CN1445360A - 人工栽培北冬虫夏草提高其生理活性物质含量的方法 - Google Patents

人工栽培北冬虫夏草提高其生理活性物质含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种人工栽培北冬虫夏草提高其生理活性物质含量的方法,具体为:菌种分离:将新鲜野生北冬虫夏草洗净,切片;2)斜面菌种培养:将培养基调pH为6~7,灭菌后做成斜面,将1)中切片置于培养基上,20~25℃下7~10天;3)液体菌种培养:将培养基调pH为6~7,灭菌,接入步骤1)斜面培养的菌种,液体培养;4)固体栽培:固体栽培主要成分为大米、高粱米,按所述原料总重量的1.4~1.8倍加入营养液,封好容器口灭菌,再以5~6倍稀释,破碎,按每份固体栽培培养基体积加0.2~0.5倍稀释后的液体菌种在25~29℃温度下,避光,散射光培养,通气,40~60天子实体成熟。它能提高其主要生理活性物质虫草酸(D-甘露醇)、虫草素(3-脱氧腺苷)、虫草多糖的含量。

Description

人工栽培北冬虫夏草提高其生理活性物质含量的方法
技术领域
本发明涉及北冬虫夏草,具体在说是一种人工栽培北冬虫夏草提高其生理活性物质含量的方法。
背景技术
北冬虫夏草与冬虫夏草(西藏,新疆,青海,四川等山上野生)同属于冬虫夏草属的不同两个种,北冬虫夏草(蛹虫草)是冬虫夏草属的模式种,生理活性物质基本相同,其中虫草素的含量是冬虫夏草的许多倍。
我国人民很早就用冬虫夏草治病、保健身体并积累了许多宝贵经验,凡是老人体弱、病后虚损,胃虚阳痿,遗精早泄,体弱多病等,不论是单用或配伍使用均能获得良好的效果,随着科学技术的发展,测试手段提高,研究发现其应用更广,通过药理试验,有抑制肿瘤,抗病毒,抗氧化,抗衰老,保护心,脑,肝细胞作用,提高机体免疫力,防痴呆等功能。
随着冬虫夏草的广泛利用,人工栽培及发酵制取菌丝体、来替代天然冬虫夏草的研究越来越活跃,但利用合成培养基人工栽培冬虫夏草的研究到目前为止还没有成功的先例,然而利用合成培养基,人工栽培北冬虫夏草,不论在北方还是南方已达到了工厂化生产。产品已销往国内外,但国外对其主要生理活性物质的含量要求较高,故不能满足需求。
发明内容
本发明目的在于提供一种人工栽培北冬虫夏草提高其主要生理活性物质含量的方法。
为了实现上述目的,本发明的技术方案是按如下工艺流程操作:
按如下工艺流程操作:
(1)菌种分离:将新鲜野生北冬虫夏草洗干净,按体积百分比采用0.1~0.3%浓度的二氯化汞(HgCL2)、70~75%浓度的乙醇(CH3CH2OH)或10~30%浓度的双氧水(H2O2)作为表面消毒剂,3~5分钟后,无菌水冲洗5~10次,无菌条件下将其切成薄片,待用;
(2)斜面菌种培养:培养基成分按重量百分比计,其成分为葡萄糖1~2%,蛋白胨0.5~2.0%,酪素0.5~2%,磷酸二氢钾(KH2PO4)0.03~0.10%,马铃薯20~30%,硫酸镁(MgSO4)0.05~0.10%,VB1、VB2微量,琼脂1.8~2.0%,余量为水;调pH为6~7,装容器内灭菌,然后将容器内的培养基做成斜面,将切成薄片的新鲜野生北冬虫夏草置于马铃薯斜面培养基上,20~25℃下7~10天长出白色菌落,供菌种培养;
(3)液体菌种培养:培养基成分按重量百分比计,为葡萄糖0.5~1.0%,蔗糖0.5~1.0%,蛋白胨0.5~2.0%,酪素1.0~1.5%,MgSO4 0.05~0.10%,KH2PO4 0.03~0.10%,VB1、VB2微量,马铃薯的含量20~30%,余量为水;调pH为6~7,将液体培养基装入容器内灭菌,冷却后接入步骤1所述斜面培养的菌种,振荡或静止培养,培养温度为23~29℃,7~10天长出白色菌落,外观成为带有金黄或杏黄色的液体菌种供固体栽培使用;
(4)固体栽培:固体栽培主要成分为大米、高粱米,两者投放重量比为大米:高梁米1~2∶1,然后按所述原料总重量的1.4~1.8倍加入营养液,封好容器口灭菌,作为固体栽培培养基待用;
(5)将所述培养好的液体菌种以5~6倍稀释,再破碎,按每份固体栽培培养基体积加0.2~0.5倍稀释后的液体菌种,在25~29℃温度下,避光培养5~7天,然后散射光培养,于19~25℃温度、60~80%湿度、菌丝体长满栽培基体的表面条件下通气,40~60天子实体成熟。
所述培养基成分的配制方法为:先将马铃薯去皮切碎,加4~8倍的水,煮汁、过滤、去渣、加入其它成分,配成所需溶液;
所述营养液按重量百分比计,其成分为0.5~1%玉米粉,0.3~1.0%蛋白胨,0.3~0.5%酪素,0.5~1%去皮及内脏的蚕蛹浆,0.02~0.05%KH2PO4,0.05~0.10%MgSO4,微量的VB1、VB2,余量为水;
所述液体菌种培养采用摇床振荡培养方式,时间为7~10天,其中可在往复式摇床上振荡培养,以110~150次/分进行,或在旋转摇床上振荡培养以100~250转/分进行;
所述液体菌种培养采用静止培养方式时,采用广口容器,培养时间为14~20天。
本发明具有如下优点:
1.主要生理活性物质含量高。本发明从菌种的培养到栽培子实体各级培养基的成分及其配比,均有新的改进,特别是加入酪素、蛋白胨、蚕蛹汁、高粱米、玉米粉等成分,使培养出来的北冬虫夏草的主要生理活性物质含量大大提高,主要生理活性物质如虫草酸(D-甘露醇)、虫草素(3-脱氧腺苷),虫草多糖的含量获得提高,虫草酸达9.0×104~2.0×105mg/kg(与现有技术相比提高了13%),虫草素达1.0×103~2.8×104mg/kg(与现有技术相比提高了15%),虫草多糖达5.5×104~9.0×104mg/kg(与现有技术相比提高了15~20%)。
2.本发明菌种分离时采用0.1%HgCL2,70~75%乙醇,特别是采用30%H2O2作为表现消毒剂,因为H2O2作为表面消毒剂穿透力差,所以不易伤害要分离的菌。
3.方法简单,成本低。本发明采用合适配伍,在保证生理活性物质高含量同时节省费用;其工艺易掌握。
具体实施方式
下面通过实施例详述本发明。
实施例1
按如下工艺流程操作:
(1)菌种分离:取新鲜野生北冬虫夏草,洗净,采用0.1%浓度的HgCL2,作为表面消毒剂,5分钟后,无菌水冲洗5次,无菌条件下将其切成薄片,待用;
(2)斜面菌种培养:葡萄糖20克、小带鱼粉蛋白胨10克、酪素20克、磷酸二氢钾0.3克、硫酸镁0.5克、VB1、VB2微量、琼脂1.8克、马铃薯200克,步骤:将马铃薯去皮切碎,加5倍的水,煮汁、过滤、去渣后加入其它成分,配成1000毫升;加热溶化,调pH为6.5,装入18×180mm试管中灭菌,115℃灭菌25分钟,然后将试管中培养基做成斜面,将切成薄片的新鲜野生北冬虫夏草置于马铃薯斜面培养基上,22℃下培养7~10天,长出白色菌落,供菌种培养;
(3)液体菌种培养:培养基成分为葡萄糖10克、蔗糖10克、酪素10克、蛋白胨10克、磷酸二氢钾0.3克、硫酸镁0.5克、200克马铃薯,VB1、VB2微量;步骤:将马铃薯去皮切碎,加5倍的水,煮汁、过滤、去渣后加入其它成分,配成1000毫升,调pH=6,将液体培养基50ml装入300ml三角瓶中,高压灭菌,1个大气压,20分钟,冷却后接入步骤(2)所述斜面培养的菌种,摇床振荡培养(往复式摇床150次/分),培养温度为25℃,7~10天长出白色菌落,外观成为带有金黄或杏黄色的液体菌种保存在8℃的冰箱中;
液体培养后回接感染试验,将保存在冰箱斜面菌种,试种在所述培养基上看是否长草,同时进行选优,将优良的菌种供固体栽培使用;
(4)固体栽培:容器为广口玻璃瓶,在500ml玻璃瓶中加大米20克、高粱米10克,然后加入营养液42ml;所述营养液按重量百分比计,其成分为0.21克玉米粉,0.126克蛋白胨,0.126克酪素,0.21克去皮及内脏的蚕蛹浆(将蚕蛹去皮、内脏,打碎成浆),0.0084克KH2PO4,0.021克MgSO4,微量的VB1、VB2,余量为水;封口用聚乙烯薄膜,灭菌,121℃,30分钟,作为固体栽培培养基待用;
(5)冷却后上述液体菌种稀释5倍后,再破碎,接入10毫升于固体栽培培养基中,均匀撒入玻璃瓶中;25℃左右避光培养7天后,光照80~500lux,湿度65%,温度20℃,经45~60天子实体成熟,采摘阴干或50℃以下烘干。
用《中华人民共和国药典》(2001版)或高压液相色谱法检测主要活性物质虫草酸(D-甘露醇),虫草素(3-脱氧腺苷),虫草多糖,如:虫草酸9.0×104~2.0×105mg/kg,虫草素1.0×103~2.8×104mg/kg,虫草多糖5.5×104~9.0×104mg/kg。
实施例2
按如下工艺流程操作:
(1)菌种分离:取新鲜野生北冬虫夏草,洗净,采用70%浓度的乙醇,作为表面消毒剂,5分钟后,无菌水冲洗7次,无菌条件下将其切成薄片,待用;
(2)斜面菌种培养:葡萄糖20克、小带鱼粉蛋白胨10克、酪素17克、磷酸二氢钾0.3克、硫酸镁0.5克、VB1、VB2微量、琼脂1.8%、马铃薯20%,步骤:将马铃薯去皮切碎,加7倍的水,煮汁、过滤、去渣后加入其它成分,配成1000毫升;加热溶化,调pH为7,装入18×180mm试管中,115℃灭菌25分钟,然后将试管中培养基做成斜面,将切成薄片的新鲜野生北冬虫夏草置于马铃薯斜面,25℃下培养7~10天,长出白色菌落,供菌种培养;
(3)液体菌种培养:培养基成分为葡萄糖10克、蔗糖10克、酪素10克、蛋白胨10克、磷酸二氢钾0.3克、硫酸镁0.5克、200克马铃薯,VB1、VB2微量;步骤:将马铃薯去皮切碎,加7倍的水,煮汁、过滤、去渣后加入其它成分,配成1000毫升,调pH=7,将液体培养基50ml装入300ml三角瓶中,灭菌,115℃下20分钟,冷却后接入步骤(2)所述斜面培养的菌种,摇床振荡培养(旋转式摇床200转/分),培养温度为29℃,7~10天长出白色菌落,外观成为带有金黄或杏黄色的液体菌种保存在8℃的冰箱中;
液体培养后回接感染试验,将保存在冰箱斜面菌种,试种在所述培养基上看是否长草,同时进行选优,将优良的菌种供固体栽培使用;
(4)固体栽培:容器为广口玻璃瓶,在500ml玻璃瓶中加大米20克、高粱米10克,然后加入营养液50ml;所述营养液按重量百分比计,其成分为0.35克玉米粉,0.25克蛋白胨,0.168克酪素,0.35克去皮及内脏的蚕蛹浆(将蚕蛹去皮、内脏,打碎成浆),0.0126克KH2PO4,0.042克MgSO4,微量的VB1、VB2,余量为水;封口用聚乙烯薄膜,灭菌,121℃,30分钟,作为固体栽培培养基待用;
(5)冷却后上述液体菌种稀释5倍后,再破碎,接入10毫升于固体栽培培养基中,均匀撒入玻璃瓶中;25℃左右避光培养5天后,光照80~500lux,湿度65%,温度20℃,经45~60天子实体成熟,采摘阴干或50℃以下烘干。
用《中华人民共和国药典》(2001版)或高压液相色谱法检测主要活性物质虫草酸(D-甘露醇),虫草素(3-脱氧腺苷),虫草多糖,如:虫草酸9.0×104~2.0×105mg/kg,虫草素1.0×103~2.8×104mg/kg,虫草多糖5.5×104~9.0×104mg/kg。
实施例3
按如下工艺流程操作:
(1)菌种分离:取新鲜野生北冬虫夏草,洗净,采用30%浓度的H2O2,作为表面消毒剂,5分钟后,无菌水冲洗5次,无菌条件下将其切成薄片,待用;
(2)斜面菌种培养:葡萄糖20克、小带鱼粉蛋白胨10克、酪素15克、磷酸二氢钾0.3克、硫酸镁0.5克、VB1、VB2微量、琼脂1.8%、马铃薯20%,步骤:将马铃薯去皮切碎,加5倍的水,煮汁、过滤、去渣后加入其它成分,配成1000毫升;加热溶化,调pH为6,装入18×180mm试管中,115℃灭菌25分钟,然后将试管中培养基做成斜面,将切成薄片的新鲜野生北冬虫夏草置于马铃薯斜面,20℃下培养7~10天,长出白色菌落,供菌种培养;
(3)液体菌种培养:培养基成分为葡萄糖10克、蔗糖10克、酪素10克、蛋白胨10克、磷酸二氢钾0.3克、硫酸镁0.5克、20%马铃薯,VB1、VB2微量;步骤:将马铃薯去皮切碎,加8倍的水,煮汁、过滤、去渣后加入其它成分,配成1000毫升,调pH=7,将液体培养基50ml装入300ml三角瓶中,灭菌,115℃下,20分钟,冷却后接入步骤(2)所述斜面培养的菌种,采用静止培养方式,采用广口容器,培养时间为15天,培养温度为25℃,7~10天长出白色菌落,外观成为带有金黄或杏黄色的液体菌种保存在8℃的冰箱中;
(4)固体栽培:容器为广口玻璃瓶,在500ml玻璃瓶中加大米15克、高粱米15克,然后加入营养液45ml;所述营养液按重量百分比计,其成分为0.21克玉米粉,0.126克蛋白胨,0.168克酪素,0.35克去皮及内脏的蚕蛹浆(将蚕蛹去皮、内脏,打碎成浆),0.0084克KH2PO4,0.021克MgSO4,微量的VB1、VB2,余量为水;封口用聚乙烯薄膜,121℃下,40分钟灭菌,作为固体栽培培养基待用;
(5)冷却后上述液体菌种稀释2倍后,再破碎,接入10毫升于固体栽培培养基中,均匀撒入玻璃瓶中;25℃左右避光培养7天后,光照80~500lux,湿度75%,温度25℃,经45~60天子实体成熟,采摘阴干或50℃以下烘干。
用《中华人民共和国药典》(2001版)或高压液相色谱法检测主要活性物质虫草酸(D-甘露醇),虫草素(3-脱氧腺苷),虫草多糖,如:虫草酸9.0×104~2.0×105mg/kg,虫草素1.0×103~2.8×104mg/kg,虫草多糖5.5×104~9.0×104mg/kg。

Claims (4)

1.一种人工栽培北冬虫夏草提高其生理活性物质含量的方法,其特征在于:按如下工艺流程操作:
(1)菌种分离:将新鲜野生北冬虫夏草洗干净,按体积百分比计采用0.1~0.3%浓度的二氯化汞HgCL2、70~75%浓度的乙醇或10~30%浓度的双氧水H2O2作为表面消毒剂,3~5分钟后,无菌水冲洗5~10次,无菌条件下将其切成薄片,待用;
(2)斜面菌种培养:培养基成分按重量百分比计,其成分为葡萄糖1~2%,蛋白胨0.5~2.0%,酪素0.5~2%,磷酸二氢钾0.05~0.10%,马铃薯20~30%,硫酸镁0.03~0.05%,VB1、VB2微量,琼脂18~20%,余量为水;调pH为6~7,装容器内灭菌,然后将容器内的培养基做成斜面,将切成薄片的新鲜野生北冬虫夏草置于马铃薯斜面培养基上,20~25℃下7~10天长出白色菌落,供菌种培养;
(3)液体菌种培养:培养基成分按重量百分比计,为葡萄糖0.5~1.0%,蔗糖0.5~1.0%,蛋白胨0.5~2.0%,酪素1.0~1.5%,硫酸镁0.03~0.05%,磷酸二氢钾0.05~0.10%,VB1、VB2微量,马铃薯的含量20~30%,余量为水;调pH为6~7,将液体培养基装入容器内灭菌,冷却后接入步骤1所述斜面培养的菌种,振荡或静止培养,培养温度为23~29℃,7~10天长出白色菌落,供固体栽培使用;
(4)固体栽培:固体栽培主要成分为大米、高粱米,两者投放重量比为大米:高梁米1~2∶1,然后按所述原料总重量的1.4~1.8倍加入营养液,封好容器口灭菌,作为固体栽培培养基待用;
所述营养液按重量百分比计,其成分为0.5~1%玉米粉,0.3~1.0%蛋白胨,0.3~0.5%酪素,0.5~1%去皮及内脏的蚕蛹浆,0.05~0.10%磷酸二氢钾KH2PO4,0.03~0.05%硫酸镁MgSO4,微量的VB1、VB2,余量为水
(5)将所述培养好的液体菌种以5~6倍稀释,再破碎,按每份固体栽培培养基体积加0.2~0.5倍稀释后的液体菌种,在25~29℃温度下,避光培养7~10天,然后散射光培养,于19~25℃温度、60~80%湿度、菌丝体长满栽培基体的表面条件下通气,40~60天子实体成熟。
2.根据权利要求1所述人工栽培北冬虫夏草提高其生理活性物质含量的方法,其特征在于:所述培养基成分的配制方法为:先将马铃薯去皮切碎,加4~8倍的水,煮汁、过滤、去渣、加入其它成分,配成所需溶液。
3.根据权利要求1所述人工栽培北冬虫夏草提高其生理活性物质含量的方法,其特征在于:所述液体菌种培养采用摇床振荡培养方式,时间为7~10天,其中可在往复式摇床上振荡培养,以110~150次/分进行,或在旋转摇床上振荡培养以100~250转/分进行。
4.根据权利要求1所述人工栽培北冬虫夏草提高其生理活性物质含量的方法,其特征在于:所述液体菌种培养采用静止培养方式时,培养时间为14~20天。
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