CN105349523A - 一种耐高温高产金针菇菌株的选育方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及真菌育种领域，具体而言，涉及一种耐高温高产金针菇菌株的选育方法，包括：以生物学效率为90～110％的金针菇菌株与子实体形成温度范围在3～20℃的耐高温金针菇菌株为亲株，通过灭活原生质体融合技术选育出耐高温高产金针菇菌株。本申请提供的原生质体融合金针菇选育方法，无细胞壁障碍，细胞融合频率高，从而使基因重组的频率也高；对于参与融合的亲本株，可以不需要特殊的遗传标记或精确的遗传分析，且育种快速、准确，菌株生命活力好；通过本申请提供的选育方法，可融合两亲本菌株的高生物转化率与耐高温特点，所培育的金针菇菌株，不仅生物学效率能达到120％左右，且在22℃时仍能保持高产特性。

Description

一种耐高温高产金针菇菌株的选育方法

技术领域

本发明涉及真菌育种领域，具体而言，涉及一种耐高温高产金针菇菌株的选育方法。

背景技术

金针菇学名为毛柄金钱菌(Flammulinavelutiper(Fr.)Sing)，它既是一种美味食品，又是较好的保健食品。金针菇性寒，味甘、咸，具有补肝、益肠胃、抗癌的功效，主治肝病、胃肠道炎症、溃疡、肿瘤等病症。金针菇中锌含量较高，对预防男性前列腺疾病较有帮助。而且金针菇还是高钾低钠食品，可防治高血压，对老年人也有益。金针菇氨基酸的含量也非常丰富，高于一般菇类，尤其是赖氨酸的含量特别高，赖氨酸具有促进儿童智力发育的功能。最近有研究表明，金针菇还具有很好的抗癌作用。

金针菇属低温结实性真菌，菌丝较耐低温，但对高温抵抗力较弱，在34℃以上停止生长，甚至死亡。子实体分化在3～18℃的范围内进行，但形成的最适温度为8～10℃。长期以来，制约金针菇生产的最主要因素就是季节的限制，维持低温将会导致巨大的能耗，这将提高大规模生产金针菇所需要的成本。目前市面上已经存在耐高温的金针菇菌株，但其生物学效率较低，仅为50～70％之间。

金针菇的栽培生产在我国已经普及多年，现在我国金针菇的选育方法主要有单孢分离法、组织分离法、单一因子诱变法等，然而这些菌种选育都有着很大的局限性，如单孢分离法很难准确、快速获取优良的性状；组织分离法会使得菌株的菌龄变老，生命活力降低，优良性状逐步丧失，最终失去使用价值；而单一因子诱变法容易达到诱变效应饱和。基因工程育种也是今年来兴起的一种新型育种方法，然而利用基因工程技术构建的转基因菌株，外源基因在金针菇中的表达水平比较低，常常与预期的抗性效果有较大差距。因而现有方法很难选育出生物学效率高且耐高温的金针菇菌种。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种耐高温高产金针菇菌株的选育方法，所述的选育方法，可克服现有技术选育不准确、不快速，选育的菌株容易变老，抗性不显著的缺点。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种耐高温高产金针菇菌株的选育方法，包括：以生物学效率为90～110％的金针菇菌株与子实体形成温度范围在3～20℃的耐高温金针菇菌株为亲株，通过灭活原生质体融合技术选育出耐高温高产金针菇菌株。

灭活原生质体融合技术，就是将双亲株的微生物细胞分别通过酶解脱壁，使之形成原生质体，然后在高渗的条件下混合，并加入物理的或化学的或生物的助融条件，使双亲株的原生质体间发生相互凝集，通过细胞质融合、核融合，而后发生基因组间的交换、重组，进而可以在适宜的条件下再生出微生物的细胞壁来，从而获得重组子的过程。

此方法具有许多常规杂交方法无法比拟的独到之处：原生质体融合无细胞壁障碍，细胞融合频率高，从而使基因重组的频率也高；对于参与融合的亲本株，可以不需要特殊的遗传标记或精确的遗传分析，且育种快速、准确，菌株生命活力好

本申请采用的亲本菌株均为外购的现有品种，具体的，其中高生物学效率的亲株为白色品系的金针菇，耐高温的亲株为黄色品系的金针菇。通过本申请提供的选育方法，可融合两亲本菌株的高生物学效率与耐高温特点，所培育的金针菇菌株，不仅平均生物转化率高，且耐温性也非常好。

优选的，如上所述的耐高温高产金针菇菌株的选育方法，具体包括如下步骤：

1)、选择生物学效率为90～110％的金针菇菌株与子实体形成温度范围在3～20℃的耐高温金针菇菌株为亲株，分别进行菌种活化和预培养；

2)、将预培养后的亲株制备成原生质体并灭活，得到灭活亲株；

3)、诱导灭活亲株融合，得到融合菌株并对其进行再生培养；

4)、通过与亲株的拮抗实验，从再生培养后的融合菌株中筛选出获得了与亲株遗传特性不同的融合菌株；

5)、从与亲株遗传特性不同的融合菌株中进一步筛选得到同时具备双亲耐高温及高生物学效率性状的金针菇菌株。

本申请在制备原生质体并融合后，需要通过拮抗实验来筛选出获与亲株遗传特性不同的融合菌株。不同品种的食用菌在生产发育中，菌丝会相互限制对方的生长蔓延，在交界处形成拮抗线。筛选出的获得了新的遗传特性的融合菌株，再通过测定其生物转化率，并在温度梯度培养同时测定不同温度下的生物转化率，即可筛选出生物转化率又高，耐高温特性又好的菌株。

优选的，如上所述的耐高温高产金针菇菌株的选育方法，在步骤1)中，所述预培养的具体操作为：

将菌龄为5～7天的亲株在PDA培养基中，20～25℃培养6～8天。

预培养6～8天可使亲本菌株长到对数生长期，生长状态最好，制备原生质体成功率最高。

优选的，如上所述的耐高温高产金针菇菌株的选育方法，在步骤2)中，制备原生质体的方法为酶法去壁。

进行原生质体融合的首要前提，就是要制备数量较大的原生质体。机械法脱壁是早期常用的方法，但这种办法原生质体制备数量有限而且易使原生质体受到损伤，不利于再生。而酶法去壁由于特异性更好，通常原生质体受到损伤也非常小。

进一步优选的，所述酶法去壁具体包括：

用1.4～1.6％的蜗牛酶处理预培养后的亲株110～130min，处理温度36～38℃，选用0.4～0.6mol/L的氯化钾作为渗透压缓冲液。

蜗牛酶是从蜗牛的嗦囊和消化道中制备的混合酶，它含有纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、蛋白酶等20多种酶。蜗牛酶是很有价值的一种酶。它可以用于真菌细胞壁的破碎，因此广泛用于细胞生物学和基因工程学的研究。酶的浓度和作用时间对原生质体制备的影响最大。

优选的，如上所述的耐高温高产金针菇菌株的选育方法，在步骤2)中，所述灭活的方法为：

对于生物转化率较高的金针菇亲株采用热灭活处理；

对于耐高温的金针菇亲株采用紫外线灭活处理。

进一步优选的：

所述热灭活处理的具体操作为：将生物转化率较高的金针菇亲株44～46℃水浴8～9分钟；

所述紫外线灭活处理的具体操作为：将耐高温的金针菇亲株通过19～21W的紫外光照射90～110s，照射距离是14～16cm。

微生物原生质体的灭活是利用物理或化学方法使其某一小部位的生理结构受到致死损伤，结果造成原生质体丧失独立的再生活性，但决不是被彻底杀死，原生质体的染色体仍然保持复制与重组能力，融合后原生质体的细胞核和线粒体等仍具有转化和互补功能。

灭活原生质体的方法主要有热灭活、紫外线灭活和化学药剂灭活三种。目前认为，温度灭活原生质体的作用主要在细胞质中，使核糖体或核糖体RNA受到损伤结果使细胞内的功能蛋白、酶蛋白的合成受到影响或使其变性失活，产生致死作用。紫外线对原生质体造成的致死损伤主要集中在DNA上而且在不同的原生质体细胞中作用位置可能存在很大差别。化学药剂可以使细胞代谢过程中的某些关键酶不可逆的失活，导致原生质体即使在适宜的条件下仍然不能再生。

优选的，如上所述的耐高温高产金针菇菌株的选育方法，在步骤3)中，诱导灭活亲株融合的方法为PEG诱导法。

进一步优选的，所述PEG诱导法的具体操作为：

取灭活亲株等体积混合，用配比为25～35％的PEG4000、18～22mM的氯化钙作为融合剂在28～30℃下孵育10～20min。

关于灭活原生质体的融合机制目前还不很清楚。因为紫外线的作用位点主要在原生质体的DNA上，而且不同的细胞中作用位置可能有很大差别，这样双亲株原生质体用紫外线灭活或分别用紫外线和温度灭活，融合后损伤可以互补，而双亲株都用热灭活，可能在不同的细胞中作用位点差别不大。所以不能互补融合形成重组体。本申请分别使用热灭活和紫外线灭活，然后进行互补，灭活和互补成功率都很高。

优选的，如上所述的耐高温高产金针菇菌株的选育方法，在步骤3)中，所述再生培养的具体操作为：

将诱导灭活亲株融合得到的融合菌株在PDA再生培养基中，20～25℃培养6～8天。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本申请提供的原生质体融合金针菇选育方法，无细胞壁障碍，细胞融合频率高，从而使基因重组的频率也高；对于参与融合的亲本株，可以不需要特殊的遗传标记或精确的遗传分析，且育种快速、准确，菌株生命活力好。

(2)通过本申请提供的选育方法，可融合两亲本菌株的高生物转化率与耐高温特点，所培育的金针菇菌株，不仅平均生物学效率能达到120％左右，且在22℃时仍能保持高产特性。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

一种耐高温高产金针菇菌株的选育方法，具体包括如下步骤：

1)、选择生物学效率为90～110％的金针菇菌株与子实体形成温度范围在3～20℃的耐高温金针菇菌株为亲株，分别进行菌种活化和预培养；

2)、将预培养后的亲株制备成原生质体并灭活，得到灭活亲株；

3)、诱导灭活亲株融合，得到融合菌株并对其进行再生培养；

4)、通过与亲株的拮抗实验，从再生培养后的融合菌株中筛选出获得了与亲株遗传特性不同的融合菌株；

5)、从与亲株遗传特性不同的融合菌株中进一步筛选得到同时具备双亲耐高温及高生物学效率性状的金针菇菌株。

实施例2

一种耐高温高产金针菇菌株的选育方法，具体包括如下步骤：

1)、选择生物学效率为90～110％的金针菇菌株与子实体形成温度范围在3～20℃的耐高温金针菇菌株为亲株，分别进行菌种活化和预培养，预培养的具体操作为：

将菌龄为5天的亲株在PDA培养基中，20～25℃培养8天。

2)、用1.4％的蜗牛酶处理预培养后的亲株130min，处理温度36～38℃，选用0.4mol/L的氯化钾作为渗透压缓冲液，处理后得到亲株的原生质体；

将生物转化率较高的金针菇亲株44℃水浴9分钟进行热灭活；

将耐高温的金针菇亲株通过19W的紫外光照射110s，照射距离是14cm进行紫外线灭活。

3)、取灭活亲株等体积混合，用25％的PEG4000、18mM的氯化钙溶液在28～30℃下孵育10min。诱导灭活亲株融合，得到融合菌株并对其进行再生培养；再生培养的具体操作为：

诱导灭活亲株融合得到的融合菌株在PDA再生培养基中，20～25℃培养6天。

4)、通过与亲株的拮抗实验，从再生培养后的融合菌株中筛选出获得了与亲株遗传特性不同的融合菌株；

5)、从与亲株遗传特性不同的融合菌株中进一步筛选得到同时具备双亲耐高温及高生物学效率性状的金针菇菌株。

实施例3

一种耐高温高产金针菇菌株的选育方法，具体包括如下步骤：

1)、选择生物学效率为90～110％的金针菇菌株与子实体形成温度范围在3～20℃的耐高温金针菇菌株为亲株，分别进行菌种活化和预培养，预培养的具体操作为：

将菌龄为7天的亲株在PDA培养基中，20～25℃培养6天。

2)、用1.6％的蜗牛酶处理预培养后的亲株130min，处理温度36～38℃，选用0.6mol/L的氯化钾作为渗透压缓冲液，处理后得到亲株的原生质体；

将生物转化率较高的金针菇亲株46℃水浴8分钟进行热灭活；

将耐高温的金针菇亲株通过21W的紫外光照射110s，照射距离是16cm进行紫外线灭活。

3)、取灭活亲株等体积混合，用35％的PEG4000、22mM的氯化钙溶液在28～30℃下孵育20min。诱导灭活亲株融合，得到融合菌株并对其进行再生培养；再生培养的具体操作为：

诱导灭活亲株融合得到的融合菌株在PDA再生培养基中，20～25℃培养8天。

4)、通过与亲株的拮抗实验，从再生培养后的融合菌株中筛选出获得了与亲株遗传特性不同的融合菌株；

5)、从与亲株遗传特性不同的融合菌株中进一步筛选得到同时具备双亲耐高温及高生物学效率性状的金针菇菌株。

实施例4

一种耐高温高产金针菇菌株的选育方法，具体包括如下步骤：

1)、选择生物学效率为90～110％的金针菇菌株(以下简称为F)与子实体形成温度范围在3～20℃的耐高温金针菇菌株(以下简称为Y)为亲株，分别进行菌种活化和预培养，预培养的具体操作为：

将菌龄为6天的亲株在PDA培养基中，20～25℃培养6～8天。

2)、用1.5％的蜗牛酶处理预培养后的亲株120min，处理温度36～38℃，选用0.5mol/L的氯化钾作为渗透压缓冲液，处理后得到亲株的F原生质体和Y原生质体；

3)、原生质体灭活条件选择

将制得的F菌株原生质体45℃水浴0、2、4、6、8、10、12min，吸取0.1mL涂布于PDA再生培养基上，在黑暗环境中培养7天，计算致死率，结果如表1。

表1F菌株原生质体致死率实验

时间(min)	平均菌落数(个)	致死率(％)
			0	45	0
2	36	20.0
			4	13	71.1
6	2	95.6
			8	0	100
10	0	100
			12	0	100

从上表可见，在水浴8分钟时，致死率即可达到100％，所以选择F菌株原生质体致死条件为45℃水浴8min。

将制得的Y菌株原生质体用20W紫外灯从15cm处照射0、20、40、60、80、100、120s，吸取0.1mL涂布于再生培养基上，在黑暗环境中培养7天，计算致死率，结果如表2。

表2Y菌株原生质体致死率实验

时间(s)	平均菌落数(个)	致死率(％)
			0	62	0
20	58	6.5
			40	37	40.3
60	13	79.0
			80	9	85.5
100	0	100
			120	0	100

所以选择Y菌株原生质体致死条件为20W紫外灯从15cm处照射100s。

3)、取灭活亲株等体积混合，用35％的PEG4000、22mM的氯化钙溶液在28～30℃下孵育15min。诱导灭活亲株融合，得到融合菌株并对其进行再生培养；再生培养的具体操作为：

诱导灭活亲株融合得到的融合菌株在PDA再生培养基中，20～25℃培养7天。

4)、通过与亲株的拮抗实验，从再生培养后的融合菌株中筛选出获得了与亲株遗传特性不同的融合菌株；

5)、从与亲株遗传特性不同的融合菌株中进一步筛选得到同时具备双亲耐高温及高生物学效率性状的金针菇菌株：

将拮抗实验筛选得到的7株菌株与亲本菌株F、Y进行栽培实验，考察生物学效率，生物学效率(％)＝(新鲜的菇体产量÷培养基的消耗量)×100％，实验结果如表3。

表3生物学效率考察

由上表可筛选出与生物转化率最高的3号和6号菌株，且分别命名为FY1和FY2。

耐温性实验

将F，Y，FY1，FY2四株菌株在不同温度下进行出菇实验，以生物转化率为考察指标，实验结果如表4。

由表4可知亲本F在19℃不能形成子实体，亲本Y菌株和新菌株FY1在22℃都可以形成子实体，且FY1菌株在20℃时的生物转化率远远高于Y菌株的生物转化率，FY2菌株在18℃时不能形成子实体。

表4耐温性考察

由上述实验可知，本发明一种优良金针菇菌株的选育方法利用灭活双亲原生质体融合技术选育出的FY1菌株克服了双亲F和Y菌株的不足之处，且，在各培养温度下FY1菌株的生物学效率都远远高于其亲本Y菌株，并且在21～22℃时仍然能形成子实体。通常融合菌株的性状应该与亲本菌株相差不大，因而1菌株超越亲本的特性可能是由于发生了一些特定的遗传物质的重组导致的突变。

实验例1

对实施例1～4培养出的菌株做生物学效率和耐温性考察，每个实施例选出一株综合效果最好的，结果如表5所示：

表5实施例1～4生物学效率和耐温性考察

从上表可知，实施例4所培育的菌株(即上述的FY1菌株)综合性状最好。

实验例2

挑选目前本领域最常用的金针菇栽培品种与本申请实施例中生物转化率的菌株FY1进行比较，结果如表6所示：

表6生物学效率对比

从表6可知，FY1相比市面上的常见金针菇菌株品种，无论是出菇温度范围还是生物学效率都非常具有优势。

实验例3

目前市面上常见的金针菇品种多分为黄色品种和白色品种

金针菇淡黄色种在正常条件下，菌盖淡黄色，在弱光或光照不足的条件下是乳白色。菌柄上部着色很浅，仅基部稍有颜色，有的品种柄基部色也很浅，菇体均匀整齐，菇盖大小中等，不易开伞，子实体个数相对较多，菇柄细但挺直。质量好。对温度的需求介于黄色与白色两品系之间，出菇对温度反应比较敏感，一般均在18℃以下出菇，出菇较晚，在适宜的温度条件下，一般都是在菌丝发到袋底后再行出菇，其产量主要集中在前期，即第一、第二茬菇。菇体质地鲜嫩柔软。

金针菇白色种由黄色或浅色种突变而来，在长期的营养生长中发生突变的频率也较高，变异也很快，因此，退化的发生较前两类品种快，这也正是许多菇农使用来源不清的白色种产量低的重要原因。当然保藏良好的白色种变异和退化大大变缓。金针菇白色种菇体质地柔软，有一定的韧性，采收不及时，菇柄下半部容易纤维化，韧性大，易塞牙。白色品系因其味淡，口感不如黄色金针菇。

本申请采用的亲本菌株均为外购的现有品种，其中，高生物学效率的亲株为白色品系的金针菇，耐高温的亲株为黄色品系的金针菇。所筛选出的耐高温高产金针菇FY1则为白色品系。

申请人邀请了6位营养师对本申请实施例制得FY1菌株的口感、回味和韧性(是否容易咀嚼，分数越高代表韧性越好)进行了评价，每项满分均为5分。以苏金7号(黄色品系)、FU088(白色品系)作为对比。结果如表6所示：

表7口味评定及打分

平均分	FY1	苏金6号	FU088
				口感	4.0	4.5	3.3
回味	4.6	4.4	4.5
				韧性	4.1	4.6	3.2
总分	12.7	13.5	11

从表7可知，虽然本申请育成的FY1菌株为白色品系，但口感、回味和韧性却好于普通的白色品系，甚至与黄色品系金针菇相差不多，这可能是由于原生质体融合时发生了一些特定的遗传物质的重组导致的突变，因而产生了意想不到效果。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种耐高温高产金针菇菌株的选育方法，其特征在于，包括：以生物学效率为90～110％的金针菇菌株与子实体形成温度范围在3～20℃的耐高温金针菇菌株为亲株，通过灭活原生质体融合技术选育出耐高温高产金针菇菌株。

2.如权利要求1所述的耐高温高产金针菇菌株的选育方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

1)、选择生物学效率为90～110％的金针菇菌株与子实体形成温度范围在3～20℃的耐高温金针菇菌株为亲株，分别进行菌种活化和预培养；

2)、将预培养后的亲株制备成原生质体并灭活，得到灭活亲株；

3)、诱导灭活亲株融合，得到融合菌株并对其进行再生培养；

4)、通过与亲株的拮抗实验，从再生培养后的融合菌株中筛选出获得了与亲株遗传特性不同的融合菌株；

5)、从与亲株遗传特性不同的融合菌株中进一步筛选得到同时具备双亲耐高温及高生物学效率性状的金针菇菌株。

3.如权利要求2所述的耐高温高产金针菇菌株的选育方法，其特征在于，在步骤1)中，所述预培养的具体操作为：

将菌龄为5～7天的亲株在PDA培养基中，20～25℃培养6～8天。

4.如权利要求2所述的耐高温高产金针菇菌株的选育方法，其特征在于，在步骤2)中，制备原生质体的方法为酶法去壁。

5.如权利要求4所述的耐高温高产金针菇菌株的选育方法，其特征在于，所述酶法去壁具体包括：

用1.4～1.6％的蜗牛酶处理预培养后的亲株110～130min，处理温度36～38℃，选用0.4～0.6mol/L的氯化钾作为渗透压缓冲液。

6.如权利要求2所述的耐高温高产金针菇菌株的选育方法，其特征在于，在步骤2)中，所述灭活的方法为：

对于生物转化率较高的金针菇亲株采用热灭活处理；

对于耐高温的金针菇亲株采用紫外线灭活处理。

7.如权利要求6所述的耐高温高产金针菇菌株的选育方法，其特征在于，

所述热灭活处理的具体操作为：将生物转化率较高的金针菇亲株44～46℃水浴8～9分钟；

所述紫外线灭活处理的具体操作为：将耐高温的金针菇亲株通过19～21W的紫外光照射90～110s，照射距离是14～16cm。

8.如权利要求2所述的耐高温高产金针菇菌株的选育方法，其特征在于，在步骤3)中，诱导灭活亲株融合的方法为PEG诱导法。

9.如权利要求8所述的耐高温高产金针菇菌株的选育方法，其特征在于，所述PEG诱导法的具体操作为：

取灭活亲株等体积混合，用配比为25～35％的PEG4000、18～22mM的氯化钙作为融合剂在28～30℃下孵育10～20min。

10.如权利要求2所述的耐高温高产金针菇菌株的选育方法，其特征在于，在步骤3)中，所述再生培养的具体操作为：

将诱导灭活亲株融合得到的融合菌株在PDA再生培养基中，20～25℃培养6～8天。