CN1771809A - 玉米秸秆木霉生物杀菌剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种玉米秸秆木霉生物杀菌剂的制备方法，属农用杀菌剂技术领域，用于解决玉米秸秆制备生物杀菌剂的问题。它以玉米秸杆粉为原料，经原料加工、液体发酵、固体发酵、菌剂制备等步骤制成，其中，在固体发酵阶段，取粉碎好的玉米秸秆粉8～10克，(NH4) 2SO4 0.12～0.14克，MgSO4 0.002～0.004克，KH2PO4 0.004～0.005克，把上述无机盐加200毫升水溶解，再放入玉米秸秆粉，经搅拌、灭菌、冷却后接入培养液，再经培养、风干后制成成品。本发明给出的杀菌剂不对人畜和生态环境产生污染，对农作物真菌性土传病害有很好的防治效果，并有促生长和增产作用。此外，可大量利用玉米秸秆，减少环境污染，是发展高效、绿色、生态农业的理想生物农药。
Description
技术领域
本发明涉及一种农用生物杀菌剂，特别是以玉米秸秆为原料生产的木霉生物杀菌剂的制备方法，属农用微生物杀菌剂技术领域。
背景技术
在一个农业生产大国内，每年收获农作物后的秸杆可高达上亿吨，其中直接和间接还田的不足半数，另有一部分作为工业原料或农用燃料，剩余相当一部分被焚烧，这种处理方式不但浪费资源而且严重污染环境。尽管各种政令禁止焚烧秸杆，但因苦于无适当的处理方式而屡禁不止。在另一方面，由于农作物经常会受到各种病虫害的侵扰造成减产甚至绝产，目前的方法多是使用化学农药、杀虫剂来杀灭或抑制病虫害，随着农葯的大量使用，各种害虫抗药性增加，农药用量也在不断加大，其结果形成恶性循环，致使病虫害更加难以防治且使农产品农药残留量增加。近年来，研究发现将木霉生物制剂作为土壤微生物菌剂，用于防治农作物及经济作物的真菌性土传病害如灰霉病、立枯病、枯萎病、腐霉病等，有着很好的防治效果，且不会产生化学药品的副作用。但目前存在的问题是：制备木霉杀菌剂需要使用玉米粉、糖蜜、麦麸等价格较贵的原料，使木霉杀菌剂的生产成本增加、难以广泛推广使用。
综上，如果能利用秸杆等廉价原料制备木霉杀菌剂，既可以变废为宝解决秸杆利用问题，又可以使用低价环保的木霉杀菌剂防治虫害。
发明内容
本发明用于解决上述已有技术之缺陷而提供一种使用廉价玉米秸秆粉为原料用于生产米秸秆木霉生物杀菌剂的制备方法。
本发明所称问题是通过以下技术方案解决的：
一种玉米秸秆木霉生物杀菌剂的制备方法，它以玉米秸杆粉为原料、并按照如下步骤制备：
a.原料加工：选择无霉变玉米秸秆，粉碎成20目粉状备用；
b.液体发酵：培养基成分为：麸皮0.5～0.8克，(NH4)2SO4 02.～0.4克，KH2PO4 0.1～0.3克，CaCO3 0.1～0.3克，葡萄糖1～2克，用上述物质配制液体发酵培养基100毫升，调整PH值为5.5～6，高压灭菌30～40分钟，待物料冷却后接入拮抗性木霉菌种，于26～30℃振荡培养36～48小时后停止培养备用；
c.固体发酵：取粉碎好的玉米秸秆粉8～10克，(NH4)2SO4 0.12～0.14克，MgSO4 0.002～0.004克，KH2PO4 0.004～0.005克，把上述无机盐加200毫升水溶解，再放入玉米秸秆粉，搅拌均匀，高压灭菌30～40分钟，待物料冷却后接入步骤b的培养液1～1.5毫升，搅拌均匀，放于恒温培养箱中进行12小时黑暗光照交替培养90～96小时，培养好的固体发酵物料在低于50℃的环境中风干备用；
d.菌剂制备：取步骤c中干燥固体菌剂1克加入99毫升无菌水和适量玻璃珠，摇床上振荡30～40分钟，测量孢子个数，再用粉碎好的玉米秸秆粉稀释到孢子含量为108个/克孢子即得分包装的木霉生物杀菌剂。
上述玉米秸秆木霉生物杀菌剂的制备方法，所述拮抗性木霉菌种为绿色木霉，并经紫外光照射诱变选育。
上述玉米秸秆木霉生物杀菌剂的制备方法，所述固体发酵步骤中恒温培养温度为28～30℃，湿度65～80％。
本发明使用廉价的玉米秸秆粉为原料，替代目前使用的淀粉等类原料，采用液-固两相发酵工艺，制备生物杀菌剂。该杀菌剂不对人畜和生态环境产生危害和污染，对农作物的真菌性土传病害如灰霉病、立桔病、枯萎病、腐霉病等有很好的防治效果，同时还对玉米秸秆的纤维素有很好的分解性，使之转换成有用的营养物质，这对木霉菌的分生孢子产生和施用后的植物生长非常有利。能明显促进农作物生长、增加农作物产量10-20％，具有有病防病，无病增产的效果。本发明产生的分生孢子数量大，通过12小时光照和黑暗交替培养，可使发酵物每克干品的木霉分生孢子数达到200～500亿(一般为2～5亿每克)。此外，目前所用木霉高孢粉都是直接应用，或是用土等惰性填充物料稀释后使用，由于土壤的抑真菌作用，可使木霉对植物病害的防治效果降低且不稳定。本发明用玉米秸秆粉作稀释、营养剂，使施入的木霉菌能长出较多、较长的菌丝，可以延伸到植株根围的较大范围去侵染病菌，抑制病害发生，这不仅可以消除或降低土壤抑真菌作用，使木霉菌剂防治效果提高，稳定持久，而且提高了木霉的防治病害效果；以玉米秸杆粉为原料，可大量利用废弃的玉米秸秆，降低成本几倍～十几倍，变废为宝，减少焚烧污染，具有很好得社会效益和经济效益，是发展高效、绿色、生态农业的理想生物农药。
具体实施方式
本发明经过反复筛选和紫外光照射诱变选育，选用适宜在玉米秸秆粉中发酵生长的拮抗性木霉菌-绿色木霉。该菌株不仅对多种植物病害有很好的抑制作用。而且，还对玉米秸秆的纤维素有很好分解性，产孢子量大。通常在经过液体发酵和固体发酵后的菌剂孢子个数可达到1010/克个孢子，而成品木霉生物杀菌剂的孢子含量为108个/克，显然，需要大量玉米秸秆粉作为营养剂和稀释剂，因此可以消化利用大量废弃的玉米秸秆，减少每年因焚烧秸秆对环境造成的污染，为秸秆的综合利用提供了一条新的途径。
以下提供几个实施例：
实施例1：
a.原料加工：选择无霉变玉米秸秆，晾晒干燥后粉碎成20目粉状备用；
b.液体发酵：培养基成分：麸皮0.5克，(NH4)2SO4 0.2克，KH2PO4 0.1克，CaCO3 0.1克，葡萄糖1.5克。上述物质配制液体发酵培养基100毫升，调整液体的PH值为5.5，放入300毫升三角瓶中高压灭菌30分钟。物料冷却后接人筛选好的拮抗性木霉菌种，于28℃振荡培养40小时，停止培养备用。
c.固体发酵：取粉碎好的玉米秸秆粉9克，(NH4)2SO4 0.12克，MgSO4 0.002克，KH2PO4 0.004克。把上述无机盐放入300毫升三角瓶加200毫升水溶解，再放入玉米秸秆粉，搅拌均匀，盖好瓶塞。高压灭菌30分钟，待物料冷却后接入步骤b制得的1毫升液体培养液。搅拌均匀，放于28℃的恒温培养箱中，保持湿度65％进行固体培养90小时。培养好的固体发酵物料在温度小于50℃环境中风干后备用。
d.菌剂制备：取一克干燥好的固体菌剂放入300毫升三角瓶中，加入99毫升无菌水和10～20个豌豆大小的玻璃珠，玻璃珠的作用是提高搅拌摇振力。放在180——200转/分钟的摇床上振荡30分钟。用血球计数板测量孢子个数1010/克个孢子，用粉碎好的玉米秸秆粉稀释到孢子含量为108/克个孢子即得木霉生物杀菌剂。
实施例2：
a.原料加工：选择无霉变玉米秸秆，晾晒干燥后粉碎成20目粉状备用；
b.液体发酵：培养基成分：麸皮0.8克，(NH4)2SO4 0.35克，KH2PO4 0.25克，CaCO3 0.2克，葡萄糖1克。上述物质配制液体发酵培养基100毫升，调整液体的PH值为6，放入300毫升三角瓶中高压灭菌40分钟。物料冷却后接入筛选好的拮抗性木霉菌种，于29℃振荡培养42小时，停止培养备用。
c.固体发酵：取粉碎好的玉米秸秆粉10克，(NH4)2SO4 0.14克，MgSO4 0.004克，KH2PO4 0.045克。把上述无机盐放入300毫升三角瓶加200毫升水溶解，再放入玉米秸秆粉，搅拌均匀，盖好瓶塞。高压灭菌35分钟，待物料冷却后接入步骤b制得的1.5毫升液体培养液。搅拌均匀，放于30℃的恒温培养箱中，保持湿度80％进行12小时黑暗光照交潜培养固体培养96小时。培养好的固体发酵物料在温度小于50℃环境中风干后备用。
d.菌剂制备：同实施例1。
实施例3：
a.原料加工：选择无霉变玉米秸秆，晾晒干燥后粉碎成20目粉状备用；
b.液体发酵：培养基成分：麸皮0.7克，(NH4)2SO4 0.4克，KH2PO4 0.3克，CaCO3 0.3克，葡萄糖2克。上述物质配制液体发酵培养基100毫升，调整液体的pH值为5.5，放入300毫升三角瓶中高压灭菌35分钟。物料冷却后接入筛选好的拮抗性木霉菌种，于30℃振荡培养48小时，停止培养备用。
c.固体发酵：取粉碎好的玉米秸秆粉8克，(NH4)2SO4 0.13克，MgSO4 0.003克，KH2PO4 0.005克。把上述无机盐放入300毫升三角瓶加200毫升水溶解，再放入玉米秸秆粉，搅拌均匀，盖好瓶塞。高压灭菌35分钟，待物料冷却后接入步骤b制得的1.3毫升液体培养液。搅拌均匀，放于28℃的恒温培养箱中，保持湿度70％进行12小时黑暗光照交替培养固体培养93小时。培养好的固体发酵物料在温度小于50℃环境中风干后备用。
d.菌剂制备：同实施例1。
本发明中所用拮抗性木霉菌种为绿色木霉，并经紫外光照射诱变选育。所谓紫外光照射诱变选育，是指按如下工艺进行的选育：先制备PDA(土豆200克，葡萄糖20克，琼指18克，水1000ml)培养基平板，把拮抗性木霉菌种接种在平板上，在25℃恒温培养5天产生绿色木霉分生孢子。加灭菌水10毫升洗脱孢子，制成浓度为106/ml个孢子的悬浮液。取PDA平板，每板吸取0.1毫升悬浮液，均匀涂在平板表面，放在恒温培养箱中在25℃恒温培养一天，然后在蔽光条件下，30瓦紫外灯，距离灯管30cm处照射80分钟。然后用黑纸包好，放在4℃培养箱中低温培养12小时。再放入25℃恒温培养黑暗。3天后选取生长快速的菌株，接入PDA培养基纯化培养，作为下次紫外诱变的菌种。直到选出拮抗性好，能很好分解纤维素的木霉菌株。
本发明可以拌种使用，也可以在移栽时沾根，还可以在进行整地时垄施，每亩地10-20公斤。
Claims (3)
1.一种玉米秸秆木霉生物杀菌剂的制备方法，其特征在于：所述杀菌剂以玉米杆粉为原料按照如下步骤制备：
a.原料加工：选择无霉变玉米秸秆，粉碎成20目粉状备用；
b.液体发酵：培养基成分为：麸皮0.5～0.8克，(NH4)2SO4 02.～0.4克，KH2PO4 0.1～0.3克，CaCO3 0.1～0.3克，葡萄糖1～2克，用上述物质配制液体发酵培养基100毫升，调整PH值为5.5～6，高压灭菌30～40分钟，待物料冷却后接人拮抗性木霉菌种，于26～30℃振荡培养36～48小时后停止培养备用；
c.固体发酵：取粉碎好的玉米秸秆粉8～10克，(NH4)2SO4 0.12～0.14克，MgSO4 0.002～0.004克，KH2PO4 0.004～0.005克，把上述无机盐加200毫升水溶解，再放人玉米秸秆粉，搅拌均匀，高压灭菌30～40分钟，待物料冷却后接人步骤b的培养液1～1.5毫升，搅拌均匀，放于恒温培养箱中进行12小时黑暗光照交替培养90～96小时，培养好的固体发酵物料在低于50℃的环境中风干备用；
d.菌剂制备：取步骤c中干燥固体菌剂1克加入99毫升无菌水和玻璃珠，摇床上振荡30～40分钟，测量孢子个数，再用粉碎好的玉米秸秆粉稀释到孢子含量为108/克个孢子即得木霉生物杀菌剂。
2.根据权利要求1所述玉米秸秆木霉生物杀菌剂的制备方法，其特征在于：所述拮抗性木霉菌种为绿色木霉，并经紫外光照射诱变选育。
3.根据权利要求2所述玉米秸秆木霉生物杀菌剂的制备方法，其特征在于：所述固体发酵步骤中恒温培养温度28～30℃，湿度65～80％，进行12小时黑暗和光照交替培养。
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