JP2020180160A - 人工的に活性化した毒性ペプチド - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は2014年4月4日に出願された米国特許出願No.61/975,147の優先権を主張するものであり、その内容全体は参照により本明細書に援用される。
本出願は、2015年4月3日に作成され、本明細書と共に電子的に提出されている「FAM_N_PRV_SEQ_LISTING_2015_04_03_ST25.txt」(106,014バイト)というタイトルの配列表全体を包含する。
定義は、その記載、実施例、及び請求項の出願全体を考慮して解釈及び理解すべきである。
本明細書では、熱単独、温水、蒸気と組み合わせた熱、熱と圧力、及び/または独立した酸処理を含む様々な処理が述べられ、これらの処理によっていくつかのペプチドの活性を処理される前よりも約5倍大きい活性に増加させることができる。高温及び高圧の下でこれらの活性が失われず、これらのペプチドの活性は飛躍的な活性の増加を示した。我々は、この変化の特性、並びに、我々が生理学的に活性なペプチド及びまたは毒性ペプチドと称するペプチドを含む、いくつかのペプチドの活性を低下させるのではなく向上させるために使用することができる条件と、温度、圧力、及びpHの範囲について示す。
蒸気あり:a)110C、30psi、20分;b)120C、15psi、15分;c)130C、30psi、容器及び「変換」がされたか否かに応じて3分、8分、10分〜15分。
蒸気なし(乾燥した常圧):a)120C、0psi、12時間;b)130C、0psi、6時間;c)140C、0psi、3時間;d)150C、0psi、2.5時間;e)160C、0psi、2時間;f)170C、0psi、1時間。
我々は、以降で詳細に述べるものを含む、数多くのペプチドが「変換」に好適であると考えている。毒性昆虫ペプチドすなわち昆虫捕食者ペプチドは、2個、3個、または4個のシスチン結合を有しており、これはそれらが4個、6個、または8個のシステインを有していることを意味する。これらは約10個超のアミノ酸残基かつ約300個未満のアミノ酸残基のペプチドである。より好ましくは、これらはアミノ酸すなわちaaサイズが約20aa〜約50アミノ酸の範囲である。これらは約550Da〜約350,000Daの分子量の範囲である。これらは高い熱及び低いpHに曝された場合に、驚異的な安定性を示す。毒性昆虫ペプチドは、いくつかのタイプの殺虫活性を有する。典型的には、これらは昆虫に注入された場合に活性を示すが、多くは昆虫に局所的に適用する場合にはほとんど活性を示さない。毒性昆虫ペプチドの殺虫活性は、様々な方法で測定される。測定の一般的な方法は当業者に周知である。そのような方法としては、麻痺、死亡率、体重増加不良などの様々なパラメーターの評価に基づく用量−反応プロットのフィッティングによる反応用量の中央値(例えばLD50、PD50、LC50、ED50)の決定が挙げられるが、これらに限定されない。測定は、当該の殺虫性製剤の様々な用量に曝露される昆虫のコホートに対して行うことができる。データの分析は、プロビット分析及び/またはヒルの式等によって規定される曲線を形成することによって行うことができる。そのような場合、用量は皮下注射によって、高圧注入によって、食料または餌の試料の一部としての殺虫性製剤の提示によって、等で投与されるであろう。
配列番号119は、GSQYCVPVDQPCSLNTQPCCDDATCTQERNENGHTVYYCRAである。配列番号119は41個のアミノ酸を有している。適切に折り畳まれた場合、これは3つのジスルフィド結合を有する。これは、C185H276N56O68S6の元素組成を有する。配列番号119は、「+2ハイブリッド」、「ハイブリッド+2」、または「プラス2ハイブリッド」と呼ばれる場合がある。
マススペクトルグラフのピーク1/形態1及びピーク2/形態2。図1〜4では、以下に示される説明文及び記載と共に配列番号119のマススペクトルグラフが示されており、これは2つの明瞭なピークを有している。この2つのピークは、太字の大きい数字と、数字を指す括弧状の矢印で特定されている。我々は、この2つのピークをピーク1及びピーク2という。これらの図中のスペクトルは、WatersのNanoAcquity UPLCシステムで、オンラインでWater/Micromass四重極−飛行時間型(Q−Tof Premier)質量分析計を使用して生成し、分析した。
図4は、図3に示されているピーク2のデコンボリューションされたスペクトルでの、配列番号119のマススペクトルであり、4544.8838の質量値を有する。
ペプチド並びにピーク1及びピーク2によって示されるその形態は単離され、その活性が比較された。以下の実施例に、ペプチドのピーク1、形態1、ネイティブ、酸形態、ペプチド酸、元の、「変換」前、未変換、または「変換」されてない形態、のいずれかとして呼ばれる元々の形態の活性の比較が示されている。形態1は、パート2で規定されているラクトンのような形態2あるいはラクトン形態あるいはペプチドラクトンへと変わるために熱をかけられるか酸性化される形態あるいは酸形態である。これらの実施例のいくつかでは、熱処理は21psi、約121℃で20分のオートクレーブ処理である。あるいは、ペプチドが液体の形態の場合には、これはペプチドを、ピーク2、形態2、ラクトン形態、ペプチドラクトン(ラクトンはパート2で定義される)、ペプチドの脱水形態、またはペプチドの「変換」された形態、のうちのいずれかとして呼ばれるものへと「変換」するために7.0未満のpHに下げることを意味する。
飼料混入試験。図5のグラフは、ピーク2で示されるラクトン形態のペプチドの、あるいはペプチドラクトンの、処理後の、あるいは「変換」された、ペプチドの毒性と比べた、元の形態、ピーク1、ペプチド酸、未変換、のペプチドの毒性の比較を示している。両方の形態は対照とも比較される。図5は、空腹の幼虫に対照の飼料または処理した飼料を与えた後の1日目、2日目、3日目、及び4日目の幼虫死亡率(100%は16匹すべての幼虫が死亡)を示している。この試験で使用されたペプチドは配列番号119であり、これらは粉末618または618ハイブリッド粉末(両方の語は同じ意味である)と呼ばれる噴霧乾燥粉末に製剤された。飼料中に2ppt(1000分の1)相当の用量割合で昆虫に投与した。ピーク1は「変換」または処理前の元のペプチドである。これは、「従来型618」、または単に618粉末もしくは乾燥粉末とも呼ばれる。ピーク2は、「変換」あるいは処理後の、この場合では121℃、21psi(すなわち高温、蒸気、及び圧力)で20分間のオートクレーブ処理後のペプチドである。ピーク2は、図5で「オートクレーブ処理された6−18乾燥粉末」と名付けられている。図5は、水平軸すなわちX軸上の各数字に対して3つの組のデータすなわち棒についての、棒グラフの形態でのデータを示している。この数字は試験に使用した昆虫(ジュウイチホシウリハムシ(southern corn rootworm(SCR))と呼ばれる実際の昆虫)に餌を与えた後の日数であり、試験は、幼虫期に対して行われた。各試験を始めるために16匹の昆虫の幼虫が使用された。凡例が図5に示されており、これは、4日目の上の3つ組の棒の右にある4日目の上に見られる大きい暗い棒が、形態2のペプチドラクトンを昆虫に与えた結果であることを説明している。マススペクトルのピーク2は、ペプチドの「変換」された形態2、ペプチドラクトンの形態である。図5において、4日目のピーク2である黒い棒は、ペプチドの「変換」された形態2を幼虫に摂取させたことによる死亡率を示している。この事例では、形態2は形態1をオートクレーブ処理することによって「変換」された。4日目では、形態1、ペプチド酸、またはネイティブのもしくは未変換のペプチドについては約22%の死亡率なのに対し、形態2、ペプチドラクトンは95%のレベルのウリハムシ死亡率である。4日目の対照は5%未満の死亡率である。幼虫には、未処理の昆虫飼料すなわち対照も与えられた。これは、図5の細かいグレーのクロスハッチであるそれぞれの日の1番目の棒である。より大きい白と黒のクロスハッチ模様の2番目の棒は、マススペクトルのピーク1によって示される「変換」前のペプチドである形態1のペプチドの餌が与えられた幼虫についてのデータを示している。微細な暗色の棒の3番目の棒は、マススペクトル分析のピーク2によって示される形態2の餌が与えられた幼虫についてのデータを示している。餌を与えた後の1〜4日目が示されており、ほとんどの死亡が4日目に生じている。Y軸は死亡した幼虫の割合を示しており、初めに16匹の生きている幼虫が使用された。
培地:SCRの幼虫の飼料は、Bioserve(製品番号F9800B、ニュージャージー州フレンチタウン)から購入した。100mLの飼料を作るため、100mLの脱イオン水を1.44gの準備された寒天と共に沸騰させる。寒天が完全に溶解するまで溶液を沸騰させる。その後、13.28gの飼料と460μlのKOHを添加し、培地を温かい撹拌プレート上で均一になるまで混合する。その後、培地を20mLずつ分割し、水浴中で65Cまで冷却する。
バイオアッセイの比較。バイオアッセイ比較の結果は表6及び7に示されている。ピーク1及びピーク2は、図1〜4に示されている試験を行うために使用されたものと同様に、別個に用意され、別個に液体クロマトグラフィーカラムから単離された。配列番号119のペプチドはこの比較のために使用された。「変換」前ピークであるピーク1、または「変換」後ピークであるピーク2のいずれかを取り出して測定された濃縮物を作り、その後、これを注射によってイエバエに投与した。LD50すなわちハエの50%致死量は、pmol/gの濃度として決定された。ハエは12〜20mgの重さであった。各試料に10匹のハエが存在した。ピーク1の形態とピーク2の形態の分子量の差は、基準のpmol/g溶液を調製する際に考慮しなかった。LD50溶液を形成する全ての溶液は、我々が「スーパーLC」またはスーパーリキッド濃縮物と呼ぶものから、RpHPLCすなわち逆相高圧液体クロマトグラフィーを使用して製造した。
安定性pH試験。これは、安定性とpHの試験の両方であった。これは、「変換」前すなわち形態1と、「変換」後すなわち形態2のペプチドとを比較する。この試験は配列番号119のペプチドを使用した。この試験は、熱に加えて、pHを下げると、すなわち酸またはpHを7以下にするための任意の手段によってペプチド溶液のpHを下げると、形態1から形態2へのペプチドの「変換」が増加する結果になることを示す。
安定性pH試験の結果は図8〜10に示されている。
5μLの注入体積を用いた。結果は下に記載されている。
「変換」なしのアイソフォーム。我々は、配列番号119が高温で分子量中の18ダルトンを失ってアイソフォームを形成し得ることを示した。実施例2では、我々は粉末としての配列番号119の元々の形態、形態1を、形態2に「変換」するためにオートクレーブ処理し、これをジュウイチホシウリハムシの幼虫群の飼料に添加することによって試験した場合に、殺虫効果が約5倍に増加することを示した。しかし、ハイブリッドペプチドである配列番号119におけるこの変形は、天然型ペプチドである配列番号121のようなペプチドでは注目されていなかった。配列番号119とは対照的に、配列番号121にはN末端Glnが存在し、これはそれ自体がNH3を失って、すなわち分子量中の17ダルトンを失ってN−Pyrへと環化する場合がある。これら2つの化学的変性、H2Oを失うこととNH3を失うことは、これらの2つのプロセスで失う分子量が非常に近いことから区別することは困難である。我々は、これらの化学的変性の両方が配列番号121のような配列(我々はこれを天然型ハイブリッドペプチドとも呼ぶ)に生じ得るかどうかを評価するために、分析用HPLCと高感度TOF LC/MS法を使用した。以下のデータは、このプロセスについて我々が本明細書で記載しているような適切な条件に置いた場合に天然型ハイブリッドペプチドに「変換」が生じ得るかを示している。
5μLの試料を、流速5μm/分でWaters BEH130 C−18 Symmetryカラム(0.3mmID×15cm)に注入した。0.1%の移動相B(0.1%のギ酸が入った水)から40%の移動相B(0.1%のギ酸が入った100%アセトニトリル)まで25分かけて直線的な濃度勾配をかけ、25.5分で85%のB、27.5分で85%のB、そして28分で0.1%のBとすることで逆相分離を行った。
10〜30μLμLの試料を、流速1mL/分でWaters C−18 X−Bridgeカラム(4.6mmID×50mm)に注入した。99%の移動相A(0.1%のギ酸が入った水)から95%の移動相B(0.1%のギ酸が入った100%アセトニトリル)まで6分かけて直線的な濃度勾配をかけ、11分で95%のB、11.2分で1%のBで、15分かけて逆相分離を行い、全体の実行時間は18分であった。
LC−MSシステムは、エレクトロスプレーイオン化源を備えたWaters/MicromassZQスペクトロメーターから構成された。試料は、流速1mL/分でZorbax SB−C18カラム(2.1×30mm)に注入した。逆相分離は、ダイオードアレイ検出器(210〜300nm)を使用して、96%の移動相A(0.1%のギ酸が入った水)から98%の移動相B(0.07%のギ酸が入った100%アセトニトリル)まで直線的な濃度勾配をかけることにより3.1分かけて行った。
パート1では、我々は、そのネイティブな状態すなわち我々が形態1と呼ぶペプチドから、我々が形態2と呼ぶ有用な状態へと変換するために、温度、圧力、強い及び/または弱い酸などの機械的または化学的手段で毒性ペプチドを人工的に操ることが可能な方法を述べている。形態2の構成は、本明細書では「カルボニル」、「活性化カルボニル」、「ラクトン」、「ラクトン状」、及び/または「ラクトン状形態」と呼ばれる場合がある。この文書では、我々は通常この形態2の構成を単にラクトンまたはペプチドラクトンと呼ぶ。この文書中ではこれらの化合物の構造は辞書的定義を有しておらず、ここで我々が述べる特性によってこれらは定義される。ここで、「ラクトン」は、われわれが形態2の化合物に起因すると考える特性を有する。これらの化合物はラクトンのように反応することから、我々は、「ラクトン」及びペプチド「ラクトン」という語を使用する。我々はこれらの製造方法、これらの同定方法、これらの単離方法、及びこれらの使用方法を述べる。我々は、これらのペプチドラクトンがネイティブなペプチドよりも生物学的に活性であり、これらが非常に有用かつ多用途であることを示すためのデータを提示する。これらは他の有益な化合物の製造に使用可能な安定な中間体である。パート2では、我々はペプチドラクトンを、様々な他の化合物を製造するための安定な中間体として有用な2つの異なる安定な活性化合物にする方法を示す。
I)ペプチドヒドラジド
ペプチドヒドラジドは、ペプチドラクトン(パート1参照)とヒドラジンから作られ、ペプチドヒドラジドを形成する。ペプチドヒドラジドは、本質的に3段階の手順で作られる。ペプチドラクトンをヒドラジン一水和物と混合する。混合物を溶液になるまで撹拌してペプチドヒドラジドを形成する、そしてペプチドヒドラジドを精製する。
ペプチドヒドラゾンとペプチドヒドラジドは重要な中間体である。ペプチドに望まれる官能基が何であるかに応じて、様々な種類のペプチドヒドラゾンを製造することができる。ここでは我々は異なるペプチドヒドラゾンの様々な実施例を示す。ヒドラゾンの例は実施例8〜11に示されている。当業者はこれらが実施例を限定しない代表的で例示的なものに過ぎず、他の試薬や条件も使用できることを理解するであろう。
そのネイティブな酸形態のペプチド、パート1で述べられたペプチドラクトン、及びパート2のペプチドヒドラジドを表す典型的な式が示される。他のヒドラジド及びヒドラゾンは実施例8〜11で述べる。
この実施例では、ペプチドヒドラジド(I)を合成するための2つの方法を示す。最初の方法の実施例6(a)では、ペプチドラクトンの出発溶液は比較的純度の高い、HPLC分取したものである。2つ目の方法の実施例6(b)では、ペプチドラクトンの出発溶液は純度が低く、形態1と形態2の両方を含んでいる。すなわち、ペプチドラクトンと混ざったペプチドが存在する。両方の手順でも、ペプチドヒドラジドの同じマススペクトルが得られる。
実施例7では我々はその典型的な酸の形態、形態1すなわちペプチドの形態の毒性ペプチドと、ここで示される式でラベリングされるようなペプチドヒドラジド、すなわちペプチドヒドラジド(I)へと変換された後の同じ毒性ペプチドとを比較する。注射のために次の試料が準備される:
1.100ng/μLのヒドラジド(I)水溶液。この溶液を水で希釈して50ng/μLと5ng/μLの溶液を作製する。
2.100ng/μLのハイブリッド+2水溶液。この溶液を水で希釈して50ng/μLと5ng/μLの溶液を作製する。
適切な標識をした、注射されるハエの容器を用意し、18ゲージの針で容器の蓋に空気穴を開ける。ハエを選択する。完全に孵化して1日目及び2日目のハエを使用する。1日目とは完全に孵化した日である。CO2ガスラインを開き、針でCO2ガスを入れることにより箱の中でハエを動かなくする。ハエが動かなくなった後、ハエをCO2プレートに移し、これらを眠らせたままにする。ハエの重さを量り、12〜18mgの質量を有するものを注射の生物学的分析に使用する。
(実施例10(a):アクリルケトン(V)の合成)
(実施例11(a):PEG4ケトン(VIII)の合成)
「変換」なしのアイソフォーム。我々は、配列番号119が高温で分子量中の18ダルトンを失ってアイソフォームを形成し得ることを示した。実施例2では、我々は粉末としての配列番号119の元々の形態、形態1を、形態2に「変換」するためにオートクレーブ処理し、これをジュウイチホシウリハムシの幼虫群の飼料に添加することによって試験した場合に、殺虫効果が約5倍に増加することを示した。しかし、ハイブリッドペプチドである配列番号119におけるこの変形は、天然型ペプチドである配列番号37のようなペプチドでは注目されていなかった。配列番号119とは対照的に、配列番号37にはN末端Glnが存在し、これはそれ自体がNH3を失って、すなわち分子量中の17ダルトンを失ってN−Pyrへと環化する場合がある。これら2つの化学的変性、H2Oを失うこととNH3を失うことは、これらの2つのプロセスで失う分子量が非常に近いことから区別することは困難である。我々は、これらの化学的変性の両方が配列番号37のような配列(我々はこれを天然型ハイブリッドペプチドとも呼ぶ)に生じ得るかどうかを評価するために、分析用HPLCと高感度TOF LC/MS法を使用した。以下のデータは、このプロセスについて我々が本明細書で記載しているような適切な条件に置いた場合に天然型ハイブリッドペプチドに「変換」が生じ得るかを示している。
(1)次の工程を含み、任意選択的にはこれらの工程を文字順で含む、毒性ペプチドを含むペプチドの活性または毒性の増加方法。
a)水と前記ペプチドを混合して、液体中にある前記ペプチドまたは半液体中にある前記ペプチドの形態の、水溶液または水性エマルションを形成する工程であって、前記水溶液または水性エマルションが少なくとも10%の水からなる工程;
b)前記ペプチドの前記水溶液または水性エマルションのpHを測定する工程;
c)前記溶液またはエマルションのpHをpH7.0未満に調整する工程
(2)前記水溶液または水性エマルションが、約1.0〜約6.5、約2.0〜約6.0、約2.5〜約5.5、約3.0〜約5.0、約3.0〜約4.0のpHに調整される、または約3.2、3.4、3.5、3.6、または3.8のpHに調整される、(1)に記載の方法。
(3)前記pHの調整が強酸または弱酸を使用して行われ;前記強酸が使用される場合には、前記強酸によるpH調整が、塩素酸(HClO 3 )、塩酸(HCl)、臭化水素酸、(HBr)、ヨウ化水素酸(HI)、リン酸(H 3 PO 4 )、硫酸(H 2 SO 4 )、過塩素酸(HClO 4 )、及び硝酸(HNO 3 )のいずれか、またはこれらの酸の組み合わせから選択され、リン酸、硫酸、または硝酸から選択される強酸を使用することが注目され;前記弱酸が使用される場合には、前記弱酸によるpH調整が酢酸及び/またはシュウ酸から選択される弱酸を独立に、または組み合わせて使用して行われる、(1)に記載の方法。
(4)前記pHの調整時、前記水溶液または水性エマルションは乾いた熱、すなわち蒸気もしくは圧力なしの温度上昇、または蒸気及びもしくは蒸気ありの温度上昇、またはこれらのいずれかの組み合わせ、を含む熱に曝露され、任意選択的には前記pHの調整の後にペプチドが乾燥粉末または顆粒の形態へと乾燥される、(1)〜(3)のいずれか1つに記載の方法。
(5)前記ペプチドの水溶液またはエマルションの状態時に前記溶液またはエマルションの前記pHを7.0未満に下げることによる、共有結合している2H+Oまたは分子のうちのいずれか1つ以上のペプチドからの除去方法。
(6)任意のペプチド、任意の毒性ペプチド、配列表にある任意のペプチド;配列番号119のペプチド;配列番号37のペプチド;本明細書及び請求項に記載されているいずれかのペプチド、を使用する、(1)〜(5)のいずれか1つに記載の方法。
(7)前記ペプチドまたは毒性ペプチドで処理されるべき昆虫の生息場所への適用に適した、(1)〜(6)のいずれか1つに記載の方法からの毒性ペプチドの前記ペプチドの、製剤状態の殺虫性組成物。
(8)前記ペプチドが入った水溶液またはエマルションのpHが7.0未満に下げられ、ペプチドの共有結合している2H+Oまたは分子のうちのいずれか1つ以上が除去される、毒性ペプチド。
(9)ペプチドの毒性及び/または活性を増加させるための方法であって、
a)純粋な形態1のペプチドすなわちペプチド酸として、または約10%未満の水を含む組成物として、前記ペプチドを準備する工程;
b)前記形態1のペプチドすなわちペプチド酸を制御可能なチャンバーまたは加熱台の中に置く工程;
c)前記ペプチドを圧力ありまたは圧力なしで、蒸気ありまたは蒸気なしで、望ましい温度まで加熱する工程;
d)形態1のペプチドすなわちペプチド酸のうちの望ましい量が、形態2のペプチドすなわちペプチドラクトンに変換されるまで、前記加熱したペプチドを、望ましい温度、圧力、及び蒸気の状態に保持する工程;
を含み、
任意選択的かつ独立的には、工程a)〜d)は次の条件、すなわち
任意選択的かつ独立的に、制御可能なチャンバーを0〜500℃の温度と大気圧〜500psiの圧力を維持可能である;
任意選択的かつ独立的に、前記ペプチドをおおよそ次の温度まで加熱すること、すなわち少なくとも約10℃以上であり、約200℃、300℃、または最大でも400℃から選択される最大温度以下まで加熱する;
任意選択的かつ独立的に、前記ペプチドを10℃〜20℃、20℃〜30℃、30℃〜40℃、40℃〜50℃、50℃〜60℃、60℃〜70℃、70℃〜80℃、80℃〜90℃、90℃〜100℃、100℃〜110℃、110℃〜120℃、120℃〜130℃、130℃〜140℃、140℃〜150℃、150℃〜160℃、160℃〜170℃、170℃〜180℃、180℃〜190℃、190℃〜200℃、200℃〜210℃、210℃〜220℃、220℃〜230℃、230℃〜240℃、240℃〜250℃、250℃〜260℃、260℃〜270℃、270℃〜280℃、280℃〜290℃、290℃〜300℃、300℃〜400℃、及び400℃〜500℃のうちの温度、温度範囲、または温度範囲の組み合わせのうちのおおよそいずれかから選択される温度に少なくとも加熱する;
任意選択的かつ独立的に、前記圧力をa)約10psi〜約40psi、b)約15psi〜約35psi、c)約18psi〜約25psi、d)約21psi、の圧力または圧力範囲のうちのいずれかから選択する;
任意選択的かつ独立的に、選択される温度及び圧力に応じて、a)約5分〜約40分、b)約10分〜約30分、c)約15分〜約25分、d)約21分、の時間の範囲で、前記ペプチドを選択される前記温度及び圧力に維持する;
任意選択的かつ独立的に、前記ペプチドを、a)約100℃〜約140℃、約10psi〜約40psiの圧力、約5分間〜約40分間;b)約110℃〜約130℃、約15psi〜約35psiの圧力、約10分間〜約30分間;c)約115℃〜約125℃、約18psi〜約25psiの圧力、約15分間〜約25分間;d)約121℃、約21psiの圧力、約20分間;の温度、圧力、及び時間まで加熱及びそこで保持する;
任意選択的かつ独立的に、前記圧力が大気圧以下であり、前記温度を少なくとも50℃〜60℃またはそれ以上の温度から選択する;
任意選択的かつ独立的に、50℃〜60℃、60℃〜70℃、70℃〜80℃、80℃〜90℃、90℃〜100℃、100℃〜110℃、110℃〜120℃、120℃〜130℃、130℃〜140℃、140℃〜150℃、150℃〜160℃、160℃〜170℃、170℃〜180℃、180℃〜190℃、190℃〜200℃、200℃〜210℃、210℃〜220℃、220℃〜230℃、230℃〜240℃、240℃〜250℃、250℃〜260℃、260℃〜270℃、270℃〜280℃、280℃〜290℃、290℃〜300℃、300℃〜400℃、及び400℃〜500℃の温度、温度範囲、または温度範囲の組み合わせを使用する;
条件で行われる、方法。
(10)前記ペプチドが、
a)加熱されて約100℃より高い温度で少なくとも約1時間保持される;
b)加熱されて約80℃〜約120℃の温度で少なくとも約2時間保持される;
c)加熱されて約50℃〜約80℃の温度で少なくとも約3時間保持される;
または前記ペプチドが、
a)加熱されて約180℃より高い温度及び少なくとも約5psiの圧力で少なくとも約5分間保持される;
b)加熱されて約100℃より高い温度及び少なくとも約10psiの圧力で少なくとも約10分間保持される;
c)加熱されて約80℃〜約120℃の温度及び少なくとも約10psiの圧力で少なくとも約30分間保持される;もしくは
d)加熱されて約50℃〜約80℃の温度で少なくとも1時間保持される;
または前記ペプチドが、
a)加熱されて約200℃〜約300℃の温度及び約5〜約10psiの圧力で約5〜約10分間保持される;
b)加熱されて約150℃〜約200℃の温度及び約10〜約30psiの圧力で約5〜約30分間保持される;
c)加熱されて約80℃〜約150℃の温度及び約10〜約20psiの圧力で約20〜約60分間保持される;もしくは
d)加熱されて約50℃〜約80℃の温度及び約10〜約40psiの圧力で約30〜約60分間保持される;
または前記ペプチドが、
a)加熱されて約110℃〜約130℃の温度及び約10〜約20psiの圧力で約10〜約20分間保持される;もしくは
b)加熱されて約121℃の温度及び約21psiの圧力で約20分間保持される、
ことを含む多段階手順のいずれかに従って処理される、(9)に記載の方法。
(11)昆虫捕食者のペプチドラクトンをヒドラジンと混合し、精製することでペプチドヒドラジドを得ることを含む、昆虫捕食者ペプチドをペプチドラクトンの形態からペプチドヒドラジドの形態へと変換する方法によって製造される、ペプチドヒドラジド製品の製造方法及び前記ペプチドヒドラジド製品。
(12)前記ペプチドラクトンを水中に用意し、ヒドラジン一水和物を添加し、混合物を撹拌してペプチドヒドラジドを形成し、これを任意選択的には凍結、解凍、及び精製することで精製されたペプチドヒドラジドを得る、(11)に記載の方法及び製品。
(13)前記昆虫捕食者ペプチドが、約20個のアミノ酸から約50個のアミノ酸まで大きさが多様であり、2個、3個、もしくは4個のシスチン結合、または、3個もしくは4個のシスチン結合を有する、(12)に記載の方法及び製品。
(14)前記ペプチドラクトンが、配列表にある任意のペプチド、並びに、配列表にある任意のペプチドと80%超の相同性を有する配列表にある任意のペプチド及び任意のペプチド、または85%、90%、95%、もしくは99%以上の相同性があり3個もしくは4個のシスチン結合を有する任意の配列、から調製される、(13)に記載の方法及び製品。
(15)方法aまたは方法bのいずれかを使用することが可能な、(14)に記載のハイブリッド+2ペプチドと名付けられた、(14)に記載の方法及び製品であって、
方法a;a)100mgの精製した形態2のペプチド、ハイブリッド+2ペプチドラクトンが1mLの水に入っている溶液から出発する、
b)100mgの前記ペプチドラクトンの1mLを100μLのヒドラジン一水和物で処理し、室温で撹拌して、任意選択的には2時間撹拌して、ペプチドヒドラジドを形成する、
c)分取HPLC(アセトニトリル/水/トリフルオロ酢酸のグラジエントで溶出)で前記ペプチドヒドラジドの溶液を精製する、
d)適切なペプチドヒドラジドのフラクションを選ぶ、
e)適切なペプチドヒドラジドのフラクションを合わせて減圧下で濃縮して体積を減らす、
f)前記減らした体積のペプチドヒドラジドを0℃未満で、任意選択的には−80℃で、凍結する、
g)前記ハイブリッド+2ペプチドヒドラジドを、任意選択的には凍結乾燥機で、凍結乾燥してハイブリッド+2ペプチドヒドラジド(I)を得る、
または、
以下を含む方法b;
a)ペプチド酸である形態1と形態2との混合物であるスーパーリキッド濃縮物(Super Liquid Concentrate)25mLの溶液を、任意選択的には約50℃〜90℃で、任意選択的には75℃で、撹拌する、
b)溶液を冷ます、
c)溶液を、任意選択的には2mLである、ヒドラジン一水和物で処理して、任意選択的には室温で2時間、撹拌する、
d)任意選択的にはアセトニトリル/水/トリフルオロ酢酸)のグラジエントで溶出する、分取HPLCで一部を精製する、
e)フラクションを集めて濃縮し、任意選択的には減圧下で、体積を減らす、
f)残っている液体を凍結して、任意選択的には−80℃及び凍結乾燥機で凍結乾燥してハイブリッド+2ペプチドヒドラジドを得る、
を含む、方法及び製品。
(16)a)ヒドラジド水溶液を混合し、ヘキサナールのエタノール溶液を添加し、撹拌すること、
b)ヘキサナール、酢酸、及びエタノールからなるストック溶液で処理して撹拌すること、
c)ヘキサナール、酢酸、及びエタノールからなるストック溶液を添加すること、
d)混合し、放置し、その後任意選択的に加熱してヒドラゾンを生成すること、
を含む、昆虫捕食者のペプチドをペプチドヒドラジドからペプチドヒドラゾンへと変換するプロセスによって作られる、ペプチドヒドラジド製品の製造方法及び前記ペプチドヒドラジド製品。
(17)a)ヒドラジド(I)水溶液をヘキサナールのエタノール溶液と混合して撹拌すること、
b)(16)に記載のストック溶液を少量添加すること、
d)混合し、放置し、その後任意選択的に加熱してヒドラゾン(II)を生成すること、
を含む、前記製品がペプチドヒドラゾン(II)である(16)に記載の方法及び製品。
(18)複合グリコールを強酸または弱酸で酸性化することと、ヒドラジドを添加してよく混ぜてペプチドグリコールヒドラゾンを製造することとを含む、昆虫捕食者のペプチドをペプチドヒドラジドからペプチドヒドラゾンへと変換するプロセスによって作られる、ペプチドヒドラジド製品の製造方法及び前記ペプチドヒドラジド製品。
(19)a)O−[2−(6−オキソカプロイルアミノ)エチル]−O’−メチルポリエチレングリコール(IV)と呼ばれる化合物のエタノール混合物のストック溶液に酢酸を1滴添加すること、
b)工程aからの、酢酸で処理されたO−[2−(6−オキソカプロイルアミノ)エチル]−O’−メチルポリエチレングリコール(IV)(分子量約2’000)のストック溶液を使用し、ヒドラジド(I)の水溶液にこれを添加すること、
c)混合し、室温で放置すること、
d)O−[2−(6−オキソカプロイルアミノ)エチル]−O’−メチルポリエチレングリコール(IV)(分子量約2’000)のストック溶液の残部を分割して添加し、混合後終夜放置しておくことでペプチドヒドラゾン(III)を生成すること、
を含む、前記製品がペプチドヒドラゾン(III)である(18)に記載の方法及び製品。
(20)アクリルケトンをヒドラジドに添加してヒドラゾンを形成することを含む、昆虫捕食者ペプチドをペプチドヒドラジドからペプチドヒドラゾンへと変換するプロセスによって製造される、ペプチドヒドラジドケトン製品の製造方法及び前記ペプチドヒドラジドケトン製品。
(21)エタノールに入ったアクリルケトン(V)をヒドラジド(I)水溶液に添加して混合することを含む、前記製品がペプチドヒドラゾン(VI)である(20)に記載の方法及び製品。
(22)PEG4ケトン(VIII)をヒドラジド(I)の水溶液に添加して混合することでヒドラゾン(IX)を形成することを含む、前記製品がペプチドヒドラゾン(IX)である(20)に記載の方法及び製品。
(23)共有結合している2H+OまたはH 2 Oまたは分子のうちのいずれか1つ以上をペプチドから除去することとして記述される方法であって、本明細書に記載されているまたは明細書もしくは請求項中に見出されるような単独または組み合わせでの、いずれかの条件、温度、圧力、及びpHまたは酸性条件の下で、共有結合している2H+Oまたは分子のうちのいずれか1つ以上が取り除かれた任意の毒性ペプチドを含み、本明細書及び請求項に記載の手順のいずれかによって製造されたいずれかの前記ペプチド、ヒドラジド、またはヒドラゾンを含む方法、により製造されるペプチドの調製方法及びまたはペプチド、及びまたは前記方法によって製造される殺虫性組成物、または、本明細書及び請求項に記載の方法のいずれかによって製造され、その後昆虫の生息場所への適用に好適な製剤中で使用される、前記ペプチドの殺虫性組成物としてのこれらのペプチドのいずれかの使用。
Claims (23)
- 次の工程を含み、任意選択的にはこれらの工程を文字順で含む、毒性ペプチドを含むペプチドの活性または毒性の増加方法。
a)水と前記ペプチドを混合して、液体中にある前記ペプチドまたは半液体中にある前記ペプチドの形態の、水溶液または水性エマルションを形成する工程であって、前記水溶液または水性エマルションが少なくとも10%の水からなる工程;
b)前記ペプチドの前記水溶液または水性エマルションのpHを測定する工程;
c)前記溶液またはエマルションのpHをpH7.0未満に調整する工程 - 前記水溶液または水性エマルションが、約1.0〜約6.5、約2.0〜約6.0、約2.5〜約5.5、約3.0〜約5.0、約3.0〜約4.0のpHに調整される、または約3.2、3.4、3.5、3.6、または3.8のpHに調整される、請求項1に記載の方法。
- 前記pHの調整が強酸または弱酸を使用して行われ;前記強酸が使用される場合には、前記強酸によるpH調整が、塩素酸(HClO3)、塩酸(HCl)、臭化水素酸、(HBr)、ヨウ化水素酸(HI)、リン酸(H3PO4)、硫酸(H2SO4)、過塩素酸(HClO4)、及び硝酸(HNO3)のいずれか、またはこれらの酸の組み合わせから選択され、リン酸、硫酸、または硝酸から選択される強酸を使用することが注目され;前記弱酸が使用される場合には、前記弱酸によるpH調整が酢酸及び/またはシュウ酸から選択される弱酸を独立に、または組み合わせて使用して行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記pHの調整時、前記水溶液または水性エマルションは乾いた熱、すなわち蒸気もしくは圧力なしの温度上昇、または蒸気及びもしくは蒸気ありの温度上昇、またはこれらのいずれかの組み合わせ、を含む熱に曝露され、任意選択的には前記pHの調整の後にペプチドが乾燥粉末または顆粒の形態へと乾燥される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ペプチドの水溶液またはエマルションの状態時に前記溶液またはエマルションの前記pHを7.0未満に下げることによる、共有結合している2H+Oまたは分子のうちのいずれか1つ以上のペプチドからの除去方法。
- 任意のペプチド、任意の毒性ペプチド、配列表にある任意のペプチド;配列番号119のペプチド;配列番号121のペプチド;本明細書及び請求項に記載されているいずれかのペプチド、を使用する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ペプチドまたは毒性ペプチドで処理されるべき昆虫の生息場所への適用に適した、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法からの毒性ペプチドの前記ペプチドの、製剤状態の殺虫性組成物。
- 前記ペプチドが入った水溶液またはエマルションのpHが7.0未満に下げられ、ペプチドの共有結合している2H+Oまたは分子のうちのいずれか1つ以上が除去される、毒性ペプチド。
- ペプチドの毒性及び/または活性を増加させるための方法であって、
a)純粋な形態1のペプチドすなわちペプチド酸として、または約10%未満の水を含む組成物として、前記ペプチドを準備する工程;
b)前記形態1のペプチドすなわちペプチド酸を制御可能なチャンバーまたは加熱台の中に置く工程;
c)前記ペプチドを圧力ありまたは圧力なしで、蒸気ありまたは蒸気なしで、望ましい温度まで加熱する工程;
d)形態1のペプチドすなわちペプチド酸のうちの望ましい量が、形態2のペプチドすなわちペプチドラクトンに変換されるまで、前記加熱したペプチドを、望ましい温度、圧力、及び蒸気の状態に保持する工程;
を含み、
任意選択的かつ独立的には、工程a)〜d)は次の条件、すなわち
任意選択的かつ独立的に、制御可能なチャンバーを0〜500℃の温度と大気圧〜500psiの圧力を維持可能である;
任意選択的かつ独立的に、前記ペプチドをおおよそ次の温度まで加熱すること、すなわち少なくとも約10℃以上であり、約200℃、300℃、または最大でも400℃から選択される最大温度以下まで加熱する;
任意選択的かつ独立的に、前記ペプチドを10℃〜20℃、20℃〜30℃、30℃〜40℃、40℃〜50℃、50℃〜60℃、60℃〜70℃、70℃〜80℃、80℃〜90℃、90℃〜100℃、100℃〜110℃、110℃〜120℃、120℃〜130℃、130℃〜140℃、140℃〜150℃、150℃〜160℃、160℃〜170℃、170℃〜180℃、180℃〜190℃、190℃〜200℃、200℃〜210℃、210℃〜220℃、220℃〜230℃、230℃〜240℃、240℃〜250℃、250℃〜260℃、260℃〜270℃、270℃〜280℃、280℃〜290℃、290℃〜300℃、300℃〜400℃、及び400℃〜500℃のうちの温度、温度範囲、または温度範囲の組み合わせのうちのおおよそいずれかから選択される温度に少なくとも加熱する;
任意選択的かつ独立的に、前記圧力をa)約10psi〜約40psi、b)約15psi〜約35psi、c)約18psi〜約25psi、d)約21psi、の圧力または圧力範囲のうちのいずれかから選択する;
任意選択的かつ独立的に、選択される温度及び圧力に応じて、a)約5分〜約40分、b)約10分〜約30分、c)約15分〜約25分、d)約21分、の時間の範囲で、前記ペプチドを選択される前記温度及び圧力に維持する;
任意選択的かつ独立的に、前記ペプチドを、a)約100℃〜約140℃、約10psi〜約40psiの圧力、約5分間〜約40分間;b)約110℃〜約130℃、約15psi〜約35psiの圧力、約10分間〜約30分間;c)約115℃〜約125℃、約18psi〜約25psiの圧力、約15分間〜約25分間;d)約121℃、約21psiの圧力、約20分間;の温度、圧力、及び時間まで加熱及びそこで保持する;
任意選択的かつ独立的に、前記圧力が大気圧以下であり、前記温度を少なくとも50℃〜60℃またはそれ以上の温度から選択する;
任意選択的かつ独立的に、50℃〜60℃、60℃〜70℃、70℃〜80℃、80℃〜90℃、90℃〜100℃、100℃〜110℃、110℃〜120℃、120℃〜130℃、130℃〜140℃、140℃〜150℃、150℃〜160℃、160℃〜170℃、170℃〜180℃、180℃〜190℃、190℃〜200℃、200℃〜210℃、210℃〜220℃、220℃〜230℃、230℃〜240℃、240℃〜250℃、250℃〜260℃、260℃〜270℃、270℃〜280℃、280℃〜290℃、290℃〜300℃、300℃〜400℃、及び400℃〜500℃の温度、温度範囲、または温度範囲の組み合わせを使用する;
条件で行われる、方法。 - 前記ペプチドが、
a)加熱されて約100℃より高い温度で少なくとも約1時間保持される;
b)加熱されて約80℃〜約120℃の温度で少なくとも約2時間保持される;
c)加熱されて約50℃〜約80℃の温度で少なくとも約3時間保持される;
または前記ペプチドが、
a)加熱されて約180℃より高い温度及び少なくとも約5psiの圧力で少なくとも約5分間保持される;
b)加熱されて約100℃より高い温度及び少なくとも約10psiの圧力で少なくとも約10分間保持される;
c)加熱されて約80℃〜約120℃の温度及び少なくとも約10psiの圧力で少なくとも約30分間保持される;もしくは
d)加熱されて約50℃〜約80℃の温度で少なくとも1時間保持される;
または前記ペプチドが、
a)加熱されて約200℃〜約300℃の温度及び約5〜約10psiの圧力で約5〜約10分間保持される;
b)加熱されて約150℃〜約200℃の温度及び約10〜約30psiの圧力で約5〜約30分間保持される;
c)加熱されて約80℃〜約150℃の温度及び約10〜約20psiの圧力で約20〜約60分間保持される;もしくは
d)加熱されて約50℃〜約80℃の温度及び約10〜約40psiの圧力で約30〜約60分間保持される;
または前記ペプチドが、
a)加熱されて約110℃〜約130℃の温度及び約10〜約20psiの圧力で約10〜約20分間保持される;もしくは
b)加熱されて約121℃の温度及び約21psiの圧力で約20分間保持される、
ことを含む多段階手順のいずれかに従って処理される、請求項9に記載の方法。 - 昆虫捕食者のペプチドラクトンをヒドラジンと混合し、精製することでペプチドヒドラジドを得ることを含む、昆虫捕食者ペプチドをペプチドラクトンの形態からペプチドヒドラジドの形態へと変換する方法によって製造される、ペプチドヒドラジド製品の製造方法及び前記ペプチドヒドラジド製品。
- 前記ペプチドラクトンを水中に用意し、ヒドラジン一水和物を添加し、混合物を撹拌してペプチドヒドラジドを形成し、これを任意選択的には凍結、解凍、及び精製することで精製されたペプチドヒドラジドを得る、請求項11に記載の方法及び製品。
- 前記昆虫捕食者ペプチドが、約20個のアミノ酸から約50個のアミノ酸まで大きさが多様であり、2個、3個、もしくは4個のシスチン結合、または、3個もしくは4個のシスチン結合を有する、請求項12に記載の方法及び製品。
- 前記ペプチドラクトンが、配列表にある任意のペプチド、並びに、配列表にある任意のペプチドと80%超の相同性を有する配列表にある任意のペプチド及び任意のペプチド、または85%、90%、95%、もしくは99%以上の相同性があり3個もしくは4個のシスチン結合を有する任意の配列、から調製される、請求項13に記載の方法及び製品。
- 方法aまたは方法bのいずれかを使用することが可能な、請求項14に記載のハイブリッド+2ペプチドと名付けられた、請求項14に記載の方法及び製品であって、
方法a;a)100mgの精製した形態2のペプチド、ハイブリッド+2ペプチドラクトンが1mLの水に入っている溶液から出発する、
b)100mgの前記ペプチドラクトンの1mLを100μLのヒドラジン一水和物で処理し、室温で撹拌して、任意選択的には2時間撹拌して、ペプチドヒドラジドを形成する、
c)分取HPLC(アセトニトリル/水/トリフルオロ酢酸のグラジエントで溶出)で前記ペプチドヒドラジドの溶液を精製する、
d)適切なペプチドヒドラジドのフラクションを選ぶ、
e)適切なペプチドヒドラジドのフラクションを合わせて減圧下で濃縮して体積を減らす、
f)前記減らした体積のペプチドヒドラジドを0℃未満で、任意選択的には−80℃で、凍結する、
g)前記ハイブリッド+2ペプチドヒドラジドを、任意選択的には凍結乾燥機で、凍結乾燥してハイブリッド+2ペプチドヒドラジド(I)を得る、
または、
以下を含む方法b;
a)ペプチド酸である形態1と形態2との混合物であるスーパーリキッド濃縮物(Super Liquid Concentrate)25mLの溶液を、任意選択的には約50℃〜90℃で、任意選択的には75℃で、撹拌する、
b)溶液を冷ます、
c)溶液を、任意選択的には2mLである、ヒドラジン一水和物で処理して、任意選択的には室温で2時間、撹拌する、
d)任意選択的にはアセトニトリル/水/トリフルオロ酢酸)のグラジエントで溶出する、分取HPLCで一部を精製する、
e)フラクションを集めて濃縮し、任意選択的には減圧下で、体積を減らす、
f)残っている液体を凍結して、任意選択的には−80℃及び凍結乾燥機で凍結乾燥してハイブリッド+2ペプチドヒドラジドを得る、
を含む、方法及び製品。 - a)ヒドラジド水溶液を混合し、ヘキサナールのエタノール溶液を添加し、撹拌すること、
b)ヘキサナール、酢酸、及びエタノールからなるストック溶液で処理して撹拌すること、
c)ヘキサナール、酢酸、及びエタノールからなるストック溶液を添加すること、
d)混合し、放置し、その後任意選択的に加熱してヒドラゾンを生成すること、
を含む、昆虫捕食者のペプチドをペプチドヒドラジドからペプチドヒドラゾンへと変換するプロセスによって作られる、ペプチドヒドラジド製品の製造方法及び前記ペプチドヒドラジド製品。 - a)ヒドラジド(I)水溶液をヘキサナールのエタノール溶液と混合して撹拌すること、
b)請求項16に記載のストック溶液を少量添加すること、
d)混合し、放置し、その後任意選択的に加熱してヒドラゾン(II)を生成すること、
を含む、前記製品がペプチドヒドラゾン(II)である請求項16に記載の方法及び製品。 - 複合グリコールを強酸または弱酸で酸性化することと、ヒドラジドを添加してよく混ぜてペプチドグリコールヒドラゾンを製造することとを含む、昆虫捕食者のペプチドをペプチドヒドラジドからペプチドヒドラゾンへと変換するプロセスによって作られる、ペプチドヒドラジド製品の製造方法及び前記ペプチドヒドラジド製品。
- a)O−[2−(6−オキソカプロイルアミノ)エチル]−O’−メチルポリエチレングリコール(IV)と呼ばれる化合物のエタノール混合物のストック溶液に酢酸を1滴添加すること、
b)工程aからの、酢酸で処理されたO−[2−(6−オキソカプロイルアミノ)エチル]−O’−メチルポリエチレングリコール(IV)(分子量約2’000)のストック溶液を使用し、ヒドラジド(I)の水溶液にこれを添加すること、
c)混合し、室温で放置すること、
d)O−[2−(6−オキソカプロイルアミノ)エチル]−O’−メチルポリエチレングリコール(IV)(分子量約2’000)のストック溶液の残部を分割して添加し、混合後終夜放置しておくことでペプチドヒドラゾン(III)を生成すること、
を含む、前記製品がペプチドヒドラゾン(III)である請求項18に記載の方法及び製品。 - アクリルケトンをヒドラジドに添加してヒドラゾンを形成することを含む、昆虫捕食者ペプチドをペプチドヒドラジドからペプチドヒドラゾンへと変換するプロセスによって製造される、ペプチドヒドラジドケトン製品の製造方法及び前記ペプチドヒドラジドケトン製品。
- エタノールに入ったアクリルケトン(V)をヒドラジド(I)水溶液に添加して混合することを含む、前記製品がペプチドヒドラゾン(VI)である請求項20に記載の方法及び製品。
- PEG4ケトン(VIII)をヒドラジド(I)の水溶液に添加して混合することでヒドラゾン(IX)を形成することを含む、前記製品がペプチドヒドラゾン(IX)である請求項20に記載の方法及び製品。
- 共有結合している2H+OまたはH2Oまたは分子のうちのいずれか1つ以上をペプチドから除去することとして記述される方法であって、本明細書に記載されているまたは明細書もしくは請求項中に見出されるような単独または組み合わせでの、いずれかの条件、温度、圧力、及びpHまたは酸性条件の下で、共有結合している2H+Oまたは分子のうちのいずれか1つ以上が取り除かれた任意の毒性ペプチドを含み、本明細書及び請求項に記載の手順のいずれかによって製造されたいずれかの前記ペプチド、ヒドラジド、またはヒドラゾンを含む方法、により製造されるペプチドの調製方法及びまたはペプチド、及びまたは前記方法によって製造される殺虫性組成物、または、本明細書及び請求項に記載の方法のいずれかによって製造され、その後昆虫の生息場所への適用に好適な製剤中で使用される、前記ペプチドの殺虫性組成物としてのこれらのペプチドのいずれかの使用。
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