CN108251313A - 一种高密度液体菌种的发酵方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高密度液体菌种的发酵方法，属于杏鲍菇栽培技术领域，在液体种子、摇瓶种子、种子罐种子及发酵罐液体菌种各阶段培养基中科学复配可提高菌种抗冷、热应激性、免疫性和抗杂菌能力的中草药提取物，同时科学复配了既具有原料适应性，又具有消泡剂功能的木屑粉，并且采用追加接种和分段变温发酵的方式，缩短了菌种菌龄及增殖代数差距，适时流加包被后的具有特殊功能的壳聚糖，培养出发酵菌丝粗壮、活性高、菌丝球直径小、密度大、分布均匀的液体菌种，其菌丝球密度为4.5‑5.5ⅹ105个/L，菌丝球直径为0.5‑0.7mm，菌丝球干重为90‑100g/L，萌发时间为4‑5h，胞外多糖为3.0‑3.5g/L。

Description

一种高密度液体菌种的发酵方法
本申请是以下申请的分案申请：申请日为2015年06月11日，申请号为201510316761.2，发明名称为一种高密度液体菌种及其发酵方法。
技术领域
本发明涉及杏鲍菇栽培技术领域，具体涉及一种高密度液体菌种的发酵方法。
背景技术
杏鲍菇(PleurotuseryngiiQuel.)又名刺芹侧耳，具有菌肉肥厚、质地脆嫩等优点，特别是其菌柄组织致密、结实、乳白、爽口，被称为“平菇王”、“干贝菇”，具有杏仁香味和鲍鱼的口感，适合保鲜、加工，深得人们的喜爱，其营养丰富，富含蛋白质、碳水化合物、维生素及钙、镁、铜、锌等矿物质，可以提高人体免疫功能，对人体具有抗癌、降血脂、润肠胃以及美容等作用，具有极高的栽培价值与商业价值。
目前国内外杏鲍菇栽培以固体菌种为主，而液体菌种相对于固体菌种具有生产周期短、菌龄一致、出菇齐、便于管理、菌种成本低、接种方便且快速等优点，有利于食用菌生产的规模化、工厂化。近年来由于工厂化栽培技术的迅猛发展，为缩短菌种制备周期，提高菌种质量和生产效率，国内外生产厂家研究开发液体菌种用于替代目前杏鲍菇生产中普遍使用的固体菌种，并在实际生产中开始应用。
杏鲍菇液体菌种是通过液体发酵工艺生产有活力的杏鲍菇菌丝体。目前，国内尚未颁布统一的国家标准来规范杏鲍菇液体菌种的质量和品质，但是在实际应用过程中人们总结应用效果制订了一些地方性标准，如辽宁省地方标准《DB21/T 1693-2008食用菌液体菌种生产技术规程》等，在这些标准中明确规定，合格的食用菌液体菌种应该“可见特有的菌丝形态，球状和丛状菌丝体大量分布，菌丝粗壮，菌丝内原生质分布均匀”“菌液稍粘稠，有大量片状或球状菌丝体悬浮、分布均匀”，也就是说优良的液体菌种菌丝球密度高、直径小，分布均匀；另一方面，在实际生产应用中杏鲍菇液体菌种是通过生产线接种机进行机械化接种操作，由于接种机喷口狭窄，为防止菌液堵塞管道，还需要增加液体菌种接种前的预处理工艺(一般采用机械粉碎的方法使菌液中的菌丝球直径变小，使菌液变均匀)。因此，杏鲍菇液体发酵菌丝球的大小、密度、均匀度等物理特性是优质液体菌种的关键控制指标。
目前，有关杏鲍菇液体培养的研究报道和专利技术大部分集中于摇瓶水平，规模化发酵研究的较少，基本集中在发酵工艺的优化方面，尤其在发酵培养基的改良方面较多：申请号为201410568173.3的中国专利公开了一种改良的杏鲍菇液体发酵培养基以及利用其培养杏鲍菇液体菌种的方法，在发酵培养基中添加0.1-0.3g/100ml的明胶、琼脂中的一种或二者的混合物，采用搅拌、摇床震荡培养，上述公开的专利培养基中琼脂添加量超过0.4g/100ml凝固，无法进行液体培养，不易控制，存在发酵失败隐患，并且摇床培养得到的液体菌种量少，不适合规模化、机械化生产，同时菌种质量不是很好。申请号为201410244283.4的中国专利公开了一种食用菌液体菌种的生产方法，是将保存的食用菌菌株经活化后在固体培养基培养，然后粉碎，继续在固体培养基上密封培养2-3天，与0.15-0.2％的琼脂溶液接触混匀得到液体菌种，上述公开的专利实质上仍然存在固体发酵的缺陷，并且其中的粉碎再培养工艺和调配工艺易污染杂菌，高速搅拌打浆和粉碎的高剪切力对菌种伤害颇大。北方园艺.食用菌篇公开了刘冠卉等发表的杏鲍菇液体菌种的制备研究【2009(11)230-232】，对发酵培养基和发酵条件进行了优化，但仍不全面，不能很好的适合菌种生长、繁殖，得到的液体菌种的发酵菌丝球的大小、密度、均匀度等物理特性不很理想，同样存在搅拌剪切力对菌丝球质量的严重影响。
鼓气发酵是将氧气或无菌空气从气升式发酵罐底部通入的发酵方式，同时具备通氧和柔和搅拌的作用，通氧效率高、溶氧效果好，可有效防止搅拌式发酵剪切力对杏鲍菇液体菌种质量的影响，得到的液体菌种菌丝粗壮、粘度适中、菌丝球直径小、密度高、分布均匀。申请号为201310479951.7的中国专利公开了一种杏鲍菇液体菌种的培养方法，将传统的马铃薯碳源和麸皮氮源替换为豆粕粉，将培养基倒入发酵罐，121℃灭菌60-120分钟，灭菌后水淋冷却并通入无菌空气；接种培养好的液体母种，接种量为1-2‰，发酵罐培养温度为21-26℃，通气压力为0.5-1.5兆帕，培养7-10天得到杏鲍菇液体菌种，但上述公开的专利培养基营养不全面，发酵工艺滞后，发酵周期长，得到的液体菌种质量仍不理想。
综上，依据杏鲍菇的菌种特性，通过优化培养基和培养条件，采用鼓气发酵制备高质量、高产量、成本低的杏鲍菇液体菌种仍是本领域技术人员的不懈追求。
发明内容
本发明所解决的技术问题是克服现有鼓气发酵制备杏鲍菇液体菌种的缺陷，在菌种培养过程各阶段培养基中科学复配可提高菌种抗冷、热应激性和免疫性的中草药提取物以及适应性原料木屑粉，采用分段追加接种和变温发酵的方式，缩短菌种菌龄、增殖代数差距，适时流加包被后的壳聚糖调整发酵培养基的粘度，培养出一种发酵菌丝粗壮、活性高、菌丝球直径小、密度大、分布均匀、发酵周期短的杏鲍菇液体菌种。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种高密度液体菌种的发酵方法，包括如下步骤：
1)取保存好的杏鲍菇斜面菌种0.2cm2的菌种块2块接种于平板培养基进行活化，25℃恒温培养10天，如此活化2次，得平板种子；
2)将平板种子用直径为0.5cm的打孔器截取0.2cm2的菌种块3块接入250mL三角瓶中，液体种子培养基装液量为100mL，于25℃恒温培养2天，然后放入恒温摇床中，25℃、100r/min振荡培养3天得液体种子；
3)将液体种子以10％的接种量接种于500mL摇瓶中，摇瓶培养基装液量250mL，于25℃、150r/min振荡恒温培养4天得摇瓶种子；
4)将摇瓶种子以10％的接种量接种于5L种子罐中，种子罐培养基装液量3L，于25℃、通气量4L/min条件下恒温培养4天得种子罐种子；
5)首先将种子罐种子以5％接种量接种于30L发酵罐，发酵培养基装液量15L,于30℃、通气量3L/min恒温发酵12h,然后以0.3℃/min的速率降温至18℃，向发酵罐中加入8g包被壳聚糖和900mL种子罐种子，在通气量6L/min条件下恒温发酵10h，最后以0.2℃/min的速率升温至24℃，在通气量5L/min条件下恒温发酵45h即得高密度液体菌种；
所述杏鲍菇斜面菌种为市购杏鲍菇纯化菌株；
所述平板培养基组成为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁1.5g/L，琼脂20g/L，VB1 0.02g/L，余量为水，pH值6.0；
所述液体种子培养基组成为：葡萄糖30g/L，酵母浸出汁5g/L，蛋白胨2g/L，琼脂2g/L，中草药提取物0.3g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，木屑粉0.2g/L，VB1 0.01g/L，余量为水，pH值6.0；
所述摇瓶培养基组成为：黄豆饼粉60g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，中草药提取物0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，木屑粉0.2g/L，VB1 0.01g/L，余量为水，pH值6.0；
所述种子罐培养基组成为：黄豆饼粉60g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，中草药提取物0.8g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，木屑粉0.3g/L，VB1 0.01g/L，余量为水，pH值6.0；
所述发酵培养基的组成为：黄豆饼粉60g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，中草药提取物1.5g/L，木屑粉0.6g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，VB1 0.01g/L，余量为水，pH值6.0；
优选地，所述中草药提取物的制备方法，包括如下步骤：按重量份数计，称取黄芪30份，干姜30份，陈皮30份，牛黄25份，丹皮25份，甘草20份，知母18份，金银花18份，鱼腥草17份，赤芍15份，黄芩15份，川芎10份，当归8份；置盛有0.2％碳酸氢钠溶液的超声波清洗机中于200W、30KHz清洗12min，沥干，将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，置容器中均匀混合并添加5倍重量的水，得混合物料，控制温度80℃保持3h，接着降温至45℃，用乳酸调节pH值为4，在功率200W条件下进行微波提取12min，同时在功率250W,频率35KHz条件下进行超声波辅助提取；然后加入混合物料总重量1.0％的混合酶进行酶解，用乳酸调节pH值为6.2，酶解3h，最后添加混合物料2倍重量乙醇和丙醇的混合物，乙醇和丙醇混合的质量比为1:2，控制温度至70℃保持3.5h，过滤，得第一滤液；添加滤渣2倍重量的水，控制温度90℃保持2h，然后降温至30℃，过滤，得第二滤液；将第一滤液和第二滤液按照质量比3:2合并,滤液真空浓缩后冷冻干燥、粉碎即得中草药提取物；
所述混合酶为葡聚糖酶、木聚糖酶、戊聚糖酶、果胶酶按质量比3:2:2:1均匀混合。
优选地，所述木屑粉的制备方法包括如下步骤：将无发霉、无病虫锯木末或废木屑除去杂物，置于装有质量百分比浓度0.5％的碳酸氢钠溶液的超声波清洗机中于200W、30KHz清洗10min，冲洗、沥干，放入蒸汽釜中于0.3-0.4MPa蒸煮20-30min,取出，沥干，与植物油按质量比100:1均匀混合，然后将混合物置微波干燥机于2000W、120℃微波辐照5min，使之水分达到8-10％，最后超微粉碎至粒径0.3-0.5mm,密封包装即得木屑粉；
更优选地，所述干燥工艺为：微波辐照10s,停留10s。
优选地，所述发酵培养基的制备方法为：按照培养基配方准确称量各原料，首先取黄豆饼粉质量4-6倍的水，用乳酸调节pH值为5，加入5u/g黄豆饼粉的耐高温a-淀粉酶,边搅拌边加入黄豆饼粉，升温至90℃，保温，液化10min,然后降温至50℃，保温，边搅拌边加入40u/g黄豆饼粉的糖化酶和30u/g黄豆饼粉的蛋白酶水解20min，边搅拌边加入剩余水和其它原料，均匀混合，调整pH值为6.0，123℃灭菌30min即得发酵培养基；
优选地，所述包被壳聚糖的制备方法，包括如下步骤：取壳聚糖加入其质量30-50％的质量百分比浓度为10-12％的α-环状糊精水溶液中，制成软材，用10-20目筛制粒，得湿颗粒，置微波干燥机中于功率2000W、60-80℃干燥4-6min，用10-20目筛快速整粒即得包被壳聚糖。
本发明液体菌种主要质量指标的检测方法：
菌丝球干重的测定
取50ml发酵液用80目的筛网进行过滤，收集菌球，用清水进行反复冲洗，而后置于恒温烘干箱中80℃烘干4小时后称重，并每隔半小时称量一次，直至两次称量差不超过2mg，即为恒重。最后计算菌丝干重的平均值。
菌丝球密度的测定
用移液管取发酵液1ml于培养皿中，对菌球数量进行计数，重复记数三次，最后计算菌球密度的平均值。
菌丝球直径的测定
用移液管取发酵液1ml，用镊子取10个菌球排成一长列，测量总长度，然后求平均值，重复测量三次，计算菌球直径的平均值。
菌丝球回接平板萌发时间的测定
从发酵培养基的培养液中取一个菌球置于PDA培养基平板中央，每一种发酵培养基做三个重复，将放有菌球的PDA平板置于培养箱中25℃进行培养，每隔1小时观察一次，等到观察到有一组菌球萌发后，改为每0.5小时观测一次，并记录各实验组的萌发时间，最后计算每一种发酵培养基中菌球回接平板后萌发时间的平均值。
胞外多糖含量的测定
取发酵液50ml，抽滤，取上清液，加入两倍体积的工业酒精，沉淀多糖过夜，然后3600r/min离心10分钟，收集多糖，置于40℃下烘干，2小时后称重之后每隔半小时称量一次，直至两次称量差不超过2mg，即为恒重。
本发明另一目的是提供上述方法制备的高密度液体菌种。
所述高密度液体菌种经发酵罐发酵67-92h,菌丝球密度为4.5-5.5ⅹ105个/L，菌丝球直径为0.5-0.7mm，菌丝球干重为90-100g/L，萌发时间为4-5h，胞外多糖为3.0-3.5g/L。
本发明还有一个目的是提供上述高密度液体菌种在杏鲍菇栽培中的应用。
有益效果：
本发明根据杏鲍菇原菌株的特性，在液体种子、摇瓶种子、种子罐种子及发酵罐液体菌种各阶段培养基中自少至多科学复配可提高菌种抗冷、热应激性、免疫性和抗菌性的中草药提取物，同时科学复配了既具有原料适应性，又具有消泡剂功能的木屑粉，通过逐级驯化、复壮扩大培养，增强了杏鲍菇菌种抗高温及低温应激能力，提高了产多种降解酶的能力，激发了其增殖能力和增殖密度，缩短了萌发时间，提高了菌丝及胞外多糖的产量，提高了菌株对发酵环境及后续栽培环境的适应性，同时采用追加接种和分段变温发酵的方式，缩短了菌种菌龄及增殖代数差距，适时流加包被后的具有增稠性、相溶性、稳定性、吸附性和抑菌性等特殊功能的壳聚糖调整发酵培养基的粘度及稳定性，提高了菌丝球在发酵液中分布的均一性和溶氧程度，并且打破了传统发酵培养基的制备方法，对其中的黄豆饼粉进一步生物酶解，缩短了发酵周期，培养出一种发酵菌丝粗壮、活性高、菌丝球直径小、密度大、分布均匀的液体菌种，其菌丝球密度为4.5-5.5ⅹ105个/L，菌丝球直径为0.5-0.7mm，菌丝球干重为90-100g/L，萌发时间为4-5h，胞外多糖为3.0-3.5g/L。全面提高了液体菌种的质量和产量，降低了生产成本，为杏鲍菇的高质量、高产量和规模化栽培奠定了坚实的基础，经栽培试验表明：本发明制备的液体菌种健壮、活力高，生长速度快，菌丝产量和质量高，抗杂菌能力强，保质期长，与市售液体菌种相比发菌时间缩短22.22％，杂菌感染率降低96.67％，一级菇率提高5％，生产能力为市售液体菌种2倍以上，体现了较高的经济价值，更加适合工厂化、规模化栽培。
具体技术原理为：
1.本发明的中草药提取物科学复配显著提高菌种抗冷、热应激性、免疫性和抗病性的中草药为原料，经超声清洗、低温酶解、水提醇提和超声波辅助微波提取而制备的，提取物有效成分含量高，成本低，可有效通过逐级驯化、复壮扩大培养，增强了杏鲍菇菌种抗高温及低温应激能力，提高了产纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶等降解酶的能力，激发了其增殖能力和增殖密度，缩短了萌发时间，有效提高了液体菌种的密度、菌丝干重和胞外多糖的产量，缩小了菌丝球直径，增强了菌株对发酵环境及后续栽培环境的适应性，全面增强了高密度液体菌种的抗应激性、抗病性和免疫能力，同时采用超声清洗可有效杀灭原料中的虫卵及杂菌，降低重金属离子含量和农药残留量，降低了杏鲍菇富集重金属离子的原料可能，提高了食用菌的食品安全性和液体菌种的保质期。
2.本发明木屑粉以高纤维素含量和高木质素含量的木屑与植物油为原料，采用超声清洗、高压蒸煮和微波干燥工艺制备，其质地细柔软，营养纤维素含量高，非常有利于杏鲍菇菌种发酵，同时网格结构丰富、均匀，吸附力强，植物油附着量大，既可为杏鲍菇提供丰富的营养，还可解决高通风量下鼓气发酵易起泡沫的问题，也为后期的栽培过程提供了环境适应性能力，并且采用超声清洗可有效杀灭原料中的虫卵及杂菌，降低重金属离子含量和农药残留量，降低了杏鲍菇富集重金属离子的原料可能，提高了食用菌的食品安全性。
3.本发明克服了传统制备发酵培养基的方法，对其中的黄豆饼粉进一步液化和酶解，将其中的淀粉和蛋白质大分子营养物质降解为小分子，便于杏鲍菇起酵和发酵，缩短了杏鲍菇发酵周期。
4.本发明的包被壳聚糖，同时具有壳聚糖和α-环状糊精的多重功能，适度调整了杏鲍菇发酵液的粘度、相溶性、稳定性、吸附性和抑菌性，提高了菌丝球在发酵液中分布的均一性和溶氧程度。
5.本发明高密度液体菌种的发酵方法采用鼓气发酵工艺，工艺简单、操作方便、发酵周期短(发酵罐67-92h)，可规模化和机械化生产，通过优化菌种扩培和发酵过程培养基及发酵工艺，采用分段追加接种和变温发酵的方式，缩短了菌龄及增殖代数差距，有效提高了液体菌种的生物活性和发酵力，显著提高了菌丝球的密度、菌丝干重和胞外多糖的产量，缩小了菌丝球直径，全面提高了液体菌种的质量和产量，降低了生产成本。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例1 原料制备
1.中草药提取物的制备：
所述中草药提取物的制备方法，包括如下步骤：按重量份数计，称取黄芪30份，干姜30份，陈皮30份，牛黄25份，丹皮25份，甘草20份，知母18份，金银花18份，鱼腥草17份，赤芍15份，黄芩15份，川芎10份，当归8份；置盛有0.2％碳酸氢钠溶液的超声波清洗机中于200W、30KHz清洗12min，沥干，将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，置容器中均匀混合并添加5倍重量的水，得混合物料，控制温度80℃保持3h，接着降温至45℃，用乳酸调节pH值为4，在功率200W条件下进行微波提取12min，同时在功率250W,频率35KHz条件下进行超声波辅助提取；然后加入混合物料总重量1.0％的混合酶进行酶解，用乳酸调节pH值为6.2，酶解3h，最后添加混合物料2倍重量乙醇和丙醇的混合物，乙醇和丙醇混合的质量比为1:2，控制温度至70℃保持3.5h，过滤，得第一滤液；添加滤渣2倍重量的水，控制温度90℃保持2h，然后降温至30℃，过滤，得第二滤液；将第一滤液和第二滤液按照质量比3:2合并,滤液真空浓缩后冷冻干燥、粉碎即得中草药提取物；
所述混合酶为葡聚糖酶、木聚糖酶、戊聚糖酶、果胶酶按质量比3:2:2:1均匀混合。
2.木屑粉的制备：
所述木屑粉的制备方法，包括如下步骤：将无发霉、无病虫锯木末或废木屑除去杂物，置于装有质量百分比浓度0.5％的碳酸氢钠溶液的超声波清洗机中于200W、30KHz清洗10min，冲洗、沥干，放入蒸汽釜中于0.35MPa蒸煮25min,取出，沥干，与植物油按质量比100:1均匀混合，然后将混合物置微波干燥机于2000W、120℃微波辐照5min，其中微波辐照10s,停留10s，最后超微粉碎至粒径0.4mm,密封包装即得木屑粉。
3.包被壳聚糖的制备：
所述包被壳聚糖的制备方法，包括如下步骤：取壳聚糖加入其质量40％的质量百分比浓度为11％的α-环状糊精水溶液中，制成软材，用20目筛制粒，得湿颗粒，置微波干燥机中于功率2000W、70℃干燥5min，用20目筛快速整粒即得包被壳聚糖。
下述实施例2中所使用的中草药提取物、木屑粉及包被壳聚糖均为实施例1制备，杏鲍菇菌种为福建省漳州市龙海食用菌研究所提供的“龙海3号”，其它原料均为市购。
实施例2
一种高密度液体菌种的发酵方法，包括如下步骤：
1)取保存好的杏鲍菇斜面菌种0.2cm2的菌种块2块接种于平板培养基进行活化，25℃恒温培养10天，如此活化2次，得平板种子；
2)将平板种子用直径为0.5cm的打孔器截取0.2cm2的菌种块3块接入250mL三角瓶中，液体种子培养基装液量为100mL，于25℃恒温培养2天，然后放入恒温摇床中，25℃、100r/min振荡培养3天得液体种子；
3)将液体种子以10％的接种量接种于500mL摇瓶中，摇瓶培养基装液量250mL，于25℃、150r/min振荡恒温培养4天得摇瓶种子；
4)将摇瓶种子以10％的接种量接种于5L种子罐中，种子罐培养基装液量3L，于25℃、通气量4L/min条件下恒温培养4天得种子罐种子；
5)首先将种子罐种子以5％接种量接种于30L发酵罐，发酵培养基装液量15L,于30℃、通气量3L/min恒温发酵12h,然后以0.3℃/min的速率降温至18℃，向发酵罐中加入8g包被壳聚糖和900mL种子罐种子，在通气量6L/min条件下恒温发酵10h，最后以0.2℃/min的速率升温至24℃，在通气量5L/min条件下恒温发酵45h即得高密度液体菌种；
所述平板培养基组成为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁1.5g/L，琼脂20g/L，VB1 0.02g/L，余量为水，pH值6.0；
所述液体种子培养基组成为：葡萄糖30g/L，酵母浸出汁5g/L，蛋白胨2g/L，琼脂2g/L，中草药提取物0.3g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，木屑粉0.1g/L，VB1 0.01g/L，余量为水，pH值6.0；
所述摇瓶培养基组成为：黄豆饼粉60g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，中草药提取物0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，木屑粉0.2g/L，VB1 0.01g/L，余量为水，pH值6.0；
所述种子罐培养基组成为：黄豆饼粉60g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，中草药提取物0.8g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，木屑粉0.3g/L，VB1 0.01g/L，余量为水，pH值6.0；
所述发酵培养基的组成为：黄豆饼粉60g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，中草药提取物1.5g/L，木屑粉0.6g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，VB1 0.01g/L，余量为水，pH值6.0；
所述发酵培养基的制备方法为：按照培养基配方准确称量各原料，首先取黄豆饼粉质量4倍的水，用乳酸调节pH值为5，加入5u/g黄豆饼粉的耐高温a-淀粉酶,边搅拌边加入黄豆饼粉，升温至90℃，保温，液化10min,然后降温至50℃，保温，边搅拌边加入40u/g黄豆饼粉的糖化酶和30u/g黄豆饼粉的蛋白酶水解20min，边搅拌边加入剩余水和其它原料，均匀混合，调整pH值为6.0，123℃灭菌30min即得发酵培养基。
经上述方法制备的高密度液体菌种菌丝球密度为5.0ⅹ105个/L，菌丝球直径为0.6mm，菌丝球干重为96g/L，胞外多糖为3.2g/L。
实施例3本发明高密度液体菌种的栽培试验
1.试验菌种：以本发明实施例2制备的液体菌种和市售的“龙海3号”液体菌种为试验菌种，分为试验组和对照组；
2.接种方法：试验组和对照组以相同的接种量和接种密度采用常规方法接种，分别接种2000瓶；
3.生产管理：试验组和对照组采用同样的管理方法
3.1发菌管理
接种后将菌瓶放在恒温培养室内，避光培养。温度控制在23℃，相对湿度70％～75％。此阶段用于栽培料中的养分完全分解和积累。发菌期管理的关键是保温、保湿，前期如果温度过低，持续时间较长，会降低菌种活力，菌丝生产速度减慢。所有菌瓶菌丝浓白后再持续培养15d，使养分彻底分解，菌丝达到生理成熟。
3.2开瓶、搔菌
菌瓶后熟期过后，按常规方法进行开瓶、搔菌处理。搔菌过程中，液体菌种搔菌时去掉表面薄薄一层即可。搔菌完成后将菌瓶移入出菇房，菌瓶倒置，使菌丝恢复生长。待菌丝恢复后，温度控制在14℃～16℃，相对湿度为90～95％，光照500～800Lx，CO2浓度600～1500ppm，待现蕾出菇。
3.3子实体生长管理
温度控制在15～18℃，空气湿度保持在85％～90％，CO2浓度在1500～1800ppm之间，子实体生长迅速。当菇盖基本展开，孢子尚未弹射时采收一潮菇。
4.质量及产量指标测定
观察记录试验组和对照组栽培瓶的菌丝浓度、菌丝颜色、发菌时间、杂菌感染状况，观察比较子实体性状，测量子实体菌柄长度、菌盖大小和菌柄直径、单瓶产量，并统计计算杂菌感染率、一级菇率和生物转化率，结果如表1-3：
生物学转化率(％)＝子实体鲜品产量(g)/培养料干重(g)×100％
表1
项目 发菌时间 菌丝颜色 菌丝浓度 杂菌感染率
试验组 14天 白色 浓密 0.5％
对照组 18天 白偏黄 较淡 15％
以上结果表明：本发明液体菌种健壮、活力高，生长速度快，菌丝产量和质量高，抗杂菌能力强，与对照组相比发菌时间缩短22.22％，杂菌感染率降低96.67％。
表2
项目 菌柄平均长度(cm) 菌盖平均直径(cm) 菌柄平均直径(cm) 一级菇率
试验组 15.17 7.34 6.28 97％
对照组 10.36 7.79 3.42 92％
以上结果表明：本发明液体菌种栽培后的子实体菌盖与菌柄生长比例合适，外观优美，质量等级高，与对照组相比一级菇率提高5％。
表3
项目 单瓶平均重量(g) 栽培料干重(g) 生物转化率(％)
试验组 123.41 180 68.56
对照组 91.73 180 50.96
以上结果表明：本发明液体菌种栽培后的子实体单凭产量高，生物转化率高，具有较好的经济效益，更加适合工厂化、规模化栽培。与对照组相比，生物转化率提高34.79％。
同时，本发明液体菌种菌丝球密度高为5.5ⅹ105个/L，市售液体菌种菌丝球密度最高为2.7ⅹ105个/L，与对照组相比，其生产能力为市售液体菌种2倍以上，体现了较高的经济价值。

Claims (5)

1.一种高密度液体菌种的发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：将保存的杏鲍菇斜面菌种经平板培养基活化后依次经液体种子培养基、摇瓶种子培养基和种子罐培养基逐级扩大培养得到种子罐种子，首先将种子罐种子以5％接种量接种于30L发酵罐，发酵培养基装液量15L,于30℃、通气量3L/min恒温发酵12h,然后以0.3℃/min的速率降温至18℃，向发酵罐中加入8g包被壳聚糖和900mL种子罐种子，在通气量6L/min条件下恒温发酵10h，最后以0.2℃/min的速率升温至24℃，在通气量5L/min条件下恒温发酵45h即得高密度液体菌种；
所述发酵培养基的组成为：黄豆饼粉60g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，中草药提取物1.5g/L，木屑粉0.6g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，VB1 0.01g/L，余量为水，pH值6.0；
所述中草药提取物的制备方法，包括如下步骤：按重量份数计，称取黄芪30份，干姜30份，陈皮30份，牛黄25份，丹皮25份，甘草20份，知母18份，金银花18份，鱼腥草17份，赤芍15份，黄芩15份，川芎10份，当归8份；置盛有0.2％碳酸氢钠溶液的超声波清洗机中于200W、30KHz清洗12min，沥干，将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，置容器中均匀混合并添加5倍重量的水，得混合物料，控制温度80℃保持3h，接着降温至45℃，用乳酸调节pH值为4，在功率200W条件下进行微波提取12min，同时在功率250W,频率35KHz条件下进行超声波辅助提取；然后加入混合物料总重量1.0％的混合酶进行酶解，用乳酸调节pH值为6.2，酶解3h，最后添加混合物料2倍重量乙醇和丙醇的混合物，乙醇和丙醇混合的质量比为1:2，控制温度至70℃保持3.5h，过滤，得第一滤液；添加滤渣2倍重量的水，控制温度90℃保持2h，然后降温至30℃，过滤，得第二滤液；将第一滤液和第二滤液按照质量比3:2合并,滤液真空浓缩后冷冻干燥、粉碎即得中草药提取物；
所述混合酶为葡聚糖酶、木聚糖酶、戊聚糖酶、果胶酶按质量比3:2:2:1均匀混合；
所述木屑粉的制备方法包括如下步骤：将无发霉、无病虫锯木末或废木屑除去杂物，置于装有质量百分比浓度0.5％的碳酸氢钠溶液的超声波清洗机中于200W、30KHz清洗10min，冲洗、沥干，放入蒸汽釜中于0.3-0.4MPa蒸煮20-30min,取出，沥干，与植物油按质量比100:1均匀混合，然后将混合物置微波干燥机于2000W、120℃微波辐照5min，最后超微粉碎至粒径0.3-0.5mm,密封包装即得木屑粉；
所述发酵培养基的制备方法为：按照培养基配方准确称量各原料，首先取黄豆饼粉质量4倍的水，用乳酸调节pH值为5，加入5u/g黄豆饼粉的耐高温a-淀粉酶,边搅拌边加入黄豆饼粉，升温至90℃，保温，液化10min,然后降温至50℃，保温，边搅拌边加入40u/g黄豆饼粉的糖化酶和30u/g黄豆饼粉的蛋白酶水解20min，边搅拌边加入剩余水和其它原料，均匀混合，调整pH值为6.0，123℃灭菌30min即得发酵培养基；
所述包被壳聚糖的制备方法包括如下步骤：取壳聚糖加入其质量30-50％的质量百分比浓度为10-12％的α-环状糊精水溶液中，制成软材，用10-20目筛制粒，得湿颗粒，置微波干燥机中于功率2000W、60-80℃干燥4-6min，用10-20目筛快速整粒即得包被壳聚糖。
2.如权利要求1所述的一种高密度液体菌种的发酵方法，其特征在于，所述液体种子培养基组成为：葡萄糖30g/L，酵母浸出汁5g/L，蛋白胨2g/L，琼脂2g/L，中草药提取物0.3g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，木屑粉0.2g/L，VB1 0.01g/L，余量为水，pH值6.0。
3.如权利要求1所述的一种高密度液体菌种的发酵方法，其特征在于，所述摇瓶种子培养基组成为：黄豆饼粉60g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，中草药提取物0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，木屑粉0.2g/L，VB1 0.01g/L，余量为水，pH值6.0。
4.如权利要求1所述的一种高密度液体菌种的发酵方法，其特征在于，所述种子罐培养基组成为：黄豆饼粉60g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，中草药提取物0.8g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，木屑粉0.3g/L，VB1 0.01g/L，余量为水，pH值6.0。
5.如权利要求1所述的一种高密度液体菌种的发酵方法，其特征在于，微波干燥时微波辐照10s,停留10s。
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