CN109628369A - 一种谷瘟病菌产孢培养基及其制备方法 - Google Patents

一种谷瘟病菌产孢培养基及其制备方法 Download PDF

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李志勇
董志平
全建章
郑直
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Abstract

本发明公开了一种谷瘟病菌产孢培养基及其制备方法，该培养基原料包括生苦荞/麦麸、琼脂和水。该培养基制备方法包括以下步骤：将生苦荞/麦麸加水煮沸，过滤，在滤液中加入琼脂加热融化后加水定容，高温高压灭菌备用；接种前，加热融化培养基，冷却，未凝固前倒入培养皿中。本发明所述培养基配方组分易得、简单合理，培养基配制方法简便、易操作，培养过程不易污染、省时省力。

Description

一种谷瘟病菌产孢培养基及其制备方法
技术领域
本发明涉及植物病原真菌技术领域，尤其涉及一种谷瘟病菌产孢培养基及其制备方法。
背景技术
谷瘟病是严重危害谷子生产的重要病害，进行谷子抗谷瘟病鉴定，筛选抗性材料是培育谷子良种及保证谷子安全生产的前提。但制约谷子抗谷瘟病工作顺利进行的主要因素则是含有大量谷瘟菌分生孢子的接种菌液的制备，能否随时获得大量孢子来配制菌液供田间大量鉴定使用，是制约抗性鉴定工作开展的瓶颈，也是谷子研究工作者急需解决的问题。
谷瘟病病原为灰梨孢菌，寄主植物为谷子、狗尾草。虽然该菌目前的拉丁名与稻瘟菌相同，但二者在培养特性、侵染能力上有很大差异。谷瘟菌不侵染水稻，稻瘟菌也不侵染谷子。相对于稻瘟菌来说从事谷瘟菌研究的单位及科研人员很少，谷瘟菌产孢培养基的研究也多集中在上世纪，目前通常采用高梁粒培养分生孢子。虽然稻瘟菌产孢培养基有较多报道，除高粱外，还有稻节、大麦或小麦种粒等组织培养法，以及燕麦片培养基、米糠培养基、粗面粉培养基、玉米粉培养基、酵母淀粉培养基等。但这些产孢方法操作存在过程繁琐、培养时间长、产孢效果不理想或培养过程中容易污染杂菌等缺点，并且在培养谷瘟菌过程中表现尤其明显。例如高粱粒组织培养法，需要先将筛选籽粒大小相近的高粱粒煮成特定状态(软但不开裂)后再接入已在PDA培养基中培养2-3周、产生较大量可供接种的谷瘟病菌菌丝体。期间高粱粒覆盖纱布后无法保持无菌状态并需持续保持相对稳定的湿度，操作繁琐、耗时长，培养条件不好掌握，且极易污染黄曲霉、黑曲霉、青霉等空气中常见的杂菌，影响后续试验进度。而上述稻瘟菌常用固体培养基虽然可降低污染几率，但多不适用于谷瘟菌分生孢子培养，谷瘟菌在以上固体培养基上多生长缓慢、产孢量低，不能满足后期谷子抗谷瘟病鉴定工作所需。
发明内容
本发明的目的是提供一种谷瘟病菌产孢培养基及其制备方法，解决谷瘟病菌产孢的问题。
为了解决上述问题，本发明采用如下技术方案：
一种谷瘟病菌的产孢培养基，根据重量份的原料包括：生苦荞/麦麸40～60份，琼脂12～18份，水500～2500份。
优选的，根据重量份的原料包括：生苦荞/麦麸50份，琼脂15份，水1000～2000份。
一种谷瘟病菌的产孢培养基制作方法：将生苦荞/麦麸50g放入1000mL的水中煮沸30分钟，用双层纱布对溶液进行过滤，在滤液中放入15g琼脂，用微波炉加热直至琼脂融化后加水补足至1000mL。趁热倒入500mL三角瓶，每瓶200mL，将三角瓶放入高压蒸汽灭菌锅中于121℃下灭菌20分钟备用。接种前，用微波炉加热融化三角瓶中的固体培养基成为液体，待冷却至45～55℃培养基未凝固前倒入9mm培养基约2-3mm高(每皿约20mL)备用。
本发明根据病原真菌在不适条件下会促进分生孢子产生的特点，通过减少固体培养基中的营养物质，只采用了生苦荞/麦麸和琼脂创造不易的生长环境来提高谷瘟菌的产孢量，同时在制备该培养基时所选用的配方是将生苦荞/麦麸煮沸后弃去滤渣，将其中的营养成分溶解在清液中进行后面培养基的制备步骤。而生苦荞/麦麸所提供的营养可以保证菌丝体较快生长，从而能更快地进入具有产孢能力的阶段，缩短产孢时间并获得大量分生孢子。
与现有技术相比，本发明的有益技术效果：本发明采用生苦荞/麦麸和琼脂制备培养基，未加入一般真菌培养基常加的蔗糖成分，制备培养基原料易得、成分简单、制作简便、不易污染；同时本申请制备的培养基不需要额外进行任何形式光照处理，步骤简单；本申请制备的培养基产孢稳定，缩短产孢时间，降低了污染几率，提高了工作效率，节约了科研成本。
具体实施方式
下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更容易被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界点。
实施例1生苦荞培养基、麦麸培养基与高粱粒培养基比较
生苦荞培养基：生苦荞50g、琼脂15g、水1000～2000mL
麦麸培养基：麦麸50g、琼脂15g、水1000～2000mL
苦荞/麦麸培养基制作方法：将生苦荞/麦麸50g放入1000mL的水中煮沸30分钟，用双层纱布对溶液进行过滤，在滤液中放入15g琼脂，用微波炉加热直至琼脂融化后加水补足至1000mL。趁热倒入500mL三角瓶，每瓶200mL，将三角瓶放入高压蒸汽灭菌锅中于121℃下灭菌20分钟备用。接种前，用微波炉加热融化三角瓶中的固体培养基成为液体，待冷却至45～55℃培养基未凝固前倒入9mm培养基约2-3mm高(每皿约20mL)备用。
本申请为节约时间，将谷瘟菌丝放在PDA培养基上生长，PDA培养基不产孢但菌丝长得比较快，然后再转到产孢培养基上使其产孢。
PDA培养基制作方法：水1000毫升，加入切成2厘米直径大小的土豆200克，煮20分钟，双层纱布过滤，在清液中加葡萄糖20克，琼脂粉15克至完全溶化，然后补足水至1000毫升，装瓶灭菌。
苦荞/麦麸培养基产孢培养方法：将预先在PDA培养基上扩繁长满整皿的谷瘟菌丝体用5mm打孔器打出菌片备用。每皿1片放入培养皿中间，盖皿盖后倒置放入26℃生化培养箱静置培养。第14天镜检产孢情况。
高粱粒组织培养法：供试红高粱品种冀酿2号。首先过筛，挑选大小较为一致的籽粒1000g，用清水煮至籽粒变软但表皮不开裂状态，捞出、沥水，放入500mL三角瓶，每瓶约200g，121℃高压蒸汽灭菌锅中灭菌20分钟备用。将已在PDA培养基上培养10天(与苦荞培养基所用同批次)，培养皿内已长出足量菌丝的谷瘟菌用5mm打孔器打出菌片备用，每个三角瓶放置1片后移入26℃生化培养箱静置培养。10天后三角瓶内的高粱粒周围长满白色菌丝体，将此高粱粒到入灭菌搪瓷盘中并覆盖灭菌纱布(含水量已湿润但拧不出水为宜)后再移入26℃生化培养箱静置培养，期间需喷适量灭菌水保持纱布湿度。第4天镜检高粱粒上的产孢情况。
以上供试谷瘟菌株均为分离自2015年田间谷瘟病叶的谷瘟菌株2015-1。该菌株在PDA培养基上菌丝生长速度较快且在田间具有较强产孢能力。实验前已扩繁培养约10-15天。
镜检方法：上述试验，苦荞/麦麸固体培养基取1培养皿(约20g培养基)，倒入1毫升灭菌水，用接种针刮下菌丝及孢子后，补齐至10毫升水，混匀取0.5微升(10*10倍视野完全可见)，置于10*10倍视野，观察孢子数。
高粱粒培养法取20g高粱粒，用10毫升水搓洗下菌丝及孢子，混匀取0.5微升，置于10*10倍视野，观察孢子数。
试验结果如表1：
表1
14天产孢量(个) 7天菌落直径(厘米)
苦荞培养基培养 33 4.5
麦麸培养基培养 27 4.2
高粱粒培养法 10 ——
通过表1，可以看出14天后经苦荞/麦麸培养基培养的谷瘟病菌产孢量明显大于高粱粒培养法所得到的谷瘟病菌产孢量。
同时，在制备谷子抗谷瘟病鉴定所需菌液时，若产孢采用的是高粱粒培养法，则需要先将高粱粒上附着的孢子用手搓洗下来后再过滤使用，这样就容易附带高粱组织，堵塞喷雾器口，且操作繁琐。而且纱布湿度及高粱粒煮熟状态与个人经验关系密切，无法形成规范性操作标准。但固体培养基如苦荞/麦麸培养基上的孢子，可在培养皿内加适量水后用接种针轻轻刮下，制成菌液后用家用搅拌机打匀后使用，操作简便。繁琐耗时，易污染。
实施例2苦荞、麦麸培养基与常用燕麦片培养基的产孢量对比
苦荞、麦麸培养基制作：同实施例1
燕麦片培养基制作：先将30克生燕麦片放入1000mL水中煮沸50分钟，不过滤放入蔗糖20克、琼脂12克，加热融化后补足水分至1000mL。趁热倒入500mL三角瓶，每瓶200毫升左右；入121℃高压蒸汽灭菌锅中灭菌20分钟，备用。
燕麦片培养基产孢方法：将预先在PDA培养基上扩繁长满整皿的谷瘟菌丝体用5mm打孔器打出菌片备用。每皿1片放入培养皿中间，盖皿盖后倒置放入26℃生化培养箱静置培养。第14天镜检产孢情况。
镜检方法同实施例1固体培养基镜检方法。
试验结果如表2
表2
14天产孢量(个) 7天菌落直径(厘米)
苦荞培养基培养 29 4.1
麦麸培养基培养 27 4.1
燕麦片培养基 0 2.3
通过表2中14天后的谷瘟病菌产孢量可以看出，燕麦片培养基产孢量为0。燕麦片培养基由于含有谷物成分，培养基易污染，菌落生长速度缓慢，因此使得燕麦片培养基中产孢量为0。
实施例3苦荞培养基与改进燕麦片清液培养基的产孢量对比
苦荞培养基制作：同实施例1
燕麦片清液培养基制作：先将50克市售生燕麦片加入1000mL水中煮沸30分钟后双层纱布过滤，放入蔗糖20克、琼脂15克，加热融化后补足水分至1000mL。趁热倒入500mL三角瓶，每瓶200毫升左右；入121℃高压蒸汽灭菌锅中灭菌20分钟，备用。
燕麦片清液培养基产孢方法：将预先在PDA培养基上扩繁长满整皿的谷瘟菌丝体用5mm打孔器打出菌片备用。每皿1片放入培养皿中间，盖皿盖后倒置放入26℃生化培养箱静置培养。第14天镜检产孢情况。
镜检方法同实施例1固体培养基镜检方法。
试验结果如表3。
表3
14天产孢量(个) 7天菌落直径(厘米)
苦荞培养基培养 31 4.3
麦麸培养基培养 27 4.0
燕麦片清液培养基 0 2.1
从表3中可以看出，燕麦片清液培养基14天后产孢量仍为0，与燕麦片培养基相比污染几率降低了，但菌丝生长速度和产孢量方面并没有得到提高。
实施例4苦荞培养基与常用玉米粉培养基的产孢量对比
苦荞培养基制作：同实施例1。
玉米粉培养基制作：先将20克市售玉米粉加水1000mL煮沸20分钟，单层纱布过滤后放入琼脂12克，加热融化后补足水分至1000mL。趁热倒入500mL三角瓶，每瓶200毫升左右；入121℃高压蒸汽灭菌锅中灭菌20分钟，备用。
玉米粉培养基产孢方法：将预先在PDA培养基上扩繁长满整皿的谷瘟菌丝体用5mm打孔器打出菌片备用。每皿1片放入培养皿中间，盖皿盖后倒置放入26℃生化培养箱静置培养。第14天镜检产孢情况。
镜检方法同实施例1固体培养基镜检方法。
试验结果如表4。
表4
14天产孢量(个) 7天菌落直径(厘米)
苦荞培养基培养 40 4.5
麦麸培养基培养 30 4.2
玉米粉培养基 5 2.2
玉米粉培养基由于含有谷物成分，极易污染杂菌，且菌落生长速度慢，产孢量少，本申请制备的苦荞/麦麸培养基产孢量明显由于玉米粉培养基。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (8)

1.一种谷瘟病菌产孢培养基，其特征在于，根据重量份的原料包括：生苦荞/麦麸40～60份，琼脂12～18份，水500～2500份。
2.根据权利要求1的一种谷瘟病菌产孢培养基，其特征在于，根据重量份的原料包括：生苦荞/麦麸50份，琼脂15份，水1000份。
3.一种如权利要求1～2任意一项所述的谷瘟病菌产孢培养基的制备方法，其特征在于：将生苦荞/麦麸加水煮沸，过滤，在滤液中加入琼脂加热融化后加水定容，高温高压灭菌备用；接种前，加热融化培养基，冷却，未凝固前倒入培养皿中。
4.根据权利要求3所述的谷瘟病菌产孢培养基制备方法，其特征在于，所述过滤采用双层纱布。
5.根据权利要求3所述的谷瘟病菌产孢培养基制备方法，其特征在于，所述定容为加水定容至1L。
6.根据权利要求3所述的谷瘟病菌产孢培养基制备方法，其特征在于，所述灭菌条件为121℃下灭菌20分钟。
7.根据权利要求3所述的谷瘟病菌产孢培养基制备方法，其特征在于，所述冷却温度为45～55℃。
8.根据权利要求1的一种谷瘟病菌的产孢培养基在培养谷瘟病菌产孢的应用。
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