CN110607242A - 一株灵芝属菌株cz06及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株灵芝属菌株CZ06及其应用。该菌株已于2019年4月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2019258。该菌株从一株野生灵芝子实体中分离纯化而来，具有菌丝生长迅速、以菌丝体扭结力强的特性，可用于生态可降解果品包装盒的研发，应用前景良好。

Description

一株灵芝属菌株CZ06及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一株灵芝属菌株CZ06及其应用。

背景技术

我国是世界最大的水果生产和消费大国，据统计，2016年我国水果总产量达28351.1万 t，且以年均9.9％比例增加。水果产业的蓬勃发展对满足人民生活需要，促进我国经济发展起到了重要的推动作用。

在水果贮存及运输过程中，常采用聚苯乙烯塑料泡沫作为包装材料，使用结束被废弃，这些塑料包装难以被微生物降解，回收利用率低，是“白色污染”的重要来源。以苹果为例， 2016年我国苹果产量达4300万吨，运输销售中产生的废弃塑料泡沫包装约500万吨左右，造成的环境问题不可忽视。白色污染严重威胁大气、水、土安全，已成为世界范围内影响可持续发展的一大公害。近年来，环保力度越来越大，我国每年投入白色污染防治高达2万亿元。因此，亟待开发环保型果品包装盒取代传统塑料泡沫。

另一方面，我国每年可生产的农作物秸秆近7亿t，是农业生产的主要副产品。农作物秸秆含丰富的有机质及氮、磷、钾等营养成分，已应用于食用菌栽培、有机肥等产业。同时，我国有丰富的食用真菌资源，仅食用菌类的种质资源达930多种，包括丰富的灵芝种质资源，目前已经记载的灵芝属品种已达50个。我国对于灵芝的开发应用很早，但近年来开发应用力度越来越大，申报的专利数量大。查阅国家知识产权局专利公布公告网，截止2019年8 月底，国家知识产权局公布了14006件与灵芝有关的中国专利，其中3110件获得发明专利授权；与灵芝栽培有关的专利公布541件，获得发明专利授权106件；与灵芝属有关的专利公布19件，获得发明专利授权的7件。分析这些所公布的专利授权及发明授权，主要涉及品种筛选、栽培技术、功能性产物提取，绝大多数专利与灵芝提取物深加工有关。而灵芝属真菌的菌丝体具有独特的特性，在形成子实体原基前，菌丝体迅速扭结，强度迅速增加，具备了天然的粘结剂的特性。

我国是农业大国，农作物秸秆总量大但利用不充分。以农作物秸秆为原材料，筛选优良灵芝属菌株，利用其菌丝黏合能力强的特点，生产环保型果品包装盒取代传统塑料泡沫、聚苯乙烯塑料泡沫等果品包装，在解决塑料包装污染重等难题的同时，实现了农业副产物综合循环利用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：针对现有塑料泡沫水果包装难降解、污染日益严重的问题，提供了一株从野生灵芝中分离纯化得到的灵芝菌株CZ06，以及其在生态可降解果品包装盒中的应用。

本发明的技术方案为：

一株灵芝属菌株Ganoderma sp.CZ06，保藏单位：中国典型培养物保藏中心；地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内；保藏日期：2019年4月15日，保藏编号：CCTCC NO:M 2019258。

灵芝属菌株CZ06在制备生态可降解果品包装盒中的应用。

本发明从四川省成都市大邑县安仁镇采集一朵野生灵芝子实体，寄主植物为法国梧桐，将试验材料子实体采集后带回实验室分离。通过分离纯化得到真菌菌株，命名为CZ06。在 PDA培养基上培养，菌落呈辐射状生长，菌落质地为绒毛状，较为紧密，菌丝体为白色，生长中后期菌丝体产生黄至黄褐色水溶性色素并渗透至培养基内。

提取该菌株的总DNA，扩增ITS片段，所述的菌株CZ06的ITS序列如SEQ ID NO.1 所示。将所测得的ITS序列在美国国立生物信息中心(NCBI)进行比对，获得相似性较高的菌株序列，MEGA7.0软件邻接法(Neighbor-joining)构建系统发育树。用DNAMAN8.0软件进行序列相似度的计算，结果表明，菌株CZ06与四川灵芝(G.sichuanense)JQ781878和G.subamboinenseKU569546序列相似性最高仅为98.9％。据此可初步判断CZ06在分类上属于灵芝属，与现有品种存在差异的一株新品种，初步命名为Ganoderma sp.CZ06。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一株灵芝属菌株CZ06，该菌株最适培养条件为25℃，pH为7.0；母种培养基为PDA；最佳原种配方为玉米芯80％，麸皮10％，玉米粉10％；该菌株菌丝生长温度和初始生长pH范围较宽；菌丝扭结性强，以玉米芯、麸皮为原料，接种供试菌株培养7d，可生产出质量很好的生态可降解水果包装盒。该生态可降解水果包装盒洁白光滑，轻质美观，内部结构疏松多孔，透气性好，缓冲性佳，能有效防止果品运输中的损耗，使用后放置于自然环境可快速地降解，成为土壤有机质，具有培肥土壤的效果，既实现农业副产品的综合循环利用，又能有效解决塑料泡沫材料带来的环境问题，应用前景良好。

保藏信息：

灵芝属菌株Ganoderma sp.CZ06，保藏单位：中国典型培养物保藏中心；地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内；保藏日期：2019年4月15日，保藏编号： CCTCCNO:M 2019258。

附图说明

图1是灵芝属菌株CZ06在PDA培养基上的菌落形态；

图2是灵芝属菌株CZ06的ITS序列的系统发育图；

图3是生态可降解枇杷包装盒产品图；

图4是生态可降解苹果包装盒产品图。

具体实施方式

实施例1灵芝属菌株CZ06的分离、纯化和保存

野生灵芝子实体采自四川省成都市大邑县安仁镇，寄主植物为法国梧桐，将灵芝子实体采集后带回实验室分离。

制备PDA培养基：土豆200g，蔗糖20g，琼脂20g，pH自然，蒸馏水1L。

采用组织分离法对供试菌种进行分离。在无菌条件下，将采集的灵芝用消毒酒精棉进行表面消毒，无菌切取灵芝子实体组织块，移至PDA斜面培养基中，25℃培养，观察菌丝生长情况，及时挑出污染管。根据菌丝生长，挑取尖端菌丝纯化，结合镜检得到纯培养物，命名为CZ06，PDA斜面试管培养，4℃保藏。

如图1所示，本实验例的分离纯化得到的菌株CZ06在PDA平板培养5d，菌落呈辐射状生长，菌落质地为绒毛状，菌丝白色，生长中后期菌丝体产生黄至黄褐色水溶性色素并渗透至培养基内。

实施例2菌株CZ06的ITS扩增及系统发育分析

提取菌株总DNA，以总DNA为模板，用ITS4(5’-TCCTCCGCT TATTGATATGC-3’ SEQ IDNo.2)和ITS5(5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’SEQ ID No.3)为引物扩增ITS 片段，PCR反应用Bio-RADMyCyclerTM仪器。

反应体系(30μl)如表1所示：2×Mix 15μl，引物ITS4和ITS5各1μl，模板DNA1μl，超纯水补足至30μl。

PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸2min，循环30次；72℃最终延伸8min。

ITS扩增产物在1.0％的琼脂糖凝胶电泳上检测后，送到上海生工生物工程有限公司进行序列测定。所测序列结果如SEQ ID No.1。

将所得的序列结果在美国国立生物信息中心(NCBI)进行比对，选择相似性较高的菌株序列作为参比菌株，MEGA7.0软件邻接法(Neighbor-joining)构建系统发育树(图2)。用软件 DNAman6.0进行基因序列相似度的计算，发现CZ06与G.sichuanenseJQ781878和G.subamboinenseKU569546序列相似性最高，为98.9％。

根据ITS序列可初步判断CZ06为灵芝属的菌株，但与现有灵芝属标准菌株遗传差异大，同一系统发育分支的已知菌株与CZ06差异大，结合ITS序列相似性，将菌株初步鉴定为赤灵芝属的一个新种。基于以上特征，将菌株鉴定为灵芝，初步命名为Ganodermasp.CZ06。该菌株已于2019年4月15日保存在中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:M 2019258。

实施例3灵芝属菌株CZ06生长特性研究

(1)菌株生长温度范围测定：将CZ06接种于PDA固体培养基上，设15、20、25、30、 35℃等5个处理，培养7d，观测不同温度对菌丝体生长的影响，分别记载菌丝平均生长速度和菌丝生长势(表1)。

表1不同温度对菌丝生长速度的影响

注：+:菌丝稀疏、++:菌丝较浓密、+++:菌丝浓密、++++:极浓密。

表1结果表明，供试菌株的生长温度范围较宽，为15℃～35℃；以25℃时最高，生长速率为5.61±0.038mm·d^-1，其最适生长温度为25℃。

(2)菌株初始生长pH范围测定：分别调整PDA固体培养基pH为4、6、7、8、9、 10，将菌株接种于PDA固体培养基上，25℃培养7d，重复3次，测定不同pH值下菌丝的平均生长速度和菌丝生长势(表2)。

表2不同pH对菌丝生长速度的影响

注：+:菌丝稀疏、++:菌丝较浓密、+++:菌丝浓密、++++:菌丝极浓密。

结果表明，供试菌株的初始生长pH范围较宽，在pH为4.0～10.0均能生长，但pH＝4.0、 9.0和10.0生长速率慢。在pH为6.0～8.0范围菌丝长势较好，最适生长pH为7.0。

本实施例表明，尽管菌株CZ06最适生长温度为25℃，最适pH为7.0；但其适应范围较广，在25℃～35℃、pH为6.0～8.0的条件下，菌丝生长较快，长势良好；尤其能在偏碱性环境较好生长，可有效预防其他真菌污染，稳定产品质量。

实例4菌株母种培养基筛选

分别制备：

PDA培养基：去皮马铃薯20％、葡萄糖2％、琼脂2％。

PDA+酵母粉：去皮马铃薯20％、葡萄糖2％、琼脂2％、KH₂PO₄ 0.1％、MgSO₄ 0.05％、酵母粉0.1％。

PDA+蛋白胨：去皮马铃薯20％、葡萄糖2％、琼脂2％、KH₂PO₄ 0.1％、MgSO₄ 0.05％、蛋白胨0.1％。

取相同大小和菌龄的菌株CZ06接种块，接种于平板培养基中央，每个处理3次重复， 25℃培养7d。测定菌丝生长速度，观察记录菌丝长势(表3)。

表3不同培养基对菌丝生长速度的影响

注：+++:菌丝浓密、++++:菌丝极浓密。

结果表明，菌株CZ06菌丝在三种不同培养基上均能较好生长，且平均生长速率差异较小。菌丝生长速率由大到小的培养基依次为：PDA+蛋白胨>PDA>PDA+酵母粉，其中在PDA+蛋白胨和PDA上菌丝生长速率差异极小，分别为7.74±0.099mm·d^-1、7.73±0.154mm·d^-1，同时菌丝长势也最好，菌丝极浓密。

三种培养基上菌丝黄化程度依次为：PDA+蛋白胨>PDA培养基>PDA+酵母粉。其中，在PDA+蛋白胨培养基培养8d，菌丝大范围出现黄化；在PDA上培养11d后菌丝开始变黄，主要集中于接种菌块周围；在PDA+酵母粉培养基上生长13d，中部及边缘菌丝黄化，菌块周围无明显黄化。

本实施例说明，PDA培养基上菌丝生长快，生长势良好，菌丝黄化程度低，应用于产品生产中可有效缩短生产周期、改善产品外观、降低生产成本。综合考虑生产成本，，PDA 培养基为CZ06的最适母种培养基。

实例5菌株最适原种和栽培种配方筛选

以玉米芯、木屑为主料，设计了5个栽培配方(表4)。

表4不同原种和栽培种配方组成(％)

注：原料均以干重计。

木屑和玉米芯2种主要原料，按量称取各组分，玉米芯使用前用自来水浸泡10h，沥水至含水60％左右。按原料重量1％加入生石灰，充分混匀，调整培养料含水量55％-65％，pH 7～8，最后装入培养瓶，用双层报纸封口，121℃灭菌2h，灭菌后待温度降至30℃以下，按无菌操作进行接种，25℃培养20d，培养期间及时检查污染，并测定菌丝萌发时间(d)、菌丝生长势、菌丝颜色、菌丝生长速度(mm·d^-1)等，各配方重复15瓶(表5)。

表5不同原种和生产种配方筛选

注：+++:菌丝浓密、++++:菌丝极浓密。

供试菌株在5种原种培养基上均能生长，在配方5上需要的萌发时间最短(3d)，配方 5与配方2上菌丝长势最好，浓密且雪白。以配方5上菌丝生长最快，达到 6.31±0.151mm·d^-1。因此，菌株CZ06最适原种、栽培种配方组合为玉米芯80％，麸皮10％，玉米粉10％。

实例6生态可降解果品包装盒产品制备

以玉米芯为主要原料、麸皮和玉米粉为辅料，按比例玉米芯:麸皮:玉米粉＝8:1:1比例混合，调整含水量55％-60％，装袋灭菌，冷却接入CZ06生产种，25℃培养至菌丝满袋；将长好菌丝的培养料揉碎，填充入灭菌备用的水果包装模具内，塑料膜密封保湿、20-25℃培养 5～7d，待产品表面长满气生菌丝，呈浓白状态后脱模，60℃干燥得成品。产品类型及参数列于表6。

表6初产品类型及参数

从表6可看出，产品填充原料选用低密度的玉米芯、麸皮，填充时产品边角及底部填料紧实，中间疏松，在充分保证包装盒承重性的同时控制重量。培养5～7d，产品表面气生菌丝大量生长，长势浓白，即可脱模后，随后于60℃烘干成型。生产出生态可降解枇杷包装盒规格为390×300×60mm，重400g，容量为30枚；苹果包装盒规格为340×340×80mm，重500g，容量为16枚。两种生态可降解果品包装盒颜色洁白，表面光滑，外观良好。枇杷包装盒见图3，苹果包装盒见图4。

本实施例说明菌株CZ06表现出良好的生产特性，灵芝属于食药兼用的菌类，安全无毒副作用。利用菌株CZ06生产的生态可降解果品包装盒初产品具备轻质美观的优点，可一定程度替代现有聚苯乙烯塑料泡沫包装，应用前景良好。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的相关技术人员而言，任何改动和变化，只要没有脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一株灵芝属菌株CZ06及其应用

<141> 2019-10-08

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 622

<212> DNA

<213> 灵芝属(Ganoderma Karst)

<400> 1

cgtaacaagg tttccgtagg tgaacctgcg gaaggatcat tatcgagttt tgactgggtt 60

gtagctggcc ttccgaggca tgtgcacgcc ctgctcatcc actctacacc tgtgcactta 120

ctgtgggttt caaacgtcgt gaagcgggtc tctttactga gcttgtagag cggcgtctgt 180

gcctgcgttt atcacaaact ccataaagta ttagaatgtg tattgcgatg taacgcatct 240

atatacaact ttcagcaacg gatctcttgg ctctcgcatc gatgaagaac gcagcgaaat 300

gcgataagta atgtgaattg cagaattcag tgaatcatcg aatctttgaa cgcaccttgc 360

gctccttggt attccgagga gcatgcctgt ttgagtgtca tgaaatcttc aacttacaga 420

cctttgcggg tttttgtagg cttggacttg gaggcttgtc ggccgtgttt cggtcgggct 480

cctcttaaat gcattagctt gattccttgc ggatcggctc tcggtgtgat aatgtctacg 540

ccgcgaccgt gaagcgtttt ggcgagcttc taaccgtcct cgttcggaca actttatgac 600

ctctgacctc aaatcaggta ga 622

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcctccgctt attgatatgc 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggaagtaaaa gtcgtaacaa gg 22

Claims (3)

1.一株灵芝属菌株(Ganoderma sp.)CZ06，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:M 2019258。

2.根据权利要求1所述的菌株CZ06，其特征在于，所述菌株CZ06的ITS基因序列如SEQID NO.1所示。

3.权利要求1所述的菌株CZ06在制备生态可降解果品包装盒中的应用。