CN112029667A - 一株木霉、木霉孢子悬液、木霉发酵菌粉及其制备方法与应用 - Google Patents

一株木霉、木霉孢子悬液、木霉发酵菌粉及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株木霉、木霉孢子悬液、木霉发酵菌粉及其制备方法与应用，属于微生物技术领域。该木霉菌株编号为MN115681，保藏编号为CGMCC No.15678。该木霉具有较佳的耐酸、耐碱以及耐盐性能。该木霉以及由其制备得到的木霉孢子悬液和木霉发酵菌粉以及含有上述木霉、木霉孢子悬液和木霉发酵菌粉中的至少一种的微生物肥料或生物农药均可用于防治常见土传病害病原菌及促进蔬果生长并具有较佳的效果。

Description

一株木霉、木霉孢子悬液、木霉发酵菌粉及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体而言，涉及一株木霉、木霉孢子悬液、木霉发酵菌粉及其制备方法与应用。
背景技术
木霉(Trichoderma)是一类易于分离的丝状真菌，属半知菌类的丝孢纲，丛梗孢目科。木霉菌在自然界中分布广泛，具有生长速率快，生命力强和适应性好的特点。
我国蔬果生产经济效益较高，因此常集约化程度高，具有作物单一、倒茬困难和复种指数高的特点。长期同种植物的种植和大量化肥的投入易造成土壤表层盐分累积以及病虫害严重，严重影响蔬果产量。化学药剂的使用一方面易残留在土壤中污染土壤环境，造成土壤酸化和板结，另一方面农产品农药残留威胁人类身体健康。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的之一包括提供一株木霉，该木霉具有较佳的耐酸、耐碱以及耐盐性能，同时对常见土传病害病原菌有良好的防治效果，对蔬果有较好的促生效果。该木霉适用于土壤酸碱盐度相对恶劣的地区，提升该地区作物抗土传病害的能力，提高作物产量。
本发明的目的之二包括提供一种由上述木霉制备而得的木霉孢子悬液，其具有木霉所具有的全部效果。
本发明的目的之三包括提供一种上述木霉孢子悬液的制备方法。
本发明的目的之四包括提供一种由上述木霉制备而得的木霉发酵菌粉，其具有木霉所具有的全部效果。
本发明的目的之五包括提供一种上述木霉发酵菌粉的制备方法。
本发明的目的之六包括提供一种含有上述木霉、木霉孢子悬液和木霉发酵菌粉中至少一种的微生物肥料，其同样具有木霉所具有的全部效果。
本发明的目的之七包括提供一种含有上述木霉、木霉孢子悬液和木霉发酵菌粉中至少一种的生物农药，其同样具有木霉所具有的全部效果。
本发明的目的之八包括提供一种上述木霉、木霉孢子悬液、木霉发酵菌粉、微生物肥料或生物农药在防治土传病害或/和促进蔬果生长中的应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，本申请提供一株木霉(Trichodermasp.)，菌株编号为MN115681，保藏编号为CGMCC No.15678。该木霉于2018年05月21日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实验证明，该木霉MN115681耐受浓度≤0.25mol/L的NaCl引起的盐胁迫和pH为5-11引起的酸碱胁迫，且在pH为11的碱性环境中该木霉MN115681仍具有良好的长势。
第二方面，本申请提供如前述木霉的分离筛选方法，包括以下步骤：
将土壤样本制得的土壤悬液转接于PDA固体培养基第一次培养，随后取单一菌落接种于新的PDA固体培养基第二次培养。
其中，土壤样本采自河南省烟草地。
在可选的实施方式中，土壤悬液经土壤样本与吐温水混合后得到。
在可选的实施方式中，PDA固体培养基的组成包括：马铃薯浸粉5.0g、葡萄糖20.0g、琼脂20.0g、氯霉素0.1g以及蒸馏水1000mL。
在可选的实施方式中，第一次培养是于27-31℃的条件下进行3-5天。
在可选的实施方式中，第二次培养是于27-31℃的条件下进行5-7天。
在可选的实施方式中，第一次培养和第二次培养均是于恒温培养箱中倒置培养。
第三方面，本申请提供一种木霉孢子悬液，木霉孢子悬液由如前述的木霉和吐温水制备而得。
在可选的实施方式中，木霉孢子悬液中木霉的孢子数为1×106-1×1010sp/mL。
第四方面，本申请提供如前述的木霉孢子悬液的制备方法，包括以下步骤：将木霉的孢子制成悬液。
在可选的实施方式中，将活化后的木霉于27-31℃的条件下培养5-7天，获取培养后长出的孢子制成悬液。
在可选的实施方式中，活化于PDA固体培养基中进行。
第五方面，本申请提供一种木霉发酵菌粉，木霉发酵菌粉由如前述的木霉制备而得。
第六方面，本申请提供如前述的木霉发酵菌粉的制备方法，包括以下步骤：将木霉的种子液接种至固体发酵培养基发酵培养，再将发酵液进行干燥即可。
在可选的实施方式中，发酵培养是于温度为27-31℃、相对湿度为85％以上的条件下进行8-9天。
在可选的实施方式中，接种量为7-15wt％。
在可选的实施方式中，固体发酵培养基的组成包括质量比为1:1.5-2的固料和液料，固料包括玉米芯、麸皮和稻壳中的至少一种，液料为无机盐溶液。
在可选的实施方式中，固料由重量百分比分别为50％、40％和10％的玉米芯、麸皮和稻壳混合而成；无机盐溶液含有3.5wt％的磷酸二氢钾、0.04wt％的硫酸镁和4wt％的硫酸铵。
在可选的实施方式中，种子液经以下步骤得到：取木霉在PDA固体培养基上活化产孢后的孢子至PDB液体培养基中，于27-31℃的条件下摇床培养3-5天。
在可选的实施方式中，种子液中的菌活为0.15-0.3cfu/mL。
在可选的实施方式中，PDB液体培养基的组成包括：去皮马铃薯200.0g、葡萄糖20.0g以及蒸馏水1000mL。
第七方面，本申请提供一种微生物肥料，其含有如前述的木霉、木霉孢子悬液和木霉发酵菌粉中的至少一种。
第八方面，本申请提供一种生物农药，其含有如前述的木霉、木霉孢子悬液和木霉发酵菌粉中的至少一种。
第九方面，本申请提供如前述的木霉、木霉孢子悬液、木霉发酵菌粉、微生物肥料或生物农药在防治作物土传病害中的应用。
在可选的实施方式中，防治作物土传病害为防治作物在酸碱盐胁迫环境中的土传病害。
在可选的实施方式中，土传病害为病原菌引起的病害。
在可选的实施方式中，病原菌包括立枯丝核菌、禾谷镰孢菌、亚洲镰孢菌和尖孢镰刀菌中的至少一种。
在可选的实施方式中，病害包括立枯病、根腐病、茎基腐病和枯萎病中的至少一种。
第十方面，本申请提供如前述木霉、木霉孢子悬液、木霉发酵菌粉、微生物肥料或生物农药在促进蔬果生长中的应用；
在可选的实施方式中，蔬果包括西红柿、圣女果和草莓中的任意一种。
本申请的有益效果包括：
本申请提供的木霉为有效的生防菌株，其具有较佳的耐酸、耐碱以及耐盐性能，能够拮抗多种土传病害病原菌，并有较好的促生作用。由其制备得到的木霉孢子悬液、木霉发酵菌粉以及含有上述木霉、木霉孢子悬液和木霉发酵菌粉中的至少一种的微生物肥料和生物农药均可用于防治常见作物土传病害及促进蔬果生长并具有较佳的效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本申请中木霉的生物保藏信息以及存活证明；
图2至图9为本申请实施例5中木霉防治病原菌的效果图；
图10为本申请实施例8中木霉对圣女果促生效果图；
图11为本申请实施例9中木霉对草莓促生效果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本申请提供的木霉、木霉孢子悬液、木霉发酵菌粉及其制备方法与应用进行具体说明。
本申请提出一株木霉。该木霉的分离筛选方法参照以下步骤：
将土壤样本制得的土壤悬液转接于PDA固体培养基第一次培养，随后取单一菌落接种于新的PDA固体培养基第二次培养。
其中，土壤样本采自河南省烟草地。
在可选的实施方式中，土壤悬液经土壤样本与吐温水混合后得到。可参考地，以5g土壤样本加入至灭菌后的45mL的质量浓度为0.1％的吐温水中，震荡1分钟混匀并静置25分钟，即可得到土壤悬液。进一步地，根据所得的土壤悬液的浓度，可将其梯度稀释至10-3及10-4浓度，随后再进行培养。值得说明的是，在其它实施方式中，土壤样本与吐温水的混合比例以及吐温水的浓度、震荡时间、静置时间以及稀释等级等均可做合理调整。
在可选的实施方式中，第一次培养可以于27-31℃的条件下进行3-5天，优选于28℃的条件下进行4天。
在可选的实施方式中，第二次培养可以于27-31℃的条件下进行5-7天，优选于28℃的条件下进行5天。
在可选的实施方式中，第一次培养和第二次培养均是于恒温培养箱中倒置培养。
对本申请提供的分离筛选方法得到的菌株的ITS序列进行种属鉴定，测定结果见序列表，也即其序列如SEQ ID NO.1所示。鉴定类别为木霉(Trichodermasp.)，菌株编号为MN115681，保藏编号为CGMCC No.15678。该木霉于2018年05月21日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该菌的生物保藏信息以及存活证明请参见图1。
在可选的实施方式中，该木霉耐受浓度≤0.25mol/L，如0mol/L、0.05mol/L、0.1mol/L、0.15mol/L、0.2mol/L或0.25mol/L的NaCl引起的盐胁迫。
在可选的实施方式中，木霉耐受pH为5-11引起的酸碱胁迫，如耐受pH大于等于5且不高于7引起的酸胁迫或耐受pH小于等于11且不低于7引起的碱胁迫。值得说明的是，在pH为11的碱性环境中该木霉仍具有良好的长势。
此外，本申请还提供一种木霉孢子悬液，其由上述木霉用0.1％吐温水悬浮制备而得。
在可选的实施方式中，木霉孢子悬液中木霉的孢子数可以为1×106-1×1010sp/mL，优选为1×107sp/mL。
可参考地，上述木霉孢子悬液的制备方法可包括以下步骤：将木霉的孢子制成悬液。
在可选的实施方式中，将活化后的木霉于27-31℃，如28℃的条件下培养5-7天，获取培养后长出的孢子制成悬液。
其中，活化于PDA固体培养基中进行，至绿色孢子产满板。活化后，用吐温水洗下培养基表面的孢子并稀释至孢子数为1×107个/mL即可。
此外，本申请还提供一种木霉发酵菌粉，其由上述木霉制备而得。
可参考地，上述木霉发酵菌粉的制备方法可包括以下步骤：将木霉的种子液接种至固体发酵培养基发酵培养，干燥发酵液。
在可选的实施方式中，发酵培养可以于温度为27-31℃，如28℃、相对湿度为85％以上的条件下进行8-9天。
在可选的实施方式中，接种量可以为7-15wt％，如10wt％。
在可选的实施方式中，固体发酵培养基的组成例如可包括质量比(固液比)为1：1.5-2.0，如1:1.8的固料和液料。其中，固料可包括玉米芯、麸皮和稻壳中的至少一种，可参考地，其可由重量百分比分别为50％、40％和10％的玉米芯、麸皮和稻壳混合而成。液料可以为无机盐溶液。可参考地，上述无机盐溶液中可含有磷酸二氢钾、硫酸镁和硫酸铵，可参考地，该液料可含有3.5wt％的磷酸二氢钾、0.04wt％的硫酸镁和4wt％的硫酸铵。
在可选的实施方式中，上述种子液可经以下步骤得到：取木霉在PDA固体培养基上活化产孢后的孢子至PDB液体培养基中，于27-31℃的条件下摇床培养3-5天，即可形成种子液。
在可选的实施方式中，种子液中的菌活可以为0.15-0.3cfu/mL，如0.15cfu/mL、0.2cfu/mL、0.25cfu/mL或0.3cfu/mL等。
可参考地，本申请所涉及的PDA固体培养基配方可参照：马铃薯浸粉5.0g，葡萄糖20.0g，琼脂20.0g，氯霉素0.1g，蒸馏水1000mL。PDB液体培养基配方可参照：去皮马铃薯200.0g，葡萄糖20.0g，蒸馏水1000mL。值得说明的是，在一些具体的实施方式中，PDA固体培养基配方和PDB液体培养基配方也可参照现有技术中公开的相关方式，在此不做过多限定或赘述。
此外，本申请还提供一种微生物肥料，其含有如前述的木霉、木霉孢子悬液和木霉发酵菌粉中的至少一种。
此外，本申请还提供一种生物农药，其含有如前述的木霉、木霉孢子悬液和木霉发酵菌粉中的至少一种。
进一步地，本申请还提供如前述的木霉、木霉孢子悬液和木霉发酵菌粉中的至少一种、前述微生物肥料或前述的生物农药在防治作物土传病害中的应用。
上述防治作物土传病害为防治作物在酸碱盐胁迫环境中的土传病害。其中，土传病害为病原菌引起的病害。可参考地，病原菌可包括立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)、亚洲镰孢菌(Fusariumasiaticum)和尖孢镰刀菌(FusariumoxysporumSchl)中的至少一种。病害包括立枯病、根腐病、茎基腐病和枯萎病中的至少一种。
在可选的实施方式中，木霉、木霉孢子悬液和木霉发酵菌粉中的至少一种、前述微生物肥料或生物农药可用于防治黄瓜立枯病并具有很好的防治效果，其中木霉发酵菌粉在碱胁迫环境中对黄瓜立枯病的防治效果可接近90％。
进一步地，本申请还提供如前述木霉、木霉孢子悬液和木霉发酵菌粉中的至少一种、前述微生物肥料或生物农药在蔬果促生中的应用。
其中，蔬果可以但不仅限于包括西红柿、圣女果和草莓中的任意一种。
综上，本申请提供的木霉为有效的生防菌株，其具有较佳的耐酸、耐碱以及耐盐性能，能够拮抗多种土传病害病原菌，并有较好的促生作用。由其制备得到的木霉孢子悬液、木霉发酵菌粉以及含有上述木霉、木霉孢子悬液和木霉发酵菌粉中的至少一种的微生物肥料或生物农药均可用于防治常见作物土传病害及促进蔬果生长并具有较佳的效果。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
木霉菌株的分离与筛选
称取5g样本土壤，加入到灭过菌的45mL浓度为0.1wt％的吐温水中，震荡1分钟混匀并静置25分钟，取土壤悬液梯度稀释至10-3、10-4浓度，然后涂布于PDA固体无机盐培养基中，于28℃恒温培养箱中倒置培养4d，4d后挑取单一真菌菌落，接种于PDA固体培养基上，于28℃恒温培养箱中倒置培养5d。
其中，PDA固体培养基配方为：马铃薯浸粉5.0g、葡萄糖20.0g、琼脂20.0g、氯霉素0.1g以及蒸馏水1000mL。
随后，对该菌株的ITS序列进行种属鉴定，测定结果见序列表SEQ ID NO.1，鉴定类别为Trichodermasp.，菌株编号为MN115681，保藏编号为CGMCC No.15678。该木霉于2018年05月21日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
该菌的生物保藏信息以及存活证明请参见图1。
实施例2
本实施例提供一种MN115681木霉孢子悬液，其由以下方法得到：
在PDA固体培养基上活化实施例1得到的木霉MN115681，置于28℃恒温培养箱培养5天至绿色孢子产满板，用0.1％吐温水洗下培养基表面的孢子，调整孢子数为1×107sp/mL，即得到MN115681木霉孢子悬液。
其中，PDA固体培养基配方同实施例1。
实施例3
本实施例提供一种MN115681木霉发酵菌粉，其由以下方法得到：
将实施例1得到的木霉MN115681在PDA固体培养基上活化产孢后，挑取少量孢子，移至PDB液体培养基中，28℃摇床振荡培养5天，形成种子液，将种子液按10wt％的比例接种至固体发酵培养基，保持28℃恒温和相对湿度85％以上发酵培养8天，发酵液干燥以后即可得到木霉发酵菌粉。
其中，PDA固体培养基配方同实施例1。
PDB液体培养基配方为去皮马铃薯200.0g、葡萄糖20.0g以及蒸馏水1000mL。
固体发酵培养基配方(质量百分含量)：固料：玉米芯50％、麸皮40％以及稻壳10％；无机盐溶液：磷酸二氢钾3.5wt％，硫酸镁0.04wt％，硫酸铵4wt％，剩余为水。固料与无机盐溶液的质量比为1：1.8。
实施例4
耐酸、耐碱以及耐盐能力评估
(1)耐酸和耐碱实验：
待经高温高压灭菌后的PDA培养基冷却至60℃左右时，用1mol/L的HCl和1mol/L的NaOH溶液将培养基的pH值分别调节至5、7(不用调节，对照)、9和11，并制成平板备用。从活化好的菌株边缘打取直径约5mm的菌饼，接种至不同pH值培养基的中央，重复3次，恒温25-28℃下培养，培养至48h时，分别测量菌落直径、记录。
第48h的菌落直径结果见表1。
表1菌落直径
pH 5 7 9 11
菌落直径(mm) 69.6 64.0 65.7 71.0
由表1可以看出，在弱酸和弱碱环境下，木霉菌株MN115681的生长并没有受到抑制，在强碱环境(pH＝11)菌落直径明显大于中性环境(pH＝7)，说明较中性环境而言，木霉菌株MN115681在碱性环境具有更好的生长能力。
(2)耐盐实验：
先配制含NaCl0.05mol/L、0.1mol/L、0.15mol/L、0.2mol/L及0.25mol/L的PDA培养基，高温高压灭菌后制成平板，从活化好的实施例1的木霉菌落边缘打取菌饼，接种至培养基上，25-28℃恒温培养，以不加NaCl的培养基为对照，观察菌落生长，生长至48h时，测量菌落直径并记录。
第48h的菌落直径结果见表2。
表2菌落直径
盐浓度(mol/L) 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25
菌落直径(cm) 76.5 60.5 62.8 56.2 49.9 43.9
由表2可以看出，木霉菌株MN115681的菌落直径随盐浓度的增加而变小，但在盐浓度较高(NaCl 0.25mol/L)时仍能较快生长。
实施例5
木霉MN115681防治病原菌效果评估
平板对峙实验：
供试病原菌：立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)、亚洲镰孢菌(Fusariumasiaticum)、尖孢镰刀菌(FusariumoxysporumSchl)。
CK(空白对照)：从活化3天的病原菌菌落边缘打取菌饼(直径5mm)，将其置于离PDA平板中心2.5cm处，对侧中央放置直径5mmPDA琼脂块，28℃恒温培养，平板5个重复。
处理：从活化3天的病原菌菌落边缘打取菌饼(直径5mm)，将其置于离PDA平板中央2.5cm处，从活化3天的实施例1培养的木霉MN115681菌落打取直径5mm菌饼，将其置于PDA平板另一侧中央，使病原菌和木霉的中心连线穿过平板中央，25℃恒温培养，每处理5重复。木霉MN115681对立枯丝核菌的抑制效果如图2至图9所示。
其中，图2和图3对应立枯丝核菌，图2为空白对照(仅含立枯丝核菌，未加木霉MN115681)的结果图，图3为处理(添加有立枯丝核菌和木霉MN115681)的结果图。图4和图5对应禾谷镰孢菌，图4为空白对照(仅含禾谷镰孢菌，未加木霉MN115681)的结果图，图5为处理(添加有禾谷镰孢菌和木霉MN115681)的结果图。图6和图7对应亚洲镰孢菌，图6为空白对照(仅含亚洲镰孢菌，未加木霉MN115681)的结果图，图7为处理(添加有亚洲镰孢菌和木霉MN115681)的结果图。图8和图9对应尖孢镰刀菌，图8为空白对照(仅含尖孢镰刀菌，未加木霉MN115681)的结果图，图9为处理(添加有尖孢镰刀菌和木霉MN115681)的结果图。
数据采集：接种后，平板倒置培养，每隔24h测量一次病原菌直径，并根据以下公式计算抑菌率。
抑菌率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径*100％。
抑菌率效果如图所示，抑菌率见表3。
表3碱环境胁迫下木霉MN115681的抑菌率
Figure BDA0002674334900000121
注：各培养基的pH＝11。
由表3可知，即使在pH为11的碱性环境下，木霉MN115681仍能较快繁殖，并对病原菌产生较好的抑制作用。其中，对立枯丝核菌和亚洲镰孢菌的抑制作用保持在65％以上，若将木霉MN115681作用于受碱胁迫的土传病害植株中将极大改善病害程度，促进植株健康生长。
实施例6
防治黄瓜立枯病温室盆栽试验
(1)试验处理药剂包括：清水(空白对照)、甲基托布津(化药)、实施例2得到的木霉孢子悬液(以MN115681孢子悬液示)、实施例3得到的木霉发酵菌粉(以MN115681发酵菌粉示)。
(2)黄瓜立枯丝核菌病原培养
(3)盆栽试验方法：将已育苗21天的黄瓜苗进行伤根处理后，移栽至新的装有灭菌翠筠靓土的花盆中，每盆移栽3株，试验设3个重复，每重复6个花盆。移栽后在每个花盆中接种2个直径5mm的，培养14天左右的立枯丝核菌饼。将木霉孢子悬液用pH11的氢氧化钠水溶液稀释10倍，将木霉发酵菌粉用pH11的氢氧化钠水溶液稀释300倍，甲基托布津用pH11的氢氧化钠水溶液稀释300倍，每盆100mL进行灌根。随后放置于高温高湿(温度≥30℃，湿度≥85％)条件下培养4-5天，统计黄瓜的病级情况，并计算病情指数和相对防效。
黄瓜苗根茎部发病严重度分级标准为：
0级，健康苗；
1级，茎基或根部稍现病斑或稍变色；
2级，1/3或1/2茎基或根部出现病斑或变色腐烂；
3级，全茎或根部被病斑环绕、变色、腐烂；
4级，黄瓜苗萎蔫枯死。
病情指数＝[∑(各级病株数×对应各级代表数值)/(调查总株数×发病最高级的代表数值)]×100；
防治效果(％)＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100。
(4)试验结果如表4所示：
表4碱环境胁迫下对立枯病的防治效果
Figure BDA0002674334900000131
由表4可知，在碱胁迫环境下，木霉孢子悬液和木霉发酵菌粉对黄瓜立枯丝核病仍具有很好的防治效果，其中发酵菌粉的防治效果接近90％，比传统化药甲基托布津在碱胁迫环境中的病原菌防治效果更优。
实施例7
大田西红柿促生效果评估
(1)试验处理药剂包括：清水(空白对照)、实施例3的MN115681发酵菌粉(处理组)、武汉科诺类芽孢杆菌产品(同类对照)，处理方式见表5。
(2)试验地点：广东省广州市番禺区石碁镇兴腾试验基地，试验地点交通便利，土壤肥沃，光照充足，土壤为红沙壤，试验地前茬作物为黄瓜，且土传病害严重。
试验方法：按照单个试验区域面积18m2来规划试验区域，共设置九块试验区域，并分成处理组、同类对照和空白对照三组，每组重复三个试验区域。每个试验区域内移栽等数量的长势均一的西红柿幼苗，并用定根水浇灌西红柿幼苗，移栽七天后按照表5所示处理方法对各个试验区内的西红柿幼苗分别进行根际冲施处理，并于移栽后30天和开花前期各施用一次复合肥。待移栽两个月后，随机抽取各试验区域西红柿植株20株，测定株高，并测定不同花序坐果率(结果数在开花总数中的占比)。
表5处理方式
处理 施用方式 有效剂量
处理组 根际冲施 1kg/亩(兑水稀释300倍使用)
同类对照 根际冲施 1kg/亩(兑水稀释300倍使用)
空白对照 - -
(3)试验结果：
如表6和表7所示。
表6株高试验结果
Figure BDA0002674334900000151
表7坐果率试验结果
Figure BDA0002674334900000152
由表6和表7可以看出，相对比于空白对照和施用武汉科诺类芽孢杆菌产品，施用MN115681发酵菌粉后西红柿的株高明显增加，同时西红柿坐果率明显提高。
实施例8
实验室盆栽圣女果促生效果评估
(1)试验处理药剂包括：清水(空白对照)、实施例3的MN115681发酵菌粉，处理方式见表8。
试验方法：选择直径10cm的育苗钵40个，装入等量灭菌后的草炭、秸秆粉作混合基质，随机将长势均一的圣女果幼苗移至育苗钵中，将其分成处理组和空白对照组，分组20盆，移栽7天后按照表8所示处理方法进行等量浇灌处理，并于移栽后30天和开花前期各施用一次肥水。待圣女果成熟后摘取圣女果测定产量，并计算增产率。
表8处理方式
处理 施用方式 有效剂量
MN115681发酵菌粉 浇灌 用清水稀释300倍使用
空白对照 浇灌 -
(3)试验结果：
种植结果如图10所示，圣女果产量如表9所示。
表9圣女果产量和增产率
处理 圣女果产量(kg) 比对照组增产率(％)
MN115681发酵菌粉 7.97 47.32％
空白对照 5.41 -
结果发现MN115681发酵菌粉处理的较空白对照实验室盆栽圣女果产量增加47.32％。
实施例9
大田草莓促生效果评估
(1)试验处理药剂包括：清水(空白对照)、实施例3的MN115681发酵菌粉，处理方式见表10。
(2)试验方法：在深圳市洲石路田田农园草莓采摘园，选取地势、土壤肥力、往年作物产量相当的地块，等面积划分成十块试验区域，将十块试验区域分成两组，即处理组和对照组，每块试验区域移栽长势相当的红星一号草莓苗，分别在移栽7天和14天后按照表10所示处理方法对处理组和对照组区域内的草莓苗分别进行灌根处理，待草莓成熟测定不同试验区域的有效挂果数，计算草莓增果率。
试验方法如表10所示。
表10处理方式
处理 施用方式 有效剂量
MN115681发酵菌粉 灌根 1kg/亩(稀释300倍使用)
空白对照 灌根 -
(3)试验结果：
种植结果如图11所示，草莓平均有效挂果数如表11所示。
表11草莓挂果数和增果率
处理 平均有效挂果数(个/株) 增果率(％)
MN115681发酵菌粉 117.67±15.84 10.31％
空白对照 106.67±16.67 -
结果发现，MN115681发酵菌粉处理的草莓平均有效挂果数明显增加，相对于空白对照增加10.31％。
综上所述，本申请提供的木霉为有效的生防菌株，其具有较佳的耐酸、耐碱以及耐盐性能，能够拮抗多种土传病害病原菌，并有较好的促生作用。由其制备得到的木霉孢子悬液、木霉发酵菌粉以及含有上述木霉、木霉孢子悬液和木霉发酵菌粉中的至少一种的微生物肥料或生物农药均可用于防治常见土传病害及促进蔬果生长并具有较佳的效果。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 慕恩（广州）生物科技有限公司
<120> 一株木霉、木霉孢子悬液、木霉发酵菌粉及其制备方法与应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 583
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atcattaccg agtttacaac tcccaaaccc aatgtgaacg ttaccaaact gttgcctcgg 60
cgggatctct gccccgggtg cgtcgcagcc ccggaccaag gcgcccgccg gaggaccaac 120
caaaactctt attgtatacc ccctcgcggg ttttttaata atctgagcct tctcggcgcc 180
tctcgtaggc gtttcgaaaa tgaatcaaaa ctttcaacaa cggatctctt ggttctggca 240
tcgatgaaga acgcagcgaa atgcgataag taatgtgaat tgcagaattc agtgaatcat 300
cgaatctttg aacgcacatt gcgcccgcca gtattctggc gggcatgcct gtccgagcgt 360
catttcaacc ctcgaacccc tccggggggt cggcgttggg gatcggccct cccttagcgg 420
gtggccgtct ccgaaataca gtggcggtct cgccgcagcc tctcctgcgc agtagtttgc 480
acactcgcat cgggagcgcg gcgcgtccac agccgttaaa cacccaactt ctgaaatgtt 540
gacctcggat caggtaggaa tacccgctga acttaagcat atc 583

Claims (10)

1.一株木霉，其特征在于，所述木霉的菌株编号为MN115681，保藏编号为CGMCCNo.15678。
2.如权利要求1所述的木霉，其特征在于，所述木霉耐受浓度≤0.25mol/L的NaCl引起的盐胁迫和/或所述木霉耐受pH为5-11引起的酸碱胁迫。
3.一种木霉孢子悬液，其特征在于，所述木霉孢子悬液由如权利要求1所述的木霉制备而得；
优选地，所述木霉孢子悬液中所述木霉的孢子数为1×106_1×1010sp/mL。
4.如权利要求3所述的木霉孢子悬液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将活化后的所述木霉于27-31℃的条件下培养5-7天，获取培养后长出的孢子制成悬液。
5.一种木霉发酵菌粉，其特征在于，所述木霉发酵菌粉由如权利要求1所述的木霉经发酵制备而得。
6.如权利要求5所述的木霉发酵菌粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将所述木霉的种子液接种至固体发酵培养基发酵培养，再将发酵液进行干燥即可；
优选地，发酵培养是于温度为27-31℃、相对湿度为85％以上的条件下进行8-9天；
优选地，接种量为7-15wt％；
优选地，所述固体发酵培养基的组成包括质量比为1:1.5-2的固料和液料，所述固料包括玉米芯、麸皮和稻壳中的至少一种，所述液料为无机盐溶液；
优选地，所述固料由重量百分比分别为50％、40％和10％的所述玉米芯、所述麸皮和所述稻壳混合而成；
优选地，所述无机盐溶液中含有3.5wt％的磷酸二氢钾、0.04wt％的硫酸镁和4wt％的硫酸铵；
优选地，所述种子液经以下步骤得到：取所述木霉在PDA固体培养基上活化产孢后的孢子至PDB液体培养基中，于27-31℃的条件下摇床培养3-5天；
优选地，所述种子液中的菌活为0.15-0.3cfu/mL；
优选地，所述PDB液体培养基的组成包括：去皮马铃薯200.0g、葡萄糖20.0g以及蒸馏水1000mL。
7.一种微生物肥料，其特征在于，所述微生物肥料含有如权利要求1所述的木霉、权利要求3所述的木霉孢子悬液和权利要求5所述的木霉发酵菌粉中的至少一种。
8.一种生物农药，其特征在于，所述生物农药含有如权利要求1所述的木霉、权利要求3所述的木霉孢子悬液和权利要求5所述的木霉发酵菌粉中的至少一种。
9.如权利要求1所述的木霉、权利要求3所述的木霉孢子悬液、权利要求5所述的木霉发酵菌粉、权利要求7所述的微生物肥料或权利要求8所述的生物农药在防治作物土传病害中的应用；
优选地，所述防治作物土传病害为防治作物在酸碱盐胁迫环境中的土传病害；
优选地，所述土传病害为病原菌引起的病害；
优选地，所述病原菌包括立枯丝核菌、禾谷镰孢菌、亚洲镰孢菌和尖孢镰刀菌中的至少一种；
优选地，所述病害包括立枯病、根腐病、茎基腐病和枯萎病中的至少一种。
10.如权利要求1所述的木霉、权利要求3所述的木霉孢子悬液和权利要求5所述的木霉发酵菌粉、权利要求7所述的微生物肥料或权利要求8所述的生物农药在促进蔬果生长中的应用；
优选地，所述蔬果包括西红柿、圣女果和草莓中的任意一种。
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