦ−２／ＣＩ−ＭＰＲに対するその親和性を増加させることができる。具体的には、ｒｈＧＡＡを、８−１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度まで濃縮し、そして第一アミンを欠くｐＨ約７．３の緩衝液（例えば、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．３／１００ｍＭ ＮａＣｌ）中に交換し、そしてその後、１２ないし２０倍モル過剰のヘテロ二官能性架橋剤スクシンイミジル６−ヒドラジノニコチン酸アセトン（Ｓ−Ｈｙｎｉｃ）で、室温で約３０分間で修飾することができる。この反応において、Ｓ−Ｈｙｎｉｃからの化学的に反応性のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）基は、アミノ（Ｎ）末端の第１アミノ酸残基のα−アミノ基及びｒｈＧＡＡ上のリシンのε−アミノ基と反応して、新規な化学的に活性なヒドラジド基をこれらの修飾されたアミノ酸残基に導入する。次いでＳ−Ｈｙｎｉｃで修飾されたｒｈＧＡＡは、過剰の架橋剤及び化学的副産物を除去し、そして酵素活性を保存するために、サイズ排除クロマトグラフィー又は透析により、酸性の緩衝液（例えば、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．８／１００ｍＭ ＮａＣｌ／０．０５％ ポリソルベート−８０）中に急速に交換される。この化学反応は、Ｓ−ＨｙｎｉｃとｒｈＧＡＡの比を理解するために、様々な量のＨｙｎｉｃ（例えば、５−４０倍のモル過剰）で滴定し、これは、ｒｈＧＡＡ上に１−４個の化学的に活性なヒドラジド基を再現性良く得ることができる。次いで最適条件をｒｈＧＡＡのＳ−Ｈｙｎｉｃ修飾反応をスケールアップするために使用する。

[0063]別の反応において、短い伸長リンカー領域を（Ｎ−末端に）含有する［ｄｅｌ（１−４）、Ａｒｇ６、Ｌｅｕ２７、Ａｒｇ６５］ＩＧＦ−２等の変異型ＩＧＦ２ペプチドを、ヘテロ二官能性架橋剤ＰＥＧ４−ペンタフルオロベンゼン−４−ホルミル安息香酸（ＰＥＧ４−ＰＦＢ）を使用して、ｐＨ約７．５で、２−３時間室温で、化学的に修飾する。この反応において、ＰＥＧ４−ＰＦＢは、短い伸長リンカー領域からの第１アミノ酸のグリシンのα−アミノ基を修飾して、アミノ末端に新規な反応性のアルデヒド化学基を導入する。変異型ＩＧＦ−２ペプチドの化学的修飾は、Ｃ４逆相クロマトグラフィーによってモニターして、化学的修飾の進行及び完全性を、図５に示すように評価することができる。次いでＰＥＧ４−ベンズアルデヒド修飾ＩＧＦ−２ペプチドを、ゲル濾過クロマトグラフィー又は透析によって精製して、結合のための適当な緩衝液（例えば、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．８／１００ｍＭ ＮａＣｌ／０．０５％ポリソルベート−８０）中の過剰の架橋剤及び化学的副産物を除去する。次いで最後の反応を行い、Ｓ−Ｈｙｎｉｃ修飾ｒｈＧＡＡを、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．８／１００ｍＭ ＮａＣｌ／０．０５％ ポリソルベート−８０緩衝液中で、２４時間かけて室温で、ＰＥＧ４−ベンズアルデヒド修飾ＩＧＦ−２ペプチドに結合させる。この化学反応（ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）は、Ｓ−Ｈｙｎｉｃ修飾ｒｈＧＡＡからのヒドラジド基を、ＰＥＧ４−ベンズアルデヒド修飾ＩＧＦ２ペプチドからの化学的に活性なアルデヒド基にカップリングして、安定な共有（ヒドラゾン）結合を形成させる。この反応は、カップリングを最適化するために、アニリンの存在下（例えば、１０ｍＭ）で、様々な量のＰＥＧ４−ベンズアルデヒド修飾ＩＧＦ−２ペプチド（例えば、１−１０倍のモル過剰）で行うことができる。次いでＩＧＦ−２ペプチド結合ｒｈＧＡＡを、サイズ排除クロマトグラフィー、又は５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２／１００ｍＭ ＮａＣｌ／０．０５％ポリソルベート−８０に対する透析によって、精製して、過剰のＰＥＧ４−ベンズアルデヒド修飾ＩＧＦ−２ペプチドを除去し、そして変異型ＩＧＦ２ペプチド結合ｒｈＧＡＡ（ｖＩＧＦ２−ｒｈＧＡＡ）を、４℃の同じ緩衝液中で、或いは−２０℃又は−７０℃で冷凍して保存する。

実施例２
[0064]哺乳動物製造系から誘導された組換えヒト酸性αグルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）を、変異型ＩＧＦ−２ペプチドに結合するために使用し、優れたｒｈＧＡＡのＥＲＴを開発するために、改善されたタンパク質ターゲティング及び細胞取込みのためにＩＧＦ−２／ＣＩ−ＭＰＲに対する親和性を増加させる。具体的には、シュタウジンガーライゲーション（アジド−ホスフィン）反応化学を使用して、改善された薬物ターゲティングのためのＩＧＦ２ペプチド−ｒｈＧＡＡ複合体を産生するために、ＩＧＦ２ペプチドをｒｈＧＡＡにカップリングする。この実施例において、ｒｈＧＡＡ（５−１０ｍｇ／ｍｌにおいて）を、第一アミンを欠くｐＨ約７．３の緩衝液（例えば、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．３）／１００ｍＭ ＮａＣｌ）中に交換し、そしてその後、１０ないし２０倍モル過剰のヘテロ二官能性架橋剤スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル−ホスフィン（スルホ−ＮＨＳ−ホスフィン）で、約３０分間室温で修飾する。この化学反応において、スルホ−ＮＨＳ−ホスフィンからの化学的に反応性のＮＨＳ基は、ｒｈＧＡＡ上のＮ−末端の第１アミノ酸残基のα−アミノ基及びリシンのε−アミノ基と反応して、新規な化学的に活性なホスフィン基を、これらの修飾されたアミノ酸残基に導入する。次いでホスフィン含有ｒｈＧＡＡを、僅かに酸性の緩衝液（例えば、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５／１００ｍＭ ＮａＣｌ）中に、サイズ排除クロマトグラフィー又は透析により急速に交換して、過剰の架橋剤及び化学的副産物を除去し、そして酵素活性を保存する。この化学反応は、スルホ−ＮＨＳ−ホスフィンのｒｈＧＡＡに対する比を理解するために、様々な量のスルホ−ＮＨＳ−ホスフィン（例えば、５−４０倍モル過剰）で滴定することができ、これは、ｒｈＧＡＡ上の１−４個の化学的に活性なホスフィン基を再現性良く得る。最適な条件は、ｒｈＧＡＡのスルホ−ＮＨＳ−ホスフィン修飾反応をスケールアップするために使用することができる。

[0065]別の反応において、短い伸長リンカー領域を（Ｎ−末端において）含有する［ｄｅｌ（１−４）、Ａｒｇ６、Ｌｅｕ２７、Ａｒｇ６５］ＩＧＦ−２等の変異型ＩＧＦ−２ペプチドを、３０倍モル過剰のヘテロ二官能性架橋剤Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル−ＰＥＧ４−アジド（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−アジド）を使用して、第一アミンを欠くｐＨ約７．５の緩衝液（例えば、５０ｍＭリン酸ナトリウム／５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中で１−３時間室温で化学的に修飾する。この反応において、ＮＨＳ−ＰＥＧ４−アジドの反応性ＮＨＳ基は、短い伸長リンカー領域からのグリシンのα−アミノ基と反応して、Ｎ−末端に新規なアジド化学基を導入する。変異型ＩＧＦ２ペプチドの化学的修飾は、Ｃ４逆相クロマトグラフィーによってモニターして、化学的修飾の進行及び完全性を評価することができる。次いでＰＥＧ４−アジド修飾ＩＧＦ−２ペプチドを、Ｃ４逆相クロマトグラフィーによって精製し、そして修飾されたペプチドを、凍結乾燥して、溶媒を除去し、そして乾燥粉末として保存する。

[0066]次いで最後の反応を行い、ホスフィン修飾ｒｈＧＡＡ（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５／１００ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液中の）を、冷凍乾燥したＰＥＧ４−アジド修飾ＩＧＦ−２ペプチドに、５部のＩＧＦ２ペプチドに対して１部のｒｈＧＡＡのモル比で直接加え、室温で２４時間にわたりインキュベーションすることによって、ホスフィン修飾ｒｈＧＡＡをＰＥＧ４−アジド修飾ＩＧＦ−２ペプチドに結合させる。この化学反応は、アジド修飾ＩＧＦ−２ペプチドからのアジド化学基を、ホスフィン修飾ｒｈＧＡＡにカップリングして、安定な共有（アミド）結合を形成させる。次いで変異型ＩＧＦ−２ペプチド結合ｒｈＧＡＡ（ｖＩＧＦ２−ｒｈＧＡＡ）を、サイズ排除クロマトグラフィー又は透析によって精製して、過剰のＰＥＧ４−アジド修飾ＩＧＦ−２ペプチドを除去し、そして僅かに酸性のｐＨの緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５／１００ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液）中で４℃で保存する。

実施例３
[0067]哺乳動物製造系から誘導された組換えヒト酸性イズロニデート２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）を、変異型ＩＧＦ−２ペプチドへの結合のために使用し、優れたＩ２ＳのＥＲＴを開発するために、改善されたタンパク質ターゲティング及び細胞取込みのために、ＩＧＦ−２／ＣＩ−ＭＰＲに対する酵素親和性を増加させる。具体的には、シュタウジンガーライゲーション（アジド−ホスフィン）反応化学を使用して、改善された薬物ターゲティングのためのＩＧＦ−２ペプチド−Ｉ２Ｓ複合体を産生するために、変異型ＩＧＦ２ペプチドをＩ２Ｓにカップリングする。この実施例において、Ｉ２Ｓ（概略３ｍｇ／ｍｌにおいて）を、２０倍モル過剰のヘテロ二官能性架橋剤スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル−ホスフィン（スルホ−ＮＨＳ−ホスフィン）で、第一アミンを欠くｐＨ約７．３の緩衝液（例えば、５０ｍＭリン酸ナトリウム／１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．３）中で、約３０分間室温で修飾する。この化学反応において、スルホ−ＮＨＳ−ホスフィンからの化学的に反応性のＮＨＳ基は、Ｉ２Ｓ上のＮ−末端における第１アミノ酸残基のα−アミノ基及びリシンのε−アミノ基と反応して、新規な化学的に活性なホスフィン基をこれらの修飾されたアミノ酸残基に導入する。次いでホスフィン含有Ｉ２Ｓは、サイズ排除クロマトグラフィー又は透析により、僅かに酸性の緩衝液（例えば、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５／１００ｍＭ ＮａＣｌ）中に急速に交換されて、過剰の架橋剤及び化学的副産物を除去し、そして酵素活性を保存する。この化学反応は、Ｉ２Ｓに対するスルホ−ＮＨＳ−ホスフィンの比を理解するために、様々な量のスルホ−ＮＨＳ−ホスフィン（例えば、５−４０倍のモル過剰）で滴定することができ、これは、Ｉ２Ｓ上に１−４個の化学的に活性なホスフィン基を再現性良く得る。最適な条件は、Ｉ２Ｓのスルホ−ＮＨＳ−ホスフィン修飾反応をスケールアップするために使用することができる。

[0068]別の反応において、短い伸長リンカー領域（Ｎ−末端において）を含有する［ｄｅｌ（１−４）、Ａｒｇ６、Ｌｅｕ２７、Ａｒｇ６５］ＩＧＦ−２等の変異型ＩＧＦ−２ペプチドを、３０倍モル過剰のヘテロ二官能性架橋剤Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル−ＰＥＧ４−アジド（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−アジド）を使用して、第一アミンを欠くｐＨ約７．５の緩衝液（例えば、５０ｍＭリン酸ナトリウム／５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中で、１−３時間室温で化学的に修飾する。この反応において、ＮＨＳ−ＰＥＧ４−アジドの反応性ＮＨＳ基は、短い伸長リンカー領域からのグリシンのα−アミノ基と反応して、新規なアジド化学基をＮ−末端に導入する。変異型ＩＧＦ２ペプチドの化学的修飾は、Ｃ４逆相クロマトグラフィーによってモニターして、化学的修飾の進行及び完全性を評価することができる。次いでＰＥＧ４−アジド修飾ＩＧＦ−２ペプチドを、Ｃ４逆相クロマトグラフィーによって精製し、そしてペプチドを凍結乾燥し、そして乾燥粉末として保存する。

[0069]次いで最終反応を行い、ホスフィン修飾Ｉ２Ｓ（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５／１００ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液中の）を、冷凍乾燥したＰＥＧ４−アジド修飾ＩＧＦ−２ペプチドに、５部のＩＧＦ２ペプチドに対して１部のＩ２Ｓのモル比で直接加え、室温で２４時間にわたりインキュベーションすることによって、ホスフィン修飾Ｉ２ＳをＰＥＧ４−アジド修飾ＩＧＦ−２ペプチドに結合させる。この化学反応は、アジド修飾ＩＧＦ−２ペプチドからの反応性アジド化学基を、ホスフィン修飾Ｉ２Ｓにカップリングして、安定な共有（アミド）結合を形成させる。次いで変異型ＩＧＦ−２ペプチド結合Ｉ２Ｓ（ｖＩＧＦ２−Ｉ２Ｓ）を、サイズ排除クロマトグラフィー又は透析によって精製して、過剰のＰＥＧ４−アジド修飾ＩＧＦ−２ペプチドを除去し、そして僅かに酸性のｐＨの緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５／１００ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液）中で４℃で保存する。

実施例４
[0070]哺乳動物製造系から誘導された組換えヒト酸性α−グルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）を、修飾ＩＧＦ−２ペプチドへの結合のために使用して、優れたｒｈＧＡＡのＥＲＴを開発するために、改善されたタンパク質ターゲティング及び細胞取込みのために、ＩＧＦ−２／ＣＩ−ＭＰＲに対する親和性を増加させる。この実施例において、Ｎ−末端にシステイン残基を伴う短い伸長リンカー領域を含有する［ｄｅｌ（１−４）、Ａｒｇ６、Ｌｅｕ２７、Ａｒｇ６５］ＩＧＦ−２等の変異型ＩＧＦ−２ペプチドを、ヘテロ二官能性架橋剤ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）で、ｐＨ約６で、３０−６０分間室温で修飾する。この反応において、ＭＢＳからの化学的に反応性のマレイミド基は、Ｎ−末端システインからの遊離のスルフヒドリル基と反応し、一方、ｒｈＧＡＡにカップリングするためにＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル反応性基を保存する。ＭＢＳ修飾ＩＧＦ−２ペプチドを、ゲル濾過クロマトグラフィー又は透析によって急速に精製して、過剰のＭＢＳを除去する。次いでｒｈＧＡＡを、ＭＢＳ修飾ＩＧＦ−２ペプチドへのカップリングのために、ｐＨ７．３のアミン非含有緩衝液中で３０分間室温で加える。この化学反応において、化学的に反応性のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基（ＭＢＳ修飾ＩＧＦ−２ペプチドから）は、ｒｈＧＡＡ上のＮ−末端の第１アミノ酸残基のα−アミノ基及びリシンのε−アミノ基と反応して、安定な共有結合を形成する。この反応を、様々な量のＭＢＳ修飾ＩＧＦ−２ペプチド（例えば、１−２０倍のモル過剰）を使用して滴定し、ｒｈＧＡＡ上に１−４個のＩＧＦ−２ペプチドをカップリングさせるための、ＭＢＳ修飾ＩＧＦ−２ペプチドのモル過剰を決定する。次いで最適なカップリング条件を、この方法をスケールアップするために使用する。ＩＧＦ−２結合ｒｈＧＡＡを、ゲル濾過クロマトグラフィー又は透析によって精製して、過剰のＩＧＦ−２ペプチドを除去し、そして酸性のｐＨの緩衝液（０．１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．５緩衝液）中で保存する。

実施例５
[0071]高マンノース型Ｎ−グリカン構造を伴うｒｈＧＡＡのような組換えヒトリソソーム酵素（酵母、ＧＮＴ−１欠失Ｌｅｃ１哺乳動物細胞、等に由来する）を変異型ＩＧＦ−２ペプチドへの結合のために使用して、優れたｒｈＧＡＡのＥＲＴを開発するために、改善されたタンパク質ターゲティング及び細胞取込みのために、ＩＧＦ−２／ＣＩ−ＭＰＲに対する親和性を増加させることができる。この実施例において、ｒｈＧＡＡ（８−１０ｍｇ／ｍｌにおいて）を、第一アミンを欠くｐＨ約７．３の緩衝液（例えば、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．３）／１００ｍＭ ＮａＣｌ）中に交換し、そしてその後、Ｎ−スクシンイミジル６−ヒドラジノニコチン酸アセトン（Ｓ−Ｈｙｎｉｃ）のようなヘテロ二官能性架橋剤で、第一アミンを欠くｐＨ約７．３の緩衝液（例えば、５０ｍＭリン酸ナトリウム／０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．３）中で、３０分間室温で修飾する。次いでヒドラジド修飾ｒｈＧＡＡを、酸性の緩衝液（例えば、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．８／１００ｍＭ ＮａＣｌ／０．０５％ポリソルベート−８０）中に、サイズ排除クロマトグラフィー又は透析により急速に交換して、過剰の架橋剤及び化学的副産物を除去し、そして酵素活性を保存する。

[0072]別の反応において、短い伸長リンカー領域（Ｎ−末端において）を含有する［ｄｅｌ（１−４）、Ａｒｇ６、Ｌｅｕ２７、Ａｒｇ６５］ＩＧＦ−２等の変異型ＩＧＦ−２ペプチドを、３０倍のモル過剰のヘテロ二官能性架橋剤ＰＥＧ４−ペンタフルオロベンゼン−４−ホルミル安息香酸（ＰＥＧ４−ＰＦＢ）を使用して、第一アミンを欠くｐＨ約７．５の緩衝液（例えば、５０ｍＭリン酸ナトリウム／５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中で、１−３時間室温で化学的に修飾する。この反応において、ＰＥＧ４−ＰＦＢは、短い伸長リンカー領域からのグリシンのα−アミノ基を修飾して、新規なアルデヒド化学基をＮ−末端に導入する。変異型ＩＧＦ２ペプチドの化学的修飾は、Ｃ４逆相クロマトグラフィーによってモニターして、化学的修飾の進行及び完全性を評価することができる。次いでＰＥＧ４−ベンズアルデヒド修飾ＩＧＦ−２ペプチドを、ゲル濾過クロマトグラフィー又は透析によって精製して、結合のための適当な緩衝液（例えば、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．８／１００ｍＭ ＮａＣｌ／０．０５％ポリソルベート−８０）中で、過剰の架橋剤及び化学的副産物を除去する。

[0073]次いで最終反応を行い、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．８／１００ｍＭ ＮａＣｌ／０．０５％ポリソルベート−８０緩衝液中で室温で２４時間にわたり、Ｓ−Ｈｙｎｉｃ修飾ｒｈＧＡＡをＰＥＧ４−ベンズアルデヒド修飾ＩＧＦ−２ペプチドに結合させる。この化学反応は、Ｓ−Ｈｙｎｉｃ修飾ｒｈＧＡＡからのヒドラジド基を、ＰＥＧ４−ベンズアルデヒド修飾ＩＧＦ−２ペプチドからの化学的に活性なアルデヒド基にカップリングして、安定な共有（ヒドラゾン）結合を形成させる。この反応は、アニリンの存在下（例えば、１０ｍＭ）で、様々な量のＰＥＧ４−ベンズアルデヒド修飾ＩＧＦ−２ペプチド（例えば、１−１０倍のモル過剰）で行い、カップリングを最適化することができる。次いで変異型ＩＧＦ−２ペプチド結合ｒｈＧＡＡ（ｖＩＧＦ２−ｒｈＧＡＡ）を、サイズ排除クロマトグラフィー又は透析で精製して、酸性のｐＨの緩衝液（５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．８／１００ｍＭ ＮａＣｌ／０．０５％ポリソルベート−８０）中で過剰のＰＥＧ４−アジド修飾ＩＧＦ−２ペプチドを除去する。

[0074]ｒｈＧＡＡ上の高マンノース型Ｎ−グリカンは、これらの糖鎖が、タンパク質がマクロファージ及び脾臓のマンノース受容体により血液循環から急速に排除されることを引き起こすと信じられているために、問題がある。然しながら、高マンノース型Ｎ−グリカンは、天然の下（即ち、触媒活性を保存する非変性条件）でエンドグリコシダーゼＦ（ＥｎｄｏＦ）又はエンドグリコシダーゼＨ（ＥｎｄｏＨ）を、酸性のｐＨの緩衝液（例えば、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．８／１００ｍＭ ＮａＣｌ／０．０５％ ポリソルベート−８０）中で室温で使用して、ｒｈＧＡＡから除去することができる。ｒｈＧＡＡは、Ｎ−グリカンの除去後、可溶性のままであり、そして完全に活性であることを、実験的に示している（データは示さない）。ｒｈＧＡＡの脱グリコシル化は、酵素がＳ−Ｈｙｎｉｃで修飾され、そして（過剰の架橋剤を除去するためのサイズ排除クロマトグラフィー又は透析により）精製された後に行うことができる。この戦略は、１−５日かけてＥｎｄｏＦ又はＥｎｄｏＨを使用して、酵素活性に影響することなく、ｒｈＧＡＡの脱グリコシル化を完結させることを可能にする。次いで脱グリコシルされたヒドラジド修飾ｒｈＧＡＡを、ＰＥＧ４−ベンズアルデヒド修飾ＩＧＦ−２ペプチドに結合させる。或いは、ｒｈＧＡＡの脱グリコシル化は、ＰＥＧ４−ベンズアルデヒド修飾ＩＧＦ−２ペプチドのヒドラジド修飾ｒｈＧＡＡへの結合の間に、高濃度のＥｎｄｏＦ又はＥｎｄｏＨを使用して、同時に行うことができる。次いで脱グリコシルされたＩＧＦ−２結合ｒｈＧＡＡを、ゲル濾過クロマトグラフィー又は透析によって精製して、過剰のホスフィン修飾ＩＧＦ−２ペプチドを除去し、そして酸性のｐＨの緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２／１００ｍＭ ＮａＣｌ／０．０５％ポリソルベート−８０）中で保存する。酵母由来のｒｈＧＡＡからの高マンノースＮ−グリカンを除去するための理想的な方法は、ｒｈＧＡＡのタンパク質精製に先立って、ｉｎ ｖｉｖｏの脱グリコシル化のためにＥｎｄｏＨをリソソーム酵素と同時発現させることである。これは、直接修飾され、そしていずれもの更なる加工を行うことなく変異型ターゲティングペプチドにカップリングすることができる、脱グリコシルされたｒｈＧＡＡを産生する。

[0075]上記の戦略は、アレルギー反応を予防し、そして急速なタンパク質の排除を予防するためにｒｈＧＡＡからの好ましくないＮ−グリカンの除去を可能にし、一方ＩＧＦ−２ペプチド結合リソソーム酵素の改善されたタンパク質ターゲティング及び細胞取込みのために、ＩＧＦ−２／ＣＩ−ＭＰＲに対する結合親和性を有意に改善する。重要なことには、この戦略は、非哺乳動物系から産生されたリソソーム酵素を使用することができ、そして優れたＥＲＴの開発のためのはるかに対費用効果の高い方法を表す。

[0076]上記の実施例は、修飾されたＩＧＦ−２ペプチドの化学的結合によるＩＧＦ−２／ＣＩ−ＭＰＲに対する異なったリソソーム酵素の親和性を増加させるために設計される。この戦略は、ＬＳＤに対する優れた治療を開発するために、現時点及び将来のＥＲＴのためのタンパク質ターゲティングを改善する。

実施例６
[0077]ＩＧＦ−２／ＣＩ−ＭＰＲ受容体結合アッセイを、リソソーム酵素ｒｈＧＡＡ及びＩ２Ｓに対する受容体親和性に対するＩＧＦ−２ペプチドの化学結合の影響を評価するために使用した。このアッセイは、未結合のリソソーム酵素が処理中に洗い流されるため、ＩＧＦ−２／ＣＩ−ＭＰＲに対する高い結合親和性を伴うリソソーム酵素を、低ないし中程度の結合を伴うものと区別するために設計される。更に、リソソーム酵素の様々なタンパク質濃度が結合を評価するために使用されるために、このアッセイは、それぞれのリソソーム酵素調製物に対する結合親和性を推定するために使用することができる結合性受容体のために必要なタンパク質濃度を決定することができる。具体的には、非修飾リソソーム酵素及びＩＧＦ２ペプチド結合リソソーム酵素を、４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．７）／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／１０ｍＭ ＥＤＴＡ中に段階希釈し、そして次いでＩＧＦ２／ＣＩ−ＭＰＲ受容体で被覆された９６ウェルのＥＬＩＳＡプレート（ウェル当たり５０μｌのリン酸緩衝生理食塩水中の６μｇ／ｍｌの受容体；次いでリン酸緩衝生理食塩水中の２％ＢＳＡでブロッキング）中で、１時間３０℃でインキュベートした。その後、プレートを、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有する同じ緩衝液で３回洗浄して、未結合のタンパク質を除去した。次いで結合したリソソーム酵素を、酵素活性によって、アッセイ緩衝液（５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．８／２％ ＢＳＡ／０．０２％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）中の適当な蛍光発生基質（例えば、ｒｈＧＡＡに対して、４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−グルコピラノシド（４−ＭＵ−α−Ｇｌｃ））を使用して、３７℃で１時間測定した。次いで試料を新しい９６ウェルプレートに移し、０．１Ｍ ＮａＯＨを加えて、溶液のｐＨを概略１０．５に上げ、そしてプレートを、適当な励起及び放射波長（即ち、４−ＭＵに対して３７０ｎｍ励起及び４６０ｎｍ放射）で蛍光プレートリーダーで読取った。本発明者等の結果は、図６Ａに示すように、試験された全てのタンパク質濃度において、非結合のｒｈＧＡＡよりはるかに高い量の結合した酵素活性がｖＩＧＦ−２ｒｈＧＡＡについて観察されたことを示す。ｖＩＧＦ２−ｒｈＧＡＡのＩＧＦ２／ＣＩ−ＭＰＲプレートに対する結合は、遊離のＷＴヒトＩＧＦ２ペプチドの包含によって有意に減少し、この結合がＩＧＦ２ペプチドに依存性であったことを示した。はるかに高い量の遊離のＷＴヒトＩＧＦ２ペプチドが、ＩＧＦ２／ＣＩ−ＭＰＲに対するｖＩＧＦ２−ｒｈＧＡＡの完全な遮断のために必要である可能性がある。Ｉ２Ｓに対するＩＧＦ２ペプチドの化学的結合も、ＩＧＦ２／ＣＩ−ＭＰＲに対するこの酵素の結合親和性を実質的に増加させることが示された（図７Ａ）。更に、同様な量の結合したＩ２Ｓ活性が、ＩＧＦ２ペプチド結合Ｉ２Ｓ（ｖＩＧＦ２−Ｉ２Ｓ）に対して１及び３μｇ／ｍｌで観察され、これは、受容体結合が飽和したことを示す。

[0078]これらのデータは全体として、変異型ＩＧＦ２ペプチド結合アプローチの幾つかの重要な特徴を明らかにした。（１）変異型ＩＧＦ２ペプチドのタンパク質構造は、ＩＧＦ２／ＣＩ−ＭＰＲ受容体に対する高親和性結合のために適当である。この機能的評価は、本発明者等のＣ４逆相クロマトグラフィーのデータと一致し、これは、図５に示すように、野生型及び変異型ＩＧＦ２ペプチドが殆ど同一の条件で結合及び溶出することを示す。これらの二つのＩＧＦ２ペプチドの“フィンガープリント”は、Ｃ４逆相クロマトグラフィーにおいて実質的に区別不能であるため、これらは、これらのタンパク質高次構造において非常に類似であるはずである。（２）変異型ＩＧＦ２ペプチドの化学的結合は、ｒｈＧＡＡ又はＩ２Ｓのいずれかに対する酵素活性に影響しなかった（データは示さない）。リソソーム酵素へのペプチドの化学的カップリングのための伸長リンカー領域の使用は、酵素活性を維持しながら、ＩＧＦ２ペプチド結合のために十分である鎖（tether）を提供する可能性がある。（３）結合された変異型ＩＧＦ２ペプチドは安定であり、そしてリソソーム酵素活性を維持するために必要な酸性緩衝液中で適当なタンパク質構造を維持する。

[0079]従って、データは全体として、リソソーム酵素（例えば、ｒｈＧＡＡ及びＩ２Ｓ）へのＩＧＦ２ペプチドの化学的結合が、実際にＩＧＦ２／ＣＩ−ＭＰＲ受容体に対するこれらの結合親和性を有意に増加させることができることを示す。このアプローチは、ＩＧＦ２／ＣＩ−ＭＰＲに対するこれらの結合親和性を改善するために、いずれものリソソームタンパク質及び他の非リソソームタンパク質への変異型ＩＧＦ２ペプチドの化学的結合に対して、理論的には幅広く適用可能である筈である。

実施例７
[0080]外因性リソソーム酵素の細胞取込みに対するＩＧＦ２ペプチドの機能的影響を評価するために、ＩＧＦ２結合ｒｈＧＡＡ（ｖＩＧＦ２−ｒｈＧＡＡ）の内部移行を、Ｌ６ラットの骨格筋筋芽細胞中で評価した。簡単には、Ｌ６筋芽細胞を、Ｔ−７５フラスコ中でコンフルエンスまで、１０％の胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を含有するＤＭＥＭ培地中で、３７℃、５％ＣＯ_２の環境で増やした。細胞をトリプシン／ＥＤＴＡにより回収し、そして６ウェルの組織培養プレートにウェル当たり３×１０^５細胞の細胞密度で播き、そしてＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ培地中でインキュベートした。リソソーム酵素の添加の２時間前に、使用済ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ培地を２．５ｍｌの取込み培地（Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２／１０％ＦＢＳ／２ｍＭ ＰＩＰＥＳ、ｐＨ６．７）で置換した。非結合ｒｈＧＡＡ及びｖＩＧＦ２−ｒｈＧＡＡを、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５／１００ｍＭ ＮａＣｌ／０．０５％ポリソルベート−８０で０．５ｍｇ／ｍｌに希釈し、そして０．２μｍのスピンフィルターデバイス（Ｃｏｓｔａｒ）を通して滅菌した。非結合ｒｈＧＡＡを、１０−２００ｎＭの最終タンパク質濃度で個々のウェルに加え、一方、ｖＩＧＦ２−ｒｈＧＡＡは２−２５ｎＭで加えた。全てのウェルが同じ体積及び正しいタンパク質濃度を有することを確実にするために、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５／１００ｍＭ ＮａＣｌ／０．０５％ポリソルベート−８０緩衝液を、酵素及び緩衝液の全体積がそれぞれの試料について０．２ｍｌであるように加えた。図６Ｂに示すように、ｖＩＧＦ２−ｒｈＧＡＡの内部移行は、試験された全てのタンパク質濃度において非結合ｒｈＧＡＡより有意に良好であった。これらの結果は、ｖＩＧＦ２−ｒｈＧＡＡについて幾つかの重要な側面を明らかにした：（１）変異型ＩＧＦ２ペプチドのタンパク質構造は、細胞表面のＩＧＦ２／ＣＩ−ＭＰＲ受容体に対する高親和性結合のために十分である；（２）ｖＩＧＦ２−ｒｈＧＡＡは、細胞内小器官がこのプロトコルで単離されたため、Ｌ６筋芽細胞中に効率よく内部移行され、そしてリソソームに送達された；（３）変異型ＩＧＦ２ペプチドは、ｖＩＧＦ２−ｒｈＧＡＡが、培地中のＩＧＢＰに結合されるよりむしろＬ６筋芽細胞中に内部移行されたことから、予想されたように血清ＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）に対する低い結合親和性を有する；（４）変異型ＩＧＦ２ペプチドの化学的カップリングは、ｒｈＧＡＡ酵素活性を変更しなかった。

[0081]これらの結果は、ｒｈＧＡＡへの変異型ＩＧＦ２ペプチドの化学的カップリングが、ＩＧＦ２／ＣＩ−ＭＰＲに対するその結合親和性を有意に改善することができ、これは、標的細胞中のリソソーム酵素の実質的に改善された細胞取込みに直接翻訳されることを明確に示す。これらのデータは、ｖＩＧＦ２−ｒｈＧＡＡが、ポンペ病の治療のための優れたＥＲＴであることを示唆する。

実施例８
[0082]多数のＩＧＦ２ペプチドが、リソソーム酵素に化学的に結合されるか否かを決定するために、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドタンパク質ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を使用して、タンパク質をそのサイズに基づき分離し、そしてゲルを、その後、タンパク質バンドの可視化のために、改良クマシーブルー染色で染色した。図７Ｂに示すように、組換え野生型ヒトイズロニデート２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）の分子量は、変異型ＩＧＦ２ペプチドの化学的結合後、約８０ｋＤａから概略１２０ｋＤａに有意に増加した。これらのデータは、変異型ＩＧＦ２ペプチドの分子量がわずか概略８ｋＤａであることから、多数の変異型ＩＧＦ２ペプチドがＩ２Ｓにカップリングした筈であることを明確に示す。染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、様々な量の付加された変異型ＩＧＦ２ペプチドを伴うｖＩＧＦ２−Ｉ２Ｓ種の分布が存在し、Ｉ２Ｓの分子当たり平均で５個の付加されたペプチドを伴うことを示す（ゲル上の概略１２０ｋＤａの分子量を得るための約４０ｋＤａの増加に相当する）。重要なことには、これらのデータは、多数の異なったペプチドを同じリソソーム酵素にカップリングするためのこの方法の潜在性も強調する。例えば、変異型ＩＧＦ２ペプチド及び他のターゲティングペプチド（例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）を通って輸送されることが知られているペプチド）を、内臓組織（ＩＧＦ２ペプチドにより）並びに脳及び中枢神経系（ＢＢＢ透過性ペプチドにより）へのリソソーム酵素のターゲティングのために、同じリソソーム酵素に化学的にカップリングすることができる。従ってこの方法は、現時点のＥＲＴの主要な制約を克服するための潜在性を有する。

実施例９
[0083]配列番号：１は、Ｎ−末端伸長リンカー領域及びＴＥＶプロテアーゼ認識部位を伴う、８ＸＨｉｓ−標識された［（ｄｅｌ１−４）−Ａｒｇ６−Ｌｅｕ２７−Ａｒｇ６５］ＩＧＦ−２ペプチドに対するｃＤＮＡ配列を表す（Ｅ．ｃｏｌｉ中の発現のために最適化）。
配列番号：１：
ａｔｇｇｇｃａｇｃｃａｃｃａｃｃａｃｃａｔｃａｔｃａｃｃａｃｃａｃａｃｔａｇｔｇｃｃｇｇｃｇａｇａａｔｃｔｇｔａｃｔｔｔｃａｇｇｇｃｇｇｔｇｇｔｇｇｔａｇｃｇｇｃｇｇｔｇｇｔｇｇｔａｇｃｃｇｔａｃｃｃｔｇｔｇｔｇｇｔｇｇｃｇａａｔｔｇｇｔｔｇａｔａｃｇｃｔｇｃａａｔｔｃｇｔｃｔｇｔｇｇｔｇａｃｃｇｃｇｇｔｔｔｃｃｔｇｔｔｃｔｃｔｃｇｔｃｃｇｇｃｇｔｃｃｃｇｃｇｔｇａｇｃｃｇｔｃｇｃａｇｃｃｇｔｇｇｔａｔｃｇｔｔｇａａｇａｇｔｇｃｔｇｔｔｔｔｃｇｔａｇｃｔｇｃｇａｃｃｔｇｇｃｔｃｔｇｃｔｇｇａａａｃｃｔａｔｔｇｃｇｃｇａｃｃｃｃｇｇｃａｃｇｔａｇｃｇａｇｔｇａ
[0084]配列番号：２は、伸長配列を伴う変異型ＩＧＦ２ペプチドに対するアミノ酸配列を表す。
配列番号：２：
ＮＨ２−ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＲＴＬＣＧＧＥＬＶＤＴＬＱＦＶＣＧＤＲＧＦＬＦＳＲＰＡＳＲＶＳＲＲＳＲＧＩＶＥＥＣＣＦＲＳＣＤＬＡＬＬＥＴＹＣＡＴＰＡＲＳＥ−ＣＯＯＨ
[0085]配列番号：２は、ＴＥＶプロテアーゼによるＮ−末端の８ＸＨｉｓ標識の除去後の変異型ＩＧＦ２ペプチドに対応する。この変異型ＩＧＦ２ペプチドは、Ｎ−末端のセリン残基が、ＷＴ ＩＧＦ２の残基５に対応するように、残基１−４を欠く。６位においてグルタミン酸を置換するアルギニンは、血清ＩＧＦ結合性タンパク質（ＩＧＦＢＰ）に対するＩＧＦ２ペプチドの結合親和性を実質的に低下させることが知られている。２７位におけるロイシンへのチロシンの置換は、インスリン及びＩＧＦ１受容体に対するＩＧＦ２ペプチドの結合親和性を実質的に低下させることが知られている。６５位におけるアルギニンへのリシンの保存的置換は、リソソーム酵素への結合のためのＮ−末端の伸長リンカー領域のみの化学的修飾を可能にするために使用された。Ｎ−末端の伸長領域は、配列番号：３によって表される。

配列番号：３：
ＧＧＧＧＳＧＧＧ
配列番号：３のＮ−末端のグリシン残基は、リソソーム酵素へのカップリングのための化学的修飾のために使用される。

Claims (26)

1. 組換えリソソーム酵素に結合したターゲティングペプチドを製造する方法であって：
   第１の架橋剤で修飾された組換えヒトリソソーム酵素を、一つ又はそれより多い第２の架橋剤で修飾された変異型ＩＧＦ−２ペプチドに結合させること；
   を含んでなり、ここで
   第１の架橋剤で修飾された組換えリソソーム酵素は、第１の架橋剤で化学的に修飾されたＮ−末端及び一つ又はそれより多い第１の架橋剤で修飾されたリシン残基を有するとして特徴付けられる組換えリソソーム酵素を含んでなり；そして
   一つ又はそれより多い第２の架橋剤で修飾された変異型ＩＧＦ−２ペプチドは、アミノ（Ｎ）末端の、５ないし２０個のアミノ酸残基を含んでなる短い伸長リンカー内の第２の架橋剤で修飾されたアミノ酸を含んでなる一つ又はそれより多い変異型ＩＧＦ−２ペプチドを含んでなり、
   変異型ＩＧＦ−２ペプチドは、野生型ヒトＩＧＦ−２ペプチドに対し、
   少なくとも以下の修飾：
   １−４位のアミノ酸の削除、６位におけるグルタミン酸のアルギニンへの置換、２７位におけるチロシンのロイシンへの置換、及び６５位におけるリシンのアルギニンへの置換；
   を含み、かつ
   任意選択的に以下の修飾：
   ７位のアミノ酸の削除；又は７位におけるトレオニンのリシンへの置換；
   を含む、前記方法。
2. 前記組換えヒトリソソーム酵素が、ヒト酸性α−グルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）である、請求項１に記載の方法。
3. 二つのリシン残基が、前記組換えヒトリソソーム酵素上で修飾される、請求項１に記載の方法。
4. 前記第１の架橋剤が、Ｎ−スクシンイミジル６−ヒドラジノニコチン酸アセトン（Ｓ−Ｈｙｎｉｃ）を含んでなる、請求項１に記載の方法。
5. 前記第２の架橋剤が、ＰＥＧ４−ペンタフルオロベンゼン−４−ホルミル安息香酸（ＰＥＧ４−ＰＦＢ）を含んでなる、請求項１に記載の方法。
6. 組換えヒトリソソーム酵素上のＮ−末端及び一つ又はそれより多いリシン残基が、第一アミンを欠くｐＨ７．３の緩衝液中で、３０分間室温で修飾される、請求項１に記載の方法。
7. 前記第１の架橋剤で修飾された組換えヒトリソソーム酵素を、前記短い伸長リンカーを含有する第２の架橋剤で修飾された変異型ＩＧＦ−２ペプチドに結合させる前に、前記短い伸長リンカーを含有する第２の架橋剤で修飾された変異型ＩＧＦ−２ペプチドを精製することを更に含んでなる、請求項１に記載の方法。
8. 前記第１の架橋剤が、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル−ホスフィン（スルホ−ＮＨＳ−ホスフィン）を含んでなる、請求項１に記載の方法。
9. 前記第１の架橋剤が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル−テトラオキサペンタデカンアセチレン（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−アセチレン）を含んでなる、請求項１に記載の方法。
10. 前記第１の架橋剤が、ジフルオロシクロオクチン（ＤＩＦＯ）及びジベンゾシクロオクチン（ＤＩＢＯ）から選択されるヘテロ二官能性架橋剤を含んでなる、請求項１に記載の方法。
11. 前記第２の架橋剤が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル−ＰＥＧ４−アジド（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−アジド）を含んでなる、請求項１に記載の方法。
12. 酵素置換療法に適した分子を製造する方法であって：
    ヘテロ二官能性架橋剤を変異型ＩＧＦ−２ペプチドに結合させること；及び
    ヘテロ二官能性架橋剤で修飾された変異型ＩＧＦ−２ペプチドを、組換えヒトリソソーム酵素に結合させること；
    又は、
    ヘテロ二官能性架橋剤を組換えヒトリソソーム酵素に結合させること；及び
    ヘテロ二官能性架橋剤で修飾された組換えヒトリソソーム酵素を、変異型ＩＧＦ−２ペプチドに結合させること；
    を含んでなり、
    変異型ＩＧＦ−２ペプチドは、野生型ヒトＩＧＦ−２ペプチドに対し、
    少なくとも以下の修飾：
    １−４位のアミノ酸の削除、６位におけるグルタミン酸のアルギニンへの置換、２７位におけるチロシンのロイシンへの置換、及び６５位におけるリシンのアルギニンへの置換；
    を含み、かつ
    任意選択的に以下の修飾：
    ７位のアミノ酸の削除；又は７位におけるトレオニンのリシンへの置換；
    を含む、前記方法。
13. 前記組換えヒトリソソーム酵素が、ヒト酸性α−グルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）である、請求項１２に記載の方法。
14. 前記二官能性架橋剤が、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）を含んでなる、請求項１２に記載の方法。
15. 組換えヒトリソソーム酵素に化学的に結合した一つ又はそれより多い変異型ＩＧＦ−２ペプチドを含んでなり、
    変異型ＩＧＦ−２ペプチドは、野生型ヒトＩＧＦ−２ペプチドに対し、
    少なくとも以下の修飾：
    １−４位のアミノ酸の削除、６位におけるグルタミン酸のアルギニンへの置換、２７位におけるチロシンのロイシンへの置換、及び６５位におけるリシンのアルギニンへの置換；
    を含み、かつ
    任意選択的に以下の修飾：
    ７位のアミノ酸の削除；又は７位におけるトレオニンのリシンへの置換；
    を含む、複合体。
16. 前記組換えヒトリソソーム酵素が、ヒト酸性α−グルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）である、請求項１５に記載の複合体。
17. 化学的結合が、アミノ反応性二官能性架橋剤から誘導される架橋剤に媒介されている、請求項１５に記載の複合体。
18. 化学的結合が、Ｎ−スクシンイミジル６−ヒドラジノニコチン酸アセトン（Ｓ−Ｈｙｎｉｃ）から誘導される架橋剤に媒介されている、請求項１５に記載の複合体。
19. 化学的結合が、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル−ホスフィン（スルホ−ＮＨＳ−ホスフィン）から誘導される架橋剤に媒介されている、請求項１５に記載の複合体。
20. 化学的結合が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル−テトラオキサペンタデカンアセチレン（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−アセチレン）から誘導される架橋剤に媒介されている、請求項１５に記載の複合体。
21. 化学的結合が、ジフルオロシクロオクチン（ＤＩＦＯ）及びジベンゾシクロオクチン（ＤＩＢＯ）から選択されるヘテロ二官能性架橋剤から誘導される架橋剤に媒介されている、請求項１５に記載の複合体。
22. 組換えヒトリソソーム酵素に結合したヘテロ二官能性架橋剤で修飾された変異型ＩＧＦ−２ペプチドを含んでなる、請求項１５に記載の複合体。
23. リソソーム蓄積症に罹った対象を治療するための医薬であって、請求項１５に記載の複合体のリソソーム蓄積症を治療するために十分な量を含んでなる、医薬。
24. 前記リソソーム蓄積症が、以下の：ポンペ病、ファブリー病、及びゴーシェ病、ＭＰＳ Ｉ、ＭＰＳ ＩＩ、ＭＰＳ ＶＩＩ、テイ・サックス、サンドホフ、α−マンノシドーシス、並びにウォルマンの少なくとも一つである、請求項２３に記載の医薬。
25. 前記変異型ＩＧＦ−２ペプチドが、配列番号：２のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載の方法。
26. 前記変異型ＩＧＦ−２ペプチドが、配列番号：２のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１５に記載の複合体。