CN102038006B

CN102038006B - 一种苏云金杆菌杀虫蛋白和芽胞吸附复合剂型的制备方法

Info

Publication number: CN102038006B
Application number: CN 201010588070
Authority: CN
Inventors: 周学永; 董庆洁; 董建萍; 马锦明
Original assignee: Tianjin University of Technology
Current assignee: Tianjin University of Technology
Priority date: 2010-12-15
Filing date: 2010-12-15
Publication date: 2013-03-20
Anticipated expiration: 2030-12-15
Also published as: CN102038006A

Abstract

本发明公开了一种苏云金杆菌杀虫蛋白和芽胞吸附复合剂型的制备方法。该方法是在苏云金杆菌发酵液中预先加入微米级矿物吸附剂，然后直接加碱溶解伴胞晶体，产生的活性杀虫蛋白同时被矿物载体吸附，实现对活性杀虫蛋白的负载固定。本发明制备苏云金杆菌杀虫蛋白和芽胞吸附复合剂型方法简便，成本低，省去了苏云金杆菌胞晶混合物用NaCl溶液和无菌去离子水洗涤过程，实现了活性杀虫蛋白制备与吸附的同步进行。所得到的吸附复合剂型吸附量大，杀虫活性高。此外，由于芽胞的增效作用，活性杀虫蛋白吸附制剂的杀虫活性较原毒素吸附剂型有了进一步提高。

Description

一种苏云金杆菌杀虫蛋白和芽胞吸附复合剂型的制备方法

【技术领域】

本发明涉及有害生物的生物防治技术领域，特别是通过省略杀虫蛋白的提取和芽胞分离程序，直接将矿物加到发酵液中，伴胞晶体碱解生成的活性杀虫蛋白被矿物载体吸附，得到含有芽胞的苏云金杆菌杀虫蛋白吸附复合剂型。

【背景技术】

苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）是一种近缘于腊状芽胞杆菌、产生芽胞和伴胞晶体、能寄生于昆虫体内引起昆虫发病的细菌，1938年法国出现了第一个苏云金杆菌制剂，20世纪中期实现了工业化生产，其产量占生物杀虫剂总量的97%，成为当前世界上产量最大、应用最广的一种生物杀虫剂，对鳞翅目、膜翅目、直翅目、双翅目、鞘翅目等数百种昆虫有防治效果。然而，苏云金杆菌制剂存在持效期短，防治效果易受阳光、温度、湿度、雨水等外界气候和生态条件制约等缺点，制剂贮藏稳定性差，田间残效期短。从实际应用效果上看，经过2-3天的日光照射，伴胞晶体即基本上失去活性。苏云金芽胞杆菌田间应用残效期短，已成为制约该杀虫剂发展的瓶颈，如何提高其杀虫效果是苏云金杆菌科研单位和生产企业所共同面临的难题。目前延长残效期的方法主要有：添加紫外线吸收剂、制备微胶囊包被、与化学农药复配，具有一定的实际效果，但尚未成为一种经济、环保、高效兼顾的理想手段。苏云金杆菌商业制剂是由伴胞晶体、芽胞和填料组成，其中伴胞晶体又称δ内毒素，是苏云金杆菌制剂的主要杀虫成分。伴胞晶体是否会在环境中积累与以下三种因素有关：（1）使用的浓度；（2）昆虫消耗的速度；（3）紫外光及土壤、作物表面微生物群对其钝化和降解的速度。上述三种因素中，环境降解是苏云金杆菌制剂活性下降的主要原因。研究发现，伴胞晶体酶解后释放的活性杀虫蛋白很容易被土壤矿物颗粒吸附, 而且一旦吸附完成，Bt杀虫蛋白就会对微生物分解产生抗性，杀虫活性持续的时间显著延长。吸附态Bt蛋白杀虫活性提高、持效期延长的性质为苏云金杆菌长效制剂研究提供了新思路。为此，国内有专利（ZL200510015282.3）提出了利用土壤矿物吸附固定杀虫蛋白的方法，使之能够抵御阳光、微生物和酶的降解。实践证明，这种吸附剂型具有活性高、持效期长的特点，但这种剂型是以苏云金杆菌伴胞晶体释放的原毒素为唯一杀虫成分，不含芽胞，因而缺乏芽胞的增效作用。其次，原毒素（分子量130 kDa）的杀虫毒力与活性杀虫蛋白（分子量65-70 kDa）相当，而分子量却比后者高出了一倍，空间位阻效应导致原毒素在土壤矿物上的负载量低于活性杀虫蛋白。经实验计算，原毒素在土壤矿物上的饱和吸附量仅为活性杀虫蛋白的71.0%-90.7%。原毒素蛋白在矿物载体上吸附量偏低，必然影响吸附制剂的单位质量效价。

为了提高苏云金杆菌吸附剂型的效价和降低制造成本，申请人在长期研究中发现，将苏云金杆菌发酵液中的伴胞晶体和芽胞不经洗涤直接碱溶，得到分子量较低的活性杀虫蛋白，生成的杀虫蛋白被预先加入的矿物载体吸附，不仅提高了杀虫蛋白在矿物载体上的吸附量，而且发挥了芽胞的增效作用，使吸附制剂的效价大幅度提高。由于省去了胞晶混合物的洗涤、离心分离等步骤，产品的制备成本降低。

【发明内容】

本发明的目的在于改进现有苏云金杆菌吸附剂型的制备方法，通过简化原毒素的提取制备程序，直接对发酵液中的伴胞晶体碱解，得到降解的活性杀虫蛋白。

本发明公开了这种苏云金杆菌杀虫蛋白和芽胞吸附复合剂型的制备方法，其特征在于按照下列步骤操作：

（1）采用SDS-PAGE电泳法对苏云金芽胞杆菌发酵液中的伴胞晶体进行含量测定，计算发酵液中杀虫蛋白总量；

（2）取微米级矿物颗粒用水配置成重量与体积比为5.0%—20.0%的悬浮液，然后按照矿物：杀虫蛋白的质量比=10:1~1:15的比例将矿物悬液加入到苏云金芽胞杆菌发酵液中；

（3）将步骤（2）得到的苏云金芽胞杆菌发酵液升温至37-60℃，用浓度1mol/L NaOH溶液调节pH至 11—12，溶解4—6 h；

（4）将步骤（3）得到的溶解液用浓度1mol/L HCl溶液调节pH至 6-8，并缓慢降至0℃-35℃，继续搅拌吸附1-10 h；

（5）将步骤（4）得到的吸附悬浮液进行离心浓缩，脱出上清液，即得到苏云金杆菌杀虫蛋白和芽胞的吸附复合剂型，冷冻保存。

所述矿物颗粒是2:1型层状矿物蒙脱土或累托石，2:1型层链状矿物海泡石或凹凸棒土，或1:1型非膨胀型矿物高岭石中的一种或两种以上的混合物。

本发明制备苏云金杆菌杀虫蛋白和芽胞吸附复合剂型方法简便，成本低，省去了苏云金杆菌胞晶混合物用NaCl溶液和无菌去离子水洗涤过程，实现了活性杀虫蛋白制备与吸附的同步进行，所得到的吸附复合剂型具有以下特点：

（1）吸附量大。活性杀虫蛋白的分子量只有原毒素的二分之一，吸附时所遇到的空间位阻小，所以吸附量高。

（2）杀虫活性高。蛋白酶对苏云金杆菌原毒素蛋白的降解是从C端开始的，最后得到一段分子量在65000-70000的N端片段。这个片段对蛋白酶的水解具有很高的抗性，可以稳定存在并保持了原毒素的活性。吸附量的增加提高了单位质量吸附剂的杀虫活力。此外，由于芽胞的增效作用，活性杀虫蛋白吸附制剂的杀虫活性较原毒素吸附剂型有了进一步提高。以蒙脱土、高岭土、海泡石、累托石、凹凸棒土为吸附载体的活性杀虫蛋白和芽胞吸附复合剂型的杀虫效价（三龄棉铃虫幼虫）分别为：132450、92379、74627、117647、12133 IU/mg，而原毒素被上述矿物吸附后的杀虫效价（三龄棉铃虫幼虫）分别为：106382、67682、67001、80972 、10402 IU/mg，前者活性比后者分别提高24.5%，36.5%，11.4%、45.3%和16.6%。

【具体实施方式】

本发明提出的一种苏云金杆菌杀虫蛋白和芽胞吸附复合剂型的制备方法，是在苏云金杆菌发酵液中预先加入微米级矿物吸附剂，然后直接加碱溶解伴胞晶体，产生的活性杀虫蛋白同时被矿物载体吸附，实现对活性杀虫蛋白的负载固定。活性杀虫蛋白与土壤矿物颗粒的质量比为：10:1~1:15（质量比），在温度0℃-35℃，搅拌下吸附1-10小时。

上述的矿物颗粒可以是2:1型层状矿物蒙脱土、累托石，2:1型层链状矿物海泡石和凹凸棒土，1:1型非膨胀型矿物高岭石。

本发明苏云金杆菌杀虫蛋白和芽胞吸附复合剂型可以通过以下方法制备：

（1）苏云金杆菌活性杀虫蛋白含量测定

取苏云金芽胞杆菌发酵液样品，用SDS-PAGE电泳法对发酵液中的伴胞晶体进行检测，以已知浓度的纯伴胞晶体作为定量标准，计算发酵液中伴胞晶体含量。按照伴胞晶体与活性杀虫蛋白分子量的比值，推算发酵液中活性杀虫蛋白含量。

（2）矿物吸附剂的配制与添加

活性杀虫蛋白含量与发酵液体积的乘积，即为碱解后产生的活性杀虫蛋白总量，据此可以计算出微米级矿物吸附剂的添加量。取微米级矿物颗粒用水配置成5.0%—20.0%（w/v）的悬浮液，然后按照矿物：杀虫蛋白=10:1~1:15（质量比）的比例将矿物悬液加入发酵液中，搅拌均匀。

（3）伴胞晶体的碱解与活性杀虫蛋白吸附

将苏云金芽胞杆菌发酵液在搅拌下升温至37-60℃，缓慢滴加1mol/L NaOH溶液，调节pH 至11—12，维持4—6 h。期间如遇pH降低情况，则补加碱液。伴胞晶体降解产生的活性杀虫蛋白随时被矿物载体吸附。碱解完成后，悬浮液用1mol/L HCl调节至pH 6-8，并缓慢降至0℃-35℃，继续搅拌吸附1-10 h。降低温度和降低体系pH可以增加活性杀虫蛋白的吸附量。

（4）吸附悬浮液的离心浓缩

吸附悬浮液转入离心管，于高速离心机上15000 r/min离心20min，去掉上清液，即为苏云金杆菌杀虫蛋白和芽胞吸附复合剂型，冷冻保存。

实施例1：苏云金杆菌杀虫蛋白和芽胞蒙脱土吸附复合剂型

取苏云金芽胞杆菌发酵液1000 mL(固含量6.5%，w/v),经SDS-PAGE检测杀虫蛋白0.51%。称取蒙脱土（粒径＜2微米）30 g，加去离子水500 mL配成6%（w/v）的悬浮液。将蒙脱土悬浮液在搅拌下加入苏云金芽胞杆菌发酵液中。水浴加热发酵液使之升温至37℃，搅拌下缓慢滴加1mol/L氢氧化钠溶液调pH11—12， 5 h后降温至25℃，悬浮液用1mol/L HCl调节至pH 6-7，继续搅拌3 h。

将苏云金杆菌吸附悬浮液装入离心管，15000 r/min离心10 min，倾去上清液，得苏云金杆菌杀虫蛋白和芽胞蒙脱土吸附复合剂型，效价132450IU/mg。

实施例2：苏云金杆菌杀虫蛋白和芽胞高岭土吸附复合剂型

取苏云金芽胞杆菌发酵液1000 mL(固含量6.5%，w/v),经SDS-PAGE检测杀虫蛋白0.51‰。称取高岭土（粒径＜2微米）80 g，加去离子水1000 mL配成8%（w/v）的悬浮液。将高岭土悬浮液在搅拌下加入苏云金芽胞杆菌发酵液中。水浴加热发酵液使之升温至60℃，搅拌下缓慢滴加1mol/L氢氧化钠溶液调pH11—12，4 h后降温至20℃，悬浮液用1mol/L HCl调节至pH 7-8，继续搅拌2 h。将吸附完成的悬浮液装入离心管，15000 r/min离心10 min，倾去上清液，得苏云金杆菌杀虫蛋白和芽胞高岭土吸附复合剂型，效价92379 IU/mg。

实施例3：苏云金杆菌杀虫蛋白和芽胞海泡石吸附复合剂型

取苏云金芽胞杆菌发酵液1500 mL(固含量6.8%，w/v),经SDS-PAGE检测杀虫蛋白0.56%。称取海泡石（粒径＜2微米）117g，加去离子水1200 mL配成9.75%（w/v）的悬浮液。将海泡石悬浮液在搅拌下加入苏云金芽胞杆菌发酵液中。水浴加热发酵液使之升温至50℃，搅拌下缓慢滴加1mol/L氢氧化钠溶液调pH11—12， 5 h后降温至20℃，悬浮液用1mol/L HCl调节至pH 7-8，继续搅拌6 h。将吸附完成的悬浮液装入离心管，15000 r/min离心10 min，倾去上清液，得苏云金杆菌杀虫蛋白和芽胞海泡石吸附复合剂型，效价74627 IU/mg。

实施例4：苏云金杆菌杀虫蛋白和芽胞累托石吸附复合剂型

取苏云金芽胞杆菌发酵液1500 mL(固含量6.8%，w/v),经SDS-PAGE检测杀虫蛋白0.56%。称取累托石（粒径＜2微米）25g，加去离子水250 mL配成10%（w/v）的悬浮液。将累托石悬浮液在搅拌下加入苏云金芽胞杆菌发酵液中。水浴加热发酵液使之升温至45℃，搅拌下缓慢滴加1mol/L氢氧化钠溶液调pH11—12，5 h后降温至15℃，悬浮液用1mol/L HCl调节至pH 6-7，继续搅拌3 h。将吸附完成的悬浮液装入离心管，15000 r/min离心10 min，倾去上清液，得苏云金杆菌杀虫蛋白和芽胞累托石吸附复合剂型，效价117647 IU/mg。

实施例5：苏云金杆菌杀虫蛋白和芽胞凹凸棒土吸附复合剂型

取苏云金芽胞杆菌发酵液800 mL(固含量6.0%，w/v),经SDS-PAGE检测杀虫蛋白0.47%。称取凹凸棒土（粒径＜2微米）11.75g，加去离子水195 mL配成6.0%（w/v）的悬浮液。将凹凸棒土悬浮液在搅拌下加入苏云金芽胞杆菌发酵液中。水浴加热发酵液使之升温至45℃，搅拌下缓慢滴加1mol/L氢氧化钠溶液调pH11—12， 5 h后降温至5℃，悬浮液用1mol/L HCl调节至pH 6-7，继续搅拌3 h。将吸附完成的悬浮液装入离心管，15000 r/min离心10 min，倾去上清液，得苏云金杆菌杀虫蛋白和芽胞凹凸棒土吸附复合剂型，效价96956 IU/mg。

苏云金杆菌原毒素与活性杀虫蛋白在同一种矿物上的吸附量比较见表1。

表1苏云金杆菌原毒素和活性杀虫蛋白吸附量比较

Claims

1.一种苏云金杆菌杀虫蛋白和芽胞吸附复合剂型的制备方法，其特征在于按照下列步骤操作：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述矿物颗粒是2:1型层状矿物蒙脱土或累托石，2:1型层链状矿物海泡石或凹凸棒土，或1:1型非膨胀型矿物高岭石中的一种或两种以上的混合物。