CN113229294B - 一种基于哈茨木霉菌m-17厚垣孢子的可湿性粉剂组合物、制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于哈茨木霉菌M‑17厚垣孢子的可湿性粉剂组合物、制备方法及应用，包括厚垣孢子粉，载体、润湿剂、分散剂、紫外保护剂，所述厚垣孢子粉为哈茨木霉M‑17菌种经扩大培养后得到；所述哈茨木霉M‑17菌种的真菌类型为哈茨木霉菌，哈茨木霉菌M‑17的保藏编号为：CCTCC NO：2018538，由宁夏农林科学院植物保护研究所提供，发明含有的M‑17的生物菌剂对马铃薯土传病害病原菌有抑制作用，减少了土壤中有害真菌，并且能促进根系发达，吸收土壤营养能力增强，提高马铃薯的抗逆性，起到促生作用，地上生物量积累增多，产量增加明显。

Description

一种基于哈茨木霉菌M-17厚垣孢子的可湿性粉剂组合物、制 备方法及应用
技术领域
本发明涉及农业用木霉制剂技术领域。具体地说，是涉及一种基于哈茨木霉菌M-17厚垣孢子的可湿性粉剂组合物、制备方法及应用。
背景技术
化学肥料和农药是保障国家粮食安全和主要农产品有效供给不可替代的投入品，2015年我国化肥总用量超过6000万t，农药总用量超过180万t，耕地面积占世界的7％投入了超过世界总量33％的化肥农药，因此，随着农业的不断发展，围绕解决农药过量施用带来的生态环境污染、耕地质量下降、生物多样性破坏、农产品质量安全及生产成本持续升高等问题已成为农业工作者的关注重点，寻找新的方法来代替传统化肥农药迫在眉睫。近几年来，生物防治作为一种环境友好型的病虫害防治技术逐渐走进公众的视野，生物农药副作用小、对人无害是目前化学农药减量和替代的主要方式之一，而研制出防治效果良好的生防产品则是加快化学农药替代化进程的前提，日益成为全球农药发展的一种趋势。
木霉(Trichodermaspp.)属子囊菌门(Ascomycota)，粪壳菌纲(Sordariomycetes)，肉座菌目(Hypocreales)，肉座菌科(Hypocreaceaes)真菌，是目前国际上应用非常普遍的生防真菌之一，主要用于防治各类植物的土传病害，以及部分叶部和穗部病害，特别是对丝核菌(Rhizoctoniaspp.)、镰刀菌(Fusariumspp.)、腐霉菌(Pythiumspp.)、疫霉菌(Phytophthoraspp.)等18个属29种病原真菌表现出拮抗活性。
生产上常用的木霉制剂多为它的孢子制剂，是一种利用孢子于营养基质及固体基质填充混合固定而支撑的颗粒状制剂。目前已成功研制出了50多种以分生孢子或分生孢子和菌丝为有效成分的木霉制剂。而国际上已有60多个国家使用100多种含有木霉菌成分的生物制剂产品，生防菌的活菌数、制剂加工和贮存条件以及田间环境因素等对农用微生物杀菌剂的防效均有很大影响，如何保持木霉制剂的活性和稳定的田间防效是目前木霉应用所面临的最大问题，然而，以分生孢子为主效成分的木霉制剂，由于分生孢子的活力受环境因素影响较大，分生孢子的抗逆性弱，抗土壤抑菌作用弱等不足，造成木霉制剂货架期短、田间防效不稳。厚垣孢子是木霉菌在逆境条件下产生的一种繁殖体，与分生孢子相比，其体积大、细胞壁厚、抗逆性强、存活期长、易加工贮存。该类孢子在抗逆及对土壤抑菌作用的抵抗力方面均优于分生孢子，相同的保存条件下厚垣孢子货架期明显长于分生孢子，(Lewisetal.，1983；Papavizasetal.，1985)等还表明木霉菌厚垣孢子制剂比分生孢子制剂更能抵抗环境压力，对土壤抑菌作用的敏感性较低，因此是一种更有潜力的制剂。
常见具有生防作用的木霉属真菌主要有哈茨木霉菌(Trichodermaharzianum)、绿色木霉(Trichodermaviride)、深绿木霉(Trichodermaatroviride)、钩状木霉(Trichodermahamatum)、康氏木霉
Figure BDA0002924632340000021
等，其中哈茨木霉菌M-17是目前商业化最多的木霉属菌株之一，制剂类型多为可湿性粉剂、颗粒剂、微胶囊剂、油悬浮剂，而我国目前现有的农用微生物杀菌剂剂型种类较为单一，生防菌的活菌数、制剂加工和贮存条件以及田间环境因素等对农用微生物杀菌剂的防效均有很大影响。
如前所述己经商品化的木霉制剂大多为分生抱子制剂。众所周知，厚垣抱子抗逆性强、货架期长、防效高，但由于诱导木霉菌大量形成厚垣孢子十分困难，加之木霉厚垣孢子发酵技术难度较大，因此，国内外商品化的木霉菌厚垣孢子制剂很少。本研究以项目组前期已经分离的哈茨木霉菌M-17为试验材料，进行以M-17厚垣孢子为有效成分的木霉可湿性粉剂的研制，通过各种助剂与厚垣孢子的生物相容性和可湿性粉剂质量指标的测定，确定了木霉厚垣孢子可湿性粉剂的组成，以期进一步稳定和提高木霉制剂的田间防效，为更好地利用木霉这一微生物资源提供新的技术支撑，为木霉的应用提供新的方法和途径。
发明内容
本发明的目的在于克服上述传统技术的不足之处，一种基于哈茨木霉菌M-17厚垣孢子的可湿性粉剂组合物、制备方法及应用。
本发明的目的是通过以下技术措施来达到的：
一种基于哈茨木霉菌M-17厚垣孢子的可湿性粉剂组合物，包括厚垣孢子粉，载体、润湿剂、分散剂、紫外保护剂，所述厚垣孢子粉为哈茨木霉M-17菌种经扩大培养后得到；
所述哈茨木霉M-17菌种的真菌类型为哈茨木霉菌，哈茨木霉菌M-17的保藏编号为：CCTCC NO：2018538，由宁夏农林科学院植物保护研究所提供。
作为上述技术方案的一种改进：一种基于哈茨木霉菌M-17厚垣孢子的可湿性粉剂组合物，按重量份计：厚垣孢子粉15-25份，凹凸棒、膨润土、硅藻土、活性炭中的一种或者两种以上的混合物65-75份，湿润剂是十二烷基硫酸钠2-6份，分散剂是羧甲基纤维素钠5-8份，紫外保护剂是维生素C1-3份；
扩大培养用培养基A2，所述培养基A2包括马铃薯葡萄糖琼脂培养基A21、厚垣孢子种子液培养基A22、土豆粉培养基A23和厚垣孢子培养基A24；
所述马铃薯葡萄糖琼脂培养基A21，按重量份计，包括马铃薯200份、葡萄糖20份、琼脂12份、蒸馏水1000份；
所述厚垣孢子种子液培养基A22包括玉米粉25-30份，硫酸链霉素0.1-0.3份，蒸馏水800-1200份；
所述土豆粉培养基A23包括土豆粉1-4份，葡萄糖0.3-0.6份，酵母粉0.15-0.45份，硫酸镁0.01-0.04份，蒸馏水900-1200份；
所述厚垣孢子培养基A24包括甘草50-59份、马铃薯全粉20-29份、玉米粉20-29份。
作为上述技术方案的一种改进：一种基于哈茨木霉菌M-17厚垣孢子的可湿性粉剂组合物，按重量份计：厚垣孢子粉20份，凹凸棒、膨润土、硅藻土、活性炭中的一种或者两种以上的混合物68份，湿润剂是十二烷基硫酸钠4份，分散剂是羧甲基纤维素钠7份，紫外保护剂是维生素C1份。
作为上述技术方案的一种改进：基于哈茨木霉菌M-17厚垣孢子的可湿性粉剂组合物的制备方法，包括以下步骤，
B1：哈茨木霉M-17菌种的制备和保存；
B2：哈茨木霉M-17菌种繁殖得到厚垣孢子粉；
B3：厚垣孢子粉、载体、润湿剂、分散剂、紫外保护剂的混合制得可湿性粉剂组合物。
作为上述技术方案的一种改进：所述厚垣孢子粉的制备方法包括以下步骤：
C1：哈茨木霉M-17菌种的活化：将哈茨木霉M-17菌种接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基A21上，28℃恒温培养7天，用无菌水冲洗哈茨木霉M-17菌种平板得到木霉孢子液，充分混匀后用血球计数板计数，并调整其浓度为1×106cfu/mL,得到活化好的木霉菌E1；
C2：再将活化后的木霉菌E1接入厚垣孢子种子液培养基A22上，按重量份计，所述厚垣孢子种子液培养基A22包括玉米粉25-30份，硫酸链霉素0.1-0.3份，蒸馏水800-1200份，放入温度为28℃、转速170r/min摇床培养箱培养7d，得到哈茨木霉M-17的种子菌F1；
C3：将哈茨木霉M-17的种子菌F1接入发酵罐中发酵，以15％-20％接种量接种到土豆粉培养基A23中，培养时间不超过48h，温度为28℃，溶氧量为0～99％，搅拌转速为100～150转/分钟，通气量为2～3L/min，发酵罐中的培养基为土豆粉培养基A23，按重量份计，所述土豆粉培养基A23包括土豆粉1-4份，葡萄糖0.3-0.6份，酵母粉0.15-0.45份，硫酸镁0.01-0.04份，蒸馏水900-1200份；结果得到发酵罐菌液G1；
C4：选择第46-48h的发酵罐菌液G1，以13％-15％接种量接种到厚垣孢子培养基A24中，按重量份计，所述厚垣孢子培养基A24包括甘草50-59份、马铃薯全粉20-29份、玉米粉20-29份，培养温度为28℃、湿度85％、调整PH、控制光照，培养7d，将厚垣孢子培养基A24的厚垣孢子在50℃烘箱烘干3h，烘干后采用粉碎机进行粉碎，得到厚垣孢子粉。
作为上述技术方案的一种改进：在步骤C4中，光照为红光和黄光，光照强度为100lx-400lx。
作为上述技术方案的一种改进：在步骤C4中，所述初始pH为6-8。
作为上述技术方案的一种改进：在步骤C4中，在培养第36h-48h期间，用0.5～5％的氢氧化钠溶液将PH调整到6-8。
作为上述技术方案的一种改进：可湿性粉剂组合物用于防治马铃薯土传病害。
由于采用了上述技术方案，与现有技术相比，本发明的优点是：
效果一：组合物种的M-17分离自沙漠，沙漠土壤缺水干旱、含盐和碱重，本发明实验地点是在宁夏，种植条件恶劣，可以说明本发明的组合物让马铃薯能够适应缺水、含盐和碱性的土壤环境，发明含有的M-17的生物菌剂对马铃薯土传病害病原菌有抑制作用，减少了土壤中有害真菌，并且能促进根系发达，吸收土壤营养能力增强，提高马铃薯的抗逆性，起到促生作用，地上生物量积累增多，产量增加明显。
效果二：使用本发明对马铃薯的产量影响较大，经可湿性粉剂组合物处理的马铃薯产量最大为3206.79kg/亩，其余的处理产量分别为2889.22kg/亩、2558.09kg/亩3144.53kg/亩，均小于本发明的产量。
效果三，本发明可以有效防治马铃薯土传病害，减少土传病害病菌对马铃薯幼芽的毒害，可以促进马铃薯发芽，对马铃薯病害有防控作用，减少了断苗；
效果四：施用本发明的生物菌剂对马铃薯品种营养成分产生影响，优化马铃薯淀粉、蛋白质、多糖的比例，营养成分更好；
效果五：脲酶、磷酸酶和过氧化氢酶广泛存在于土壤中，与土壤养分和作物生长相关，在农田中施加哈茨木霉菌M-17厚垣孢子的可湿性粉剂组合物会显著提高土壤中脲酶和磷酸酶活性(P<0.05)，利于作物生长；
效果六：病害调查结果表明，本发明干腐病防治效果明显，防效为79.14％。下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。
附图说明
图1是本发明可湿粉剂成品的示意图；
图2是本发明的应用；
图3为M-17是实施例2的条件下制备厚垣孢子粉菌体7天的生长情况；
图4为多因素统计表中前期不经过黑暗处理制备厚垣孢子粉菌体7天的生长情况；
图5马铃薯株高的影响；
图6是6月12日马铃薯生物量；
图7是6月29日马铃薯生物量；
图8是8月1日马铃薯生物量；
图9是8月20日马铃薯生物量；
图10分散剂CMC含量对哈茨木霉M-17厚垣孢子可湿性粉剂悬浮率的影响；
图11为各载体与哈茨木霉M-17的相容性。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。
实施例1：
基于哈茨木霉菌M-17厚垣孢子的可湿性粉剂组合物，菌种选用哈茨木霉菌M-17的保藏编号为：CCTCC NO：2018538，由宁夏农林科学院植物保护研究所提供，厚垣孢子粉为哈茨木霉M-17菌种经扩大培养后得到，按重量份计，本实施例的组合物厚垣孢子粉可以是15-25份，凹凸棒可以是65-75份，并且载体可以是凹凸棒、膨润土、硅藻土、活性炭中的一种或者两种以上的混合物，湿润剂是十二烷基硫酸钠可以是2-6份，分散剂是羧甲基纤维素钠可以是5-8份，紫外保护剂是维生素C可以是1-3份。
其中厚垣孢子粉的制备方法如下：
C1：哈茨木霉M-17菌种的活化：将哈茨木霉M-17菌种接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基A21上，按重量份计，马铃薯葡萄糖琼脂培养基A21包括马铃薯200份、葡萄糖20份、琼脂12份、蒸馏水1000份，在28℃恒温培养7天，用无菌水冲洗哈茨木霉M-17菌种平板得到木霉孢子液，充分混匀后用血球计数板计数，并调整其浓度为1×106cfu/mL,得到活化好的木霉菌E1；
C2：再将活化后的木霉菌E1接入厚垣孢子种子液培养基A22上，按重量份计，所述厚垣孢子种子液培养基A22，用到的玉米粉可以是25-30份，硫酸链霉素可以是0.1-0.3份，蒸馏水可以是800-1200份，放入温度为28℃、转速170r/min摇床培养箱培养7d，得到哈茨木霉M-17的种子菌F1；
C3：将哈茨木霉M-17的种子菌F1接入发酵罐中发酵，以15％-20％接种量接种到土豆粉培养基A23中，培养时间不超过48h，一般是46-48h，温度为28℃，溶氧量为0～99％，搅拌转速为100～150转/分钟，通气量为2～3L/min，发酵罐中的培养基为土豆粉培养基A23，按重量份计，所述土豆粉培养基A23的土豆粉可以是1-4份，葡萄糖可以是0.3-0.6份，酵母粉可以是0.15-0.45份，硫酸镁可以是0.01-0.04份，蒸馏水可以是900-1200份；结果得到发酵罐菌液G1；
C4：选择第48h的发酵罐菌液G1，以14％接种量接种到厚垣孢子培养基A24中，一般接种量在15％-20％之间，按重量份计，所述厚垣孢子培养基A24中的甘草可以是50-59份、马铃薯全粉可以是20-29份、玉米粉可以是20-29份，培养温度为28℃、湿度85％、用0.5％的氢氧化钠溶液调整PH，实际中使用到的可以是0.5％-5％的氢氧化钠溶液，也可以用氨水，还可以给体系补充氮源、控制光照强度、光照时间和光色，具体的数值可以参见表5不同光照对结果的影响，培养7d，将厚垣孢子培养基A24的厚垣孢子在50℃烘箱烘干3h，烘干后采用粉碎机进行粉碎，得到厚垣孢子粉。
最后将厚垣孢子粉、载体以及各种助剂等按照上述比例混合均匀，并进行研磨粉碎得到可湿性粉剂；按重量份计，加入40份的水和5份的粘结剂进行捏合造粒，加水40-50份，粘结剂的用量范围在2-5份都可以，制成水分散粒剂的初级产物，最后再对初级产物进行挤压造粒和干燥，筛分后得到颗粒剂成品。
实施例2
本实施例制得的产品综合性能最优，并且说明书后续部分用于证明产品效果的实验也是本实施例条件下制得的。
基于哈茨木霉菌M-17厚垣孢子的可湿性粉剂组合物，菌种选用哈茨木霉菌M-17的保藏编号为：CCTCCNO：2018538，由宁夏农林科学院植物保护研究所提供，厚垣孢子粉为哈茨木霉M-17菌种经扩大培养后得到，本实施例中组合物包括，厚垣孢子粉20份，凹凸棒68份，湿润剂是十二烷基硫酸钠4份，分散剂是羧甲基纤维素钠7份，紫外保护剂是维生素C1份。
厚垣孢子粉的制备方法如下：
C1：哈茨木霉M-17菌种的活化：将哈茨木霉M-17菌种接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基A21上，按重量份计，马铃薯葡萄糖琼脂培养基A21包括马铃薯200份、葡萄糖20份、琼脂12份、蒸馏水1000份，在28℃恒温培养7天，用无菌水冲洗哈茨木霉M-17菌种平板得到木霉孢子液，充分混匀后用血球计数板计数，并调整其浓度为1×106cfu/mL,得到活化好的木霉菌E1；
C2：再将活化后的木霉菌E1接入厚垣孢子种子液培养基A22上，按重量份计，所述厚垣孢子种子液培养基A22包括玉米粉28份，硫酸链霉素0.2份，蒸馏水1000份，放入温度为28℃、转速170r/min摇床培养箱培养7d，得到哈茨木霉M-17的种子菌F1；
C3：将哈茨木霉M-17的种子菌F1接入发酵罐中发酵，以15％-20％接种量接种到土豆粉培养基A23中，培养时间48h，温度为28℃，溶氧量为20～40％，搅拌转速为100～150转/分钟，通气量为2～3L/min，发酵罐中的培养基为土豆粉培养基A23，按重量份计，所述土豆粉培养基A23包括土豆粉2份，葡萄糖0.5份，酵母粉0.25份，硫酸镁0.02份，蒸馏水1000份；结果得到发酵罐菌液G1；
C4：选择第48h的发酵罐菌液G1，以14％接种量接种到厚垣孢子培养基A24中，按重量份计，所述厚垣孢子培养基A24包括甘草56份、马铃薯全粉22份、玉米粉22份，培养温度为28℃、湿度85％、用0.5％的氢氧化钠溶液调整PH值起始为7，第3天再调节到7、先黑暗处理9小时，再用红光强度为300lx的光处理，培养7d，将厚垣孢子培养基A24的厚垣孢子在50℃烘箱烘干3h，烘干后采用粉碎机进行粉碎，得到厚垣孢子粉。
最后将厚垣孢子粉、载体以及各种助剂等按照上述比例混合均匀，并进行研磨粉碎得到可湿性粉剂；按重量份计，加入40份的水和5份的粘结剂进行捏合造粒制成水分散粒剂的初级产物，最后再对初级产物进行挤压造粒和干燥，筛分后得到颗粒剂成品。
最优选的实验条件和助剂的确定，结果见表5，选择过程如下，以下提到的CK为空白对照组，仅限在相应的实验中的对照组，各处的字母虽然一致，但并不表示含义一样。
载体的选择
载体对厚垣孢子萌发的影响：将各载体配制成100、500、1000μg/mL3个浓度，并在3种浓度中分别加入等量的厚垣孢子液(浓度为1×108个/ml)，混合均匀后28℃摇床培养12h，之后采用显微观察法测定孢子的萌发数量，并计算萌发率。
载体对厚垣孢子吸附率的测定方法：准确称取不同载体各5g，分别放入50mL锥形瓶中备用，滴加M-17木霉厚垣孢子浆，用玻璃棒搅拌至载体开始聚成一团，称量吸附悬液后载体质量，并计算载体对厚垣孢子浆的吸附率，每个载体3次重复
q＝(mf-mo)/mo
其中q为载体吸附率(g/g)，mf为吸附厚垣孢子浆后载体的质量(g)，mo为吸附载体前吸附材料的质量(g)。
厚垣孢子粉的制备方法：将载体与厚垣孢子浆按1:7比例进行混合，在45℃烘箱烘干3h，烘干后采用粉碎机进行粉碎，得到厚垣孢子粉。
将厚垣孢子粉用无菌水稀释，用单层擦镜纸过滤，制成浓度较高的哈茨木霉M-17厚垣孢子液，用显微法测定每mL中哈茨木霉M-17厚垣孢子液中的孢子数并记录，将相同体积的M-17厚垣孢子液加入到定量载体的锥形瓶中，充分混匀，以120r/min震荡30min，取出静置，测定每mL上清液中的厚垣孢子数，计算出单位质量载体吸附的孢子数，得出载体吸附率。
载体对哈茨木霉M-17厚垣孢子相容性的测定方法：采用菌落计数法来考察载体对M-17厚垣孢子的相容性。先制备PDA培养基，然后向培养基中加入50mg/ml的载体，摇匀后放入高压灭菌锅中，于121℃，灭菌20min。然后取调制为104的M-17厚垣孢子液1ml于培养皿中，与15mL尚未冷却的含有载体的PDA培养基倒于平板中，摇匀，冷却后放入25℃的恒温培养箱中，待菌落长出时，记录菌落的数量，每个载体3次重复。
由表1可知，不同浓度的7种载体对木霉厚垣孢子萌发均有一定的影响，且随着载体浓度增加，孢子的萌发率呈现降低的趋势。其中凹凸棒浓度为100μg/mL、500μg/mL对孢子萌发影响较小，其次是活性炭，两载体之间无显著差异，而载体玉米粉对孢子萌发影响最大，孢子萌发率仅为51％～56％，且与其他载体之间存在显著差异。
载体对厚垣孢子浆吸附率的测定结果：
厚垣孢子的载体是可湿性粉剂中占最大比例的一部分，所以载体的选择的至关重要，载体对厚垣孢子浆的吸附率表示载体吸附有效成分的能力，吸附率越大则表明制剂性能越好。载体对厚垣孢子的吸附性，以两个指标表征，一个是在同体积、同质量条件下，对厚垣孢子的吸附性，结果如表2所示；另一指标为载体与哈茨木霉M-17厚垣孢子的相容性，结果如图7所示。
表1不同载体同体积、同质量的吸附厚垣孢子数
载体种类 同体积吸附孢子数×104个/mL 每g载体吸附孢子数×104个/g
玉米粉 2.1d 5.0g
木屑 2.8d 17.9f
凹凸棒 31.3a 61.2b
β-环糊精 24.0b 47.2c
膨润土 14.0c 26.5e
硅藻土 12.3c 36.9d
活性炭 30.2a 75.3a
由表1可知，在同体积下凹凸棒吸附能力最强，为31.3×104个/mL，其次为活性炭，玉米粉和木屑对厚垣孢子浆的吸附率最低。在同重量下活性炭吸附能力最强，为75.3×104个/g。图11中各载体与哈茨木霉M-17的相容性结果来看，玉米粉和凹凸棒的相容性最好。综合考虑载体对木霉厚垣孢子萌发率和相容性的影响及载体对厚垣孢子浆的吸附率，确定凹凸棒为木霉厚垣孢子可湿性粉剂最优选的载体，其次载体可以是凹凸棒、膨润土、硅藻土、活性炭中的一种或者两种以上的混合物。
润湿剂的选择
润湿剂对哈茨木霉M-17厚垣孢子萌发影响：按照载体筛选方法进行。
润湿剂流点的测定方法：准确称取厚垣孢子粉1g于50ml的烧杯中，用移液器将配制成浓度为4％的润湿剂滴加在烧杯中，用玻璃棒将厚垣孢子粉搅拌至糊状，直到液滴能滴下为止，记录使用润湿剂的体积，并计算单位重量有效成分所需溶液的体积，即润湿剂的流点，每处理重复3次。
润湿剂对厚垣孢子的相容性测定方法：将哈茨木霉M-17厚垣孢子液稀释成106个/ml，将4％各润湿剂与其同体积混合，取适量放入皿中，采用琼脂玻片法于12h、24h各测定一次厚垣孢子的萌发率，置于25℃的恒温箱中培养，每个处理重复3次。
润湿剂含量测定方法：根据润湿剂对厚垣孢子萌发率的影响的结果，选择合适的润湿剂种类，进行润湿剂含量的测定，润湿剂含量的测定方式以润湿时间的长短来判定(GB/T 5451-2001)，润湿时间越短，润湿效果越好。润湿剂含量分别为1％，2％，3％，4％，5％，厚垣孢子粉的添加量为20％，然后以载体补齐总量，测定不同比例润湿剂的润湿时间，测定其润湿时间，每个处理重复3次。
由表5可知，不同润湿剂对木霉厚垣孢子萌发率的影响不同。与对照相比，各种润湿剂对木霉厚垣孢子萌发都存在抑制作用，且随浓度的升高，孢子的萌发率降低，差异性显著，其中十二烷基硫酸钠不同浓度对厚垣孢子的萌发率最高，浓度为100μg/mL时萌发率为81.2％，与吐温-40、十二烷基三甲基溴化铵和甘油存在显著差异。
润湿剂流点的高低直接影响可湿性粉剂的质量，4种润湿剂的流点测定结果表明(表5)，十二烷基硫酸钠的流点最低，为3.14g/mL，与十二烷基苯磺酸钠和吐温-20存在显著差异，因湿润剂的高低影响最终粉剂的质量，综合考虑润湿剂的萌发率、生物相容性和流点的高低，选择十二烷基硫酸钠作为湿润剂。润湿剂含量对润湿时间的影响。
表2润湿剂含量的确定
湿润剂含量/％ 湿润时间/s
1％ 59.58a
2％ 54.88b
3％ 49.99c
4％ 41.71d
5％ 48.09c
润湿时间的长短直接影响最终产品的质量，润湿时间越短，产品的润湿效果越好，由表2可知，十二烷基硫酸钠含4％的时候是最优的。如果有特殊需求可以选择表中相应的浓度。
分散剂的选择
分散剂对哈茨木霉M-17厚垣孢子萌发的影响：按照载体筛选方法进行。
分散剂种类的选择：按厚垣孢子粉20％、分散剂10％、以凹凸棒补足100％的配比制成可湿性粉剂，测定由不同分散剂组成的可湿性粉剂的润湿时间，计算样品的悬浮率。
分散剂与哈茨木霉M-17厚垣孢子的相容性：将羧甲基纤维素钠，PVP，聚乙二醇三种分散剂分别配成5％的溶液，培养条件与测定方法同1.2.3，考察分散剂与哈茨木霉M-17厚垣孢子的相容性。
分散剂含量的确定：筛选出相容性较好的分散剂后，继续考察了分散剂的含量。将分散剂分别按照1％、3％、5％、7％、9％的比例加入20％的孢子粉，剩余部分以凹凸棒补齐，根据文献[25]的方法测定由不同分散剂组成的可湿性粉剂的润湿时间，计算各比例分散剂的悬浮率(GB/T 14825-2006)，观察实验结果是否和分散剂对厚垣孢子的生物相容性结果一致，确定分散剂最佳用量。
紫外保护剂的选择
紫外保护剂对哈茨木霉M-17厚垣孢子萌发的影响：按照载体筛选方法进行。
紫外线照射的情况下，保护剂对木霉厚垣孢子萌发的保护作用：分别将1％的紫外保护剂与用无菌水稀释到1×108哈茨木霉M-17厚垣孢子液同体积均匀混合，以厚垣孢子悬液与无菌水等体积混合液为对照1。
吸取5ml不同紫外保护剂处理的哈茨木霉M-17厚垣孢子放于直径为9cm的培养皿中，打开培养皿盖，与对照放入到无菌的20W紫外灯(光强120l x)下30cm，处照射3min后，以厚垣孢子悬液与无菌水等体积混合液未进行紫外照射的处理设为对照2。
将不同处理的厚垣孢子液稀释后，吸取0.1ml涂布于PDA平板上，盖上培养皿盖培养48h，记录菌落数。
助剂成分比例优化
以1g为基数，其余用载体补足100％，分别以孢子粉、湿润剂、分散剂、保护剂为实验因素，选择不同因素助剂按常用质量分数用量设计3个水平，以悬浮率为测试指标，进行正交设计。
哈茨木霉M-17可湿性粉剂质量检测
根据GB/T5451-2001、GB/T1482-2006、GB/T25864-2010、GB/T16150-1995要求对哈茨木霉M-17菌株厚垣孢子的悬浮率、润湿时间、样品细度、pH进行检测。采用稀释涂平板方法进行可湿性粉剂中活孢子数的测定。
木霉厚垣孢子可湿性粉剂的润湿时间和悬浮率测定
润湿效果和悬浮率是评价分散剂好坏的重要标准。以十二烷基硫酸钠作为润湿剂，比较不同分散剂处理下样品的润湿时间和悬浮率。结果表明，以羧甲基纤维素钠(CMC)为分散剂时，厚垣孢子可湿性粉剂的润湿时间较短、悬浮率最高，因此，结合不同分散剂对厚垣孢子萌发率及悬浮率和湿润时间的影响，确定CMC作为该可湿性粉剂的分散剂。
表3木霉厚垣孢子可湿性粉剂的润湿时间和悬浮率
Figure BDA0002924632340000151
如图10所示，分散剂CMC含量对哈茨木霉M-17厚垣孢子可湿性粉剂悬浮率的影响
测定分散剂CMC含量为1％、3％、5％、7％、9％时，木霉厚垣孢子可湿性粉剂的悬浮率，结果由图10可知，不同含量的羧甲基纤维素纳CMC对对哈茨木霉M-17厚垣孢子可湿性粉剂悬浮率不同，CMC含量为7％时悬浮率最高，为72.84％，确定可湿性粉剂的组成中分散剂CMC的最优选的含量为7％。
紫外保护剂的筛选
由于木霉菌施用到土壤中，阳光中的紫外线直接对活菌体构成了威胁。因此有必要在可湿性粉剂中加入UV保护剂。UV保护剂能将阳光中的大部分紫外辐射吸收掉，将吸收的能量转化为无害的热能散发到空气中，从而保护制剂达到所需要的效果。不同保护剂对木霉孢子的保护程度是不同的，具体结果如表，不同紫外保护剂对木霉厚垣孢子的萌发及菌落生长速率的影响见表5，其中维生素C对厚垣孢子的萌发抑制率相对较小，糊精和黄原胶对厚垣孢子萌发抑制率较大；综合考虑木霉厚垣孢子萌发率及菌落生长速度，初选维生素C作为紫外保护剂进行下一步的筛选。
Vc对木霉厚垣孢子的保护作用
表4 Vc对木霉厚垣孢子的保护作用
Figure BDA0002924632340000161
表4可以看出，与对照1和对照2相比，不同浓度维生素C均显著抑制木霉分生孢子萌发，其中1％维生素C抑制作用最小，对厚垣孢子的保护作用最大，选择维生素C的最优选的浓度为1％。
木霉厚垣孢子可湿性粉剂质量检测
通过载体、润湿剂、分散剂、紫外保护剂等因素的筛选，最终确定哈茨木霉厚垣孢子可湿性粉剂的组成为：20％的厚垣孢子粉，67％的凹凸棒作为载体，4％的十二烷基硫酸钠(SDS)作为润湿剂，7％的羧甲基纤维素钠作为分散剂，1％维生素C(Vc)作为紫外保护剂。在该组成下，该厚垣孢子可湿性粉剂的活孢子数为3.1×109cfu/g，润湿时间为56.5s，总悬浮率为79％，孢子悬浮率为82.27％，pH为6.79，含水量为2.26％，98％过200目标准筛，符合国家可湿性粉剂及生物制剂的相关标准。
表5多因素统计表
Figure BDA0002924632340000171
Figure BDA0002924632340000181
说明：表5中的CK虽然代号相同，但是不表示同一种实验条件，分别表示的各个实验中的对照组，也和后续说明书中的CK没有关系。
将可湿性粉剂组合物应用于防治马铃薯土传病害，其有益效果验证如下：
本发明的产品对马铃薯生产的影响
处理1：施用市售生物菌剂(沃丰康)；
处理2：施用哈茨木霉菌M-17厚垣孢子的可湿性粉剂组合物；采用实施例2条件下的组合物实验；
处理3：化学药剂拌种(咯菌腈)；
处理4：CK空白对照，不使用拌种剂，其他条件和处理1、2和3一致。1、生物菌剂马铃薯出苗率影响
表6不同处理对马铃薯出苗影响
处理 6月6日
1 90.2b
2 93.2a
3 89.3c
CK 86.0d
由表6可以看出，不同处理对马铃薯出苗率影响较大，6月6日测定，出苗率最好的为处理2，出苗率达93.2％，对照CK最低为86％。说明哈茨木霉菌M-17厚垣孢子的可湿性粉剂组合物可以有效防治马铃薯土传病害，减少土传病害病菌对马铃薯幼芽的毒害，可以促进马铃薯发芽，对马铃薯病害有防控作用，减少了断苗。
2、对马铃薯株高的影响
从图5可以看出，不同处理对马铃薯株高具有较大的影响，基本表现为正相关关系，在6月29日测定的株高中处理CK平均株高最小，为50.2cm，处理2最大，为52.2cm。从整个生育期来看，处理2生物菌剂明显对马铃薯植株有促生作用。
表7不同处理对马铃薯株高影响
Figure BDA0002924632340000201
3、对马铃薯生物量的影响
马铃薯生物量是反应其对环境因素适应的一个综合指标，由地上部分和地下根系部分构成，图6～图9是6月12日、6月29日、8月1日和8月20日不同处理马铃薯地上和地下根系部分生物量变化。
表8不同测定时间生物量变化
Figure BDA0002924632340000202
由图可以看出，不同生物菌剂处理对马铃薯地上和地下部分生物量具有较大的影响，在6月12日马铃薯现蕾期，不同处理对其地上部分生物量的影响不显著，但对马铃薯根系生物量的影响较大，处理1和处理2比对照根系明显发达，重量重。在6月29日所测得的结果表明，地下部分和现蕾期具有类似的规律，表现为处理1和处理2显著大于其他2个处理。
在图4和图5中，地上部和地下部生物量都表现为施用生物菌剂的3个处理与对照比差异显著，其中处理2，地上部和地下部生物量积累最为明显，说明自制含有M-17的生物菌剂能对马铃薯起到促生作用，对马铃薯土传病害病原菌有抑制作用，减少了土壤中有害无所谓，促进根系发达，吸收土壤营养能力增强，地上生物量积累也最多。
4、对马铃薯产量的影响
表9不同处理条件对马铃薯产量影响
Figure BDA0002924632340000211
由表9可见，不同生物菌剂对马铃薯的产量影响较大，自制生物生物菌剂处理产量最大为3206.79kg/亩，其次为处理1、3，对照CK产量最低为2558kg/亩。
5、不同生物菌剂处理马铃薯品质变化
表10为不同生物菌剂处理大西洋的品质指标，由表可以看出，不同处理对马铃薯淀粉、蛋白质、多糖的影响较大。处理2淀粉含量最大，为15.3g/100g，其次为处理1和处理3，两者之间没有显著性差异，淀粉含量最小为处理CK，仅为10.8g/100g，除处理1和处理3之间无显著性差异外，其余各处理间均具有显著性性差异(P＜0.05)，且具有统计学意义。蛋白质含量最高的为处理2，其次为处理1、处理3，处理2与对照差异性显著。多糖各处理均存在显著性差异，其多糖含量最大的为处理2，其次为处理3。可见，施用生物菌剂对马铃薯品种大西洋品质指标具有较大的影响。
表10不同处理马铃薯品质指标
处理 淀粉(g/100g) 蛋白质(g/100g) 多糖(g/100g)
1 11.7b 8.71b 0.44d
2 14.5a 9.53a 0.88a
3 11.8b 8.52bc 0.71b
CK 10.8c 8.28c 0.65c
6、对马铃薯土传病害病害的生防效果
表11不同生物菌剂对马铃薯土传病害防效
Figure BDA0002924632340000221
由表11可知，病害调查结果表明，处理2干腐病防治效果明显，防效为79.14％，其次为处理1，防效为78％，其他处理对干腐病都不具有防控作用。处理1对黑痣病防效明显，防效为67.82％，其他处理对黑痣病防效不明显。农田施加哈茨木霉菌M-17厚垣孢子的可湿性粉剂组合物对土壤酶活性的影响
表12生物菌剂对土壤酶活性影响
Figure BDA0002924632340000231
脲酶、磷酸酶和过氧化氢酶广泛存在于土壤中，与土壤养分和作物生长相关。由表12可知，与CK相比，在农田中施加哈茨木霉菌M-17厚垣孢子的可湿性粉剂组合物会显著提高土壤中脲酶和磷酸酶活性(P<0.05)，利于作物生长。与CK相比，在农田中施加哈茨木霉菌M-17厚垣孢子的可湿性粉剂组合物蔗糖酶和过氧化氢酶活性并没有显著变化。
农田施加哈茨木霉菌M-17厚垣孢子的可湿性粉剂组合物马铃薯根际土壤微生物数量的影响
表13 M-17生物菌剂处理对马铃薯根际土壤微生物数量的影响
Figure BDA0002924632340000232
Figure BDA0002924632340000241
由表13可知，不同生物菌剂处理对马铃薯根际土壤微生物数量发生不同程度变化，不同菌剂施入后(6月7日)，其中CK真菌数量最多，明显高于其他处理；不同处理的细菌数量和放线菌数量均高于CK，其中以处理1细菌数量最多，其次为处理2、处理3，分别比CK增加了52.0％、42.63％、23.60％，放线菌数量分别比CK增加41.96％、10.64％、7.62％；不同菌剂处理在马铃薯收获后的真菌数量测定结果显示(10月11日)，不同处理真菌数量与前期测定的数量变化不大，而CK的真菌数量了呈现了增加的趋势；细菌数量随不同菌剂施入时间的延长其数量均呈现减少的趋势，但仍明显高于CK，其中以处理2的细菌数量最多，比CK增加87.64％，处理1和处理3的细菌数量差异不大；不同菌剂处理的放线菌数量呈现增加的趋势，均显著高于CK，其中处理2放线菌数量最多，其次处理1、处理3，比CK分别增加了60.26％、22.10％、3.47％。表明不同菌剂施入后可以改善真菌、细菌、放线菌三大类群，减轻了连作效应。
除此以外，本发明的产品还可以用于防治其他种类的蔬菜土传病害，本发明仅仅详细列举了对马铃薯的影响，且对本发明的较佳实施方式进行了具体说明，但本发明创造并不限于此，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明精神的前提下还可作出种种的等同变型或替换，这些等同的变型或替换均包括在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (7)

1.一种基于哈茨木霉菌M-17厚垣孢子的可湿性粉剂组合物，其特征在于，按重量份计：厚垣孢子粉20份，凹凸棒68份，湿润剂是十二烷基硫酸钠4份，分散剂是羧甲基纤维素钠7份，紫外保护剂是维生素C1份；
所述可湿性粉剂组合物中的活孢子数为3.1×109cfu/g，润湿时间为56.5s，总悬浮率为79%，孢子悬浮率为82.27%，pH为6.79，含水量为2.26%。
2.根据权利要求1所述一种基于哈茨木霉菌M-17厚垣孢子的可湿性粉剂组合物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤，
B1：哈茨木霉M-17菌种的制备和保存；
B2：哈茨木霉M-17菌种繁殖得到厚垣孢子粉；
B3：厚垣孢子粉、载体、润湿剂、分散剂、紫外保护剂的混合制得可湿性粉剂组合物。
3.根据权利要求2所述的一种基于哈茨木霉菌M-17厚垣孢子的可湿性粉剂组合物的制备方法，其特征在于：所述厚垣孢子粉的制备方法包括以下步骤：
C1：哈茨木霉M-17菌种的活化：将哈茨木霉M-17菌种接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基A21上，28℃恒温培养7天，用无菌水冲洗哈茨木霉M-17菌种平板得到木霉孢子液，充分混匀后用血球计数板计数，并用无菌水稀释其浓度为1×106cfu／mL,得到活化好的木霉菌E1；
C2：再将活化后的木霉菌E1接入厚垣孢子种子液培养基A22上，按重量份计，所述厚垣孢子种子液培养基A22包括玉米粉25-30份，硫酸链霉素0.1-0.3份，蒸馏水800-1200份，放入温度为28℃、转速170r/min摇床培养箱培养7d，得到哈茨木霉M-17的种子菌F1；
C3：将哈茨木霉M-17的种子菌F1接入发酵罐中发酵，以15%-20%接种量接种到土豆粉培养基A23中，培养时间不超过48h，温度为28℃，溶氧量为0~99%，搅拌转速为100～150转/分钟，通气量为2～3L/min，发酵罐中的培养基为土豆粉培养基A23，按重量份计，所述土豆粉培养基A23包括土豆粉1-4份，葡萄糖0.3-0.6份，酵母粉0.15-0.45份，硫酸镁0.01-0.04份，蒸馏水900-1200份；结果得到发酵罐菌液G1；
C4：选择第46-48h的发酵罐菌液G1，以13%-15%接种量接种到厚垣孢子培养基A24中，按重量份计，所述厚垣孢子培养基A24包括甘草50-59份、马铃薯全粉20-29份、玉米粉20-29份，培养温度为28℃、湿度85%、调整pH、控制光照，培养7d，将厚垣孢子培养基A24的厚垣孢子在50℃烘箱烘干３h，烘干后采用粉碎机进行粉碎，得到厚垣孢子粉。
4.根据权利要求3所述的一种基于哈茨木霉菌M-17厚垣孢子的可湿性粉剂组合物的制备方法，其特征在于：在步骤C4中，光照为红光和黄光，光照强度为100lx-400lx。
5.根据权利要求3所述的一种基于哈茨木霉菌M-17厚垣孢子的可湿性粉剂组合物的制备方法，其特征在于：在步骤C4中，所述pH为6-8。
6.根据权利要求3所述的一种基于哈茨木霉菌M-17厚垣孢子的可湿性粉剂组合物的制备方法，其特征在于：在步骤C4中，在培养第36h-48h期间，用0.5~5%的氢氧化钠溶液将pH调整到6-8。
7.根据权利要求1所述的一种基于哈茨木霉菌M-17厚垣孢子的可湿性粉剂组合物的应用，其特征在于，可湿性粉剂组合物用于防治马铃薯土传病害。
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