CN115851447A

CN115851447A - 一株促进杉木植株磷吸收的内生胶孢炭疽菌s28

Info

Publication number: CN115851447A
Application number: CN202210552160.1A
Authority: CN
Inventors: 洪滔; 李勇; 颜欢欢; 何俊; 汤智德; 谢安强
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2022-05-21
Filing date: 2022-05-21
Publication date: 2023-03-28
Anticipated expiration: 2042-05-21
Also published as: CN115851447B

Abstract

本发明公开了一株促进杉木植株磷吸收的内生胶孢炭疽菌S28，属于微生物技术领域。所述菌株分类命名为胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides），已于2020年1月7日登记保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19363。试验表明，该内生胶孢炭疽菌S28能在低磷环境下促进杉木幼苗的生长，提高幼苗对低磷环境的适应性。

Description

一株促进杉木植株磷吸收的内生胶孢炭疽菌S28

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株促进杉木植株磷吸收的内生胶孢炭疽菌S28。

背景技术

杉木（Cunninghamia lanceolata），是中国南方最常见的树种，也是人工林和经济林的主要树种，生长面积大，分别占中国和世界森林林木面积的18%和5%。生长快，品质好，产量高，这是杉木的三大特点，因此可以作为亚热带森林中最具优势的经济树种。杉木人工林和经济林造林面积日益增加，同一块地上对杉木进行多代连栽，导致了土地营养肥力减弱和生产力下降，发生了严重的“第二代效应”。此外，人工林的营林、管理维护措施不当，也会导致林地营养和地力的衰退，进而导致杉木质量和产量下降，造成了生态破坏和巨大的经济损失。

据科学家估计，世界中分布分微生物种类超过了900万，微生物数量大，生活范围广，内生菌更是如此，基本上各种植物体内（包括了藻类、苔藓类、蕨类等低等植物，高等裸子植物和被子植物）都存在内生真菌，从目前的研究情况来看，只有极少部分的微生物被认识和研究。内生菌不仅数量大，研究发现对某一种植物内生菌进行分离和纯化工作，最终可以得到近百种，甚至超多百种的内生真菌，运用高通量测序手段能够得到更加全面和详细的内生菌种类和分布特点；并且在植物中分布更广，根部、根际土壤、茎部、叶片和果实等部位，经研究发现，这些部位均可分离纯化出内生菌，只是数量有差异，这个与内生菌分布的普遍性和在植物体内分布的特异性有关。子囊菌（Sac fungi）、担子菌（basidiomycete）、接合菌（Zygomycotina）、有孢子菌（Mitoporic fungi）和无孢菌（Mycelia sterile）等内生真菌被逐步研究发现出来。

植物内生菌在植物体内生存时，与宿主植物保持了较为一致的生命活动周期，在物质和能量进行交换，并且在生命周期内能够发挥一定的生理作用。研究发现，内生菌能够对植物的生长发育或其他生理活性具有影响作用，其中根部作为与土壤交换界面，微生物、根际微生物的效应最为明显；叶片是呼吸和光合效应的场所、与外界环境接触，受到内生菌的影响较根部弱；茎干因起到支撑、物质运输等作用，内生菌的生存数量较少。经过研究，内生菌具有促生菌、固氮菌、益生菌和生防菌等多种功能，共同影响植物的生长发育。影响方式不仅是内生菌自身作为调节因子起作用，还可以通过其代谢产物等方式起到影响作用。内生菌在不同组织器官中生活，与宿主植物形成了物质能量交换关系，因此，内生菌具有特定性、多样性等特点，因植物体内特定的生活环境和条件的不同，具有不同的功能和效应。

发明内容

本发明的目的在于提供一株能促进杉木植株磷吸收的内生胶孢炭疽菌S28。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明首先提供了一株能促进杉木植株磷吸收的内生胶孢炭疽菌S28，所述菌株分类命名为胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides），已于2020年1月7日登记保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19363，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

进一步的，本发明提供的内生胶孢炭疽菌S28的菌落形态及菌体形态为：在PDA培养基上的菌落呈白色色，绒毛状，气生菌丝发达；分生孢子梗无色，单个分生孢子无色、单孢，形态为长圆柱形或椭圆形，内含几个油球，大小不同。

进一步的，本发明提供的内生胶孢炭疽菌S28是从杉木植株中分离纯化得到的，具体的分离纯化方法为：

1）样品预处理：将采集得到的根、茎、叶组织样品分别用纯水清洗干净，用脱脂棉或者纸巾吸取样品表面水分，分装到自封袋内，于4℃冰箱保存；

2）外植体消毒：75%酒精浸泡1min→无菌水冲洗3次→2%次氯酸钠浸泡3min→无菌水冲洗3次；

3）消毒效果的验证：将消毒最后一步清洗样品的无菌水涂布于PDA培养基上， 28℃恒温培养5天，若无菌体长出则为消毒干净，如有菌落生成，则表明样品表面消毒不彻底，需继续调整消毒方法；

4）接种：使用解剖刀分别将消毒后的外植体沿横切面切成小块状，将切好的组织分别铺放在PDA培养基表面，于28℃恒温培养7天后，用接种针挑取组织周围菌落生长良好的菌丝，分别于新的PDA培养基上采用划线法进行菌株纯化，28℃恒温培养5天，反复纯化3~4次，得到纯化菌株，将纯化后的菌株接入PDA斜面培养基，于4℃保存。

本发明还提供了上述一株内生胶孢炭疽菌S28在低磷环境下杉木幼苗种植中的应用。

进一步的，上述一株内生胶孢炭疽菌S28在杉木种植中的应用的方式为：将内生胶孢炭疽菌S28的菌液通过杉木幼苗顶端施浇的方式用于低磷环境下杉木幼苗的种植。

本发明的显著优点在于：在现实生产中由于大量施肥产生的营养物质流失，造成大量水域富营养化，同时导致造林营林的成本提高。利用菌株接种的方式可提高植株苗木的抗逆性，提高植株的养分吸收效率。由于本发明所采用的菌株S28取自自然环境条件下生长健壮的杉木植株，几乎不对环境产生任何危害，但能在低磷环境下促进杉木幼苗的生长，提高幼苗对低磷环境的适应性，是未来杉木植株种植过程中的一个优良的“菌肥”。

附图说明

图1为PCR扩增得到的目的条带。

图2为胶孢炭疽菌S28的系统发育树。

图3为胶孢炭疽菌S28在杉木幼苗根系中的定殖情况。

图4为低磷环境下胶孢炭疽菌S28对杉木幼苗根冠比的影响。

图5为低磷环境下胶孢炭疽菌S28对杉木幼苗叶片叶绿素含量的影响。

图6为低磷环境下胶孢炭疽菌S28对杉木幼苗叶片叶绿素荧光特性的影响。

图7为低磷环境下胶孢炭疽菌S28对杉木幼苗叶片过氧化物酶活性的影响。

图8为低磷环境下胶孢炭疽菌S28对杉木幼苗叶片酸性磷酸酶活性的影响。

图9为低磷环境下胶孢炭疽菌S28对杉木幼苗根系酸性磷酸酶活性的影响。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

实施例1 内生胶孢炭疽菌S28的分离纯化

1）样品预处理：将采集得到的根、茎、叶组织样品分别用纯水清洗干净，用脱脂棉或者纸巾吸取样品表面水分，分装到自封袋内，于4℃冰箱保存。

2）外植体表面消毒：75%酒精浸泡1min→无菌水冲洗3次→2%次氯酸钠浸泡3min→无菌水冲洗3次。

3）消毒效果的验证：将消毒最后一步清洗样品的无菌水涂布于PDA培养基上，28℃恒温培养5天，若无菌体长出则为消毒干净，如有菌落生成，则表明样品表面消毒不彻底，需继续调整消毒灭菌时间。

4）接种：使用解剖刀分别将消毒后的外植体沿横切面切成小块状，将切好的组织分别铺放在PDA培养基表面，于28℃恒温培养7天后，用接种针挑取组织周围菌落生长良好的菌丝，分别于新的PDA培养基上采用划线法进行菌株纯化，28℃恒温培养5天，反复纯化3~4次，得到纯化菌株。与此同时，在培养的过程中做好观察、记录和拍照工作。

5）保存：将纯化后的菌株接入PDA斜面培养基，于4℃保存。此外，保证每3个月对斜面进行转接工作。

6）筛选：

平板初筛：将活化后的菌株接种于NBRIP培养基，28℃恒温培养7d，每个菌株3个重复，根据平板内透明圈的大小初步筛选具有解磷能力的菌株；

摇瓶复筛：将活化后的菌株接种于NBRIP液体培养基，28℃、180r/min摇床培养7d，用无菌移液器吸取2mL菌液于50mL容量瓶中，采用钼蓝比色法测定菌液内有效P含量，得到目标菌株，将该菌株命名为S28，每个菌株3个重复，以不接菌的NBRIP液体培养基作为对照。

7）分子生物学鉴定：

菌株总DNA的提取：将目标菌株活化后，采用使用OMEGA公司的Fungal DNA MiniKit试剂盒提取菌株的总DNA，然后采用TIANGEN公司的Unversal DNA Purification Kit试剂盒进行DNA的纯化回收，将提取好的DNA样品放在-20℃的冰箱中保存备用；

菌株ITS rDNA的PCR扩增：以上述提取的DNA样品为模板，利用真菌18S rDNA通用引物ITS1和ITRS4扩增目标菌株的ITS序列，引物ITS1和ITRS4序列为：

ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，

ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'；

PCR反应体系为：

PCR反应程序为：

PCR产物回收：PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，割取目的条带（图1），用天根回收试剂盒（DP214-03）进行纯化回收，进行测序；

ITS序列对比及系统发育树构建：将所得ITS rDNA序列（SEQ ID NO.1）提交NCBI数据库进行序列对比分析，用BLAST程序对该程序序列与数据库中的序列进行同源性比较，选取具有较高同源性的序列用Clustal X和MEGA软件对需要进行绘制系统发育树的序列进行比对，再采用Neighbor-Joining法构建系统发育树（图2）；结果表明，菌株S28与Colletotrichum gloeosporioides isolate CgloTIN10（KJ676455.1）的亲缘关系最近，同源性99%，形成一个族群，可初步判定分离得到的菌株S28为胶孢炭疽菌。

实施例2

菌液制备：将活化后的胶孢炭疽菌S28接入500mL的PDB液体培养基中，放于恒温振荡培养箱中于28℃、180r/min条件下摇培3-4天，使用血球计数板计算菌液浓度，将培养后的菌液用无菌水稀释成浓度为5.5×10⁶ cfu/mL。

本试验采用土培盆栽试验，试验所选用杉木幼苗为生长健壮、无病害的020号无性系杉木幼苗，由福建省林业科学研究院提供。栽植所用花盆规格为直径20厘米、高40厘米，所用土壤是经过甲醛熏蒸灭菌后的黄心土，栽植时，严格控制每盆土的质量为4kg，实验所用的土壤养分含量为：有机质：20.5612 mg/g；全氮含量：0.3054 mg/g；水解氮含量：0.1205mg/g；全磷含量：0.4105 mg/g；有效磷含量：0.0051 mg/g。

在2018年3月10日对杉木幼苗进行定植，然后保证2个月的恢复性生长。于2018年5月12日开始接菌，连续3天于杉木幼苗顶端施浇100mL制备好的菌液，确保植株叶片、茎干、根部以及土壤中均有菌液，以蒸馏水处理为空白对照。

采用KH₂PO₄来设置胁迫梯度，本实验设置4个磷胁迫梯度（正常条件18mg/kg、轻度胁迫12 mg/kg、中度胁迫6 mg/kg、重度胁迫0 mg/kg），各个胁迫梯度设置3个重复。磷胁迫于2018年7月1日、7月2日和7月3日分三次进行。实验过程中，保证水分和其他营养元素的充足。在实验过程中，按时测定收集各项指标数据。

测定指标：

内生真菌定殖检测：取接种胶孢炭疽菌S28后第15天的杉木幼苗根系，以台盼蓝为染料，对根系样品进行染色，在光学显微镜下观察侵染结构。由图3可知，在杉木根系细胞中可观察到内生真菌S28的菌丝，该结果表明，在施浇胶孢炭疽菌S28菌液后的第15天，胶孢炭疽菌S28在杉木幼苗根部定殖成功。

苗高地径测定：分别在接种胶孢炭疽菌S28后第15天、第30天、第45天、第60天用钢尺测定苗高，用数显游标卡尺测定地径。结果如表1和表2所示，胶孢炭疽菌S28在低磷胁迫下可有效促进杉木幼苗苗高和地径的增长；正常条件下，接种胶孢炭疽菌S28的杉木幼苗的苗高和地径在胁迫期间总增长率分别为14.91%和28.43%，明显大于对照组；轻度胁迫条件下，接种胶孢炭疽菌S28的杉木幼苗的苗高和地径在胁迫期间总增长率分别为8.22%和27.79%，明显大于对照组；中度胁迫条件下，接种胶孢炭疽菌S28的杉木幼苗的苗高和地径在胁迫期间总增长率分别为4.82%和21.35%，明显大于对照组；重度胁迫条件下，接种胶孢炭疽菌S28的杉木幼苗的苗高和地径在胁迫期间总增长率分别为9.48%和23.28%，明显大于对照组。

表1 胶孢炭疽菌S28对杉木幼苗苗高的影响

表2 胶孢炭疽菌S28对杉木幼苗地径的影响

根冠比测定：取接种胶孢炭疽菌S28后第60天的杉木幼苗，将植株的地上部和地下部剪碎烘干后测定生物量，计算根冠比；根系为地下部分；茎和叶为地上部分。结果如图4所示，胶孢炭疽菌S28对低磷胁迫下杉木幼苗的根冠比有较大影响；在正常条件、轻度胁迫及重度胁迫条件下，接种胶孢炭疽菌S28的杉木幼苗的根冠比均大于对照组。

叶绿素含量测定：取接种胶孢炭疽菌S28后第60天的杉木幼苗，采用丙酮乙醇提取法测定叶片叶绿素含量。结果如图5所示，在正常条件、轻度胁迫及重度胁迫条件下，与对照组相比，接种胶孢炭疽菌S28的杉木幼苗的叶绿素含量均有所增加。

叶绿素荧光特性测定：取接种胶孢炭疽菌S28后第60天的杉木幼苗，于太阳光充足、光源稳定的上午9-11点，使用Handy Fluor Cam荧光成像仪测定叶绿素荧光特性。结果如图6所示，在轻度胁迫、中度胁迫及重度胁迫条件下，接种胶孢炭疽菌S28的杉木幼苗的初始荧光参数Fo在胁迫后期（接种后第60天）均低于对照组，能够有效缓解光抑制程度。

抗氧化酶活性测定：取接种胶孢炭疽菌S28后第60天的杉木幼苗，采用愈创木酚法测定植株叶片过氧化物酶（POD）活性。结果如图7所示，在轻度胁迫、中度胁迫及重度胁迫条件下，接种胶孢炭疽菌S28能提高杉木幼苗的过氧化物酶（POD）活性，使植物更好的适应低磷环境。

酸性磷酸酶活性测定：取接种胶孢炭疽菌S28后第15天、第30天、第45天、第60天的杉木幼苗，采用南京建成生物工程研究所酸性磷酸酶（ACP）测定试剂盒测定叶片、根系酸性磷酸酶活性。结果如图8~9所示，在正常条件、轻度胁迫、中度胁迫及重度胁迫条件下，接种胶孢炭疽菌S28能提高杉木幼苗定叶片、根系的酸性磷酸酶活性，促进植株更加有效的吸收利用土壤中的磷元素，以适应低磷环境。

磷含量测定：取接种胶孢炭疽菌S28后第60天的杉木幼苗，采用钼锑抗比色法测定植株地上部磷含量。结果如表3所示，在正常条件下，接种胶孢炭疽菌S28的杉木幼苗地上部磷元素含量较对照组高出75.48%；在轻度胁迫条件下，接种胶孢炭疽菌S28的杉木幼苗地上部磷元素含量较对照组高出18.02%；在中度胁迫条件下，接种胶孢炭疽菌S28的杉木幼苗地上部磷元素含量较对照组高出14.86%；在重度胁迫条件下，接种胶孢炭疽菌S28的杉木幼苗地上部部磷元素含量较对照组高出160.61%。因此，在低磷环境下，通过给杉木施浇内生胶孢炭疽菌S28菌液，可以提高杉木的磷含量，促进杉木生长，提高杉木的适应性，抵御外界不良环境。

表3 胶孢炭疽菌S28对杉木幼苗磷含量的影响

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 一株促进杉木植株磷吸收的内生胶孢炭疽菌S28

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 576

<212> DNA

<213> Colletotrichum gloeosporioides

<400> 1

ttctgtaggt gaacctgcgg agggatcatt actgagttta cgctctacaa ccctttgtga 60

acatacctat aactgttgct tcggcgggta gggtctccgt gaccctcccg gcctcccgcc 120

cccgggcggg tcggcgcccg ccggaggata accaaactct gatttaacga cgtttcttct 180

gagtggtaca agcaaataat caaaactttt aacaacggat ctcttggttc tggcatcgat 240

gaagaacgca gcgaaatgcg ataagtaatg tgaattgcag aattcagtga atcatcgaat 300

ctttgaacgc acattgcgcc cgccagcatt ctggcgggca tgcctgttcg agcgtcattt 360

caaccctcaa gctctgcttg gtgttggggc cctacagctg atgtaggccc tcaaaggtag 420

tggcggaccc tcccggagcc tcctttgcgt agtaacttta cgtctcgcac tgggatccgg 480

agggactctt gccgtaaaac ccccaatttt ccaaaggttg acctcggatc aggtaggaat 540

acccgctgaa cttaagcata tcaataagca gaggaa 576

Claims

1.一株促进杉木植株磷吸收的内生胶孢炭疽菌S28，其特征在于：所述菌株分类命名为胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides），已于2020年1月7日登记保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19363，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

2.如权利要求1所述的内生胶孢炭疽菌S28在低磷环境下杉木幼苗种植中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：将内生胶孢炭疽菌S28的菌液通过杉木幼苗顶端施浇的方式用于低磷环境下杉木幼苗的种植。