CN102428831A - 灵芝属赤灵芝新菌株 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株灵芝属赤灵芝(Ganoderma lucidum)的新菌株荣保灵芝1号，保藏号为CGMCC No.4873。荣保灵芝1号子实体形状好、菌盖较厚、菌柄长度适中，灵芝子实体和灵芝孢子粉产量高，可用于灵芝子实体和灵芝孢子粉的生产，具有良好的应用前景。

Description

灵芝属赤灵芝新菌株

技术领域

本发明涉及食药用菌新品种及其应用领域，尤其涉及一个灵芝新品种——荣保灵芝1号。 

背景技术

灵芝是我国传统的蕈菌珍品，享有″仙草″美誉。《神农本草经》和《本草纲目》即已对灵芝的药效及功能进行了详细记载。灵芝作为药用真菌已正式被国家药典收载，亦是国家批准的新资源食品，可药食两用。 

现代医学研究表明，灵芝药理成分十分丰富，其有效成份达10余类，包括灵芝多糖、多肽、三萜类、氨基酸、甾类、香豆精苷、生物碱、有机酸(主含延胡索酸)等。灵芝具有调节和增强人体免疫力，降血脂血糖、保肝，抑制肥胖和动脉硬化，阻止胆固醇吸收等功能，对神经衰弱、冠心病、高血压、慢性支气管炎、糖尿病和肿瘤等有良好的预防和治疗作用，兼具抗疲劳、美容养颜、延缓衰老等功效。 

近十多年来，全球的灵芝产业发展极为迅速。据统计，1999年全球灵芝产品年产值超过16亿美元，2000年即超过20亿美元。而且，全球灵芝市场利润和灵芝消费量逐年上升，据估计每年销售量以20％左右的比例增长。目前，我国已开发出系列灵芝产品，包括灵芝切片、超微粉、灵芝茶、破壁灵芝孢子粉胶囊、灵芝孢子油胶囊等，因其具有良好保健效果而深受消费者喜爱，市场需求也越来越大。 

进入本世纪以来，我国大力推进中药材产业的现代化，制定了中药现代化中长期发展纲要(2002年至2010年)。由于灵芝等药用真菌的独特疗效与保健作用，在中药现代化建设中担当着重要的角色。长春中医药大学从松杉灵芝中开发出了国家二类抗肿瘤新药“松百泰”注射剂，已由长白山制药有限公司量产投放市场。因此，加强拥有自主知识产权药用真菌资源的开发，为进一步研制新型抗肿瘤、延衰老药物提供微生物种质资 源，既是发展现代中医药产业的重要内容，也是保护我国丰富的药用真菌资源重要举措。 

我国的灵芝种质资源丰富，目前已经记载的灵芝属品种已达50个，从中发现了具有抗肿瘤活性物质的松杉灵芝，开发出了新药“松百泰”注射剂。另一方面，尽管我国灵芝的栽培规模和产量都很大，但普遍存在着基础研究薄弱，灵芝的品质稳定性和一致性较差，品种退化严重等缺点，我国常见的灵芝栽培品种仅十余个品种，主要有包括赤芝、京大灵芝、山东灵芝、密纹薄芝、信洲灵芝、紫灵芝、川芝6号等，为了满足生产需要，我国还引进了韩国灵芝、美国灵芝和日本灵芝等优良灵芝品种。因而，不断发掘我国丰富的灵芝种质资源，加大独特灵芝种质资源的筛选与驯化，是一项重要而紧迫的工作。 

发明内容

本发明的目的是提供一个灵芝属赤灵芝(Ganoderma lucidum)新品种——荣保灵芝1号，用于生产灵芝子实体、孢子粉，以及灵芝子实体浸提物生产相关产品。 

本发明的菌株是2005年从四川省广元市苍溪县白山乡青龙村青冈树林枯枝堆收集到的2株野生灵芝子实体经驯化培育而成，属于灵芝属的一个新品种，该品种已于2011年5月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中科院微生物研究所，邮编：100101)，分类地位为灵芝属赤灵芝(Ganoderma lucidum)种，保藏编号为CGMCC No.4873。 

采用采用PDA斜面培养基从野生灵芝子实体分离获得，25-28℃培养，每天检查菌丝生长情况，及时剔出被污染的试管，最终获得纯菌丝，在测定菌株的生理生化特性，农艺性状后，将其命名为荣保灵芝1号。菌丝长满管后，4℃冰箱保存。 

经培养观察，荣保灵芝1号菌丝初期白色，后期中心淡黄色，长势浓密(图1)，有锁状联合，菌丝直径2.2±0.6μm。子实体菌柄长2.3-5.2cm，深褐色，菌盖半圆形或肾形，初期金黄色，后期褐色(图2)，菌盖表面有环状棱纹，大小约8.9-13.2×14.9-21.1cm；菌褶褐色，表面为米黄色膜状物，密布小孔。荣保灵芝1号的孢子呈褐色，卵圆形，表面刺突(图3)，大小8.07×4.96μm；孢子粉印圆形散布于灵芝子实体周 围。 

荣保灵芝1号的菌丝生长温度范围15-35℃，最适生长温度为25-30℃，10℃、40℃不生长。出芝温度24-34℃，最佳出芝温度26-30℃。菌丝生长pH范围4-9，最适宜pH5-7。原种和栽培种培养料的pH保持自然(pH6.5左右)。不需变温结实，子实体菌盖分化期间，环境温度应高于25℃，温差5-10℃有利于菌盖分化。孢子粉弹射温度26-35℃，最佳弹射温度28-32℃。菌丝体生长不需光线，子实体分化需3200-5000lx散射光，有利于子实体形成和分化。栽培过程中，培养料含水量60％-65％为宜，环境湿度65％左右；原基分化及出芝阶段，环境湿度保持在85％-90％之间；孢子粉弹射期间，环境湿度宜保持在75％左右。菌丝体生长和子实体发育阶段均需要足够的氧气，环境CO₂浓度在600-800ppm为宜。 

自然条件下，菌丝体35-40天满袋；3-5天完成菌柄伸长，菌盖分化持续15-18天，孢子粉弹射持续时间15-20天；至第一潮灵芝采收，生育期约63天左右；转潮时间10天左右。子实体生物学转化率为9％-12％(干芝/干料)，孢子粉产量为0.8％-0.9％(干料)。 

采用RAPD分析技术(图4)，从14个随机引物中筛选出适合揭示供试灵芝遗传差异的RAPD分析引物OPC20和OPF9。对荣保灵芝1号、川农灵芝1号、川芝6号、南韩赤灵芝和紫芝进行了RAPD分析，其结果表明，荣保灵芝1号不同于其他供试灵芝品种。 

进而对荣保灵芝1号菌株的ITS序列进行了分析，其ITS序列长度为655bp(序列表)，从GenBank中查得，荣保灵芝1号的ITS序列与数据库中相关赤芝(Ganoderma Lucidum)菌株的ITS序列相似性最高，其分类地位应为灵芝属的赤灵芝，但不同于已经报道的国内其他灵芝品种(图5)，从而确定荣保灵芝1号是赤灵芝中的一个新品种。 

荣保灵芝1号的特点是菌柄长度适中，有利于采用覆膜收集孢子粉；其孢子粉产量和灵芝子实体产量均较高。 

附图说明

图1是荣保灵芝1号菌丝斜面； 

图2是荣保灵芝1号子实体； 

图3是荣保灵芝1号孢子形态(1500×)； 

图4是供试灵芝菌株RAPD指纹图谱(4A：引物OPC20，4B：引物OPF9；图中，M：分子量标准，1.川芝6号，2.川农灵芝1号，3.南韩赤灵芝，4.紫芝，5.荣保灵芝1号)； 

图5是荣保灵芝1号ITS系统发育； 

具体实施方式

实施例1 

荣保灵芝1号品种的分离驯化 

本发明的菌株是从四川省广元市苍溪县白山乡青龙村青冈树林枯枝堆收集到的2株野生灵芝子实体经驯化培育而成，命名为荣保灵芝1号。纯菌丝PDA斜面培养基培养满管后，4℃冰箱保存备用。 

分离驯化过程如下，将采集的野生灵芝子实体整理干净，用75％的酒精进行表面消毒，撕开灵芝子实体，用无菌解剖刀切取黄豆粒大小子实体菌肉部分，无菌操作置于PDA斜面培养基，25-28℃培养，每天检查菌丝生长情况，及时剔出被污染的试管，最终获得纯菌丝。进一步测定灵芝菌丝的生理生化特性，包括碳氮源利用、生长温度范围、最适pH范围，农艺性状测定包括母种、原种、栽培种培养料配方探讨，菌丝长势、出芝温度范围，灵芝子实体形状、产量、孢子粉产量等。 

经培养观察，荣保灵芝1号菌丝初期白色，后期中心淡黄色，长势浓密(图1)，有锁状联合，菌丝直径2.2±0.6μm。子实体菌柄长2.3-5.2cm，深褐色，菌盖半圆形或肾形，初期金黄色，后期褐色(图2)，菌盖表面有环状棱纹，大小约8.9-13.2×14.9-21.1cm；菌褶褐色，表面为米黄色膜状物，密布小孔。荣保灵芝1号的孢子呈褐色，卵圆形，表面刺突(图3)，大小8.07×4.96μm；孢子粉印圆形散布于灵芝子实体周围。 

经鉴定，荣保灵芝1号属于灵芝属的一个新品种，于2011年5月16日保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类地位为灵芝属赤灵芝(Ganoderma lucidum)种，保藏编号为CGMCC No.4873。 

实施例2 

荣保灵芝1号的生物学特性研究 

测定了荣保灵芝1号生长温度范围、生长初始pH范围、在不同母种培养基和原种培养基中的生长情况等生物学特性。 

(1)生长温度范围 

供试菌株接种于PDA斜面培养基中，置于10℃、15、20、25、30、35和40℃培养箱培养，每天观察并记录菌丝生长情况。 

实验结果表明，荣保灵芝1号菌丝生长温度范围较宽，在15-35℃范围均可生长(表1)，其最适生长温度为25-30℃，在该温度范围，灵芝菌丝长势和密度最好，生长速度为分别达0.94-1.26cm/d。在温度为10℃、40℃的环境中，菌丝不生长。 

表1荣保灵芝1号的生长温度范围 

注：+++菌丝稠密，长势旺；++菌丝较稠密，长势较好；+菌丝稀疏，长势弱；-不生长 

(2)生长pH范围 

分别测定了供试菌株在初始pH4、5、6、7、8和pH9条件下的生长情况。 

研究结果表明，荣保灵芝1号菌丝的pH适应范围较宽(表2)，在pH4-9的范围内 均可以生长，最适宜pH范围为pH5-7。在pH5、6、7的PDA培养基中，菌丝长势好、密度大，生长快，其平均生长速度为1.19-1.38cm/d。 

表2荣保灵芝1号在不同pH中的生长情况 

注：+++菌丝稠密，长势旺；++菌丝较稠密，长势较好；+菌丝稀疏，长势弱；-不生长 

(3)培养基配方 

①母种培养基 

分别测定了供试菌株在PDA和加富PDA上的长势，常规方法接种，25℃培养，观察菌丝生长情况。在PDA中分别添加0.5％磷酸氢二钾和硫酸镁制成加富PDA培养基。 

表2荣保灵芝1号在两种培养基中的生长情况 

注：+++菌丝稠密，长势旺。 

②原种和栽培种培养基 

根据表3中的比例称取原料，按料∶水＝1.2∶1添加水分，将主辅料充分混匀，最后调整培养料含水量65％左右，pH自然，分装于750ml蘑菇瓶，培养料装至瓶肩，注意松紧适中，双层牛皮纸封口。121℃灭菌2h，冷却后接种，25℃培养。分别于不同时间观察菌丝生长情况(表3)。 

表3荣保灵芝1号原种和栽培种培养基配方(％) 

表4数据为荣保灵芝1号在不同配方中的生长情况，可以看出，荣保灵芝1号在5种培养基上均能生长，但其长势存在明显差异。从菌丝生长浓密程度看，配方1、2＞配方3、4；从菌丝长势来看，荣保灵芝1号在配方2培养料中的长势最佳，19天满瓶，配方1、4次之，满瓶时间分别为22和25天，配方3的菌丝长势较弱，满瓶时间较长，为29天。 

表4不同配方中荣保灵芝1号的生长情况 

根据上述结果，本研究筛选出了适合荣保灵芝1号原种和栽培种的配方2个，分别为配方1：杂木屑75％，麦麸23％，过磷酸钙1％，石膏1％，pH自然，含水量65％；配方2：杂木屑73％，麦麸20％，玉米粉5％，过磷酸钙1％，石膏1％自然pH，含水量65％。 

实施例3 

荣保灵芝1号遗传学特性及菌种鉴定 

本实施例以荣保灵芝1号、川农灵芝1号和引进的常见栽培品种川芝6号、南韩赤灵芝、紫芝为研究材料，采用RAPD和ITS序列分析菌株的遗传特性。 

RAPD分析中，从14个随机引物中筛选出适合揭示供试灵芝遗传差异的RAPD分析引物OPC20和OPF9。研究结果显示，荣保灵芝1号与其它供试菌株存在明显的遗传差异。对荣保灵芝1号菌株的ITS序列进行了分析，其ITS序列长度为655bp，从GenBank中查得，荣保灵芝1号的ITS序列与数据库中相关赤芝(Ganoderma Lucidum)菌株的ITS序列相似性最高。对从GenBank中查得灵芝属相近种的ITS序列，应用MEGA4.0构建出了供试菌株的系统发育树(参见图5)。 

实施例4 

荣保灵芝1号栽培规范技术 

(1)菌种准备 

按原种和栽培种配方配制好培养料，调整水分含量65％左右，装瓶灭菌，冷却至室温接种供试菌株，每支母种斜面培养基接种5瓶原种，每瓶原种培养基接种25-30瓶栽培种，25℃培养35天左右至满瓶，其间及时挑出被污染菌种。 

(2)栽培季节确定 

根据荣保灵芝1号的理化特性，其适宜的栽培季节为夏季栽培，制袋时间为3月下旬，发菌40-45天左右菌丝可长满菌袋，5月中下旬开始覆土出菇。也可根据气温变化确定接种时间，通常，灵芝菌袋下地覆土时，地温应稳定地高于25℃，持续时间在1周左右，由此向前推40-45天准备培养袋。 

(3)栽培袋的制备 

灵芝大生产栽培配方为：杂木屑78％，麸皮20％，石膏1％，玉米粉2％。 

按配方称取杂木屑，按料∶水＝1.2～1.4∶1加水，堆置12小时，使培养料均匀吸水，装袋前3-4小时添加麸皮、石膏和玉米粉，充分混匀，期间翻料2次，调整含水量60％～65％，pH自然。 

培养料配制完成后，应及时装袋。栽培袋采用规格为17cm×53cm×0.005cm的 聚乙烯菌袋，装袋机装料，每袋装干料0.85-1.1kg，湿重为1.8-2.2kg。装袋完毕，将袋口清理干净并用棉绳扎紧。 

采用常压蒸汽灭菌，每灶装5000袋左右，旺火灭菌，快速升温至100℃左右，维持1天，熄火后焖12小时。灭菌结束后，待灶内温度自然降至50-60℃时，将菌袋搬到冷却室，待料温降至室温，用手摸无热感时即可接种。 

(4)接种发菌 

接种发菌采用开放式“打孔接种、二次套袋”技术。将开放式接种室用气雾消毒剂消毒3h左右，接种前将打孔棒用酒精燃烧消毒、接种者双手用70％-75％消毒。接种时，先将菌袋表面用70％-75％处理，随即用打孔棒均匀打孔，共打四个接种穴，其中一穴尽可能靠近扎袋口。接种孔直径1.5cm左右，深2cm～2.5cm。打穴与接种快速配合，打一穴，接一穴。接种完毕，立即交由另一人用17cm×58cm×0.002cm的聚乙烯塑料套袋封口。 

(5)培菌管理 

接种后的菌袋随即进入培菌管理，初期菌袋密集排列，待菌丝萌发后，堆温逐渐升高时及时翻袋，此时将菌袋摆放成井字形，以利通风控温，翻堆期间及时将污染袋剔除。待菌丝长满接种口5cm左右时，即可脱去套袋，以增加通氧量，促进菌丝生长。培菌期间，控制温度25～28℃，培菌35-40天后，菌丝即可长满菌袋，此时进入出芝阶段。 

(6)脱袋及覆土 

在出芝大棚挖宽1.4m，深20cm的沟槽，调节土壤含水量60％。用美工刀划袋，脱去料袋，将袋放入沟槽中，间距2-3cm，袋缝填土，轻压实，放满后检查覆土，使袋面和覆土面基本成一个平面，保湿，每天在棚内最高温度时开大棚侧面通风，直至小原基出土，分化形成芝盖。 

(7)出芝管理 

出芝大棚内控光七荫三阳，控温25-28℃，控制棚内相对湿度在85％-90％，满足灵芝菌盖扩展的需要。每天通气，防止发生畸形芝。 

(8)孢子粉采集 

待灵芝菌盖边沿的金黄色生长圈消失，停止喷水，用0.005cm聚丙烯薄膜置于灵芝子实体基部，控制空气湿度70％-75％，采集孢子粉；孢子粉弹射15-20天后，即可收获灵芝子实体和孢子粉，进入第二潮灵芝子实体出芝管理，气候适宜，通常可收2-3潮灵芝子实体和孢子粉。 

应当理解的是，对本领域技术人员而言，可以适当改进，如改变灵芝栽培配方及其他原料的适当改变等，所有这些改变都应属于本发明所附权利要求的保护范围。 

Claims (1)

1.灵芝属赤灵芝(Ganoderma lucidum)新菌株荣保灵芝1号，保藏号为CGMCC No.4873。

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