CN110305799A - 一株哈茨木霉固体发酵及其产品在马铃薯镰刀菌根腐病中的应用 - Google Patents
一株哈茨木霉固体发酵及其产品在马铃薯镰刀菌根腐病中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种哈茨木霉固体发酵，其步骤为将哈茨木霉M‑17菌种接种到固体培养基中进行培养，该培养基配方由中药粉、马铃薯全粉、玉米粉、木屑、马铃薯皮组成，在28℃培养7～10d。利用该方法培养的哈茨木霉菌对木贼镰刀菌、接骨木镰刀菌、尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌、锐顶镰刀菌等马铃薯根腐病的致病菌有很好的抑制效果，可以应用于马铃薯根腐病的防治过程，从而减少和防治马铃薯根腐病的发生，提高马铃薯的产量和质量。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株哈茨木霉固体发酵及其产品在马铃薯镰刀菌根腐病中的应用。
背景技术
木霉菌是广泛存在于自然界中的一种微生物，木霉属于半知菌门，丝孢目，木霉属，常见的木霉有绿色木霉、康宁木霉、棘孢木霉、深绿木霉、哈茨木霉、长枝木霉等。其中哈茨木霉的菌丝纤细无色，具分隔，多分枝，分生孢子梗从菌丝的侧枝上生出，对生或互生，一般有2～3次分枝，着生分生孢子的小梗瓶形或锥形，分生孢子多为球形，孢壁具小疣突，蓝绿色。在PDA培养基上菌落初为白絮状，后为暗绿色。
镰刀菌是一类世界性分布的真菌，可以侵染多种植物，引起植物的根腐、茎腐、花腐和穗腐等多种病害。目前，国内外学者在镰刀菌的分类地位与寄主范围、形态学与分子特征、致病机理等方面均有报道，镰刀菌侵染马铃薯引起的根腐病、干腐病、枯萎病是世界性的土传真菌病害，马铃薯根腐病在育苗期和大田生长期均可发病，由多种镰刀菌引起的马铃薯镰刀菌根腐病近几年对马铃薯的生产危害严重，一般发病地块减产13％～35％，严重的成片死亡甚至绝产。
目前，马铃薯根腐病的防治一般采用化学杀菌剂进行处理，如用50％多菌灵可湿性粉剂500倍液或800倍85％甲基托布津可湿性粉剂药液浸种薯；用85％甲基托布津800倍液或50％多菌灵250～300倍药液，浸蘸苗基部深6～10厘米、2～3分钟；生长过程发现根腐病用用络氨铜，氯溴异氰尿酸，甲霜恶霉灵，咯菌腈或者枯草芽孢杆菌加生根剂灌根，叶面喷施磷酸二氢钾加芸苔素调理。用化学药剂处理时往往存在残留问题，同时生产田中的镰刀菌不能除根，来年易复发等，因此需要一种能进行生物防治根腐病的方法进行处理，环保安全有效，可进行长期防治。
发明内容
基于以上现有技术，本发明的目的在于提供一株哈茨木霉固体发酵及其产品在防控马铃薯镰刀菌根腐病中的应用，利用本发明生产的哈茨木霉发酵产品，对木贼镰刀菌、接骨木镰刀菌、尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌、锐顶镰刀菌等马铃薯根腐病的致病菌有很好的抑制效果，可以应用于马铃薯根腐病的防治过程，从而减少和防治马铃薯根腐病的发生，提高马铃薯的产量和质量。
本发明所用的哈茨木霉菌M-17，保藏编号：CCTCC NO：2018538，拉丁文名称为Trichoderma harzianum M-17，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2018年8月13日，保藏地址为中国武汉武汉大学。
一种哈茨木霉M-17的固体发酵方法，包括以下步骤：
步骤1、菌种培养：将哈茨木霉M-17菌种接种到PDA固体平板上，黑暗条件下，25～28℃培养5～7d；
步骤2、固体发酵：将步骤1培养的木霉菌菌落用打孔器沿菌落边缘各打出菌饼，接种到灭菌的固体发酵培养基中，待菌丝长满培养基后即可。
为了更好的实现本发明，进一步的，哈茨木霉M-17的发酵产物用于马铃薯镰刀菌根腐病的防治应用；所述的镰刀菌为木贼镰刀菌、接骨木镰刀菌、尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌、锐顶镰刀菌中的至少一种。
为了更好的实现本发明，进一步的，步骤1中PDA固体平板制作方法为：
1)先按以下配比称取培养基各组分：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，蒸馏水1000ml；
2)土豆切成小块放入锅中，加水1000ml，在加热器上加热至沸腾，维持20～30min，用2层纱布趁热在量杯上过滤，滤渣弃取，滤液补充蒸馏水分到1000ml；
3)把滤液放入锅中，加入葡萄糖20g，琼脂15～20g，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒不断搅拌，待琼脂完全溶解后，进行分装，121℃灭菌25～30min后自然冷却凝固备用。
为了更好的实现本发明，进一步的，步骤2中固体发酵培养基组分为：中药粉30～70％、马铃薯全粉10～20％、玉米粉10～30％、木屑0～15％，马铃薯皮5～7％，加水量为以上组分质量的70～80％；灭菌条件为蒸汽灭菌，121～125℃，维持45～60min。
为了更好的实现本发明，进一步的，步骤2中打孔器大小为Φ＝10mm；固体发酵培养条件为接种量10％，于25℃下静止培养3d，手工摇瓶后继续培养，培养温度27～30℃，培养时间7～10d。
为了更好的实现本发明，进一步的，中药粉为甘草、板蓝根、葡萄酒皮渣中的一种或几种。
为了更好的实现本发明，进一步的，中药粉组成为甘草0～100％、板蓝根0～100％、葡萄酒皮渣0～60％。
有益效果
本发明的有益效果如下：
(1)哈茨木霉菌M-17菌在固体培养基中生长快，培养基成分便宜，比较容易获得，同时容易培养；
(2)哈茨木霉菌M-17菌生长稳定，重复性好，可以稳定的培养，培养条件简单，容易实现；
(3)哈茨木霉菌M-17菌培养过程中加入中药成分，得到的培养产物对木贼镰刀菌、接骨木镰刀菌、尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌、锐顶镰刀菌等马铃薯根腐病的致病菌有很好的抑制效果，可以应用于马铃薯根腐病的防治过程，从而减少和防治马铃薯根腐病的发生，提高马铃薯的产量和质量。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
PDA固体平板制作方法为：
1)先按以下配比称取培养基各组分：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，蒸馏水1000ml；
2)土豆切成小块放入锅中，加水1000ml，在加热器上加热至沸腾，维持20～30min，用2层纱布趁热在量杯上过滤，滤渣弃取，滤液补充蒸馏水分到1000ml；
3)把滤液放入锅中，加入葡萄糖20g，琼脂15～20g，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒不断搅拌，待琼脂完全溶解后，进行分装，121℃灭菌25～30min后自然冷却凝固备用。
实施例1
本实施例提供一种哈茨木霉M-17的固体发酵方法，包括以下步骤：
步骤1、菌种培养：将哈茨木霉M-17菌种接种到PDA固体平板上，黑暗条件下，25℃培养7d；
步骤2、固体发酵：将步骤1培养的木霉菌菌落用Φ＝10mm的打孔器沿菌落边缘各打出菌饼，以10％的接种量接种到灭菌后的固体发酵培养基中，于25℃下静止培养3d，手工摇瓶后继续培养，培养温度27℃，培养时间10d，待菌丝长满培养基后即可。
其中固体发酵培养基组分和灭菌条件为：中药粉50％、马铃薯全粉20％、玉米粉20％、木屑5％，马铃薯皮5％，加水量为以上组分质量的75％；灭菌条件为蒸汽灭菌，121℃，维持60min。
其中中药粉为100％甘草粉。
实施例2
本实施例提供一种哈茨木霉M-17的固体发酵方法，包括以下步骤：
步骤1、菌种培养：将哈茨木霉M-17菌种接种到PDA固体平板上，黑暗条件下，27℃培养7d；
步骤2、固体发酵：将步骤1培养的木霉菌菌落用Φ＝10mm的打孔器沿菌落边缘各打出菌饼，以10％的接种量接种到灭菌后的固体发酵培养基中，于25℃下静止培养3d，手工摇瓶后继续培养，培养温度28℃，培养时间10d，待菌丝长满培养基后即可。
其中固体发酵培养基组分和灭菌条件为：中药粉70％、马铃薯全粉10％、玉米粉10％、木屑5％，马铃薯皮5％，加水量为以上组分质量的75％；灭菌条件为蒸汽灭菌，124℃，维持60min。
其中中药粉为50％甘草粉和50％板蓝根。
实施例3
本实施例提供一种哈茨木霉M-17的固体发酵方法，包括以下步骤：
步骤1、菌种培养：将哈茨木霉M-17菌种接种到PDA固体平板上，黑暗条件下，28℃培养5d；
步骤2、固体发酵：将步骤1培养的木霉菌菌落用Φ＝10mm的打孔器沿菌落边缘各打出菌饼，以10％的接种量接种到灭菌后的固体发酵培养基中，于25℃下静止培养3d，手工摇瓶后继续培养，培养温度30℃，培养时间7d，待菌丝长满培养基后即可。
其中固体发酵培养基组分和灭菌条件为：中药粉30％、马铃薯全粉20％、玉米粉30％、木屑15％，马铃薯皮5％，加水量为以上组分质量的70％；灭菌条件为蒸汽灭菌，125℃，维持45min。
其中中药粉为100％板蓝根。
实施例4
本实施例提供一种哈茨木霉M-17的固体发酵方法，包括以下步骤：
步骤1、菌种培养：将哈茨木霉M-17菌种接种到PDA固体平板上，黑暗条件下，28℃培养6d；
步骤2、固体发酵：将步骤1培养的木霉菌菌落用Φ＝10mm的打孔器沿菌落边缘各打出菌饼，以10％的接种量接种到灭菌后的固体发酵培养基中，于25℃下静止培养3d，手工摇瓶后继续培养，培养温度28℃，培养时间9d，待菌丝长满培养基后即可。
其中固体发酵培养基组分和灭菌条件为：中药粉70％、马铃薯全粉10％、玉米粉10％、木屑5％，马铃薯皮5％，加水量为以上组分质量的80％；灭菌条件为蒸汽灭菌，121℃，维持60min。
其中中药粉为70％甘草粉和30％葡萄酒皮渣。
实施例5
本实施例提供一种哈茨木霉M-17的固体发酵方法，包括以下步骤：
步骤1、菌种培养：将哈茨木霉M-17菌种接种到PDA固体平板上，黑暗条件下，28℃培养7d；
步骤2、固体发酵：将步骤1培养的木霉菌菌落用Φ＝10mm的打孔器沿菌落边缘各打出菌饼，以10％的接种量接种到灭菌后的固体发酵培养基中，于25℃下静止培养3d，手工摇瓶后继续培养，培养温度28℃，培养时间7d，待菌丝长满培养基后即可。
其中固体发酵培养基组分和灭菌条件为：中药粉63％、马铃薯全粉10％、玉米粉20％、马铃薯皮7％，加水量为以上组分质量的75％；灭菌条件为蒸汽灭菌，123℃，维持60min。
其中中药粉为30％甘草粉、10％板蓝根和60％葡萄酒皮渣。
上述实施例1至5中提供的哈茨木霉M-17的固体培养基配比所采用的原料如下表1所示：
表1原料百分比
| 固体培养基原料 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 |
| 甘草 | 50 | 35 | 0 | 49 | 18.9 |
| 板蓝根 | 0 | 35 | 30 | 0 | 6.3 |
| 葡萄酒皮渣 | 0 | 0 | 0 | 21 | 37.8 |
| 马铃薯全粉 | 20 | 10 | 20 | 10 | 10 |
| 玉米粉 | 20 | 10 | 30 | 10 | 20 |
| 木屑 | 5 | 5 | 15 | 5 | 0 |
| 马铃薯皮 | 5 | 5 | 5 | 5 | 7 |
对上述实施例1至5中制得的哈茨木霉菌在病原菌的抑制测试方法：
将转接于PDA固体培养基上的马铃薯根腐病病原菌，于25℃黑暗条件下静止培养5d后，用Φ＝10mm打孔器沿其菌落边缘打菌饼三块，放入已涂布哈茨木霉菌发酵产物的固体培养基中线上，两菌饼之间的距离须大于20mm，于25℃黑暗条件下静止培养9d左右，考察发酵产物对马铃薯根腐镰刀菌木贼镰刀菌、接骨木镰刀菌、尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌、锐顶镰刀菌的抑制效果。
菌落抑制率的测定方法：以直尺取菌落互相垂直的两个直径分别读数，并以PDA固体培养基接入一块病原菌菌饼为对照，按照以下公式计算菌落抑制率：
菌落抑制率(％)＝(SCK-S1)/SCK×100％
其中：Sck表示PDA固体培养基接入病原菌菌饼后菌落直径距离(mm)，S1表示在PDA固体培养基上涂布生防菌发酵产物后接入病原菌菌落的直径距离。
结果见表2所示：
表2 M-17对5种马铃薯镰刀菌根腐病病原真菌的抑菌作用
对上述实施例1至5中制得的哈茨木霉菌制作成颗粒菌剂，其有效活菌计数≥1亿/克，进行大田应用，使用方法为1kg菌剂加7kg水混合均匀后进行拌种；每亩大田施用1kg菌剂和100kg土的均匀混合物。
收获时调查各处理马铃薯薯块干腐病的发病级数，计算病情指数和防效。
干腐病病薯分级标准：0级：薯块上无病斑；1级：病斑小，病部面积整个薯块面积5％以下；3级：病斑较小，病部面积占整个薯块面积5～10％；5级：病斑较小或个别较大，病部面积占整个薯块面积11～25％；7级：病斑大小均有分布，病部面积占整个薯块面积26～50％；9级：病斑大小均有分布，病部相连面积占整个薯块面积的50％以上。
病情指数＝Σ(各级病薯数×相对级数值)×100/(调查总薯数×9)
相对防效(％)＝[(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数]×100％
试验结果如表3所示：
表3各实施例对马铃薯镰刀菌根腐病防效和产量的测定结果
由表3可知，施用本发明得到的哈茨木霉微生物菌剂可不同程度降低马铃薯镰刀菌根腐病发病，对马铃薯镰刀菌根腐病具有一定的防治效果，同时可增加马铃薯产量和提高商品薯率。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种哈茨木霉M-17的固体发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、菌种培养：将哈茨木霉M-17菌种接种到PDA固体平板上，黑暗条件下，25～28℃培养5～7d；
步骤2、固体发酵：将步骤1培养的木霉菌菌落用打孔器沿菌落边缘各打出菌饼，接种到灭菌的固体发酵培养基中，待菌丝长满培养基后即可。
2.根据权利要求1所述的哈茨木霉M-17固体发酵产物用于马铃薯镰刀菌根腐病的防治应用；所述的镰刀菌为木贼镰刀菌、接骨木镰刀菌、尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌、锐顶镰刀菌中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的一种哈茨木霉M-17的固体发酵方法，其特征在于，步骤1中PDA固体平板制作方法为：
1)先按以下配比称取培养基各组分：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，蒸馏水1000ml；
2)土豆切成小块放入锅中，加水1000ml，在加热器上加热至沸腾，维持20～30min，用2层纱布趁热在量杯上过滤，滤渣弃取，滤液补充蒸馏水分到1000ml；
3)把滤液放入锅中，加入葡萄糖20g，琼脂15～20g，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒不断搅拌，待琼脂完全溶解后，进行分装，121℃灭菌25～30min后自然冷却凝固备用。
4.根据权利要求1所述的一种哈茨木霉M-17的固体发酵方法，其特征在于，步骤2中固体发酵培养基组分为：中药粉30～70％、马铃薯全粉10～20％、玉米粉10～30％、木屑0～15％，马铃薯皮5～7％，加水量为以上组分质量的70～80％；灭菌条件为蒸汽灭菌，121～125℃，维持45～60min。
5.根据权利要求1所述的一种哈茨木霉M-17的固体发酵方法，其特征在于，步骤2中打孔器大小为Φ＝10mm；固体发酵培养条件为接种量10％，于25℃下静止培养3d，手工摇瓶后继续培养，培养温度27～30℃，培养时间7～10d。
6.根据权利要求1所述的一种哈茨木霉M-17的固体发酵方法，其特征在于，中药粉为甘草、板蓝根、葡萄酒皮渣中的一种或几种。
7.根据权利要求1所述的一种哈茨木霉M-17的固体发酵方法，其特征在于，中药粉组成为甘草0～100％、板蓝根0～100％、葡萄酒皮渣0～60％。
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