CN111615996A - 一种大球盖菇菌种繁育方法 - Google Patents

一种大球盖菇菌种繁育方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种大球盖菇菌种繁育方法，包括：制备大球盖菇复壮培养基，将大球盖菇母种接种到复壮培养基上进行变温复壮纯培养，培育抗逆和高活性的大球盖菇母种；制备摇瓶液体培养基，将复壮培养后的大球盖菇母种接种到摇瓶液体培养基上，采用摇瓶液体深层发酵工艺，培育大球盖菇摇瓶液体菌种；制备发酵罐发酵培养基，将培养好的摇瓶液体菌种接种到发酵罐发酵培养基上，采用发酵罐液体深层发酵工艺，培育大球盖菇液体深层发酵菌种；采用堆制发酵方法，制备大球盖菇栽培种培养基，把制备的栽培种发酵培养基装入栽培种育种盘穴孔中，然后用接种枪将培养好的大球盖菇液体深层发酵菌种接种到育种盘穴孔中的栽培种发酵培养基上，采用开放式固体发酵工艺，培育大球盖菇栽培种。

Description

一种大球盖菇菌种繁育方法
技术领域
本发明属于食用菌菌种繁育领域，具体涉及一种大球盖菇菌种繁育方法。
背景技术
大球盖菇隶属担子菌门、伞菌纲、伞菌目、球盖菇科、球盖菇属。大球盖菇不仅含有丰富的膳食纤维、矿物质元素和维生素等营养物质，而且富含蛋白质和多糖等活性成分，能够调节人体免疫力、抗氧化、抑制肿瘤细胞和降血糖等，具有较高的营养价值和药用价值，是国际菇类交易市场上的十大菇类之一，也是联合国向发展中国家推荐栽培的重要食用菌品种。
上世纪60年代，德国开始试种大球盖菇，后来波兰和匈牙利等国家相继引种栽培，我国上世纪80年代开始引种试种，并获得成功。由于大球盖菇栽培原料广泛，栽培设施简单，栽培技术容易掌握，同时具有较好的经济、生态和社会效益，近年来在我国很多地区自北向南栽培面积不断扩大。
大球盖菇菌种是大球盖菇生产的基础原料，对大球盖菇高效生产具有重要的影响。近年来，在我国大球盖菇栽培获得成功并不断推广栽培的同时，大球盖菇栽培种繁育中一直存在污染率高、菌种容易老化、繁育周期长和生产成本高等诸多问题，导致大球盖菇栽培成本高、产量和质量不稳定，制约着大球盖菇产业的可持续发展。为了更好地开发利用大球盖菇，需要研究开发一种活性强、快速、高效的大球盖菇菌种繁育方法。
发明内容
本发明提供的方法目的在于提供一种大球盖菇栽培种活性强、快速、高效培育的方法。为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种大球盖菇菌种繁育方法，包括如下步骤：
S1、母种复壮：选择优质高产的大球盖菇品种作为母种，将活化后的大球盖菇母种接种到复壮培养基上，在8-32℃温度下进行变温复壮纯培养，所述复壮培养基的配方为：壳斗科树种树皮或边材100g，去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，磷酸二氢钾0.6g，硫酸镁0.5g，维生素B10.5g，水1000ml，pH6.5-7.5，选择在复壮培养基上变温复壮后菌丝生长势强、菌丝生长浓密、菌丝尖端生长整齐的复壮大球盖菇母种；
S2、液体菌种培育：将变温复壮培育的大球盖菇母种接种到大球盖菇摇瓶液体培养基上，采用摇瓶液体深层发酵工艺，培育大球盖菇摇瓶液体菌种，所述摇瓶液体培养基的配方为：葡萄糖1-2％、玉米粉2.5-3.5％、酵母粉0.25-0.35％、麸皮1.5-2.5％、KH2PO41.0-1.5％、MgSO4 0.5-1.0％、pH值6.5-7.5，摇瓶培养发酵终点判断标准为菌球数量为1100-1200个/ml、菌球直径为0.6-0.8mm，培养液澄清；
然后将大球盖菇摇瓶液体菌种接种到发酵罐发酵培养基上，采用发酵罐液体深层发酵工艺，培育大球盖菇发酵罐液体深层发酵菌种，所述发酵罐发酵培养基配方为：马铃薯20-25％、麦麸3-4％、蛋白胨2-3％、KH2PO40.1-0.15％、MgSO4·7H2O 0.05-0.1％、酵母粉0.3-0.4％、消泡剂1-1.5％，发酵终点判断标准为菌球数量为220-250个/ml、菌球直径为1.2-1.4mm、培养液澄清、pH值为3.5-4.0；
S3、栽培种培育：将发酵料装入发酵箱中发酵，制作大球盖菇栽培种发酵培养基，把制备的栽培种发酵培养基装入育种穴盘中的孔穴中，然后用接种枪将培养好的大球盖菇发酵罐液体深层发酵菌种接种到育种盘孔穴中的栽培种发酵培养基上，采用开放式固体发酵工艺，培育大球盖菇栽培种，所述栽培种发酵培养基的配方为：直径为4-5mm颗粒型木屑75-76％、直径为0.5-1mm，粉碎型木屑12％、尿素2-3％、稻田土10％，培育10-15d后，当大球盖菇菌丝长透培养料，即培育成大球盖菇栽培种。
作为本发明优选的实施方案，所述S1步骤中，所述复壮培养基的制备方法为：将去皮后的马铃薯洗净称重后加入500ml水，煮沸后，用小火再煮10-15min，趁热用双层纱布过滤，取滤液，制成马铃薯煮汁液；将称重后的树皮或边材粉碎或切成小块，加入500ml水，煮沸后用小火再煮10-15min，趁热用双层纱布过滤，取滤液，制成木块煮汁液；将马铃薯煮汁液和木块煮汁液混合后加入琼脂，待琼脂融化后加入其它成分，经过定容、灭菌、分装和冷却，制成大球盖菇母种复壮培养基。
作为本发明优选的实施方案，所述S1步骤中，所述变温复壮纯培养是先从8℃以1℃/h 递增到32℃，然后从32℃以1.5℃/h递减到22℃，再稳定在22℃培养，选择在复壮培养基上菌丝生长势强、菌丝生长浓密、菌丝尖端生长整齐的母种。
作为本发明优选的实施方案，所述S2步骤中，所述摇瓶液体培养的工艺参数为：摇瓶装料系数为25-30％、23-25℃下静止培养时间为2.5-3d，摇瓶培养温度为24-26℃，摇瓶培养前1-2d转速为160-180r/min，摇瓶培养3-4天后转速为200r/min。
作为本发明优选的实施方案，所述S2步骤中，所述发酵罐液体发酵培养工艺参数为：发酵罐装料系数为55-60％，接种量为12-15％，培养温度为24-26℃，搅拌机转速为180-200r/min，通气量为1:0.6-0.7V/V/min，培养时间5-6天。
作为本发明优选的实施方案，所述S3步骤中，所述育种穴盘采用53cm×27cm×3.6cm 规格的塑料200孔穴盘，孔穴尺寸为上口径2.4cm×2.4cm、下口径1.0cm×1.0cm，每个育种穴盘装湿料3kg。
作为本发明优选的实施方案，所述S3步骤中，接种量为每穴盘栽培种培养基接种20-30ml 液体菌种；培养条件为培养室温度24-26℃，空气相对湿度为78％-80％，每天通风2次，每次通风15-20min，培养室光照强度调整为黑暗。
作为本发明优选的实施方案，所述S3步骤中，所述栽培种发酵培养基的制备方法为：先将木屑和尿素按照栽培种发酵培养基配方混合均匀，调节混合料含水量至65-70％，然后将混合料装入发酵箱里，混合料在发酵箱里堆至距离泡沫盖板12-15cm，盖好泡沫盖板，将发酵期环境温度调控在22-24℃，当堆料温度升至60℃时维持2d后进行第一次翻堆，翻堆时将堆料重新混合均匀，然后继续发酵；当堆料温度再次上升至60℃时维持2d后，进行第二次翻堆；当堆料温度上升至70℃-72℃后维持5d后完成发酵，发酵终点判断标准为发酵料没有刺激的氨气气味，颜色变浅褐色。发酵结束后，将90％发酵料和10％稻田土混合均匀，调节混合料含水量至65％，制成大球盖菇栽培种发酵培养基。
综上，与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：
(1)采用大球盖菇母种复壮培养基和变温复壮培养工艺，大球盖菇菌种活性及抗逆性增强，菌丝生长速度更快；
(2)采用液体发酵方法生产液体菌种和液体菌种接种栽培种工艺，大球盖菇菌种繁育周期缩短，大球盖菇菌种活力增强，大球盖菇液体菌种和栽培种的生长一致性提高；
(3)采用开放式培养工艺，工作效率高，生产菌种一致性程度高，而且因为育种穴盘的孔穴体积小，使得大球盖菇栽培种培养时间缩短了30-35d，培育的大球盖菇栽培种菌丝生长健壮，大球盖菇栽培种生产成本降低30％以上。
(4)设置的育种穴盘孔穴体积大小即为培育成的大球盖菇栽培种尺寸大小，可以直接进行播种，工作效率高，可以避免损伤菌丝活性，从而加快了栽培种菌丝在田间的萌发速度和抗杂能力。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实验例1
采用以下方法繁育大球盖菇栽培种。
S1、母种复壮
选择优质高产的大球盖菇品种，制备大球盖菇复壮培养基，将活化后的大球盖菇母种接种到复壮培养基上，在8-32℃温度下进行变温复壮纯培养，所述变温复壮纯培养是先从8℃以1℃/h递增到32℃，然后从32℃以1.5℃/h递减到22℃，再稳定在22℃培养，选择在复壮培养基上菌丝生长势强、菌丝生长浓密、菌丝尖端生长整齐的母种，培育成复壮大球盖菇母种。
大球盖菇母种复壮培养基配方：壳斗科树种树皮或边材100g，去皮马铃薯200g，葡萄糖 20g，琼脂20g，磷酸二氢钾0.6g，硫酸镁0.5g，维生素B10.5g，水1000ml，pH7.0；
大球盖菇母种复壮培养基制备工艺：将去皮后的马铃薯洗净称重后加入500ml水，煮沸后，用小火再煮15min，趁热用双层纱布过滤，取滤液，制成马铃薯煮汁液；将称重后的树皮或边材粉碎或切成小块，加入500ml水，煮沸后用小火再煮10-15min，趁热用双层纱布过滤，取滤液，制成木块煮汁液；将马铃薯煮汁液和木块煮汁液混合后加入琼脂，待琼脂融化后加入其它成分，经过定容、灭菌、分装和冷却，制成大球盖菇母种复壮培养基；
大球盖菇母种变温复壮纯培养：将活化后的大球盖菇母种接种到复壮培养基上，在8-32℃温度区间进行变温复壮培养，所述变温复壮纯培养是先从8℃以1℃/h递增到32℃，然后从 32℃以1.5℃/h递减到22℃，再稳定在22℃培养，选择在复壮培养基上菌丝生长势强、菌丝生长浓密、菌丝尖端生长整齐的母种，培育成复壮大球盖菇母种。
S2、液体菌种培育
①液体菌种摇瓶培育
将复壮后的大球盖菇母种接种到大球盖菇摇瓶液体培养基上，采用摇瓶液体深层发酵工艺，培育大球盖菇摇瓶液体菌种。
摇瓶培养基配方：葡萄糖1.5%、玉米粉 3%、酵母粉0. 3%、麸皮 2%、KH2PO41.2%、MgSO4 0.8%、pH 值7.0；
摇瓶液体培养工艺参数：摇瓶装料系数为 28%、25℃下静止培养时间为 3d，摇瓶培养温度为25℃，摇瓶培养前2d转速为160r/min，摇瓶培养后4天转速为200 r/min；摇瓶培养发酵终点判断标准：菌球数量为 1100-1200个/ml、菌球直径为 0.6-0.8mm，培养液澄清。
②液体菌种发酵罐发酵培育
将大球盖菇摇瓶液体菌种接种到发酵罐发酵培养基上，采用液体深层发酵工艺，培育大球盖菇发酵罐液体深层发酵菌种。
发酵罐发酵培养基配方：马铃薯25％、麦麸4％、蛋白胨2.5％、KH2PO40.15％、MgSO4·7 H2O 0.07％、酵母粉0.35％、消泡剂1.3％；
发酵罐液体发酵培养工艺参数：发酵罐装料系数为58％，接种量为13％，培养温度为25℃，搅拌机转速为180r/min，通气量为1:0.6V/V/min，培养时间6天；发酵终点判断标准：菌球数量为220-250个/ml、菌球直径为1.2-1.4mm、培养液澄清、pH值为3.5-4.0。
S3、栽培种培育
将发酵料装入育种穴盘中发酵，制作大球盖菇栽培种发酵培养基，把制备的栽培种发酵培养基装入栽培种育种穴盘中，填满孔穴即可，然后用接种枪将培养好的大球盖菇发酵罐液体深层发酵菌种接种到育种盘穴孔中的栽培种发酵培养基上，采用开放式固体发酵工艺，培育大球盖菇栽培种。
①栽培种发酵培养基制备
栽培种发酵培养基配方：直径为4-5mm颗粒型木屑75%、直径为0.6mm粉碎型木屑12%、尿素3%、稻田土10%；
发酵箱制作方法：选用厚度为5cm的可发性聚苯乙烯泡沫板，按照90cm×70cm×50cm的规格制成长方体发酵箱，发酵箱上面用厚度为5cm的可发性聚苯乙烯泡沫板制作一块活动式盖板，盖板上按照10cm×15cm行间距均匀地打两排直径为5cm的通气圆孔；
栽培种发酵培养基制备工艺：先将木屑和尿素按照栽培种发酵培养基配方混合均匀，调节混合料含水量至70%，然后将混合料装入发酵箱里，混合料在发酵箱里堆至距离泡沫盖板15cm，盖好泡沫盖板，将发酵期环境温度调控在24℃。当堆料温度升至60℃时维持2d后，进行第一次翻堆，翻堆时将堆料重新混合均匀，然后继续发酵；当堆料温度再次上升至60℃时维持2d后进行第二次翻堆；当堆料温度上升至72℃后，维持5d后完成发酵。发酵终点判断标准为发酵料没有刺激的氨气气味，颜色变浅褐色。发酵结束后，将90%发酵料和10%稻田土混合均匀，调节混合料含水量至65%，制成栽培种发酵培养基。
②栽培种培养
将栽培种发酵培养基分装到育种穴盘的孔穴中，然后用接种枪把培育好的大球盖菇发酵罐液体深层发酵菌种接种到育种盘穴孔中的栽培种发酵培养基表面，采用开放式固体发酵工艺，培育成大球盖菇栽培种。
栽培种开放式固体发酵工艺：所述开放式固体发酵培养容器采用育种穴盘，育种穴盘采用53cm×27cm×3.6cm规格的塑料200孔穴盘，孔穴尺寸为上口径2.4cm×2.4cm、下口径 1.0cm×1.0cm，每个育种穴盘装湿料3kg，开放式固体发酵接种量为每穴盘栽培种培养基接种20-30ml液体菌种；开放式固体发酵培养条件为培养室温度24-26℃，空气相对湿度为 78％-80％，每天通风2次，每次通风15-20min，培养室光照强度为黑暗，培育10-15d后，当大球盖菇菌丝长透培养料2-3天，即培育成大球盖菇栽培种。
对比例1-5
按照实施例1所述方法培育大球盖菇栽培种，区别在于，对比例1-5的复壮培养基的配方中，分别用下表中的树皮替代实施例1中的壳斗科树种树皮或边材，使用量均为100g。
表1对比例1-5使用的树皮种类
对比例1 对比例2 对比例3 对比例4 对比例5
榆树皮 松树皮 柳树皮 杨树皮 广玉兰树皮
对实施例1及对比例1-5在S1步骤培育的复壮大球盖菇母种在相同培育时间段进行菌落长势评分，由差到好依次为1-5分，5分表示菌丝浓密，3分表示菌丝较浓密，3分表示菌丝较稀疏，2分表示菌丝稀疏，1分表示菌丝极稀疏，统计结果见表2。
表1实施例1和对比例1-5母钟复壮菌丝情况(菌落长势评分)
培育时间 3d 6d 9d 12d 15d 18d
实施例1 1 3 4 5 —— ——
对比例1 1 1 2 3 5 ——
对比例2 —— 1 2 3 4 5
对比例3 1 2 2 4 5 ——
对比例4 —— 1 3 3 4 5
对比例5 1 2 3 3 4 5
上述实验结果表明，本发明以壳斗科树种树皮或边材和去皮马铃薯为主要培养基成分，进行母种复壮，结果相较于其他树皮制备的培养基，其菌丝生长速度最快，可显著缩短培养时间。
对比例6-9
按照实施例1所述方法培育大球盖菇栽培种，区别在于，对比例6-8变温复壮培养方法按照表3进行，对比例9则始终在25℃常温培养。
表3对比例6-8使用的变温驯化方法
Figure BDA0002498231540000061
对实施例1及对比例6-9在S1步骤培育的复壮大球盖菇母种在相同培育时间段(培育第 12天)进行菌丝生长速度的测定，菌丝生长速度＝1/2(菌落半径)(mm)/菌丝生长时间(d)，统计结果见表4。
表4实施例1与对比例6-9培育第12天菌丝生长速度结果
培育时间 菌丝生长速度mm/d
实施例1 3.18±0.08
对比例6 1.94±0.13
对比例7 2.16±0.06
对比例8 1.49±0.05
对比例9 0.87±0.03
上述实验结果表明，本发明以从8℃以1℃/h递增到32℃，然后从32℃以1.5℃/h递减到22℃，再稳定在22℃培养的变温复壮方法培育，结果相较于其他方法培育，其菌丝生长速度最快，可显著缩短培养时间。
对比例10-11
按照实施例1所述方法培育大球盖菇栽培种，区别在于，对比例10不是将栽培种发酵培养基填满育种穴盘中培养，而是将栽培种发酵培养基分装到塑料培养筐中，采用接种枪喷洒的方式，把培育好的大球盖菇发酵罐液体菌种接种到栽培种发酵培养基表面上，培养筐采用48cm×30cm×17cm规格的塑料筐，每个培养筐装湿料5kg；接种量为每筐栽培种培养基接种20-30ml液体菌种；采用开放式固体发酵工艺，培养条件：培养室温度26℃，空气相对湿度为80%，每天通风2次，每次通风15-20min，培养室光照强度为黑暗；30-35d后，当大球盖菇菌丝长透培养料后，即培育成大球盖菇栽培种。
对比例11不是将栽培种发酵培养基填满育种穴盘中培养，将发酵箱中制备好的栽培种发酵培养基，直接按每5kg栽培种发酵培养基接种20-30ml液体菌种，然后将接种后的栽培种发酵培养基分装于透气塑料袋中，然后置于培养室，培养室温度26℃，空气相对湿度为80%，每天通风2次，每次通风15-20min，培养室光照强度为黑暗；35-40d后，当大球盖菇菌丝长透培养料，菌丝布满栽培种培养基后，即培育成大球盖菇栽培种。
对实施例1及对比例10-11在S3步骤培育的栽培种(含培养基)移入菇房培养，室内温度控制在18-22℃，湿度75-85％，观察子实体长势(+增多，表示长势更好)，栽培种培育好后，进行播种出菇试验，记录出菇率、生长周期，并计算生物学效率，统计结果见表5。
表5实施例1与对比例10-11栽培种种植效果
考察指标 菌丝长势 生物学效率％ 生长周期d
实施例1 +++++ 85 52
对比例10 ++++ 62 75
对比例11 +++ 41 96
上述实验结果表明，本发明采用育种穴盘培育栽培种，结果相较于其他方法获得的栽培种菌丝生长旺盛，菌种活性更强，生长周期更短。

Claims (8)

1.一种大球盖菇菌种繁育方法，其特征在于包括如下步骤：
S1、母种复壮：选择优质高产的大球盖菇品种作为母种，将活化后的大球盖菇母种接种到复壮培养基上，在8-32℃温度下进行变温复壮纯培养，选择变温条件下在复壮培养基上菌丝生长势强、菌丝生长浓密、菌丝尖端生长整齐的母种，培育成复壮大球盖菇母种，所述复壮培养基的配方为：壳斗科树种树皮或边材100g，去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，磷酸二氢钾0.6g，硫酸镁0.5g，维生素B10.5g，水1000ml，pH6.5-7.5；
S2、液体菌种培育：将变温复壮培育的大球盖菇母种接种到大球盖菇摇瓶液体培养基上，采用摇瓶液体深层发酵工艺，培育大球盖菇摇瓶液体菌种，所述摇瓶液体培养基的配方为：葡萄糖1-2%、玉米粉 2.5-3.5%、酵母粉0. 25-0.35%、麸皮 1.5-2.5%、KH2PO41.0-1.5%、MgSO4 0.5-1.0%、 pH 值6.5-7.5，摇瓶培养发酵终点判断标准为菌球数量为1100-1200个/ml、菌球直径为0.6-0.8mm，培养液澄清；
然后将大球盖菇摇瓶液体菌种接种到发酵罐发酵培养基上，采用发酵罐液体深层发酵工艺，培育大球盖菇发酵罐液体深层发酵菌种，所述发酵罐发酵培养基配方为：马铃薯20-25%、麦麸 3-4%、蛋白胨2-3%、KH2PO40.1-0.15%、 MgSO4·7 H2O 0.05-0.1%、酵母粉 0.3-0.4%、消泡剂1-1.5%，发酵终点判断标准为菌球数量为220-250个/ml、菌球直径为 1.2-1.4mm、培养液澄清、pH 值为 3.5-4.0；
S3、栽培种培育：将发酵料装入发酵箱中发酵，制作大球盖菇栽培种发酵培养基，把制备好的栽培种发酵培养基装入栽培种育种盘穴孔中，然后用接种枪将培养好的大球盖菇发酵罐液体深层发酵菌种接种到育种盘孔穴中的栽培种发酵培养基上，采用开放式固体发酵工艺，培育大球盖菇栽培种，所述栽培种发酵培养基配方为：直径为4-5mm颗粒型木屑75-76%、直径为0.5-1mm，粉碎型木屑12%、尿素2-3%、稻田土10%，培育10-15d后，大球盖菇菌丝长透栽培种培养基后，即培育成大球盖菇栽培种。
2.根据权利要求1所述的大球盖菇菌种繁育方法，其特征在于所述S1步骤中，所述复壮培养基的制备方法为：将去皮后的马铃薯洗净称重后加入500ml水，煮沸后，用小火再煮10-15min，趁热用双层纱布过滤，取滤液，制成马铃薯煮汁液；将称重后的树皮或边材粉碎或切成小块，加入500ml水，煮沸后用小火再煮10-15min，趁热用双层纱布过滤，取滤液，制成木块煮汁液；将马铃薯煮汁液和木块煮汁液混合后加入琼脂，待琼脂融化后加入其它成分，经过灭菌、分装和冷却，制成大球盖菇母种复壮培养基。
3.根据权利要求1所述的大球盖菇菌种繁育方法，其特征在于所述S1步骤中，所述变温复壮纯培养是先从8℃以1℃/h递增到32℃，然后从32℃以1.5℃/h递减到22℃，再稳定在22℃培养，选择在复壮培养基上菌丝生长势强、菌丝生长浓密、菌丝尖端生长整齐的母种，培育成复壮大球盖菇母种。
4.根据权利要求1所述的大球盖菇菌种繁育方法，其特征在于所述S2步骤中，所述摇瓶液体培养的工艺参数为：摇瓶装料系数为25-30%、23-25℃下静止培养时间为 2.5-3d，摇瓶培养温度为24-26℃，摇瓶培养前1-2d转速为160-180r/min，摇瓶培养3-4天后转速为200r/min。
5.根据权利要求1所述的大球盖菇菌种繁育方法，其特征在于所述S2步骤中，所述发酵罐液体发酵培养工艺参数为：发酵罐装料系数为55-60%，接种量为12-15%，培养温度为24-26℃，搅拌机转速为 180-200r/min，通气量为1:0.6-0.7V/V/min，培养时间5-6天。
6.根据权利要求1所述的大球盖菇菌种繁育方法，其特征在于所述S3步骤中，所述育种穴盘采用53cm×27cm×3.6cm规格的塑料200孔穴盘，孔穴尺寸为上口径2.4cm×2.4cm、下口径1.0cm×1.0cm，每个育种穴盘装湿料3kg。
7.根据权利要求1所述的大球盖菇菌种繁育方法，其特征在于所述S3步骤中，接种量为：每穴盘栽培种培养基接种20-30ml液体菌种；培养条件为：培养室温度24-26℃，空气相对湿度为78%-80%，每天通风2次，每次通风15-20min，培养室光照强度为黑暗。
8.根据权利要求1所述的大球盖菇菌种繁育方法，其特征在于所述S3步骤中，所述栽培种发酵培养基的制备方法为：先将木屑和尿素按照栽培种发酵培养基配方混合均匀，调节混合料含水量至65-70%，然后将混合料装入发酵箱里，混合料在发酵箱里堆至距离泡沫盖板12-15cm，盖好泡沫盖板，将发酵期环境温度调控在22-24℃，当堆料温度升至60℃时维持2d后，进行第一次翻堆，翻堆时将堆料重新混合均匀，然后继续发酵；当堆料温度再次上升至60℃时维持2d后进行第二次翻堆；当堆料温度上升至70℃-72℃后，维持5d后完成发酵，发酵终点判断标准为发酵料没有刺激的氨气气味，发酵料颜色变浅褐色，发酵结束后，将90%发酵料和10%稻田土混合均匀，调节混合料含水量至65%，制成大球盖菇栽培种发酵培养基。
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