CN106414485A

CN106414485A - 人工活化的毒性肽

Info

Publication number: CN106414485A
Application number: CN201580029683.6A
Authority: CN
Inventors: R.M.肯尼迪; 鲍林; A.R.卡尔森; C.L.富恩; A.M.哈斯; B.A.施泰因鲍夫
Original assignee: Vestaron Corp
Current assignee: Vestaron Corp
Priority date: 2014-04-04
Filing date: 2015-04-03
Publication date: 2017-02-15
Also published as: MX2021015198A; JP2020180160A; CN111233992B; US20170121377A1; NZ724966A; JP2017512821A; KR20220131354A; AU2015240516A1; CN111233992A; KR20160141804A; CA2944334A1; KR102643502B1; JP7143371B2; WO2015154020A1; EP3125694A1; AU2015240516B2; AU2015240516C1; JP6800752B2; US20200181212A1; MX2022010854A

Abstract

描述了对某些毒性肽进行人工诱导的转化以生成那些肽的不同形式和原始肽的新型且可用的衍生物二者，这两者本身有用且可用作可用于制备其它重要化合物的新型化合物和新型稳定中间体。

Description

人工活化的毒性肽

相关申请的交叉引用

本申请要求于2014年4月4日提交的美国专利申请第61/975,147号的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

发明领域

本发明涉及提高天然和杂合生理活性肽的活性的化学方法和机械方法，所述肽例如与毒蜘蛛、蜗牛、软体动物及其它动物中发现的毒素相关或源自其中的肽毒素。

序列表

本申请整体并入题为“FAM_N_PRV_SEQ_LISTING_2015_04_03_ST25.txt”的序列表(106,014字节)，该序列表创建于2015年4月3日，并以电子形式随附提交。

背景

通常，采用高热和高压(例如由高压灭菌器产生的和用于灭菌的条件)来中和和灭活生物样品，例如真菌、细菌和病毒。通常蛋白质经这样的过程变性或甚至被破坏。通常，当生物体暴露于高温和高压时，它们不能生长或甚至存活，因为它们的蛋白质变性，生物体因此变得失活并死亡。随后的唯一生物过程是衰变。仅酸性条件有时可以产生类似的结果。将大多数活性肽(例如毒性蛋白质)暴露于低pH或酸性条件，肽变性并不再像天然肽或蛋白质那样起作用。高压灭菌器通常被医疗机构用来处理仪器、装置以使其安全和无菌地用于重复使用，并且高压灭菌器越来越多地用于处理生物污染的废物，以将其变成安全的中性无害废物用于处置。在此，我们报道了对某些毒性肽进行人工诱导的转化以生成那些肽的不同形式和原始肽的新型且可用的衍生物二者，这两者本身有用，且可用作可用于制备其它重要化合物的新型化合物和新型稳定的中间体。

发明概述

本发明有两部分。在第1部分中，我们描述了使用人工诱导的化学和机械方法来提高肽(包括毒性肽)的活性和毒性的方法，所述方法任选地以字母顺序包括以下步骤：a)将所述肽与水混合，以制备所述肽的液体或半液体形式的水溶液或水乳液，其中所述水溶液或水乳液含至少10％的水；b)测量所述肽在所述水溶液或水乳液中的pH；c)将所述溶液或乳液的pH调节至低于pH 7.0。所述pH可以为约1.0至约6.5；约2.0至约6.0；约2.5至约5.5；约3.0至约5.0；约3.0至约4.0；或约3.2、3.4、3.5、3.6或3.8。

在所述方法中，在所述pH调节后，将所述肽干燥为干粉或颗粒形式。可以使用强酸或弱酸进行所述pH调节；强酸的实例为任何下述酸：氯酸(HClO₃)、盐酸(HCl)、氢溴酸(HBr)、氢碘酸(HI)、磷酸(H₃PO₄)、硫酸(H₂SO₄)、高氯酸(HClO₄)和硝酸(HNO₃)。弱酸的实例为乙酸和/或草酸。在所述pH调节期间，将所述水溶液或水乳液暴露于干热，即无蒸汽或压力或热、压力和蒸汽的温度升高。说明书中所述热及热和压力条件还可以与包括本文所述的干粉程序在内的任何程序一起使用。

在肽为水溶液或乳液时通过将所述溶液或乳液的pH降低至低于7.0从所述肽中除去任何一个或更多个共价结合的2H+O或分子的方法。利用所述方法尤其好地起作用的肽是说明书或序列表中所述的肽，特别是SEQ ID NO.119和SEQ ID NO.121。

除了所述方法，我们对肽的杀虫组合物和适于施用于待用所述肽处理的昆虫所在地的制剂进行了描述。除了所述方法和组合物，我们对毒性肽本身进行了描述，其中除去了任何一个或更多个共价结合的2H+O或分子，所述肽在水溶液或乳液中的pH降低至低于7.0。

我们对提高肽的毒性和/或活性的方法进行了描述，所述方法包括以下步骤：a)将所述肽制备为纯的形式1肽或肽酸或含少于约10％的水的组合物，b)将所述形式1肽或肽酸置于可控室或加热平台中；c)将所述肽加热至期望的温度，有或无压力，有或无蒸汽；d)将所述加热的肽维持在期望的温度、压力和蒸汽下直至期望量的称为肽酸的形式1肽转化为称为肽内酯的形式2肽；所述可控室可维持温度为0至500℃，压力为大气压力至500psi。可以将所述肽加热至约如下温度；加热至至少约10℃，但不高于选自约200℃、300℃或至多400℃的最高温度。

我们对如下方法进行了描述：其中将所述肽加热至至少选自约任何如下温度、温度范围或温度范围的组合的温度：10℃至20℃、20℃至30℃、30℃至40℃、40℃至50℃、50℃至60℃、60℃至70℃、70℃至80℃、80℃至90℃、90℃至100℃、100℃至110℃、110℃至120℃、120℃至130℃、130℃至140℃、140℃至150℃、150℃至160℃、160℃至170℃、170℃至180℃、180℃至190℃、190℃至200℃、200℃至210℃、210℃至220℃、220℃至230℃、230℃至240℃、240℃至250℃、250℃至260℃、260℃至270℃、270℃至280℃、280℃至290℃、290℃至300℃、300℃至400℃以及400℃至500℃；

我们对如下方法进行了描述：将所述肽或肽酸暴露于任何如下压力或压力范围：a)约10psi至约40psi；b)约15psi至约35psi；c)约18psi至约25psi；d)约21psi。根据所选温度和压力将所述肽在所述所选温度和压力下维持如下时间段：a)约5分钟至约40分钟；b)约10分钟至约30分钟；c)约15分钟至约25分钟；d)约21分钟；

可以使用如下条件，应将所述肽维持在如下温度和压力和时间：a)约100℃至约140℃；约10psi至约40psi的压力；约5分钟至约40分钟；b)约110℃至约130℃；约15psi至约35psi的压力；约10分钟至约30分钟；c)约115℃至约125℃；约18psi至约25psi的压力；约15分钟至约25分钟；d)约121℃；约21psi的压力；约20分钟。在压力不高于大气压力的情况下，所述温度选自至少50℃至60℃或更高的温度。在一些情况下，使用如下温度、温度范围或温度范围的组合：50℃至60℃、60℃至70℃、70℃至80℃、80℃至90℃、90℃至100℃、100℃至110℃、110℃至120℃、120℃至130℃、130℃至140℃、140℃至150℃、150℃至160℃、160℃至170℃、170℃至180℃、180℃至190℃、190℃至200℃、200℃至210℃、210℃至220℃、220℃至230℃、230℃至240℃、240℃至250℃、250℃至260℃、260℃至270℃、270℃至280℃、280℃至290℃、290℃至300℃、300℃至400℃以及400℃至500℃。

该方法可使用如下温度和时间，其中将所述肽：a)加热并在高于约100℃的温度下维持至少约1小时；b)加热并在约80℃至约120℃的温度下维持至少约2小时；c)加热并在约50℃至约80℃的温度下维持至少约3小时。或者，可以将所述肽a)加热并在高于约180℃的温度和至少约5psi的压力下维持至少约5分钟；b)加热并在高于约100℃的温度和至少约10psi的压力下维持至少约10分钟；c)加热并在高于约80℃至约120℃的温度和至少约10psi的压力下维持至少约30分钟；或d)加热并在约50℃至约80℃的温度下维持至少约1小时。

可以使用如下条件转化所述肽：a)加热并在约200℃至约300℃的温度和约5至约10psi的压力下维持约5至约10分钟；b)加热并在约150℃和约200℃的温度和约10至约30psi的压力下维持约5至约30分钟；c)加热并在约80℃至约150℃的温度和约10至约20psi的压力下维持约20至约60分钟；或者d)加热并在约50℃至约80℃的温度和约10至约40psi的压力下维持约30至约60分钟。

替选条件为：其中将所述肽a)加热并在约110℃至约130℃的温度和约10至约20psi的压力下维持约10至约20分钟；或者b)加热并在约121℃的温度和约21psi的压力下维持约20分钟。

一般而言，我们描述了在本文所述的任何条件、温度和压力下通过加热肽从所述肽中除去任何一个或更多个共价结合的2H+O或H₂O或分子的方法。通过在本文所述的任何条件、温度和压力下通过加热所述肽从序列表肽中的任何肽中除去任何一个或更多个共价结合的2H+O或H₂O或分子的方法。我们描述了转化后序列表中的任何肽。我们描述了由说明书或权利要求书中所述的任何过程产生的肽。我们描述了通过任何权利要求所述的方法产生的肽的杀虫组合物，其在适于施用于待用所述肽或毒性肽处理的昆虫所在地的制剂中。我们描述了毒性肽，并在除去任何一个或更多个共价结合的2H+O或分子时在将肽加热至本文所述的任何条件、温度和压力时将其称为肽内酯。在本文中和在第2部分中，我们描述了在除去了一个或更多个共价结合的2H+O或H₂O分子时通过任何程序产生的任何毒性肽，于是将其称为肽内酯。

尤其合适的转化条件是加热所述肽并在约121℃的温度和约21psi的压力下维持约20分钟。

在该申请的第2部分中，我们描述了可以如何将肽内酯转化为肽酰肼，以及如何将肽酰肼转化为肽腙。我们描述了制备方法，和通过将昆虫捕食者肽从肽内酯形式转化为肽酰肼形式的方法制备的肽酰肼产物，所述方法包括将昆虫捕食者肽内酯与酰肼混合，并纯化以得到所述肽酰肼。我们描述了如何在水中制备肽内酯，添加酰酰肼单水合物，并搅拌所述混合物以形成所述肽酰肼，任选地将其冷冻、解冻和纯化以得到经纯化的肽酰肼。如果期望的话，所述昆虫捕食者肽的大小可以为约20个氨基酸至约50个氨基酸不等，并且具有2、3或4个胱氨酸键，或者具有3或4个胱氨酸键或者2或3个胱氨酸键。可以使用序列表中的任何肽和序列表中的任何肽或与序列表中的任何肽具有大于80％同源性的任何肽或者具有大于85％、90％、95％或99％同源性和3或4个胱氨酸键的任何序列制备所述肽内酯。

我们证实了如何利用使用称为杂合体+2肽的肽的那些方法，其中可以利用方法a或方法b，包括：方法a；a)始于100mg的纯化形式2肽、所述杂合体+2肽内酯在1mL水中的溶液，b)用100uL酰肼单水合物处理1mL的100mg肽内酯，并在室温下搅拌以形成所述肽酰肼，任选地保持2小时，c)在制备型HPLC上纯化肽酰肼溶液(用梯度乙腈/水/三氟乙酸洗脱)，d)选择合适的肽酰肼级分，e)合并合适的肽酰肼级分并在真空下浓缩以减小体积，f)在低于零度下，任选地在-80℃下，冷冻减小体积的肽酰肼，g)任选地在冻干机上冻干所述杂合体+2肽酰肼，以得到杂合体+2肽酰肼(I)；或者方法b，其中方法b包括：a)任选地在约50℃至90℃、任选地在75℃下搅拌25mL的超级液体浓缩物的溶液，所述超级液体浓缩液是形式1、肽酸和形式2的混合物；b)使所述溶液冷却；c)用任选地2mL酰肼单水合物处理溶液，并任选地在室温下搅拌2小时；d)在制备型HPLC上纯化部分，任选地用梯度(乙腈/水/三氟乙酸)洗脱；e)任选地在真空下合并和浓缩级分，减小体积；f)冷冻剩余的液体，任选地在-80℃下冷冻，并冻干以产生杂合体+2肽酰肼。

我们还示出如何使用肽酰肼并使其与羰基反应以制备有用的肽腙。其通过将昆虫捕食者肽从所述肽酰肼转化为所述肽腙来完成，包括：a)混合酰肼的水溶液，并添加乙醇中的己醛，搅拌；b)用由己醛、乙酸和乙醇制备的储液处理，搅拌；c)添加由己醛、乙酸和乙醇制备的储液；d)混合并静置，然后任选地加热以产生腙。我们采用该方法来制备腙(II)。其通过如下来完成：a)混合肼(I)的水溶液与乙醇中的己醛，搅拌；b)添加一些权利要求16所述的储液；d)混合并静置，然后任选地加热以产生腙(II)。

该腙是关键的稳定中间体并且也可以是终产物。该产物为聚乙二醇化肽或PEG肽。该腙也可以是其他物质，但我们认为当其聚乙二醇化时最有用。我们还示出了烷基化腙。聚乙二醇化肽实际上采用腙的形式。参见实施例9和腙(III)以及实施例11和(IX)。这样的化合物此前从未存在，而且其制备化学此前从未教导过。这些肽腙是新型的，像腙(IX)这样的聚乙二醇化肽腙在两方面是新型的。首先，实施例10(b)和11(b)中所示的不饱和羰基键此前从未用于连接PEG与肽。其次，在“聚乙二醇化侧”用醛或酮开始该反应，其中醛或酮与PEG结合，然后使其与肽酰肼反应此前从未示出过。通常将醛或酮置于肽上，然后使肽酮或肽醛与PEG反应或组合。在该反应中使用不饱和羰基使得键更加稳定并且难以断裂，因为亚胺氮的碱性较低。因此，可以对实施例9中的羰基进行比较，其中PEG用饱和羰基与实施例11的肽连接，其中PEG用不饱和羰基与肽连接。实施例11的不饱和羰基键是特别重要的，因为它形成更强的键，在肽与PEG之间形成更持久的连接。这种更强的键是不饱和羰基使亚胺氮碱性较低且不容易质子化的结果，这是腙键水解的第一步。这些类型的键此前从未被用于连接肽和PEG或烷基。

聚乙二醇化的肽是众所周知的，但是由转化为酰肼的肽内酯制成的聚乙二醇化腙制备的这种方法是新的并且迄今未知。聚乙二醇化的有毒杀虫肽非常重要，因为当这些杀虫剂通过植物的摄取而被递送到昆虫时，口服生物利用度是非常重要的。在一种方式中，这非常类似于口服时由人服用的药物的口服生物利用度有多重要。在这两种情况下，控制药物“起作用”程度的因素是其口服生物利用度。蛋白质的聚乙二醇化增加分子的大小和分子量。聚乙二醇化通过减少通过网状内皮系统或通过特定的细胞蛋白质相互作用消除减少细胞蛋白质清除。此外，聚乙二醇化形成蛋白质周围的保护性“壳”。这种壳及其相关的水合水使蛋白质免于免疫原性识别，并增加对蛋白水解酶(例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和灰色链霉菌蛋白酶)降解的抗性。参见，Pegylation A Novel Process of ModifyingPharmacokinetics.J.Milton Harris，Nancy E.Martin and Marlene Modi，in ClinPharmacolomry 2001；40(7)：539-551，543页。聚乙二醇化通过给予肽更长的半衰期而增加生物利用度。例如，聚乙二醇化降低了胰蛋白酶对天冬酰胺酶的降解：在50分钟的孵育期后，天然天冬酰胺酶、PEG-天冬酰胺酶和支链-PEG-天冬酰胺酶的残留活性分别为5％、25％和98％Id。

我们示出了如何将昆虫捕食者肽从肽内酯转化为肽酰肼，最后转化为肽腙，其是聚乙二醇化的肽。我们给出了肽酰肼(I)与醛(IV)混合以制备肽腙(III)(聚乙二醇化蛋白)的实例。该方法包括用强酸或弱酸酸化复合二醇，加入酰肼并充分混合以制备肽腙。肽腙可以是聚乙二醇化的肽，取决于用于制备腙的羰基。我们示出了如何通过以下步骤制备肽腙(III)：a)向称为O-[2-(6-氧代己酰基氨基)乙基]-O'-甲基聚乙二醇(IV)的化合物在乙醇中的混合物的储液中加入1滴乙酸，b)使用用来自步骤a的乙酸处理的O-[2-(6-O-己酰基氨基)乙基]-O'-甲基聚乙二醇(IV)的储液，并将其加入到酰肼(I)在水中的溶液中，c)混合并使之在室温下静置，d)分批添加剩余的O-[2-(6-氧代己酰基氨基)乙基]-O'-甲基聚乙二醇(IV) 的储液，使混合物静置过夜以产生肽腙(III)。我们示出了如何可以将昆虫捕食者肽酰肼转化为肽腙，包括，将丙烯酸酮加入酰肼以制备腙。后一种方法通过制备肽腙(VI)的方法证实，包括将乙醇中的丙烯酸酮(V)加入到酰肼(I)的水溶液中并混合。我们还制备了肽腙(IX)，包括将PEG4酮(VIII)加入到酰肼(I)的水溶液中，并混合以制备腙(IX)。因此，肽腙显示为根据我们的方法制备聚乙二醇化肽所需的关键中间体。

我们描述了肽的制备方法和或通过所述方法产生的肽和或通过所述方法产生的杀虫组合物，所述方法描述为从肽去除任何一个或更多个共价结合的2H+O或H₂O或分子；包括具有如本文所述或见于说明书或权利要求书中的单独或组合的任何条件、温度、压力和pH或酸性条件下去除了任何一个或更多个共价结合的2H+O或分子的任何毒性肽；包括由说明书和权利要求书中所述的任何程序产生的任何肽、酰肼或腙或者任何那些肽作为通过说明书和权利要求书中所述任何方法产生、然后用于适于施用于昆虫所在地的制剂中的肽的杀虫组合物的用途。

附图简述

图1是SEQ ID NO：119的质谱，箭头显示峰1具有数字11.84。

图2是SEQ ID NO：119的质谱，具有图1所示的峰1的去卷积谱，其中图1的去卷积的峰1的值为4562.8896。

图3是SEQ ID NO：119的质谱，箭头显示峰2具有数字12.82。

图4是SEQ ID NO：119的质谱，具有图3所示的峰2的去卷积谱，质量值为4544.8838。

图5是显示原始形式的肽(峰1)的毒性与治疗后的新形式的肽(即峰2)的毒性相比较的柱状图。也将两种形式与对照进行了比较。

图6是从液相色谱分别制备的峰1和峰2的生物测定比较。示出了峰1结果。

图7是从液相色谱分别制备的峰1和峰2的生物测定比较。示出了峰2结果。

图8是来自稳定性pH研究的pH 5.6时的SEQ ID NO：119的质谱。

图9是来自稳定性pH研究的pH 3.9时的SEQ ID NO：119的质谱。

图10是来自稳定性pH研究的pH 8.3时的SEQ ID NO：119的质谱。

图11显示来自HPLC的峰1、2和3，并且其显示在加热时，H₂O和NH₃可以从SEQ ID NO：121或天然杂合体分别失去。在滞留时间为4.2分钟、5.4分钟和6.9分钟时，鉴定出三个HPLC峰，其中UV吸光度随温度变化。

图12显示天然杂合肽的同种型的TOF MS评价的结果。

图13是酰肼(I)的质谱。

图14是酰肼(I)的质谱，具有去卷积谱。

图15是腙(II)的质谱。

图16是腙(II)的质谱，具有去卷积谱。

图17是腙(III)的质谱。

图18是腙(III)的质谱，其中观察到的分子离子显示出分布。

图19是丙烯酸酮(V)的质谱，UV轨迹。

图20是丙烯酸酮(V)的质谱。

图21是腙(VI)的质谱。

图22是腙(VI)的质谱，具有去卷积光谱。

图23是PEG4酮(VIII)的质谱，UV轨迹。

图24是PEG 4酮(VIII)的质谱。

图25是腙(IX)的质谱。

图26是腙(IX)的质谱，具有去卷积谱。

发明详述

定义

应当根据整体申请、其描述、实施例和权利要求来阅读和理解定义。

AI表示活性成分。

高压灭菌器是指具有压力容器的装置，该压力容器可以关闭或锁定的，并且允许添加蒸汽和/或热水，通常允许用蒸汽除去干燥空气，若需要的话，有时使用真空泵，任选地使蒸汽脉冲或循环，以便利用干热和/或高压和任选的蒸汽产生更高温度。它通常由连接的电线、电源线供电，电源线将电流从壁装插座传送到装置，以为装置产生的热和压力提供电力，但它可以指可在炉子上加热的简单压力容器。

羰基是指醛或酮。

室是指封闭的管或空间。

摄氏度是温度的单位，通常以度数表示，其可以如在在40C中缩写为C，在40℃中缩写为℃。

转化是指使用本文所述的方法，单独或与其它因素组合的热、热和蒸汽和/或压力或酸性条件将肽从描述为形式1至形式2的转化。本文更充分地对转化进行了描述和举例说明。

DI表示去离子水。

形式I或形式1肽是指肽的形式，该形式提示其被折叠或呈现其活性位点的方式及其内部键合的数目或程度，具体地，形式I或形式1是指肽因为它在首次形成时存在，并且没有2H+O或其分子量的18道尔顿的损失。形式1也称为肽的酸形式，在本文中有时称为肽酸。

形式2或形式2肽是指肽的形式，该形式提示其被折叠或呈现其活性位点的方式及其内部键合的数目或程度，具体来说，形式II或形式2是指这样的肽，开始为形式1肽，但通过应用本文所述的处理组合中的任何一种或组合转化，例如：热、温度、压力、蒸汽、酸、低pH条件，导致其在从形式1转化为形式2之前和之后测量时相当于水分子的18道尔顿的损失。当肽以一种形式开始，然后从其分子量中失去2H+O或18道尔顿时，其作为形式2肽存在。形式2也称为内酯形式的肽或肽内酯。参见第2部分中关于内酯定义的第一段，因为它在本文中所用。

配制是指通常包括活性成分的成分混合物，在此通常是具有用于提高通常与储存或递送活性成分相关的溶解度、稳定性、铺展性、有效性、安全性或其它所需性质的其它成分的毒性肽。

昆虫和待处理的昆虫是指具有昆虫知识的人想要以某种方式控制的昆虫，例如限制其食物消耗，限制其生长或缩短其生命，因为它被认为消耗或破坏食物或材料，或者由于其性质和存在而是不期望的。

昆虫的所在地是指昆虫通常生活、吃、睡或旅行或所来自的地方。

生理活性肽是指具有生物活性的毒性肽。

压力容器是指能够保持高压的密闭容器，具有干燥或湿式加压装置，其能够在加入水时产生加热的蒸汽和高温。压力容器需要从外部源(例如从炉顶加热环)或作为高压灭菌装置的一部分接收电力(power)。

强酸是指在水溶液中完全电离的酸。其具有低pH，通常在1和3之间。实例包括：盐酸-HCl、氢溴酸-HBr、氢碘酸-HI、硫酸-H₂SO₄、磷酸(H₃PO₄)、高氯酸HClO₄、硝酸HNO₃和氯酸HClO₃。

毒性肽是指由天然或人工氨基酸构成的天然、人工或合成的肽，其在暴露于肽时对昆虫产生有害影响。毒性肽包括有毒肽，其是来自或与有毒生物(例如蜘蛛、蛇、软体动物和蜗牛)有关的肽。毒性肽包括在US 8,217,003和US 8,501,684中鉴定和描述的肽。

水约10％或至少约10％或10％或更多或更少意指具有其作为水可获得的总重量或量的至少约10％的任何制剂或混合物，即不共价结合的水分子作为更大分子的一部分并且能够离子化H₂O分子，其能够维持pH。

弱酸是指当在水溶液中时不完全解离的酸。它们通常具有3至6的pH。实例包括：乙酸和草酸。弱酸以离子化的分子与不被离子化的分子之间的平衡存在。

一般描述和程序

本文描述了各种处理，包括单独的热，与热水结合的热、蒸汽、热和压力和/或独立的酸处理，其可以将一些肽的活性增加比处理之前的活性高近5倍的活性。代替在高温和高压下失去其活性，这些肽的活性显示出活性的显著增加。我们示出了改变的性质和温度、压力及pH的条件和范围，其可用于提高而非降低一些肽的活性，包括我们称为生理活性肽和/或毒性肽的肽的活性。

这些肽基本上经历通过重排过程的脱水。我们称该转化为“转化”。当使用升高的温度、或加热，有或无蒸汽和压力、或酸、或用酸加热、或用酸和热加蒸汽和/或压力，或者温度、热、热与压力、热与蒸汽和压力、酸性或低pH、酸或低pH与热、酸或低pH与热和压力、酸或低pH与热、蒸汽和压力时，通常有毒的肽转化成活性更高、毒性更强的肽时转化发生。当施加热或者如果肽在水中时，当向肽的水溶液施加低pH时，可使转化较快发生。温度升高，即热，有或无压力升高；有或无蒸汽；或pH降低，即通过对液体制剂施加酸或酸性条件；或温度和酸的组合导致本文所述的某些毒素肽的活性出乎意料地提高。公开了并要求保护与该发现相关的对多种实施方案的进一步的观察、测量和分析。

在一些实施方案中，用以下条件处理对昆虫有毒的肽：单独加热或与蒸汽和压力组合加热，例如在约100℃至150℃下操作的典型高压灭菌器中。如果蒸汽和压力在约100kPa或15psi的压力下使用，根据温度、压力和酸度的变量，从3、5、10、20、30、40、50、60、70、75、80或90分钟的时间，然后转化将导致短的时间。合适的转化条件是加热肽并将其在约121℃的温度和约21psi的压力下维持约20分钟。在一些实施方案中，本文所述的一些程序类似于当高压灭菌生物样品用于再次使用或安全处置时使用的标准程序。

如果使用比上述温度和压力低的温度和压力，则转化所用时间比上述时间长。该方法可以用于肽的干粉或晶体形式，或者可以将肽放入溶液中然后转化。当将肽置于水溶液中时，pH变成监测、调节和控制的重要因素。一般来说，降低pH，溶液比高pH溶液转化更快，转化在高于pH 7.0时停止。

适用于本文所述方法的典型的高压灭菌器操作条件是：在约100kPa或15psi或约10至20psi的压力下加热至约120℃至135℃约15分钟或约10至20分钟的蒸汽，将足以在合理的时间段内进行转化。本领域技术人员将能够通过使用如本文所述的测量和测定来改变和改变监测和控制转化速率的条件。

提高肽活性的方法需要超过室温的一些热量。可以使用自身的热或在蒸汽存在下的热和/或在压力存在下的热。转化所需的时间取决于多少热量和/或蒸汽和压力，以及如果相关的话，肽所在溶液的酸度。热加时间足以使得进行本文中所定义的变化或转化。需要多少时间取决于使用多少热量以及是否使用蒸汽和压力与热。类似地，需要多少热量取决于肽被加热多长时间以及是否使用蒸汽和压力。

公开了可能的热选择的一些例子，有和无蒸汽；以及可用于提高肽的毒性的各种压力。本领域技术人员能够使用这些教导和实施例来确定许多其它可能的温度、压力、pH条件及其组合。

温度、时间和压力、有和无蒸汽的实例。

有蒸汽：a)110C，30psi，20分钟；b)120C，15psi，15分钟；c)130C，30psi，3分钟、8分钟、10分钟至15分钟，取决于容器是否覆盖。

无蒸汽(干正常压力)：a)120C，0psi，12小时；b)130C，0psi，6小时；c)140C，0psi，3小时；d)150C，0psi，2.5小时；e)160C，0psi，2小时；f)170C，0psi，1小时。

应当注意和理解，即使温和的温度升高也可以实现肽中所需的变化，只要给予足够的时间用于进行反应。例如，室温通常在约20至25C的范围内。当制剂的温度升至低至40C时，反应可以在几小时或几天内发生；然而，在无蒸汽和无压力下于40C反应将非常缓慢地进行，并且可能需要长达2年才能完成。在无蒸汽和无压力下于100C下反应可能需要长达6个月才能完成。但是如果反应在120C，15psi下进行，转化可以在15分钟内完成。

上面提供的热、时间、蒸汽和压力的实例可以与湿制剂或干制剂一起使用。干制剂活性是重要的，因为在肽毒素的商业制剂中，干制剂容易测量、运输、销售和使用。将干燥粉末暴露于蒸汽热的方法是特别优选的，因为蒸汽热还可以用于使大多数活性物质例如酵母杂合体无用并失活，所述活性物质可能是来自有毒肽的制备的非期望遗留污染物。

除了热、蒸汽和压力之外，可用于提高肽活性的另一个独立因素是pH或酸度。当肽在溶液中并且在室温下或与上述时间、温度、压力和蒸汽因素组合时，可以使用低pH，即低于7，或酸度。

酸度和酸性条件被认为是可以影响转化率的重要因素。首先应当理解，当肽为无水形式的干燥形式时，可以进行上述方法，但是当与水混合时，或者当用足够的水水合以形成可测量的pH时，其可转化为其活性更高的形式。低pH或酸性条件—7.0或更低已被发现是可用于提高转化速率和速度的独立因素。当肽在溶液中时，最佳pH似乎在约1.5至约6之间，优选在约2至约5之间，更优选在约3至约4之间，更优选约3.5，但是任何酸条件，7.0或更低，将提高反应速率。这基本上是由pH驱动的平衡反应。在pH高于7.0时，反应将是缓慢的，pH越高越慢，直到其变得如此慢以致当使用水性反应条件时基本上无效。在略高于pH 7.0至约7.5的pH下会有一些转化。在较高pH条件下，转化将会如此缓慢以至于有效并且通常被认为具有很小的商业价值。

在一个实施方案中，将肽与水混合，置于pH为6.0或更低的溶液中，并在蒸汽和压力下在约120℃至约150℃之间的温度下以少于约10分钟的快速转化而转化。

反应。不希望受理论约束，并且所描述的程序不需要它，而是为了进一步推进本发现的公开并改进本文的教导，我们认为在转化期间可能发生以下反应。当根据本文所述的热、压力、蒸汽和酸方案处理某些肽时，它们似乎失去当量的水分子，因此我们有时将该过程称为脱水。

为了说明的目的，我们提供了在实施例和序列表中提供的2条序列—SEQ ID NO：119(也称为杂合体+2)和SEQ ID NO：121的数据。其为仅仅其N-末端氨基酸不同的两种毒性肽。SEQ ID NO：119具有N端GS。SEQ ID NO：121不具有N末端GS。SEQ ID NO：121具有39个氨基酸，它们是见于SEQ ID NO：119中的相同的39个C末端氨基酸。那些毒性肽可用于证明和解释转化。

我们首先解释转换不是什么。当具有如SEQ ID NO：121中或如谷氨酰胺或Q的氨基酸的具有N-末端的肽自发形成环状化合物如焦谷氨酸时，并非转化。例如，SEQ ID NO：121的N端谷氨酸可形成焦谷氨酸。在此我们将具有游离NH₃基的N-端或内部氨基酸的自发环化称为“NH₃反应”。NH₃反应不是转化，其与转化率不相当。我们将转化称为“2H+O反应”或“H₂O反应”或“脱水反应”，并且它与NH3反应完全不同。两者可以与我们在实施例5中证明的相同的肽一起发生。用这两种肽证明并且在下面的实施例中表征和解释两种形式的单一肽的存在和将一种形式改变为另一种形式或至少将具有2H+O的形式转化为不具有它的形式的受控能力。

用于转化的最佳肽。

我们认为许多肽适合于转化，包括下面详细描述的那些。有毒昆虫肽或昆虫捕食者肽具有2、3或4个胱氨酸键，这意味着它们具有4、6或8个半胱氨酸。它们是大于约10个氨基酸残基和小于约300个氨基酸残基的肽。更优选地，它们的范围为氨基酸或大小为大约20个氨基酸至大约50个氨基酸。它们的分子量范围为约550Da至约350,000Da。当暴露于高热和低pH时，它们显示出令人惊讶的稳定性。有毒昆虫肽具有某种类型的杀虫活性。通常，当注射到昆虫中时它们显示活性，但是当局部施用于昆虫时大多数无显著的活性。有毒昆虫肽的杀虫活性以多种方式测量。常用的测量方法是本领域技术人员公知的。这样的方法包括但不限于通过基于对各种参数进行计分拟合剂量响应图确定中值响应剂量(例如，LD₅₀、PD₅₀、LC₅₀、ED₅₀)，所述参数例如：麻痹、死亡率、增重失败等。可以对暴露于所讨论的各种剂量的杀虫制剂的昆虫群体进行测量。可以通过创建由概率分析和/或Hill方程等定义的曲线来进行数据分析。在这种情况下，将通过皮下注射、通过高压输注、通过作为食物或诱饵等样品的一部分呈递杀虫制剂来施用剂量。

有毒昆虫肽在本文中定义为所有显示为在通过皮下注射、高压输注或经由输送至昆虫时递送至昆虫时具有杀虫性的肽(即，通过摄入作为提供给昆虫的食品样品的一部分)。因此，这类肽包括但不限于作为蜘蛛、螨、蝎、蛇、蜗牛等毒液的组分天然产生的许多肽。该类还包括但不限于由以下产生的各种肽：植物(例如各种凝集素、核糖体失活蛋白和胱氨酸蛋白酶)和由昆虫病原微生物(例如由各种芽孢杆菌属菌种产生的蛋白的Cry1/δ内毒素家族)产生的各种肽。

以下文献通过引用整体并入本文，在其他管辖区中被允许并且由于它们的出版而作为公知常识。此外，它们通过引用并入，并且在它们描述肽序列的程度上以其序列表具体已知。请参阅以下内容：

2008年4月8日授权的美国专利7,354,993 B2，特别是序列表中列出的肽序列和编号为1-39的肽序列，以及命名为U-ACTX多肽的那些，可形成2-4链内二硫键的毒素及其变体，和出现在说明书的4-9栏和图1中的肽。EP专利1 812 464 B1，2008年8月10日公报2008/41公开和授权，特别是序列表中列出的肽序列，可形成2-4链内二硫键的毒素，以及编号1-39的那些，那些命名为U-ACTX多肽及其变体，以及出现在那些专利的段落0023至0055中并出现在图1中的肽。

通过提及本文鉴定的肽描述和并入的是所提及的序列的同源变体，与这样的序列具有同源性或本文中提及，其也被鉴定和要求保护为适合根据本文所述方法的转化，包括但不限于：所有同源序列，包括与本文任何公开的序列或通过引用并入的任何序列具有至少任何以下同一性百分比的同源序列：30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高同一性，以及本文鉴定的任何其他序列，包括本申请序列表中的各个和每一序列。当术语同源或同源性在本文中与数字例如30％或更大一起使用时，则指两个肽之间的同一性百分比或相似性百分比。当使用没有数字百分比的同源或同源性时，其是指在进化或发育方面密切相关的两个肽序列，因为它们共享共同的物理和功能方面，例如局部毒性和相似大小在长度的100％以内或50％更短的长度或肽。

描述并通过引用并入本文中鉴定的肽，其衍生自上文提及的美国和EP专利文献中提及的任何来源，包括但不限于以下：从植物和昆虫分离的毒素，特别是来自蜘蛛、蝎子和植物的毒素，其捕食或防御昆虫，例如，漏斗网蜘蛛和尤其是澳大利亚漏斗网蜘蛛，包括见于、分离自或衍生自澳毒蛛属(Atrax)或漏斗网蛛属(Hadronyche)的毒素，包括如下属种，蓝山漏斗网蛛(Hadronyche versuta)或蓝山漏斗网蜘蛛、强壮澳毒蛛(Atrax robustus)、骇人澳毒蛛(Atrax formidabilis)、恼人澳毒蛛(Atrax infensus)，包括被称为“蜘蛛毒素”、“共-蜘蛛毒素”、“κ”蜘蛛毒素、“ω”蜘蛛毒素的毒素、U-ACTX多肽、U-ACTX-Hv1a、rU-ACTX-Hv1a、rU-ACTX-Hv1b或突变体或变体，特别是任何这些类型的肽，尤其是那些小于约200个氨基酸但大于约10个氨基酸的肽，尤其是小于约150个氨基酸但大于约20个氨基酸的肽，尤其是小于约100个氨基酸但大于约25个氨基酸的肽，尤其是小于约65个氨基酸但大于约25个氨基酸的肽，尤其是小于约55个氨基酸但大于约25个氨基酸的肽，尤其是约37或39或约36至42个氨基酸，尤其是具有少于约55个氨基酸但大于约25个氨基酸的肽，尤其是具有少于约45个氨基酸但大于约35个氨基酸的肽，尤其是具有少于大于约115个氨基酸但大于约75个氨基酸，尤其是具有小于约105个氨基酸但大于约85个氨基酸的肽，尤其是具有小于约100个氨基酸但大于约90个氨基酸的肽，包括本文提及的任何长度的可以形成2、3和/或4个或更多个链内二硫桥的肽毒素，包括破坏钙通道电流的毒素，包括破坏钾通道电流的毒素，尤其是昆虫钙通道或其杂合体，尤其是任何这些类型的毒素或其变体，以及具有局部杀虫活性的本文所述的任何类型的毒素的任何组合，其可以通过本文所述的方法转化。

应当理解，可以将相同的或其他肽与本文所述的肽缀合。形式1至形式的转化为内部转化，N和C末端肽不会受到影响，因此，N和C末端氨基酸可以有共价结合的伴侣，无论是长或短。除了描述了900、800、700、600、500、400、300、200、100、50个或更少的氨基酸肽缀合物以外，我们还详细描述了大小高达1000个氨基酸的结合伴侣。

当通过本发明描述的方法、程序或工艺处理时，来自澳大利亚漏斗网蜘蛛澳毒蛛属和漏斗网蛛属的有毒肽特别合适并且良好地起作用。当通过本发明中所述的方法处理时，这些蜘蛛肽，像许多其他毒性肽一样，尤其是包括有毒蝎和毒性植物肽，成为局部活性或毒性。本文提供了所测试的合适肽和数据的实例。除了上面提到的生物，以下的物种还可以携带适合于通过本发明的方法转化的毒素。以下种属被命名为：开放美洲漏斗蛛(Agelenopsis aperta)、赫克托黄肥尾蝎(Androctonus australis Hector)、骇人澳毒蛛、恼人澳毒蛛、强壮澳毒蛛、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、东方钳蝎(Bothusmartensii Karsch)、Bothus occitanus tunetanus、莫桑比克荧光蝎(Buthacusarenicola)、以色列鳄黑背蝎(Buthotus judaicus)、默氏钳蝎(Buthus occitanusmardochei)、中美毒蝎(Centruroides noxius)、Centruroides suffusus suffusus、芬瑟岛漏斗网蛛(Hadronyche infensa)、蓝山漏斗网蛛、机智漏斗网蛛(Hadronycheversutus)、短全漏斗蛛(Hololena curta)、以色列黑鳄背蝎(Hottentotta judaica)、以色列金蝎(Leiurus quinquestriatus)、黑背以色列金蝎(Leiurus quinquestriatushebraeus)、金背以色列金蝎(Leiurus quinquestriatus quinquestriatus)、Oldenlandiaaffinis、以色列阔爪金蝎(Scorpio maurus palmatus)、巴西钳蝎(Tityus serrulatus)、Tityus zulianu。根据本发明的方法，可根据本发明的方法考虑来自上述所列任何属的任何肽毒素的转化。

本说明书中的实施例无意于并且不应当被用来限制本发明，它们仅用于说明本发明。

如上所述，许多肽是转化的合适候选物。上文、下文和序列表中所述的序列是特别合适的可以转化的肽。那些肽中的一些已经根据本文所述的程序转化，如下文实施例中所述。

SEQ ID NO：60(单字母密码)

SEQ ID NO：60(三字母密码)

命名为“ω-ACTX-Hv1a”，其在位置4-18、11-22和17-36处具有二硫键。分子量为4096。

SEQ ID NO:117(单字母密码)

SEQ ID NO:117(三字母密码)

命名为“ω-ACTX-Hv1a+2”，其在位置6-20、13-24和19-38处具有二硫键。分子量为4199。

SEQ ID NO:118(单字母密码)

SEQ ID NO:118(三字母密码)

命名为“rκ-ACTX-Hvlc”，其在位置5-19、12-24、15-16、18-34处具有二硫键。分子量为3912.15。

SEQ ID NO:119(单字母密码)

SEQ ID NO:119(三字母密码)

命名为“rU-ACTX-Hv1a(“杂合体”)+2”，其在位置5-20、12-25、19-39处具有二硫键。分子量为4570.51。

以下实施例旨在说明并提供对本公开的进一步书面描述和支持。它们不旨在限制本公开或权利要求。

实施例

关于实施例的一般信息

SEQ ID NO：119是GSQYCVPVDQPCSLNTQPCCDDATCTQERNENGHTVYYCRA。SEQ ID NO：119具有41个氨基酸。当适当折叠时，其具有3个二硫键。其具有C₁₈₅H₂₇₆N₅₆O₆₈S₆的元素组成。SEQ ID NO：119可被称为“+2杂合体，”“杂合体+2”或“+2杂合体”。

SEQ ID NO：121是QYCVPVDQPCSLNTQPCCDDATCTQERNENGHTVYYCRA。SEQ ID NO：121具有39个氨基酸并且它们与SEQ ID NO：119中的39“C”末端氨基酸相同。SEQ ID NO：121可被称为“天然”或“天然杂合体”或“天然杂合肽”。

SEQ ID NO：119的N末端氨基酸是“G”、甘氨酸或Gly。SEQ ID NO：119中的2个N末端氨基酸是“GS”，这些氨基酸不是SEQ ID NO：121的N末端的一部分。SEQ ID NO：121的N末端是“Q”或谷氨酰胺。

以谷氨酰胺、Q或Gln结束的序列，如SEQ ID NO：121，可能自发地由谷氨酰胺环化为焦谷氨酸。反应可以是快速的，可以是自发的，并且不需要加热或酸。已知这种氨基基团，有时是N-末端环化，发生在肽中，并且这导致肽失去17质量单位、原子单位或道尔顿，与环化后损失的NH₃的17道尔顿相关。我们将这个反应称为“NH₃反应”，它不是我们所称的转化。我们在下面的实施例5中更详细地解释了该反应。

我们认为当热施加于如SEQ ID NO：121的有毒肽时发生非常不同的反应，并且我们将该反应称为转化或“2H+O反应”。转化导致活性令人惊讶的提高，这是完全不同的反应，所述肽与经历NH₃反应的肽发生的情况相比具有不同的性质。

由转化产生的活性提高可以是接近5倍，或5倍，数据如下所示。当毒性肽暴露于我们在本文所述的任何转化条件，即水溶液的热、压力、蒸汽、酸条件时，则我们认为“2H+O反应”导致肽具有提高的活性。

转化或2H+O反应导致具有比反应开始之前少一个水分子的化合物。在下文中，我们提供数据显示，由转化产生的肽导致具有少一个H₂O或18道尔顿的这样的肽，并且基本上脱水，但也是比肽在其转化前稳定得多且更具毒性的肽。这是肽变化的形式，使得原始形式(在本文中称为形式1或峰1)比转化的形式2肽多18道尔顿。

质谱证据显示2H+O反应与NH₃反应不同，而是，2H+O反应导致损失18道尔顿，与18道尔顿的H₂O而非17道尔顿的NH₃相关。我们在实施例1中示出2H+O反应中损失的H₂O的道尔顿；并且实施例5中提供了17道尔顿的NH₃损失。

实施例1

质谱峰1/形式1和峰2/形式2。在图1-4中，鉴于以下提供的标题和描述，示出了SEQID NO：119的质谱并且其具有2个不同的峰。两个峰被标识为粗体的大数字和指向数字的括号形箭头。我们将这两个峰称为峰1和峰2。使用Waters/Micromass四极杆飞行时间(Q-TofPremier)在线质谱仪与Waters NanoAcquity UPLC系统生成和分析那些图中的光谱。

图1显示具有箭头的质谱，示出峰1在11.84处。

图2是SEQ ID NO：119的质谱，其具有图1所示的峰1的去卷积谱，其中图1的去卷积的峰1的值为4562.8896。

图3示出具有箭头的质谱，其示出峰2具有数字12.82。

图4是SEQ ID NO：119的质谱，其具有图3所示的峰2的去卷积谱，质量值为4544.8838。

图1-4显示峰1和峰2之间的差为18道尔顿或2H+O。

当将图2和图4的两个质量值彼此相减时，4562.8896-4544.8838＝18.00，该值为18，其对应于水分子的质量值。峰2也被称为肽或肽内酯的“脱水形式”或形式2。在第2部分的开始对内酯进行了定义。当与示出峰1的结构相比时，峰2表明肽已经采取从其结构失去水分子的形式。

分离由峰1和2指示的肽及其形式，并比较其活性。以下实施例提供了原始形式的活性的比较，称为以下中的任一种：峰1、形式1、天然、酸形式、肽酸、原始、预转化、未转化的或未转化形式的肽。形式1是经加热或酸化以将其转化为形式2或内酯形式或肽内酯的形式或酸形式，内酯在第2部分中定义。在这些实施例的一些中，热处理是在约121℃，21psi下高压灭菌处理20分钟，或者如果肽呈液体形式，则意味着将pH降低至低于7.0，以将肽转化为所谓的如下所述的任一个：峰2、形式2、内酯形式、肽内酯(如在第2部分中定义的内酯)，肽的脱水形式或肽的转化形式。

实施例2

饮食掺入研究。图5中的图示出了与处理或转化后峰2所示的内酯形式的肽或肽内酯的毒性相比，原始形式的肽、峰1、未转化的肽酸的毒性的比较。也将两种形式与对照进行了比较。图5示出在饲喂饥饿的幼崽对照或处理的饮食后第1天、第2天、第3天和第4天的死亡幼虫的百分比(100％将是所有16个幼虫死亡)。本研究中使用的肽是SEQ ID NO.119，并将它们配制成称为粉末618或618混合粉末的喷雾干燥粉末，这两个术语的意思相同。昆虫以其饮食中2ppt(千分之一份)的当量剂量的速率给药。峰1是转化或处理前的原始肽，这也称为“传统618”或简单地618粉末或干粉。峰2是转化或处理后的肽，在这种情况下，在121℃和21psi下(即高温、蒸汽和压力)高压灭菌20分钟后。峰2在图5中被称为“高压灭菌的6-18干粉”。图5提供了在水平轴或X轴的每个数字上面的三组数据或条的条形图形式的数据，所述数字为饲喂在研究中使用的昆虫后的天数，所述昆虫被称为南部玉米根虫(southerncorn rootworm,SCR)，它实际上是昆虫，测试在幼虫阶段进行。使用十六只昆虫幼虫来开始每次试验。图例示于图5中，它说明了于第4天之上的3个分组条右侧的在第4天之上可见大暗条，是饲喂形式2肽内酯给昆虫的结果。质谱的峰2是肽的转化形式2，肽内酯形式。在图5中，在第4天，峰2暗条示出了由幼虫摄取肽的转化形式2的死亡率。在这种情况下，通过对形式1高压灭菌转化形式2。在第4天，与形式1(肽酸)或者天然或未转化的肽的形式约22％的死亡率相比，形式2(肽内酯)的根虫死亡率水平为95％。在第4天，对照具有小于5％的死亡率。为幼虫饲喂未处理的昆虫饮食(即对照)，这为每一天的第一条，图5中的细灰交叉影线。具有较大的黑色和白色交叉线图案的第二条示出了饲喂形式1的肽的幼虫的数据，其由质谱的峰1表示，这是转化前的肽。第三条，具有发现暗条，示出了饲喂形式2的幼虫的数据，其由质谱分析中的峰2所示。饲喂后1-4天示出大多数死亡发生在第4天。Y轴示出了死亡幼虫百分比，并在开始时使用16只活幼虫。

饲喂昆虫后4天，传统618(转化前)与经高压灭菌的618(转化后)之间的死亡百分比差异变得显著。高压灭菌处理在幼虫食用经处理食物后更快速度的死亡。用形式2处理的死亡昆虫数为约95％，相比之下，618干粉形式1、天然肽或未转化的肽形式1为约22％。对常规肽进行高压灭菌未如所预期使杂合蛋白失活，相反，这提高了其活性。可能有许多原因引起效力的急剧变化。

方法：昆虫：SCR购自Crop Characteristics(Farmington,MN)。昆虫作为“准备孵化”在滤纸上接受。在室温下(26C)孵化昆虫并将其置于运送它们的塑料袋中。1-2天后孵化昆虫，并在孵化当天用于测定。

培养基：SCR幼虫饮食购自Bioserve(产品#F9800B,Frenchtown,NJ)。为了制备100mL饮食，将100mL去离子水与提供的1.44g琼脂一起煮沸。煮沸溶液直到琼脂完全溶解。然后，添加13.28g饮食和460ul KOH并在温暖的搅拌板上混合培养基直至均匀。然后将培养基等分为20mL部分，并在水浴中冷却至65C。

处理剂：采用25％AI的计算方法制备了618处理剂。通过混合260mg粉末与6.5mL水制备10ppt溶液(10毫克/毫升)。充分混合溶液，并且如果需要的话，进行超声处理以使所有的粉末完全溶解。将200mg 618粉末放入顶部有螺旋的玻璃瓶中。然后将粉末在盖松开的情况下在20分钟干燥循环中进行高压灭菌。高压灭菌循环之后，粉末已经吸收了一些液体。然后将5ml水加入到粉末，并充分混合至溶解。然后向20mL的65C的食物中添加5mL的水或处理剂，并充分混合，然后使用重复移液器的虫室(bug condos)(Bioserve产品#BAW128)将1mL的DI转移到每个孔，并使其冷却。

然后，一旦培养基冷却即施加昆虫，并设置(20分钟)，每个孔一只，利用漆刷转移SCR。然后用穿孔盖(Bioserve产品#BACV16)密封孔，并留在昆虫实验室光车上。

实施例3

生物测定比较。生物测定的比较结果示于图6和7中。峰1和峰2单独制备，并从液相层析柱单独分离，类似于用于产生图1-4中所示的研究的那些。使用SEQ ID NO：119的肽进行这一比较。取峰1(预转化峰)或峰2(之后转化峰)并制成测量浓缩物，然后通过注射至家蝇内施用。将蝇的LD₅₀或50％致死剂量确定为pmol/克的浓度。蝇称重为12至20mg。每个样品中有10只蝇。在制备标准pmol/g溶液时，未考虑峰1形式和峰值2形式之间的分子量差。制备LD 50溶液的所有溶液均使用RpHPLC或反相高压液相色谱自我们所谓的“超级LC”或超级浓缩液制备。

图6是峰1和峰2的生物测定比较，其中每个峰级分分别由液相色谱制备。示出了峰1制备结果。

图7是峰1和峰2的生物测定比较，其中每个峰级分分别由液相色谱制备。示出了峰2结果。

在下表1中提供了作为致死剂量50的生物测定比较的结果。

下表1。

溶液 LD50(pmol/g)

杂合体+2峰1 127

杂合体+2峰2 92

实施例4

稳定性pH研究。这既是稳定研究也是pH研究。它比较转化前或形式1与转化后或形式2肽。研究中使用SEQ ID NO 119的肽并示出除热以外，pH降低将导致肽从形式1到形式2转化增加，所述pH降低为用酸或任何降低pH的方式降低肽溶液的pH至使其为7.0或更低。

稳定性pH研究结果示于图8-10中。

图8是SEQ ID NO：119在pH 5.6下的质谱。图9是SEQ ID NO：119在pH 3.9下的质谱。图10是SEQ ID NO：119在pH 8.3下的质谱。图8、9和10示出但不具体指明峰1和峰2。在所有三幅图中，峰1在峰2的左侧，并且两者都是图中较大的峰。这三幅图—图8、图9和图10代表了在这项研究中产生的质谱结果。从这些图得到的数据及其他数据示于下表2-7中。峰1在峰2之前洗脱。在图8中，这两个峰的高度大致相同。在图9中，峰2大于峰1。在图10中，峰1大于峰2。通过向2mL超级液体浓缩物(54PPT)中添加2mL pH 2或pH 10的缓冲液来制备该研究中的所有样品。在Agilent HPLC上分析样品。使用5微升注射体积。下文描述了结果。

下表2。

样品1，在pH 3.9和8.3下

观察结果。峰2的高度在这两种pH溶液中略有下降。

下表3。

样品2在25℃下在pH 3.9和8.3下24小时

观察结果。峰2的高度在这两种pH溶液中略有下降。

下表4。

样品3在25℃下在pH 4.0和7.8下96小时

观察结果。峰2的高度在较高pH溶液中有较大下降。

下表5。

样品4在40℃下在pH 3.9和8.3下72小时

观察结果。峰1的高度在较低pH溶液中有下降。峰2在较高pH溶液中有下降。

下表6。

样品5在75℃下在pH 3.9和8.3下1小时

观察结果。峰2高度在较高pH溶液中有轻微下降。

下表7。

样品6在75℃下在pH 3.9和8.3下3小时

*用缓冲液1：3稀释，以得到适当的pH

观察结果。在pH 3.9溶液中峰1高度降低。在pH 7.5溶液中峰2高度降低。在pH 9.4溶液中失去峰2。

本研究示出在它们被溶解在水溶液中并调节至不同的pH或酸度水平后的峰1(转化前肽形式1)和峰2(经转化的肽形式2)。研究披露，在溶液中这是困难的且几乎没有或没有从形态1到形式2的自然迁移。除非pH降低至7.0或更小，优选6.0或更小，更优选5.0、4.5、4,0、3.5、3.0、2.5、2.0或更小、3.2至3.5至3.8并且优选3与4之间的全部pH值，否则肽形式不转化。这项研究还披露，pH越低，形式1越快转化为形式2。形式2是脱水的或更少2H+O，或少18道尔顿形式的肽。

实施例5.

非转化同种型。我们已经示出，SEQ ID NO：119可以在更高温度下形成M.W.损失了18道尔顿的同种型。在实施例2中，我们示出当将SEQ ID NO：1119的原始形式(形式1)作为粉末高压灭菌以使其转化为形式2、然后通过加入南方玉米根虫幼虫组的饮食来测试其时杀虫效力接近5倍增加。然而，在如天然肽SEQ ID NO：121的肽中尚未注意到杂合肽SEQ IDNO：119的该转换。与SEQ ID NO：119相反，在SEQ ID NO：121中存在N端Gln，其本身可环化为N-Pyr同时损失NH₃，即M.W.损失17道尔顿。这两种化学修饰，损失H₂O和损失NH₃难以区分，因为这两个过程中的M.W.的损失是如此接近。我们用分析型HPLC和灵敏的TOF LC/MS方法来评估这两种化学修饰是否均可以发生在如同SEQ ID NO：121这样的序列，而我们也将该序列称为天然杂交肽。下面的数据示出在其经历如本文针对该过程所述的合适条件时可以对天然杂合肽进行诱导转化。

材料和方法。SEQ ID NO：121由杂合体-ACTX-Hv1a K.乳酸菌株pLB12D-YCT-24-L制成。使用具有Onyx 100monolithic C18 HPLC柱的Agilent HPLC系统来分析SEQ ID NO：121的肽生产和同种型形成。

LC-MS系统位于SMIC的发射MI实验室，并且由Waters/Micromass四极杆飞行时间(Q-Tof Premier)在线质谱仪与Waters NanoAcquity UPLC系统组成。将样品在水中的0.1％甲酸中以1:50稀释。

方法A.

将5μL的样品以5uL/min的流速注射到Waters BEH130 C-18对称柱(0.3mm ID×15cm)。使用从0.1％流动相B(含0.1％甲酸的水)至40％流动相B(含0.1％甲酸的100％乙腈)的线性梯度经25分钟实现反相分离，85％B在25.5分钟，85％B在27.5分钟和0.1％B在28分钟。

方法B.

将10-30uLμL样品以1mL/min的流速注射到Waters C-18 X-Bridge柱(4.6mm ID×50mm)。用如下线性梯度实现反相分离：99％流动相A(含0.1％甲酸的水)经15分钟至95％流动相B(含0.1％甲酸的100％乙腈)经6分钟，95％B在11分钟和1％B在11.2分钟，总计运行时间为18分钟。

通过质谱仪经电喷雾电离源对柱流出物进行采样。使用Waters Masslynx4.1软件进行仪器控制及MS和MS/MS数据采集。在Masslynx中，使用MaxEnt 3算法进行多电荷离子去卷积为计算的单一同位素M+H质量值

方法C.

LC-MS系统由Waters/Micromass ZQ光谱仪与电喷雾电离源构成。将样品以1mL/min的流速注射到Zorbax SB-C18柱(2.1×30mm)上。使用二极阵列检测器(210nm至300nm)使用96％流动相A(含0.1％甲酸的水)至98％流动相B(含0.07％甲酸的100％乙腈)的线性梯度经3.1分钟实现反相分离。

结果和讨论.SEQ ID NO：121的生产，又名天然杂合肽，将生产菌株pLB24-YCT-24-L在用2％山梨糖醇作为碳源的限定培养基中于23.5C下培养6天。当在去除细胞后收集条件培养基时，OD600达到30。将300μL的条件培养基注入Agilent HPLC分析系统，并将天然杂合肽的产量确定为164mg/L。

天然杂合同种型的Agilent HPLC评估.在通过Agilent分析型HPLC分析并分别加载300μL之前，将所收集的天然杂合体条件培养基在4C、室温(约23C)和50C下处理24小时。在不同温度下处理的天然杂合肽样品的HPLC色谱示于图11中。以4.2分钟、5.4分钟和6.9分钟的滞留时间鉴定了三个HPLC峰，其中UV吸光度随温度变化。我们认为峰1是最疏水的同种型，而峰3是最疏水的同种型。

峰1，表示形式1，是最初最丰富的亚型，但峰1/形式1可随时间和更高的温度转换成同种型峰2和峰3。我们证明，50℃处理24小时将几乎使峰1消失(至仅5.6％)。相反，峰2和峰3同种型随温度增加，且温度越高，增加越快。

图12示出天然杂合肽的同种型的TOF MS评价结果(飞行时间质谱)。该结果以基峰强度(BPI)色谱的形式呈现。为了鉴定图11中的峰1、峰2和峰3，使用用RT处理的天然肽条件培养基进行飞行时间质谱分析。飞行时间MS可以分隔由MS仪器产生的同位素m/z比，因此该MS法可检测的肽的单一同位素M.W.。天然杂合体的理论单一同位素M.W.是4417.812。该TOFMS检测到在条件培养基样品中的4种天然杂合肽同种型。

通过TOF MS检测的一种同种型是M.W.为4417.6826的同种型，其表示“天然的”天然杂合肽，即未修饰的天然杂合体，其在图11中标记为峰1，和在图12中标记为峰1。

检测到的第二同种型的M.W.为4399.6455。该同种型与“天然”同种型相比有M.W.18道尔顿的损失，指示失去一个水分子。失去H₂O的该同种型未在图11中标记，并且在图12中标记为峰4。

检测到的第三同种型的M.W.为4400.6660。该同种型与“天然”同种型相比有M.W.17道尔顿的损失，且可能失去NH₃。失去NH₃的该同种型在图11中标记为峰2，并且在图12中标记为峰2。由对TEP融合杂合体+2此前的研究，N-Gln肽将天然地环化成N-焦谷氨酸，同时失去NH₃。因此，第三同种型表示具有环化成N-Pyr的N-Gln的肽，因为天然杂合肽具有N-Gln，并且这在图12中作为峰2示出。

第四同种型是H₂O和NH₃分子二者的损失的组合，从而产生M.W.为4382.6313的同种型。在图11中，将损失H₂O和NH₃二者的同种型标记为峰3，和在图12中标记为峰3。

这些结果表明，至少有两种化学修饰可能在天然杂合肽分子中，N-端谷氨酰胺环化成焦谷氨酸和脱水反应二者。根据TOF MS基峰强度色谱，仅失去H₂O的同种型几乎检测不到。这与其中仅检测到3个峰的HPLC评价相一致。H₂O的损失可以使肽更疏水，并且进一步损失NH₃可使甚至更疏水。我们可以预测H₂O的损失将天然杂合体峰迁移到在HPLC色谱中较晚的滞留时间。H₂O和NH₃两者的损失将进一步将峰迁移至甚至更晚的滞留时间。

第2部分

在第1部分，我们描述了如何可能用机械或化学手段(例如温度、压力、强酸和/或弱酸)人工操纵毒性肽以将肽从其天然状态或者我们所谓的形式1转换为我们所谓的形式2的有用状态。形式2组合物可在本文中被称为“羰基”、“活化羰基”、“内酯”、“内酯样”和/或“内酯样形式。”在该文档中，我们通常将该形式2组合物简单地称为内酯或肽内酯。本文档中的这些化合物的结构没有字典的定义，在此它们由我们在此描述的特征来定义。在此，“内酯”具有我们认为的形式2化合物属性的特性。我们使用措辞“内酯”和肽“内酯”，因为这些化合物如同内酯那样反应。我们描述了如何制备它们，如何识别它们，如何分离它们，以及如何使用它们。我们提供的数据显示，这些肽内酯比天然肽更具生物活性，并且它们非常有用和通用。它们是可用来制备其它有价值的化合物的稳定中间体。在第2部分，我们示出了肽内酯如何可以制成可用作稳定中间体以制备各种其他化合物的两种不同且稳定的活性化合物。

在第2部分，我们描述了肽酰肼、肽腙，且我们教导了如何制备和使用它们。所述酰肼或肽酰肼得自第I部分的肽内酯与酰肼的反应。我们将我们描述的其他稳定的中间化合物称为腙或肽腙。肽腙得自肽酰肼与羰基化合物的反应。关于肽腙特别有用的是，他们可以与其他有用的部分(例如烷基链和或聚乙二醇化产物)共价键合，然后用于各种目的，其中一些我们在此有述。以我们描述的方式生成烷基化蛋白质的能力非常有用。以我们描述的方式容易地生产聚乙二醇化的蛋白质的能力甚至更为有用。聚乙二醇化的蛋白质已被用于降低蛋白质的免疫原性、降低蛋白质的代谢以及提高蛋白质的生物利用度。我们相信，此处首次公开的我们的技术可以用于生成具有非凡价值的聚乙二醇化蛋白质。这些技术可用于更容易、更快捷并且以比之前可能的更低的成本制备烷基化和聚乙二醇化的蛋白质以及其它类型的蛋白质。通过聚乙二醇化增强的一种蛋白质是胰岛素。

我们能够证明所述肽内酯、肽酰肼和肽腙，这些可以是“肽中间体，”是用于与其他化合物(如实施例11中的PEG4酮(VIII))反应的新型的、化学稳定的、化学上有用的化合物，并且它们可以是终产品，如实施例11中的聚乙二醇化肽或聚乙二醇化肽腙，其示出具有比未聚乙二醇化的类似毒性肽更高活性的新型聚乙二醇化毒性肽腙。肽内酯和肽酰肼提供在这些肽或肽酸上的可加入官能团的单一离散位点。肽和毒性肽产物和中间体提供具有更有用和更具功能的独特化学合成或生物分子的单个离散的化学柄(chemical handle)。例如，这种化学性质使其用聚乙二醇化链在多肽的单一位点处单官能化。另一个例子是，它可能使其在肽或肽酸(例如高碘酸化消化的糖基化肽或其他碳水合物)上的一个离散位点处单连接分子。这些肽中间体可用于产生广泛范围的产物。我们表明，这些有毒肽中间体是有用的，具有良好的活性并提供比典型的毒性肽更多的反应选择。我们认为聚乙二醇化毒性肽甚至比未聚乙二醇化肽更具活性。

PEG化或聚乙二醇化是肽与聚乙二醇和/或聚丙二醇或(PEG)的连接。一旦连接至肽，每个PEG亚基变得与两个或三个水分子紧密相连，其具有使所述肽更溶于水和使其分子结构更大的双重功能。在第一代蛋白质聚乙二醇化中，PEG连接到蛋白质上的数个潜在位点的一个或多个，例如赖氨酸和N-端胺。这种方法的一个问题是，修饰的肽的群体可以含有以下分子的混合物：含PEG连接到不同的赖氨酸的分子以及具有不同数目的连接的PEG的分子。修饰的这种可变性降低了最终产品的纯度并阻碍再现性。

基本存在用于以更受控的方式向蛋白质添加PEG的其它两种更现代的方法；A)改变所述PEG使其更具反应性或B)改变蛋白质以提供对于PEG连接有特异性的位点。

改变PEG的A)型PEG法描述于US 4,179,337(Davis等，1979年12月18日授权)中，该专利特别是就适合于聚乙二醇化的聚合物的描述通过引用并入本文。该专利描述通过改变末端基团或者通过向肽添加具有活性的偶联基团在一端修饰聚合物，并使活化的聚合物与肽反应。该方法用于使胰岛素及其他激素聚乙二醇化。参见US 4,179,337。

B)型PEG法修饰肽而非PEG，其是在需要时添加半胱氨酸以在经选择对肽生物功能的干扰最小的位置处产生位点特异性PEG化，同时降低肽的免疫原性。PEG-马来酰亚胺、PEG-乙烯基砜、PEG-碘乙酰胺和PEG邻吡啶基二硫化物是创建以使游离的半胱氨酸残基PEG化的硫醇反应性PEG。这种方法已经以许多方式使用，包括制备单PEG化人生长激素类似物。参见Peptide PEGylation:The Next Generation,Baosheng Liu,PharmaceuticalTechnology，第35卷。

本文中所描述的方法与此前所用的任何方法相比是一种新型且不同的方法，并且它允许将PEG特异性连接至蛋白质上的特定位点。我们描述的新方法提供了利用与肽酰肼的PEG羰基反应的PEG连接至肽，并且在下文中详述。其可使用选自聚乙二醇和聚丙二醇的分子量为约500至约20,000道尔顿的任何直线或支链聚合物。该聚合物可未被取代或者被其中取代基具有少于5个碳原子的烷氧基或烷基所取代。能够制备PEG毒性昆虫肽的益处是显著的，并在本发明的上述概述中有述。

一般反应.

I)肽酰肼.

肽酰肼由肽内酯(见第1部分)和肼制备以形成肽酰肼。肽酰肼基本上由三步程序制成。将肽内酯与肼一水合物混合。将混合物搅拌成溶液以形成肽酰肼，并对所述肽酰肼进行纯化。

本领域的普通技术人员将能够得出许多版本的该程序，例如，应充分搅拌肽内酯与酰肼的混合物以形成溶液。然后可以通过各种方法(例如通过制备型HPLC)纯化形成在该溶液中的肽酰肼。

我们教导混合肽内酯的水溶液和作为酰肼一水合物添加的酰肼溶液二者，然后在室温下充分搅拌。然后可纯化该肽酰肼。我们用HPLC进行纯化，本领域技术人员已知的其他选择是可用的。这种类型的程序对于普通化学家而言是公知的，并且本文阐述的程序可以由本领域技术人员改变相当大。可以采用用于收集和纯化的其他选择。在以下实施例中，使用内酯的相对纯和不纯样品两者作为原料，并且这两者均导致高纯度的肽酰肼(I)，并描述于实施例6中。可以使用其他程序。在实施例6a和6(b)中，将肽内酯和酰肼混合在一起并搅拌。纯化步骤可大大不同，且可获得多种选择，并且这些选择对本领域技术人员而言是已知的。

II)肽腙.

肽腙和肽酰肼是重要的中间体。不同类型的肽腙可以根据肽所需的官能团制备。在此，我们示出不同的肽腙的各种实例。腙的实例示于实施例8-11中。本领域的技术人员将理解这些只是代表性和说明性的非限制性实例，可使用其它的试剂和条件。

这些实施例使用肽酰肼与一种或另一种类型的羰基，以产生新型肽腙，如式(II)、(III)、(VI)和(IX)的实例。提供了产生新型聚乙二醇化的蛋白质的反应性羰基化合物的一些实例。

向酰肼中添加己醛以产生腙(II)。

上面讨论的反应示于下文描述中详细提供的下面的结构中，而支持数据可见于图13-26中。

实施例6示出了被称为肽酰肼(I)或酰肼(I)的肽酰肼可以由肽内酯制成。质谱数据提供于图13和14中。

实施例7提供的数据示出了当将肽的常规酸形式制成其酰肼形式时，肽酰肼更快发挥作用。用于两种化合物的毒性肽始于杂合体+2。将杂合体+2转化成酰肼后，两种化合物(肽酸形式和肽酰肼形式)是不同的化合物，但它们非常相似并具有相同的肽主链。净差异基本上是添加一种具有酰肼的肽以生成杂合体+2的酰肼(I)。然后在蝇上对这两个样品进行测试。将样品之一，肽的常规酸形式或肽的酰肼形式(即酰肼(I))暴露于两组蝇中的之一。将一组蝇暴露于酰肼形式的毒性肽(即酰肼(I))，将另一组蝇暴露于呈其天然酸形式的毒性肽。下文实施例7中提供的数据示出酰肼比相同肽的天然酸形式更快杀死昆虫。

实施例8示出己醛如何可以被用来制备肽的腙形式。实施例8始于酰肼(I)，添加己醛，并且结果是腙，在此被称为式(II)或腙(II)。质谱数据提供于图15和16中。

实施例9提供了与实施例8不同的腙的制备。在实施例9中，使用化合物“O-[2-6-氧代己酰基氨基)乙基]-O'-甲基聚乙二醇(IV) ”来制备肽腙。质谱数据提供于图17和18中。

实施例10示出了用于制备腙的另一种方法。在此，其为由酰肼和丙烯酸酮制备的腙。其为用丙烯酸酮(V)由酰肼(I)制备腙(VI)。质谱数据提供于图19-22中。

实施例11描述了使用PEG4酮(VIII)制备腙(IX)。这个实施例始于实施例11(a)，其中3-乙酰基丙烯酸和碳二亚胺可用于制备PEG4酮(VIII)。然后，实施例11(b)中，使用PEG4酮(VIII)和酰肼I制备腙(IX)。质谱数据提供于图23-26中。

实施例6-11.细节和数据

示出了描述其天然酸形式的肽的代表性式，在第1部分中描述的肽内酯和第2部分的肽酰肼。其他肼和腙在实施例8-11中描述。

实施例6.肽酰肼(I)的制备

该实施例示出了两种制备肽酰肼(I)的方法。在第一种方法中，实施例6(a)肽内酯的起始溶液是相对纯的，来自HPLC制备。在第二种方法中，实施例6(b)肽内酯的起始溶液不太纯并含有形式1和形式2，即存在肽与肽内酯混合。这两个程序产生同一质谱的肽酰肼。

实施例6(a).用100uL酰肼一水合物处理100mg纯化形式2肽、肽内酯在1mL水中的溶液，并在室温下搅拌2小时。将材料在制备型HPLC(用乙腈/水/三氟乙酸的梯度洗脱)上分批纯化。合并合适的级分，并在真空下浓缩至减少的体积。将该液体在冷冻机中于-80℃下冷冻，并在冻干机上冻干以得到36.94mg呈白色固体的肽酰肼(I)。

实施例6(b).将超级液体浓缩液(形式1和形式2肽的混合物，又名肽内酯，14mg/mL)中的溶液(25毫升)在75℃下搅拌过夜。冷却后，HPLC示出大多数为形式2肽，肽内酯。用2mL酰肼一水合物处理该溶液，并在室温下搅拌2小时。在制备型HPLC(用乙腈/水/三氟乙酸的梯度洗脱)上分批纯化该材料。合并合适的级分，并在真空下浓缩至减少的体积。将该液体在冷冻机中于-80℃下冷冻，然后在冻干机上冻干以得到252.2mg呈白色固体的肽酰肼(I)。通过方法B的酰肼(I)LCMS ESI/MS 4578.00(M+H)，滞留时间3.6-4.1分钟。参见图13和14。

实施例7.与杂合体+2相比，向蝇注射酰肼(I)。

在实施例7中，我们对其典型的酸形式(形式1)或肽形式(在转化为肽酰肼后具有相同的毒性肽)或如在本文提供的式中标记的肽酰肼(I)进行比较。制备下列样品用于注射：

1.酰肼(I)在水中的100ng/uL溶液。用水稀释该溶液以制备50ng/uL和5ng/uL溶液。

2.杂合体+2在水中的100ng/uL溶液。用水稀释该溶液以制备50ng/uL和5ng/uL溶液。

制备具有适当标签的注射蝇容器，并用18号针头在容器盖子打出空气孔。选择蝇。在完全孵出之后1日和2日使用蝇，并且第1天是完全孵出的当天。打开CO₂气体管线并通过用针输入CO₂气体将蝇固定在框中。蝇被固定后，将蝇转移至CO₂板，并让他们睡觉。将蝇集中，并使用那些质量为12至18mg的蝇进行注射生物测定。

进行注射。向带有30号针头的1ml注射器加载100-200μl溶液并加所述加载的注射器安装入微量敷料器。通过转动微量敷料器的推杆从注射器除去气泡。然后设置注射体积为在微量敷料器中0.5μl。通过转动推杆从背胸部向家蝇注射0.5μl以上制备的溶液。向以上制备的各溶液注入10只蝇。把经注射的蝇置于准备的带具有空气孔的盖的杯子中。加入2Whatman#4，4.2cm滤纸片上。加入1mL无菌纯水。保持经注射的全部蝇在室温。注射后3小时、5小时、21小时和24小时，记录经注射的蝇。如果阴性对照中存在超过20％的死亡率，则如上所述重新进行蝇注射。在所有四个得分的时间点，水和麻醉对照具有0％的死亡率。

在5小时时间点，100ng/uL浓度的酰肼有80％的死亡率，而相同浓度的杂合体+2达到10％的死亡率。

实施例8.腙(II)来自己醛

用0.16uL(0.00133mmol)己醛在10uL无水乙醇中处理5mg(0.00109mmol)酰肼(I)在100uL水中的溶液。将混合物搅拌1小时。制成5mg己醛和2.86uL乙酸在490uL无水乙醇中的储液。用10.9uL原液处理反应物，且在混合后静置2小时。将混合物在下加热1小时。方法B的LCMS ESI/MS 4661.60(M+H，腙)，滞留时间6.8-7.1分钟。参见图15和16。

实施例9.腙(Ⅲ)来自O-[2-(6-氧代己酰基氨基)乙基]-O'-甲基聚乙二醇(IV)

用1滴乙酸处理O-[2-(6-氧代己酰基氨基)乙基]-O'-甲基聚乙二醇(IV)(10.9毫克)在100uL无水乙醇中的储液。注意：O-[2-(6-氧代己酰基氨基)乙基]-O'-甲基聚乙二醇(MW-2'000)是MW分布在约2000的化合物的混合物，而不是单一的化合物。用22uL(0.0012mmol)的O-[2-(6-氧代己酰基氨基)乙基]-O'-甲基聚乙二醇(IV)的储液处理5mg(0.00109mmol)酰肼(I)在100uL水中的溶液。混合后，将混合物在室温下静置。分批加入O-[2-(6-氧代己酰基氨基)乙基]-O'-甲基聚乙二醇(IV)的储液的剩余部分，并使混合物在混合后静置过夜。方法B的LCMS ESI/MS滞留时间7.2-7.6分钟参见图17和18。

实施例10.使用丙烯酸酮(V)来自酰肼(I)的腙(VI)

实施例10(a).丙烯酸酮(V)的制备

在氮气下，将0.5g(4.38mmol)的3-乙酰基丙烯酸、0.924g(4.82mmol)的N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和0.651g(4.82mmol)的1-羟苯并三唑水合物(HOBt)在4mL二氯甲烷和4mL四氢呋喃中的混合物在氮气下在室温下搅拌10分钟。将反应物在冰浴中冷却并用0.443g(4.38mmol)己胺在8mL二氯甲烷中的溶液处理。将反应物搅拌冷却1小时，并在室温下过夜。用二氯甲烷稀释反应物并用饱和碳酸氢钠溶液然后用水洗涤有机物。经硫酸镁干燥有机层，过滤并真空浓缩，得到黄色固体。将该固体溶解在二氯甲烷中并在硅胶柱(用50％乙酸乙酯/己烷洗脱)上纯化。合并适当的级分并真空浓缩，得到537.06mg呈白色固体的丙烯酸酮(V)。方法C的LCMS ESI/MS 198.1(M+H)，196.2(M-H)。参见图19和20。

实施例10(b).来自丙烯酸酮(V)的腙(VI)

将5mg(0.00109mmol)的酰肼(I)在150uL水中的溶液用0.96mg(0.0048mmol)的丙烯酸酮(V)在48uL的无水乙醇中分批处理。在每次添加之后搅拌混合半小时，然后过夜。方法B的LCMS ESI/MS 198.24(M+H,丙烯酸酮)；4760.60(M+H，腙)，滞留时间5.1-5.8分钟。参见图21和22。

实施例11.使用由3-乙酰基丙烯酸制备的PEG4酮(VIII)的腙(IX)

实施例11(a).PEG4酮(VIII)的制备

将137.6mg(1.21mmol)的3-乙酰基丙烯酸、254.3mg(1.327mmol)的N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和179.25mg(1.327mmol)的1-羟苯并三唑水合物(HOBt)在1mL二氯甲烷和1mL四氢呋喃中的混合物在氮气下于室温下搅拌10分钟。在冰浴中冷却该反应午，并用250mg(1.21mmol)的m-PEG4-胺(VII)在2mL的二氯甲烷中的溶液处理。将反应物搅拌冷却1小时，并在室温下过夜。用二氯甲烷稀释该反应物，并用饱和的碳酸氢钠水溶液接着用水洗涤有机物。经硫酸镁干燥有机层，过滤并在真空下浓缩以得到302.29mg呈油状物的PEG4酮(VIII)。方法C的LCMS ESI/MS 304.1(M+H),302.1(M-H)。参见图23和24。

实施例11(b).使用PEG4酮(VIII)的腙(IX)

用2.0mg(0.0066mmol)的PEG4酮(VIII)分批处理5mg(0.00109mmol)的酰肼(I)在150uL的水中的溶液。在每次添加后搅拌混合物半小时。方法B的LCMS ESI/MS 304.28(M+H，PEG4酮)；4867.70(M+H，腙)滞留时间4.7-5.1分钟。参见图25和26。

所述实施例旨在说明但不限制权利要求和所要求保护的本发明。可以预期本领域普通技术人员能够对本文所示内容作出多种变化并得到不同的版本。

Claims

1.一种提高包括毒性肽的肽的活性或毒性的方法，所述方法任选地以字母顺序包括以下步骤：

a)将所述肽与水混合以制备液体或半液体形式的所述肽的水溶液或水乳液，其中所述水溶液或水乳液由至少10％的水组成；

b)测量所述肽在所述水溶液或水乳液中的pH；

c)将所述溶液或乳液的pH调节至低于pH 7.0。

2.根据权利要求1所述的方法，其中将所述溶液或水乳液调节至约1.0至约6.5；约2.0至约6.0；约2.5至约5.5；约3.0至约5.0；约3.0至约4.0的pH；或调节至约3.2、3.4、3.5、3.6或3.8的pH。

3.根据权利要求1所述的方法，其中使用强酸或弱酸进行所述pH调节；其中如果使用强酸，则所述强酸pH调节选自任何下述酸或酸的组合：氯酸(HClO₃)、盐酸(HCl)、氢溴酸(HBr)、氢碘酸(HI)、磷酸(H₃PO₄)、硫酸(H₂SO₄)、高氯酸(HClO₄)和硝酸(HNO₃)，注意使用选自磷酸、硫酸或硝酸的强酸：其中如果使用弱酸，则单独或组合使用选自乙酸和/或草酸的弱酸进行所述弱酸pH调节。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，在所述pH调节期间，将所述水溶液或水乳液暴露于热，包括干热，即无蒸汽或压力的温度升高；或者有压力和或蒸汽；或其任何组合，并且其中任选地在所述pH调节后，将所述肽干燥为干粉或颗粒形式。

5.一种在所述肽在水溶液或乳液中时从肽除去任何一个或更多个共价结合的2H+O或分子的方法，其通过将所述溶液或乳液的pH降低至低于7.0进行。

6.根据权利要求1-5所述的方法，其使用任何肽、任何毒性肽、序列表中的任何肽；为SEQ ID NO.119的肽；为SEQ ID NO.121的肽，说明书和权利要求书中所述的任何肽。

7.一种来自如权利要求1-6所述的方法的毒性肽的所述肽的杀虫组合物，其在适于施加于待用所述肽或毒性肽处理的昆虫所在地的制剂中。

8.一种毒性肽，其中除去了任何一个或更多个共价结合的2H+O或分子，所述肽在水溶液或乳液中的pH降低至低于7.0。

9.一种提高肽的毒性和/或活性的方法，其包括以下步骤：

a)将所述肽制备为纯的形式1或肽酸或含少于约10％的水的组合物，

b)将所述形式1肽或肽酸置于可控室或加热平台中；

c)在有或无压力下，在有或无蒸汽下，将所述肽加热至期望的温度；

d)将所述加热的肽维持在期望的温度、压力和蒸汽下，直至期望量的形式1肽或肽酸转化为形式2肽或肽内酯；

任选地和独立地，其中在如下条件下进行步骤a)至d)：

任选地和独立地，其中所述可控室可维持温度为0至500℃，且压力为大气压力至500psi；

任选地和独立地，其中将所述肽加热至约如下温度；加热至至少约10℃，但不超过选自约200℃、300℃或至多400℃的最大温度；

任选地和独立地，其中将所述肽加热至至少选自约如下任何温度、温度范围或温度范围的组合的温度：10℃至20℃、20℃至30℃、30℃至40℃、40℃至50℃、50℃至60℃、60℃至70℃、70℃至80℃、80℃至90℃、90℃至100℃、100℃至110℃、110℃至120℃、120℃至130℃、130℃至140℃、140℃至150℃、150℃至160℃、160℃至170℃、170℃至180℃、180℃至190℃、190℃至200℃、200℃至210℃、210℃至220℃、220℃至230℃、230℃至240℃、240℃至250℃、250℃至260℃、260℃至270℃、270℃至280℃、280℃至290℃、290℃至300℃、300℃至400℃以及400℃至500℃；

任选地和独立地，其中所述压力选自任何如下压力或压力范围：a)约10psi至约40psi，b)约15psi至约35psi，c)约18psi至约25psi，d)约21psi；

任选地和独立地，其中根据所选温度和压力将所述肽在所述所选温度和压力范围下维持如下时间段：a)约5分钟至约40分钟；b)约10分钟至约30分钟；c)约15分钟至约25分钟；d)约21分钟；

任选地和独立地，其中加热所述肽至并维持在如下温度和压力和时间：a)约100℃至约140℃；约10psi至约40psi的压力；持续约5分钟至约40分钟；b)约110℃至约130℃；约15psi至约35psi的压力；持续约10分钟至约30分钟；c)约115℃至约125℃；约18psi至约25psi的压力；持续约15分钟至约25分钟；d)约121℃；约21psi的压力；持续约20分钟；

任选地和独立地，其中所述压力不高于大气压力，且所述温度选自至少50℃至60℃或更高的温度；

任选地和独立地，其中使用如下温度；温度范围或温度范围的组合：50℃至60℃；60℃至70℃；70℃至80℃；80℃至90℃；90℃至100℃；100℃至110℃、110℃至120℃、120℃至130℃、130℃至140℃、140℃至150℃、150℃至160℃、160℃至170℃、170℃至180℃、180℃至190℃、190℃至200℃、200℃至210℃、210℃至220℃、220℃至230℃、230℃至240℃、240℃至250℃、250℃至260℃、260℃至270℃、270℃至280℃、280℃至290℃、290℃至300℃、300℃至400℃以及400℃至500℃。

10.根据权利要求9所述的方法，其中根据所提供的任何多步骤程序处理所述肽，包括其中将所述肽：

a)加热并在超过约100℃的温度下维持至少约1小时；

b)加热并在约80℃至约120℃的温度下维持至少约2小时；

c)加热并在约50℃至约80℃的温度下维持至少约3小时；

可选地，其中将所述肽

a)加热并在超过约180℃的温度和至少约5psi的压力下维持至少约5分钟；

b)加热并在超过约100℃的温度和至少约10psi的压力下维持至少约10分钟；

c)加热并在约80℃至约120℃的温度和至少约10psi的压力下维持至少约30分钟；或

d)加热并在约50℃至约80℃的温度下维持至少约1小时；

可选地，其中将所述肽：

a)加热并在约200℃至约300℃的温度和约5至约10psi的压力下维持约5至约10分钟；

b)加热并在约150℃至约200℃的温度和约10至约30psi的压力下维持约5至约30分钟；

c)加热并在约80℃至约150℃的温度和约10至约20psi的压力下维持约20至约60分钟；或者

d)加热并在约50℃至约80℃的温度和约10至约40psi的压力下维持约30至约60分钟；

可选地，其中将所述肽

a)加热并在约110℃至约130℃的温度和约10至约20psi的压力下维持约10至约20分钟；或

b)加热并在约121℃的温度和约21psi的压力下维持约20分钟。

11.制备方法，和通过将昆虫捕食者肽从肽内酯形式转化为肽酰肼形式的方法制备的肽酰肼产物，所述方法包括将昆虫捕食者肽内酯与酰肼混合并纯化以得到所述肽酰肼。

12.根据权利要求11所述的方法和产物，其中在水中制备所述肽内酯，添加酰酰肼单水合物，并搅拌混合物以形成所述肽酰肼，将所述肽酰肼任选地将其冷冻、解冻和纯化以得到经纯化的肽酰肼。

13.根据权利要求12所述的方法和产物，其中所述昆虫捕食者肽的大小为约20个氨基酸至约50个氨基酸不等，并且具有2、3或4个胱氨酸键，或者可选地具有3或4个胱氨酸键。

14.根据权利要求13所述的方法和产物，其中使用序列表中的任何肽和序列表中的任何肽或者与序列表中的任何肽具有大于80％同源性的任何肽或者具有大于85％、90％、95％或99％同源性和3或4个胱氨酸键的任何序列制备所述肽内酯。

15.根据权利要求14所述的方法和产物，即根据权利要求14所述的杂合体+2肽，其中可以使用方法a或方法b，包括：

方法a；a)从100mg的纯化形式2肽、所述杂合体+2肽内酯在1mL水中的溶液开始，

b)用100uL酰肼单水合物处理1mL的100mg肽内酯，并在室温下搅拌以形成所述肽酰肼，任选地持续2小时，

c)在制备型HPLC上纯化肽酰肼溶液(用乙腈/水/三氟乙酸的梯度洗脱)，

d)选择合适的肽酰肼级分

e)合并合适的肽酰肼级分并在真空下浓缩以减小体积，

f)在低于零度下，任选地在-80℃下，冷冻减小体积的肽酰肼，

g)任选地在冻干机上冻干所述杂合体+2肽酰肼，以得到杂合体+2肽酰肼(I)；

或者方法b，其中方法b包括：

a)任选地在约50℃至90℃下、任选地在75℃下搅拌25mL的超级液体浓缩物的溶液，所述超级液体浓缩液是形式1、肽酸和形式2的混合物，

b)使所述溶液冷却，

c)用任选地2mL酰肼单水合物处理溶液，并任选地在室温下搅拌2小时

d)在制备型HPLC上纯化部分，任选地用乙腈/水/三氟乙酸的梯度洗脱

e)任选地在真空下合并和浓缩级分，减小体积，

f)冷冻剩余的液体，任选地在-80℃下冷冻，并冻干以产生杂合体+2肽酰肼。

16.制备方法，和通过将昆虫捕食者肽从肽酰肼转化为所述肽腙的方法制备的肽酰肼产物，所述方法包括：

a)混合酰肼的水溶液，并添加于乙醇中的己醛，搅拌，

b)用由己醛、乙酸和乙醇制备的储液处理，搅拌，

c)添加由己醛、乙酸和乙醇制备的储液，

d)混合，静置，然后任选地加热以产生腙。

17.根据权利要求16所述的方法和产物，其中所述产物是所述肽腙(II)，所述方法包括：

a)混合肼(I)的水溶液与于乙醇中的己醛，搅拌，

b)添加一些根据权利要求16所述的储液，

d)混合并静置，然后任选地加热以产生腙(II)。

18.制备方法，和通过将昆虫捕食者肽从肽酰肼转化为肽腙的方法制备的肽酰肼产物，所述方法包括：用强酸或弱酸酸化复合二醇，添加酰肼并混合均匀以制备肽二醇腙。

19.根据权利要求18所述的方法和产物，其中所述产物是所述肽腙(III)，所述方法包括：

a)向称为O-[2-(6-氧代己酰基氨基)乙基]-O'-甲基聚乙二醇(IV)的化合物的混合物在乙醇中的储液中添加1滴乙酸，

b)使用步骤a中用乙酸处理的O-[2-(6-氧代己酰基氨基)乙基]-O'-甲基聚乙二醇(IV)(MW～2'000)储液，并将其添加至酰肼(I)的水溶液，

c)混合并使其在室温下静置，

d)分批添加余下的所述O-[2-(6-氧代己酰基氨基)乙基]-O'-甲基聚乙二醇(IV)(MW～2'000)储液，并在混合后使所述混合物静置过夜以产生肽腙(III)。

20.制备方法，和通过将昆虫捕食者肽从肽酰肼转化为肽腙的方法制备的肽酰肼酮产物，所述方法包括向酰肼中添加丙烯酸酮以制备腙。

21.根据权利要求20所述的方法和产物，其中所述产物是所述肽腙(VI)，所述方法包括向酰肼(I)的水溶液添加于乙醇中的丙烯酸酮(V)并混合。

22.根据权利要求20所述的方法和产物，其中所述产物是所述肽腙(IX)，所述方法包括向酰肼(I)的水溶液中添加PEG4酮(VIII)，并混合以制备腙(IX)。

23.一种制备肽的方法和或通过所述方法产生的肽和或通过所述方法产生的杀虫组合物，所述方法被描述为从肽去除任何一个或更多个共价结合的2H+O或H₂O或分子；包括具有如本文所述或见于说明书或权利要求书中的单独或组合的任何条件、温度、压力和pH或酸性条件下去除了任何一个或更多个共价结合的2H+O或分子的任意毒性肽；包括由说明书和权利要求书中所述的任何程序产生的肽、酰肼或腙的任一种，或者这些肽的任一种作为通过说明书和权利要求书中所述任何方法产生、然后用于适于应用于昆虫所在地的制剂中的的肽的杀虫组合物的用途。