KR102444555B1 - 인위적으로 활성화된 펩타이드 - Google Patents

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브루스 에이. 스테인바우
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Abstract

특정한 독성 펩타이드의 인위적으로 유도된 전환으로서, 이러한 펩타이드의 상이한 형태 및 원래 펩타이드의 신규하고 유용한 유도체 둘 다를 생성하는 전환이 기재되고, 이들은 둘 다 그 자체로 유용하며, 신규한 화합물 및 다른 중요한 화합물을 제조하는데 사용될 수 있는 신규하고 안정한 중간체로서 유용하다.

Description

인위적으로 활성화된 펩타이드{ARTIFICIALLY ACTIVATED PEPTIDES}
관련 출원에 대한 교차 참고
본 출원은 2014년 4월 4일자로 출원된 미국 특허 출원 제61/975,147호에 대한 우선권을 주장하며, 이의 전문은 본 명세서에 참고로서 인용된다.
발명의 분야
본 발명은 천연 및 하이브리드 생리학적 활성 펩타이드, 예를 들면, 이에 관련되거나 이로부터 모사된 펩타이드 독소의 활성을 증가시키는 화학적 및 기계적 방법에 관한 것이고, 독소는 독이 있는 거미, 달팽이, 연체동물 및 기타 동물에서 발견된다.
서열 목록
본 출원은 2015년 4월 3일 생성되고 함께 전자 출원된 "FAM_N_PRV_SEQ_LISTING_2015_04_03_ST25.txt"(106,014 바이트)라는 제목의 서열 목록을 전부 포함한다.
오토클레이브에 의해 생성되고 살균을 위해 사용되는 조건과 같은 전형적으로 높은 열 및 압력은 진균, 박테리아 및 바이러스와 같은 생물학적 샘플을 중화시키고 불활성화시키는데 사용된다. 이러한 공정에 의해 종종 단백질은 변성되거나 심지어 파괴된다. 일반적으로 유기체가 높은 온도 및 압력에 노출되는 경우, 이들의 단백질이 변성되기 때문에 이들은 자라는데 실패하거나 심지어 생존에 실패하고, 그 결과 유기체는 불활성화되고 사멸한다. 이후 생물학적 과정은 오직 부패뿐이다. 단독 산성 조건은 때때로 유사한 결과를 생성할 수 있다. 독성 단백질과 같은 대부분의 활성 펩타이드가 낮은 pH 또는 산 조건에 노출되면, 펩타이드는 변성되고 더 이상 천연 펩타이드 또는 단백질과 같이 기능하지 않는다. 오토클레이브는 종종 의료실에서 기구, 장치를 처리하여 이들을 안전하게 만드는데 사용되고, 점점 더 이들은 처분을 위하여 생물학적으로 오염된 폐기물을 처리하여 이를 안전한 중성의 무해한 폐기물로 변화시키는데 사용된다. 여기서 본 발명자들은 이러한 펩타이드의 상이한 형태 및 원래 펩타이드의 신규하고 유용한 유도체 둘 다를 생성하는 특정한 독성 펩타이드의 인위적으로 유도된 전환을 보고하고, 이들은 둘 다 그 자체로 유용하며, 신규한 화합물 및 다른 중요 화합물을 만드는데 유용한 신규하고 안정한 중간체로서 유용하다.
본 발명은 두 파트를 갖는다. 파트 1에서 본 발명자들은, 임의로 문자 순으로, 하기 단계를 포함하는, 독성 펩타이드를 포함하는 펩타이드의 활성 및 독성을 증가시키는 인위적으로 유도된 화학적 및 기계적 방법을 사용하는 방법을 기재한다: a) 상기 펩타이드를 물과 혼합하여 액체 또는 반액체 형태로 상기 펩타이드의 수성 용액 또는 수성 에멀전을 제조하는 단계로서, 수성 용액 또는 수성 에멀전이 적어도 10% 물을 포함하는 것인 단계; b) 수성 용액 또는 수성 에멀전의 상기 펩타이드의 pH를 측정하는 단계; c) 상기 용액 또는 에멀전의 pH를 pH 7.0 미만으로 조정하는 단계. pH는 약 1.0 내지 약 6.5, 약 2.0 내지 약 6.0, 약 2.5 내지 약 5.5, 약 3.0 내지 약 5.0, 약 3.0 내지 약 4.0, 약 3.2, 3.4, 3.5, 3.6, 또는 3.8일 수 있다.
상기 pH 조정 후, 펩타이드가 건조 분말 또는 과립 형태로 건조되는 방법. pH 조정은 강산 또는 약산을 사용하여 만들어질 수 있다. 강산 예는 임의의 하기 산이다 - 염소산(HClO3), 염산(HCl), 브롬화수소산(HBr), 요오드화수소산(HI), 인산(H3PO4), 황산(H2SO4). 과염소산(HClO4), 및 질산(HNO3). 약산 예는 아세트산 및/또는 옥살산이다. pH 조정 동안, 수성 용액 또는 수성 에멀전은 건열, 즉, 수증기 또는 압력의 부재하에 온도 증가, 또는 압력 및 수증기의 존재하에 열에 노출된다. 명세서에 기재된 열 및 열과 압력 조건은 또한 본 명세서에 기재된 건조 분말 과정을 포함하는 임의의 과정과 함께 사용될 수 있다.
상기 펩타이드가 수성 용액 또는 에멀전 중에 존재하는 동안, 용액 또는 에멀전의 pH를 7.0 미만으로 감소시킴으로써 임의의 하나 이상의 공유 결합된 2H+O 또는 분자를 펩타이드로부터 제거하는 방법. 방법이 특히 효과가 있는 펩타이드는 명세서 또는 서열 목록 및 특히 서열 번호 119 및 서열 번호 121에 기재된 펩타이드이다.
방법 이외에 본 발명자들은 펩타이드로 처리되는 곤충의 장소에 대한 적용에 적합한 펩타이드의 살충제 조성물 및 제형을 기재한다. 방법 및 조성물 이외에 본 발명자들은 수성 용액 또는 에멀전의 펩타이드의 pH가 7.0 미만으로 감소된, 임의의 하나 이상의 공유 결합된 2H+O 또는 분자가 제거된 독성 펩타이드 그 자체를 기재한다.
본 발명자들은 하기 단계를 포함하는 펩타이드의 독성 및/또는 활성을 증가시키는 방법을 기재한다: a) 순수한 형태 1 펩타이드, 또는 펩타이드 산 또는 약 10% 미만의 물을 함유하는 조성물로서 상기 펩타이드를 제조하는 단계, b) 상기 형태 1 펩타이드를 제어 가능한 챔버 또는 가열 플랫폼 내에 위치시키는 단계; c) 상기 펩타이드를 목적하는 온도로, 압력의 존재 또는 부재하에, 수증기의 존재 또는 부재하에, 가열하는 단계; d) 펩타이드 산으로 지칭되는 형태 1 펩타이드의 목적하는 양이 펩타이드 락톤으로 지칭되는 형태 2 펩타이드로 전환될 때까지 가열된 펩타이드를 목적하는 온도, 압력 및 수증기에서 유지하는 단계. 제어 가능한 챔버는 0 내지 500℃의 온도 및 대기압 내지 500psi의 압력을 유지할 수 있다. 펩타이드는 대략 하기 온도로 가열될 수 있고; 적어도 약 10℃ 내지 약 200℃, 300℃, 또는 최대 400℃로부터 선택된 최대 온도 이하로 가열될 수 있다.
본 발명자들은 펩타이드가 적어도 대략 임의의 하기 온도, 온도 범위 또는 온도 범위의 조합으로부터 선택된 온도로 가열되는 방법을 기재한다: 10℃ 내지 20℃; 20℃ 내지 30℃; 30℃ 내지 40℃; 40℃ 내지 50℃; 50℃ 내지 60℃; 60℃ 내지 70℃; 70℃ 내지 80℃; 80℃ 내지 90℃; 90℃ 내지 100℃; 100℃ 내지 110℃, 110℃ 내지 120℃, 120℃ 내지 130℃, 130℃ 내지 140℃, 140℃ 내지 150℃, 150℃ 내지 160℃, 160℃ 내지 170℃, 170℃ 내지 180℃, 180℃ 내지 190℃, 190℃ 내지 200℃, 200℃ 내지 210℃, 210℃ 내지 220℃, 220℃ 내지 230℃, 230℃ 내지 240℃, 240℃ 내지 250℃, 250℃ 내지 260℃, 260℃ 내지 270℃, 270℃ 내지 280℃, 280℃ 내지 290℃, 290℃ 내지 300℃, 300℃ 내지 400℃ 및 400℃ 내지 500℃.
본 발명자들은 펩타이드, 또는 펩타이드 산이 임의의 하기 압력 또는 압력 범위에 노출되는 방법을 기재한다: a) 약 10psi 내지 약 40psi; b) 약 15psi 내지 약 35psi; c) 약 18psi 내지 약 25psi; d) 약 21psi. 선택된 온도 및 압력 범위는 선택된 온도 및 압력에 따른 하기 기간에 속한다: a) 약 5분 내지 약 40분; b) 약 10분 내지 약 30분; c) 약 15분 내지 약 25분; d) 약 21분.
하기 조건을 사용할 수 있고, 펩타이드는 하기 온도 및 압력 및 시간으로 유지되어야 한다: a) 약 100℃ 내지 약 140℃; 약 10psi 내지 약 40psi의 압력; 약 5분 내지 약 40분; b) 약 110℃ 내지 약 130℃; 약 15psi 내지 약 35psi의 압력; 약 10분 내지 약 30분; c) 약 115℃ 내지 약 125℃; 약 18psi 내지 약 25psi의 압력; 약 15분 내지 약 25분; d) 약 121℃, 약 21psi의 압력, 약 20분. 압력이 대기압 이하인 경우, 온도는 적어도 50℃ 내지 60℃ 또는 그 이상의 온도로부터 선택된다. 몇몇 경우, 하기 온도, 온도 범위 또는 온도 범위의 조합이 사용된다: 50℃ 내지 60℃; 60℃ 내지 70℃; 70℃ 내지 80℃; 80℃ 내지 90℃; 90℃ 내지 100℃; 100℃ 내지 110℃, 110℃ 내지 120℃, 120℃ 내지 130℃, 130℃ 내지 140℃, 140℃ 내지 150℃, 150℃ 내지 160℃, 160℃ 내지 170℃, 170℃ 내지 180℃, 180℃ 내지 190℃, 190℃ 내지 200℃, 200℃ 내지 210℃, 210℃ 내지 220℃, 220℃ 내지 230℃, 230℃ 내지 240℃, 240℃ 내지 250℃, 250℃ 내지 260℃, 260℃ 내지 270℃, 270℃ 내지 280℃, 280℃ 내지 290℃, 290℃ 내지 300℃, 300℃ 내지 400oC 및 400℃ 내지 500℃.
방법은 하기 온도 및 시간을 사용할 수 있고, 펩타이드는 a) 약 100℃ 이상의 온도에서 적어도 약 1시간 동안 가열되고 유지되거나; b) 약 80℃ 내지 약 120℃의 온도에서 적어도 약 2시간 동안 가열되고 유지되거나; c) 약 50℃ 내지 약 80℃의 온도에서 적어도 약 3시간 동안 가열되고 유지된다. 대안적으로 펩타이드는 a) 약 180℃ 이상의 온도 및 적어도 약 5psi의 압력에서 적어도 약 5분 동안 가열되고 유지되거나; b) 약 100℃ 이상의 온도 및 적어도 약 10psi의 압력에서 적어도 약 10분 동안 가열되고 유지되거나; c) 약 80℃ 내지 약 120℃의 온도 및 적어도 약 10psi의 압력에서 적어도 약 30분 동안 가열되고 유지되거나; d) 약 50℃ 내지 약 80℃의 온도에서 적어도 약 1시간 동안 가열되고 유지될 수 있다.
펩타이드는 하기 조건을 사용하여 전환될 수 있다: a) 약 200℃ 내지 약 300℃의 온도 및 약 5 내지 약 10psi의 압력에서 약 5 내지 약 10분 동안 가열되고 유지되거나; b) 약 150℃ 내지 약 200℃의 온도 및 약 10 내지 약 30psi의 압력에서 약 5 내지 약 30분 동안 가열되고 유지되거나; c) 약 80℃ 내지 약 150℃의 온도 및 약 10 내지 약 20psi의 압력에서 약 20 내지 약 60분 동안 가열되고 유지되거나; d) 약 50℃ 내지 약 80℃의 온도 및 약 10 내지 약 40psi의 압력에서 약 30 내지 약 60분 동안 가열되고 유지된다.
대안적인 조건은 펩타이드가 a) 약 110℃ 내지 약 130℃의 온도 및 약 10 내지 약 20psi의 압력에서 약 10 내지 약 20분 동안 가열되고 유지되거나; b) 약 121℃의 온도 및 약 21psi의 압력에서 약 20분 동안 가열되고 유지되는 것이다.
일반적으로 본 발명자들은 상기 펩타이드를 본 명세서에 기재된 바와 같은 임의의 조건, 온도 및 압력하에 가열함으로써 임의의 하나 이상의 공유 결합된 2H+O, 또는 H2O 또는 분자를 펩타이드로부터 제거하는 방법을 기재한다. 상기 펩타이드를 본 명세서에 기재된 바와 같은 임의의 조건, 온도 및 압력하에 가열함으로써 임의의 하나 이상의 공유 결합된 2H+O, 또는 H2O 또는 분자를 서열 목록의 임의의 펩타이드로부터 제거하는 방법. 본 발명자들은 전환 후, 서열 목록의 임의의 펩타이드를 기재한다. 본 발명자들은 명세서 또는 청구항에 기재된 임의의 과정으로부터 제조된 펩타이드를 기재한다. 본 발명자들은 펩타이드로 처리되는 곤충의 장소에 대한 적용에 적합한 제형인, 청구항의 임의의 방법에 의해 제조된 펩타이드의 살충제 조성물을 기재한다. 본 발명자들은 독성 펩타이드를 기재하고, 이를, 펩타이드가 본 명세서에 기재된 바와 같은 임의의 조건, 온도 및 압력하에 가열되는 경우, 임의의 하나 이상의 공유 결합된 2H+O 또는 분자가 제거되는 경우, 펩타이드 락톤으로 지칭한다. 본 발명자들은 하나 이상의 공유 결합된 2H+O 또는 H2O 분자가 제거되는 임의의 과정에서 기재되거나 임의의 과정에 의해 제조된 독성 펩타이드를 기재한 다음, 이를 본 명세서 및 파트 2에서 펩타이드 락톤으로 지칭한다.
전환에 특히 적합한 조건은 약 121℃의 온도 및 약 21psi의 압력에서 약 20분 동안 펩타이드를 가열하고 유지하는 것이다.
본 출원의 파트 2에서, 본 발명자들은 펩타이드 락톤을 펩타이드 하이드라자이드로 전환할 수 있고, 펩타이드 하이드라자이드를 펩타이드 하이드라존으로 전환할 수 있는 방법을 기재한다. 본 발명자들은 곤충 포식자 펩타이드 락톤을 하이드라진과 혼합하는 것 및 정제하여 펩타이드 하이드라자이드를 수득하는 것을 포함하는, 곤충 포식자 펩타이드를 펩타이드 락톤 형태로부터 펩타이드 하이드라자이드 형태로 전환시키는 방법에 의한 펩타이드 하이드라자이드의 제조 방법, 및 이로써 제조된 펩타이드 하이드라자이드 생성물을 기재한다. 본 발명자들은 펩타이드 락톤을 물 중에 제조하고, 하이드라진 일수화물을 가하고, 혼합물을 교반하여 펩타이드 하이드라자이드를 형성하고, 이를 임의로 냉동하고, 해동하고, 정제하여 정제된 펩타이드 하이드라자이드를 수득하는 방법을 기재한다. 목적하는 경우, 곤충 포식자 펩타이드는 크기가 약 20 아미노산 내지 약 50 아미노산으로 다양할 수 있고, 2, 3 또는 4 시스틴 결합, 또는 대안적으로 3 또는 4 시스틴 결합 또는 2 또는 3 시스틴 결합을 갖는다. 펩타이드 락톤은 서열 목록의 임의의 펩타이드 및 서열 목록의 임의의 펩타이드 또는 서열 목록의 임의의 펩타이드에 80% 이상의 상동성을 갖는 임의의 펩타이드, 또는 85%, 90%, 95% 또는 99% 이상의 상동성 및 3 또는 4 시스틴 결합을 갖는 임의의 서열로부터 제조될 수 있다.
본 발명자들은 하기를 포함하는 방법 a 또는 방법 b를 사용하여, 이러한 방법을 하이브리드+2 펩타이드로 명명된 펩타이드로 사용하는 방법을 입증하였다: 방법 a; a) 물 1㎖ 중의 하이브리드+2 펩타이드 락톤인 정제된 형태 2 펩타이드 100mg의 용액으로부터 시작하는 단계, b) 100mg 펩타이드 락톤 1㎖를 하이드라진 일수화물 100uL로 처리하고, 임의로 2시간 동안, 실온에서 교반하여 펩타이드 하이드라자이드를 형성하는 단계, c) 펩타이드 하이드라자이드 용액을 분취용 HPLC(아세토나이트릴/물/트라이플루오로아세트산 구배로 용리됨)에서 정제하는 단계, d) 펩타이드 하이드라자이드의 적절한 분획을 선택하는 단계, e) 펩타이드 하이드라자이드의 적절한 분획을 조합하고, 진공하에 농축하여 용적을 감소시키는 단계, f) 펩타이드 하이드라자이드의 감소된 용적을 영하의 온도, 임의로 -80℃에서 냉동하는 단계, g) 하이브리드+2 펩타이드 하이드라자이드를, 임의로 동결건조기에서 동결건조하여 하이브리드+2 펩타이드 하이드라자이드(I)를 수득하는 단계; 또는 방법 b, 방법 b는 하기를 포함한다: a) 형태 1, 펩타이드 산 및 형태 2의 혼합물인 초 액체 농축물 25㎖의 용액을, 임의로 약 50℃ 내지 90℃에서, 임의로 75℃에서, 교반하는 단계, b) 용액이 냉각되도록 두는 단계, c) 용액을 하이드라진 일수화물, 임의로 2㎖로 처리하고, 임의로 실온에서 2 시간 동안, 교반하는 단계, d) 부분을 분취용 HPLC(임의로 아세토나이트릴/물/트라이플루오로아세트산 구배로 용리됨)에서 정제하는 단계, e) 분획을 조합하고 농축하고, 용적을, 임의로 진공하에, 농축하는 단계, f) 잔여 액체를, 임의로 -80℃에서 냉동하고, 동결건조하여 하이브리드+2 펩타이드 하이드라자이드를 제조하는 단계.
본 발명자들은 또한 펩타이드 하이드라자이드를 사용하고, 이를 카보닐과 반응시켜 유용한 펩타이드 하이드라존을 제조하는 방법을 보여준다. 이는 곤충 포식자 펩타이드를 펩타이드 하이드라자이드로부터 펩타이드 하이드라존으로 전환시킴으로써 수행되고, 이는 하기를 포함한다: a) 물 중의 하이드라자이드 용액을 혼합하고, 에탄올 중의 헥산알을 가하고, 교반하고, b) 헥산알, 아세트산 및 에탄올로 만들어진 스톡 용액으로 처리하고, 교반하고, c) 헥산알, 아세트산 및 에탄올로 만들어진 스톡 용액을 가하고, d) 혼합하고, 그대로 둔 다음, 임의로 가열하여 하이드라존을 제조한다. 본 발명자들은 이러한 방법을 사용하여 하이드라존(II)을 제조하였다. 이는 a) 물 중의 하이드라자이드(I) 용액을 에탄올 중의 헥산알과 혼합하고, 교반하고, b) 제16항의 일부 스톡 용액을 가하고, d) 혼합하고, 그대로 둔 다음, 임의로 가열하여 하이드라존(II)을 제조함으로써 수행되었다.
하이드라존은 중요한 안정한 중간체이면서 또한 최종 생성물일 수 있다. 생성물은 페길화된 펩타이드 또는 PEG 펩타이드이다. 하이드라존은 다른 것일 수도 있지만, 본 발명자들은 이것이 페길화된 경우 가장 유용한 것으로 간주한다. 본 발명자들은 또한 알킬화된 하이드라존을 보여준다. 페길화된 펩타이드는 실제로 하이드라존의 형태를 취한다. 실시예 9 및 하이드라존(III) 및 실시예 11 및 (IX)를 참고한다. 이와 같은 화합물은 이전에 절대 존재하지 않았고, 이들을 만드는 화학은 이전에 절대 생각되지 않았다. 이러한 펩타이드 하이드라존은 신규하고, 하이드라존(IX)과 같은 페길화된 펩타이드 하이드라존은 두 가지 측면에서 신규하다. 첫째, 실시예 10(b) 및 11(b)에서 나타낸 불포화된 카보닐 연결은 이전에 PEG를 펩타이드와 연결하는데 절대 사용되지 않았다. 둘째, 알데하이드 또는 케톤이 PEG에 결합되는 곳인 "페길화 면"에서 알데하이드 또는 케톤으로 시작한 다음, 펩타이드 하이드라자이드와 반응하는 이러한 반응은 이전에 절대 나타나지 않았다. 일반적으로 알데하이드 또는 케톤은 펩타이드 위에 놓인 다음, 펩타이드 케톤 또는 펩타이드 알데하이드는 PEG와 반응하거나 조합된다. 이민 질소가 덜 염기성이기 때문에, 이러한 반응에서 불포화된 카보닐의 사용은 결합을 더 안정하고 파괴되기 어렵게 만든다. 따라서 PEG가 포화된 카보닐이 있는 펩타이드에 연결되는 실시예 9와 PEG가 불포화된 카보닐이 있는 펩타이드에 연결되는 실시예 11에서 카보닐을 비교할 수 있다. 실시예 11의 불포화된 카보닐 연결은 펩타이드와 PEG 사이의 더 내구성 있는 연결을 만드는 더 강한 결합을 형성하기 때문에 특히 중요하다. 이러한 더 강한 결합은 덜 염기성인 이민 질소를 만드는 불포화된 카보닐의 결과이고, 하이드라존 연결의 가수분해에서 제1 단계인 양성화가 용이하게 되지 않기 때문이다. 이러한 결합 유형은 이전에 펩타이드 및 PEG 또는 알킬기를 연결하는데 절대 사용되지 않았다.
페길화된 펩타이드는 잘 알려져 있지만, 하이드라자이드로 전환되는 펩타이드 락톤으로부터 제조된 페길화된 하이드라존으로부터 이들을 제조하는 이러한 방법은 신규하고 현재까지 알려지지 않았다. 페길화된 독성 살충제 펩타이드는, 이러한 살충제가 식물의 섭취를 통해 곤충에게 전달되는 경우, 경구 생체이용률이 매우 중요하기 때문에 극도로 중요하다. 어떤 면에서 이는 인간에 의해 섭취된 약물에 있어서 입으로 섭취되는 경우에 경구 생체 이용률이 얼마나 중요한지와 매우 유사하다. 두 상황에서, 약제가 얼마나 잘 "작용"하는지를 제어하는 인자는 이의 경구 생체이용률이다. 단백질의 페길화는 분자의 크기 및 분자량을 증가시킨다. 페길화는 세망내피계를 통하거나 특이적인 세포-단백질 상호작용에 의해 제거를 감소시켜 세포 단백질 제거를 감소시킨다. 추가로, 페길화는 단백질 주변에 보호 "껍질"을 형성한다. 이러한 껍질 및 이의 관련된 수화의 물은 단백질을 면역성 인식으로부터 보호하고, 단백질분해 효소, 예를 들면, 트립신, 키모트립신 및 스트렙토미케스 그리세우스(Streptomyces griseus) 프로테아제에 의한 분해에 대한 내성을 증가시킨다. 문헌 [PEGylation A Novel Process of Modifying Pharmacokinetics. J. Milton Harris, Nancy E. Martin and Marlene Modi, in Clin Pharmacolomry 2001; 40(7): 539-551 at 543]을 참고한다. 페길화는 펩타이드에 더 큰 반감기를 제공함으로써 생체이용률을 증가시킨다. 예를 들면, 페길화는 트립신에 의한 아스파라기나제의 분해를 감소시켰다: 50분 배양 기간 후, 천연 아스파라기나제, PEG-아스파라기나제 및 분지된-PEG-아스파라기나제의 각각 5, 25 및 98% 잔여 활성이 존재하였다. 동일 문헌 참고.
본 발명자들은 곤충 포식자 펩타이드를 펩타이드 락톤으로부터 펩타이드 하이드라자이드로, 최종적으로 페길화된 펩타이드인 펩타이드 하이드라존으로 전환하는 방법을 보여준다. 본 발명자들은 펩타이드 하이드라자이드(I)를 알데하이드(IV)와 혼합하여 페길화된 단백질인 펩타이드 하이드라존(III)을 제조하는 예시를 제공한다. 방법은 착물 글리콜을 강산 또는 약산으로 산성화시키고, 하이드라자이드를 가하고, 잘 혼합하여 펩타이드 하이드라존을 제조하는 것을 포함한다. 펩타이드 하이드라존은 하이드라존을 제조하는데 사용되는 카보닐에 따라 페길화된 펩타이드일 수 있다. 본 발명자들은 a) 아세트산 1 방울을 에탄올 중의 O-[2-(6-옥소카프로일아미노)에틸]-O'-메틸폴리에틸렌 글리콜(IV)로서 지칭되는 화합물의 혼합물인 스톡 용액에 가하는 단계, b) 단계 a로부터 아세트산으로 처리된 O-[2-(6-옥소카프로일아미노)에틸]-O'-메틸폴리에틸렌 글리콜(IV)(MW 대략 2'000)의 스톡 용액을 사용하고, 이를 물 중의 하이드라자이드(I) 용액에 가하는 단계, c) 혼합하고 실온에서 그대로 두는 단계, d) O-[2-(6-옥소카프로일아미노)에틸]-O'-메틸폴리에틸렌 글리콜(IV)(MW 대략 2'000)의 잔여 스톡 용액을 부분으로 나누어 가하고, 혼합 후, 혼합물을 밤새 그대로 두어 펩타이드 하이드라존(III)을 제조하는 단계에 의해, 펩타이드 하이드라존(III)을 제조하는 방법을 보여준다. 본 발명자들은 아크릴릭 케톤을 하이드라자이드에 가하여 하이드라존을 제조하는 것을 포함하는, 곤충 포식자 펩타이드 하이드라자이드를 펩타이드 하이드라존으로 전환시킬 수 있는 방법을 보여준다. 후자 방법은 에탄올 중의 아크릴릭 케톤(V)을 물 중의 하이드라자이드(I)의 용액에 가하는 단계 및 혼합하는 단계를 포함하는, 펩타이드 하이드라존(VI)의 제조 방법으로 입증된다. 본 발명자들은 또한 PEG4 케톤(VIII)을 물 중의 하이드라자이드(I)의 용액에 가하는 단계 및 혼합하여 하이드라존(IX)을 제조하는 단계를 포함하여, 펩타이드 하이드라존(IX)을 제조한다. 펩타이드 하이드라존은 따라서 우리의 방법에 따른 페길화된 펩타이드를 제조하는데 필요한 중요한 중간체인 것으로 나타난다.
본 발명자들은 명세서 및 청구항에 기재된 임의의 과정으로부터 제조된 임의의 펩타이드, 하이드라자이드 또는 하이드라존을 포함하여, 본 명세서에 기재되거나 명세서 및 청구항에서 확인되는 바와 같은 임의의 조건, 온도, 압력 및 pH 또는 산성 조건하에, 단독으로 또는 조합으로, 임의의 하나 이상의 공유 결합된 2H+O 또는 분자가 제거된 독성 펩타이드를 포함하는, 임의의 하나 이상의 공유 결합된 2H+O, 또는 H2O 또는 분자를 펩타이드로부터 제거함으로써 기재된 펩타이드의 제조 방법 및/또는 상기 방법에 의해 제조된 펩타이드 및/또는 상기 방법에 의해 제조된 살충제 조성물, 또는 명세서 및 청구항에 기재된 임의의 방법에 의해 제조된 다음, 곤충의 장소에 대한 적용에 적합한 제형으로 사용되는 펩타이드의 살충제 조성물로서의 이러한 임의의 펩타이드의 용도를 기재한다.
도 1은 서열 번호 119의 질량 분석이고, 화살표로 나타낸 피크 1은 수 11.84를 갖는다.
도 2는 서열 번호 119의 질량 분석이고, 도 1에 나타낸 피크 1의 디콘볼루션된 스펙트럼이고, 도 1의 디콘볼루션된 피크 1은 값 4562.8896을 갖는다.
도 3은 서열 번호 119의 질량 분석이고, 화살표로 나타낸 피크 2는 수 12.82를 갖는다.
도 4는 서열 번호 119의 질량 분석이고, 도 3에 나타낸 피크 2의 디콘볼루션된 스펙트럼은 질량 값 4544.8838을 갖는다.
도 5는 처리 후, 신규한 형태의 펩타이드의 독성, 즉, 피크 2와 비교된 원래 형태의 펩타이드의 독성인 피크 1의 비교를 보여주는 막대 그래프이다. 두 형태 모두 또한 대조군과 비교된다.
도 6은 액체 크로마토그래피로부터 개별적으로 생성된 피크 1 및 피크 2의 생물검정 비교이다. 피크 1 결과를 나타낸다.
도 7은 액체 크로마토그래피로부터 개별적으로 생성된 피크 1 및 피크 2의 생물검정 비교이다. 피크 2 결과를 나타낸다.
도 8은 안정성 pH 연구로부터 pH 5.6에서 서열 번호 119의 질량 분석이다.
도 9는 안정성 pH 연구로부터 pH 3.9에서 서열 번호 119의 질량 분석이다.
도 10은 안정성 pH 연구로부터 pH 8.3에서 서열 번호 119의 질량 분석이다.
도 11은 HPLC로부터의 피크 1, 2 및 3을 나타내고, 이는 가열하에 H2O 및 NH3이 서열 번호 121, 또는 천연 하이브리드로부터 개별적으로 이탈될 수 있다는 것을 나타낸다. 세 HPLC 피크의 온도 변화된 UV 흡광도는 4.2분, 5.4분 및 6.9분의 체류 시간에서 확인되었다.
도 12는 천연 하이브리드 펩타이드의 아형의 TOF MS 평가의 결과를 나타낸다.
도 13은 하이드라자이드(I)의 질량 분석이다.
도 14는 하이드라자이드(I)의 질량 분석이고, 디콘볼루션된 스펙트럼이다.
도 15는 하이드라존(II)의 질량 분석이다.
도 16은 하이드라존(II)의 질량 분석이고, 디콘볼루션된 스펙트럼이다.
도 17은 하이드라존(III)의 질량 분석이다.
도 18은 하이드라존(III)의 질량 분석이고, 보이는 분자 이온은 분포를 나타낸다.
도 19는 아크릴릭 케톤(V)의 질량 분석, UV 트레이스이다.
도 20은 아크릴릭 케톤(V)의 질량 분석이다.
도 21은 하이드라존(VI)의 질량 분석이다.
도 22은 하이드라존(VI)의 질량 분석이고, 디콘볼루션된 스펙트럼이다.
도 23은 PEG4 케톤(VIII)의 질량 분석, UV 트레이스이다.
도 24는 PEG4 케톤(VIII)의 질량 분석이다.
도 25는 하이드라존(IX)의 질량 분석이다.
도 26은 하이드라존(IX)의 질량 분석이고, 디콘볼루션된 스펙트럼이다.
정의
정의는 전체 출원, 이의 설명, 실시예 및 청구항을 고려하여 읽혀지고 이해되어야 한다.
AI는 활성 성분을 의미한다.
오토클레이브는 전형적으로 수증기에 의한 건조 공기의 제거를 허용하는, 밀폐되거나 잠금될 수 있고 수증기 및/또는 가열된 물의 첨가를 허용하는 압력 용기를 갖고, 때때로, 목적하는 경우, 임의로 건열 및/또는 고압 및 임의로 수증기로 더 높은 온도를 생성하기 위하여 수증기 펄싱 또는 순환을 허용하는 진공 펌프를 갖는 장치를 의미한다. 이는 일반적으로 벽 배출구로부터 장치에 전류를 이동시켜 장치에 의해 만들어진 열 및 압력에 동력을 공급하는 전원 코드인 부착된 전기 코드로부터 동력 곱급되지만, 이는 스토브 탑에서 가열될 수 있는 단순 압력 용기를 나타낼 수 있다.
카보닐은 알데하이드 또는 케톤을 의미한다.
챔버는 밀폐된 용기 또는 공간을 의미한다.
센티그레이드는 일반적으로 도로서 온도의 단위이고, 이는 40C와 같이 C 또는 40℃와 같이 ℃로 약칭될 수 있다.
전환하다 및 전환은 열, 열 및 수증기 및/또는 압력 또는 산 조건을 단독으로 또는 다른 인자들과의 조합으로 본 명세서에 기재된 방법을 사용하는, 형태 1로 기재된 것으로부터 형태 2로의 펩타이드의 변형을 의미한다. 전환은 본 명세서에서 더 완전하게 기재되고 예시된다.
DI는 탈이온수를 의미한다.
형태 1 또는 형태 1 펩타이드는 펩타이드의 형태를 나타내고, 형태는 폴딩되거나 이의 활성 부위 및 이의 수 또는 내부 결합의 정도를 나타내는 방식을 제시하고, 특히 형태 I 또는 형태 1은 이의 분자량으로부터 2H+O 또는 18 달톤의 손실 없이 먼저 형성되는 경우에 존재하는 펩타이드를 의미한다. 형태 1은 또한 여기서 때때로 펩타이드 산으로 지칭되는 펩타이드의 산 형태로도 알려져 있다.
형태 2 또는 형태 2 펩타이드는 펩타이드의 형태를 나타내고, 형태는 폴딩되거나 이의 활성 부위 및 이의 수 또는 내부 결합의 정도를 나타내는 방식을 제시하고, 특히 형태 II 또는 형태 2는 형태 1 펩타이드로 시작되지만, 본 명세서에 기재된 처리 조합 중 임의의 하나, 예를 들면, 형태 1로부터 형태 2로 전환되기 전과 후에 측정하는 경우, 물 분자에 대한 당량인 18 달톤의 손실을 야기하는 열, 온도, 압력, 수증기, 산, 낮은 pH 조건의 적용을 통해 변형된 펩타이드를 의미한다. 펩타이드가 하나의 형태에서 시작한 다음, 이의 분자량으로부터 2H+O 또는 18 달톤을 손실하고, 그 다음, 이는 형태 2 펩타이드로 존재한다. 형태 2는 또한 펩타이드의 락톤 형태 또는 펩타이드 락톤으로도 알려져 있다. 본 문서에서 사용되는 바와 같이, 락톤의 정의에 대하여 파트 2의 첫번째 문단을 참고한다.
제형은 일반적으로 활성 성분을 포함하는 성분의 혼합물, 여기서 전형적으로 독성 펩타이드와 용해성, 안정성, 퍼짐성, 유효성, 안전성 또는 일반적으로 활성 성분의 저장 또는 전달과 관련된 기타 목적하는 성질을 증가시키는 다른 성분의 혼합물을 의미한다.
곤충 및 처리되는 곤충은 곤충에 대한 지식이 있는 자가, 식량 또는 재료를 소비하고 파괴하는 것으로 여겨지거나 이의 성질 또는 존재가 바람직하지 않기 때문에, 이의 식량 소비 제한, 이의 성장 제한 또는 이의 수명 단축과 같은 몇몇 방식으로 방제되길 바라는 곤충을 의미한다.
곤충의 장소는 곤충이 일반적으로 살거나, 먹거나, 자거나, 이동하거나, 이로부터 유래되는 곳을 의미한다.
생리학적 활성 펩타이드는 생물학적으로 활성인 독성 펩타이드를 의미한다.
압력 용기는, 물의 첨가와 함께, 가열된 수증기 및 고온을 생성할 수 있는 건식 또는 습식 가압된 장치가 있는, 고압을 유지할 수 있는 폐쇄된 컨테이너를 의미한다. 압력 용기는 스토브 탑 가열 링과 같은 외부 공급원으로부터 또는 오토클레이브 장치의 부품으로서 동력을 제공받을 필요가 있다. 강산은 물의 용액 중에 완전하게 이온화되는 산을 의미한다. 이는 낮은 pH, 일반적으로 1 내지 3을 갖는다. 예는 염산-HCl, 브롬화수소산-HBr, 요오드화수소산-HI, 황산-H2SO4, 인산(H3PO4), 과염소산 HClO4, 질산 HNO3 및 염소산 HClO3을 포함한다.
독성 펩타이드는 곤충이 펩타이드에 노출되는 경우, 곤충에 해로운 효과를 생성하는 천연 또는 인공 아미노산으로 구성된, 천연, 인공 또는 합성 펩타이드를 의미한다. 독성 펩타이드는 거미, 뱀, 연체동물 및 달팽이와 같은 독이 있는 생물로부터 또는 이와 관련된 펩타이드인 독이 있는 펩타이드를 포함한다. 독성 펩타이드는 제US 8,217,003호 및 제US 8,501,684호에서 확인되고 기재된 펩타이드를 포함한다.
물 약 10% 또는 적어도 약 10% 또는 10% 가량은 임의의 제형 또는 혼합물이 큰 분자의 부분으로서 공유 결합된 것이 아니고 H2O 분자의 이온화를 가능하게 하는, 즉, pH를 유지할 수 있는 물 분자인, 물로서 이용 가능한, 이의 총 중량 또는 양의 적어도 약 10%를 갖는 것을 의미한다.
약산은 물 용액 중에 있을 경우, 완전하게 해리되지 않는 산을 의미한다. 이들은 일반적으로 3 내지 6의 pH를 갖는다. 예는 아세트산 및 옥살산을 포함한다. 약산은 이온화되는 분자와 그렇지 않은 분자 사이의 평형으로 존재한다.
일반적인 설명 및 과정
처리되기 전보다 거의 5배 큰 활성으로 몇몇 펩타이드의 활성을 증가시킬 수 있는, 열 단독, 가열된 물, 수증기, 열 및 압력과의 조합으로의 열 및/또는 독립적으로 산 처리를 포함하는 다양한 처리가 본 명세서에 기재된다. 높은 온도 및 압력하에 이의 활성을 손실하는 대신에, 이러한 펩타이드의 활성은 활성의 극적인 증가를 나타냈다. 본 발명자들은 우리가 생리학적 활성 및/또는 독성 펩타이드라고 부르는 펩타이드를 포함하는 몇몇 펩타이드의 활성을, 감소시키기 보다는, 증가시키는데 사용될 수 있는 변화의 성질 및 온도, 압력 및 pH 조건 및 범위를 보여준다.
이러한 펩타이드는 재배열 공정에 의하여 본질적으로 탈수화를 겪는다. 본 발명자들은 이러한 변형을 "전환"이라고 부른다. 전환은 일반적으로 독성 펩타이드가 상승된 온도, 또는 열, 수증기 및 압력의 존재 또는 부재하에, 또는 산, 또는 산과 열, 또는 열+수증기 및/또는 압력과 산, 또는 다양한 조합의 온도, 열, 압력과 열; 수증기 및 압력과 열; 산성 또는 낮은 pH; 열과 산 또는 낮은 pH; 열 및 압력과 산 또는 낮은 pH; 열, 수증기 및 압력과 산 또는 낮은 pH를 사용하여 매우 더 활성이고 더 독성인 펩타이드로 변형되는 경우에 발생한다. 전환은 열이 적용되거나 펩타이드가 물 중에 있는 경우, 낮은 pH가 펩타이드의 수성 용액에 적용되는 경우, 비교적 빠르게 발생할 수 있다. 압력 증가의 존재 또는 부재하에; 수증기의 존재 또는 부재하에, 열은 온도를 증가시키고, 산 또는 산 조건을 액체 제형에 적용함으로써 pH를 감소시키거나; 온도 및 산 둘 다의 조합은 본 명세서에 기재된 특정한 독소 펩타이드의 활성의 놀라운 증가를 야기한다. 이러한 발견과 관련된 추가의 다양한 실시형태의 관찰, 측정 및 분석이 기재되고 청구된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 곤충에 독성인 펩타이드는 하기 조건으로 처리된다; 열 단독 또는 수증기 및 압력과의 조합으로의 열, 예를 들면, 약 100℃ 내지 150℃에서 전형적인 오토클레이브 작동. 수증기 및 압력이 다양한 온도, 압력 및 산성에 따라 임의로 3, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80 또는 90분 동안 약 100 kPa 또는 15psi의 압력이 사용되는 경우, 전환은 비교적 단기간의 시간을 야기할 것이다. 전환에 적합한 조건은 펩타이드를 약 121℃의 온도 및 약 21psi의 압력에서 약 20분 동안 가열하고 유지하는 것이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 몇몇 과정은 재사용 또는 안전한 폐기를 위하여 생물학적 샘플을 오토클레이브 처리하는 경우에 사용되는 표준 과정과 유사하다.
상기 기재된 것보다 낮은 온도 및 압력이 사용되는 경우, 전환은 상기 제시된 시간보다 더 길어진다. 방법은 펩타이드의 건조 분말 또는 결정 형태에서 사용될 수 있거나, 펩타이드를 용액에 넣은 다음, 전환시킬 수 있다. 펩타이드를 수성 용액에 넣는 경우, pH는 모니터링, 조절 및 제어에 중요한 인자가 된다. 일반적으로, 낮은 pH 용액이 높은 pH 용액보다 전환이 빠르고, 전환은 pH 7.0 이상에서 거의 중단된다.
본 명세서에 기재된 방법에 적합한 전형적인 오토클레이브 작동 조건은 하기와 같다: 약 15분, 또는 약 10 내지 20분 동안, 약 100 kPa 또는 15psi, 또는 약 10 내지 20psi의 압력에서, 약 120℃ 내지 135℃로 가열된 수증기가 합리적인 시간 기간으로 전환을 만드는데 충분할 것이다. 당해 분야의 숙련가는 본 명세서에 기재된 바와 같은 측정 및 검정을 사용함으로써 전환율을 모니터링하고 제어하는 조건을 변화시키고 다르게 할 수 있을 것이다.
펩타이드 활성을 증가시키는 방법은 실온을 초과하거나 그 이상의 약간의 열을 필요로 한다. 열 그 자체 또는 수증기 존재하의 열 및/또는 압력 존재하의 열이 사용될 수 있다. 전환되는데 걸리는 시간은 열, 및/또는 수증기 및 압력 및, 관련된 경우, 펩타이드가 있는 용액의 산성이 어느 정도인지에 따라 좌우된다. 열과 시간을 더한 것은 본 명세서에서 확인된 변화 또는 전환을 만드는데 충분하다. 시간이 어느 정도 필요한지는 열이 어느 정도 사용되는지와 수증기 및 압력이 열과 함께 사용되는지 안되는지 여부에 따라 좌우된다. 유사하게, 열이 어느 정도 필요한지 여부는 펩타이드가 가열되는 시간이 어느 정도인지와 수증기 및 압력이 사용되는지 안되는지 여부에 따라 좌우된다.
펩타이드의 독성을 증가시키는데 사용될 수 있는, 수증기뿐만 아니라 압력의 존재 또는 부재하에, 가능한 열 선택사항의 몇몇 예가 기재된다. 당해 분야의 숙련가는 이러한 기술 및 예시를 사용하여 많은 다른 가능한 온도, 압력, pH 조건 및 이의 조합을 결정할 수 있을 것이다.
수증기의 존재 또는 부재하에, 온도, 시간 및 압력의 예. 수증기의 존재하에: a) 110C, 30psi, 20분; b) 120C, 15psi, 15분; c) 130C, 30psi, 컨테이너 및 이의 밀폐 여부에 따라 3분, 8분, 10분 내지 15분. 수증기의 부재하에(건조 정상 압력): a) 120C, 0psi, 12시간; b) 130C, 0psi, 6시간; c) 140C, 0psi, 3시간; d) 150C, 0psi, 2.5시간; e) 160C, 0psi, 2시간; f) 170C, 0psi, 1시간.
반응이 진행되는 시간이 충분히 제공된다면 심지어 온도의 중간 증가가 펩타이드의 목적하는 변화를 유발할 수 있다는 것을 주의하고 이해하여야 한다. 예를 들면, 실온은 전형적으로 약 20 내지 25C 범위이다. 제조 온도가 40C 만큼 적게 증가하는 경우, 반응은 다수의 시간 또는 일이 걸릴 수 있고; 하지만, 수증기 및 압력 부재하의 40C에서 반응은 매우 느리게 진행될 것이고 완료되는데 2년 만큼 길게 걸릴 수 있다. 수증기 및 압력의 부재하에 100C에서의 반응은 완료되는데 6개월 만큼 길게 걸릴 수 있다. 그러나, 반응이 120C, 15psi에서 운용되는 경우, 전환은 15분 동안 완료될 수 있다.
상기 제공된 열, 시간, 수증기, 및 압력의 예는 습식 또는 건식 제조에 사용될 수 있다. 펩타이드 독소의 상업적인 제조에서 건식 제조는 측정, 수송, 판매 및 사용이 용이하기 때문에, 건식 제조 활성은 중요하다. 수증기 열은 또한 독성 펩타이드의 제작으로부터 남은 바람직하지 않은 오염물일 수 있는 이스트 하이브리드와 같은 대부분의 살아있는 물질을 불능화 및 비활성화시키는데 사용될 수 있기 때문에, 건조 분말을 수증기 열에 노출하는 방법은 특히 바람직하다.
열, 수증기 및 압력 이외에, 펩타이드의 활성을 증가시키는데 사용될 수 있는 또 다른 독립적인 인자는 pH 또는 산성이다. 낮은 pH, 즉, 7 이하, 또는 산성은 펩타이드가 용액 중에 있는 경우, 실온에서 또는 상기 논의된 시간, 온도, 압력 및 수증기 인자와 조합으로 사용될 수 있다.
산성 및 산 조건은 전환율에 영향을 미칠 수 있는 중요한 인자로 여겨진다. 상기 기재된 방법은 펩타이드가 물이 없는 건조 형태인 경우에 발생할 수 있지만, 이는 또한 물과 혼합되는 경우, 이의 보다 활성인 형태로 전환될 수 있거나, 충분한 물로 수화되는 경우, 측정 가능한 pH를 형성할 수 있다는 것을 인식하여야 한다. 낮은 pH 또는 산 조건, 7.0 이하는 전환율과 전환 속도를 증가시키는데 사용될 수 있는 독립적인 인자로 확인되었다. 최적 pH는 약 1.5 내지 약 6, 바람직하게는 약 2 내지 약 5, 보다 바람직하게는 약 3 내지 약 4, 보다 바람직하게는 약 3.5인 것으로 나타나지만, 임의의 산 조건, 7.0 이하는 펩타이드가 용액 중에 있는 경우 반응 속도를 증가시킬 것이다. 이는 본질적으로 pH에 의해 추진되는 평형 반응이다. 7.0 이상의 pH에서 반응은 느려질 것이고, 수성 반응 조건을 사용하는 경우, 더 높은 pH는 본질적으로 비효과적일 만큼 느려질 때까지 느려지게 한다. pH 7.0 약간 이상 내지 약 7.5의 pH에서 약간의 전환이 있을 것이다. 더 높은 pH 조건에서 전환은 효과적일 만큼 느려질 것이고 일반적으로 거의 상업적 가치가 없는 것으로 간주된다.
하나의 실시형태에 있어서 펩타이드는 물과 혼합되고, pH 6.0 이하의 용액에 넣어지고, 수증기 및 압력하에 약 120℃ 내지 약 150℃의 온도에서 약 10분 미만의 빠른 전환으로 전환된다.
반응. 이론과 결부되는 것을 원하지 않고, 기재된 과정은 이것이 필요하지 않지만, 발견의 개시내용을 추가로 발전시키고 본 명세서의 교시를 개선하기 위하여, 본 발명자들은 하기 반응이 전환 동안 발생할 수 있다고 생각한다. 특정한 펩타이드가 열, 압력, 수증기, 및 산 체제에 따라 진행되는 경우, 이는 물 분자의 등가물을 손실하는 것으로 나타나고, 따라서 본 발명자들은 공정을 때때로 탈수 공정으로 지칭한다.
예시를 목적으로, 본 발명자들은 서열 번호 119(또한 하이브리드+2로도 지칭됨) 및 서열 번호 121인 2종의 서열에 대한 데이터를 제공하고, 둘 다 실시예 및 서열 목록에서 제공된다. 이들은 오직 이의 N-말단 아미노산만이 상이한 2종의 독성 펩타이드이다. 서열 번호 119는 N-말단 GS를 갖는다. 서열 번호 121은 N-말단 GS를 갖지 않는다. 서열 번호 121은 39 아미노산을 갖고, 이는 서열 번호 119에서 확인된 39 C-말단 아미노산과 동일하다. 이러한 독성 펩타이드는 전환을 입증하고 설명하는데 유용하다.
본 발명자들은 무엇이 전환이 아닌지를 설명하는 것으로 시작한다. 전환은 글루타민 또는 서열 번호 121에서 Q와 같이 아미노산을 갖는 N-말단이 있는 펩타이드가 자발적으로 파이로글루탐산과 같은 고리 화합물을 형성하는 경우가 아니다. 예를 들면, 서열 번호 121 N-말단 글루탐산은 파이로글루탐산을 형성할 수 있다. 여기서 본 발명자들은 유리 NH3 기를 갖는 N-말단 또는 내부 아미노산의 자발적인 고리화를 "NH3 반응"으로 지칭한다. NH3 반응은 전환이 아니고, 이는 전환과 비슷하지 않다. 본 발명자들은 전환을 "2H+O 반응" 또는 "H2O 반응" 또는 "탈수 반응"이라고 지칭하고, 이는 NH3 반응과 완전히 상이하다. 우리가 실시예 5에 증명한 바와 같이, 둘 다 동일한 펩타이드에 의해 발생할 수 있다. 단일 펩타이드의 두 형태의 존재 및 한 형태를 다른 것으로, 또는 적어도 2H+O를 갖는 형태를 이를 갖지 않는 형태로 변화시키는 제어된 능력은 이러한 2종의 펩타이드에 의해 입증되고 하기 실시예에서 특성화되고 설명된다.
전환을 위한 최적의 펩타이드.
본 발명자들은 하기 상세하게 기재된 것들을 포함하여 많은 펩타이드가 전환에 적합하다고 생각한다. 독성 곤충 펩타이드 또는 곤충 포식자 펩타이드는 2, 3 또는 4 시스틴 결합을 갖고, 이는 이들이 4, 6, 또는 8 시스테인을 갖는 것을 의미한다. 이들은 약 10 아미노산 잔기 이상 및 약 300 아미노산 잔기 이하의 펩타이드이다. 보다 바람직하게는 이들은 약 20 aa 내지 약 50 아미노산의 아미노산 또는 aa 크기 범위이다. 이들은 약 550 Da 내지 약 350,000 Da의 분자량 범위이다. 이들은 높은 열 및 낮은 pH에 노출시 놀라운 안정성을 나타낸다. 독성 곤충 펩타이드는 살충제 활성의 몇몇 유형을 갖는다. 전형적으로 이들은 곤충에 주사되는 경우 활성을 나타내지만, 대부분은 곤충에 국소적으로 적용되는 경우 유의미한 활성을 나타내지 않는다. 독성 곤충 펩타이드의 살충제 활성은 다양한 방식으로 측정된다. 일반적인 측정 방법은 당해 분야의 숙련가에게 광범위하게 알려져 있다. 이러한 방법은 마비, 사망, 중량 증가 실패 등과 같은 다양한 파라미터의 점수화를 기반으로 용량-반응 플롯의 핏팅에 의한 중앙 반응 용량(예를 들면, LD50, PD50, LC50, ED50)의 측정을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 측정은 당해 살충제 제형의 다양한 용량에 노출된 곤충 집단에 대해서 수행될 수 있다. 데이터의 분석은 프로빗 분석 및/또는 힐(Hill) 공식 등에 의해 정의된 곡선을 생성함으로써 수행될 수 있다. 이러한 경우, 용량은 피하 주사, 고압 주입, 음식 또는 미끼 등의 샘플의 부분으로서 살충제 제형의 제공에 의해 투여될 것이다.
독성 곤충 펩타이드는 여기서 피하 주사, 고압 주입에 의해 곤충에의 전달, 또는 곤충에의 경구 전달(즉, 곤충에게 제공되는 음식의 샘플의 부분으로서의 섭취)에 의해 살충성을 나타내는 모든 펩타이드로 정의된다. 이러한 펩타이드 부류는 따라서 거미, 진드기, 전갈, 뱀, 달팽이 등의 독의 구성분으로서 천연적으로 생성된 많은 펩타이드를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 이러한 부류는 또한 식물에 의해 생성된 다양한 펩타이드(예를 들면, 다양한 렉틴, 리보솜 불활성화 단백질, 및 시스틴 프로테아제), 및 곤충병원성 미생물에 의해 생성된 다양한 펩타이드(예를 들면, 다양한 바실러스 종에 의해 생성된 단백질의 크릴/델타 내독소 패밀리)를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
하기 문서는 미국 및 허용되는 다른 관할구역에서 이의 전문이 참고로서 인용되고, 이들은 이들의 문헌에서 제공된 일반적인 지식이다. 추가로, 이들은 이들이 펩타이드 서열을 기재하는 정도로 이의 서열 목록에 대하여 참고로서 인용되고 특정하게 공지된다. 하기를 참고한다: 2008년 4월 8일에 발행된 미국 특허 제7,354,993 B2호, 특히 서열 목록에 열거된 펩타이드 서열, 및 1 내지 39번의 것들, 및 U-ACTX 폴리펩타이드로 명명된 것들, 2-4 사슬간 이황화 브릿지, 및 이의 변이를 형성할 수 있는 독소, 및 명세서의 4-9열 및 도 1에 나타난 펩타이드. 공고 2008/41, 08.10.2008에 공개되고 결정된 유럽 특허 제1 812 464 B1호, 특히 서열 목록에 열거된 펩타이드 서열, 2-4 사슬간 이황화 브릿지를 형성할 수 있는 독소, 및 1 내지 39번의 것들, 및 U-ACTX 폴리펩타이드로 명명된 것들, 및 이의 변이, 및 문단 0023 내지 0055에 나타나고 이러한 특허의 도 1에 나타난 펩타이드.
본 명세서에서 확인된 펩타이드에 대하여 기재되고 참고로서 인용된 것은 언급된 서열의 상동성 변이이고, 이는 또한 본 명세서에 기재된 방법에 따른 전환에 적합한 것으로 확인되고 청구된 이러한 서열에 상동성을 갖고, 이는 본 명세서에 기재된 임의의 서열 또는 참고로서 인용된 임의의 서열에 적어도 임의의 하기 퍼센트 동일성을 갖는 상동성 서열을 포함하는 모든 상동성 서열을 포함하지만 이에 한정되지 않는다: 상기 기재된 특허에서 확인된 임의의 및 모든 서열, 및 본 출원의 서열 목록의 각각의 및 모든 서열을 포함하여 본 명세서에서 확인된 임의의 다른 서열에 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 또는 그 이상의 동일성. 30% 이상과 같은 수와 함께 용어 상동 또는 상동성이 본 명세서에서 사용되는 경우, 이는 두 펩타이드 사이의 퍼센트 동일성 또는 퍼센트 유사성을 의미하는 것이다. 상동 또는 상동성이 수치 퍼센트 없이 사용되는 경우, 이는 이들이 국소적인 독성 및 100% 이상의 길이 또는 50% 짧은 길이 내의 유사한 크기 또는 펩타이드와 같은 공통적인 물리적 및 기능적 측면을 공유한다는 점에서 진화적이거나 발달적인 측면에서 밀접하게 관련된 두 펩타이드 서열을 나타낸다.
본 명세서에서 확인된 펩타이드에 대하여 기재되고 참고로서 인용된 것은 상기 언급된 미국 및 유럽 특허 문서에 언급된 임의의 공급원으로부터 유래되고, 이는 하기를 포함하지만 이에 한정되지 않는다: 식물 및 곤충으로부터 단리된 독소, 특히 곤충을 잡아먹거나 곤충으로부터 자신을 방어하는 거미, 전갈 및 식물, 예를 들면, 깔대기 그물 거미 및 특히 오스트레일리아 깔대기 그물 거미로부터의 독소로서, 이는 하드로니케 베르수타(Hadronyche versuta), 또는 블루 마운틴 깔대기 그물 거미, 아트락스 로부스투스(Atrax robustus), 아트락스 포르미다빌리스(Atrax formidabilis), 아트락스 인펜수스(Atrax infensus) 종 속을 포함하는 아트락스(Atrax) 또는 하드로니케(Hadronyche) 종에서 발견되거나, 이로부터 단리되거나, 이로부터 유래된 독소를 포함하고, "아트라코톡신", "co-아트라코톡신", "카파" 아트라코톡신, 또한 ω-아트라코톡신로도 알려진 "오메가" 아트라코톡신, U-ACTX 폴리펩타이드, U-ACTX-Hvla, rU-ACTX-Hvla, rU-ACTX-Hvlb로 알려진 독소, 또는 돌연변이 또는 변이, 특히 임의의 이러한 유형의 펩타이드 및 특히 약 200 아미노산 미만이지만 약 10 아미노산 초과의 펩타이드, 및 특히 약 150 아미노산 미만이지만 약 20 아미노산 초과의 펩타이드, 특히 약 100 아미노산 미만이지만 약 25 아미노산 초과의 펩타이드, 특히 약 65 아미노산 미만이지만 약 25 아미노산 초과의 펩타이드, 특히 약 55 아미노산 미만이지만 약 25 아미노산 초과의 펩타이드, 특히 약 37 또는 39 또는 약 36 내지 42 아미노산의 펩타이드, 특히 약 55 아미노산 미만이지만 약 25 아미노산 초과의 펩타이드, 특히 약 45 아미노산 미만이지만 약 35 아미노산 초과의 펩타이드, 특히 약 115 아미노산 미만이지만 약 75 아미노산 초과의 펩타이드, 특히 약 105 아미노산 미만이지만 약 85 아미노산 초과의 펩타이드, 특히 약 100 아미노산 미만이지만 약 90 아미노산 초과의 펩타이드를 포함하고, 2, 3 및/또는 4 이상의 사슬간 이황화 브릿지를 형성할 수 있다고 여기서 언급된 임의의 길이의 펩타이드 독소를 포함하고, 칼륨 채널 흐름, 특히 곤충 칼슘 채널 또는 이의 하이브리드를 방해하는 독소를 포함하는 칼슘 채널 흐름을 방해하는 독소, 특히 임의의 이러한 유형의 독소 또는 이의 변이, 및 국소적 살충 활성을 갖는 본 명세서에 기재된 임의의 유형의 독소의 임의의 조합을 포함하는 독소는 본 명세서에 기재된 방법에 의해 전환될 수 있다.
동일하거나 다른 펩타이드는 본 명세서에 기재된 펩타이드에 접합될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 형태 1로부터 형태로의 전환은 내부 전환이고, N 및 C 말단 펩타이드는 영향을 받지 않고, 따라서 N 및 C 말단 아미노산은 공유 결합 파트너를 지닐 수 있고, 이들은 길거나 짧을 수 있다. 본 발명자들은 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 50 아미노산 또는 그 이하의 펩타이드 접합체가 기재된 것 이외에 1000 아미노산 이하의 크기인 결합 파트너를 상세하게 기재한다.
아트락스 및 하드로니케 종의 오스트레일리아 깔대기 그물 거미로부터의 독이 있는 펩타이드는 본 발명에 기재된 방법, 과정 또는 공정으로 처리되는 경우, 특히 적합하고 효과가 있다. 특히 독성 전갈 및 독성 식물 펩타이드를 포함한 많은 다른 독성 펩타이드와 같이 이러한 거미 펩타이드는 본 발명에 기재된 방법에 의해 처리되는 경우, 국소적으로 활성 또는 독성이 된다. 데이터와 함께 시험된 적합한 펩타이드의 예가 본 명세서에 제공된다. 상기 언급된 유기체 이외에, 하기 종이 또한 본 발명의 방법에 의한 전환에 적합한 독소를 지닐 수 있다. 하기 종이 명명된다: 아젤레놉시스 아페르타(Agelenopsis aperta), 안드록토누스 아우스트랄리스 헥토르(Androctonus australis Hector), 안트락스 포르미다빌리스(Antrax formidabillis), 안트락스 인펜수스(Antrax infensus), 아트락스 로부스투스, 바실루스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis), 보투스 마르텐시 카르쉬(Bothus martensii Karsch), 보투스 옥시타누스 투네타누스(Bothus occitanus tunetanus), 부타쿠스 아레니콜라(Buthacus arenicola), 부토투스 주다이쿠스(Buthotus judaicus), 부투스 옥시타누스 마르도케이(Buthus occitanus mardochei), 센트루로이데스 녹시우스(Centruroides noxius), 센트루로이데스 수푸수스 수푸수프(Centruroides suffusus suffusus), 하드로니케 인펜사(Hadronyche infensa), 하드로니케 베르수타, 하드로니케 베르수투스(Hadronyche versutus), 홀롤레나 쿠르타(Hololena curta), 호텐토타 주다이카(Hottentotta judaica), 레이우루스 퀸퀘스트리아투스(Leiurus quinquestriatus), 레이우루스 퀸퀘스트리아투스 헤브라에우스(Leiurus quinquestriatus hebraeus), 레이우루스 퀸퀘스트리아투스 퀸퀘스트리아투스(Leiurus quinquestriatus quinquestriatus), 올덴란디아 아피니스(Oldenlandia affinis), 스코르피오 마우루스 팔마투스(Scorpio maurus palmatus), 티티우스 세르룰라투스(Tityus serrulatus), 티티우스 줄리아누(Tityus zulianu). 상기 열거된 임의의 종으로부터의 임의의 펩타이드 독소는 본 발명의 방법에 따른 전환을 위하여 고려될 수 있다.
본 명세서에서 실시예는 본 발명을 한정하는 것을 의도하지 않으며 본 발명을 한정하는데 사용되어서는 안되고, 오직 본 발명을 예시화하기 위하여 제공된다.
상기 기재된 바와 같이, 많은 펩타이드는 전환의 적합한 후보이다. 상기, 하기 및 서열 목록에 기재된 서열은 전환될 수 있는 특히 적합한 펩타이드이다. 하기 실시예에 기재된 바와 같이 이러한 몇몇 펩타이드를 본 명세서에 기재된 과정에 따라 전환하였다.
서열 번호 60(한 문자 코드)
Figure 112016106445719-pct00001
서열 번호 60(세 문자 코드)
Figure 112016106445719-pct00002
"ω-ACTX-Hvla"로 명명되고, 이는 4 내지 18, 11 내지 22 및 17 내지 36번 위치에 이황화 브릿지를 갖는다. 분자량은 4096이다.
서열 번호 117(한 문자 코드)
Figure 112016106445719-pct00003
서열 번호 117(세 문자 코드)
Figure 112016106445719-pct00004
"ω-ACTX-Hvla+2"로 명명되고, 이는 6 내지 20, 13 내지 24 및 19 내지 38번 위치에 이황화 브릿지를 갖는다. 분자량은 4199이다.
서열 번호 118(한 문자 코드)
Figure 112016106445719-pct00005
서열 번호 118(세 문자 코드)
Figure 112016106445719-pct00006
"rκ-ACTX-Hvlc"로 명명되고, 이는 5 내지 19, 12 내지 24, 15 내지 16, 18 내지 34번 위치에 이황화 브릿지를 갖는다. 분자량은 3912.15이다.
서열 번호 119(한 문자 코드)
Figure 112016106445719-pct00007
서열 번호 119(세 문자 코드)
Figure 112016106445719-pct00008
"rU-ACTX-Hvla("하이브리드")+2"로 명명되고, 이는 5 내지 20, 12 내지 25, 19 내지 39번 위치에 이황화 브릿지를 갖는다. 분자량은 4570.51이다.
하기 실시예는 추가로 기재된 설명을 예시하고 제공하고 본 기재내용을 지지하는 것을 의도한다. 이들은 기재내용 또는 청구항을 한정하는 것을 의도하지 않는다.
실시예
실시예에 대한 일반적인 정보
서열 번호 119는 GSQYCVPVDQPCSLNTQPCCDDATCTQERNENGHTVYYCRA이다. 서열 번호 119는 41 아미노산을 갖는다. 적절하게 폴딩되는 경우, 이는 3 이황화 결합을 갖는다. 이는 C185H276N56O68S6의 원소 조성을 갖는다. 서열 번호 119는 "+2 하이브리드", "하이브리드+2", 또는 "플러스 2 하이브리드"로 지칭될 수 있다. 서열 번호 121은 QYCVPVDQPCSLNTQPCCDDATCTQERNENGHTVYYCRA이다. 서열 번호 121은 39 아미노산을 갖고, 이들은 서열 번호 119와 39 "C" 말단 아미노산이 동일하다. 서열 번호 121은 "천연" 또는 "천연 하이브리드" 또는 "천연 하이브리드 펩타이드"로 지칭될 수 있다.
서열 번호 119의 N-말단 아미노산은 "G," 글리신 또는 Gly이다. 서열 번호 119의 2개의 N-말단 아미노산은 "GS"이고, 이들 아미노산은 서열 번호 121의 N-말단의 부분이 아니다. 서열 번호 121의 N-말단은 "Q" 또는 글루타민이다.
서열 번호 121과 같이, 글루타민, Q 또는 Gin에서의 서열 종결은 자발적으로 글루타민으로부터 파이로글루탐산으로 고리화를 겪는 것이 가능하다. 반응은 빠를 수 있고, 자발적일 수 있으며, 열 또는 산의 첨가를 필요로 하지 않는다. 때때로 N-말단 고리화인 이러한 아미노기는 펩타이드에서 발생하는 것으로 알려져 있고, 이는 펩타이드의 17 질량 단위, 원자 단위 또는 달톤 손실을 야기하고, 이는 고리화에서 NH3의 17 달톤 손실과 관련된다. 본 발명자들은 이러한 반응을 "NH3 반응"으로 나타내고, 이는 우리가 전환이라고 지칭하는 것이 아니다. 본 발명자들은 이러한 반응을 하기 실시예 5에서 보다 상세히 설명한다.
본 발명자들은 서열 번호 121과 같은 독성 펩타이드에 열을 적용하는 경우, 매우 상이한 반응이 발생하는 것으로 생각하고, 본 발명자들은 이러한 반응을 전환 또는 "2H+O 반응"으로 나타낸다. 전환은 펩타이드 활성의 놀라운 증가를 야기하고, 이는 완전히 상이한 반응이고, 펩타이드는 NH3 반응을 경험하는 펩타이드에서 발생하는 것과 비교하여 상이한 성질을 갖는다.
전환으로부터 야기된 활성의 증가는 거의 5배, 또는 5X일 수 있고, 데이터는 하기 나타낸다. 독성 펩타이드가 우리가 본 명세서에 기재한 임의의 전환 조건, 즉, 열, 압력, 수증기, 수성 용액에 있어서 산 조건에 노출되는 경우, 본 발명자들은 "2H+O 반응"이 증가된 활성을 갖는 펩타이드를 야기하는 것으로 생각한다.
전환, 또는 2H+O 반응은 반응 시작 전보다 하나 적은 물 분자를 갖는 화합물을 야기한다. 하기, 본 발명자들은 전환으로부터 야기된 펩타이드가 H2O가 하나 적거나 18 달톤이 적은 펩타이드를 야기하고, 본질적으로 탈수되지만 또한 전환되기 전 펩타이드보다 매우 더 강력하고 독성인 펩타이드라는 것을 나타내는 데이터를 제공한다. 이는 본 명세서에서 형태 1 또는 피크 1로 지칭된 원래 형태가 전환된 형태 2 펩타이드와 비교하여 18 달톤을 더 갖고 있는, 펩타이드 변화의 형태이다.
질량 분석은 2H+O 반응이 NH3 반응과 동일한 것이 아니고, 그보다, 2H+O 반응은 NH3의 17 달톤 대신에 H2O의 18 달톤과 관련된 18 달톤 손실을 야기한다는 것을 증명한다. 본 발명자들은 실시예 1에서 2H+O 반응에서 H2O의 달톤 손실을 보이고, NH3의 17 달톤 손실은 실시예 5에 제공된다.
실시예 1
질량 분석 피크 1/형태 1 및 피크 2/형태 2. 도 1 내지 4에서, 하기 제공된 캡션 및 설명과 함께, 서열 번호 119의 질량 분석을 나타내고, 이는 2개의 별개의 피크를 갖는다. 2개의 피크는 굵은 글씨체의 큰 수 및 수를 가리키는 괄호 모양의 화살표에 의해 확인된다. 본 발명자들은 피크 1 및 피크 2로서 2개의 피크를 나타낸다. 이러한 도면에서 스펙트럼은 워터스 나노 액큐티(Waters Nano Acquity) UPLC 시스템과 연결된 워터스/마이크로매스(Waters/Micromass) 사중극자 비행시간(time-of-flight)(Q-Tof 프리미어) 질량 분석계를 사용하여 생성하고 분석하였다.
도 1은 질량 분석을 나타내고, 화살표로 표시된 피크 1은 11.84이다.
도 2는 서열 번호 119의 질량 분석이고, 도 1에 나타난 피크 1의 디콘볼루션된 스펙트럼이고, 도 1의 디콘볼루션된 피크 1은 값 4562.8896을 갖는다.
도 3은 질량 분석을 나타내고, 화살표로 표시된 피크 2는 수 12.82를 갖는다. 도 4는 서열 번호 119의 질량 분석이고, 질량 값 4544.8838을 갖는 도 3에 나타난 피크 2의 디콘볼루션된 스펙트럼이다.
도 1 내지 4는 피크 1과 피크 2 사이의 차이가 18 달톤 또는 2H+O라는 것을 보여준다.
도 2 및 4로부터의 2개의 질량 값을 하나로부터 다른 것을 빼는 경우, 4562.8896 - 4544.8838 = 18.00로, 값은 물 분자의 질량 값에 상응하는 18이다. 피크 2는 또한 펩타이드의 "탈수된 형태", 또는 펩타이드 락톤 또는 형태 2로서 지칭된다. 락톤은 파트 2의 시작에 정의된다. 피크 2는 피크 1을 나타내는 구조와 비교시 이의 구조로부터 물 분자를 손실한 형태를 갖는 펩타이드를 나타낸다. 피크 1 및 2로 지시된 펩타이드 및 이의 형태를 단리시키고 이의 활성을 비교하였다. 하기 실시예는 하기 중 임의로 지칭되는 원래 형태의 활성의 비교를 제공한다: 피크 1, 형태 1, 천연, 산 형태, 펩타이드 산, 펩타이드의 원래, 전환전, 미전환, 또는 전환되지 않은 형태. 형태 1은, 이를 형태 2 또는 파트 2에 정의된 락톤과 같은 락톤 형태 또는 펩타이드 락톤으로 변화시키기 위하여, 가열되거나 산성화되는 형태 또는 산 형태이다. 이러한 몇몇 실시예에서, 하기 중 임의로 지칭되는 펩타이드로 전환하기 위하여, 열 처리는 약 121℃에서 20분 동안 21psi에서 오토클레이브 처리이거나, 펩타이드가 액체 형태 중에 존재하는 경우, pH를 7.0 미만으로 낮추는 것을 의미한다: 피크 2, 형태 2, 락톤 형태, 펩타이드 락톤(파트 2에서 정의된 락톤과 같음), 펩타이드의 탈수된 형태, 또는 펩타이드의 전환된 형태.
실시예 2
식이 포함 연구. 도 5의 그래프는 피크 2에 의해 지시된 락톤 형태, 또는 펩타이드 락톤, 처리후 또는 전환된 펩타이드의 독성과 비교된 원래 형태, 피크 1, 펩타이드 산, 미전환 펩타이드의 독성의 비교를 나타낸다. 두 형태는 또한 대조군과 비교된다. 도 5는 배고픈 애벌레에게 대조군 또는 처리된 식이가 공급한 후, 1, 2, 3, 및 4일에 죽은 유충의 퍼센트(100%는 모든 유충 16마리의 죽음일 것이다)를 나타낸다. 이러한 연구에서 사용된 펩타이드는 서열 번호 119이고, 이는 두 용어가 동일한 것을 의미하는 분말 618 또는 618 하이브리드 분말로 지칭된 분무 건조된 분말로 제형화되었다. 곤충은 이의 먹이 중의 2ppt(천분율)의 동일한 용량 비율로 투여되었다. 피크 1은 전환 또는 처리 전의 원래 펩타이드이고, 이는 또한 "종래의 618" 또는 단순하게 618 분말 또는 건조 분말로 지칭된다. 피크 2는 전환 또는 처리 후, 이 경우, 20분 동안 121℃ 및 21psi에서, 즉, 높은 온도, 수증기 및 압력에서 오토클레이브 처리 후의 펩타이드이다. 피크 2는 도 5에서 "6-18 건조 분말 오토클레이브 처리"로 명명된다. 도 5는 수평축 또는 X축의 각각의 숫자에 대하여 데이터 또는 막대의 3 세트에 대한 막대 그래프 형태의 데이터를 제공하고, 숫자는, 실제 공충인 남부 옥수수 뿌리벌레(SCR)로 지칭된, 연구에 사용된 곤충에게 공급된 후의 일수이고, 시험은 유충 단계에서 수행되었다. 16마리의 곤충 유충을 사용하여 각각의 시험을 시작하였다. 범례는 도 5에 나타내고, 이는 펩타이드 락톤인 형태 2를 곤충에 공급한 결과인, 4일 위의 세 그룹의 막대의 우측에 있는 4일 위에 보이는 큰 검은 막대를 설명한다. 질량 분석의 피크 2는 펩타이드 락톤 형태인 펩타이드의 전환된 형태 2이다. 도 5에서, 4일에, 피크 2인 검은 막대는 펩타이드의 전환된 형태 2를 섭취한 유충의 사망률을 나타낸다. 이 경우에 형태 2는 형태 1을 오토클레이브 처리함으로써 전환되었다. 4일에, 형태 1, 펩타이드 산, 또는 천연 또는 미전환 펩타이드의 형태의 약 22% 사망률과 비교하여, 펩타이드 락톤인 형태 2의 뿌리벌레 사망률의 95% 수준이 존재한다. 4일에서 대조군은 5% 미만의 사망률을 갖는다. 애벌레에 미처리된 곤충 식이, 즉, 대조군을 공급하였고, 이는 도 5에서 미세한 회색 십자 무늬인, 각일의 첫번째 막대이다. 큰 흑색과 백색의 십자 무늬 패턴을 갖는 두번째 막대는 전환 전의 펩타이드인 질량 분석의 피크 1에 의해 지시된 형태 1의 펩타이드가 공급된 애벌레에 대한 데이터를 나타낸다. 미세한 검은 막대인 세번째 막대는 질량 분석 검정에서 피크 2에 의해 지시된 형태 2가 공급된 애벌레에 대한 데이터를 나타낸다. 공급 후 1-4일은 4일에 가장 높은 사망률을 보인다. Y축은 죽은 유충의 퍼센트를 나타내고, 시작시 16마리의 살아있는 유충이 존재하였다.
곤충에게 공급된 후 4일에, 종래의 618(전환 전)과 오토클레이브 처리된 618(전환 후) 사이의 퍼센트 사망률 차이는 확연해졌다. 오토클레이브 처리는 애벌레가 처리된 음식을 먹은 후 더 빠르고 신속한 죽음을 야기한다. 618 건조 분말 형태 1, 천연 펩타이드 또는 전환되지 않은 펩타이드, 형태 1이 약 22%인 것과 비교하여, 형태 2로 처리된 후 죽은 곤충의 수는 약 95%이다. 정상 펩타이드를 오토클레이브 처리하는 것은 예상된 바와 같이 하이브리드 단백질을 불활성화시키지 않고, 대신에, 이의 활성을 향상시킨다. 효능에서 극적인 변화는 몇몇 이유가 존재할 수 있다.
방법: 곤충: SCR은 크롭 캐릭터리스틱스(Crop Characteristics)(미네소타주의 파밍턴시에 소재)로부터 구입한다. 곤충은 여과지 위의 "부화 준비상태"로 제공받았다. 곤충을 실온에서(26C)에서 부화시키고, 이들이 배송된 플라스틱 백 안에 놔두었다. 곤충은 1-2일 후 부화되었고, 검정을 위하여 부화일에 사용되었다.
배지: SCR 유충 식이는 바이오서브(Bioserve)(제품# F9800B, 뉴저지주의 프렌치타운시에 소재)로부터 구입하였다. 식이 100㎖를 만들기 위하여, DI 물 100㎖를 제공된 아가 1.44g과 함께 끓였다. 아가가 완전히 용해될 때까지 용액을 끓인다. 그 다음, 식이 13.28g 및 KOH 460ul를 가하고, 배지를 따뜻한 교반 플레이트 위에서 균일해질 때까지 혼합한다. 그 다음, 배지를 20㎖ 부분으로 분취하고, 물 욕조에서 65C로 냉각시킨다.
처리: 25% AI의 계산을 사용하여 618 처리를 제조하였다. 분말 260mg을 물 6.5㎖와 혼합하여 10ppt 용액을 만들었다(10mg/㎖). 용액을 철저하게 혼합하고, 필요한 경우, 초음파처리하여 모든 분말을 완전하게 용해시킨다. 618 분말 200mg을 상부에 스크류가 있는 유리병에 넣었다. 그 다음, 분말을 느슨한 뚜껑하에 20분 건조 사이클로 오토클레이브 처리하였다. 오토클레이브 사이클 후, 분말은 약간의 액체를 흡수하였다. 그 다음, 물 5㎖를 분말에 가하고, 잘 혼합하여 용해시켰다. 그 다음, 물 또는 처리 5㎖를 65C 음식 20㎖에 가하고, 잘 혼합한 다음, DI 1㎖를 반복 피페터를 사용하여 벌레 콘도(바이오서브 제품# BAW128)의 각각의 웰에 옮기고, 냉각되도록 둔다.
그 다음, 배지가 냉각되고 굳으면(20분), 곤충을 웰당 하나씩 페인트 붓을 사용하여 적용하여 SCR를 옮긴다. 그 다음, 웰을 천공 리드(바이오서브 제품# BACV16)로 밀봉하고, 곤충 실험실에서 라이트 카트에 둔다.
실시예 3
생물검정 비교. 생물검정 비교의 결과를 도 6 및 7에 나타낸다. 피크 1 및 피크 2를 개별적으로 생성하고, 도 1 내지 4에 나타낸 연구를 수행하는데 사용된 것들과 유사하게, 개별적으로 액체 크로마토그래피 컬럼으로부터 단리하였다. 이러한 비교를 위하여 서열 번호 119의 펩타이드를 사용하였다. 전환전 피크인 피크 1, 또는 전환후 피크인 피크 2를 수득하고, 측정된 농도로 만든 다음, 집파리에 주사로 투여하였다. 파리의 LD50 또는 50%의 치사량을 p㏖/그램의 농도로서 측정하였다. 파리의 중량은 12 내지 20mg이었다. 각각의 샘플에서 10마리의 파리가 존재하였다. 표준 p㏖/g 용액 제조시 피크 1 형태와 피크 2 형태 사이의 분자량 차이는 고려하지 않았다. LD50 용액을 만드는 모든 용액은 RpHPLC, 또는 역상 고압 액체 크로마토그래피를 사용하여 우리가 "초 LC" 또는 초 액체 농축물이라고 지칭하는 것으로부터 제조하였다.
도 6은 피크 1과 피크 2의 생물검정 비교이고, 각각의 피크 분획은 개별적으로 액체 크로마토그래피로부터 제조되었다. 피크 1 생물검정 결과를 나타낸다.
도 7은 피크 1과 피크 2의 생물검정 비교이고, 각각의 피크 분획은 개별적으로 액체 크로마토그래피로부터 제조되었다. 피크 2 생물검정 결과를 나타낸다.
치사량 50으로서 생물검정 비교의 결과는 하기 표 1에 제공된다.
표 1, 하기.
용액 LD50(p㏖/g)
하이브리드+2 피크 1 127
하이브리드+2 피크 2 92
실시예 4
안정성 pH 연구. 이는 안정성 및 pH 연구 둘 다였다. 이는 전환전 또는 형태 1을 전환후 또는 형태 2 펩타이드에 대하여 비교한다. 연구는 서열 번호 119의 펩타이드를 사용하였고, 열 이외에, 산 또는 임의의 pH를 7.0 이하로 낮추는 수단으로 펩타이드 용액의 pH를 낮추는 pH의 감소가 형태 1로부터 형태 2로 펩타이드의 증가된 전환을 야기할 것임을 나타낸다. 안정성 pH 연구 결과를 도 8 내지 10에 나타낸다.
도 8은 pH 5.6에서 서열 번호 119의 질량 분석이다. 도 9는 pH 3.9에서 서열 번호 119의 질량 분석이다. 도 10은 pH 8.3에서 서열 번호 119의 질량 분석이다. 도 8, 9 및 10은, 특정하게 확인되지는 않지만, 피크 1 및 피크 2를 나타낸다. 모든 세 도면에서 피크 1은 피크 2의 좌측에 있고, 둘 다 도면에서 큰 피크이다. 이러한 세 도면, 도 8, 9 및 10은 이러한 연구에서 생성된 대표적인 질량 분석 결과이다. 이러한 도면으로부터의 데이터 및 다른 데이터를 하기 표 2 내지 7에 나타낸다. 피크 1은 피크 2 전에 용리된다. 도 8에서, 두 피크 높이는 거의 동일하다. 도 9에서, 피크 2는 피크 1보다 크다. 도 10에서, 피크 1은 피크 2보다 크다. 이러한 연구에서 모든 샘플은 pH 2 또는 pH 10 버퍼 2㎖를 초 액체 농축물(54PPT) 2㎖에 가함으로써 제조되었다. 샘플을 애질런트(Agilent) HPLC에서 분석하였다. 5 마이크로리터 주사 용적을 사용하였다. 결과를 하기 기재한다.
표 2, 하기.
pH 3.9 및 8.3에서 샘플 1
샘플 피크 1 높이 피크 2 높이
LC pH 5.6 2360 2225
LC pH 3.9 2948 1630
LC pH 8.3 2000 1526
관찰. 두 pH 용액에서 피크 2 높이의 약간의 감소
표 3, 하기.
25℃에서 24시간 동안 pH 3.9 및 8.3에서 샘플 2
샘플 피크 1 높이 피크 2 높이
LC pH 5.6 2359 2215
LC pH 3.9 2001 1670
LC pH 8.3 2023 1527
관찰. 두 pH 용액에서 피크 2 높이의 약간의 감소
표 4, 하기.
25℃에서 96시간 동안 pH 4.0 및 7.8에서 샘플 3
샘플 피크 1 높이 피크 2 높이
LC pH 5.6 2341 2198
LC pH 4.0 1887 1795
LC pH 7.8 2038 1355
관찰. 용액의 pH가 높을수록 피크 2 높이가 크게 감소
표 5, 하기.
40℃에서 72시간 동안 pH 3.9 및 8.3에서 샘플 4
샘플 피크 1 높이 피크 2 높이
LC pH 5.6 2325 2275
LC pH 3.9 1365 2104
LC pH 8.3 2082 782
관찰. 낮은 pH 용액에서 피크 1 높이의 감소. 높은 pH 용액에서 피크 2의 감소.
표 6, 하기.
75℃에서 1시간 동안 pH 3.9 및 8.3에서 샘플 5
샘플 피크 1 높이 피크 2 높이
LC pH 5.6 2359 2272
LC pH 3.9 1807 1869
LC pH 8.3 2008 1493
관찰. 높은 pH 용액에서 피크 2 높이의 약간의 감소
표 7, 하기.
75℃에서 3시간 동안 pH 3.9 및 8.3에서 샘플 6
샘플 피크 1 높이 피크 2 높이
LC pH 5.6 2117 2111
LC pH 1.6 855 800
LC pH 3.9* 1038 1716
LC pH 7.5 1630 798
LC pH 9.4* 689 -
* 적절한 pH를 수득하기 위하여 버퍼로 1:3 희석
관찰. pH 3.9 용액에서 피크 1 높이의 감소. pH 7.5 용액에서 피크 2 높이의 감소. pH 9.4 용액에서 피크 2의 손실.
이러한 연구는 수성 용액에 혼입되고, 상이한 pH 또는 산성 수준으로 조정된 후, 전환전 펩타이드 형태 1인 피크 1 및 전환된 펩타이드 형태 2인 피크 2를 나타낸다. 연구는 용액 중에서 형태 1로부터 형태 2로의 자연적 이동은 어렵고 거의 없거나 존재하지 않음을 나타낸다. 펩타이드 형태는 pH가 7.0 이하, 바람직하게는 6.0 이하, 보다 바람직하게는 5.0, 4.5, 4,0, 3.5, 3.0. 2.5, 2.0 이하, 3.2 내지 3.5 내지 3.8로 낮아지지 않는 한, 전환되지 않고, 3 내지 4의 모든 pH 값이 바람직하다. 이러한 연구는 또한 pH가 낮아질수록 형태 1은 형태 2로 빠르게 전환될 것임을 나타낸다. 형태 2는 펩타이드의 탈수된 또는 2H+O 적은, 또는 18 달톤 적은 형태이다.
실시예 5
비전환 아형. 본 발명자들은 서열 번호 119가 높은 온도에서 M.W.에서 18 달톤의 손실을 갖는 아형을 형성할 수 있다는 것을 보여줬다. 실시예 2에서 본 발명자들은 분말로서 형태 1인 서열 번호 119의 원래 형태를 오토클레이브 처리하여 이를 형태 2로 전환한 다음, 남부 옥수수 뿌리벌레, 유충 세트의 식이에 첨가함으로써 시험하는 경우, 살충제 효능의 거의 5배 증가를 보여줬다. 그러나, 하이브리드 펩타이드인 서열 번호 119에서의 이러한 변형은 천연 펩타이드인 서열 번호 121과 같은 펩타이드에서는 보이지 않았다. 서열 번호 119와 대조적으로, 서열 번호 121에는 NH3 손실, 즉, M.W.에서 17 달톤의 손실과 함께 그 자체로 N-Pyr로 고리화될 수 있는 N-말단 Gln이 존재한다. 이러한 두 화학적 변형, H2O의 손실 및 NH3의 손실은 이러한 두 과정에서 M.W.의 손실이 매우 가깝기 때문에 구별하기 어렵다. 본 발명자들은 분석 HPLC 및 감응성 TOF LC/MS 방법을 사용하여, 우리가 또한 천연 하이브리드 펩타이드로도 지칭하는 서열 번호 121와 같은 서열에서 이러한 화학적 변형 둘 다가 일어날 수 있는지 여부를 평가하였다. 하기 데이터는 이 방법을 위하여 우리가 본 명세서에 기재한 바와 같은 적절한 조건의 대상이 되는 경우, 천연 하이브리드 펩타이드에서 전환이 유도될 수 있음을 보여준다.
물질 및 방법. 서열 번호 121는 하이브리드-ACTX-Hvla K, 락티스(lactis) 균주, pLB12D-YCT-24-1로부터 제조하였다. 오닉스(Onyx) 100 모놀리식 C18 HPLC 컬럼이 있는 애질런트 HPLC 시스템을 사용하여 서열 번호 121 펩타이드 제조 및 아형 형성을 분석하였다.
LC-MS 시스템은 SMIC에서 런치 MI 랩(Launch MI Lab)에 위치하고, 워터스 나노 액큐티 UPLC 시스템과 연결된 워터스/마이크로매스 사중극자 비행시간(Q-Tof 프리미어) 질량 분석계로 이루어진다. 샘플을 물 중의 0.1% 포름산 중에 1:50로 희석하였다.
방법 A.
샘플 5㎕를 워터스 BEH130 C-18 대칭 컬럼(0.3mm ID × 15cm)에 5uL/분의 유속으로 주입하였다. 25분 동안 0.1% 이동상 B(0.1% 포름산을 갖는 물)에서 40% 이동상 B(0.1% 포름산을 갖는 100% 아세토나이트릴)로, 25.5분에 85% B, 27.5분에 85% B, 및 28분에 0.1% B의 선형 구배를 사용하여 역상 분리를 달성하였다.
방법 B.
샘플 10 내지 30㎕를 워터스 C-18 X-브릿지 컬럼(4.6mm ID × 50mm)에 1㎖/분의 유속으로 주입하였다. 6분 동안 99% 이동상 A(0.1% 포름산을 갖는 물)로부터 95% 이동상 B(0.1% 포름산을 갖는 100% 아세토나이트릴)로, 11분에 95% B, 및 11.2분에 1% B의 선형 구배를 사용하여, 18분의 총 작동 시간 동안 역상 분리를 15분 동안 달성하였다.
컬럼 용출액은 전기분무 이온화원을 통해 질량 분석계에 의해 샘플링되었다. 장치 제어 및 MS 및 MS/MS 데이터 획득을 위하여 워터스 매스링스(Masslynx) 4.1 소프트웨어를 사용하였다. 계산된 단일동위원소 M+H 질량 값에 대한 다중 하전된 이온의 디콘볼루션을 위하여 매스링스에서 MaxEnt 3 알고리즘을 사용하였다.
방법 C.
LC-MS 시스템은 전기분무 이온화원과 워터스/마이크로매스 ZQ 분석계로 이루어졌다. 샘플을 조르박스(Zorbax) SB-C18 컬럼(2.1 × 30mm)에 1㎖/분의 유속으로 주입하였다. 다이오드 어레이 검출기(210 내지 300 작동)를 사용하는 96% 이동상 A(0.1% 포름산을 갖는 물)로부터 98% 이동상 B(0.07% 포름산을 갖는 100% 아세토나이트릴)로의 선형 구배를 사용하여 3.1분 동안 역상 분리를 달성하였다.
결과 및 논의. 천연 하이브리드 펩타이드로도 알려진 서열 번호 121의 제조, 제조 균주, pLB24-YCT-24-1을 23.5C에서 6일 동안 탄소원으로서 2% 소르비톨을 갖는 한정 배지에서 배양하였다. 세포 제거 후에 조건 배지가 수집되는 시간에 OD600은 30에 도달하였다. 조건 배지 300㎕를 애질런트 HPLC 분석 시스템에 주입하였고, 천연 하이브리드 펩타이드의 수율은 164mg/L로 측정되었다.
천연 하이브리드 아형의 애질런트 HPLC 평가. 수집된 천연 하이브리드 조건 배지를 애질런트 분석 HPLC로 분석하기 전에 각각 300㎕의 로딩으로 4C, 실온(대략 23C) 및 50C에서 24시간 동안 처리하였다. 상이한 온도에서 처리된 천연 하이브리드 펩타이드 샘플의 HPLC 크로마토그래프는 도 11에 나타낸다. 온도에 따라 변하는 UV 흡광도의 세 HPLC 피크는 4.2분, 5.4분 및 6.9분의 체류 시간에서 확인되었다. 본 발명자들은 피크 1이 가장 소수성이 작은 아형이고, 피크 3이 가장 소수성이 큰 아형인 것으로 생각한다.
형태 1을 지시하는 피크 1은 초기에 가장 풍부한 아형이었지만, 피크 1/형태 1은 시간 및 높은 온도와 함께 아형 피크 2 및 피크 3으로 변형될 수 있다. 본 발명자들은 24시간 동안 50℃ 처리가 피크 1을 거의(겨우 5.6%로) 사라지게 만들 것이라는 것을 입증한다. 반대로, 피크 2 및 피크 3 아형은 온도에 따라 증가하고, 온도가 높을수록 빠르게 증가한다.
도 12는 천연 하이브리드 펩타이드의 아형의 TOF MS 평가(비행시간 질량 분석)의 결과를 나타낸다. 결과는 기본 피크 강도(BPI) 크로마토그래프의 형태로 나타낸다. 도 11에서 피크 1, 피크 2 및 피크 3을 확인하기 위하여, RT 처리와 함께 천연 펩타이드 조건 배지를 사용하여 비행시간 질량 분석계를 수행하였다. 비행시간 MS는 MS 장치로부터 발생된 동위원소 m/z 비를 단리할 수 있고, 따라서 이러한 MS 방법은 펩타이드의 단일동위원소 M.W.를 검출할 수 있다. 천연 하이브리드의 이론적 단일동위원소 M.W.는 4417.812이다. TOF MS는 조건 배지 샘플에서 천연 하이브리드 펩타이드의 4종의 아형을 검출하였다.
TOF MS에 의해 검출된 하나의 아형은 4417.6826의 M.W.를 갖는 것이고, 이는 "천연" 천연 하이브리드 펩타이드, 즉, 변형되지 않은 천연 하이브리드를 나타내고, 이는 도 11에서 피크 1로 표시되고, 도 12에서 피크 1로 표시된다.
검출된 제2 아형은 4399.6455의 M.W를 가졌다. 이러한 아형은 M.W.에서 "천연" 아형으로부터 18 달톤 손실을 갖고, 이는 물 분자의 손실을 나타낸다. H2O 손실을 갖는 이러한 아형은 도 11에서 표시되지 않고, 도 12에서 피크 4로 표시된다.
검출된 제3 아형은 4400.6660의 M.W.를 가졌다. 이러한 아형은, NH3의 손실과 같이, M.W.에서 "천연" 아형으로부터 17 달톤 손실을 가졌다. NH3의 손실을 갖는 이러한 아형은 도 11에서 피크 2로 표시되고, 도 12에서 피크 2로 표시된다. TEP 융합 하이브리드+2의 이전 연구로부터, N-Gln 펩타이드는 NH3의 손실과 함께 자연적으로 N-파이로글루탐산으로 고리화될 것이다. 따라서, 제3 아형은 천연 하이브리드 펩타이드가 N-Gln를 갖기 때문에 N-Pyr로 고리화되는 N-Gln를 갖는 펩타이드를 나타내고, 도 12에서 피크 2로 나타난다.
제4 아형은 H2O 및 NH3 분자 둘 다의 손실 조합이고, 이는 4382.6313의 M.W.를 갖는 아형을 야기한다. H2O 및 NH3 둘 다의 손실을 갖는 아형은 도 11에서 피크 3으로 표시되고, 도 12에서 피크 3으로 표시된다.
이러한 결과는 파이로글루탐산으로의 N-말단 글루타민 고리화, 및 탈수 반응 둘 다인 천연 하이브리드 펩타이드 분자에서 가능한 적어도 두 화학적 변형이 존재한다는 것을 보여준다. TOF MS 기반 피크 강도 크로마토그래프로부터, 오직 H2O 손실만을 갖는 아형은 거의 검출 가능하지 않았다. 이는 오직 세 피크만이 검출된 HPLC 평가와 일치한다. H2O 분자의 손실은 펩타이드를 더 소수성으로 만들 수 있고, 추가의 NH3의 손실은 펩타이드를 더욱 더 소수성으로 만들 수 있다. 본 발명자들은 H2O의 손실이 HPLC 크로마토그래프에서 천연 하이브리드 피크를 더 늦은 체류 시간으로 이동시킬 것임을 예측할 수 있다. H2O 및 NH3 둘 다의 손실은 추가로 피크를 더욱 더 늦은 체류 시간으로 이동시킬 것이다.
파트 2
파트 1에서 본 발명자들은 펩타이드를 이의 천연 상태 또는 우리가 형태 1이라고 지칭하는 것으로부터 우리가 형태 2라고 지칭하는 유용한 상태로 변형시키기 위하여, 온도, 압력, 강산 및/또는 약산과 같은 기계적 또는 화학적 수단으로 독성 펩타이드를 인위적으로 조작하는 것이 어떻게 가능한지 기재한다. 형태 2 조성물은 본 명세서에서 "카보닐", "활성화된 카보닐", "락톤", "락톤 유사", 및/또는 "락톤 유사 형태"로 기재될 수 있다. 이러한 문서에서 본 발명자들은 일반적으로 이러한 형태 2 조성물을 단순하게 락톤 또는 펩타이드 락톤으로 기재한다. 이러한 화합물의 구조는 이러한 문서에서 사전적 정의를 갖지 않고, 여기서 이는 우리가 본 명세서에서 기재한 특징에 의해 정의된다. 여기서 "락톤"은 우리가 형태 2 화합물에 부여한 성질을 갖는다. 본 발명자들은 이러한 화합물이 락톤과 유사하게 반응하기 때문에 단어 "락톤" 및 펩타이드 "락톤"을 사용한다. 본 발명자들은 이를 만드는 방법, 이를 확인하는 방법, 이를 단리하는 방법 및 이를 사용하는 방법을 기재한다. 본 발명자들은 이러한 펩타이드 락톤이 천연 펩타이드보다 생물학적으로 더 활성이며, 매우 유용하고 다용도임을 나타내는 데이터를 제공한다. 이는 다른 가치있는 화합물을 만드는데 사용될 수 있는 안정한 중간체이다. 파트 2에서 본 발명자들은 펩타이드 락톤을, 다양한 다른 화합물을 만드는데 안정한 중간체로서 유용한, 2종의 상이하고 안정한 활성 화합물로 만들 수 있는 방법을 보여준다.
파트 2에서 본 발명자들은 펩타이드 하이드라자이드, 펩타이드 하이드라존을 기재하고, 본 발명자들은 이들을 제조하고 사용하는 방법을 교시한다. 하이드라자이드 또는 펩타이드 하이드라자이드는 파트 I 펩타이드 락톤과 하이드라진의 반응으로부터 야기된다. 우리가 기재한 다른 안정한 중간체 화합물을 본 발명자들은 하이드라존 또는 펩타이드 하이드라존이라고 지칭한다. 펩타이드 하이드라존은 펩타이드 하이드라자이드와 카보닐 화합물의 반응으로부터 야기된다. 펩타이드 하이드라존에 있어서 특히 유용한 것은 이들이 알킬 사슬 및/또는 페길화된 생성물과 같은 다른 유용한 잔기에 공유적으로 결합한 다음, 다양한 목적을 위하여, 사용될 수 있다는 것이고, 이 중 몇몇은 우리가 본 명세서에 기재한다. 우리가 기재한 방식으로, 알킬화된 단백질을 생성하는 능력은 매우 유용하다. 우리가 기재한 방식으로, 페길화된 단백질을 용이하게 제조하는 능력은, 아마도, 더욱 더 유용하다. 페길화된 단백질은 단백질의 면역원성을 감소시키고, 단백질의 대사작용을 감소시키고, 단백질의 생체이용률을 증가시키는데 사용되었다. 본 발명자들은 본 명세서에 처음으로 기재된 우리의 기술이 예외적인 값의 페길화된 단백질을 생성하는데 사용될 수 있다. 이러한 기술을 사용하여 이전에 가능했던 것보다 더 용이하고 빠르고 낮은 비용으로 알킬화된 및 페길화된 단백질, 및 다른 유형의 단백질을 제조할 수 있다. 페길화에 의해 향상된 하나의 단백질은 인슐린이다.
본 발명자들은 펩타이드 락톤, 펩타이드 하이드라자이드, 및 펩타이드 하이드라존이 실시예 11에서 PEG4 에톤(VIII)과 같은 다른 화합물과 반응하는데 사용되는 신규하고 화학적으로 안정하고 화학적으로 유용한 화합물인 "펩타이드 중간체"일 수 있고, 실시예 11에서 페길화를 갖지 않는 유사한 독성 펩타이드보다 큰 활성을 갖는 신규한 페길화된 독성 펩타이드 하이드라존을 나타내는 페길화된 펩타이드 또는 페길화된 펩타이드 하이드라존과 같은 최종 생성물일 수 있다는 것을 증명할 수 있다. 펩타이드 락톤 및 펩타이드 하이드라자이드는 작용기가 첨가된 이러한 펩타이드 또는 펩타이드 산에 단일 개별 부위를 제공한다. 펩타이드 및 독성 펩타이드 생성물 및 중간체는 더 유용하고 작용적인 특유의 화학적 합성 또는 생물학적 분자와 함께 단일 개별 화학적 취급을 제공한다. 예를 들면, 이러한 화학은 폴리펩타이드의 단일 부위에서 페길화 사슬에 의한 단일 작용화를 허용한다. 또 다른 예는 이것이 과요오드산염화된 소화된 글리코실화된 펩타이드 또는 다른 탄수화물과 같은 펩타이드 또는 펩타이드 산의 하나의 개별 부위에 분자를 단일 부착하는 것을 허용할 수 있다는 것이다. 이러한 펩타이드 중간체는 광범위한 생성물을 제조하는데 사용될 수 있다. 본 발명자들은 이러한 독성 펩타이드 중간체가 우수한 활성으로 유용하고, 전형적인 독성 펩타이드보다 더 많은 반응 선택사항을 제공하는 것을 보여준다. 본 발명자들은 페길화된 독성 펩타이드가 페길화되지 않은 펩타이드보다 더욱 더 활성임을 이해한다.
페길화(PEGylation/pegylation)는 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 폴리프로프로필렌 글리콜 또는 (PEG)에 대한 펩타이드의 연결이다. 일단 펩타이드에 연결되면, 각각의 PEG 서브유닛은 2 또는 3개의 물 분자와 단단하게 연관되고, 이는 펩타이드를 물에 더 가용성으로 만들고 이의 분자 구조를 크게 만드는 이중 작용을 갖는다. 제1 발생 단백질 페길화에서 PEG는 리신 및 N-말단 아민과 같은 단백질의 하나 이상의 몇몇 잠재적인 부위에 부착된다. 이러한 접근의 문제점은 변형된 펩타이드의 집단이 PEG가 상이한 리신에 부착된 분자 뿐만 아니라 연결된 PEG의 상이한 수를 갖는 분자의 혼합물을 함유할 수 있다는 것이다. 변형에서 이러한 가변성은 최종 생성물의 순도를 감소시키고 재현성을 저해시킨다.
기본적으로 더 제어된 방식으로 PEG를 단백질에 첨가하는데 사용되는 2종의 더 현대적인 다른 접근법이 존재하였다: A) PEG를 더 반응성 있게 만들도록 변경하는 것 또는 B) PEG 부착을 위한 특정한 부위를 제공하도록 단백질을 변경하는 것.
유형 A)의 PEG 방법은 본 명세서에 참고로서 인용된 제US 4,179,337호(Davis et al., 1979년 12월 18일에 발행됨)에 기재된 것으로 PEG를 특히 이의 설명에 따라 페길화에 적합한 중합체로 변경한다. 이러한 특허에는 말단기의 변경에 의해, 또는 활성을 갖는 커플링기를 펩타이드에 첨가 및 활성화된 중합체와 펩타이드의 반응에 의해, 하나의 말단에서 중합체를 변형하는 것이 기재되어 있다. 이러한 방법을 사용하여 인슐린 및 다른 호르몬을 페길화하였다. 제US 4,179,337호를 참고한다.
PEG보다 펩타이드를 변형하는 유형 B)의 PEG 방법은 펩타이드의 면역원성을 감소시키면서 펩타이드의 생물학적 작용의 방해를 최소화하도록 선택된 위치에 부위-특이적 페길화를 유발하는 것이 바람직한 시스테인을 첨가하는 것이다. PEG-말레이미드, PEG-비닐설폰, PEG-요오도아세트아미드, 및 PEG 오르토피리딜 이황화는 유리 시스테인 잔기를 페길화하도록 생성된 티올 반응성 PEG이다. 이러한 접근법은 모노페길화된 인간 성장 호르몬 유사체를 만드는 것을 포함하여 다수의 방식으로 사용되었다. 문헌 [Peptide PEGylation: The Next Generation, by Baosheng Liu, Pharmaceutical Technology, Volume 35]을 참고한다.
본 명세서에 기재된 방법은 이전에 사용된 것과 비교하여 신규하고 상이한 방법이고, 이는 단백질의 특이적 부위에 대한 PEG의 특이적 부착을 허용한다. 우리가 기재한 신규한 방법은 펩타이드 하이드라자이드에 PEG 카보닐 반응을 사용하여 펩타이드에 대한 PEG 부착을 제공하고, 이는 하기 상세하게 기재된다. 이는 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로프로필렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 선택된 약 500 내지 약 20,000 달톤의 분자량을 갖는 임의의 선형 또는 분지형 중합체와 함께 사용될 수 있다. 중합체는 알콕시 또는 알킬기에 의해 치환되지 않거나 치환될 수 있고, 치환기는 탄소 원자 5개 미만을 갖는다. PEG 독성 곤충 펩타이드를 만들 수 있는 것의 이득은 실질적이고 상기 발명의 내용에 기재된다.
일반적인 반응.
I) 펩타이드 하이드라자이드.
펩타이드 하이드라자이드를 펩타이드 락톤(파트 1 참고) 및 하이드라진으로부터 제조하여 펩타이드 하이드라자이드를 형성한다. 펩타이드 하이드라자이드는 본질적으로 세 단계 과정으로 제조된다. 펩타이드 락톤을 하이드라진 일수화물과 혼합한다. 혼합물을 용액으로 교반하여 펩타이드 하이드라자이드를 형성하고, 펩타이드 하이드라자이드를 정제한다.
당해 분야의 숙련가는 이러한 과정의 많은 버전을 생성하는 것이 가능할 것이고, 예를 들면, 펩타이드 락톤과 하이드라진의 혼합물을 잘 교반하여 용액을 형성하여야 한다. 이러한 용액으로 형성된 펩타이드 하이드라진을 분취용 HPLC와 같은 다양한 방법으로 정제할 수 있다.
본 발명자들은 펩타이드 락톤의 수성 용액 및 하이드라진 일수화물로서 첨가된 하이드라진의 용액을 둘 다 잘 혼합한 다음, 실온에서 잘 교반하는 것을 교시한다. 그 다음, 펩타이드 하이드라자이드를 정제할 수 있다. 본 발명자들은 정제를 위하여 HPLC를 사용하였고, 당해 분야의 숙련가에게 알려진 다른 선택사항이 이용 가능하다. 이러한 유형의 과정은 숙련된 화학자에게 잘 알려져 있고, 당해 분야의 숙련가에 의해 고려될 수 있는 본 명세서에 서술된 과정은 다양할 수 있다. 수집 및 정제에 대한 다른 선택사항이 사용될 수 있다. 하기 실시예에서 락톤의 비교적 순수한 및 불순한 샘플 둘 다는 출발 물질로서 사용되었고, 이들 둘 다는 고순도의 펩타이드 하이드라자이드(I)를 야기하고, 실시예 6에 기재된다. 다른 과정이 사용될 수 있다. 실시예 6a 및 6(b)에서 펩타이드 락톤 및 하이드라자이드를 함께 혼합하고 교반한다. 정제 단계는 광범위하게 다양할 수 있고, 다양한 선택사항이 이용 가능하며 당해 분야의 숙련가에게 알려져 있다.
II) 펩타이드 하이드라존.
펩타이드 하이드라존 및 펩타이드 하이드라자이드는 중요한 중간체이다. 어떤 작용기가 펩타이드에 바람직한지에 따라 펩타이드 하이드라존의 상이한 유형을 만들 수 있다. 여기서 본 발명자들은 상이한 펩타이드 하이드라존의 다양한 예를 나타낸다. 하이드라존의 예를 실시예 8 내지 11에 나타낸다. 당해 분야의 숙련가는 이들이 대표적이고 예시적인 것이고, 사용될 수 있는 예, 다른 시약 및 조건을 한정하는 것이 아님을 이해할 것이다.
이러한 예는 펩타이드 하이드라자이드를 카보닐의 하나의 또는 또 다른 유형과 함께 사용하여 화학식 (II), (III), (VI) 및 (IX)의 예와 같은 신규한 펩타이드 하이드라존을 생성한다. 신규한 페길화된 단백질을 생성하는 반응성 카보닐 화합물의 몇몇 예가 제공된다.
헥산알을 하이드라자이드에 가하여 하이드라존(II)을 제조한다.
상기 논의된 반응은 하기 상세한 설명에서 하기 상세하게 제공된 구조로 나타내고 지지 데이터는 도 13 내지 26에서 확인할 수 있다.
실시예 6은 펩타이드 락톤으로부터 만들어질 수 있는, 펩타이드 하이드라자이드(I) 또는 하이드라자이드(I)로서 기재된 펩타이드 하이드라자이드를 나타낸다. 질량 분석 데이터는 도 13 및 14에 제공된다.
실시예 7은 펩타이드의 정상 산 형태가 이의 하이드라자이드 형태로 만들어지는 경우, 펩타이드 하이드라자이드가 빠르게 작용하는 것을 보여주는 데이터를 제공한다. 두 화합물에 사용되는 독성 펩타이드는 하이브리드+2로 시작한다. 하이브리드+2가 하이드라자이드로 전환된 후, 두 화합물(펩타이드 산 형태 및 펩타이드 하이드라자이드 형태)은 상이한 화합물이지만, 이들은 매우 유사하고, 동일한 펩타이드 골격을 갖는다. 최종적인 차이는 본질적으로 하이드라진을 갖는 하나의 펩타이드를 가하여 하이브리드+2의 하이드라자이드(I)를 생성하는 것이다. 그 다음, 이러한 두 샘플을 파리에 대해서 시험하였다. 펩타이드의 정상 산 형태 또는 펩타이드의 하이드라자이드 형태, 즉, 하이드라자이드(I) 중 하나의 샘플을 두 그룹의 파리 중 하나에 노출시켰다. 하나의 파리 그룹은 하이드라자이드 형태의 독성 펩타이드, 즉, 하이드라자이드(I)에 노출시키고, 다른 파리 그룹은 이의 천연 산 형태의 독성 펩타이드에 노출시켰다. 실시예 7에서 하기 제공된 데이터는 하이드라자이드가 동일한 펩타이드의 천연 산 형태보다 더 빠르게 곤충을 죽이는 것을 나타낸다.
실시예 8은 헥산알을 사용하여 펩타이드의 하이드라존 형태를 제조할 수 있는 방법을 보여준다. 실시예 8은 하이드라자이드(I)로 출발하여, 헥산알을 가하고, 결과는 본 명세서에서 화학식(II)로 나타낸 하이드라존 또는 하이드라존(II)이다. 질량 분석 데이터는 도 15 및 16에 제공된다.
실시예 9는 실시예 8과 상이한 하이드라존의 제조를 제공한다. 실시예 9에서 화합물 "O-[2-(6-옥소카프로일아미노)에틸]-O'-메틸폴리에틸렌 글리콜(IV)(MW 대략 2'000)"을 사용하여 펩타이드 하이드라존을 제조한다. 질량 분석 데이터는 도 17 및 18에 제공된다.
실시예 10은 하이드라존을 제조하는 또 다른 방식을 보여준다. 여기서 이는 하이드라자이드와 아크릴릭 케톤으로부터 제조된 하이드라존이다. 이는 아크릴릭 케톤(V)을 사용하는 하이드라자이드(I)로부터의 하이드라존(VI)의 제조이다. 질량 분석 데이터는 도 19 내지 22에 제공된다.
실시예 11은 PEG4 케톤(VIII)을 사용하는 하이드라존(IX)의 제조를 기재한다. 이러한 실시예는 3-아세틸아크릴산 및 카보디이미드를 사용하여 PEG4 케톤(VIII)을 제조하는 실시예 11(a)로 시작한다. 그 다음, 실시예 11(b)에서, PEG4 케톤(VIII) 및 하이드라자이드 I을 사용하여 하이드라존(IX)을 제조한다. 질량 분석 데이터는 도 23 내지 26에 제공된다.
실시예 6 내지 11. 설명 및 데이터
천연 산 형태의 펩타이드, 파트 1에 기재된 펩타이드 락톤 및 파트 2에 기재된 펩타이드 하이드라자이드를 기술하는 대표적인 화학식이 보여진다. 다른 하이드라자이드 및 하이드라존은 실시예 8 내지 11에 기재된다.
Figure 112016106445719-pct00009
실시예 6. 펩타이드 하이드라자이드(I)의 제조
이러한 실시예는 펩타이드 하이드라자이드(I)를 제조하는 두 가지 방법을 보여준다. 제1 방법인 실시예 6(a)에서, 펩타이드 락톤의 출발 용액은 HPLC 제조로부터 비교적 순수하다. 제2 방법인 실시예 6(b)에서, 펩타이드 락톤의 출발 용액은 덜 순수하고, 형태 1 및 형태 2 둘 다를 함유하고, 즉, 펩타이드 락톤과 혼합된 펩타이드가 존재한다. 두 과정은 모두 펩타이드 하이드라자이드의 동일한 질량 분석을 생성한다.
실시예 6(a). 물 1㎖ 중의 펩타이드 락톤인 정제된 형태 2 펩타이드 100mg의 용액을 하이드라진 일수화물 100uL로 처리하고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 물질을 분취용 HPLC(아세토나이트릴/물/트라이플루오로아세트산 구배로 용리됨)에서 부분으로 나누어 정제하였다. 적절한 분획을 조합하고, 진공하에 감소된 용적으로 농축하였다. 액체를 -80℃에서 냉동기에서 냉동시킨 다음, 동결건조기에서 동결건조시켜 펩타이드 하이드라자이드(I) 36.94mg을 백색 고체로서 수득하였다.
실시예 6(b). 초 액체 농축물(형태 1과 펩타이드 락톤으로도 알려진 형태 2 펩타이드의 혼합물, 14mg/㎖) 용액(25㎖)을 밤새 75℃에서 교반하였다. 냉각 후, HPLC는 주로 펩타이드 락톤인 형태 2 펩타이드를 나타냈다. 용액을 하이드라진 일수화물 2㎖로 처리하고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 물질을 분취용 HPLC(아세토나이트릴/물/트라이플루오로아세트산 구배로 용리됨)에서 부분으로 나누어 정제하였다. 적절한 분획을 조합하고, 진공하에 감소된 용적으로 농축하였다. 액체를 -80℃에서 냉동기에서 냉동시킨 다음, 동결건조기에서 동결건조시켜 펩타이드 하이드라자이드(I) 252.2mg을 백색 고체로서 수득하였다. 방법 B에 의한 하이드라자이드(I) LCMS, ESI/MS 4578.00(M+H), 체류 시간 3.6 내지 4.1분. 도 13 및 도 14를 참고한다.
실시예 7. 하이브리드+2와 비교된 하이드라자이드(I)의 파리 주사
실시예 7에서 본 발명자들은 이의 전형적인 산 형태, 형태 1 또는 펩타이드 형태의 독성 펩타이드를 본 명세서에 제공된 화학식으로 표시된 바와 같은 펩타이드 하이드라자이드, 또는 펩타이드 하이드라자이드(I)로 전환된 후의 동일한 독성 펩타이드와 비교한다. 하기 샘플을 주사용으로 제조한다:
1. 물 중의 하이드라자이드(I)의 100ng/uL 용액. 이러한 용액을 물로 희석하여 50ng/uL 및 5ng/uL 용액을 제조하였다.
2. 물 중의 하이브리드+2의 100ng/uL 용액. 이러한 용액을 물로 희석하여 50ng/uL 및 5ng/uL 용액을 제조하였다.
종이 라벨이 있는 주사된 파리 컨테이너를 제조하고, 18-게이지 바늘로 컨테이너 리드에 공기 구멍을 낸다. 파리를 선택한다. 완전히 부화시킨 후, 1일 및 2일에 파리를 사용하고, 1일은 완전히 부화시킨 날이다. CO2 기체 라인을 켜고, 바늘로 CO2 기체를 투입하여 상자 안의 파리를 고정화시킨다. 파리를 고정화시킨 후, 파리를 CO2 플레이트로 옮기고, 이들을 수면 상태로 유지시킨다. 파리의 질량을 측정하고, 12-18mg 질량의 파리를 주사 생물검정을 위하여 사용한다.
주사를 수행한다. 30-게이지 바늘이 있는 1㎖ 주사기에 100-200㎕ 용액을 로딩하고, 로딩된 주사기를 마이크로어플리케이터에 끼웠다. 마이크로어플리케이터의 누름 막대(pushing pole)를 돌려 주사기로부터 공기 방울을 제거한다. 그 다음, 마이크로어플리케이터에서 주사 용적을 0.5㎕로 설정한다. 누름 막대를 돌려 등쪽 흉부로부터 집파리에 상기 제조된 용액 0.5㎕를 주사한다. 10마리의 파리에게 상기 각각 제조된 용액을 주사한다. 주사된 파리를 공기 구멍이 있는 리드가 있는 준비된 컵에 넣는다. 4.2cm 여과지 디스크인 2 와트만(Whatman) #4를 가한다. 살균 나노 순수한 물 1㎖를 가한다. 모든 주사된 파리를 실온에서 유지한다. 주사 후 3시간, 5시간, 21시간 및 24시간에, 주사된 파리를 점수화한다. 음성 대조군에서 20% 이상의 사망률이 존재하는 경우, 상기 기재된 바와 같이 파리 주사를 다시 시행한다. 모든 네 점수화 시간점에서, 물 및 마취 대조군은 0% 사망률을 가졌다.
5시간 시간점에서, 하이드라자이드 100ng/uL 농도는 80% 사망률을 가졌고, 동일한 농도의 하이브리드+2는 10% 사망률을 달성하였다.
실시예 8. 헥산알로부터의 하이드라존(II)
Figure 112016106445719-pct00010
물 100uL 중의 하이드라자이드(I) 5mg(0.00109m㏖)의 용액을 무수 에탄올 10uL 중의 헥산알 0.16uL(0.00133m㏖)로 처리하였다. 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 무수 에탄올 490uL 중의 헥산알 5mg 및 아세트산 2.86uL의 스톡 용액을 제조하였다. 반응물을 스톡 용액 10.9uL로 처리하고, 혼합 후, 2시간 동안 그대로 두었다. 혼합물을 대략 60℃에서 1시간 동안 가열하였다. 방법 B에 의한 LCMS, ESI/MS 4661.60(M+H, 하이드라존), 체류 시간 6.8 내지 7.1분. 도 15 및 도 16을 참고한다.
실시예 9. O-[2-(6-옥소카프로일아미노)에틸]-O'-메틸폴리에틸렌 글리콜(IV)로부터의 하이드라존(III)(MW 대략 2'000)
Figure 112016106445719-pct00011
무수 에탄올 100uL 중의 O-[2-(6-옥소카프로일아미노)에틸]-O'-메틸폴리에틸렌 글리콜(MW 대략 2'000)(IV)(10.9mg)의 스톡 용액을 아세트산 1 방울로 처리하였다. 주의: O-[2-(6-옥소카프로일아미노)에틸]-O'-메틸폴리에틸렌 글리콜(MW 대략 2'000)은 2000의 MW 근처의 분포를 갖는 화합물의 혼합물이고, 단일한 화합물이 아니다. 물 100uL 중의 하이드라자이드(I) 5mg(0.00109m㏖)의 용액을 O-[2-(6-옥소카프로일아미노)에틸]-O'-메틸폴리에틸렌 글리콜(IV)(MW 대략 2'000)의 스톡 용액 22uL(0.0012m㏖)로 처리하였다. 혼합 후, 혼합물을 실온에서 그대로 두었다. O-[2-(6-옥소카프로일아미노)에틸]-O'-메틸폴리에틸렌 글리콜(IV)(MW 대략 2'000)의 잔여 스톡 용액을 부분으로 나누어 가하고, 혼합 후, 혼합물을 밤새 그대로 두었다. 방법 B에 의한 LCMS, ESI/MS 체류 시간 7.2 내지 7.6분. 도 17 및 도 18을 참고한다.
실시예 10. 아크릴릭 케톤(V)을 사용하는 하이드라자이드(I)로부터의 하이드라존(VI)
실시예 10(a). 아크릴릭 케톤(V)의 제조
Figure 112016106445719-pct00012
다이클로로메탄 4㎖ 및 테트라하이드로푸란 4㎖ 중의 3-아세틸아크릴산 0.5g(4.38m㏖), N-(3-다이메틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC) 0.924g(4.82m㏖) 및 1-하이드록시벤조트리아졸 하이드레이트(HOBt) 0.651g(4.82m㏖)의 혼합물을 질소하에 실온에서 10분 동안 교반하였다. 반응물을 얼음 욕조에서 냉각시키고, 다이클로로메탄 8㎖ 중의 헥실아민 0.443g(4.38m㏖) 용액으로 처리하였다. 반응물을 차갑게 1시간 동안 교반하고, 밤새 실온에서 교반하였다. 반응물을 다이클로로메탄으로 희석하고, 유기물을 포화된 중탄산나트륨으로 세척한 후, 물로 세척하였다. 유기층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공하에 농축하여 황색 고체를 수득하였다. 고체를 다이클로로메탄에 혼입시키고, 실리카 겔 컬럼(50% 에틸 아세테이트 헥산으로 용리됨)에서 정제하였다. 적절한 분획을 조합하고, 진공하에 농축하여 아크릴릭 케톤(V) 537.06mg을 백색 고체로서 수득하였다. 방법 C에 의한 LCMS, ESI/MS 198.1(M+H), 196.2(M-H). 도 19 및 20를 참고한다.
실시예 10(b). 아크릴릭 케톤(V)으로부터의 하이드라존(VI)
Figure 112016106445719-pct00013
물 150uL 중의 하이드라자이드(I) 5mg(0.00109m㏖)의 용액을 무수 에탄올 48uL 중의 아크릴릭 케톤(V) 0.96mg(0.0048m㏖)으로 부분으로 나누어 처리하였다. 혼합물을 각각의 첨가 후 ½시간 동안 교반한 다음, 밤새 교반하였다. 방법 B에 의한 LCMS, ESI/MS 198.24(M+H, 아크릴릭 케톤); 4760.60(M+H, 하이드라존), 체류 시간 5.1 내지 5.8분. 도 21 및 도 22를 참고한다.
실시예 11. 3-아세틸아크릴산으로부터 제조된 PEG4 케톤(VIII)을 사용하는 하이드라존(IX).
실시예 11(a). PEG4 케톤(VIII)의 제조
Figure 112016106445719-pct00014
다이클로로메탄 1㎖ 및 테트라하이드로푸란 1㎖ 중의 3-아세틸아크릴산 137.6mg(1.21m㏖), N-(3-다이메틸아미노프로필)-N-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC) 254.3mg(1.327m㏖) 및 1-하이드록시벤조트리아졸 하이드레이트(HOBt) 179.25mg(1.327m㏖)의 혼합물을 질소하에 실온에서 10분 동안 교반하였다. 반응물을 얼음 욕조에서 냉각시키고, 다이클로로메탄 2㎖ 중의 m-PEG4-아민(VII) 250mg(1.21m㏖)의 용액으로 처리하였다. 반응물을 차갑게 1시간 동안 교반하고, 밤새 실온에서 교반한다. 반응물을 다이클로로메탄으로 희석하고, 유기물을 포화된 중탄산나트륨 용액으로 세척한 다음, 물로 세척하였다. 유기층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공하에 농축하여 PEG4 케톤(VIII) 302.29mg을 오일로서 수득하였다. 방법 C에 의한 LCMS, ESI/MS 304.1(M+H), 302.1(M-H). 도 23 및 24를 참고한다.
실시예 11(b). PEG4 케톤(VIII)을 사용하는 하이드라존(IX)
Figure 112016106445719-pct00015
물 150uL 중의 하이드라자이드(I) 5mg(0.00109m㏖)의 용액을 PEG4 케톤(VIII) 2.0mg(0.0066m㏖)으로 부분으로 나누어 처리하였다. 혼합물을 각각의 첨가 후 ½시간 동안 교반하였다. 방법 B에 의한 LCMS, ESI/MS 304.28(M+H, PEG4 케톤); 4867.70(M+H, 하이드라존) 체류 시간 4.7 내지 5.1분. 도 25 및 도 26를 참고한다.
실시예는 청구항 및 청구된 발명을 예시할 뿐, 한정하는 것을 의도하지 않는다. 당해 분야의 숙련가는 본 명세서에 나타낸 것의 많은 변형 및 상이한 버전을 만들 수 있는 것으로 예상될 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Vestaron Corporation <120> Chemically Activated Toxic Peptides <130> 225312/FAM N WO/369939 <140> TBD <141> 2015-04-03 <150> 61/975,147 <151> 2014-04-04 <160> 174 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 41 <212> PRT <213> Atrax robustus <400> 1 Gly Ser Gln Tyr Cys Ala Pro Ala Asp Gln Pro Cys Ser Leu Asn Thr 1 5 10 15 Gln Pro Cys Cys Asp Asp Val Thr Cys Thr Gln Glu Arg Asn Glu Asn 20 25 30 Gly His Thr Ala Tyr Tyr Cys Arg Val 35 40 <210> 2 <211> 98 <212> PRT <213> Hadronyche versuta <400> 2 Met Lys Phe Ser Lys Leu Ser Leu Thr Leu Ala Leu Ile Leu Thr Gln 1 5 10 15 Ala Leu Phe Val Leu Cys Gly Lys Ile Asn Glu Asp Phe Met Lys Asn 20 25 30 Gly Leu Glu Ser Gln Thr Leu His Asp Glu Ile Arg Lys Pro Ile Asp 35 40 45 Ser Glu Asn Pro Asp Thr Glu Arg Leu Leu Asp Cys Leu Leu Asp Asn 50 55 60 Arg Val Cys Ser Ser Asp Arg Asp Cys Cys Gly Met Thr Pro Ser Cys 65 70 75 80 Thr Met Gly Leu Cys Val Pro Asn Val Gly Gly Leu Val Gly Gly Ile 85 90 95 Leu Gly <210> 3 <211> 98 <212> PRT <213> 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<400> 34 Met Lys Phe Ser Lys Leu Ser Leu Thr Leu Ala Leu Ile Leu Thr Gln 1 5 10 15 Ala Leu Leu Val Val Cys Gly Lys Ile Asn Glu Asp Phe Met Glu Asn 20 25 30 Gly Leu Glu Ser His Ala Leu His Asp Glu Ile Arg Lys Ser Ile Asp 35 40 45 Thr Glu Lys Ala Asp Ala Glu Arg Val Leu Asp Cys Val Val Asn Thr 50 55 60 Leu Gly Cys Ser Ser Asp Lys Asp Cys Cys Gly Met Thr Pro Ser Cys 65 70 75 80 Thr Leu Gly Ile Cys Ala Pro Ser Val Gly Gly Ile Val Gly Gly Leu 85 90 95 Leu Gly Arg Ala Leu 100 <210> 35 <211> 95 <212> PRT <213> Hadronyche versuta <400> 35 Met Lys Phe Ser Lys Leu Ser Leu Thr Phe Ala Leu Ile Leu Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Leu Val Leu Cys Asp Phe Met Glu Asn Gly Leu Glu Ser His 20 25 30 Ala Leu His Asp Glu Ile Arg Lys Pro Ile Asp Thr Glu Lys Ala Asp 35 40 45 Ala Glu Arg Val Leu Asp Cys Val Val Asn Thr Leu Gly Cys Ser Ser 50 55 60 Asp Lys Asp Cys Cys Gly Met Thr Pro Ser Cys Thr Leu Gly Ile Cys 65 70 75 80 Ala Pro Ser Val Gly Gly Leu Val Gly Gly Leu Leu Gly Arg Ala 85 90 95 <210> 36 <211> 76 <212> PRT <213> Hadronyche versuta <400> 36 Met Asn Thr Ala Thr Gly Phe Ile Val Leu Leu Val Leu Ala Thr Val 1 5 10 15 Leu Gly Gly Val Glu Ala Gly Glu Ser His Met Arg Lys Asp Ala Met 20 25 30 Gly Arg Val Arg Arg Gln Tyr Cys Val Pro Val Asp Gln Pro Cys Ser 35 40 45 Leu Asn Thr Gln Pro Cys Cys Asp Asp Ala Thr Cys Thr Gln Glu Arg 50 55 60 Asn Glu Asn Gly His Thr Val Tyr Tyr Cys Arg Ala 65 70 75 <210> 37 <211> 39 <212> PRT <213> Hadronyche versuta <400> 37 Gln Tyr Cys Val Pro Val Asp Gln Pro Cys Ser Leu Asn Thr Gln Pro 1 5 10 15 Cys Cys Asp Asp Ala Thr Cys Thr Gln Glu Arg Asn Glu Asn Gly His 20 25 30 Thr Val Tyr Tyr Cys Arg Ala 35 <210> 38 <211> 39 <212> PRT <213> Hadronyche versuta <400> 38 Gly Ser Cys Val Pro Val Asp Gln Pro Cys Ser Leu Asn Thr Gln Pro 1 5 10 15 Cys Cys Asp Asp Ala Thr Cys Thr Gln Glu Arg Asn Glu Asn Gly His 20 25 30 Thr Val Tyr Tyr Cys Arg Ala 35 <210> 39 <211> 75 <212> PRT <213> Hadronyche versuta <400> 39 Met Asn Thr Ala Thr Gly Phe Ile Val Leu Leu Val Leu Ala Thr Ile 1 5 10 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<213> Hadronyche versuta <400> 126 Gln Tyr Cys Val Pro Val Asp Gln Pro Cys Ser Leu Asn Thr Gln Pro 1 5 10 15 Cys Cys Asp Asp Ala Thr Cys Thr Gln Glu Leu Asn Glu Asn Asp Asn 20 25 30 Thr Val Tyr Tyr Cys Arg 35 <210> 127 <211> 76 <212> PRT <213> Hadronyche versuta <400> 127 Met Asn Thr Ala Thr Gly Phe Ile Val Leu Leu Val Leu Ala Thr Ile 1 5 10 15 Leu Gly Gly Ile Glu Ala Gly Glu Ser His Met Arg Lys Asp Ala Met 20 25 30 Gly Arg Val Arg Arg Gln Tyr Cys Val Pro Val Asp Gln Pro Cys Ser 35 40 45 Leu Asn Thr Gln Pro Cys Cys Asp Asp Ala Thr Cys Thr Gln Glu Arg 50 55 60 Asn Glu Asn Gly His Thr Val Tyr Tyr Cys Arg Ala 65 70 75 <210> 128 <211> 39 <212> PRT <213> Hadronyche versuta <400> 128 Gln Tyr Cys Val Pro Val Asp Gln Pro Cys Ser Leu Asn Thr Gln Pro 1 5 10 15 Cys Cys Asp Asp Ala Thr Cys Thr Gln Glu Arg Asn Glu Asn Gly His 20 25 30 Thr Val Tyr Tyr Cys Arg Ala 35 <210> 129 <211> 76 <212> PRT <213> Hadronyche versuta <400> 129 Met Asn Thr Ala Thr Gly Phe Ile Val Leu Leu Val Leu Ala Thr Val 1 5 10 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His 50 55 60 Ser 65 <210> 144 <211> 64 <212> PRT <213> Hottentotta judaica <400> 144 Gly Arg Asp Ala Tyr Ala Leu Asp Asn Leu Asn Cys Ala Tyr Thr Cys 1 5 10 15 Gly Ser Lys Ser Tyr Cys Asn Thr Glu Cys Thr Lys Asn Gly Ala Val 20 25 30 Ser Gly Tyr Cys Gln Trp Leu Gly Lys Tyr Gly Asn Ala Cys Trp Cys 35 40 45 Ile Asn Leu Pro Asp Lys Val Pro Ile Arg Ile Pro Gly Ala Cys Arg 50 55 60 <210> 145 <211> 67 <212> PRT <213> Leiurus quinquestriatus hebraeus <400> 145 Val Arg Asp Gly Tyr Ile Ala Gln Pro Glu Asn Cys Val Tyr His Cys 1 5 10 15 Phe Pro Gly Ser Ser Gly Cys Asp Thr Leu Cys Lys Glu Lys Gly Gly 20 25 30 Thr Ser Gly His Cys Gly Phe Lys Val Gly His Gly Leu Ala Cys Trp 35 40 45 Cys Asn Ala Leu Pro Asp Asn Val Gly Ile Ile Val Glu Gly Glu Lys 50 55 60 Cys His Ser 65 <210> 146 <211> 66 <212> PRT <213> Buthus occitanus mardochei <400> 146 Gly Arg Asp Gly Tyr Ile Ala Gln Pro Glu Asn Cys Val Tyr His Cys 1 5 10 15 Phe Pro Gly Ser Ser Gly Cys Asp Thr Leu Cys Lys Glu Lys Gly Ala 20 25 30 Thr Ser Gly His Cys Gly Phe Leu Pro Gly Ser Gly Val Ala Cys Trp 35 40 45 Cys Asp Asn Leu Pro Asn Lys Val Pro Ile Val Val Gly Gly Glu Lys 50 55 60 Cys His 65 <210> 147 <211> 65 <212> PRT <213> Buthus occitanus mardochei <400> 147 Gly Arg Asp Ala Tyr Ile Ala Gln Pro Glu Asn Cys Val Tyr Glu Cys 1 5 10 15 Ala Lys Asn Ser Tyr Cys Asn Asp Leu Cys Thr Lys Asn Gly Ala Lys 20 25 30 Ser Gly Tyr Cys Gln Trp Leu Gly Lys Tyr Gly Asn Ala Cys Trp Cys 35 40 45 Glu Asp Leu Pro Asp Asn Val Pro Ile Arg Ile Pro Gly Lys Cys His 50 55 60 Phe 65 <210> 148 <211> 64 <212> PRT <213> Bothus martensii Karsch <400> 148 Val Arg Asp Ala Tyr Ile Ala Lys Pro His Asn Cys Val Tyr Glu Cys 1 5 10 15 Ala Arg Asn Glu Tyr Cys Asn Asp Leu Cys Thr Lys Asn Gly Ala Lys 20 25 30 Ser Gly Tyr Cys Gln Trp Val Gly Lys Tyr Gly Asn Gly Cys Trp Cys 35 40 45 Ile Glu Leu Pro Asp Asn Val Pro Ile Arg Val Pro Gly Lys Cys His 50 55 60 <210> 149 <211> 64 <212> PRT <213> Bothus martensii Karsch <400> 149 Val Arg Asp Ala Tyr Ile Ala Lys Pro His Asn Cys Val Tyr Ser Cys 1 5 10 15 Ala Arg Asn Glu Trp Cys Asn Asp Leu Cys Thr Lys Asn Gly Ala Lys 20 25 30 Ser Gly Tyr Cys Gln Trp Val Gly Lys Tyr Gly Asn Gly Cys Trp Cys 35 40 45 Ile Glu Leu Pro Asp Asn Val Pro Ile Arg Val Pro Gly Lys Cys His 50 55 60 <210> 150 <211> 64 <212> PRT <213> Bothus martensii Karsch <400> 150 Val Arg Asp Ala Tyr Ile Ala Lys Pro Glu Asn Cys Val Tyr His Cys 1 5 10 15 Ala Gly Asn Glu Gly Cys Asn Lys Leu Cys Thr Asp Asn Gly Ala Glu 20 25 30 Ser Gly Tyr Cys Gln Trp Gly Gly Arg Tyr Gly Asn Ala Cys Trp Cys 35 40 45 Ile Lys Leu Pro Asp Asp Val Pro Ile Arg Val Pro Gly Lys Cys His 50 55 60 <210> 151 <211> 66 <212> PRT <213> Bothus martensii Karsch <400> 151 Val Arg Asp Gly Tyr Ile Ala Leu Pro His Asn Cys Ala Tyr Gly Cys 1 5 10 15 Leu Asn Asn Glu Tyr Cys Asn Asn Leu Cys Thr Lys Asp Gly Ala Lys 20 25 30 Ile Gly Tyr Cys Asn Ile Val Gly Lys Tyr Gly Asn Ala Cys Trp Cys 35 40 45 Ile Gln Leu Pro Asp Asn Val Pro Ile Arg Val Pro Gly Arg Cys His 50 55 60 Pro Ala 65 <210> 152 <211> 64 <212> PRT <213> Leiurus quinquestriatus <400> 152 Val Arg Asp Gly Tyr Ile Ala Gln Pro Glu Asn Cys Val Tyr His Cys 1 5 10 15 Ile Pro Asp Cys Asp Thr Leu Cys Lys Asp Asn Gly Gly Thr Gly Gly 20 25 30 His Cys Gly Phe Lys Leu Gly His Gly Ile Ala Cys Trp Cys Asn Ala 35 40 45 Leu Pro Asp Asn Val Gly Ile Ile Val Asp Gly Val Lys Cys His Lys 50 55 60 <210> 153 <211> 66 <212> PRT <213> Leiurus quinquestriatus <400> 153 Val Arg Asp Gly Tyr Ile Ala Lys Pro Glu Asn Cys Ala His His Cys 1 5 10 15 Phe Pro Gly Ser Ser Gly Cys Asp Thr Leu Cys Lys Glu Asn Gly Gly 20 25 30 Thr Gly Gly His Cys Gly Phe Lys Val Gly His Gly Thr Ala Cys Trp 35 40 45 Cys Asn Ala Leu Pro Asp Lys Val Gly Ile Ile Val Asp Gly Val Lys 50 55 60 Cys His 65 <210> 154 <211> 66 <212> PRT <213> Centruroides noxius <400> 154 Lys Glu Gly Tyr Leu Val Asp Ile Lys Asn Thr Gly Cys Lys Tyr Glu 1 5 10 15 Cys Leu Lys Leu Gly Asp Asn Asp Tyr Cys Leu Arg Glu Cys Lys Gln 20 25 30 Gln Tyr Gly Lys Gly Ala Gly Gly Tyr Cys Tyr Ala Phe Ala Cys Trp 35 40 45 Cys Thr His Leu Tyr Glu Gln Ala Ile Val Trp Pro Leu Pro Asn Lys 50 55 60 Arg Cys 65 <210> 155 <211> 66 <212> PRT <213> Centruroides noxius <400> 155 Lys Glu Gly Tyr Leu Val Glu Leu Gly Thr Gly Cys Lys Tyr Glu Cys 1 5 10 15 Phe Lys Leu Gly Asp Asn Asp Tyr Cys Leu Arg Glu Cys Lys Ala Arg 20 25 30 Tyr Gly Lys Gly Ala Gly Gly Tyr Cys Tyr Ala Phe Gly Cys Trp Cys 35 40 45 Thr Gln Leu Tyr Glu Gln Ala Val Val Trp Pro Leu Lys Asn Lys Thr 50 55 60 Cys Arg 65 <210> 156 <211> 66 <212> PRT <213> Centruroides suffusus suffusus <400> 156 Lys Glu Gly Tyr Leu Val Ser Lys Ser Thr Gly Cys Lys Tyr Glu Cys 1 5 10 15 Leu Lys Leu Gly Asp Asn Asp Tyr Cys Leu Arg Glu Cys Lys Gln Gln 20 25 30 Tyr Gly Lys Ser Ser Gly Gly Tyr Cys Tyr Ala Phe Ala Cys Trp Cys 35 40 45 Thr His Leu Tyr Glu Gln Ala Val Val Trp Pro Leu Pro Asn Lys Thr 50 55 60 Cys Asn 65 <210> 157 <211> 66 <212> PRT <213> Centruroides suffusus suffusus <400> 157 Lys Glu Gly Tyr Leu Val Asn Ser Tyr Thr Gly Cys Lys Phe Glu Cys 1 5 10 15 Phe Lys Leu Gly Asp Asn Asp Tyr Cys Leu Arg Glu Cys Arg Gln Gln 20 25 30 Tyr Gly Lys Gly Ser Gly Gly Tyr Cys Tyr Ala Phe Gly Cys Trp Cys 35 40 45 Thr His Leu Tyr Glu Gln Ala Val Val Trp Pro Leu Pro Asn Lys Thr 50 55 60 Cys Asn 65 <210> 158 <211> 76 <212> PRT <213> Buthotus judaicus <400> 158 Lys Lys Asn Gly Tyr Pro Leu Asp Arg Asn Gly Lys Thr Thr Glu Cys 1 5 10 15 Ser Gly Val Asn Ala Ile Ala Pro His Tyr Cys Asn Ser Glu Cys Thr 20 25 30 Lys Val Tyr Val Ala Glu Ser Gly Tyr Cys Cys Trp Gly Ala Cys Tyr 35 40 45 Cys Phe Gly Leu Glu Asp Asp Lys Pro Ile Gly Pro Met Lys Asp Ile 50 55 60 Thr Lys Lys Tyr Cys Asp Val Gln Ile Ile Pro Ser 65 70 75 <210> 159 <211> 70 <212> PRT <213> Androctonus australis Hector <400> 159 Lys Lys Asn Gly Tyr Ala Val Asp Ser Ser Gly Lys Ala Pro Glu Cys 1 5 10 15 Leu Leu Ser Asn Tyr Cys Asn Asn Glu Cys Thr Lys Val His Tyr Ala 20 25 30 Asp Lys Gly Tyr Cys Cys Leu Leu Ser Cys Tyr Cys Phe Gly Leu Asn 35 40 45 Asp Asp Lys Lys Val Leu Glu Ile Ser Asp Thr Arg Lys Ser Tyr Cys 50 55 60 Asp Thr Thr Ile Ile Asn 65 70 <210> 160 <211> 70 <212> PRT <213> Leiurus quinquestriatus quinquestriatus <400> 160 Lys Lys Asn Gly Tyr Ala Val Asp Ser Ser Gly Lys Ala Pro Glu Cys 1 5 10 15 Leu Leu Ser Asn Tyr Cys Tyr Asn Glu Cys Thr Lys Val His Tyr Ala 20 25 30 Asp Lys Gly Tyr Cys Cys Leu Leu Ser Cys Tyr Cys Val Gly Leu Ser 35 40 45 Asp Asp Lys Lys Val Leu Glu Ile Ser Asp Ala Arg Lys Lys Tyr Cys 50 55 60 Asp Phe Val Thr Ile Asn 65 70 <210> 161 <211> 70 <212> PRT <213> Leiurus quinquestriatus hebraeus <400> 161 Lys Lys Asn Gly Phe Ala Val Asp Ser Asn Gly Lys Ala Pro Glu Cys 1 5 10 15 Phe Phe Asp His Tyr Cys Asn Ser Glu Cys Thr Lys Val Tyr Tyr Ala 20 25 30 Glu Lys Gly Tyr Cys Cys Leu Leu Ser Cys Tyr Cys Phe Gly Leu Asn 35 40 45 Asp Asp Lys Lys Val Leu Glu Ile Ser Asp Thr Thr Lys Lys Tyr Cys 50 55 60 Asp Phe Thr Ile Ile Asn 65 70 <210> 162 <211> 72 <212> PRT <213> Bothus martensii Karsch <400> 162 Lys Lys Asn Gly Tyr Ala Val Asp Ser Ser Gly Lys Val Ala Glu Cys 1 5 10 15 Leu Phe Asn Asn Tyr Cys Asn Asn Glu Cys Thr Lys Val Tyr Tyr Ala 20 25 30 Asp Lys Gly Tyr Cys Cys Leu Leu Lys Cys Tyr Cys Phe Gly Leu Leu 35 40 45 Asp Asp Lys Pro Val Leu Asp Ile Trp Asp Ser Thr Lys Asn Tyr Cys 50 55 60 Asp Val Gln Ile Ile Asp Leu Ser 65 70 <210> 163 <211> 61 <212> PRT <213> Leiurus quinquestriatus hebraeus <400> 163 Asp Gly Tyr Ile Lys Arg Arg Asp Gly Cys Lys Val Ala Cys Leu Ile 1 5 10 15 Gly Asn Glu Gly Cys Asp Lys Glu Cys Lys Ala Tyr Gly Gly Ser Tyr 20 25 30 Gly Tyr Cys Trp Thr Trp Gly Leu Ala Cys Trp Cys Glu Gly Leu Pro 35 40 45 Asp Asp Lys Thr Trp Lys Ser Glu Thr Asn Thr Cys Gly 50 55 60 <210> 164 <211> 60 <212> PRT <213> Leiurus quinquestriatus hebraeus <400> 164 Asp Gly Tyr Ile Arg Gly Asp Gly Cys Lys Val Ser Cys Val Ile Asn 1 5 10 15 His Val Phe Cys Asp Asn Glu Cys Lys Ala Ala Gly Gly Ser Tyr Gly 20 25 30 Tyr Cys Trp Ala Trp Gly Leu Ala Cys Trp Cys Glu Gly Leu Pro Ala 35 40 45 Glu Arg Glu Trp Lys Tyr Glu Thr Asn Thr Cys Gly 50 55 60 <210> 165 <211> 62 <212> PRT <213> Buthotus judaicus <400> 165 Asp Gly Tyr Ile Arg Lys Lys Asp Gly Cys Lys Val Ser Cys Ile Ile 1 5 10 15 Gly Asn Glu Gly Cys Arg Lys Glu Cys Val Ala His Gly Gly Ser Phe 20 25 30 Gly Tyr Cys Trp Thr Trp Gly Leu Ala Cys Trp Cys Glu Asn Leu Pro 35 40 45 Asp Ala Val Thr Trp Lys Ser Ser Thr Asn Thr Cys Gly Arg 50 55 60 <210> 166 <211> 61 <212> PRT <213> Buthacus arenicola <400> 166 Asp Gly Tyr Ile Arg Arg Arg Asp Gly Cys Lys Val Ser Cys Leu Phe 1 5 10 15 Gly Asn Glu Gly Cys Asp Lys Glu Cys Lys Ala Tyr Gly Gly Ser Tyr 20 25 30 Gly Tyr Cys Trp Thr Trp Gly Leu Ala Cys Trp Cys Glu Gly Leu Pro 35 40 45 Asp Asp Lys Thr Trp Lys Ser Glu Thr Asn Thr Cys Gly 50 55 60 <210> 167 <211> 61 <212> PRT <213> Leiurus quinquestriatus quinquestriatus <400> 167 Asp Gly Tyr Ile Arg Lys Arg Asp Gly Cys Lys Leu Ser Cys Leu Phe 1 5 10 15 Gly Asn Glu Gly Cys Asn Lys Glu Cys Lys Ser Tyr Gly Gly Ser Tyr 20 25 30 Gly Tyr Cys Trp Thr Trp Gly Leu Ala Cys Trp Cys Glu Gly Leu Pro 35 40 45 Asp Asp Lys Thr Trp Lys Ser Glu Thr Asn Thr Cys Gly 50 55 60 <210> 168 <211> 60 <212> PRT <213> Bothus occitanus tunetanus <400> 168 Asp Gly Tyr Ile Lys Gly Tyr Lys Gly Cys Lys Ile Thr Cys Val Ile 1 5 10 15 Asn Asp Asp Tyr Cys Asp Thr Glu Cys Lys Ala Glu Gly Gly Thr Tyr 20 25 30 Gly Tyr Cys Trp Lys Trp Gly Leu Ala Cys Trp Cys Glu Asp Leu Pro 35 40 45 Asp Glu Lys Arg Trp Lys Ser Glu Thr Asn Thr Cys 50 55 60 <210> 169 <211> 63 <212> PRT <213> Leiurus quinquestriatus hebraeus <400> 169 Asp Asn Gly Tyr Leu Leu Asn Lys Ala Thr Gly Cys Lys Val Trp Cys 1 5 10 15 Val Ile Asn Asn Ala Ser Cys Asn Ser Glu Cys Lys Leu Arg Arg Gly 20 25 30 Asn Tyr Gly Tyr Cys Tyr Phe Trp Lys Leu Ala Cys Tyr Cys Glu Gly 35 40 45 Ala Pro Lys Ser Glu Leu Trp Ala Tyr Ala Thr Asn Lys Cys Asn 50 55 60 <210> 170 <211> 62 <212> PRT <213> Tityus serrulatus <400> 170 Lys Glu Gly Tyr Leu Met Asp His Glu Gly Cys Lys Leu Ser Cys Phe 1 5 10 15 Ile Arg Pro Ser Gly Tyr Cys Gly Arg Glu Cys Gly Ile Lys Lys Gly 20 25 30 Ser Ser Gly Tyr Cys Tyr Ala Trp Pro Ala Cys Tyr Cys Tyr Gly Leu 35 40 45 Pro Asn Trp Val Lys Val Trp Asp Arg Ala Thr Asn Lys Cys 50 55 60 <210> 171 <211> 64 <212> PRT <213> Tityus zulianus <400> 171 Lys Asp Gly Tyr Leu Val Gly Asn Asp Gly Cys Lys Tyr Ser Cys Phe 1 5 10 15 Thr Arg Pro Gly Thr Tyr Cys Ala Asn Glu Cys Ser Arg Val Lys Gly 20 25 30 Lys Asp Gly Tyr Cys Tyr Ala Trp Met Ala Cys Tyr Cys Tyr Ser Met 35 40 45 Pro Asn Trp Val Lys Thr Trp Asp Arg Ala Thr Asn Arg Cys Gly Arg 50 55 60 <210> 172 <211> 29 <212> PRT <213> Oldenlandia affinis <400> 172 Gly Leu Pro Val Cys Gly Glu Thr Cys Val Gly Gly Thr Cys Asn Thr 1 5 10 15 Pro Gly Cys Thr Cys Ser Trp Pro Val Cys Thr Arg Asn 20 25 <210> 173 <211> 29 <212> PRT <213> Oldenlandia affinis <400> 173 Cys Gly Glu Thr Cys Phe Gly Gly Thr Cys Asn Thr Pro Gly Cys Ser 1 5 10 15 Cys Thr Trp Pro Ile Cys Thr Arg Asp Gly Leu Pro Val 20 25 <210> 174 <211> 30 <212> PRT <213> Oldenlandia affinis <400> 174 Gly Thr Pro Cys Gly Glu Ser Cys Val Tyr Ile Pro Cys Ile Ser Gly 1 5 10 15 Val Ile Gly Cys Ser Cys Thr Asp Lys Val Cys Tyr Leu Asn 20 25 30

Claims (23)

  1. 서열 번호 119 또는 121에 제시된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 포함하는 펩타이드 락톤이며, 천연 형태에서의 서열 번호 119 또는 121보다 1개 더 적은 2H+O 기를 갖는 펩타이드 락톤.
  2. 서열 번호 119 또는 121에 제시된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드이며, 하기 단계들에 따라 처리된 것인 펩타이드:
    a) 상기 펩타이드를 물과 혼합하여 액체 또는 반액체 형태로 상기 펩타이드의 수성 용액 또는 수성 에멀전을 제조하는 단계로서, 여기서 수성 용액 또는 수성 에멀전은 적어도 10%의 물을 포함하는 것인 단계,
    b) 수성 용액 또는 수성 에멀전 중의 상기 펩타이드의 pH를 측정하는 단계, 및
    c) 상기 용액 또는 에멀전의 pH를 7.0 미만; 1.0 내지 6.5; 2.0 내지 6.0; 2.5 내지 5.5; 3.0 내지 5.0; 3.0 내지 4.0의 pH로 조정하거나; 또는 3.2, 3.4, 3.5, 3.6 또는 3.8의 pH로 조정하는 단계.
  3. 제2항에 있어서, 상기 pH 조정이 강산 또는 약산을 사용하여 수행되고; 여기서 강산은 염소산(HClO3), 염산(HCl), 브롬화수소산(HBr), 요오드화수소산(HI), 인산(H3PO4), 황산(H2SO4), 과염소산(HClO4), 질산(HNO3), 또는 이들의 조합이고; 약산은 아세트산, 옥살산, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 것인 펩타이드.
  4. 제2항에 있어서, pH 조정 동안, 수성 용액 또는 수성 에멀전이 온도 증가에 노출되고, 여기서 온도 증가는 건열; 수증기 또는 압력의 부재하의 열; 수증기의 존재 및 압력의 부재하의 열; 수증기의 부재 및 압력의 존재하의 열; 또는 이들의 임의의 조합인 펩타이드.
  5. 제2항에 있어서, 상기 pH 조정 후, 건조 분말 또는 과립 형태로 건조되는 것인 펩타이드.
  6. 제2항에 있어서, 하나 이상의 공유 결합된 2H+O 분자가 제거된 것인 펩타이드.
  7. 삭제
  8. 서열 번호 119 또는 121에 제시된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드이며, 하기 단계들에 따라 변형된 것인 펩타이드:
    a) 상기 펩타이드를 형태 1 또는 펩타이드 산 또는 10% 미만의 물을 함유하는 조성물로서 제조하는 단계; 및
    b) 형태 1 펩타이드 또는 펩타이드 산을 목적하는 온도로, 압력의 존재 또는 부재하에, 또는 수증기의 존재 또는 부재하에, 형태 1 펩타이드 또는 펩타이드 산의 목적하는 양이 형태 2 펩타이드 또는 펩타이드 락톤으로 전환될 때까지 가열하는 단계로서,
    여기서 목적하는 온도는 10℃ 내지 500℃이고, 압력은 주위 대기압, 또는 주위 대기압을 초과하는 10psi 내지 40psi인 단계.
  9. 제8항에 있어서, 하기 온도 범위 중 적어도 하나 이상으로 가열되는 것인 펩타이드: 10℃ 내지 20℃; 20℃ 내지 30℃; 30℃ 내지 40℃; 40℃ 내지 50℃; 50℃ 내지 60℃; 60℃ 내지 70℃; 70℃ 내지 80℃; 80℃ 내지 90℃; 90℃ 내지 100℃; 100℃ 내지 110℃; 110℃ 내지 120℃; 120℃ 내지 130℃; 130℃ 내지 140℃; 140℃ 내지 150℃; 150℃ 내지 160℃; 160℃ 내지 170℃; 170℃ 내지 180℃; 180℃ 내지 190℃; 190℃ 내지 200℃; 200℃ 내지 210℃; 210℃ 내지 220℃; 220℃ 내지 230℃; 230℃ 내지 240℃; 240℃ 내지 250℃; 250℃ 내지 260℃; 260℃ 내지 270℃; 270℃ 내지 280℃; 280℃ 내지 290℃; 290℃ 내지 300℃; 300℃ 내지 400℃ 또는 400℃ 내지 500℃.
  10. 제8항에 있어서, 압력이 하기 압력 또는 압력 범위 중 임의의 것으로부터 선택되는 것인 펩타이드: 10psi 내지 40psi; 15psi 내지 35psi; 18psi 내지 25psi; 및 21psi.
  11. 제8항에 있어서, 상기 선택된 온도 및 압력 범위에서, 하기 기간 동안 유지되는 것인 펩타이드: a) 5분 내지 40분; b) 10분 내지 30분; c) 15분 내지 25분; 또는 d) 21분.
  12. 제8항에 있어서, 하기 조건 중 적어도 하나에 적용되는 것인 펩타이드: a) 100℃ 내지 140℃; 10psi 내지 40psi의 압력; 5분 내지 40분의 기간; b) 110℃ 내지 130℃; 15psi 내지 35psi의 압력; 10분 내지 30분의 기간; c) 115℃ 내지 125℃; 18psi 내지 25psi의 압력; 15분 내지 25분의 기간; d) 121℃, 21psi의 압력, 20분의 기간.
  13. 제8항에 있어서, 압력이 대기압 이하이고, 온도가 적어도 50℃ 내지 60℃ 또는 그 이상의 온도로부터 선택되는 것인 펩타이드.
  14. 제8항에 있어서, 방법이 하기 온도 범위 중 적어도 하나를 포함하는 것인 펩타이드: 50℃ 내지 60℃; 60℃ 내지 70℃; 70℃ 내지 80℃; 80℃ 내지 90℃; 90℃ 내지 100℃; 100℃ 내지 110℃; 110℃ 내지 120℃; 120℃ 내지 130℃; 130℃ 내지 140℃; 140℃ 내지 150℃; 150℃ 내지 160℃; 160℃ 내지 170℃; 170℃ 내지 180℃; 180℃ 내지 190℃; 190℃ 내지 200℃; 200℃ 내지 210℃; 210℃ 내지 220℃; 220℃ 내지 230℃; 230℃ 내지 240℃; 240℃ 내지 250℃; 250℃ 내지 260℃; 260℃ 내지 270℃; 270℃ 내지 280℃; 280℃ 내지 290℃; 290℃ 내지 300℃; 300℃ 내지 400℃; 또는 400℃ 내지 500℃.
  15. 제8항에 있어서, 하기 조건 중 하나에 따라 처리된 것인 펩타이드:
    a) 펩타이드를 100℃ 초과의 온도에서 적어도 1시간 동안 가열 및 유지;
    b) 펩타이드를 80℃ 내지 120℃의 온도에서 적어도 2시간 동안 가열 및 유지;
    c) 펩타이드를 50℃ 내지 80℃의 온도에서 적어도 3시간 동안 가열 및 유지;
    d) 펩타이드를 180℃ 초과의 온도 및 적어도 5psi의 압력에서 적어도 5분 동안 가열 및 유지;
    e) 펩타이드를 100℃ 초과의 온도 및 적어도 10psi의 압력에서 적어도 10분 동안 가열 및 유지;
    f) 펩타이드를 80℃ 내지 120℃의 온도 및 적어도 10psi의 압력에서 적어도 30분 동안 가열 및 유지;
    g) 펩타이드를 50℃ 내지 80℃의 온도에서 적어도 1시간 동안 가열 및 유지;
    h) 펩타이드를 200℃ 내지 300℃의 온도 및 5psi 내지 10psi의 압력에서 5분 내지 10분 동안 가열 및 유지;
    i) 펩타이드를 150℃ 내지 200℃의 온도 및 10psi 내지 30psi의 압력에서 5분 내지 30분 동안 가열 및 유지;
    j) 펩타이드를 80℃ 내지 150℃의 온도 및 10psi 내지 20psi의 압력에서 20분 내지 60분 동안 가열 및 유지;
    k) 펩타이드를 50℃ 내지 80℃의 온도 및 10psi 내지 40psi의 압력에서 30분 내지 60분 동안 가열 및 유지;
    l) 펩타이드를 110℃ 내지 130℃의 온도 및 10psi 내지 20psi의 압력에서 10분 내지 20분 동안 가열 및 유지; 또는
    m) 펩타이드를 121℃의 온도 및 21psi의 압력에서 20분 동안 가열 및 유지.
  16. 서열 번호 119 또는 121에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이며, 공유 결합된 2H+O 분자가 제거된 것인 펩타이드.
  17. 삭제
  18. 서열 번호 119 또는 121에 제시된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 포함하는 살충제 펩타이드 락톤이며, 천연 형태에서의 서열 번호 119 또는 121보다 2개 더 적은 수소 원자 및 1개 더 적은 산소 원자를 갖는 살충제 펩타이드 락톤.
  19. 제18항에 있어서, 서열 번호 119 또는 121에 제시된 아미노산 서열을 갖는 천연 펩타이드의 (i) 산성화; 또는 (ii) 산성화 및 가열이 천연 펩타이드로부터의 2개의 수소 원자 및 1개의 산소 원자의 손실을 야기하고, 이로부터 펩타이드 락톤 형태가 생성되는 것인 살충제 펩타이드 락톤.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 1개의 산소 원자 및 2개의 수소 원자가 제거된 살충제 펩타이드 락톤이며, 천연 형태에서의 펩타이드의 아미노산 서열에 존재하는 유리 카르복실산 모이어티로부터 히드록실 모이어티(-OH)가 이탈된 것인 살충제 펩타이드 락톤.
  21. 곤충의 서식지에 대한 적용에 적합한 제형의, 제1항 내지 제6항, 제8항 내지 제16항, 제18항 및 제19항 중 어느 한 항의 펩타이드를 포함하는 살충제 조성물.
  22. 삭제
  23. 삭제
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