CN108865899A - 一种双孢蘑菇菌株及其选育方法 - Google Patents

一种双孢蘑菇菌株及其选育方法 Download PDF

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Abstract

一种双孢蘑菇菌株及其选育方法，其生物保藏号为：CCTCC NO：M2017244，该菌株菌落9d长满平板，平板菌丝为白色，形成的原基数为151‑202个/m2，成熟子实体菌盖为棕色，工厂化栽培单位面积产量在26kg/m2以上。本发明利用基因组重排技术，选育出双孢蘑菇菌株，该菌株平板生长速率快、菌丝生长茂密、子实体原基诱导数量明显提高，提高了双孢蘑菇产量，基质利用率高，易于进行工厂化栽培，提高了经济效益。

Description

一种双孢蘑菇菌株及其选育方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种双孢蘑菇菌株及其选育方法。
背景技术
双孢蘑菇(Agaricusbisporus(Lange)sing.)，在分类学上隶属于真菌门(Eumycota)、担子菌纲(Basidiomycetetes)、伞菌目(Agaricales)，蘑菇科(Agaricaceae)蘑菇属(Agaricus)。
蘑菇属的主要特征是菌褶离生，菌盖与菌柄易分离，有菌环，孢子印紫褐色等特点。双孢蘑菇的生殖有无性繁殖和有性繁殖两种方式，其中，有性生殖是双孢蘑菇生活史的主要部分。
双孢蘑菇生活史中，主要是特殊和复杂的二级性次级同宗配合遗传方式。1972年Raper等人就详细地阐述了双孢蘑菇的生活史。在双孢蘑菇中，双孢担子占绝大部分，三孢、四孢担子为少数。双孢蘑菇的单个担孢子在适宜的条件下，萌发生长菌丝，完成营养积累，产生原基，子实体发育、成熟担孢子散射的整个生活史。
双孢蘑菇味道鲜美、富含蛋白质和氨基酸，还含有数种微量元素、维生素和核苷酸等，脂肪含量低且大部分为不饱和脂肪酸，是具有很高的营养价值和食用价值的健康食物。其中蛋白含量高达42％，具有“植物肉”的称号，含有人体所需的10余种必须氨基酸，被誉为21世纪的健康食品，被联合国粮农组织推荐的最佳饮食结构“一荤一素一蘑菇”中蘑菇就是双孢蘑菇。
双孢蘑菇含有丰富的风味物质，如八碳化合物、含硫化合物、氨基酸、5'-核苷酸及其他成分，是一种深受人们喜爱的食用真菌。双孢蘑菇含有丰富的多糖类、三萜类活性物质，具有较高的保健价值和药用价值，其对营养不良、改善肠胃消化不良、降低三高、增加白细胞、提高免疫、抗氧化、抗肿瘤等都具有显著疗效，是一种重要的食药用菌。
双孢蘑菇栽培菌种的提纯、制备与改良有110多年的历史。全球双孢蘑菇栽培品种包括白色和褐色品系，但以白色为主。
自人工栽培双孢蘑菇以来，人们就不断地选育优良双孢蘑菇菌株。双孢蘑菇的育种方法和技术包括选择育种、纯种培养、组织培养、多孢分离育种、单孢分离育种和杂交育种等。育种目标主要有四个：一是获得基质利用率高，降解转化能力强，产量高的菌株；二是改良蘑菇的抗病虫性基因，提高品种的抗病虫能力；三是改良褐变基因，提高鲜菇保鲜能力；四是提高菌株抗性(抗虫、抗病和耐热等)的新品种。
由于双孢蘑菇遗传背景复杂，缺少优良性状且稳定遗传的生物学标记，担子上的两个孢子大多是自身可育的异核，不能结实的同核体与异核体间没有锁状联合的形态差异，均限制了双孢蘑菇的常规杂交育种工作，导致双孢蘑菇改良菌株的进程缓慢。
双孢蘑菇菌种的质量制约着双孢蘑菇产业的生存和发展，菌种质量低下，可导致菇农减产减收，甚至绝产绝收。
当前世界各国使用的双孢蘑菇商业菌种来源于国外杂交品种U系列或国内AS2796系列的后代，如A15、W192等工厂化栽培菌株。目前，我国双孢蘑菇工厂化栽培所使用的菌种严重依赖国外，每年向国外支付巨额的菌种使用费。而我国自主选育的当家双孢蘑菇菌株AS2796系列是针对国内小规模农户生产的菌种，难以适应工厂化生产的需求。
连续出台的中央一号文件中均体现出要不断提高农业生产效率、增加农民收入，发展“低能耗、低污染、高效率、高收益”的新型农业的精神，在此背景下，具有“点草成金”、“化废为宝”、“化害为利”的产业特性的双孢蘑菇工厂化生产得以快速发展。
双孢蘑菇工厂化生产模式需要专门的、不同于传统栽培的新品种作为技术支撑。然而，与双孢蘑菇产业发达国家相比，我国的双孢蘑菇生产效率低下、单产较低、成本优势逐渐消失，这些问题严重制约着我国双孢蘑菇产业的健康发展。因此，选育出产量高、品质好、适合工厂化栽培的双孢蘑菇优良菌株具有重要意义。
基因组重排育种技术在改变物种遗传特性具有里程碑的意义，它结合了传统育种方法和原生质体融合技术两方面的优势，目前，国内外目前尚未见应用基因组重排技术选育双孢蘑菇菌株的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种双孢蘑菇菌株及其选育方法，选育出的棕色双孢蘑菇菌株平板生长速率快、菌丝生长茂密、子实体原基诱导数量明显提高，提高了棕色双孢蘑菇产量，基质利用率高，易于进行工厂化栽培，提高了经济效益。
为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种双孢蘑菇(Agaricusbisporus，GS5005)，其生物保藏号为CCTCC NO：M2017244，保藏日期为2017年5月18日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏地址为武汉市武昌区珞珈山武汉大学，邮编：430072。
本发明所述双孢蘑菇菌株，菌落9d长满平板，平板菌丝为白色，形成的原基数为151-202个/m2，成熟子实体菌盖为棕色，工厂化栽培单位面积产量在26kg/m2以上。
本发明所述双孢蘑菇菌株的选育方法，包括如下步骤：
1)构建突变体库
在棕色双孢蘑菇的突变体中，筛选出生长速率快、生长健壮、菌丝较密的单菌株，构建菌株突变体库；
2)原生质体灭活及筛选融合条件
将菌株突变体库中的菌株制备为原生质体，并进行双灭活；
将双灭活的原生质体离心，去上清，收集沉淀，悬浮，加入预热的PEG融合剂，进行融合，再生；根据褐色双孢蘑菇原生质体融合率，在PEG融合剂浓度25-45wt.％、融合剂pH6.5-8.5、融合时间10-40min、融合温度25℃的范围内筛选出最优融合条件；
3)基因组重排
以突变体菌株作为第一轮基因组重排的亲本，制备为原生质体，并进行双灭活，按照步骤2)中确定的最优融合条件进行融合；
原生质体融合结束后，离心沉淀原生质体并洗涤，去除PEG融合剂，悬浮于渗透压稳定剂中，涂布至再生平板，于25±0.5℃恒温培养5～7d进行再生；
以出发菌株作为对照，挑取生长速度快、菌丝浓密的菌株作为F1代阳性棕色双孢蘑菇重排菌株；
再以F1代阳性棕色双孢蘑菇重排菌株为第二轮基因组重排的亲本，按第一轮基因组重排的方法，进行第二轮原生质体融合、再生、挑取生长速度快、菌丝浓密的菌株，获得F2代阳性棕色双孢蘑菇重排菌株；
共进行5轮循环原生质体融合、再生、生长性状筛选的过程，选出每代仍然能生长的重排菌株，分别标记为GS1、GS2、GS3、GS4、GS5代重排菌株；
4)筛选
将筛选得到的GS4和GS5重排菌株连续转接培养4-10代，选出到第4-10代还保持平板生长性能良好、菌丝浓密、生长速度快、遗传性稳定的基因组重排菌株菌株，作为双孢蘑菇菌株；
5)鉴定
利用相关序列扩增多态性DNA法对获得的双孢蘑菇菌株进行基因重排鉴定。
优选地，所述双灭活为紫外线灭活和热灭活两种灭活方式。
又，步骤2)中筛选出的最优融合条件为：PEG终浓度35％、融合剂pH8.5、融合时间30min、融合温度25℃。
进一步，所述渗透压稳定剂为0.6mo1/L的甘露醇溶液。
又，所述出发菌株为棕秀一号。
本发明利用基因组重排育种技术选育棕色双孢蘑菇菌株，在突变体库中挑选出若干正向突变菌株，将其作为融合菌株库，再进行原生质体融合和再生，将再生菌落作为F1代，从中筛选若干具有阳性性状的融合菌株，将筛选的阳性融合子制备成原生质体，重复融合再生，依此类推，进行5轮递归式的原生质体融合，最终使具有正向突变特性的不同基因重组到同一原生质体细胞中，使优势性状集中化，从而达到改良菌种的目的。
本发明选育出的双孢蘑菇菌株，基质利用率高，其能正常出菇，遗传稳定性好，通过4-5轮的递推式原生质体融合，筛选得到3株生长性能提高的融合株。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明采用基因组重排技术选育出基质利用率高的双孢蘑菇菌株，其能正常出菇，平板生长速率快、菌丝生长茂密，且遗传稳定性好，其在栽培料上融合菌株较出发菌株提前了1.3天布满菌丝，形成的原基数为151-202个/m2，原基形成数提高28％以上；工厂化栽培单位面积产量为26.3kg/m2，比现有菌株的产量提高了32％以上，基质利用率提高，显著提高了经济效益。
附图说明
图1为本发明实施例双孢蘑菇原生质体(10×40倍)。
图2为本发明实施例的生长性能提高菌株的筛选平板培养。
图3为本发明实施例的突变株栽培至麦粒培养基生长情况。
图4为本发明实施例的基因组重排菌株在栽培料生长情况。
图5为本发明实施例的基因组重排菌株子实体原基情况。
图6为本发明实施例中重排菌株GS5005工厂化栽培生长情况。
图7-14为本发明实施例不同菌株的SRAP扩增产物电泳图。
图15为不同菌株的SRAP双孢蘑菇种质基于SRAP分析的聚类图。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。
本发明实施例所用培养基及溶液的配制方法：
PEG融合剂的配制(0.4g/mL)：称取40g促溶剂PEG6000，用0.6mol/L甘露醇溶液充分溶解，加入0.1molCaCl2溶液10mL，pH调节至8，终体积定容到100mL，高温灭菌备用。
液体马铃薯葡萄糖稻草浸汁培养基(1L)：无霉菌新鲜稻草100g，煮沸30min，用双层纱布过滤，滤液定容到1L，即得稻草浸汁；再按照PDA培养基配置过程将稻草浸汁代替水，用马铃薯200g，葡萄糖20g，配制马铃薯葡萄糖稻草浸汁培养基。
PDA平板培养基(1L)：马铃薯200g，加入适量水煮沸20min，4层纱布过滤弃滤渣，向滤液中加入20g葡萄糖和20g琼脂粉，补加水至1000mL，pH自然。
PDA再生培养基(1L)：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂18g，甘露醇终浓度为0.6mol/L。以上所有培养基均采用湿热灭菌法灭菌，置4℃冰箱保存备用。
渗透压稳定剂为0.6mo1/L的甘露醇溶液。
实施例棕色双孢蘑菇菌株的选育方法，包括如下步骤：
1.原生质体制备
把出发菌株棕秀一号分别接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)固体培养基上，25±0.5℃恒温培养10d，取PDA固体培养基上生长旺盛的菌丝，接种到盛有100mLPD培养基的三角瓶中，25℃、每12h摇匀一次，培养7d，收集菌丝，用无菌均质器将其拍打粉碎，吸取1mL菌液至100mL液体马铃薯葡萄糖稻草浸汁培养基中，25℃，培养10d。
取培养10d的棕色双孢蘑菇菌丝，用四层灭菌的纱布过滤，然后用无菌水冲洗3次，用无菌纸吸干后悬浮于适量已配制好的一定浓度的等体积双酶溶液(2.5％溶壁酶，9％蜗牛酶)中，25℃，100r·min-1振荡酶解。酶解10h后，用G3的砂芯漏斗过滤，除去菌丝碎屑，4000r·min-1，4℃离心10min收集原生质体，并用0.6mol·L-1的甘露醇的渗透压稳定剂洗涤3次，最后加入适量0.6mol·L-1的甘露醇渗透压稳定剂制成悬浮液，然后用血球计数板计数。每个处理设3个重复，具体结果参见图1，由图1可以看出，原生质体个体较大，形状圆润，说明原生质体活性较好，保证了它的再生率。
2.原生质体诱变
1)化学(EMS)诱变
棕色双孢蘑菇出发菌株棕秀一号培养并制备原生质体，用0.6mol/L的甘露醇渗透压稳定剂配制2％(体积浓度比)的EMS溶液，分别加入到棕秀一号原生质体中，混匀，在25±0.5℃条件下处理1h，然后用0.6mol/L的甘露醇渗透压稳定剂洗涤3次，用适量浓度为0.6mol/L的甘露醇渗透压稳定剂重新悬浮棕秀一号原生质体，用血球计数板计数，调整原生质体悬浮液的浓度到105/mL，吸取0.1mL悬浮液，涂布于PDA再生培养基。
2)紫外诱变
双孢蘑菇出发菌株棕秀一号培养并制备原生质体，用显微镜血球计数板计数，稀释原生质体浓度到105/mL，吸取0.1mL稀释的原生质体，涂布于PDA再生培养基上，用紫外灯(15W)进行诱变。培养皿距紫外灯管30cm，灯预热20min后，小心打开培养皿盖进行紫外照射，诱变时间设置为为70s。每个诱变时间梯度设5个平板重复，紫外诱变结束后，平板用黑纸包严，置25±0.5℃下避光培养。为预防光复活，以上操作均在红光下进行，恒温培养7d。
3)60Co-γ诱变
双孢蘑菇出发菌株棕秀一号培养并制备原生质体，用血球计数板计数，稀释浓度到105/mL，取1mL原生质悬浮液置于2.0mL离心管中，采用上海市农业科学院华漕院区辐照中心的15万居里(装源量)的钴源辐照装置进行双孢蘑菇原生质体诱变，剂量率为10GY/min，诱变剂量梯度设置为900GY，诱变结束后吸取0.1mL原生质体溶液，涂布于PDA再生培养基。
4)电子束诱变棕色双孢蘑菇出发菌株棕秀一号培养并制备原生质体，用血球计数板计数，稀释原生质体浓度到105/mL，取1mL原生质悬浮液置于2.0mL离心管中，采用上海市农业科学院奉浦院区束能辐照中心的高能电子直线加速器对原生质体进行诱变，功率设置为10KW，以每秒能发射10Mev能量，将电子束诱剂量梯度设置为1000GY，原生质体诱变结束后吸取0.1mL溶液，涂布于PDA再生培养基。
3.变异菌株筛选
步骤2诱变的棕色双孢蘑菇原生质体再生后，于25±0.5℃条件下培养，7d后挑取复苏生长较快的单菌落再接种于PDA平板上，筛选生长速率快，且生长健壮、菌丝较密的单菌株为初筛变异菌株。
把初筛变异菌株连续转接5代，每代都进行平板生长速率实验，参见图2，到第5代比出发菌株棕秀一号生长速率快，且生长健壮、菌丝较密的菌株为最终筛选出的突变体菌株，突变株栽培至麦粒培养基后20天的生长情况参见图3。
4.原生质体灭活及融合
将诱变获得的棕秀一号突变库中突变菌株根据诱变方式不同分为两大组，并分别制备原生质体，一组采用原生质体紫外线灭活处理，另一组采用原生质体热灭活处理。
将两组灭活的原生质体悬液各取1mL加入2mL的无菌离心管中，充分混合均匀，4℃下以转速为4000r/min冷冻离心10min，倒掉上清液，收集原生质体沉淀。用0.2mL渗透压稳定剂悬浮原生质体，然后加入已25℃预热的PEG融合剂，通过PEG溶液的加入量来调整PEG终浓度(25％-45％)，25℃水浴保温25min后加入8mL渗透压稳定剂终止细胞融合进程，并离心沉淀原生质体并洗涤3次，去除融合剂。洗涤后的棕色双孢蘑菇原生质体重新悬浮于渗透压稳定剂中，涂布到PDA再生平板再生培养。
根据棕色双孢蘑菇原生质体融合率，在PEG融合剂浓度25-45wt.％、融合剂pH6.5-8.5、融合时间10-40min、融合温度25-31℃的范围内筛选最优融合条件；
其中，棕色双孢蘑菇原生质体融合率按公式I计算：
A＝[(C-D)/B]×100％ 公式I
其中，A表示棕色双孢蘑菇原生质体融合率；B表示棕色双孢蘑菇亲株再生平板的菌落数；C表示棕色双孢蘑菇融合再生平板的菌落数；D表示棕色双孢蘑菇灭活亲本再生平板的菌落数。
筛选出的最优融合条件为：PEG终浓度35％、融合剂pH8.5、融合时间30min、融合温度25℃，此条件下，棕色双孢蘑菇原生质体融合率较高，棕色双孢蘑菇原生质体融合较好。
5.菌株5轮基因重排
构建的出发菌株棕秀一号突变株作为第一轮细胞基因组重排的亲本，分别制备原生质体后充分混合，然后将原生质体分为两等份，一份进行原生质体热灭活，另一份进行原生质体紫外线灭活。将两份不同方式灭活的原生质体混合后，在促溶剂PEG优化浓度的作用下进行细胞融合，涂布再生平板，25±0.5℃恒温培养7d再生。
以出发菌株棕秀一号经同样处理作为对照，挑取生长速度快、菌丝浓密的菌株为F1代阳性重排菌株；再进行第2轮基因组重排，将F1代阳性棕色双孢蘑菇重排菌株全部收集，分成两等份，制备F1代阳性棕色双孢蘑菇原生质体，并按同样的步骤进行第二轮原生质体融合、再生，挑取生长速度快、菌丝浓密的菌株，所得融合菌株即为第二轮融合子，即F2代阳性重排菌株。原生质体融合、再生、生长性能试验进行5轮循环。选出每代仍然能生长的重排菌株，分别标记为GS1、GS2、GS3、GS4、GS5代重排菌株。
6.重排菌株的农艺性状
对通过生长速率筛选得到的GS4和GS5重排菌株连续转接培养5代，分别记为GS4005、GS5005，到第5代还保持平板生长性能良好、菌丝浓密、生长速度快的菌株GS5005，为最终筛选出的遗传性稳定的基因组重排菌株。
以出发菌株棕秀一号为对照，进行在配料上菌丝生长速度、子实体原基发生动态和生产栽培的产量等农艺性状进行比较，重排菌株的生长情况参见图5和图6，由图5可见，重排菌株形成的原基分布均匀，而且大小一致，表现良好的原基性状。由图6可见，重排菌株成熟的子实体，菇盖圆大，呈黄褐色，菇盖多生纤维状鳞片。
7.分子生物学鉴定
对选出的农艺性状好，基质利用率高的3株重排菌株GS4017、GS4016和GS5005，用相关序列扩增多态性DNA(SRAP)法，鉴定基因组重排菌株是否在诱变的基础上，丰富了遗传变异。本实施例通过设计了相关序列扩增多态性的随机引物，对重排菌株的DNA模板进行扩增，来分析重排菌株与出发菌株的遗传多样性，具体序列见表1。
表1随机引物序列
扩增产物在2.0％琼脂糖凝胶中电泳120min，紫外灯下观察重排菌株与出发菌株的电泳条带是否存在差异，SRAP引物组扩增的部结果参见图7-14，其中，M表示标准分子量，1为棕秀一号，2为重排菌株GS4016，3为重排菌株GS4017，4为重排菌株GS5005。
图7为引物对Me7、Em16的扩增结果；图8为引物对Me6、Em6的扩增结果；图9为引物对Me1、Em14的扩增结果；图10为引物对Me6、Em12的扩增结果；图11为引物对Me2、Em16的扩增结果；图12为引物对Me7、Em12的扩增结果；图13为引物对Me7、Em14的扩增结果；图14为引物对Me1、Em15的扩增结果。
由图7-14可见，各引物对均扩增出了清晰且呈现稳定多态性的条带，图谱多态性丰富，可以明显看出重排菌株和出发菌株遗传变化。
在同一组引物的扩增产物的电泳图中，迁移率相同的条带记为一个位点，阳性扩增记为“1”，阴性扩增记为“0”。
采用popgene32计算出菌株等位基因数(Na)、菌株有效等位基因数(Ne)、菌株Shannon信息指数(I)和菌株遗传相似系数(GI)等遗传多样性参数，采用NTSYSpc2.0软件对遗传相似系数进行UPGMA聚类分析，具体和图15。
由图15可见，融合菌株与棕秀一号的成对相似系数变幅为0.5102～0.8204，融合菌株4017与棕秀一号的相似系数为0.8204，融合菌株GS4016和GS5005与起始菌株棕秀一号的相似系数为0.5102和0.5306。基因组重排在诱变的基础上，创造丰富了遗传变异，拓宽了棕秀一号原品种的遗传基础。
本实施例通过4-5轮的递推式原生质体融合，筛选得到3株生长性能提高的融合株，融合株经过在栽培料上菌丝生长、子实体原基诱导和工厂化栽培试验发现，融合菌株和出发菌株棕秀一号存在明显的差异，在栽培料上融合菌株较出发菌株提前了0.4-1.3天布满菌丝，其中重排菌株GS5005较棕秀一号提前了1.3天；重排菌株的子实体原基要比棕秀一号的原基出现的早，且总数也多。
挑选出本实施例农艺性状最好的1株棕色双孢蘑菇菌株，即重排菌株GS5005进行生物保藏，该棕色双孢蘑菇菌株能正常出菇，遗传稳定性好，基质利用率高，在栽培料上融合菌株较出发菌株提前了1.3天布满菌丝，形成的原基总数为202个/m2，比出发菌株多45个/m2，原基形成数提高28.66％；工厂化栽培单位面积产量为26.3kg/m2，分别比出发菌株的产量19.8kg/m2提高了32.83％。

Claims (7)

1.一种双孢蘑菇菌株，其生物保藏号为：CCTCC NO：M2017244。
2.根据权利要求1所述双孢蘑菇菌株，其特征在于，所述双孢蘑菇菌株菌落9d长满平板，平板菌丝为白色，形成的原基数为151-202个/m2，成熟子实体菌盖为棕色，工厂化栽培单位面积产量在26kg/m2以上。
3.一种双孢蘑菇菌株的选育方法，包括如下步骤：
1)构建突变体库
在棕色双孢蘑菇的突变体中，筛选出生长速率快、生长健壮、菌丝较密的单菌株，构建菌株突变体库；
2)原生质体灭活及筛选融合条件
将菌株突变体库中的菌株制备为原生质体，并进行双灭活；
将双灭活的原生质体离心，去上清，收集沉淀，悬浮，加入预热的PEG融合剂，进行融合，再生，根据褐色双孢蘑菇原生质体融合率，在PEG融合剂浓度25-45wt.％、融合剂pH6.5-8.5、融合时间10-40min、融合温度25-31℃的范围内筛选出最优融合条件；
3)基因组重排
以突变体菌株作为第一轮基因组重排的亲本，制备为原生质体，并进行双灭活，按照步骤2)中确定的最优融合条件进行融合；
原生质体融合结束后，离心沉淀原生质体并洗涤，去除PEG融合剂，悬浮于渗透压稳定剂中，涂布至再生平板，于25±0.5℃恒温培养5～7d进行再生；
以出发菌株作为对照，挑取生长速度快、菌丝浓密的菌株作为F1代阳性棕色双孢蘑菇重排菌株；
再以F1代阳性棕色双孢蘑菇重排菌株为第二轮基因组重排的亲本，按第一轮基因组重排的方法，进行第二轮原生质体融合、再生、挑取生长速度快、菌丝浓密的菌株，获得F2代阳性棕色双孢蘑菇重排菌株；
共进行5轮循环原生质体融合、再生、生长性状筛选的过程，选出每代仍然能生长的重排菌株，分别标记为GS1、GS2、GS3、GS4、GS5代重排菌株；
4)筛选
将筛选得到的GS4和GS5重排菌株连续转接培养4-10代，选出到第4-10代还保持平板生长性能良好、菌丝浓密、生长速度快、遗传性稳定的基因组重排菌株菌株，作为双孢蘑菇菌株；
5)鉴定
利用相关序列扩增多态性DNA法对获得的双孢蘑菇菌株进行基因重排鉴定。
4.根据权利要求3所述双孢蘑菇菌株的选育方法，其特征在于，所述双灭活为紫外线灭活和热灭活两种灭活方式。
5.根据权利要求3所述双孢蘑菇菌株的选育方法，其特征在于，步骤2)中筛选出的最优融合条件为：PEG终浓度35％、融合剂pH8.5、融合时间30min、融合温度25℃。
6.根据权利要求3所述双孢蘑菇菌株的选育方法，其特征在于，所述渗透压稳定剂为0.4-0.6mo1/L的甘露醇溶液。
7.根据权利要求3所述双孢蘑菇菌株的选育方法，其特征在于，所述出发菌株为棕秀一号。
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