CN1164179C

CN1164179C - 布氏白僵菌杀虫剂的生产方法及其用途

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Publication number: CN1164179C
Application number: CNB021167826A
Authority: CN
Inventors: 邓春生; 张燕荣; 蒋海霖
Original assignee: INST OF BIOLOG CONTROL CHINESE
Current assignee: INST OF BIOLOG CONTROL CHINESE
Priority date: 2002-05-13
Filing date: 2002-05-13
Publication date: 2004-09-01
Anticipated expiration: 2022-05-13
Also published as: CN1395839A

Abstract

本发明涉及了一种蛴螬专用白僵菌杀虫剂的生产方法及其用途。该方法是利用本发明人本发明人从蛴螬危害严重地区采集罹病虫尸，分离纯化并进行筛选，得到布氏白僵菌D5菌株采用液体培养法进行白僵菌杀虫剂的生产，其特点是本法适应工业化大生产的目的，生产周期短，产品质量稳定，该产品对蛴螬杀虫效果显著。

Description

布氏白僵菌杀虫剂的生产方法及其用途

技术领域：

本发明涉及一种分离筛选得到的可用做生物杀虫剂的白僵菌，特别是白僵菌中的布氏白僵菌(Beauveria bringniartii)(一种布氏白僵菌，已于2002年4月17日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，保藏编号为CGMCC NO.0737)的选育、生产方法以及在生物杀虫剂领域的应用。

背景技术：

白僵菌能够在自然条件通过体壁接触感染杀死害虫，试验证明，白僵菌能寄生700余种害虫，对人畜和环境比较安全、害虫一般不易产生抗药性、可与某些化学农药(杀虫剂、杀螨剂、杀菌剂)同时使用。

我国白僵菌自50年代起开始批量生产和应用，大多数采用土法生产即用三角摇瓶培养液体菌种，接入固体培养基中培养，该工艺生产周期长(固体培养7～10天，干燥7天)，容易污染，且年生产能力只有10～15吨原粉/厂。但产品的贮存稳定性问题没解决，一般常温贮存在半年以内。

目前，蛴螬危害花生、大豆、草坪、蔬菜、苗圃等多种作物，危害面积达数亿亩，仅以花生为例，我国种植4500万亩花生，均受蛴螬危害，按20％面积用白僵菌防治计算，需肪治900万亩，需白僵菌制剂4500吨。

发明内容：

本发明的目的在于克服已有技术的不足，选育一种对蛴螬有很好杀虫能力的杀虫白僵菌(即蛴螬专用白僵菌杀虫剂)，设计了生产周期短、适合于工业化生产液体法生产方法和相应的杀虫制剂。

本发明通过以下技术方案实现：

本发明的特征包括白僵菌的布氏白僵菌(Beauveria bringniartii)CGMCC NO.0737菌株、生产方法、制剂及其应用。

本发明涉及的菌株是从蛴螬危害严重地区采集罹病虫尸，分离纯化并进行筛选，得到布氏白僵菌(Beauveria bringniartii)D5菌株，已于2002年4月17日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，保藏编号为CGMCC NO.0737。该菌株菌落粉状，白色，后变为淡黄色。产孢细胞单生，很少簇生，产孢轴纤细，膝状弯曲，具小齿突。分生孢子透明，光滑，椭圆形，基部有时有小尖突，2～2.5μm×4.5～6μm。对大黑鳃金龟幼虫毒力最高，达93.1％，产孢量比出发菌株提高了2.8倍。

本发明布氏白僵菌D5(CGMCC NO.0737)菌株生产工艺流程见说明书附图1。

本发明生产方法详细描述如下：

(1)将D5原始生产菌株一种布氏白僵菌，已于2002年4月17日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，保藏编号为CGMCC NO.0737，均匀接入斜面培养基上(生产菌种斜面培养基配方：蔗糖2％，酵母粉0.5％，蛋白胨(鱼)0.5％，硫酸铜0.005％，硫酸锌0.005％，硫酸亚铁0.005％，棉仁粉0.5％，米粉0.5％，硼酸0.01％，硫酸锰0.002％，乳糖0.3％，琼脂2％)，置在26℃±1℃的培养箱中培养培养7～10d，分生孢子产生良好时取出，可作生产用斜面菌种。(2)将斜面菌种中加入液体培养基或灭菌水洗下培养物成菌悬液。(3)在摇瓶及种子罐中用液体培养法将种子放大培养至发酵罐培养所需种子液的量(液体培养基配方：蔗糖2％，酵母粉0.5％，蛋白胨(鱼)0.5％，硫酸铜0.005％，棉仁粉0.5％，米粉1％，硫酸镁0.1％，硫酸亚铁0.005％，磷酸二氢钾0.2％。)，罐装系数：70％。发酵控制条件：罐压0.2kg/cm²，通气量为1∶1(v/v/min)，罐温27℃±1℃，培养时间为36h，菌丝量大，菌液变稠，有少量芽生孢子形成，无污染，可作为种子液。(4)实罐消毒和管道消毒：在发酵罐进行实罐消毒的同时，进行种子罐与发酵罐接种管道的消毒，消毒时微开管道上各有关排气阀门，务必使整条管道畅通，不成死角，调节进气阀至管内压力1.2kg/cm²，保压30min，然后自前至后依次关闭各进气阀，冷却待用。通过两罐压差，将合格的二级液种按1∶10的比例压到发酵罐，压种毕迅速关闭两罐出料阀，然后调节好罐压力和进、排气阀，开动搅拌、进行培养。培养：搅拌速度200r/min，罐温27℃±1℃，罐内压力0.5kg/cm²，通气量1∶0.7(v/v/min).培养48～72h。发酵到24～36h大量形成菌丝体时，补充葡萄糖1％、乳糖0.3％、硼酸0.02％、磷酸二氢钾0.3％、甘油4％)，在培养中每隔4h抽样检查一次。(5)发酵液大量产孢时即菌丝80％以上均转化为芽生孢子时放罐。发酵结束时添加经灭菌处理的固体填料硫酸铜及助剂麦麸。添加助剂及填料后含水量20％～30％。(6)干燥处理：35～38℃干燥2～3天。

制剂：

颗粒剂20目玉米小颗粒(玉米粉过筛的颗粒)灭菌，用载体量0.2％的硫酸铜浸混，干燥作为载体，将0.2％硫酸铜菌悬液吸附于载体上，干燥含水量至4％～5％，测定土壤中的恢复产孢。

粉粒剂：用麦麸作为载体。

微粒剂：①用凹凸棒营养土(50％玉米粉，50％凹凸棒土作为载体，与菌液混匀后造微粒。

②用凹凸棒营养土(25％黄豆粉，25％玉米粉；50％凹凸棒土作为载体，与菌液混匀后造微粒。

包衣粉剂：30％面粉，20％玉米粉，50％1凹凸棒土，与菌液混匀后干燥，查看包衣效果，恢复产孢效果和孢子分散效果。

产品质量检验

1产品质量标准

1.1含孢量：10×10⁸/g。

1.2活孢率：90％以上。

1.3含水率：4％～5％。

1.4粉粒细度：过36目筛。

1.5孢子毒力：用2龄初大黑蛴螬进行生物测定。取幼虫置入塑料盒(Φ＝4.5厘米，高5.0厘米)的底部，上覆80克含水量7％，含孢量0.1×10⁸的湿沙，加盖后在温度为25℃、RH 75％恒温室内培养15d。10d，蛴螬出现死亡，15d蛴螬死亡率达80％以上。

2检验方法

2.1样品抽取：每批产品抽取一个样品，相当于产品总数的千分之一作送检样品，将样品搅拌均匀后摊平按对角线平均法或随机取样点状抽取各项检验用小样品。

2.2含孢量测定10×10⁸/g：精密称取受检制剂3g，倒入组织捣碎机的玻璃缸内，加0.1％吐温-80水300ml，加入玻璃缸内，捣碎1min；制成孢子悬浮液，用血球计数板(16×25或25×16的计数板)盖上配套专用的盖玻片，用滴管或吸管吸取菌液，沿盖玻片边缘滴入，使菌液充满盖玻片与载玻片之间的间隙(不能有气泡，侧沟内不能有溢出液)，静止30秒，用显微镜镜检计数，每个样品设三个重复，取其平均值。

血球计算板计数格为25个中格，每个中格为16小格，则计算双线范围内四个角上的四个中格和中间一个中格共80个小格内的总孢于数，计算式为：

活孢率测定：用500ml三角瓶或250ml营养液(蛋白胨0.5％、蔗糖2％)高压灭菌冷却后，放待测菌粉0.1g，置于140r/min摇床上定温(26℃±1℃)培养24h，取样制片镜检，取6个视野，数出每个视野发芽(孢子膨胀比原孢大1倍或芽长度大于孢子半径的)与未发芽孢子数，按下列公式计算孢于活孢率。

2.4含水率测定：先将玻皿在120℃干燥箱内烘干，15min后取出称重，再称5g菌粉于皿内，在120℃干燥箱内定温烘2h，取出立即将样品和玻皿，一起称重，每个样品做三个重复，取其平均值，按下列公式计算含水率。

2.5粉粒细度测定：称取待测粉剂和孢子粉各500g，粉剂全部通过36目筛，即为合格。

2.6菌粉毒力测定：室内作生物测定，取2龄初健康蛴螬50头，分别置入塑料盒(Φ＝4.5cm，高5.0cm)的底部，上覆80克含水量7％，含孢量0.1×10⁸的湿沙，加盖后在温度为25℃、RH 75％的恒温室内培养15d，逐日观察记录蛴螬死虫数，每个样品做三个重复，同时设空白对照，按公式算出蛴螬的死亡率和校正死亡率。

本发明涉及制品的贮存、运输及注意事项

贮存应选择干燥、通风、避光场所。常温贮存不超过半年，超过半年使用的必须要放于4℃处冷藏。

运输中应防潮、防晒、防高温(低于35℃)。禁止与杀菌剂混用。

本发明具有以下优点

本发明从蛴螬危害严重地区采集罹病虫尸，分离纯化并进行筛选，得到布氏白僵菌D5(CGMCC NO.0737)菌株，对大黑鳃金龟幼虫毒力最高，达93.1％，产孢量比出发菌株提高了2.8倍。发酵周期只有48～72h，克服了现已用于生产白僵菌杀虫剂生产周期长的缺点，而且本发明所述的生产方法具有工业化规模生产的特点。再有就是本发明所涉及的杀虫剂产品具有对蛴螬杀灭的专用性。

附图说明

图1 布氏白僵菌D5(CGMCC NO.0737)菌株生产工艺流程

具体实施方式：

实施例1

1生产菌种

1.1生产菌种斜面培养基配方：蔗糖2％，酵母粉0.5％，蛋白胨(鱼)0.5％，硫酸铜0.005％，硫酸锌0.005％，硫酸亚铁0.005％，棉仁粉0.5％，米粉0.5％，硼酸0.01％，硫酸锰0.002％，乳糖0.3％，琼脂2％。按每瓶(200ml)装量60ml分装后制备成斜面培养基，经37℃培养24h无菌检验合格后，方可使用。

2.1.2培养条件和时间：将布氏白僵菌D5(CGMCC NO.0737)菌株培养物无菌接入上述生产菌种培养基后，在26℃±1℃的培养箱中培养培养7～10d，分生孢子产生良好时取出，可作菌种用。

2.1.3贮存条件：该种子培养物于接结束培养后置4～10℃，30天内使用。

2摇瓶菌种

2.1培养基配方：蔗糖2％，酵母粉0.5％，蛋白胨(鱼)0.5％，硫酸铜0.005％，棉仁粉0.5％，米粉1％，硫酸镁0.1％，硫酸亚铁0.005％，磷酸二氢钾0.2％。灭菌温度121℃，压力1.0kg/cm²，保压30min。pH控制：消前6.2，消后6.0。

2.2接种后于转速200r/min，温度27±1℃，培养时间36h，菌丝挂壁，无污染，可做菌种使用。

3一级液体种子发酵

3.1培养基配方：蔗糖2％，酵母粉0.5％，蛋白胨(鱼)0.5％，硫酸铜0.005％，棉仁粉0.5％，米粉1％，硫酸镁0.1％，硫酸亚铁0.005％，磷酸二氢钾0.2％。灭菌温度121℃，压力1.0kg/cm²，保压30min。pH控制：消前6.2，消后6.0。罐装系数：70％。待培养基降温到30℃时，按3％的种子量接入种子。

3.2发酵控制条件：罐压0.2kg/cm²，通气量为1∶1(v/v/min)，罐温27℃±1℃，培养时间为36h，菌丝量大，菌液变稠，有少量芽生孢子形成，无污染，可作为二级种子。

3.3取样检测：在接种后12h开始，每4h取样进行镜检，检测菌丝形态，芽生孢子数量、pH值、有否杂菌污染等。

4二级液体种子发酵

4.1培养基配方：蔗糖2％，酵母粉0.5％，蛋白胨(鱼)0.5％，硫酸铜0.005％，棉仁粉0.5％，米粉1％，硫酸镁0.1％，硫酸亚铁0.005％，磷酸二氢钾0.2％。灭菌温度121℃，压力1.0kg/cm²，保压30min。pH控制：消前6.2，消后6.0。罐装系数：70％。待培养基降温到30℃时，按10％种子量接入种子。

4.2发酵控制条件：罐压0.2kg/cm²，通气量为1∶1(v/v/min)，罐温27℃±1℃，培养时间为30-36h，菌丝量大，菌液变稠，有少量芽生孢子形成，无污染，可作为二级种子。

4.3取样检测：在接种后12h开始，每4h取样进行镜检，检测菌丝形态，芽生孢子数量、pH值、有否杂菌污染等。

5发酵罐发酵

5.1培养基配方：蔗糖2％，酵母粉0.5％，蛋白胨(鱼)0.5％，硫酸铜0.005％，棉仁粉0.5％，米粉1％，硫酸镁0.1％，硫酸亚铁0.005％，磷酸二氢钾0.2％。

5.2罐体消毒：压力1.2kg/cm²，保压30min.

5.3实罐消毒和管道消毒：在发酵罐进行实罐消毒的同时，进行种子罐与发酵罐接种管道的消毒，消毒时微开管道上各有关排气阀门，务必使整条管道畅通，不成死角，调节进气阀至管内压力1.2kg/cm²，保压30min，然后自前至后依次关闭各进气阀，冷却待用。

5.4移种：通过两罐压差，将合格的二级液种按1∶10的比例压到发酵罐，压种毕迅速关闭两罐出料阀，然后调节好罐压力和进、排气阀，开动搅拌、进行培养。

5.5培养：搅拌速度200r/min，罐温27℃±1℃，罐内压力0.5kg/cm²，通气量1∶0.7(v/v/min).培养48～72h。发酵到24～36h大量形成芽生孢子时，补充葡萄糖1％、乳糖0.3％、硼酸0.02％、磷酸二氢钾0.3％、甘油4％)，在培养中每隔4h抽样检查一次。

5.6液种罐发酵管理：每小时登记一次罐温、通气量、罐压，在接种后12h开始，每4h取样进行镜检，测定菌丝形态，芽生孢子数量、pH值、有否杂菌污染等。

5.7发酵液大量产孢时(菌丝80％以上均转化为芽生孢子时放罐)发酵结束时添加经灭菌处理的固体填料及助剂(固体助剂为硫酸铜等；填料为麦麸)。，添加助剂及填料后含水量20％～30％。

5.8干燥处理：35～38℃干燥2～3天。

6制剂：

颗粒剂玉米小颗粒(玉米粉过筛的颗粒)灭菌，用载体量0.2％的硫酸铜浸混，干燥作为载体，将0.2％硫酸铜菌悬液吸附于载体上，干燥含水量至4％～5％，测定土壤中的恢复产孢。

粉粒剂：用麦麸作为载体。

颗粒剂：20目玉米粒作载体。

包衣粉剂：30％面粉，20％玉米粉，50％凹凸棒土，与菌液混匀后干燥，查看包衣效果，恢复产孢效果和孢子分散效果。

7产品贮存

产品干燥至含水量4％～6％。隔氧膜包装封口后常温贮存。

实验1 对花生蛴螬的防治效果

施菌方法分为：播种期施菌：将布氏白僵菌D5(CGMCC NO.0737)菌株用本发明制成的菌粉和定量的土混匀，花生播种时同种子一起施入土穴中。

中耕期施菌：在中耕期将布氏白僵菌D5(CGMCC NO.0737)菌株用本发明制成的菌粉和定量的土混匀(菌土法)，均匀撒到花生根际附近，再将菌粉搂入土中或将菌粉混于水中，泼到花生根部(水泼法)。

池栽试验在1的无底水泥池中播种花生，出苗后将多余的苗拔掉，使每池中苗数相等。按规定剂量和时期施菌。待蛴螬至2龄初，按5头/m²的虫量接入池内，秋后调查活虫数和花生被害果数。不同施菌期结果表明，中耕期防治效果优于播种期，当施菌计量为每公顷75万亿孢子时，在中耕期施菌大黑金龟子(蛴螬成虫)幼虫死亡率为93.3％，而播种期施菌大黑金龟子幼虫死亡率为66.6％，差异显著。不同施菌剂量结果表明，在播种期施菌，施菌剂量需150万亿孢子/hm²以上时才有理想的防治效果，而在中耕期施菌75万亿孢子/hm²菌药(+1.2kg甲基异柳磷)混用或单用菌均可达到理想的防治效果(虫果减退率可达90％)。

田间试验选择蛴螬虫口基数较一致，危害中等的地块，采用不同施菌时期、剂量、施菌方式进行防治试验。结果表明：中耕期防治效果优于播种期，与池栽试验结果一致。在中耕期施菌剂量为150万亿孢子/hm2或75万亿孢子+1.2kg甲基异柳磷/hm2时可获得80％的防治效果。菌药混用可降低菌的用量，提高防治效果。在中耕期，使用菌土法和水泼法两种施菌方式防治效果均较理想，无明显差异。

Claims

1.一种蛴螬专用白僵菌杀虫剂的生产方法，其特征主要包括以下几个步骤：(1)将D5原始生产菌株，一种布氏白僵菌(Beauveria bringniartii)，已于2002年4月17日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，保藏编号为CGMCC NO.0737，均匀接入斜面培养基上，置在26℃±1℃的培养箱中培养培养7～10d，分生孢子产生良好时取出，可作生产用斜面菌种；(2)将斜面菌种中加入液体培养基或灭菌水洗下培养物成菌悬液；(3)在摇瓶及种子罐中用液体培养法将种子放大培养至发酵罐培养所需种子液的量，罐装系数：70％，发酵控制条件：罐压0.2kg/cm²，通气量按v/v/min计为1∶1，罐温27℃±1℃，培养时间为36h，菌丝量大，菌液变稠，有少量芽生孢子形成，无污染，可作为种子液；(4)实罐消毒和管道消毒：在发酵罐进行实罐消毒的同时，进行种子罐与发酵罐接种管道的消毒，消毒时微开管道上各有关排气阀门，务必使整条管道畅通，不成死角，调节进气阀至管内压力1.2kg/cm²，保压30min，然后自前至后依次关闭各进气阀，冷却待用，通过两罐压差，将合格的二级液种按1∶10的比例压到发酵罐，压种毕迅速关闭两罐出料阀，然后调节好罐压力和进、排气阀，开动搅拌、进行培养，培养：搅拌速度200r/min，罐温27℃±1℃，罐内压力0.5kg/cm²，通气量按v/v/min计为1∶0.7，培养48～72h，发酵到24～36h大量形成芽生孢子时，补充葡萄糖1％、乳糖0.3％、硼酸0.02％、磷酸二氢钾0.3％、甘油4％，在培养中每隔4h抽样检查一次；(5)发酵液大量产孢时即菌丝80％以上均转化为芽生孢子时放罐，发酵结束时添加经灭菌处理的固体填料硫酸铜及助剂麦麸，添加助剂及填料后含水量20％～30％；(6)生产菌种斜面培养基配方：蔗糖2％，酵母粉0.5％，鱼蛋白胨0.5％，硫酸铜0.005％，硫酸锌0.005％，硫酸亚铁0.005％，棉仁粉0.5％，米粉0.5％，硼酸0.01％，硫酸锰0.002％，乳糖0.3％，琼脂2％；(7)液体培养基配方：蔗糖2％，酵母粉0.5％，鱼蛋白胨0.5％，硫酸铜0.005％，棉仁粉0.5％，米粉1％，硫酸镁0.1％，硫酸亚铁0.005％，磷酸二氢钾0.2％。

2.权利要求1所述蛴螬专用白僵菌杀虫剂的生产方法，其特征为所述的生产方法还包括将发酵后发酵液加工成颗粒剂、粉粒剂、微粒剂和包衣粉剂。