CN110643539B

CN110643539B - 解淀粉芽孢杆菌及其用途及其菌剂的制备方法

Info

Publication number: CN110643539B
Application number: CN201911006915.2A
Authority: CN
Inventors: 谭寿湖; 张琦敏; 林振业; 马金霞; 梁春吉
Original assignee: Guangxi Jinsui Ecology Technology Co ltd
Current assignee: Guangxi Jinsui Ecology Technology Co ltd
Priority date: 2019-10-22
Filing date: 2019-10-22
Publication date: 2023-03-24
Anticipated expiration: 2039-10-22
Also published as: CN110643539A

Abstract

本发明提供一种解淀粉芽孢杆菌，所述解淀粉芽孢杆菌2019年9月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称FB1‑5，保藏号CGMCC No.18482。本发明还提供了解淀粉芽孢杆菌的用途及其菌剂的制备方法。本发明提供的解淀粉芽孢杆菌具有抑制病原真菌的生长，促进根系发育，加快植株生长，缩短生长周期，提早开花坐果，增加产量等特点。

Description

解淀粉芽孢杆菌及其用途及其菌剂的制备方法

技术领域

本发明涉及微生物领域。更具体地说，本发明涉及一种解淀粉芽孢杆菌及其用途及其菌剂制备方法。

背景技术

微生物肥料是指含有特定微生物活体的制品，应用于农业生产，通过其中所含微生物的生命活动，以增加植物养分的供应量或促进植物生长，提高产量，改善农产品品质及农业生态环境。微生物肥料发挥功效的关键是其中所含微生物菌株的性能及数量，为此，微生物肥料产品要求标明有效活菌的菌种名称及数量。即便如此，同种微生物不同的菌株，其功能也不一样，如解淀粉芽孢杆菌，有的菌株具有防病功能，有的具有促生长功能，有的具产蛋白酶功能等，不同的菌株都有着不同的功能和用途。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种解淀粉芽孢杆菌，其能够抑制病原真菌的生长、促进农作物的生根、生长以及产量的增加。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种解淀粉芽孢杆菌，所述解淀粉芽孢杆菌2019年9月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称FB1-5，保藏号CGMCC No.18482。

优选的是，所述解淀粉芽孢杆菌用于抑制病原真菌的生长。

优选的是，所述解淀粉芽孢杆菌用于抑制病原镰刀菌的生长。

优选的是，所述解淀粉芽孢杆菌用于促进农作物的生长。

优选的是，所述解淀粉芽孢杆菌用于促进果树的生长。

优选的是，所述解淀粉芽孢杆菌用于促进火龙果树的生长。

优选的是，所述解淀粉芽孢杆菌用于提高果树的开花率以及坐果率。

一株解淀粉芽孢杆菌菌剂的制备方法，包括以下步骤：

1)用接种环刮取试管斜面上的单菌落，接种于NB液体培养基中，30-35℃，200-250rmp，摇瓶培养18-24小时，得到种子液；

2)将种子液按体积比0.5-2％的比例接种到扩繁培养基中，30-35℃摇瓶培养18-24小时。

3)将步骤2)扩繁培育的菌种按体积比为1-2％的比例转接到扩繁培养基中进行大规模培养，跟踪检测菌量及芽孢情况，当芽孢率大于90％时，停止发酵培养，得到高密度液体微生物菌剂。

优选的是，所述高密度液体微生物菌剂中的解淀粉芽孢杆菌的菌体密度大于50亿个/mL。

优选的是，步骤3)中，停止发酵培养时，往获得的高密度液体微生物菌剂中添加芸苔素内酯、果糖6磷酸和维生素c，所述芸苔素内酯的质量分数为0.5-1％，所述果糖6磷酸的质量分数为3-5％，所述维生素c的质量分数为0.1-0.5％。

本发明至少包括以下有益效果：本发明提供的解淀粉芽孢杆菌具有抑制病原真菌的生长，促进根系发育，加快植株生长，缩短生长周期，提早开花坐果，增加产量等特点。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明的解淀粉芽孢杆菌的菌落平板图；

图2说明的是本发明的解淀粉芽孢杆菌拮抗镰刀菌的平板图；

图3说明的是解淀粉芽孢杆菌促进火龙果生长的示意图。

具体实施方式

下面对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

从广西南宁市隆安县那桐镇广西金穗农业集团有限公司方村基地健康火龙果根际采集土样，采用“梯度稀释+镰刀菌平板涂布”的初筛方法初筛拮抗菌，具体方法：称取5g土壤，加入带玻璃珠的100ml无菌水中，28℃，200转/分，震荡摇匀40分钟，取土壤悬液1ml进行10^-1-10^-4系列浓度梯度稀释，然后取10^-3,10^-4梯度80ul稀释液，20ul镰刀菌菌液，混合涂布于PDA平板，于28℃倒置培养3天，然后挑取出现抑菌圈的菌落进行划线分离，分出单菌落再通过平板对峙实验对拮抗菌进行复筛，复筛方法：PDA平板上十字交叉画线标记，用打孔器从长满镰刀菌的平板上挖取一块病原菌菌块放置于十字交叉点，在距菌块2.5厘米处3个位置接种拮抗菌，另一个位置不接种作为空白对照，28℃倒置培养5天，观察测试拮抗菌对病原菌的抑菌情况，计算抑菌率。

如图1所示，本发明的解淀粉芽孢杆菌FB1-5的基本生物学特征为：菌落呈乳白色不透明，表面皱褶无光泽，近边沿有一圈凸起，边缘不规则，革兰氏染色呈阳性，杆状，中生芽孢，椭圆形，两端钝圆，水解淀粉和明胶，可利用柠檬酸盐；接触酶呈阳性，氧化酶呈阴性，硝酸盐还原酶呈阳性，甲基红试验呈阴性，V-P试验呈阳性；在pH4-10范围内生长良好，最佳pH指为6.5，在50℃生长良好，7％NaCl浓度下可以生长。

菌株分子鉴定：挑取单菌落接种到NB液体培养基中，培养过夜，采用上海生工《细菌基因组DNA快速抽提试剂盒》提取基因组DNA，交由广州擎科生物技术有限公司完成测序，所得16SrDNA序列如序列表SEQ No.1所示。将序列SEQ No.1在GeneBank数据库进行Blast比对，结果显示：与已知的解淀粉芽孢杆菌16SrDNA序列的同源性＞99％，可认为是同种内不同菌株的解淀粉芽孢杆菌。

本发明的解淀粉芽孢杆菌经形态特征、生理生化反应和16SrDNA序列分析，鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌的一个新菌株，命名为解淀粉芽孢杆菌FB1-5。

本发明的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)已于2019年9月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏名称FB1-5，保藏号CGMCC No18482。

试验一、平板对峙抑菌效果试验

在PDA平板上十字交叉画线标记，用打孔器从长满镰刀菌的平板上挖取一块病原菌菌块放置于十字交叉点，在距菌块2.5厘米处3个位置接种解淀粉芽孢杆菌FB1-5，另一个位置不接种作为空白对照，28℃倒置培养5天，观察拮抗菌对病原菌的抑菌情况。

抑菌率＝(对照组菌落半径－处理组菌落半径)/(对照组菌落半径－菌饼半径)×100％。

如图2所示，本发明的解淀粉芽孢杆菌FB1-5对镰刀菌的抑菌率为67.9％。

试验二、土壤抑菌效果试验

选择pH4.0以上的土壤作为试验用土，过筛，除去大颗粒，备用；用马铃薯土豆培养基(PDA)培养病原镰刀菌，得到含有大量孢子的病原菌菌液；将镰刀菌菌液添加到备用土壤中，搅拌混匀，平均分为A、B两等分，其中A组添加泥土重量比1％的解淀粉芽孢杆菌FB1-5菌剂(菌体密度为100亿/mL)，B组添加泥土重量比1％的解淀粉芽孢杆菌FB1-5菌剂灭活基质。采用稀释涂布法，定期跟踪检测土壤中病原镰刀菌菌量，评价抑菌效果，结果如表1所示。

表1土样病原菌数量变化情况表(cfu/g)

0天

7天

14天

21天

28天

35天

A组

6.3E+5

5.1E+5

2.2E+5

8.5E+4

4.6E+4

1.2E+3

B组

6.1E+5

5.7E+5

9.1E+5

9.8E+5

1.8E+6

2.4+E6

从表1可以看出，添加菌剂的试验组A，土壤病原镰刀菌含量呈明显的下降趋势，而添加灭活菌剂的试验组B，前7天，土壤病原镰刀菌含量先是下降，之后呈线性上升，可能是由于灭活菌剂中含有FB1-5产生的对病原菌有抑制作用的代谢产物，因代谢产物含量不多，仅能短暂抑制病原菌的生长繁殖,7天之后土壤镰刀菌含量呈上升趋势。从试验得出解淀粉芽孢杆菌FB1-5在土壤中可以有效抑制病原镰刀菌的生长。

试验三、解淀粉芽孢杆菌FB1-5促进火龙果生根、生长效果试验

1)解淀粉芽孢杆菌FB1-5微生物菌剂的制备

活化培养基(NB)：牛肉浸膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，pH6.5。

扩繁培养基：糖蜜80g/L，玉米浆干粉10g/L，pH6.5。

2)液体微生物菌剂的制备包括以下步骤：

①菌种活化：用接种环刮取试管斜面上的单菌落，接种于NB液体培养基中，装瓶量100ml/250ml，35℃，200rmp，摇瓶培养18小时，得到种子液。

②一级扩繁培养：将活化种子液按1％(体积比)比例接种到装有10L扩繁培养基中，35℃培养18小时。

③二级扩繁培养：然后按1％(体积比)比例转接到1000L扩繁培养基中进行大规模培养，跟踪检测菌量及芽孢情况，当芽孢率大于90％时，停止发酵培养，得到高密度液体微生物菌剂(100亿/ml)。

3)火龙果盆栽试验：

本试验设4个处理4次重复，随机区组设计。试验安排3个对照组，每个试验组4杯(3株)。

试验设计

处理一：空白对照(不施任何肥料)

处理二：常规施肥(喷施氨基酸水溶肥)

处理三：常规施肥+基质(供试菌剂微波灭菌)

处理四：常规施肥+供试菌剂

试验方法

a)火龙果种子准备：选择成熟火龙果一个，捣烂，除去果肉、果胶，自来水清洗干净种子，晾干，备用；

b)火龙果育苗：28℃催芽48小时，出芽后，均匀撒播于椰糠基质中，再覆盖一薄层椰糠基质，淋水；

c)小苗移栽：出苗后，选择长势基本一致的小苗移栽到装有椰糠的育苗杯中，每杯3株，淋足定根水；

d)实施处理：移栽15天后，小苗长势稳定，按照试验设计实施各组处理，具体为供试肥料稀释500倍，每杯20毫升灌根，15天施用一次。

试验管理

按照常规种植方法进行管理，跟踪观察火龙果生长情况，60天结束时，测量株高、鲜重等指标，另外利用根系扫描仪对根系进行分析，综合评价菌剂促生长效果，结果如表2所示，图3所示。

表2火龙果盆栽各项指标统计表

从火龙果盆栽统计数据可以看出，FB1-5制备的微生物菌剂对火龙果促生效果极为明显，处理四试验组与处理三基质对照组比较，总鲜重增加172.8％，平均株高增加104.9％，总根长增加88.2％，根面积增加221.3％，根体积增加428％，根尖数增加45.1％，分支数增加33.5％，交叉数增加6.96％。

4)解淀粉芽孢杆菌FB1-5田间应用效果试验

试验地点设在广西金穗农业集团长流不息火龙果种植基地。种植土壤为红壤土质，品种为金都1号红心火龙果，供试菌剂为本发明制备的微生物菌剂。试验设置4个处理，3次重复，每个重复10株。

试验设置

处理一：空白对照；

处理二：常规施肥；

处理三：常规施肥+基质；

处理四：常规施肥+供试菌剂。

具体实施方式为：选择地势平坦，枝条扦插苗移栽定植后一个月，长势基本一致的地块作为试验区，随机分组。按照试验设计实施各组处理；

其中，处理一为空白对照，不施任何肥料，其他组施肥时空白对照以等量清水代替；

处理二为常规施肥，按照火龙果常规管理进行；

处理三为在常规施肥的基础上施用供试菌剂经微波灭菌的基质；

处理四为本发明的制备的菌剂，每次使用前进行质量检测。

施用方法为：按每亩用量4升计算，稀释100倍，灌根施用，每个月施用一次。

试验开始后3个月进行第一次生长期观察，发现处理四比其他处理新抽发枝条多且长势旺盛；试验开始后4个月进行第二次观察，发现处理四开始有花苞，其他处理组尚未发现花苞；试验开始后5个月进行第三次观察，发现处理四比其他处理花蕾多且饱满，枝条肥大浓绿。试验进行到第8个月，第一批果成熟，按照每个小区单收、单打、单计产的原则进行采收计产，结果如表3所示。

表3第一批果小区产量统计表单位：千克

由表3可以看出：第一批果，处理四(常规施肥+供试菌剂)比处理一(空白对照)增产2.75千克，增产率283％；处理四比处理二(常规施肥)增产1.39千克，增产率56.97％；处理四比处理三(常规施肥+基质)增产0.81千克，增产率26.82％。

实施例1

一株解淀粉芽孢杆菌菌剂的制备方法，包括以下步骤：

1)用接种环刮取试管斜面上的单菌落，接种于NB液体培养基中，35℃，200rmp，摇瓶培养18小时，得到种子液；

2)将种子液按体积比2％的比例接种到扩繁培养基中，35℃摇瓶培养24小时。

3)将步骤2)扩繁培育的菌种按体积比为1％的比例转接到扩繁培养基中进行大规模培养，跟踪检测菌量及芽孢情况，当芽孢率大于90％时，停止发酵培养，得到高密度液体微生物菌剂。

实施例2

一株解淀粉芽孢杆菌菌剂的制备方法，包括以下步骤：

1)用接种环刮取试管斜面上的单菌落，接种于NB液体培养基中，30℃，250rmp，摇瓶培养18小时，得到种子液；

2)将种子液按体积比1％的比例接种到扩繁培养基中，30℃摇瓶培养18小时。

3)将步骤2)扩繁培育的菌种按体积比为2％的比例转接到扩繁培养基中进行大规模培养，跟踪检测菌量及芽孢情况，当芽孢率大于90％时，停止发酵培养，得到高密度液体微生物菌剂，其中，所述微生物菌剂的菌体密度为100亿/mL。

实施例3

一株解淀粉芽孢杆菌菌剂的制备方法，包括以下步骤：

2)将种子液按体积比1％的比例接种到扩繁培养基中，35℃摇瓶培养18小时。

3)将步骤2)扩繁培育的菌种按体积比为1％的比例转接到扩繁培养基中进行大规模培养，跟踪检测菌量及芽孢情况，当芽孢率大于90％时，停止发酵培养，往发酵培养物中添加芸苔素内酯、果糖6磷酸和维生素c，所述芸苔素内酯的质量分数为0.5％，所述果糖6磷酸的质量分数为3％，所述维生素c的质量分数为0.1％,得到高密度液体微生物菌剂，其中，所述微生物菌剂的菌体密度为100亿/mL。

本发明的解淀粉芽孢杆菌具有促进作物生长的作用，通过添加芸苔素内酯、果糖6磷酸和维生素c不仅能起到协同促进作用生长的作用，还起到了增强作用抗逆性的作用。

对比试验一

分别采用实施例2和实施例3制备的液体微生物菌剂灌根西红柿幼苗。先在温室中培育西红柿幼苗，选取培育好的健康、无病害的西红柿幼苗一共90株，试验分3组，每组30株幼苗，组一根灌实施例2制备的液体微生物菌剂(稀释100倍)；组二根灌实施例3制备的液体微生物菌剂(稀释100倍)；组三灌根灭菌微生物菌剂(稀释100倍)。48小时后，将西红柿幼苗转移至温控培养室中，其中培养室中白天的温度控制为5℃，夜间的温度控制为-1℃，白天与夜间各12h。连续观察西红柿幼苗在温控室中的生长情况。试验结果如表4所示。

表4西红柿冻害观察表

从表4结果可知，在微生物菌剂中添加芸苔素内酯、果糖6磷酸和维生素c，能起到增强植物抗性的作用，避免作物被低温冻伤的作用。

对比试验二

分别采用实施例2和实施例3制备的液体微生物菌剂灌根西红柿幼苗。先在温室中培育西红柿幼苗，选取培育好的健康、无病害的西红柿幼苗一共90株，试验分3组，每组30株幼苗，组A根灌实施例2制备的液体微生物菌剂(稀释100倍)；组B根灌实施例3制备的液体微生物菌剂(稀释100倍)；组C根灌灭菌微生物菌剂(稀释100倍)。48小时后，将西红柿幼苗转移至温控培养室中，其中培养室中白天的温度控制为15℃，夜间的温度控制为10℃，白天与夜间各12h。连续观察西红柿幼苗在温控室中开花时间以及花后采收时间。试验结果如表5所示。

表5西红柿生育期观察表

	组A	组B	组C
				开花时间(d)	73	62	75
采收时间(d)	81	73	80

从表5结果可知，实施例3制备的液体微生物菌剂具有促进西红柿生长，促使西红柿提早开花，缩短果实成熟时间的作用。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。

<110> 广西金穗生态科技股份有限公司

<120>解淀粉芽孢杆菌及其用途及其菌剂的制备方法

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1462

<212> DNA

<213> SEQ No.1

<400> 1

ACACGATATCTGTCACCTTCGGCGGCTGGCTCCATAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCCGCCCTATTTGAACGGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTTATGTCTGAACCATGCGGTTCAGACAACCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCCATCTGTCCGCTCGACTGCATGTATAGCACCCGCCAGTAGGTGC 1462

Claims

1.一种解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌2019年9月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称FB1-5，保藏号CGMCC No.18482。

2.如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌的用途，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌用于促进火龙果树的生长；所述解淀粉芽孢杆菌用于提高果树的开花率、坐果率；所述解淀粉芽孢杆菌用于火龙果树提早开花时间。

3.如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2)将种子液按体积比0.5-2％的比例接种到扩繁培养基中，30-35℃摇瓶培养18-24小时;

3)将步骤2)扩繁培育的菌种按体积比为1-2％的比例转接到扩繁培养基中进行大规模培养，跟踪检测菌量及芽孢情况，当芽孢率大于90％时，停止发酵培养，得到高密度液体微生物菌剂；

停止发酵培养时，往获得的高密度液体微生物菌剂中添加芸苔素内酯、果糖6磷酸和维生素c，所述芸苔素内酯的质量分数为0.5-1％，所述果糖6磷酸的质量分数为3-5％，所述维生素c的质量分数为0.1-0.5％。

4.根据权利要求3所述的解淀粉芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于，所述高密度液体微生物菌剂中的解淀粉芽孢杆菌的菌体密度大于50亿个/mL。