CN108342429A - 一种银耳孢子发酵高产银耳多糖的制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种银耳孢子发酵高产银耳多糖的制备方法,属于微生物发酵培养技术领域。所述方法如下:菌种:菌株为Tr21;将斜面保藏培养基放置在22.5~23.5℃温度下培养4~8 d,将液体种子培养基灭菌;用10mL生理盐水荡洗斜面保藏培养基上的孢子,按液体种子培养基体积的3~8%接种量接入菌悬液,摇床培养2~4d,转速为170~200r/min,培养温度为23~26℃;将液体发酵培养基在115℃下灭菌,在500mL三角瓶中,装液量100mL,接种量5~8%,接种摇匀静置培养4~8h,在摇床上发酵4~6d,培养温度为23~26℃,搅拌转速为180~220 r/min。本发明优化了银耳多糖的发酵条件,通过添加樟科植物干燥粉末的10~50%水浸提液,促进了发酵液中银耳孢子增殖,生物量增加68.76%~116.87%,胞外多糖产量提高67.75%~99.81%。本发明用于银耳孢子发酵高产银耳多糖。

Description

一种银耳孢子发酵高产银耳多糖的制备方法
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域,具体涉及一种银耳孢子发酵高产银耳多糖的制备方法。
背景技术
银耳(Tremella fuciformis Berk),又称白木耳,为一种高等胶质真菌,是我国久负盛名的滋补营养品和养生益寿的食药用菌。现代药理研究表明银耳具有免疫调节、抗肿瘤和衰老、降血糖血脂、抗血栓和病毒、促进神经细胞生长和防治心血管疾病等生理活性,其活性物质主要是银耳多糖。银耳多糖具有多种的药理和保健功能,被广泛应用于食品、医药及化妆品工业。银耳在不同环境因素下具有酵母孢子型和菌丝型两种形态,呈二型态现象,两种形态均能产生银耳多糖。目前有关银耳孢子多糖和银耳多糖的组成结构和药理功能已有很多报道,它们是一种杂多糖,组成结构相似、功能相当,银耳孢子多糖可替代从银耳子实体提取的多糖用于各类银耳制品。
提取银耳多糖生产上多以银耳子实体(粉)为原料,由于多糖的粘稠性,分离困难,工艺繁杂,资源浪费大且产率较低。银耳在液体培养基中主要以芽孢型存在,通过出芽分裂进行无性繁殖,可采用银耳孢子进行液体深层发酵生产银耳多糖,既能保证活性成分质量,又能进行工业化生产,具有周期短、条件易于控制、成本低、节约资源和人力等优点。目前银耳多糖发酵生产的研究大多数集中在高产银耳孢子多糖菌株选育和对发酵条件的优化,以提高孢子生物量及孢外多糖产量,国内进行银耳菌丝深层发酵提取多糖投资较大,多糖产量不高,尚未规模推广。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有的银耳多糖生产方法繁杂、成本高且产率低的问题,提供一种银耳孢子发酵高产银耳多糖的制备方法。
为实现上述目的,本发明采取的技术方案如下:
一种银耳孢子发酵高产银耳多糖的制备方法,所述方法步骤如下:
步骤一:采购银耳菌株Tr21;
步骤二:配制斜面保藏培养基:取200 g去皮土豆切成小块,加蒸馏水800mL,煮沸20~30min,纱布过滤后得到滤液,向滤液中加入20 g葡萄糖、1g蛋白胨、1g KH2PO4、0.5 g MgSO4·7H2O、20g琼脂,加热溶解后补水至总体积为1L,pH自然,在115℃下灭菌20~30 min;
步骤三:活化银耳菌种:将步骤一的菌株接种于步骤二的斜面保藏培养基上,于22.5~25.5℃温度下培养4~8 d;
步骤四:液体种子培养基配制及培养:1L水中加入20 g葡萄糖,2 g蛋白胨,1 g酵母膏,3 g K2HPO4,1.5 g MgSO4·7H2O,用1mol/L的HCl或NaOH调节pH值为5.8~6.0,115℃灭菌25~30 min;
在无菌操作条件下,用10mL无菌生理盐水荡洗步骤三斜面保藏培养基上的孢子制成菌悬液,按液体种子培养基体积的3~8%接种量接入菌悬液,摇床培养2~4 d,转速为170~200r/min,培养温度为23~26℃;
步骤五:植物浸提液制备:称取过20目筛的植物干燥粉末,按照植物干燥粉末:水=1:10的质量比加水,间歇搅拌,浸提24 h,过滤的滤液即为植物浸提液;
步骤六:液体发酵培养基的配制:称取麸皮100~200g,加500mL水,煮沸15~20 min,过滤得到滤液,加入蛋白胨5~7g,葡萄糖10~15g,可溶性淀粉5~10g,KH2PO4 4g,MgSO4·7H2O 2g,植物浸提液100~500mL,以水补足1L,溶解后调节pH为5.5~6.0,在115℃下灭菌30 min;
步骤七:按步骤六液体发酵培养基体积的4~8%接入步骤四得到的种子液,接种后摇匀静置培养4~8 h,在摇床上发酵4~6 d,培养温度为23~25℃,搅拌转速为180~220 r/min。
本发明相对于现有技术的有益效果是:
(1)本发明通过在液体发酵培养基中加入绿色安全的植物浸提液,使银耳孢子在培养基中能够保持良好细胞形态和生长状态,维持高密度的生长繁殖和分泌积累发酵产物,发酵液具有芳香味。本发明有效的缩短了发酵周期、提高了原料的利用率、具有工艺简单、操作方便、高产胞外多糖及容易实现产业化的特点。
(2)本发明通过大量实验,优化了银耳多糖液体发酵培养基和发酵条件,在原发酵培养基中添加10~50%植物干燥粉末的水浸提液,有效地促进发酵液中银耳孢子增殖,生物量增加68.76%~116.87%,胞外多糖产量提高67.75%~99.81%。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明,但并不局限于此,凡是对本发明技术方案进行修正或等同替换,而不脱离本发明技术方案的精神范围,均应涵盖在本发明的保护范围之中。
具体实施方式一:本实施方式记载的是一种银耳孢子发酵高产银耳多糖的制备方法,所述方法步骤如下:
步骤一:采购银耳菌株Tr21,购于福建省古田县兴华真菌研究所;
步骤二:配制斜面保藏培养基:取200 g去皮土豆切成小块,加蒸馏水800mL,煮沸20~30min,纱布过滤后得到滤液,向滤液中加入20 g葡萄糖、1g蛋白胨、1gKH2PO4、0.5 g MgSO4·7H2O、20 g琼脂,加热溶解后补水至总体积为1L,pH自然,在115℃下灭菌20~30 min;所述的斜面保藏培养基的作用是增加角面积;
步骤三:活化银耳菌种:将步骤一的菌株接种于步骤二的斜面保藏培养基上,于22.5~25.5℃温度下培养4~8 d;
步骤四:液体种子培养基配制及培养:1L水中加入20g葡萄糖,2g蛋白胨,1g酵母膏,3 gK2HPO4,1.5 g MgSO4·7H2O,用1mol/L的HCl或NaOH调节pH值为5.8~6.0,115℃灭菌25~30min;
在无菌操作条件下,用10mL无菌生理盐水荡洗步骤三斜面保藏培养基上的孢子制成菌悬液,按液体种子培养基体积的3~8%接种量接入菌悬液,摇床培养2~4 d,转速为170~200r/min,培养温度为23~26℃;
步骤五:植物浸提液制备:称取过20目筛的植物干燥粉末,按照植物干燥粉末:水=1:10的质量比加水,搅拌均匀,浸提24 h,过滤的滤液即为植物浸提液;
步骤六:液体发酵培养基的配制:称取麸皮100~200g,加500mL水,煮沸15~20 min,过滤得到滤液,加入蛋白胨5~7g,葡萄糖10~15g,可溶性淀粉5~10g,KH2PO4 4g,MgSO4·7H2O 2g,植物浸提液100~500mL,以水补足1L,溶解后调节pH为5.5~6.0,在115℃下灭菌30 min;
步骤七:按步骤六液体发酵培养基体积的4~8%接入步骤四得到的种子液,接种后摇匀静置培养4~8 h,在摇床上发酵4~6 d,培养温度为23~25℃,搅拌转速为180~220 r/min。
具体实施方式二:具体实施方式一所述的一种银耳孢子发酵高产银耳多糖的制备方法,步骤五中,所述的植物浸提液所用植物为樟科润楠属植物。
实施例1:
(1)活化银耳菌种:将银耳母种接种于由以下组成的斜面保藏培养基上。去皮土豆200g切成小块,加蒸馏水800mL,煮沸30min,纱布过滤后得到滤液,加入葡萄糖20g,蛋白胨1g,KH2PO41g,MgSO4·7H2O 0.5g,琼脂2g,加热溶解后补水至1L,pH自然,在115℃下灭菌25min。接种后,于24℃温度下培养5d。
(2)液体种子的培养:在1L水中加入20g葡萄糖,2g蛋白胨,1g酵母膏,3 g K2HPO4,1.5 g MgSO4·7H2O,用1mol/L的HCl或NaOH调节pH值为5.8,115℃灭菌30min。在无菌操作条件下,用10mL无菌生理盐水荡洗下在斜面保藏培养基上活化生长的菌种,制成菌悬液,按液体种子培养基体积的6%接种量接入菌悬液,摇床培养2~4d,转速为180r/min,培养温度为23~26℃;
(3)植物浸提液制备:称取20目筛筛下物的植物干燥粉末,按照植物干燥粉末:水=1:10的质量比加水,间歇搅拌均匀,浸提24 h,过滤的滤液即为植物浸提液;
(4)配制液体发酵培养基:称取麸皮100g,加500mL水,煮沸20min,过滤得到滤液,加入蛋白胨5g,葡萄糖5g,可溶性淀粉15g,KH2PO4 4g,MgSO4·7H2O 2g,植物浸提液100mL,以水补足1L,溶解后调节pH为5.5~6.0,在115℃下灭菌30min;
(5)按液体发酵培养基体积的5%接入液体种子液,接种后摇匀静置培养6 h,在摇床上发酵5d,培养温度为25℃,转速为200r/min。
(6)在液体发酵培养基中以等量水替代植物浸提液,其余所有操作相同进行发酵培养,作为对照。当发酵结束时,采用血球计数板直接计数方法测定发酵液中孢子数量。取与对照同体积的发酵液,加入2%的NaCl,溶解后5000rpm离心15min;上清液加三倍体积95%乙醇沉淀多糖,4℃静置16 h后,5000rpm离心20 min,收集沉淀物,用蒸馏水溶解并定容,进行多糖测定,测定方法为苯酚-硫酸法,发酵液银耳孢子数为1.12×109个/mL,比对照提高88.76%,胞外多糖产量提高74.76%。
实施例2:
(1)斜面保藏培养基配制和菌种活化:去皮土豆200g切成小块,加蒸馏水800mL,煮沸30min,纱布过滤后得到滤液,加入葡萄糖20g,蛋白胨1g,KH2PO41g,MgSO4·7H2O 0.5 g,琼脂20 g,加热溶解后补水至1L,pH自然,在115℃下灭菌25min。将银耳母种接种后,于24℃温度下培养5d。
(2)液体种子的培养:在1L水中加入20g葡萄糖,2g蛋白胨,1g酵母膏,3gK2HPO4,1.5g MgSO4·7H2O,用1mol/L的HCl或NaOH调节pH值为5.8,115℃灭菌30min。在无菌操作条件下,用10mL无菌生理盐水荡洗活化的菌种,制成菌悬液,按6%接种量接入液体种子培养基中,摇床培养2~4d,转速为180r/min,培养温度为23~26℃;
(3)植物浸提液制备:称取20目筛筛下物的植物干燥粉末,按照植物干燥粉末:水=1:10的质量比加水,间歇搅拌均匀,浸提24 h,过滤的滤液即为植物浸提液;
(4)配制液体发酵培养基:称取麸皮150g,加600mL水,煮沸20min,过滤得到滤液,加入蛋白胨6g,葡萄糖10g,可溶性淀粉10g,KH2PO4 4g,MgSO4·7H2O 2g,植物浸提液150mL,以水补足1L,溶解后调节pH为5.5~6.0,在115℃下灭菌30min;
(5)按发酵培养基体积的5%接入液体种子液,接种后摇匀静置培养6 h,在摇床上发酵5d,培养温度为25℃,转速为200r/min。
(6)在液体发酵培养基中以等量水替代植物浸提液,其余所有操作相同进行发酵培养,作为对照。当发酵结束时,采用血球计数板直接计数方法测定发酵液中孢子数量。取与对照同体积的发酵液,分别加入2%的NaCl,溶解后5000rpm离心15min;上清液加三倍体积95%乙醇沉淀多糖,4℃静置16h后,5000rpm离心20min,收集沉淀物,用蒸馏水溶解并定容,进行多糖测定,测定方法为苯酚-硫酸法,发酵液银耳孢子数为1.38×109个/mL,比对照提高102.14%,胞外多糖产量提高92.64%。

Claims (2)

1.一种银耳孢子发酵高产银耳多糖的制备方法,其特征在于:所述方法步骤如下:
步骤一:采购银耳菌株Tr21;
步骤二:配制斜面保藏培养基:取200 g去皮土豆切成小块,加蒸馏水800mL,煮沸20~30min,纱布过滤后得到滤液,向滤液中加入20g葡萄糖、1g蛋白胨、1g KH2PO4、0.5g MgSO4·7H2O、20g琼脂,加热溶解后补水至总体积为1L,pH自然,在115℃下灭菌20~30 min;
步骤三:活化银耳菌种:将步骤一的菌株接种于步骤二的斜面保藏培养基上,于22.5~25.5℃温度下培养4~8 d;
步骤四:液体种子培养基配制及培养:1L水中加入20g葡萄糖,2g蛋白胨,1g酵母膏,3gK2HPO4,1.5g MgSO4·7H2O,用1mol/L的HCl或NaOH调节pH值为5.8~6.0,115℃灭菌25~30min;
在无菌操作条件下,用10mL无菌生理盐水荡洗步骤三斜面保藏培养基上的孢子制成菌悬液,按液体种子培养基体积的3~8%接种量接入菌悬液,摇床培养2~4 d,转速为170~200r/min,培养温度为23~26℃;
步骤五:植物浸提液制备:称取过20目筛的植物干燥粉末,按照植物干燥粉末:水=1:10的质量比加水,搅拌均匀,浸提24 h,过滤的滤液即为植物浸提液;
步骤六:液体发酵培养基的配制:称取麸皮100~200g,加500mL水,煮沸15~20 min,过滤得到滤液,加入蛋白胨5~7g,葡萄糖10~15 g,可溶性淀粉5~10 g,KH2PO4 4g,MgSO4·7H2O2g,植物浸提液100~500mL,以水补足1L,溶解后调节pH为5.5~6.0,在115℃下灭菌30 min;
步骤七:按步骤六液体发酵培养基体积的4~8%接入步骤四得到的种子液,接种后摇匀静置培养4~8 h,在摇床上发酵4~6 d,培养温度为23~25℃,搅拌转速为180~220 r/min。
2.根据权利要求1所述的一种银耳孢子发酵高产银耳多糖的制备方法,其特征在于:步骤五中,所述的植物浸提液所用植物为樟科润楠属植物。
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