CN110591921B - 一种木霉菌液体发酵的厚垣孢子及其制备方法 - Google Patents
一种木霉菌液体发酵的厚垣孢子及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110591921B CN110591921B CN201811551665.6A CN201811551665A CN110591921B CN 110591921 B CN110591921 B CN 110591921B CN 201811551665 A CN201811551665 A CN 201811551665A CN 110591921 B CN110591921 B CN 110591921B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- chlamydospores
- trichoderma
- straw
- liquid
- culture medium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 title claims abstract description 50
- 239000007788 liquid Substances 0.000 title claims abstract description 42
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 title claims abstract description 25
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 24
- 239000010902 straw Substances 0.000 claims abstract description 46
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 34
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 claims abstract description 19
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims abstract description 18
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims abstract description 18
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims abstract description 18
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 claims abstract description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 20
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 16
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 15
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 13
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 11
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 claims description 11
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 9
- LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N pyridoxine Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 claims description 6
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 claims description 6
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 6
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 6
- 235000019158 vitamin B6 Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000011726 vitamin B6 Substances 0.000 claims description 6
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 235000019164 vitamin B2 Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000011716 vitamin B2 Substances 0.000 claims description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- RADKZDMFGJYCBB-UHFFFAOYSA-N pyridoxal hydrochloride Natural products CC1=NC=C(CO)C(C=O)=C1O RADKZDMFGJYCBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229940011671 vitamin b6 Drugs 0.000 claims description 4
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 claims description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N D-Cellobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N 0.000 claims description 3
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 241001411320 Eriogonum inflatum Species 0.000 claims description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 3
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 claims description 3
- 229930003471 Vitamin B2 Natural products 0.000 claims description 3
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 claims description 3
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 claims description 3
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 claims description 3
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 claims description 3
- XMEVHPAGJVLHIG-FMZCEJRJSA-N chembl454950 Chemical compound [Cl-].C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H]([NH+](C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@@]4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O XMEVHPAGJVLHIG-FMZCEJRJSA-N 0.000 claims description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 3
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 claims description 3
- 229960004989 tetracycline hydrochloride Drugs 0.000 claims description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 2
- QXJJQWWVWRCVQT-UHFFFAOYSA-K calcium;sodium;phosphate Chemical compound [Na+].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O QXJJQWWVWRCVQT-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 9
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 5
- -1 microelements Substances 0.000 abstract description 5
- 238000004904 shortening Methods 0.000 abstract description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 abstract description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 abstract description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 abstract description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 abstract description 2
- 241000209149 Zea Species 0.000 abstract 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- 230000000443 biocontrol Effects 0.000 description 7
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-methoxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)naphthalene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(CC(C)=O)C(O)=C2C(=O)C(OC)=CC(=O)C2=C1O UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 description 4
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 4
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 description 3
- 235000010799 Cucumis sativus var sativus Nutrition 0.000 description 3
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 3
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000000442 meristematic effect Effects 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000004563 wettable powder Substances 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000123650 Botrytis cinerea Species 0.000 description 1
- 241000219112 Cucumis Species 0.000 description 1
- 235000015510 Cucumis melo subsp melo Nutrition 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000223221 Fusarium oxysporum Species 0.000 description 1
- 108010068370 Glutens Proteins 0.000 description 1
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 241000813090 Rhizoctonia solani Species 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 241000223260 Trichoderma harzianum Species 0.000 description 1
- 239000005855 Trichoderma harzianum strains T-22 and ITEM 908 Substances 0.000 description 1
- 241000223261 Trichoderma viride Species 0.000 description 1
- FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N [4,6-bis(cyanoamino)-1,3,5-triazin-2-yl]cyanamide Chemical compound N#CNC1=NC(NC#N)=NC(NC#N)=N1 FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000853 biopesticidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000003973 irrigation Methods 0.000 description 1
- 230000002262 irrigation Effects 0.000 description 1
- 239000009004 jinqing Substances 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000002068 microbial inoculum Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000003020 moisturizing effect Effects 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N3/00—Spore forming or isolating processes
Abstract
本发明涉及一种木霉菌液体发酵的厚垣孢子及其制备方法。采用玉米秸秆酶解液作为培养基原料，所述的秸秆酶解液含有糖组分和分散剂组分等，在所述秸秆酶解液培养基接入木霉菌菌饼进行液体发酵，得到所述厚垣孢子。本发明开发了以玉米秸秆酶解液为主要原料，通过添加维生素、微量元素和分散剂等方法，不仅大幅提高了厚垣孢子的产孢量，降低了生产成本，还缩短了发酵周期2天，提高了劳动生产效率，同时货架期可达到一年。为木霉菌剂的推广应用提高了保障。
Description
技术领域
本发明涉及一种木霉菌液体发酵的厚垣孢子及其制备方法，属于生物农药及其制备技术领域。
背景技术
由于木霉菌对植物病害具有显著的生防效果，且环境相容性好，易于大量生产等优点，全球各国都尝试将其开发为生物农药商品制剂。 据统计在全球所有登记的生物农药品种中，大约60%的产品有效成分是木霉分生孢子。如美国的Topshield（哈茨木霉 T22）和以色列的 Trichodex（哈茨木霉 T39），中国的木霉菌可湿性粉剂特立克（绿色木霉 T.Viride）等。如前所述己经商品化的木霉制剂大多为分生孢子制剂。然而，由于分生孢子的抗逆性弱、耐储性差，致使分生孢子制剂保质期短、耐受性差、田间防效不稳定等。以分生孢子为有效成分的木霉制剂保质期一般只有 3 个月，货架期极短。所以，极大限制了木霉菌生防菌剂的推广与应用。因此，如何保持制剂在运输、储存和使用过程中的生物活性，提高木霉菌剂的生防效果，提高货架期是木霉制剂面临的最大挑战。
木霉厚垣孢子是木霉菌在逆境条件下产生的一种繁殖体，与分生孢子相比，其体积大、细胞壁厚、抗逆性强、存活期长、易加工贮存。木霉菌厚垣孢子制剂比分生孢子制剂更能抵抗环境压力，对土壤抑菌作用的敏感性较低，因此是一种更有潜力的生防制剂。开发木霉厚垣孢子制剂是提高木霉制剂储存和生防性能的有效途径，但诱导木霉大量产生厚垣孢子比较困难，且产孢量较少，生产成本较高，极大的限制了其应用，需要加以改进。
发明内容
本发明针对上述缺陷，目的在于提供一种能有效提高木霉菌液体厚垣孢子产量，且具备较长货架期的一种木霉菌液体发酵的厚垣孢子及其制备方法。
为此本发明采用的技术方案是：一种木霉菌液体发酵制备厚垣孢子的方法，采用秸秆酶解液作为培养基，在所述秸秆酶解液培养基接入木霉菌菌饼进行培养，得到所述厚垣孢子。
所述秸秆酶解液中碳源安重量比包括以下组分：63.6%的葡萄糖、34.0%的木糖、2.0%的阿拉伯糖和0.2%的纤维二糖、以及秸秆酶解后剩余的分散剂NNO等物质。
在所述秸秆酶解液培养基内加入NNO分散剂和玻璃珠。
在所述秸秆酶解液培养基内加入（NH4）2SO4、K2HPO4、CaCl2、MnSO4.H2O。
在所述秸秆酶解液培养基内加入维生素B2、B6。
另一制备方法为：在制备所述厚垣孢子时，还可采用玉米粉培养基、PDA培养基、燕麦培养基，在各培养基接入木霉菌菌饼以及分散剂NNO和玻璃珠。
具体的说，所述秸秆酶解液按照以下步骤进行：
称取已经过水预处理的玉米秸秆28.0-30.0g粉碎至40目(绝干底物)，置于三脚瓶中,加入150mlHAc-NaAc缓冲液(pH=4.8、浓度O.lmol/L),加入1.2ml浓度为lOmg/ml的盐酸四环素溶液,加入15ml浓度为0.5%的NNO (亚甲基二萘磺酸钠)溶液和15ml浓度为0.2%的JFC-S溶液，同时加入15FPU/g底物的纤维素酶和1.5CBU/g底物的纤维二糖酶,补加蒸馏水至液体总体积为3OOml,最加入20颗玻璃球，盖上瓶塞。混合均匀后,将三角瓶放入摇床内进行酶水解,温度设为49-50℃、转速180r/min、酶解时间80-85h，酶解液过滤，既得秸秆酶解液；
然后取秸秆酶解液500ml，麸皮20g，添加蒸馏水至 1000 ml，调节pH5，灭菌备用；
以上各物料的数据同比例放大或缩小。
经过检测，所制备得到的厚垣孢子其货架期至少达到12个月。
本发明的优点是：本发明开发了以玉米秸秆酶解液为主要原料，通过添加维生素、微量元素和分散剂等方法，不仅大幅提高了厚垣孢子的产孢量，降低了生产成本，还缩短了发酵周期2天，提高了劳动生产效率，同时货架期可达到一年。为木霉菌剂的推广应用提高了保障。
附图说明
图1为180 倍孢子悬液显微图（电子显微镜观查）。
图2为1200倍孢子悬液显微图（电子显微镜观查）。
具体实施方式
1、培养基制作
1.1 玉米秸秆酶解液
称取已经过水热预处理（方法见CN201611194437.9）的玉米秸秆28.0-30.0g粉碎至40目(绝干底物)，置于500ml 三脚瓶中,加入150mlHAc-NaAc缓冲液(pH=4.8、浓度O.lmol/L),加入1.2ml浓度为lOmg/ml的盐酸四环素溶液,加入15ml浓度为0.5%的NNO (亚甲基二萘磺酸钠)溶液和15ml浓度为0.2%的JFC-S溶液，同时加入15FPU/g底物的纤维素酶和1.5CBU/g底物的纤维二糖酶,补加蒸馏水至液体总体积为3OOml,最加入20颗玻璃球，盖上瓶塞。混合均匀后,将三角瓶放入摇床内进行酶水解,温度设为49-50℃、转速180r/min、酶解时间80-85h，酶解液过滤，既得秸秆酶解液。
1.1.1秸秆酶解液养基
取秸秆酶解液500ml，麸皮20g，添加蒸馏水至 1000 ml，调节pH5，灭菌备用。
1.2燕麦培养基：
取 30 g 燕麦片放入锅内，添加蒸馏水 1000 ml 水，煮沸 30 min，并用四层纱布过滤煮沸的燕麦，添加蒸馏水至1000 ml，调节pH5，灭菌备用。
1.3玉米培养基：
取 20 g 玉米粉放入锅内，添加蒸馏水 1000 ml水，煮沸 30 min，并用四层纱布过滤煮沸的玉米粉，添加蒸馏水至 1000 ml，调节pH5，灭菌备用。
1.4 PD 培养基：
取 200 g 马铃薯，去皮切块，放入锅内，添加1000 ml 水，煮沸 30min，并用四层纱布过滤煮沸的马铃薯，添加蒸馏水定容至 1000 ml，调节pH5，灭菌备用。
2、木霉菌活化
T32为本研究室选育的一株拮抗性木霉，该菌对灰霉病菌、立枯丝核菌、镰刀菌等多种土传性病原菌均具有优良的拮抗作用和生防效果。用接种环挑取少量绿色分生孢子，接种在PDA培养皿内中间位置，放于28℃恒温培养箱中，培养3-4天，备用。
3、液体发酵
在超净工作台里，分别量取100 ml 的PD 培养基、玉米培养基、燕麦培养基和秸秆酶解液培养基，放于已灭菌的250 ml三角瓶内。每瓶接入3片菌饼（用直径5 ml的打孔器截取）。置于25℃、转速150r/min的摇床上培养13天，用血球计数板测厚垣孢子产孢量。每处理重复3次。
表1 不同培养基木霉厚垣孢子的产孢量（×107个/ml）
| 发酵天数 | 玉米粉培养基 | PDA培养基 | 燕麦培养基 | 秸秆酶解液培养基 |
| 9 | 3.6 | 4.9 | 4.1 | 8.9 |
| 10 | 5.5 | 6.2 | 6.7 | 11.3 |
| 11 | 5.8 | 6.3 | 8.2 | 11.9 |
| 12 | 7.4 | 7.5 | 9.8 | 11.5 |
| 13 | 7.2 | 7.3 | 8.5 | 11.2 |
由表1可见：秸秆酶解液培养基产孢量最大，且在发酵11天达到最大产孢量。而其他3个培养基最大产孢量在12天。经HPLC分析，秸秆酶解液中碳源含有63.6%的葡萄糖、34.0%的木糖、2.0%的阿拉伯糖和0.2%的纤维二糖等，这些糖作为碳源可能更利于厚垣孢子的产生；同时，由于秸秆酶解液中含有少量秸秆酶解后剩余的分散剂NNO等物质，也起到了一定作用。这些可能就是致使玉米秸秆酶解液产孢量最大的原因。
图1是 180 倍孢子悬液显微图，图2是 1200倍孢子悬液显微图，液体培养物是由菌丝和游离孢子组成的，而较大的厚垣孢子多数长在菌丝的末端，不易与菌丝分离。木霉厚垣孢子的直径约为 10 μm，约是木霉分生孢子大小的十倍。厚垣孢子成簇状侧生在菌丝上或菌丝末端，厚垣孢子的生长这一特点使得液体培养所得的游离厚垣孢子较少，由于产生的厚垣孢子不能快速脱落，与菌丝之间易结成网状，也阻碍了厚垣孢子的继续产生。所以，准备改进试验。通过添加几种分散剂试验，最后筛选出添加分散剂NNO(亚甲基二萘磺酸钠)和玻璃珠。利用玻璃珠物理碰撞，使簇状侧生在菌丝上或菌丝末端的厚垣孢子脱落；利用分散剂尽快分散脱落的厚垣孢子，从而提高厚垣孢子的产量和速度。
4、添加分散剂NNO和玻璃珠
在超净工作台里，分别量取100 ml 的PD 培养基、玉米培养基、燕麦培养基和秸秆酶解液培养基，放于已灭菌的250 ml三角瓶内。分别加入NNO分散剂0.1-0.2g和20-23粒玻璃珠。置于25℃、转速150r/min的摇床上培养13天，用血球计数板测厚垣孢子产孢量。每处理重复3次。
表2 加入NNO和玻璃珠的不同培养基木霉厚垣孢子的产孢量（×108个/ml）
| 发酵天数 | 玉米粉培养基 | PDA培养基 | 燕麦培养基 | 秸秆酶解液培养基 |
| 9 | 1.5 | 5.2 | 6.5 | 17.5 |
| 10 | 3.7 | 7.6 | 9.2 | 19.6 |
| 11 | 6.4 | 8.9 | 9.9 | 19.4 |
| 12 | 6.2 | 8.6 | 9.7 | 18.9 |
| 13 | 5.9 | 8.1 | 9.2 | 18.5 |
由表2所示：加入NNO和玻璃珠后，4种培养基木霉厚垣孢子的产量都提高了一个数量级，最大产孢量都缩短了一天。特别是秸秆酶解液培养基，厚垣孢子产量都提高了2个数量级。达到了1.96×109个/ml，最大产孢量在第10天，发酵周期比其他3种培养基不加分散剂和玻璃珠缩短了2天。可显著降低生产成本，提高劳动生产率。
5、对秸秆酶解液培养基优化
5.1 培养基： 取秸秆酶解液培养基100 ml，放入250ml三角瓶，加入（NH4）2SO4 0.4g-0.5g，K2HPO4 0.1g-0.2g，加入NNO分散剂0.1-0.2g和20-23粒玻璃珠。调pH5-5.5，高压灭菌20-30分钟，备用。
5.2培养基： 取秸秆酶解液培养基100 ml，放入250ml三角瓶，加入（NH4）2SO4 0.4g-0.5g，K2HPO4 0.1g-0.2g，CaCl2 0.1 -0.2g，MnSO4·H2O 0.2-0.3g，加入NNO分散剂0.1-0.2g和20-23粒玻璃珠。调pH5-5.5，高压灭菌20-30分钟，备用。
5.3培养基： 上述5.2培养基在无菌条件下接种T32菌块时各加入0.1-0.2g的 维生素B2、维生素B6，备用。
上述5.1、5.2、5.3三种培养基中，在无菌条件下分别接入T32菌块3块，置于25℃、转速150r/min的摇床上培养12天，用血球计数板测厚垣孢子产孢量。同时，用秸秆酶解液培养基做空白对照。每处理重复3次。
表3 不同培养基木霉厚垣孢子的产孢量（×108个/ml）
| 发酵天数 | 5.1培养基 | 5.2培养基 | 5.3培养基 | 秸秆液(对照) |
| 9 | 18.5 | 19.1 | 20.8 | 17.5 |
| 10 | 20.1 | 20.5 | 26.8 | 19.7 |
| 11 | 20.9 | 21.6 | 26.5 | 19.4 |
| 12 | 20.5 | 21.3 | 26.1 | 18.9 |
由上表可以看出：优化的5.1、5.2和5.3培养基，与基础的秸秆酶解液培养基相比，厚垣孢子产孢量均有所增加。厚垣孢子产孢量分别提高了3.55%、9.65%和36.8%。可见添加少量的（NH4）2SO4 、K2HPO4 、CaCl2、MnSO4.H2O是可以提高产孢量，而维生素B2、维生素B6对提高厚垣孢子的产量作用更加明显,可提高产孢量36.8%。可以显著提高产品收率和劳动生产率，降低生产成本。这可能因为B2能促进微生物生长发育和细胞的再生；而B6可帮助分解蛋白质，脂肪和碳水化合物，为木霉菌丝或厚垣孢子的生长提供更多N和C源。另外，维生素B6也可以作为各种酶的辅酶参与各种氨基酸的代谢，促进氨基酸的吸收和蛋白质的合成，这些也是厚垣孢子的细胞生长所必需的物质。从而提高了厚垣孢子的产孢量。
6、厚垣孢子和分生孢子货架期比较
将厚垣孢子发酵液10000r/min高速离心分离后与分生孢子分别与硅藻土混合，制成孢子含量108个/g的制剂,分别置于30℃的烘箱中干燥至含水量为4%左右。烘干后的样品放在聚乙烯袋中置于室温放置4、6、8、10、12个月。分别取1g厚垣孢子与分生抱子制剂放于100mL无菌水中稀释，采用琼胶玻片法检测制剂中的活孢子数。
表4 厚垣孢子和分生孢子贮存对比结果
| 放置（月） | 0 | 6 | 8 | 10 | 12 |
| 分生孢子数 | 1.63×108 | 1.36×103 | 2.05×102 | 86 | 5 |
| 厚垣孢子数 | 1.41×108 | 2.11×107 | 1.02×107 | 2.93×106 | 1.75×106 |
贮存6个月，厚垣孢子制剂中活菌数从1.41×108个/g下降到2.11×107个/g,下降了1个数量级；而分生孢子制剂中的活菌数从1.63×108个/下降到1.36×103个/g,下降了5个数量级，已不具备生防效果。贮存12个月时，分生孢子只检测到5个/g活孢子；而厚垣孢子还有1.75×106个/g活孢子，仍可作为生防菌剂施用。可见厚垣孢子开发成制剂,在延长货架期方面将更具优势。
相对于分生抱子而言,厚垣孢子具有体积大、内涵物多、细胞壁厚的特点,这些特征决定了厚垣孢子对外界环境的适应性更强，而温度、pH、外源营养物质、紫外线等因素对厚垣孢子萌发率影响也较小,这些特性使木霉厚垣孢子制剂田间防效,更加稳定。
7、对黄瓜枯萎病生防效果
为了进行对比试验，本试验设3个处理：A 取上述放置12个月的木霉厚垣孢子菌剂10g与2000g土壤混合后装入盆内；B 取2000g土壤装入盆内，用50%速克灵可湿性粉剂500倍液15ml灌根；C 取2000g土壤装入盆内作为对照。以上三盆分别移栽8株津青1号黄瓜苗。然后分别取15ml尖镰孢菌孢子悬浮液（105cfu /ml）灌根。每处理4盆，重复3次。于25℃保湿20d，调查瓜苗发病情况，计算发病率和对枯萎病的防治效果。
发病率=感病株数/总株数×100％
防治效果=（对照发病率-用药发病率）/对照发病率×100％
经过20d盆栽防效结果统计结果见表5。
表5 厚垣孢子菌剂与速克灵的防治效果
由表5可见：厚垣孢子菌剂对黄瓜枯萎病防效达到78.4％，优于速克灵的防治效果71.1%，且差异显著。说明放置12个月后的厚垣孢子制剂仍有很好的防治效果，且优于化学农药。
Claims (7)
1.一种木霉菌液体发酵制备厚垣孢子的方法，其特征在于，采用玉米秸秆酶解液作为培养基原料，所述的秸秆酶解液含有糖组分和分散剂组分等，在所述秸秆酶解液培养基接入木霉菌菌饼进行液体发酵，得到所述厚垣孢子；
所述秸秆酶解液按照以下步骤进行：
称取已经过水热预处理的玉米秸秆28.0-30.0g粉碎至40目作为绝干底物，置于三脚瓶中,加入150mlHAc-NaAc缓冲液，缓冲液pH=4.8、浓度0.1mol/L，加入1.2ml浓度为l0mg/ml的盐酸四环素溶液,加入15ml浓度为0.5%的NNO 溶液和15ml浓度为0.2%的JFC-S溶液，同时加入15FPU/g底物的纤维素酶和1.5CBU/g底物的纤维二糖酶,补加蒸馏水至液体总体积为300ml,最加入20颗玻璃球，盖上瓶塞；
混合均匀后,将三角瓶放入摇床内进行酶水解,温度设为49-50℃、转速180r/min、酶解时间80-85h，酶解液过滤，既得秸秆酶解液；
然后配制秸秆酶解液培养基：取秸秆酶解液500ml，麸皮20g，添加蒸馏水至 1000 ml，调节pH5，灭菌备用；
以上各物料的数据同比例放大或缩小。
2.根据权利要求1所述的一种木霉菌液体发酵制备厚垣孢子的方法，其特征在于，所述秸秆酶解液中碳源按重量比包括以下组分：62-65%的葡萄糖、32-36%的木糖、1-3%的阿拉伯糖和0.1-0.5%的纤维二糖，以及秸秆酶解后剩余的少量分散剂NNO等物质。
3.根据权利要求1所述的一种木霉菌液体发酵制备厚垣孢子的方法，其特征在于，在所述秸秆酶解液培养基内加入NNO分散剂和玻璃珠。
4.根据权利要求3所述的一种木霉菌液体发酵制备厚垣孢子的方法，其特征在于，发酵周期为10天。
5.根据权利要求1或3所述的一种木霉菌液体发酵制备厚垣孢子的方法，其特征在于，在所述秸秆酶解液培养基内加入（NH4）2SO4、K2HPO4、CaCl2、MnSO4.H2O。
6.根据权利要求5所述的一种木霉菌液体发酵制备厚垣孢子的方法，其特征在于，在所述秸秆酶解液培养基内加入维生素B2、B6。
7.根据权利要求6所述的一种木霉菌液体发酵制备厚垣孢子的方法，其特征在于，采用该液体培养基：秸秆酶解液培养基100 ml，放入250ml三角瓶，加入（NH4）2SO4 0.4g-0.5g，K2HPO4 0.1g-0.2g，CaCl2 0.1 -0.2g，MnSO4.H2O 0.2-0.3g，加入NNO分散剂0.1-0.2g，0.1-0.2g的维生素B2、维生素B6和20-23粒玻璃珠；置于25℃、转速150r/min的摇床上培养。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811551665.6A CN110591921B (zh) | 2018-12-19 | 2018-12-19 | 一种木霉菌液体发酵的厚垣孢子及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811551665.6A CN110591921B (zh) | 2018-12-19 | 2018-12-19 | 一种木霉菌液体发酵的厚垣孢子及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110591921A CN110591921A (zh) | 2019-12-20 |
| CN110591921B true CN110591921B (zh) | 2023-12-05 |
Family
ID=68849285
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201811551665.6A Active CN110591921B (zh) | 2018-12-19 | 2018-12-19 | 一种木霉菌液体发酵的厚垣孢子及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110591921B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113229294B (zh) * | 2021-01-29 | 2022-04-15 | 宁夏农林科学院植物保护研究所（宁夏植物病虫害防治重点实验室） | 一种基于哈茨木霉菌m-17厚垣孢子的可湿性粉剂组合物、制备方法及应用 |
| CN114107070B (zh) * | 2021-12-03 | 2023-07-04 | 天津市农业科学院 | 一种印度梨形孢菌剂及其制备方法 |
Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1771809A (zh) * | 2005-10-14 | 2006-05-17 | 田连生 | 玉米秸秆木霉生物杀菌剂的制备方法 |
| CN101044864A (zh) * | 2007-04-06 | 2007-10-03 | 田连生 | 利用玉米秸秆制备木霉菌可湿性粉剂的方法 |
| CN102580996A (zh) * | 2012-01-16 | 2012-07-18 | 扬州工业职业技术学院 | 一种玉米秸秆制备土壤复合生物修复剂的制备方法及其在改良土壤土质中的应用 |
| CN103525748A (zh) * | 2013-10-31 | 2014-01-22 | 湖南泰谷生物科技股份有限公司 | 哈茨木霉厚垣孢子的生产方法 |
| CN104365592A (zh) * | 2013-08-16 | 2015-02-25 | 上海万力华生物科技有限公司 | 一种木霉菌可湿性粉剂及其制备方法 |
| CN105062897A (zh) * | 2015-08-14 | 2015-11-18 | 潍坊万胜生物农药有限公司 | 一株高产厚垣孢子的绿色木霉及其应用 |
| CN107254317A (zh) * | 2016-12-21 | 2017-10-17 | 扬州工业职业技术学院 | 一种秸秆的预处理方法以及包含经预处理后秸秆的修复剂 |
| CN108359631A (zh) * | 2018-05-25 | 2018-08-03 | 上海交通大学 | 一种木霉厚垣孢子的生产方法 |
| CN108575994A (zh) * | 2018-03-13 | 2018-09-28 | 上海交通大学 | 促生型木霉与芽孢杆菌复合可湿性粉剂的制备与应用 |
-
2018
- 2018-12-19 CN CN201811551665.6A patent/CN110591921B/zh active Active
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1771809A (zh) * | 2005-10-14 | 2006-05-17 | 田连生 | 玉米秸秆木霉生物杀菌剂的制备方法 |
| CN101044864A (zh) * | 2007-04-06 | 2007-10-03 | 田连生 | 利用玉米秸秆制备木霉菌可湿性粉剂的方法 |
| CN102580996A (zh) * | 2012-01-16 | 2012-07-18 | 扬州工业职业技术学院 | 一种玉米秸秆制备土壤复合生物修复剂的制备方法及其在改良土壤土质中的应用 |
| CN104365592A (zh) * | 2013-08-16 | 2015-02-25 | 上海万力华生物科技有限公司 | 一种木霉菌可湿性粉剂及其制备方法 |
| CN103525748A (zh) * | 2013-10-31 | 2014-01-22 | 湖南泰谷生物科技股份有限公司 | 哈茨木霉厚垣孢子的生产方法 |
| CN105062897A (zh) * | 2015-08-14 | 2015-11-18 | 潍坊万胜生物农药有限公司 | 一株高产厚垣孢子的绿色木霉及其应用 |
| CN107254317A (zh) * | 2016-12-21 | 2017-10-17 | 扬州工业职业技术学院 | 一种秸秆的预处理方法以及包含经预处理后秸秆的修复剂 |
| CN108575994A (zh) * | 2018-03-13 | 2018-09-28 | 上海交通大学 | 促生型木霉与芽孢杆菌复合可湿性粉剂的制备与应用 |
| CN108359631A (zh) * | 2018-05-25 | 2018-08-03 | 上海交通大学 | 一种木霉厚垣孢子的生产方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Statistical culture-based strategies to enhance chlamydospore production by Trichoderma harzianum SH2303 in liquid fermentation;Ya-Qian Li等;《J Zhejiang Univ Sci B》;20160831;第17卷(第8期);第619-627页 * |
| 利用玉米秸秆制备木霉菌可湿性粉剂;田连生等;《江苏农业科学》;20140630;第2卷(第6期);第116-118页 * |
| 哈茨木霉液体发酵产厚垣孢子条件的优化;粟静等;《山西农业科学》;20140228;第42卷(第2期);第169-173页 * |
| 木霉对多菌灵的生物降解特性研究;田连生等;《土壤学报》;20091130;第46卷(第6期);第1127-1131页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110591921A (zh) | 2019-12-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108949614B (zh) | 一种贝莱斯芽孢杆菌的微生物菌剂 | |
| CN102204570B (zh) | 链格孢菌代谢产物在防治黄瓜立枯病菌中的应用 | |
| CN102217656B (zh) | 链格孢菌代谢产物在防治番茄灰霉病菌中的应用 | |
| US20190159462A1 (en) | Serratia marcescens biocontrol strain efficiently inhibiting aflatoxins production by aspergillus flavus and application thereof | |
| CN107109343A (zh) | 木霉属组合物和使用方法 | |
| CN102027998A (zh) | 芽孢杆菌芽胞和木霉菌厚垣孢子复合制剂、其制备方法及应用 | |
| CN102191184B (zh) | 一株生防内生真菌-链格孢菌 | |
| CN102204571B (zh) | 链格孢菌代谢产物在防治西瓜枯萎病菌中的应用 | |
| CN110591921B (zh) | 一种木霉菌液体发酵的厚垣孢子及其制备方法 | |
| CN110093283B (zh) | 球孢白僵菌菌株及其培养方法 | |
| US11033032B2 (en) | Leclercia adecarboxylata biocontrol strain efficiently inhibiting production of aflatoxins by Aspergillus flavus and application thereof | |
| CN103436465B (zh) | 一种粪产碱菌株 | |
| US20140057336A1 (en) | Biocontrol formulation containing streptomyces spp., method for preparing the formulation and relevant use | |
| CN110894469A (zh) | 一株对橙带蓝尺蛾幼虫具有高致病力的金龟子绿僵菌菌株及其应用 | |
| CN109266560A (zh) | 一种含有杂草的链格孢菌培养基 | |
| CN102154155A (zh) | 防治植物真菌病害的短短芽孢杆菌及生物农药的制备方法 | |
| CN102204572B (zh) | 稻黑孢菌46代谢产物在防治菜豆炭疽病菌中的应用 | |
| CN114107070A (zh) | 一种印度梨形孢菌剂及其制备方法 | |
| CN109439555B (zh) | 一株有效吸附氯氰菊酯的酿酒酵母 | |
| CN102210329B (zh) | 局限曲霉28代谢产物在防治黄瓜立枯病菌中的应用 | |
| CN103222479A (zh) | 盐屋链霉菌代谢产物在防治菜豆炭疽病菌中的应用 | |
| CN102210331B (zh) | 稻黑孢菌46代谢产物在防治黄瓜立枯病菌中的应用 | |
| Aliyu et al. | Biomass production and field trial of entomopathogenic fungi Metarhizium anisopliae (Metschn.) against some insect pest of agricultural importance | |
| Ahmad et al. | Growth requirements of pleurotus ostreatus and antagonistic potential against Rhizoctonia solani | |
| CN106167766A (zh) | 高产黄曲霉毒素b1的黄曲霉菌cs05及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |