CN105316258B - 一种防治水稻纹枯病的菌株1ln2及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种防治水稻纹枯病的菌株1LN2，其分类命名为假单胞菌属（Pseudomonas sp.），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2015年9月10日，保藏编号为CGMCC No.11361。本发明还公开了一种生防菌剂，该生防菌剂是由防治水稻纹枯病的菌株1LN2制备而成。本发明还公开了上述生防菌剂在防治水稻纹枯病方面的应用。本发明在温室中使用生防菌剂1LN2对水稻纹枯病有一定程度的防治效果，温室防效达到60.25%，大田试验处理一个月后田间防效达到50.31%，1LN2菌株制剂可以提高稻米的蛋白质含量、降低直链淀粉含量、提高胶稠度，还有一定程度的增产效果，与常规化学药剂相比其增产效果达到7.1%。

Description

一种防治水稻纹枯病的菌株1LN2及其应用

技术领域

本发明属于农作物防治技术领域，具体涉及一种防治水稻纹枯病的菌株1LN2及其应用，专用于水稻纹枯病的绿色防治。

背景技术

水稻纹枯病是由立枯丝核菌[Rhizoctonia solani]引起的一种土传病害，是水稻的三大病害之一，分布在世界各个稻区，一般可造成10％-30％的产量损失，发生严重时可造成产量损失达50％以上。近年来，随着矮秆品种和杂交水稻的大面积推广及栽培措施的变革，水稻纹枯病发生的面积逐年扩大，给水稻的增产稳产带来了极大的障碍。

目前，水稻纹枯病的防治在抗病育种方面尚未突破，至今没有发现免疫或高抗品种，在实际生产过程中，主要依靠选用耐病品种以及化学药剂来防治，如：井冈霉素、丙环唑、烯唑醇、恶毒灵、爱苗、满穗、稻立峰等，化学药剂的长期反复使用易产生抗药性，导致使用量的不断增加以及生产成本的不断提高，在污染环境的同时也存在农药高残留的问题，给农产品的出口带来障碍，给人畜的生命带来了威胁。因此，采用生物防治策略来防治水稻纹枯病日益受到关注，成为了这种病害研究的新方向。

近年来，生物防治方法防治水稻纹枯病也日益兴盛，主要有：微生物、植物提取物、稻鸭共养模式等，它们的生防机理主要是通过拮抗、竞争、寄生、抗生以及诱导抗病性等方面进行病害的防治；已有大量研究报道了将生防菌引入植物可提高植物的抗病、抗逆性。由于生防菌在抑制植物病害方面的广谱性、高效性以及安全性，目前成为农药市场发展的趋势，被称为是最有潜力的发展方向。

迄今为止尚未发现理想的免疫或高抗品种，主要依赖化学药剂防治，环境污染问题日益突出，所以在注重发展无绿色生产技术的今天，生物防治作为防治水稻纹枯病的一种新思路，将得到进一步的重视与发展。因此，开发新的、更为高效和安全的微生物制剂控制水稻纹枯病的发生是提高社会生产总量的需要，同时更是国家粮食安全及可持续发展战略的需要。

发明内容

发明目的：针对水稻纹枯病没有较高防效的生防菌株制剂现状，本发明的第一个目的是提供一种具有良好的防治水稻纹枯病的生防菌株。

本发明的第二个目的是提供防治水稻纹枯病的菌株1LN2在防治大田水稻纹枯病方面的应用。

本发明的第三个目的是提供生防菌剂，专用于防治水稻纹枯病，菌株的防效高，并且有较好的增产功能。

本发明的第四个目的是提供上述生防菌剂的制备方法。

本发明的第五个目的是提供上述的生防菌剂在防治水稻纹枯病方面的应用。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：一种防治水稻纹枯病的菌株1LN2，其分类命名为假单胞菌属(Pseudomonas sp.)，该菌株已于2015年9月10号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为CGMCC No.11361。

上述的防治水稻纹枯病的菌株1LN2在防治大田水稻纹枯病方面的应用。

一种生防菌剂，上述的生防菌剂是由防治水稻纹枯病的菌株1LN2制备而成。

上述的生防菌剂的制备方法，包括以下步骤：将菌株1LN2在LB平板上划线，28℃生化培养箱中培养14-16h，待长出单菌落后，挑取单菌落接入含有5mL的LB培养液的试管中，置于28℃、200r/min的摇床中培养，制成种子液；以1％的接种量将种子液接种于装有500mL的LB培养液的三角瓶里，置于28℃、200r/min的摇床中培养48h，待菌液浓度达到10⁹CFU/mL时稀释待用，即为所制备的1LN2生防菌剂。

上述的生防菌剂在防治水稻纹枯病方面的应用。

其应用方法为，菌株制剂在作物育苗时喷施于秧盘或与育秧基质混合、也可以稀释后在大田喷雾使用。

有益效果：本发明与现有水稻纹枯病防治技术相比，其优点和积极效果表现在：本发明是专门针对水稻纹枯病开发的生防菌株，因而在防治水稻纹枯病方面与目前其他化学药剂相比防治效果显著提高。由于是生防微生物制剂，完全没有因化学农药的使用而带来环境问题及食品完全问题，因而有利于作物的无公害生产，农民可以不用或减少其他防治水稻纹枯病化学农药的用量，这不仅可为农民节省开支，而且有利于作物的出口。同时，生防菌株制剂还有增产功能，可为农民增加收入。

1LN2菌株制剂可以在水稻育苗时与基质混合或在水稻流水线播种时随底水喷施于秧盘内，然后随水稻移栽到大田，同时在大田进行喷雾防治。

栽苗后，菌株通过多种生防机制起作用，从而达到防治水稻纹枯病的效果。试验表明，在温室中使用1LN2菌株制剂对水稻纹枯病有一定程度的防治效果，温室防效达到60.25％，处理一个月后田间防效达到50.31％，1LN2菌株制剂可以提高稻米的蛋白质含量、降低直链淀粉含量、提高胶稠度，还有一定程度的增产效果，与常规化学药剂相比其增产效果达到7.1％。

附图说明

图1为温室试验中生防菌剂1LN2处理后30天后对水稻秧苗的促生效果；

注：左—CK，右—1LN2。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明进一步说明，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本发明的保护范围。

实施例1菌株的筛选与鉴定

于2011年10月，在江苏省太仓市城厢镇东林村以及科教新城发病严重的地块采集样品。采用五点采样法，每点间隔至少10m。每点三株健康植株与发病重的植株连同根围土一并收集。采集后的样品迅速装入写好编号的塑料袋中带回实验室进行分离。

菌株1LN2是从发病的植株茎内分离得到。其分离方法为：分别剪去根茎叶各3g，用1％的次氯酸钠1mL浸5min，70％酒精浸2min，无菌水清洗3次。(取最后一次清洗的溶液0.1mL涂R2A平板，或取0.1mL最后一次清洗液加入R2A培养液，30℃振荡培养，若48h后无菌生长则认为表面消毒干净)。用灭菌的研砵分别研碎表面消毒好的根茎叶，加3mL无菌水，无菌棉布过滤，用无菌水稀释10倍，取0.1mL涂LB平板，每个点重复3次，28℃培养48h，计数，挑取平板上所有的菌落分离纯化，-70℃、40％甘油保存备用。

通过形态特征，生理生化实验和16S rDNA基因序列分析对该菌株进行鉴定。16SrDNA基因扩增和序列分析:

菌株1LN2在R₂A培养基中28℃培养至对数期，以12000r/min离心5min收集菌体，采用上海赛百盛基因技术有限公司的基因组DNA快速提取试剂盒，提取细菌的基因组DNA，以提取的DNA产物为模板，用细菌16SrDNA基因扩增通用引物U8-27(F)5’-AGAGTTTGA TC(AC)TGGCTCAG-3’；L1494-1514(R)5’-CTACGG(AG)TACCTTGTTACGAC-3’。从细菌的基因组DNA中扩增出16S rDNA基因片段。PCR产物送上海生工生物工程有限公司进行测序。通过BLAST软件对测定16S rDNA基因序列进行同源性比较，结果将该菌株鉴定为假单胞菌属(Pseudomonassp.)，菌株测序结果如下所示。

测序结果：

1.GGCTACCATGCAGTCGAGCGGTAGAGAGAAGCTTGCTTCTCTTGAGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGTTCGGAAACGGACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGTTGTAGATTAATACTCTGCAATTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTTGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCAAAACTGACTGACTAGAGTATGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTAATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGAAGCCTTGAGCTTTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATCAAATGAACTTTCTAGAGATAGATTGGTGCCTTCGGGAACATGAGACAAGGTGCTGCATGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCGTACGAGCGCAACTCTATGTCTAGTACCAGCACGTCATGGTGGCACTCTAGAACTGCGGTGACAAATCGAGGAGTGGGATGACGTCAGTCATCATGTCTACCGCTGGCTAACCACGTGCTACAATGGTTCGTTACGAGGCTGCCAGCTCGCGAAGGGTGGAGCTC

2.AGCTCAACCGTGGTACCGTCCTCCCGAAGGTTAGACTAGCTACTTCTGGTGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGACATTCTGATTCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGGACTACGATCGGTTTTATGGGATTAGCTCCACCTCGCGGCTTGGCAACCCTCTGTACCGACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGCCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCCTTAGAGTGCCCACCATGACGTGCTGGTAACTAAGGACAAGGGTTGCGCTCGTTACGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCAATGTTCCCGAAGGCACCAATCTATCTCTAGAAAGTTCATTGGATGTCAAGGCCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCAACTTAATGCGTTAGCTGCGCCACTAAAAGCTCAAGGCTTCCAACGGCTAGTTGACATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTCAGTGTCAGTATTAGTCCAGGTGGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTTCCTATATCTACGCATTTCACCGCTACACAGGAAATTCCACCACCCTCTACCATACTCTAGTCAGTCAGTTTTGAATGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCGGGGATTTCACATCCAACTTAACAAACCACCTACGCGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCTGTATTACCGCGGCTGCTGGCACAGAGTTAGCCGTGCTTATTCTTGTCGGTAACGTCAAAATTGCAGAGTATTAATCTACAACCCTTTCCTCCCAACTTAAAGTGCTTTACAATCCGAAGACCTTCTTCACACACGCGCATGACTGGATCAGCTTCGCCCATGTCCAATATCCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGAGTCTGACGTGTTCTCAGTTCAGTGTGACTGATCATCCTCTCAGAACAGTACGATCGGTCGCTGGTGAGCATTTACCTCACCAACTAGCTATC

将该菌株1LN2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11361。

实施例2：生防菌剂的制备

将菌株1LN2在LB平板上划线，28℃生化培养箱中培养14-16h，待长出单菌落后，挑取单菌落接入含有5mL的LB培养液的试管中，置于28℃、200r/min的摇床中培养，制成种子液；以1％的接种量将种子液接种于装有500mL的LB培养液的三角瓶里，置于28℃、200r/min的摇床中培养48h，待菌液浓度达到10⁹CFU/mL时稀释待用，即为所制备的1LN2生防菌剂。

实施例3：温室防效实验和温室促生试验

1、温室防效实验：

将稻种用2％的次氯酸钠溶液对种子进行消毒15分钟，清水冲洗3-4次后浸泡置于30℃恒温箱中48h后拿出，然后用清水冲洗后将吸足水的种子置于35-38℃的室内用纱布覆盖进行高温保湿催芽至破胸，破胸后置阴凉处摊晾炼芽4h-8h，待种子内湿外干不粘连即可进行播种育苗。采用育苗移栽的方法，先将种子播种于装有灭菌基质的育秧盘内，后置于30℃-35℃，湿度为85％以上的室内进暗化出苗，出苗后置于28℃-30℃、16/8h光周期，70％以上相对湿度的温室中进行培育，在秧龄15d时移栽。移栽定植后第3d进行灌根处理、30d后进行叶面喷雾。灌根处理菌液浓度为5×10⁷CFU/ml，每钵苗用量为25ml，缓慢浇灌于水稻根部。喷雾处理菌液浓度为5×10⁷CFU/ml，按照0.01％的终浓度加入表面活性剂Tween-20，均匀喷雾于水稻叶片。对照采用清水处理。生防菌叶面喷雾处理15d后进行纹枯病病原菌挑战接种处理，在水稻每两张叶片的叶鞘处放置水稻纹枯病菌核，其上方用脱脂棉覆盖，并用封口膜捆绑固定，同时定期用灭菌水对植株以及整间温室喷雾，从而来保证室内相对湿度90％左右。接种病原菌20d后调查病害严重度并计算生防效果。水稻纹枯病的分级标准：0级，无病症；1级，基部叶片、叶鞘发病；2级，倒三叶以下各叶鞘或叶片发病；3级，倒二叶以下各叶鞘或叶片发病；4级，剑叶叶鞘或叶片发病。

病害严重度＝∑(各级病株数×级值)/(调查总株数×最高级值)×100％；

防治效果＝(对照组病害严重度－处理组病害严重度)/对照组病害严重度×100％。

在病原菌接种20d后的调查结果显示，生防菌剂1LN2对水稻纹枯病的生物防治效果(以下简称防效)达到60.25％(表1)。

表1病原菌接种20d后对水稻纹枯病的温室防效

注：数值为平均值±标准误，^*P≤0.05表示与CK(清水)组相比，处理组具有显著性差异。

2、温室促生试验

将稻种用2％的次氯酸钠溶液对种子进行消毒15分钟，清水冲洗3-4次后浸泡置于30℃恒温箱中48h后拿出，然后用清水冲洗后将吸足水的种子置于35-38℃的室内用纱布覆盖进行高温保湿催芽至破胸，破胸后置阴凉处摊晾炼芽4h-8h，待种子内湿外干不粘连即可进行播种。促生试验中采用直播的方法，将种子播到装有灭菌土的营养钵中，播后调节室内温度至28℃-30℃、16/8h光周期，相对湿度70％以上，3d后进行灌根处理，灌根处理菌液浓度为5×10⁷CFU/ml，每钵苗用量为25ml，缓慢浇灌于水稻根部。对照采用清水处理。30d后将稻苗小心拔出，用水枪冲净泥土，测量其株高、茎基宽、根长、鲜重和干重。

生物量的增加计算公式如下：

温室条件下，生防菌剂1LN2处理30d后，处理间水稻秧苗的株高、茎基宽、根长、鲜重和干重等指标上与对照之间具有显著性差异，生物量的增加达到25.89％(表2)。

表2生防菌剂1LN2处理后30天对水稻秧苗的温室促生效果

注：数值为平均值±标准误，^*P≤0.05表示与CK(清水)组相比，处理组具有显著性差异。

实施例3大田防效实验

2012年6月在江苏省太仓市科教新城欣科农场进行大田防效试验。供试品种为南粳46号(对纹枯病高感)，种植方式为机械栽插，种植密度为19000穴/667m²。试验设3个处理，3次重复，共9个小区，每小区面积为42m²，采用随机区组设排列，四周及小区之间均设有田埂和保护行。在8月底进行第一次生防菌处理，之后每隔10d喷施一次，整个水稻其共防治3次。生防菌剂处理喷施用量为2L/667m²；常规对照为井冈霉素腊芽杆菌，喷使用量为60g/667m²；空白对照为清水对照。每小区固定5点，每点取相连5穴，共调查25穴，每次用药前一天进行病情指数调查。喷施方法为采用手动喷雾器均匀粗喷雾至稻丛基部。生防菌剂喷施时均加入终浓度为0.01％的表面活性剂Tween-20。试验全部采用标准的田间常规管理模式，并且不再使用其他杀菌剂。

水稻纹枯病的分级标准：0级，无病症；1级，基部叶片、叶鞘发病；2级，倒三叶以下各叶鞘或叶片发病；3级，倒二叶以下各叶鞘或叶片发病；4级，剑叶叶鞘或叶片发病。

病害严重度＝∑(各级病株数×级值)/(调查总株数×最高级值)×100％；

防治效果＝[(对照组病害严重度-对照组基数病害严重度)-(处理组病害严重度-各处理基数病害严重度)]/(对照组病害严重度-对照组基数病害严重度)×100％；

在生防菌剂1LN2初次喷雾后第10、20和30d，生防菌剂1LN2处理的病害严重度均低于清水对照。生防菌剂1LN2的防效分别达到29.01％、50.24％、50.31％，其中在喷雾处理后的第30d生防菌剂1LN2处理组防效显著高于常规化学药剂处理组(表3)。

表3生防菌剂1LN2对水稻纹枯病的大田防效

注：数值为平均值±标准误，^*P≤0.05表示与CK(清水)组相比，处理组具有显著性差异。

在水稻收割前对各小区水稻进行测产，并调查穗数、每穗粒数、实粒数、结实率、千粒重，计算理论产量和实收产量。

理论产量＝每亩有效穗×每穗粒数×结实率×千粒重/1000×1000

发现生防菌剂1LN2处理的水稻与常规化学药剂和清水对照相比，各项指标都有一定提高(表4)，其中，生防菌剂1LN2处理后实收亩产达到656.53kg，显著高于常规化学药剂和清水对照。与常规化学药剂相比产量增幅达7.1％。

表4生防菌剂1LN2对水稻大田产量的影响

注：数值为平均值±标准误，^*P≤0.05表示与CK(清水)组相比，处理组具有显著性差异。

测定稻米的部分品质指标，发现生防菌剂1LN2处理的稻米在品质指标较常规化学药剂和清水对照均有所提高(表5)，其中蛋白质含量达到9.09％、直链淀粉含量12.61％，胶稠度达到81.00mm，略高于空白对照，与常规化学药剂相比达到显著水平。

表5稻米的部分品质指标测定

注：数值为平均值±标准误，^*P≤0.05表示与CK(清水)组相比，处理组具有显著性差异。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (5)

1.一种防治水稻纹枯病的菌株1LN2，其特征在于，其分类命名为假单胞菌属（Pseudomonas sp.），该菌株已于2015年9月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11361。

2.权利要求1所述的防治水稻纹枯病的菌株1LN2在防治大田水稻纹枯病方面的应用。

3.一种生防菌剂，其特征在于，所述的生防菌剂是由如权利要求1所述的防治水稻纹枯病的菌株1LN2制备而成。

4.权利要求3所述的生防菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将菌株1LN2在LB平板上划线，28℃生化培养箱中培养14-16h，待长出单菌落后，挑取单菌落接入含有5mL的LB培养液的试管中，置于28℃、200r/min的摇床中培养，制成种子液；以1%的接种量将种子液接种于装有500mL的LB培养液的三角瓶里，置于28℃、200r/min的摇床中培养48h，待菌液浓度达到10⁹CFU/mL时稀释待用，即为所制备的1LN2生防菌剂。

5.权利要求3所述的生防菌剂在防治水稻纹枯病方面的应用。