CN111394261A

CN111394261A - 一株耐盐碱拟棘孢木霉及其应用

Info

Publication number: CN111394261A
Application number: CN202010378203.XA
Authority: CN
Inventors: 丁明月; 蔡枫; 陈巍; 伊瑞娜·杜鲁兹尼娜
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2020-05-07
Filing date: 2020-05-07
Publication date: 2020-07-10
Anticipated expiration: 2040-05-07
Also published as: CN111394261B

Abstract

本发明公开了一株耐盐碱拟棘孢木霉及其应用。拟棘孢木霉(Trichoderma asperelloides)TUCIM 10320，于2020年4月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 19612。拟棘孢木霉TUCIM 10320可耐受1.5M(即8％)盐浓度引起的盐胁迫和pH值达9.0的碱胁迫，具有较好的耐盐碱能力。在不同盐浓度胁迫下，拟棘孢木霉TUCIM 10320解除盐对植物生长抑制作用的影响，相对于不接菌对照，接种TUCIM 10320在NaCl含量0.5％和0.75％条件下分别提高作物生物量30％和62％，促进作物根系伸长，侧根分化。

Description

一株耐盐碱拟棘孢木霉及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一株耐盐碱拟棘孢木霉及其应用。

背景技术

我国有15亿亩左右的盐土，是我国主要的后备土地资源，随着其自然脱盐碱和人为改良速度的加快，盐土的农业利用成为我国农业科技和生产中的重要组成部分。但由于盐土有机质含量低，理化性状差，微生物类群少，对作物有害的阴、阳离子多，土壤溶液渗透压高，最终导致作物不易扎根立苗，因此如何促进植物根系在盐土生长为其中关键技术。

木霉(Trichoderma spp.)属于子囊菌门(Ascomycota)肉座菌目(Hypocreales)，是一类普遍存在且易于分离的丝状真菌，广泛存在于土壤、根际、种子、腐木等生态环境中。某些木霉菌可以通过分泌类植物激素、活化土壤矿物养分等机制促进植物生长，同时可诱导植物抗性提高各种氧化酶活性缓减盐碱胁迫对植物细胞的伤害，并且木霉菌可寄生多种植物病原真菌，因此筛选得到一株能抵抗盐碱胁迫、促进植物生长的木霉菌株，对盐碱地的农业开发和资源利用具有重要意义，为盐碱土壤可持续发展提供技术支撑。

发明内容

本发明的目的在于提供一株耐盐碱拟棘孢木霉TUCIM 10320。

本发明的另一目的是提供拟棘孢木霉TUCIM 10320的菌剂。

本发明的又一目的是提供拟棘孢木霉TUCIM 10320及其菌剂的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一株耐盐碱拟棘孢木霉(Trichoderma asperelloides)TUCIM 10320，分离自江苏大丰港滨海滩涂湿地，于2020年4月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.19612。

拟棘孢木霉TUCIM 10320可耐受1.5M(即8％)盐浓度引起的盐胁迫和pH值达9.0的碱胁迫，具有较好的耐盐碱能力。

在不同盐浓度胁迫下，拟棘孢木霉TUCIM 10320解除盐对植物生长抑制作用的影响，相对于不接菌对照，接种TUCIM 10320在NaCl含量0.5％和0.75％条件下分别提高作物生物量30％和62％，促进作物根系伸长，侧根分化。

所述的拟棘孢木霉(Trichoderma asperelloides)TUCIM 10320在拮抗病原真菌中的应用；所述的病原真菌选自拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsis fici)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、链格孢菌(Alternariaalternata)、大茎点霉菌(Macrophoma sp.)中的一种或多种。

所述的拟棘孢木霉(Trichoderma asperelloides)TUCIM 10320在解除盐对作物生长抑制中的应用。

所述的拟棘孢木霉(Trichoderma asperelloides)TUCIM 10320在促进盐碱地作物生长、防治盐碱地作物病原真菌病害中的应用；所述的病原真菌选自拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsis fici)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、链格孢菌(Alternaria alternata)、大茎点霉菌(Macrophoma sp.)中的一种或多种。

由所述的拟棘孢木霉(Trichoderma asperelloides)TUCIM 10320制备的菌剂。

所述的菌剂在拮抗病原真菌中的应用；所述的病原真菌选自拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsis fici)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、链格孢菌(Alternaria alternata)、大茎点霉菌(Macrophoma sp.)中的一种或多种。

所述的菌剂在解除盐对作物生长抑制中的应用。

所述的菌剂在促进盐碱地作物生长、防治盐碱地作物病原真菌病害中的应用；所述的病原真菌选自拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsis fici)、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、链格孢菌(Alternaria alternata)、大茎点霉菌(Macrophoma sp.)中的一种或多种。

本发明的有益效果：

本发明所提供的拟棘孢木霉菌株TUCIM 10320具有拮抗多种病原真菌、耐盐碱以及解除盐对作物生长抑制作用的效果。

附图说明

图1拟棘孢木霉TUCIM 10320的进化树。

由进化树可知拟棘孢木霉(Trichoderma asperelloides)TUCIM 10320与棘孢木霉(Trichoderma asperellum)在分类学上属于不同的种。

图2为本发明拟棘孢木霉TUCIM 10320对多种植物病原菌的抑制作用。

图3为本发明拟棘孢木霉TUCIM 10320的耐盐碱能力。

图4为不同盐浓度胁迫下，本发明拟棘孢木霉TUCIM 10320对番茄幼苗生长的促进作用。

图5为不同盐浓度胁迫下，本发明拟棘孢木霉TUCIM 10320对番茄幼苗根系生长的促进作用。

生物材料保藏信息

TUCIM 10320,分类命名为Trichoderma asperelloides，于2020年4月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.19612。

具体实施方式：

实施例1：拟棘孢木霉TUCIM 10320分离鉴定

拟棘孢木霉TUCIM 10320分离自江苏大丰港滨海滩涂地芦苇的根际土壤，该菌株在PDA培养基28℃下培养72h即能长满直径9cm平板，气生菌丝呈白色长绒毛状，菌落正面产生大量深绿色分生孢子。经形态鉴定和基于ITS、rpb2、tef1基因片段的分子鉴定，该菌株为拟棘孢木霉(Trichoderma asperelloides)，最终命名为拟棘孢木霉TUCIM 10320,进化树见图1。

该拟棘孢木霉筛选于滨海盐土，对当地环境友好；产孢量大，便于进行农业生产利用，且土著木霉菌在本土应用适应能力强，更容易发挥作用。

TUCIM 10320的ITS序列如SEQ ID NO.1所示，rpb2序列如SEQ ID NO.2所示，tef1序列如SEQ ID NO.3所示。

实施例2：拟棘孢木霉TUCIM 10320的耐盐碱能力

芦苇可在含盐量为1.5％、pH＝8.5的滨海盐土中正常生长，因此从芦苇的根际土壤样本中分离出的木霉耐受高盐高碱环境的可能性很大。从筛选的木霉中挑选生长快、产孢多的菌株进行NaCl和pH耐受试验如下：

2.1耐盐试验：

以拟棘孢木霉TUCIM 10320菌株要主要研究对象，另选2株生长快、产孢多木霉菌株一同进行耐盐试验。将三个菌分别同时接种到PDA平板上，28℃培养7d，产生大量分生孢子后，在无菌条件下，刮取孢子并用无菌水稀释到OD₆₀₀＝0.1。先将含有不同NaCl浓度(0M、0.5M、1M、1.5M)的PDB培养基(马铃薯葡萄糖培养基，不含琼脂)分装到96孔板的每个孔中，每个孔中含有198μl培养基，然后每个孔再添加2μl已稀释到OD₆₀₀＝0.1的分生孢子悬浮液，设置8个重复。在25℃恒温黑暗条件下培养，并用酶标仪分别在12、24、36、48、60、72、84、96、120、144、168h测量750nm(菌丝生长)下的OD值(光密度)。

2.2耐碱试验

与耐盐试验所选木霉菌株一致，同时接种到PDA平板上，28℃培养7d，产生大量分生孢子后，在无菌条件下，刮取孢子并用无菌水稀释到OD₆₀₀＝0.1，先将不同pH(5.0、7.0、8.0、9.0)的30％的Murashige Skoog培养基(不含琼脂)分装到96孔板的每个孔中，每个孔中含有198μl培养基，然后每个孔再添加2μl已稀释到OD₆₀₀＝0.1的分生孢子悬浮液，设置8个重复在25℃恒温黑暗条件下培养，并用酶标仪分别在12、24、36、48、60、72、84、96、120、144、168h测量750nm(菌丝生长)下的OD值(光密度)。

2.3试验结果

拟棘孢木霉TUCIM 10320在耐盐和耐碱两方面均表现较好(图2)，可耐受NaCl浓度达1.5M(即8％)引起的盐胁迫，并可耐受pH值高达9.0的碱胁迫，这将为盐碱地生物菌株的改良提供良好的生物材料。

实施例3：拟棘孢木霉TUCIM 10320对多种植物病原真菌的抑制作用

选择5种植物病原真菌，包括拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsis fici TUCIM 5788)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani TUCIM 3753)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum TUCIM4848)、链格孢菌(Alternaria alternata TUCIM 10233)、大茎点霉菌(Macrophomasp.TUCIM 10254)，将上述植物病原菌用灭菌打孔器取直径约5mm大小的菌块分别接种在9cm的PDA平板一侧，24h后接种拟棘孢木霉TUCIM 10320于平板另一侧，在25℃下黑暗培养14d，拍照记录真菌对峙情况。

结果显示(图3)，拟棘孢木霉TUCIM 10320可以抑制大茎点霉菌、链格孢菌、立枯丝核菌菌落的生长，使其菌落半径限制在1-1.5cm，并完全覆盖住这三株病原真菌的菌落，于其菌落上产生少量木霉孢子；拟棘孢木霉TUCIM 10320完全覆盖尖孢镰刀菌的菌落，明显重寄生现象，并在尖孢镰刀菌菌落上产生大量木霉绿色孢子；拟棘孢木霉TUCIM 10320与拟盘多毛孢菌产生拮抗，限制其菌落进一步长大，但木霉不在其菌落表面产孢。这有助于通过木霉菌对土传真菌病害进行生物防治。

实施例4：不同盐浓度胁迫下拟棘孢木霉TUCIM 10320对番茄幼苗的促生作用

4.1供试材料：拟棘孢木霉TUCIM 10320；番茄种子(上海合作903)

4.2试验方法：

4.2.1孢子悬浮液制备：

将拟棘孢木霉TUCIM 10320菌株接种于PDA培养基上，培养7d至完全产孢，刮取孢子，用去离子水将孢子悬浮液浓度调至10⁸cfu ml^-1。

4.2.2育苗：

将番茄种子放在30℃恒温条件下浸泡2h，再用2％的H₂O₂浸泡2min，然后将种子置于铺有两层湿润滤纸的培养皿上，放在28℃条件下催芽。将发芽均匀的种子种在基质中，3周左右长至两叶一心待用。

4.2.3移苗：

将1-3mm蛭石和1-3mm珍珠岩1：1混合置于600ml的塑料盆钵中，250g每钵，选取长势一致的番茄幼苗移栽到含基质的盆钵中，定植7d后进行木霉孢子悬液灌根处理，每株番茄幼苗根部接种2.5ml浓度为10⁶cfu ml^-1的孢子悬浮液，同时浇灌含有NaCl的MurashigeSkoog营养液，不同处理的培养基质NaCl浓度分别控制在0.00％、0.5％、0.75％。

4.2.4考苗：

培育6周后对番茄植株的生长情况进行测量，测定其SPAD值(表征光合作用强度)、株高、植株鲜重、植株干重等指标，并对番茄苗根系进行扫描分析其总根长、根围、根尖数量。

4.3试验结果：

不同程度盐胁迫下，接种拟棘孢木霉TUCIM 10320处理的番茄苗长势明显优于不接菌的对照处理(表1、图4)。在盐胁迫下，对照处理CK的番茄苗叶片发黄、背面发紫、蜡质严重，茎秆细长，根系弱；而接种拟棘孢木霉TUCIM 10320的处理叶片翠绿、蜡质情况较轻，茎秆粗壮，根系发达(图5)。

表1不同盐浓度胁迫下拟棘孢木霉TUCIM 10320对番茄幼苗的促生作用

以未接种木霉菌株的处理CK为对照，处理组每株番茄幼苗根部接种2.5ml浓度为10⁶cfu ml^-1的拟棘孢木霉TUCIM 10320的孢子悬浮液。平均值±标准偏差(n＝12)。具有相同字母的处理间无显着差异(p＝0.05)。

这充分说明不同盐浓度胁迫下拟棘孢木霉TUCIM 10320对植物均具有较强的促生能力，相对于不接菌对照，接种TUCIM 10320可提高作物生物量30％以上。而且TUCIM 10320本身筛选自滨海盐土，能适应沿海滩涂地区的土壤环境，对滩涂农业发展具有实际意义。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一株耐盐碱拟棘孢木霉及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

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<212> DNA

<213> 拟棘孢木霉(Trichoderma asperelloides)

<400> 1

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<400> 2

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Claims

1.一株耐盐碱拟棘孢木霉(Trichoderma asperelloides)TUCIM 10320，于2020年4月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.19612。

2.权利要求1所述的拟棘孢木霉(Trichoderma asperelloides)TUCIM 10320在拮抗病原真菌中的应用；所述的病原真菌选自拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsis fici)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、链格孢菌(Alternariaalternata)、大茎点霉菌(Macrophoma sp.)中的一种或多种。

3.权利要求1所述的拟棘孢木霉(Trichoderma asperelloides)TUCIM 10320在解除盐对作物生长抑制中的应用。

4.权利要求1所述的拟棘孢木霉(Trichoderma asperelloides)TUCIM 10320在促进盐碱地作物生长、防治盐碱地作物病原真菌病害中的应用；所述的病原真菌选自拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsis fici)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、链格孢菌(Alternaria alternata)、大茎点霉菌(Macrophoma sp.)中的一种或多种。

5.由权利要求1所述的拟棘孢木霉(Trichoderma asperelloides)TUCIM 10320制备的菌剂。

6.权利要求5所述的菌剂在拮抗病原真菌中的应用；所述的病原真菌选自拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsis fici)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、链格孢菌(Alternaria alternata)、大茎点霉菌(Macrophoma sp.)中的一种或多种。

7.权利要求5所述的菌剂在解除盐对作物生长抑制中的应用。

8.权利要求5所述的菌剂在促进盐碱地作物生长、防治盐碱地作物病原真菌病害中的应用；所述的病原真菌选自拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsis fici)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、链格孢菌(Alternariaalternata)、大茎点霉菌(Macrophoma sp.)中的一种或多种。