CN107083333A - 攀芝1号灵芝新菌株及其繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物农业技术领域，具体涉及灵芝新菌株及其繁殖方法。本发明要解决的技术问题提供一株高产优质灵芝菌株。本发明的灵芝菌株Ganoderma lucidum攀芝1号，其保藏号为CGMCC No.13175。本发明的攀芝1号培养及栽培周期短，产量高；功效成分含量高，是保健品、药品等生产的优质原材料，具有十分可观的经济效益。
Description
技术领域
本发明属于微生物农业技术领域，具体涉及攀芝1号灵芝新菌株及其繁殖方法。
背景技术
灵芝是我国传统名贵的药用真菌，含有多种氨基酸、蛋白质、生物碱、香豆精、甾类、三萜类、挥发油、甘露脑、树脂及糖类、维生素B1、维生素C等，具有多种生理活性和药理作用。但野生灵芝资源数量有限，仅靠野生灵芝产品不能满足消费者的消费需求。因此，野生灵芝人工栽培需要进一步研究提升。
随着现代育种和栽培技术的发展，灵芝已实现了人工规模化生产。昔日珍贵稀少、高不可攀的灵芝，如今已经被开发成保健佳品。目前，全球灵芝及孢子粉产量约16万吨，产值超过50亿美元，中国是全球灵芝主产国。2015年我国人工代料和段木栽培面积达到15万亩左右，灵芝及孢子粉产量约12万吨，产值16亿美元，分别约占全球的75％和30％。在今后的5年内，对于优质，高功效成分含量的灵芝的需求会进一步增加，市场较大。
基于以上分析，高产优质灵芝新品种选育是中国灵芝产业发展的关键。
发明内容
本发明要解决的技术问题提供一株高产优质灵芝新菌株。
本发明的技术方案是灵芝菌株Ganoderma lucidum攀芝1号。该菌株的保藏号为CGMCC No.13175。保藏时间为2016年10月21日，保藏地点为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
具体的，所述灵芝菌株的ITS序列(Internal Transcribed Spacer，内源转录间隔区)具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
本发明还提供了所述灵芝菌株的繁殖方法，具体如下：攀芝1号的菌种扩繁生产需严格遵循无菌操作原则，母种生产用PDA培养基培养，原种和栽培种生产采用以棉籽壳、木屑为主料，麦麸为辅料组成的培养基；培养及栽培条件：菌丝生长温度15℃～38℃，出芝温度20℃～35℃。
优选的，菌丝生长温度24℃～26℃。
优选的，出芝温度为24℃～26℃。
本发明还提供了上述的灵芝菌株在制备药品或者保健食品中的用途。
本发明优质灵芝新菌株攀芝1号具有以下优点：
(1)遗传性状稳定，适应性广，培养及栽培周期短，产量高。
(2)芝形圆整美观，外观均一度高，有利于大规模生产。
(3)适应性强，可适宜于广泛的大面积推广种植。
(4)功效成分含量高，氨基酸含量为干重的3.658％，蛋白质含量为干重的9.89％，多糖含量1.77％，三萜含量0.94％，是保健品、药品等生产的优质原材料，具有十分可观的经济效益。
本发明涉及的灵芝菌株经鉴定为多孔菌科灵芝属赤芝种，命名为攀芝1号。该菌株保藏于：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏号为CGMCC No.13175，其生物学分类命名为：Ganoderma lucidum。
附图说明
图1.攀芝1号菌丝形态(左)、孢子形态(中)及子实体形态(右)。
图2.基于ITS序列构建的系统进化树。
图3.32个灵芝菌株P2引物扩增ISSR序列电泳图。
图4.32个灵芝菌株ISSR聚类图谱。
图5.攀芝1号与金地灵芝、川芝6号拮抗试验图。
图6.攀芝1号椴木生产推广试验现场图。
具体实施方式
本发明的灵芝菌株采自四川攀枝花的一株野生灵芝新菌株，经人工驯化而成的新品系，经鉴定为多孔菌科灵芝属赤芝种，命名为攀芝1号。该菌株保藏于：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏号为CGMCC No.13175，其生物学分类命名为：Ganoderma lucidum。
该菌株的形态特征如下：
1、形态特征
菌丝：浓白、粗壮，直径8.7±0.9μm。孢子：褐色、卵圆形，直径8.7±0.9μm。子实体呈肾形，直径7～10cm，厚1.0～1.2cm，菌盖表面初期浅黄褐色成熟时赤褐色，具环状棱纹和辐射状皱纹，边缘薄而平截，背面淡黄色，菌肉黄白色；菌柄褐色，有光泽。
2、生物学特性
营养成分来源：攀芝1号品种可PDA培养基保存，适宜在4℃冰箱低温冷藏保存，每3个月转接1次。攀芝1号的菌种扩繁生产需严格遵循无菌操作原则，母种生产适宜用PDA培养基培养；原种和栽培种生产适宜用以棉籽壳、木屑为主料，麦麸为辅料组成的培养基。
培养及栽培条件：菌丝生长温度15℃～38℃，最适24℃～26℃；出芝温度20℃～35℃，最适24℃～26℃。
实施例1菌株的筛选与鉴定
(1)亲本的来源：
为了丰富四川省灵芝种质资源，选育出优良的灵芝新菌株，解决生产上的用种问题，从四川攀枝花市盐边县新九乡的壳斗科树林中采集野生灵采集了1株野生灵芝的子实体进行野生灵芝驯化栽培研究。
(2)初筛：
将获得的菌株进行小规模栽培，了解菌株的子实体形态。筛选农艺性状较好(主要是指灵芝朵型，其中野生菌株有树舌灵芝、紫芝)的菌株进行复筛。
(3)复筛：
扩大栽培规模，了解初筛的菌株产量、抗杂性和稳定性等。对比农艺性状、产量和多糖含量，确定30号菌株(攀芝1号)进行区域试验。
表1 32个灵芝菌株产量及多糖数据
(表2的32个菌株的序号是对应表1的32个菌株的序号)
(4)菌株真实性鉴定：
依据《NY/T1730-2009食用菌菌种真实性鉴定ISSR法》，对32株菌株(表2)，进行菌株(菌种)真实性鉴定，鉴定所用的引物见表3。
表2 32株菌株编号
| 编号 | 菌株名称 | 菌株来源 | 编号 | 菌株名称 | 菌株来源 |
| 1 | SLZ177 | 攀枝花野生分离 | 17 | SLZ194 | 攀枝花野生分离 |
| 2 | SLZ178 | 攀枝花野生分离 | 18 | SLZ195 | 攀枝花野生分离 |
| 3 | SLZ179 | 攀枝花野生分离 | 19 | SLZ196 | 攀枝花野生分离 |
| 4 | SLZ180 | 攀枝花野生分离 | 20 | SLZ197 | 攀枝花野生分离 |
| 5 | SLZ181 | 攀枝花野生分离 | 21 | SLZ198 | 攀枝花野生分离 |
| 6 | SLZ183 | 攀枝花野生分离 | 22 | SLZ199 | 攀枝花野生分离 |
| 7 | SLZ184 | 攀枝花野生分离 | 23 | SLZ200 | 攀枝花野生分离 |
| 8 | SLZ185 | 攀枝花野生分离 | 24 | SLZ201 | 攀枝花野生分离 |
| 9 | SLZ186 | 攀枝花野生分离 | 25 | SLZ202 | 攀枝花野生分离 |
| 10 | SLZ187 | 攀枝花野生分离 | 26 | SLZ203 | 攀枝花野生分离 |
| 11 | SLZ188 | 攀枝花野生分离 | 27 | SLZ204 | 攀枝花野生分离 |
| 12 | SLZ189 | 攀枝花野生分离 | 28 | SLZ205 | 攀枝花野生分离 |
| 13 | SLZ190 | 攀枝花野生分离 | 29 | ZZMY | 绵阳梓潼野生分离 |
| 14 | SLZ191 | 攀枝花野生分离 | 30 | PZNO.1 | 攀芝1号 |
| 15 | SLZ192 | 攀枝花野生分离 | 31 | CYZNO.1 | 福建引进 |
| 16 | SLZ193 | 攀枝花野生分离 | 32 | CZNO.6 | 四川主栽川芝6号 |
表3 10个引物序列
| 编号 | 引物名称 | 引物序列 | 复性温度 |
| 1 | ISSR807 | AGAGAGAGAGAGAGAGT(SEQ ID No.4) | 49℃ |
| 2 | ISSR810 | GAGAGAGAGAGAGAGAT(SEQ ID No.5) | 47℃ |
| 3 | ISSR811 | GAGAGAGAGAGAGAGAC(SEQ ID No.6) | 49℃ |
| 4 | ISSR816 | CACACACACACACACAT(SEQ ID No.7) | 47℃ |
| 5 | ISSR861 | ACCACCACCACCACCACC(SEQ ID No.8) | 54℃ |
| 6 | ISSR866 | CTCCTCCTCCTCCTCCTC(SEQ ID No.9) | 49℃ |
| 7 | ISSR873 | GACAGACAGACAGACA(SEQ ID No.10) | 49℃ |
| 8 | ISSR878 | GGATGGATGGATGGAT(SEQ ID No.11) | 49℃ |
| 9 | E45846 | ACTTCCCCACAGGTTAACACA(SEQ ID No.12) | 54℃ |
| 10 | E26637 | AGAGAGAGAGAGAGAGG(SEQ ID No.13) | 54℃ |
指纹图谱(图3)结果显示，攀芝1号与现有品种及其他对照菌株在分子生物学水平上均存在着差异性。ITS序列系统进化树(图2、图4)鉴定出攀芝1号为赤芝，且与现有品种及其他对照菌株在分子生物学水平上均存在一定的差异性。
结合初筛的农艺性状子实体的形态特征、复筛的子实体产量及多糖含量的指标，确定了攀芝1号为具有商业化栽培潜质的新菌株。
为了进一步验证菌种真实性，课题组设置并完成了相关拮抗实验。依据《NY/T1845-2010食用菌菌种区别性鉴定拮抗反应》，32株菌株，进行菌株(菌种)区别性鉴定结果显示，攀芝1号与现有品种及其他野生灵芝菌株均存在着差异性，这就进一步证实了攀芝1号菌株区别于现有的灵芝菌株(图5)。
对鉴定的攀芝1号进行培养，其菌丝形态(图1左)、孢子形态(图1中)及子实体形态(图1右)。经观察，形态如下：菌丝：浓白、粗壮，直径8.7±0.9μm。孢子：褐色、卵圆形，直径8.7±0.9μm。子实体呈肾形，直径7～10cm，厚1.0～1.2cm，菌盖表面初期浅黄褐色成熟时赤褐色，具环状棱纹和辐射状皱纹，边缘薄而平截，背面淡黄色，菌肉黄白色；菌柄褐色，有光泽。
攀芝1号经特异性引物ITS1(SEQ ID No.2)：TCCGTAGGTGAACCTGCGG，ITS4(SEQ IDNo.3)：TCCTCC GCTTATTGATATGC的PCR扩增，通过构建进化树，鉴定攀芝1号为赤芝Ganoderma lucidum。
SEQ ID No.1攀芝1号的ITS序列如下(SEQ ID No.1)：
CGCGTTCGAGCTTCGACGTGGATGTAGCTGGACTTCCGAGGCATGTGCACGCCCTGCTCATCCACTCTACACCTGTGCACTTACTGTGGGCTTCAGATTGCGAGGCACGCTCTTTACCGGGCTTGCGGAGCATATCTGTGCCTGCGTTTATCACAAACTCTATAAAGTAACAGAATGTGTATTGCGATGTAACACATCTATATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGAAATCTTCAACCTACAAGCTTTTGTGGTTTGTAGGCTTGGACTTGGAGGCTTGTCGGCCGTTATCGGTCGGCTCCTCTTAAATGCATTAGCTTGGTTCCTTGCGGATCGGCTCTCGGTGTGATAATGTCTACGCCGCGACCGTGAAGCGTTTGGCGAGCTTCTAACCGTCTTATAAGACAGCTTTATGACCTCTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAT。
实施例2栽培区域试验
为明确新菌株“攀芝1号”的栽培推广价值，按照四川省农作物品种审定委员会《食用菌品种审定标准》，连续二季(即2年)开展了攀芝1号袋栽试验的不公开区域试验(以下简称区试)。
供试参比品种：以目前四川省生产上大面积栽培的品种川芝6号，并作为攀芝1号的对照。同批制作攀芝1号和川芝6号的栽培种备用。
栽培料配方：棉籽壳60％，木屑30％，玉米粉4％，麸皮5％，石膏1％。含水量65％，pH自然。供试栽培料干燥、不霉变。
装料筒袋：使用聚乙烯塑料袋塑料筒袋作为供试品种栽培料基质的盛装容器。筒袋规格(长度×折径×厚度)为33cm×17cm×0.025cm。
(1)第一年区域试验
用袋栽进行区域试验，每个品种栽培350袋，共设3个重复，每个重复100袋，在室内床架上栽培，按常规方法进行管理。结果表明(表4)：攀芝1号平均每袋产鲜灵芝162.5g，较川芝6号增产13.0％。产品质量达到同类品种标准，攀芝1号子实体菌盖直径7～10cm，盖厚1.0～1.2cm，菌柄长2～4cm，菌盖为褐色，肾形，具环纹，盖厚，较结实。
表4攀芝1号的区域试验(金堂赵家)
(2)第二年区域试验
用袋栽进行区域试验，每个品种栽培350袋，共设3个重复，每个重复100袋，在室内床架上栽培，按常规方法进行管理。结果表明(表5)：攀芝1号平均每袋产鲜灵芝159.4g，比川芝6号增产12.2％。攀芝1号产品质量达到同类品种标准。子实体呈肾形，直径7～10cm，厚1.0～1.2cm，菌盖表面初期浅黄褐色成熟时赤褐色，具环状棱纹和辐射状皱纹，边缘薄而平截，背面淡黄色，菌肉黄白色；菌柄褐色，有光泽。
表5攀芝1号的区域试验(成都大邑)
攀芝1号新菌株子实体的成熟期、形态特征和产量等综合农艺性状在同一地区相同栽培环境条件下表现较为一致；在两个区域点表现出的总体效果较为一致。这表明，“攀芝1号”的遗传性状稳定并具有适应性广的特点。比对照增产幅度较大，丰产性好。具有在生产上大面积推广应用的价值。
实施例3段木生产试验
为探究攀芝1号菌种用于段木生产的栽培情况，在四川金堂、大邑等地进行了不公开段木生产试验(图6)，生产试验结果表明攀芝1号抗性强于川芝6号，污染率为5％，低于对照川芝6号。攀芝1号在金堂的产量为560kg/亩，较对照增产12.0％；攀芝1号在金堂的产量为563kg/亩，较对照增产12.5％。子实体呈肾形，直径10～15cm，厚1.0～1.2cm，菌盖表面初期浅黄褐色成熟时赤褐色，具环状棱纹和辐射状皱纹，边缘薄而平截，背面淡黄色，菌肉黄白色；菌柄褐色，有光泽。
试验结果见表6。通过段木生产试验可以看出：攀芝1号在菌丝长势，污染率上明显优于川芝6号，同时攀芝1号具有更整齐的芝体，同时具有更高的产量。在农艺性状及栽培效益上都超过了川芝6号。
表6攀芝1号生产试验
实施例4品质分析及药用成分
委托中国测试技术研究院对子实体成分含量测定的结果显示攀芝1号的氨基酸含量为干重的3.658％，蛋白质含量为干重的9.89％，多糖含量1.77％，三萜含量0.94％。(《中国药典》2015年版，多糖含量不得少于0.90％；三萜及甾醇以齐墩果酸，不得少于0.50％)。因此，攀芝1号完全符合国家药典的标准，且功效成分含量较高，具有较高的药用价值。
表7攀芝1号的成分含量测定结果
SEQUENCE LISTING
<110> 四川省农业科学院土壤肥料研究所
<120> 攀芝1号灵芝新菌株及其繁殖方法
<130> A170155K
<160> 13
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 613
<212> DNA
<213> Ganoderma lucidum
<400> 1
cgcgttcgag cttcgacgtg gatgtagctg gacttccgag gcatgtgcac gccctgctca 60
tccactctac acctgtgcac ttactgtggg cttcagattg cgaggcacgc tctttaccgg 120
gcttgcggag catatctgtg cctgcgttta tcacaaactc tataaagtaa cagaatgtgt 180
attgcgatgt aacacatcta tatacaactt tcagcaacgg atctcttggc tctcgcatcg 240
atgaagaacg cagcgaaatg cgataagtaa tgtgaattgc agaattcagt gaatcatcga 300
atctttgaac gcaccttgcg ctccttggta ttccgaggag catgcctgtt tgagtgtcat 360
gaaatcttca acctacaagc ttttgtggtt tgtaggcttg gacttggagg cttgtcggcc 420
gttatcggtc ggctcctctt aaatgcatta gcttggttcc ttgcggatcg gctctcggtg 480
tgataatgtc tacgccgcga ccgtgaagcg tttggcgagc ttctaaccgt cttataagac 540
agctttatga cctctgacct caaatcaggt aggactaccc gctgaactta agcatatcaa 600
taagcggagg aat 613
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 特异性引物ITS1
<400> 2
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 特异性引物ITS4
<400> 3
tcctccgctt attgatatgc 20
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物 ISSR807
<400> 4
agagagagag agagagt 17
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ISSR810
<400> 5
gagagagaga gagagat 17
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物 ISSR811
<400> 6
gagagagaga gagagac 17
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物 ISSR816
<400> 7
cacacacaca cacacat 17
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ACCACCACCACCACCACC
<400> 8
accaccacca ccaccacc 18
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物 ISSR866
<400> 9
ctcctcctcc tcctcctc 18
<210> 10
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物 ISSR873
<400> 10
gacagacaga cagaca 16
<210> 11
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物 ISSR878
<400> 11
ggatggatgg atggat 16
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物 E45846
<400> 12
acttccccac aggttaacac a 21
<210> 13
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物 E26637
<400> 13
agagagagag agagagg 17
Claims (6)
1.灵芝菌株Ganoderma lucidum攀芝1号，其保藏号为CGMCC No.13175。
2.如权利要求1所述的灵芝新菌株，其特征在于：灵芝菌株的ITS序列具有如SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列。
3.权利要求1或2所述灵芝菌株的繁殖方法，其特征在于：具体如下：攀芝1号的菌种扩繁生产需严格遵循无菌操作原则，母种生产用PDA培养基培养，原种和栽培种生产采用以棉籽壳、木屑为主料，麦麸为辅料组成的培养基；培养及栽培条件：菌丝生长温度15℃～38℃，出芝温度20℃～35℃。
4.如权利要求3所述的繁殖方法，其特征在于：菌丝生长温度24℃～26℃。
5.如权利要求3或4所述的繁殖方法，其特征在于：出芝温度为24℃～26℃。
6.权利要求1或2所述灵芝菌株在制备药品或者保健食品中的用途。
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