CN108753676A

CN108753676A - 一种大球盖菇耐高温菌株的选育方法

Info

Publication number: CN108753676A
Application number: CN201810803328.5A
Authority: CN
Inventors: 姜淑霞; 朱静娴; 孟丽; 王庆佶; 李丽君; 任纪帆
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2018-07-20
Filing date: 2018-07-20
Publication date: 2018-11-06
Anticipated expiration: 2038-07-20
Also published as: CN108753676B

Abstract

本发明公开了一种大球盖菇耐高温菌株的选育方法，包括以下步骤：(1)收集大球盖菇菌株或子实体，进行遗传多样性及亲缘关系分析，剔除亲缘关系较近的菌株，将剩余菌株作为供试菌株；(2)将供试菌株进行菌丝耐高温递进式循环驯化，筛选出大球盖菇耐高温驯化菌株；(3)将大球盖菇耐高温驯化菌株接种于液体培养基中，静置培养，收集菌丝体，加入溶壁酶进行酶解，制备得到原生质体；(4)将原生质体进行高温再生试验，筛选出耐高温菌株。本发明筛选出优质高产的耐高温菌株，解决生产上初秋早播菌丝不耐高温、晚秋播种来年春末夏初子实体易开伞的问题，为华东地区早秋栽培初冬季节采收，以及延长春季出菇期提供了优质高产的菌株。

Description

一种大球盖菇耐高温菌株的选育方法

技术领域

本发明涉及真菌育种技术领域，具体涉及一种大球盖菇耐高温菌株的选育方法。

背景技术

大球盖菇(Stropharia rugosoannulata)是一种重要的食、药用真菌，其味美色优，营养丰富，具有增强人体免疫、降低血糖等保健及药用价值。大球盖菇属于中低温类食用菌，其菌丝生长温度适应范围为5-32℃，子实体形成及生长的温度范围为10-20℃，当气温上升至20℃时子实体易开伞，品质变差，25℃时原基不分化，因此我国华东地区露天栽培时，若8-9月份播种，11-12月份出菇时产品质量好，耐储存，但播种后菌丝遇到30℃以上高温，易造成“烧菌”，导致栽培失败或减产。因此在生产上一般安排在10-11月份播种，来年4月上旬地温稳定在12℃以上开始出菇，但由于气温、地温均回升很快，在5月中、下旬以后子实体质量迅速下降，严重影响生产效益。因此，亟需筛选出优质的耐高温大球盖菇菌株。

目前食用菌耐高温菌株的筛选主要是采用菌丝体热激法，即菌丝体在适宜培养条件下培养一定时间后，放入高温条件下进行热刺激1-8h，再取出放在正常温度25℃下进行恢复培养，测量菌丝的生长速度，淘汰耐高温能力差的菌株。但这种方法筛选出的耐高温菌株缺乏代表性及稳定性，随继代培养次数的增加，菌株的异质性也越来越明显；而且容易出现菌丝体耐高温，但高温条件下不能正常出菇的问题。

发明内容

针对上述现有技术，为了解决生产上初秋早播菌丝不耐高温、晚秋播种来年春末夏初子实体易开伞的问题，本发明的目的是提供一种大球盖菇耐高温菌株的选育方法，本发明通过菌丝耐高温驯化、原生质体育种定向选育出大球盖菇耐高温菌株，并在春暖棚、冬暖棚及林下环境中验证其稳定性和耐高温品质，筛选出高产优质的耐高温菌株。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种大球盖菇耐高温菌株的选育方法，包括以下步骤：

(1)收集大球盖菇菌株或子实体，对收集的大球盖菇菌株进行遗传多样性及亲缘关系分析，剔除亲缘关系较近的菌株，将剩余菌株作为供试菌株；

(2)将供试菌株进行菌丝耐高温递进式循环驯化，筛选出可在42℃条件下耐受6h的菌株作为大球盖菇耐高温驯化菌株；

(3)将步骤(2)筛选的大球盖菇耐高温驯化菌株接种于液体培养基中，静置培养，收集菌丝体，加入溶壁酶进行酶解，制备得到原生质体；

(4)将步骤(3)制备的原生质体进行高温再生试验，筛选出经过34℃培养后，菌丝长速较快、长势良好、异质性低的菌株作为耐高温菌株。

优选的，步骤(1)中，通过SRAP分子标记技术对收集的大球盖菇菌株进行遗传多样性及亲缘关系分析。

优选的，步骤(1)中，所述剔除亲缘关系较近的菌株，是通过比较菌株间的相似性系数进行剔除的，若两株菌的相似性系数大于0.96，则只保留其中一株菌。

优选的，步骤(2)中，所述菌丝耐高温递进式循环驯化，具体为：将供试菌株在26℃培养16h，30℃培养8h，循环16次；以菌丝生长速率、菌落颜色以及菌丝粗壮程度为指标进行综合筛选，筛选出生长速度较快，长势良好的菌株，依次进行(26℃，16h；34℃，8h)、(26℃，16h；38℃，8h)、(26℃，16h；42℃，6h)三个温度层次的循环驯化筛选，每个温度层次的循环进行16次。

优选的，步骤(3)中，所述液体培养基的组成为：马铃薯200.0g，葡萄糖20.0g，水1000.0mL。

优选的，步骤(3)中，原生质体制备的条件为：收集菌龄为4d的菌丝体，按每100mg的菌丝体中加入1mL浓度为1.5％的溶壁酶，在32℃条件下酶解3h。

进一步的，步骤(3)中，所述原生质体的制备还包括纯化的步骤，即：酶解后过滤除去残留菌丝，滤液经3500r/min离心15min，弃上清，沉淀用0.6mol/L的甘露醇洗涤。

优选的，步骤(4)中，所述高温再生试验，具体为：调整步骤(3)制备的原生质体浓度，均匀涂布于再生培养基中，26℃恒温倒置闭光恢复1-2d后将温度升到34℃，继续恒温闭光培养5d；挑取耐高温再生菌株，26℃培养5d后进行镜检，剔除掉其中的单核菌株，剩余菌株于26℃条件下培养5d后将温度调整至34℃，继续培养5d，再将温度调至26℃恢复培养5d；比较各菌株的生长速率，筛选出经过34℃培养后，菌丝长速较快、长势良好、异质性低的菌株作为耐高温菌株。

所述再生培养基的组成为：马铃薯200.0g，蔗糖20.0g，蛋白胨2.0g，酵母粉2.0g，磷酸二氢钾1.5g，磷酸氢二钾1.5g，硫酸镁1.5g，0.6mol/L甘露醇1000.0mL，琼脂20.0g。

优选的，在将步骤(3)制备的原生质体进行高温再生试验之前，还包括：将原生质体进行紫外诱变处理或融合处理的步骤。其中：

紫外处理是将原生质体紫外照射30s。

融合处理是两种纯化好的大球盖菇原生质体调整到106个/mL，分别进行热灭活和紫外灭活，用移液枪吸取两种灭活原生质体各0.5mL加入到2mL无菌离心管中，30℃预热5min，以25％的PEG6000与0.02mol/L Ca²⁺混合溶液为助溶剂，调节pH为8.5，26℃融合30min。离心弃上清，用无菌渗透压稳定剂洗涤两次，去除PEG毒性。

本发明的有益效果：

为了解决生产上初秋早播菌丝不耐高温、晚秋播种来年春末夏初子实体易开伞的问题，本发明从菌丝耐高温驯化入手，在初筛获得耐高温驯化菌株的基础上，通过原生质体育种技术，定向选育出大球盖菇耐高温菌株，然后再对筛选得到的耐高温大球盖菇菌株在不同环境下栽培，进行出菇产量、品质和稳定性验证，最后筛选出优质高产的耐高温菌株，为华东地区早秋栽培初冬季节采收，以及延长春季出菇期提供了优质高产的菌株。

附图说明

图1：基于SRAP标记的23个大球盖菇菌株的UPGMA聚类图。

图2：耐高温菌株与出发菌株亲缘关系图。

图3：春暖棚大球盖菇栽培期间温度统计。

图4：冬暖棚温度统计。

图5：林地温度统计。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分所介绍的，现有的大球盖菇菌种耐高温性差，严重影响了其生产效益。而目前食用菌耐高温菌株的筛选主要是采用菌丝体热激法，但这种方法筛选出的耐高温菌株缺乏代表性及稳定性，随继代培养次数的增加，菌株的异质性也越来越明显；而且容易出现菌丝体耐高温，但高温条件下不能正常出菇的问题。基于此，本发明的目的是提供一种大球盖菇耐高温菌株的选育方法。本发明通过菌丝耐高温驯化、原生质体育种定向选育出大球盖菇耐高温菌株，并在春暖棚、冬暖棚及林下环境中验证其稳定性和耐高温品质，筛选出高产优质的耐高温菌株，以期选育出适合早秋栽培的菌丝耐高温优质高产栽培品种，达到当年秋末冬初出菇，收获产量高、品质好的子实体；解决了生产上初秋早播菌丝不耐高温、晚秋播种来年春末夏初子实体易开伞的问题，为广大栽培者提供多个高产优质栽培品种。

在本发明的一种实施方案中，给出的大球盖菇耐高温菌株的选育方法，包括以下步骤：

(1)在大球盖菇的主要栽培区收集大球盖菇菌株或子实体，对收集的大球盖菇菌株通过SRAP分子标记技术进行遗传多样性及亲缘关系分析，剔除亲缘关系较近的菌株，将剩余菌株作为供试菌株。

(2)将供试菌株进行菌丝耐高温递进式循环驯化，具体为：将供试菌株在26℃培养16h，30℃培养8h，循环16次；以菌丝生长速率、菌落颜色以及菌丝粗壮程度为指标进行综合筛选，筛选出生长速度较快，长势良好的菌株，依次进行(26℃，16h；34℃，8h)、(26℃，16h；38℃，8h)、(26℃，16h；42℃，6h)三个温度层次的循环驯化筛选，每个温度层次的循环进行16次。筛选出可在42℃条件下耐受6h的菌株作为大球盖菇耐高温驯化菌株。

(3)将步骤(2)筛选的大球盖菇耐高温驯化菌株接种于液体培养基中，静置培养，收集菌龄为4d的菌丝体，按每100mg的菌丝体中加入1mL浓度为1.5％的溶壁酶，在32℃条件下酶解3h，制备得到原生质体；

(4)将步骤(3)制备的原生质体进行高温再生试验，具体为：调整步骤(3)制备的原生质体浓度，均匀涂布于再生培养基中，26℃恒温倒置闭光恢复1-2d后将温度升到34℃，继续恒温闭光培养5d；挑取耐高温再生菌株，26℃培养5d后进行镜检，剔除掉其中的单核菌株，剩余菌株于26℃条件下培养5d后将温度调整至34℃，继续培养5d，再将温度调至26℃恢复培养5d；比较各菌株的生长速率，筛选出经过34℃培养后，菌丝长速较快、长势良好、异质性低的菌株作为耐高温菌株。

上述选育方法中，通过SRAP分子标记技术进行遗传多样性及亲缘关系分析，可以了解供试菌株间的遗传多样性，明确菌株间的亲缘关系，为育种提供了基础。将亲缘关系较近的菌株剔除，可以避免一些同物异名菌株资源的重复使用，提高了育种效率。

现有的菌丝体耐高温筛选方法由于高温条件单一、缺乏菌丝体由低温到高温驯化适应性、稳定性锻炼，导致筛选出的耐高温菌株缺乏稳定性，经过多次转接后，同一处理的不同重复中菌丝耐高温能力差异性越来越显著。原因可能是菌株在耐高温驯化中部分菌丝耐高温能力逐步增加，另一部分菌丝耐高温能力退化，使该菌株的异质性增加，随继代培养次数的增加，差异越来越明显。对此，本发明采用递进循环式耐高温驯化，并对耐高温驯化条件进行了优化，将每次高温驯化的时间适当缩短，然后恢复常温培养后再进行下一次的热激循环培养，使菌丝逐步适应高温环境。经多次试验发现，采用本发明的递进式循环驯化条件，可以保证菌丝生长势，避免了长时间高温条件培养引起的菌株退化。为降低菌株的异质性，本发明将递进式循环驯化后的菌株制备成原生质体，然后进行原生质体高温再生试验，通过对高温再生试验条件的优化，从而有效降低了菌株的异质性。

原生质体的制备与再生是原生质体育种的基础，溶壁酶的处理条件是制备原生质体的关键，若溶壁酶的浓度过低，则原生质体释放效率低；若酶浓度过高，则菌丝细胞壁完全溶解，细胞受到损伤易破裂，影响原生质体再生能力；经多次试验发现，原生质体制备最佳的溶壁酶浓度为1.5％(质量浓度)。

酶解温度对原生质体产量的影响较大，主要在于两个方面，一方面随着温度的升高，反应速度加快，原生质体释放量不断增大；另一方面，温度升高蛋白质逐步变性，反应速率降低，原生质体释放率减小，同时，菌丝细胞因失去细胞壁的保护对温度更加敏感，在较高的温度下极易死亡，使原生质体产量进一步降低。经试验发现，在26℃-32℃范围内，原生质体产量逐步增多，当温度达到32℃时，原生质体产量达到最大(1.45×10⁷个/mL)。

研究发现，大球盖菇原生质体产量随酶解时间的增加而增加，3.0h时原生质体产量最高(1.48×10⁷个/mL)，超过3h，原生质体数量基本稳定，即菌丝酶解释放的原生质体数约等于原生质体死亡数。因此，本发明将酶解时间确定为3h。

原生质体产量随菌丝体培养时间的延长而增加，菌龄较小时菌丝幼嫩，容易酶解，原生质体过早暴露在酶液中易死亡破裂，影响原生质体产量；随培养时间的延长，菌丝体不断成熟，当培养4d时，原生质体产量达到最大(1.51×10⁷个/mL)；当菌龄达到5d时，菌丝开始老化，酶解效率降低，原生质体产量明显减少。试验发现，培养4d的大球盖菇菌丝体比较适合作为原生质体制备材料。

紫外照射与原生质体灭活会给菌株带来较大的损伤，增加原生质体再生难度，而且诱变产生的效果是随机的，使筛选难度加大，因此，本发明优选在34℃条件下进行原生质体再生，可定向选育出耐高温菌株，减少了工作量，提高了育种效率。

但是，紫外诱变有可能会产生优良性状，原生质体融合会将两亲本的优势性状集合到一起，获得具有双亲遗传性状的稳定融合菌株，因此，在实际选育过程中，也可以将原生质体先进行紫外诱变或者原生质体融合，然后再进行高温再生试验。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或者按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。

本发明实施例中所用到的培养基：

母种培养基：马铃薯200.0g，葡萄糖20.0g，硫酸镁1.5g，蛋白胨3.0g，磷酸二氢钾3.0g，琼脂20.0g，水1000.0mL。

液体培养基：马铃薯200.0g，葡萄糖20.0g，水1000.0mL。

再生培养基：马铃薯200.0g，蔗糖20.0g，蛋白胨2.0g，酵母粉2.0g，磷酸二氢钾1.5g，磷酸氢二钾1.5g，硫酸镁1.5g，渗透压稳定剂1000.0mL，琼脂20.0g。

以0.6mol/L的甘露醇为渗透压稳定剂。

栽培种养基质及配方：木屑30％，棉籽壳30％，稻壳20％，麦麸18％，石膏1％，生石灰1％，含水量65％。

实施例1：大球盖菇耐高温菌株的选育

1.从上海农科院、山东农科院、泰安农科院、三明真菌研究所、四川土壤肥料研究所及辽宁大连、黑龙江绥化、云南玉溪、山东济宁等大球盖菇主要栽培区收集大球盖菇菌株或子实体，共获得23株大球盖菇菌株(表1)。其中明大128(SM)、大球盖菇1号(TF)为2008年国家认证品种。

表1：菌株名称及来源

2.菌株遗传多样性及亲缘关系分析：

2.1方法：

2.1.1菌株活化、培养及DNA提取

将收集到的菌株和栽培地采集到的子实体经组织分离纯化培养后，放置在4℃冰箱保存备用。在DNA提取前将23株大球盖菇菌株活化后接种到母种培养基上，26℃培养7d，取边缘生长旺盛的菌丝转接到新的母种培养基上复壮。复壮后的菌株再转接到铺有玻璃纸的母种培养基上，26℃恒温黑暗培养10d。每菌株刮取200mg新鲜菌丝，放入研钵中，倒入液氮迅速研磨成粉末，采用植物基因组DNA提取试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)根据操作步骤，提取总DNA，经1.0％的琼脂糖凝胶电泳后，在凝胶成像分析系统中拍照，贮存于-20℃冰箱中备用。

2.1.2 SRAP扩增反应体系及反应程序

SRAP扩增反应体系：反应体积25μL，其中2×Tap PCR Master Mix 12.5μL，100μmo1/L上、下游引物各1μL，模板为50ng/μL DNA 1μL，用双蒸水补足体积。

SRAP扩增基准程序：94℃预变性5min；94℃变性1min，35℃复性1min，72℃延伸1min，5个循环；94℃变性1min，50℃复性1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

取扩增产物7μL进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，同时以DNA Ladder Marker2000bp作为分子量标记，100V恒压电泳40-60min，通过紫外凝胶成像系统观察并拍照。

2.1.3 SRAP引物筛选

采用Li et al.2001年发表的引物，由上海铂尚生物技术有限公司合成(表2)。正向引物16条(SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.16)，反向引物18条(SEQ ID NO.17-SEQ ID NO.34)，采用Me-Em的组合表示方式共得到288对引物。选用3份大球盖菇DNA对288对引物进行筛选，将重复性好、强度较高、清晰可辨无争议、能体现菌株间差异的条带确认为标记条带，进行相应的统计和分析以筛选出最佳组合引物。

表2：SRAP引物序列

2.1.4 SRAP电泳结果统计及处理分析

将相同引物PCR扩增产物中电泳迁移率一致的标记条带确认为同一条带，扩增阳性记录为“1”，扩增阴性记录为“0”，利用Excel把图形资料转换成数据资料，统计形成“0/1”表型数据矩阵，根据该数据矩阵统计计算出多态位点数、总位点数和多态位点比率P(Percentage of polymorp hic sites)，估算遗传分化的水平。

计算公式：P＝k/n(100％)

式中：P为多态性位点比率，k为多态性位点数，n为扩增位点数。

利用NTSY S-PC软件进行菌株间的非加权组平均法(UPGMA)聚类分析，生成遗传距离聚类图。

2.2结果：

2.2.1 SRAP引物筛选及其扩增结果

从288对引物中共筛选出38对重复性好、多态性比率高的引物。利用38对引物对23份大球盖菇基因组DNA进行SRAP扩增并电泳检测，共扩增出319个位点，其条带分子量大小在100-2000bp之间。其中多态性位点205个，多态性比率为64.26％。38对引物扩增的位点数从4-15个不等，平均每对引物扩增出8.39个位点，平均多态性位点数为5.39个。

基于23株供试菌株的SRAP扩增多态性，利用POPGENE1.32软件对试验数据进行统计分析。结果表明，样品间的平均Nei’s遗传多样性指数为0.1616，平均Shannon指数为0.2577，说明供试菌株间的遗传多样性较高，遗传差异性较大。

2.2.2聚类分析

23个大球盖菇菌株两两间的相似性系数范围为0.683-0.959。菌株TA和JN相似性系数为0.959，亲缘关系最近，菌株LC和1300、1301相似性系数均为0.683，亲缘关系最远。

基于SRAP标记的23个大球盖菇菌株的UPGMA聚类图见图1，从图1可以看出，23株供试菌株均可以鉴别开；当遗传相似系数0.788时，23个大球盖菇被分为2个类群：第Ⅰ类群为来源于国外的两个菌株；第Ⅱ类群为来自我国不同地市的21个菌株。在第Ⅱ类群中，源自山东济宁的5个菌株(YZ、S、F、RC、WS)聚在一起；来自黑龙江的3个菌株(HEB、SH、WC)聚在一起；来自辽宁(DL、JZ、ZY)、山东(LY、JN、TA、)的菌株与福建的菌株(SM)遗传距离较近；另外来自云南(YX)、江苏(GY、TD)、湖北(WH)的菌株也聚在一起。

结果表明：SRAP技术可以将23株大球盖菇菌株完全区别开，大球盖菇菌株间遗传多样性丰富，菌株间的亲缘关系与地理位置有关，菌株JN和TA相似性系数较大，亲缘关系较近，确定为为同物异名菌株。因此，将菌株JN剔除，剩余22株菌作为供试菌株。

3.供试菌株菌丝耐高温递进式循环驯化：

将22株大球盖菇重新转接，在全自动生化培养箱中进行16次(26℃，16h；30℃，8h)循环驯化，每个处理3次重复，以26℃恒温培养的菌株作为对照。用十字交叉法测量菌落直径，计算菌丝生长速率，以生长速率、菌落颜色以及菌丝粗壮程度为指标进行综合筛选。筛选生长速度较快、长势良好的菌株，依次进行(26℃，16h；34℃，8h)、(26℃，16h；38℃，8h)、(26℃，16h；42℃，6h)三个温度层次的循环驯化筛选，每个循环进行16次，每个处理重复3次，以26℃恒温培养的菌株作为对照。

最终筛选出可在42℃条件下耐受6h的菌株作为大球盖菇耐高温驯化菌株，并将其重新命名，用以区别出发菌株，菌株TA驯化后的菌株命名为T₂，菌株ZY驯化后的菌株命名为Z₂，菌株DL驯化后的菌株命名为D₂。菌株S驯化后的菌株命名为S₂。

4.原生质体育种：

4.1原生质体的制备与纯化

将大球盖菇耐高温驯化得到菌株接种于液体培养基中，于26℃条件下静置培养4d，并手动震荡数次，用灭过菌的滤纸过滤并收集絮状菌丝体，用无菌渗透压稳定剂清洗收集到的菌丝体3次，并用无菌滤纸吸去多余液体。将处理好的大球盖菇菌丝加入到2mL离心管中，按照每100mg菌丝加1mL酶液的比例添加浓度为1.5％的溶壁酶，手动震荡离心管使菌丝尽量分散。于32℃恒温摇床中酶解3h，摇床转速设置为80r/min。每隔半小时检测酶解程度，取酶解液10uL用血细胞计数板计数，原生质体浓度达到10⁶～10⁷个/mL时表示酶解程度适宜。酶解结束后用一次性40μm细胞筛过滤去除残留菌丝。滤液经3500r/min离心15min，弃上清，沉淀用无菌渗透压稳定剂洗涤两次，并重悬至合适的浓度，用血细胞计数板测算原生质体最终产量。

4.2大球盖菇原生质体的高温再生试验

将4.1中纯化好的原生质体浓度调整到10⁵个/mL，每次取100μL均匀涂布于再生培养基中，重复3次，另外取100μL用无菌水涨破的原生质体悬液涂布到再生培养基中作为对照，消除残留菌丝形成的菌落带来的误差。26℃恒温倒置闭光恢复1d后将温度升到34℃，继续恒温闭光培养5d，挑取耐高温再生菌株，按再生出的时间由1-50进行编号。26℃培养5d后进行镜检，剔除掉其中的单核菌株，剩余菌株于26℃条件下培养5d后将温度调整至34℃，继续培养5d，再将温度调至26℃恢复培养5d。记录并比较各菌株的生长速率，筛选出经过34℃培养后，菌丝长速较快、长势良好、异质性低的4株菌株定为耐高温菌株，分别命名为S18、S20、S24和S26。

实施例2：大球盖菇耐高温菌株的选育

与实施例1的区别在于：制备得到原生质体后，将原生质体稀释至10⁵个/mL，用稳定的15W紫外灯管在距离30cm处进行梯度诱变，诱变时间设置为30s。然后将经过紫外照射的原生质体涂布到再生培养基上，于26℃条件下恒温闭光恢复2d，将温度调至34℃继续培养，待菌落长出后挑取耐高温菌株并镜检，剔除掉其中的单核菌株，按大1～大20编号剩余菌株，并于26℃条件下培养5d后将温度调整至34℃，继续培养5d，再将温度调至26℃恢复培养5d。记录并比较各菌株的生长速率，筛选出3株经过34℃培养后，菌丝长速较快、长势良好、异质性低的菌株定为耐高温菌株，分别命名为大11、大15和大16。

实施例3：大球盖菇耐高温菌株的选育

与实施例1的区别在于：制备得到原生质体后，选择对高温耐受性较好的菌株D₂和产量较高的菌株S₂作为亲本进行融合，将两种纯化好的大球盖菇原生质体调整到10⁶个/mL，分别进行热灭活和紫外灭活，用移液枪吸取两种灭活原生质体各0.5mL加入到2mL无菌离心管中，30℃预热5min，以25％的PEG6000与0.02mol/L Ca2+混合溶液为助溶剂，调节pH为8.5，26℃融合30min。离心弃上清，用无菌渗透压稳定剂洗涤两次，去除PEG毒性。

处理完成后将原生质体涂布到再生培养基上，于26℃条件下恒温闭光恢复2d，将温度调至34℃继续培养，待菌落长出后挑取耐高温菌株并镜检。剔除掉其中的单核菌株，按R1～R20进行编号，并于26℃条件下培养5d后将温度调整至34℃，继续培养5d，再将温度调至26℃恢复培养5d。记录并比较各菌株的生长速率，筛选出4株经过34℃培养后，菌丝长速较快、长势良好、异质性低的菌株定为耐高温菌株，分别命名为R7、R9、R10和R15。

试验例1：拮抗试验

1.试验方法：

将实施例1-实施例3选育出的耐高温菌株与出发菌株(或两亲本)同时接种于培养皿中，相距20mm，每个处理重复3次，在26℃条件下培养，观察菌落交界处是否产生拮抗线。

2.试验结果：

实施例1-实施例3选育出的耐高温菌株与出发菌株(或两亲本)均有明显的拮抗现象。

试验例2：继代培养试验

将实施例1-实施例3选育出的耐高温菌株在26℃条件下进行继代培养，选取第5代、第10代、第15代作为验证对象。将新转接的菌株置于(26℃，16h；38℃，8h)循环下培养5d，计算菌丝生长速度，与初代菌丝生长速率作比较，结果见表3。

表3：耐高温菌株遗传稳定性试验结果

注：该生长速率为(26℃，16h；38℃，8h)条件下恒温培养的生长速率。

由表3可以看出，菌株T₂、Z₂、S18、R15耐高温能力逐渐减弱，其余菌株稳定性较好。菌株S20第15代菌丝生长速率(2.35mm/d)高于初代菌丝生长速率(2.13mm/d)具有超亲现象。

试验例3：耐高温菌株与出发菌株间的亲缘关系鉴定

采用SRAP方法鉴定实施例1-实施例3筛选得到的耐高温菌株与出发菌株的关系，结果见图2。由图2可以看出，当相似性系数为0.93时，11株耐高温菌株均被区别开，说明该11株耐高温菌株适合作为栽培试验的供试菌株。菌株S20、S24、S26与其出发菌株S₂聚在同一支上，但亲缘关系较远，说明以上3株菌株与出发菌株产生了一定差异，符合筛选要求。融合菌株R7和R10与S₂聚在一支，R9与D₂聚在一支，但亲缘关系均较远，说明与亲本差异明显，确定是融合菌株；诱变菌株大11、大15和大16聚在一支，说明经过紫外诱变和34℃条件再生使其产生了同一方向变异。

试验例4：出菇试验

通过耐高温驯化、原生质体育种筛选出的耐高温菌株，经室内拮抗试验、继代培养等方法验证共得到11株耐高温菌株(S₂、D₂、S20、S24、S26、R7、R9、R10、大11、大15、大16)，对其进行栽培试验，以SM(国家认证品种)、S(出发菌株)和SH(出发菌株)作为对照。

一、春暖棚出菇

2017年9月25日在春暖大棚内进行铺料播种，栽培时地温为25℃，栽培后料温为36℃。栽培结束后及时安装空气、土壤温度传感器，测量春暖棚内温度，每小时记录一次温度数据，并制作大球盖菇栽培期间春暖棚内地温和气温变化曲线(图3)。菌种萌发、定植、发菌天数及各菌株产量和一级菇比例见表4和表5。

表4：春暖棚内大球盖菇菌丝生长时间统计

表5：春暖棚大球盖菇出菇情况及产量统计

由图3可以看出，春暖棚内温度随天气变化明显，气温波动较大，料温相对较为稳定。播种后5d内为菌种萌发和定植期，期间最高气温为36.9℃，平均气温为25.3℃，最高料温为36.3℃，平均料温为31.6℃。从表4和表5中可以看出，菌株D₂、R10和S20播种1d后萌发，3d吃料定植，其次为R9、S₂、R7、S24、S26、大11、大15和大16，播种后2d萌发，4d定植，吃料定植较慢的为S、SH和对照SM，播种3d后萌发，5d定植。虽然所有菌株在5d内均萌发定植，但菌株SM、S和SH菌丝萌发时间慢，且菌丝较为细弱，说明在以上栽培条件下该菌株的生长被抑制。菌株D₂、R10和S20，在播种初期便迅速萌发，说明在以上栽培条件没有抑制菌丝生长，其菌丝具有一定的耐高温能力。

播种第7d～40d为发菌期，期间最高气温为38℃，最高料温为31.1℃，平均料温基本维持在20℃以上。播种后第25d大部分菌丝长满料堆的2/3，此时进行了覆土。这一阶段料温较为稳定，在20℃-28℃之间，供试菌株中发菌最快的为菌株D₂，仅25d就长满料堆，其次为R10(28d)和S20(28d)，之后是30d长满料堆的S、S₂、R7、S24和S26，生长较慢的是大16(35d)、大15(40d)和大11(45d)，对照SM为35d，而且菌株大11和大15有较多的墨汁鬼伞(Coprinopsis atramentaria)、泡质盘菌(Peziza vesicalosa)污染，说明菌株大11和大15抗杂能力较弱。

播种后第41d～60d为第一潮出菇期，期间温差较大，播种后第55d后最低气温降至0℃左右，料温也逐渐降至15℃以下。这一阶段最高气温为29.6℃，平均气温为11℃，最高料温20.9℃，平均料温为14.1℃。发菌速度快慢与出菇时间早晚有一定的关系，供试菌株中出菇最早的是D₂(38d)其次为S₂(40d)和S20(40d)，对照菌株第55d开始出菇，出菇最晚的为菌株大11和大15，播种后162d才出菇。出菇时间相差较大的原因可能是发菌期间，菌株大11和大15被盘菌污染，菌丝较细弱不利于扭结形成原基，之后气温、料温迅速下降，不适合大球盖菇原基形成，故次年温度升高后才出菇。第一潮菇产量最高的为S20(4.53kg/m²)，其次为R10(3.25kg/m²)和S₂(3.02kg/m²)，菌株大11和大15并未出菇，对照SM产量最低，为0.85kg/m²，原因可能是出菇时间较晚，之后料温降至10℃以下，不适合原基形成，产量偏低。播种后60d～140d料温基本低于12℃，各菌株均未出菇。

播种第141d-190d(第二年春季)为第二潮出菇期，期间最高气温为36℃，其中有38d气温高于25℃(每天维持3h以上)，料温最高为21.4℃；播种后第191d-210d为第三潮出菇期，期间最高气温为40.2℃，且基本每天至少有4h以上高于25℃的气温，此时料温最高为27.3℃，平均料温为22.4℃。春暖棚大球盖菇产量统计截止至2018年4月7日(210d)，此时春暖棚内最高气温基本在40℃以上，料温基本在25℃以上，菌株S20、R10、大11、大15和大16仍有较多的原基分化。此条件下第二、三潮菇产量最高的为S20(5.70kg/m²)，其次为R10(5.57kg/m²)和R7(5.44kg/m²)，产量最低的为大11(3.26kg/m²)和大15(3.21kg/m²)，对照SM产量为3.33kg/m²，出发菌株S和SH产量分别为6.39kg/m²和5.24kg/m²。供试菌株中产量最高的为S20(10.22kg/m2)，生物学效率为68.16％。其次为S₂和R10，转化率分别为58.90％和58.78％，生物学效率最低的是大15，仅21.38％。除大11和大15之外，所有耐高温菌株生物学效率均高于对照菌株(27.87％)。排除产量较低的大11和大15之外，一级菇比例最高的是R10，为65.96％，远高于对照菌株(27.87％)，其次是菌株D₂(58.59％)和S20(53.69％)。

由以上结果可以看出，菌株S20、D₂和R10菌丝和子实体耐高温表现最好，在料温30℃以上的条件下可以迅速萌发、定植，出菇期比对照提前10d以上，产量远高于对照，在后期气温30℃高温条件下子实体质量明显比对照好，在料温25℃高温条件下依旧有原基形成。

二、冬暖棚出菇：

2017年10月12日在春暖大棚内进行铺料播种，栽培时地温23℃，栽培后料温40℃。栽培结束后及时安装空气、土壤温度传感器，测量春暖棚内温度，每小时记录一次温度数据，并制作大球盖菇栽培期间春暖棚内地温和气温变化曲线(图4)。菌种萌发、定植、发菌天数及各菌株产量和一级菇比例见表6和表7。

表6：冬暖棚内大球盖菇菌丝生长时间统计

表7：冬暖棚大球盖菇出菇情况及产量统计

从图4可以看出，冬暖棚内最高气温和最高料温随天气情况变化较大，但平均气温和平均料温基本稳定。萌发、定植期(1d-5d)最高气温40.2℃，平均气温24.6℃，最高料温39.6℃，平均料温30℃。与春暖棚内大球盖菇萌发、定植时间类似，菌株D₂、R10和S20最早萌发定植。发菌期(7d-40d)最高气温40.2℃，最高料温为31.1℃，平均气温和平均料温在20℃左右，温度环境与春暖棚类似，菌株发菌速度也与春暖棚类似。发菌最快的是D2，播种后28d长满料堆，其次是30d长满料堆的S2、R7、R10、S20、S24和S26，发菌最慢的是大11，播种后49d长满料堆，对照SM播种后37d长满。菌株大11和大15有大量盘菌污染，其余菌株未发现杂菌，说明菌株大11和大15抗杂能力差。播种后第28d大部分菌丝长满料堆的2/3，进行了覆土。

从第45d-65d为第一潮出菇期，最高气温33℃，有15d气温可在20℃以上维持5h。冬暖棚内出菇次序与春暖棚出菇次序相似，出菇最早的是D₂(45d)，其次是R7、R10、S20和S26，出菇最晚的大11(76d)和大15(75d)，对照SM也出菇较晚，播种后71d出菇。第81d-201d为冬暖棚内大球盖菇第二、三潮出菇期，从图中可以看出，这期间温度为上升趋势，最高气温可升至45℃以上，尤其是出菇后期最高气温基本维持在30℃以上，且持续时间较长。冬暖棚大球盖菇产量统计至2018年4月30日，此时最高气温在35℃以上，料温28℃以上，菌株S20、R10、S26、大15仍有原基。总产量最高的菌株为S20，达到13.80kg/m²，为对照SM(6.83kg/m²)的2.1倍，其次为R7(10.40kg/m²)和R10(10.44kg/m²)；一级菇比例最高的为R10(65.36％)，是SM(27.45)的2.38倍，其次为大16(64.16％)和S20(59.68％)。

由以上结果可以看出，冬暖棚内冬季温度适宜，可大幅度延长大球盖菇出菇期，总产量高于春暖棚。菌株S20、D₂、R7和R10菌丝和子实体耐高温表现最好，在料温35℃以上的条件下可以迅速萌发、定植，在后期气温30℃高温条件下子实体质量明显比对照好，在料温25℃高温条件下依旧有原基形成。

三、林地出菇

2017年11月20铺料栽培结束后，测量料堆中心温度为20℃，播种后立即进行覆土并加盖稻草、地膜保温保湿。

此次试验选择在春暖棚试验中定植较快、出菇较早的菌株以及未出菇的大15菌株进行试验，供试菌株为D₂、R10、S20、大16、大15，以SM为对照。晚秋在林地环境中栽培大球盖菇，冬季温度较低，菌丝生长缓慢，发菌期较长，菌丝积累大量营养物质，次年春季地温升至10℃以上开始出菇，各潮次间区别不明显。出菇盛期温度统计见图5，林下大球盖菇产量统计至5月20日(前两潮菇)，出菇产量及质量见表8。

表8：林地大球盖菇出菇产量及质量统计

由图5可以看出，林地开放环境温度变化较为平缓，气温基本维持在25℃以上，最高气温31.7℃，平均料温基本维持在20℃以上，最高26.8℃。由表8可知，在林地环境中出菇最早的为D₂(125d)，比对照提前了16d，其次为R10和S20，也比对照提前了10d；产量最高的为S20(11.12kg/m²)，是对照的3.35倍，其次是D₂(9.99kg/m²)和R10(7.67kg/m²)；一级菇比例最高的是R10(67.36％)，比对照多26.91％，其次是S20(65.68％)，在20℃以上的气温下，一级菇比例较高说明子实体耐高温能力较好。

综合在春暖棚、冬暖棚和林地3种环境下各菌株萌发、定植、发菌和出菇期以及子实体产量和质量情况可以看出，菌株S20和D₂菌丝耐高温能力较强，在30℃以上的条件下可以较快定植发菌，致使出菇期提前，一定程度上减少了营养流失，提高了产量，可作为早播品种进行大面积试验；菌株S20和R10子实体耐高温能力较强，当气温在25℃时(4h以上)，子实体未开伞，地温高于25℃时原基正常分化，可作为晚播品种进行大面积试验。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 一种大球盖菇耐高温菌株的选育方法

<130> 2018

<160> 34

<170> PatentIn version 3.5

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Claims

1.一种大球盖菇耐高温菌株的选育方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的选育方法，其特征在于，步骤(1)中，通过SRAP分子标记技术对收集的大球盖菇菌株进行遗传多样性及亲缘关系分析。

3.根据权利要求1所述的选育方法，其特征在于，步骤(1)中，所述剔除亲缘关系较近的菌株，是通过比较菌株间的相似性系数进行剔除的，若两株菌的相似性系数大于0.96，则只保留其中一株菌。

4.根据权利要求1所述的选育方法，其特征在于，步骤(2)中，所述菌丝耐高温递进式循环驯化，具体为：将供试菌株在26℃培养16h，30℃培养8h，循环16次；以菌丝生长速率、菌落颜色以及菌丝粗壮程度为指标进行综合筛选，筛选出生长速度较快，长势良好的菌株，依次进行(26℃，16h；34℃，8h)、(26℃，16h；38℃，8h)、(26℃，16h；42℃，6h)三个温度层次的循环驯化筛选，每个温度层次的循环进行16次。

5.根据权利要求1所述的选育方法，其特征在于，步骤(3)中，所述液体培养基的组成为：马铃薯200.0g，葡萄糖20.0g，蒸馏水1000.0mL。

6.根据权利要求1所述的选育方法，其特征在于，步骤(3)中，原生质体制备的条件为：收集菌龄为4d的菌丝体，按每100mg的菌丝体中加入1mL浓度为1.5％的溶壁酶，在32℃条件下酶解3h。

7.根据权利要求6所述的选育方法，其特征在于，步骤(3)中，所述原生质体的制备还包括纯化的步骤，即：酶解后过滤除去残留菌丝，滤液经3500r/min离心15min，弃上清，沉淀用0.6mol/L的甘露醇洗涤。

8.根据权利要求1所述的选育方法，其特征在于，步骤(4)中，所述高温再生试验，具体为：调整步骤(3)制备的原生质体浓度，均匀涂布于再生培养基中，26℃恒温倒置闭光恢复1-2d后将温度升到34℃，继续恒温闭光培养5d；挑取耐高温再生菌株，26℃培养5d后进行镜检，剔除掉其中的单核菌株，剩余菌株于26℃条件下培养5d后将温度调整至34℃，继续培养5d，再将温度调至26℃恢复培养5d；比较各菌株的生长速率，筛选出经过34℃培养后，菌丝长速较快、长势良好、异质性低的菌株作为耐高温菌株。

9.根据权利要求8所述的选育方法，其特征在于，所述再生培养基的组成为：马铃薯200.0g，蔗糖20.0g，蛋白胨2.0g，酵母粉2.0g，磷酸二氢钾1.5g，磷酸氢二钾1.5g，硫酸镁1.5g，0.6mol/L甘露醇1000.0mL，琼脂20.0g。

10.根据权利要求1所述的选育方法，其特征在于，在将步骤(3)制备的原生质体进行高温再生试验之前，还包括：将原生质体进行紫外诱变处理或融合处理的步骤。