CN115340953A - 一种灵芝新菌株的高效筛选方法 - Google Patents

一种灵芝新菌株的高效筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于灵芝育种选种技术领域，具体涉及一种灵芝新菌株的高效筛选方法。针对现有技术中快速筛选灵芝新菌株的困难，本发明提供的筛选方法以灵芝的菌盖外观、产量和化学成分含量为指标筛选灵芝新菌株，所述化学成分为多糖和三萜及甾醇。本发明即保证了对灵芝菌株评价的全面、系统和准确，又最大程度上减少了工作量，能够有效、全面和快速地对高品质的灵芝菌株进行筛选，适宜于大批量的灵芝菌株筛选工作，具有很好的应用前景。

Description

一种灵芝新菌株的高效筛选方法
技术领域
本发明属于灵芝育种选种技术领域，具体涉及一种灵芝新菌株的高效筛选方法。
背景技术
灵芝[Ganodermalucidum(Curbs:Fr.)P.Karst]已在中国、韩国、日本等多地有多年的使用历史，是最著名的药用菌之一。近几十年来，灵芝的生物学和药理学研究主要集中在从灵芝子实体中提取的生物活性物质，包括多糖、三萜及甾醇、甾醇、蛋白质和多肽等。多糖和三萜及甾醇在灵芝中含量丰富，具有多种生物活性，包括抗氧化、抗疲劳、抗衰、抗肿瘤(抗癌)、抗炎、免疫调节、降血糖以及降血脂活性。
此外灵芝目前已被纳入可用于保健食品的真菌菌种名单，化妆品原料目录和“药食同源”生产经营试点中药材，可将其用作普通食品原料、药品原料、保健食品原料、化妆品原料等途径使用。所以现今选育灵芝新品种不只要求灵芝满足其药品属性，更多的应该是考虑市场的需求。例如针对食用菌品种，国家标准(GB/T 21125-2007)对食用菌品种的一致性、稳定性等标准进行了要求。然而，一致性和稳定性均需要较长时间和较大规模的实验栽培和调查分析，实验和调查周期较长，不利于新菌株的筛选过程的高效进行。
为了缩短育种过程中的筛选的实验和调查周期，现有技术中，快速筛选优质灵芝新菌株时一般会通过比较菌株的菌丝长势(菌丝生长速度、菌丝生长势)、产量、子实体大小(菌盖大小，菌柄大小)有效成分(多糖含量、三萜及甾醇含量)其中的一个或几个指标通过简单评价法来进行筛选：如王磊等(食用菌学报，2008.15(4)：53-56)通过比较灵芝菌株的菌丝生长速度、菌丝体生物量和多糖含量来筛选优势菌株；班立桐等(天津农学院学报，2006.13(1)：17-19)通过比较灵芝子实体转化率、孢子粉多糖含量来筛选优良菌株。然而通过简单评价来筛选灵芝新菌株，缺少系统化评判(中国中药杂志，2015,40(3)：7-12)。然而，这些方法都是针对单一指标进行简单地对比筛选，无法系统性地体现灵芝菌株的品种质量。然而，由于能够评价灵芝菌株的各种指标较多，加之新菌株的培育和筛选过程是一个需要大量重复劳动的工作，从工作量上来讲，在筛选菌株时对灵芝菌株的各种指标进行全面的测试和评价是不经济、不现实的。
发明内容
针对现有技术中快速筛选灵芝新菌株的困难，本发明提供一种灵芝新菌株的高效筛选方法。其目的在于：通过选择获取容易的参数，系统化地体现出灵芝菌株的品质，从而实现对灵芝新菌株的快速、全面的评价。
一种灵芝新菌株的高效筛选方法，以灵芝的菌盖体积、产量和化学成分含量为指标筛选灵芝新菌株，所述化学成分为多糖和三萜及甾醇。
优选的，所述灵芝为Ganodermalucidum(Curbs:Fr.)P.Karst。
优选的，所述菌盖外观通过菌盖体积评价。
优选的，具体包括如下步骤：
(1)取需要筛选的所有品种的灵芝菌株，计算每一种灵芝菌株的菌盖体积、产量和化学成分含量三种指标；
(2)以计算结果中三种指标的最大值作为基准，对三种指标进行归一化处理；
(3)利用三角面积法，将步骤(2)得到的每一种灵芝菌株的三种指标转化为三角形面积；
(4)以计算结果中三角形面积的最大值为基准，对三角形面积进行归一化处理，得到灵芝菌株的品质综合评分。
优选的，步骤(1)中，所述菌盖体积的计算方法为：测试灵芝菌盖的直径和厚度，将所述菌盖视为圆柱体计算其体积。
优选的，步骤(1)中，所述菌盖体积Ei的计算公式如下：
Figure BDA0003066938120000021
其中，Di为菌盖的直径，Ti为菌盖的厚度。
优选的，步骤(1)中，所述产量的计算方法为：计算培养产出子实体的干重与培养料的干重之间的比值。
优选的，步骤(1)中，化学成分含量的计算方法为：测定灵芝中多糖和/或三萜及甾醇的含量。
优选的，步骤(3)中，所述三角形面积的计算公式为：
Figure BDA0003066938120000022
其中，S为三角形面积，a,b,c分别为三角形的三条边长，R为三条边长的平均数；
所述三条边长通过如下公式计算得到：
Figure BDA0003066938120000031
Figure BDA0003066938120000032
Figure BDA0003066938120000033
其中，E为归一化后的菌盖体积，Y为归一化后的产量，C为归一化后的化学成分含量；
E的计算方法为：E＝Ei/Emax，其中，Ei为菌盖体积，Emax为步骤(1)所述的所有品种的灵芝菌株的菌盖体积的最大值；
Y的计算方法为：Y＝Yi/Ymax，其中，Yi为产量，Ymax为步骤(1)所述的所有品种的灵芝菌株的产量的最大值；
C的计算方法为：C＝Ci/Cmax，其中，Ci为化学成分含量，Cmax为步骤(1)所述的所有品种的灵芝菌株的化学成分含量的最大值。
优选的，步骤(4)中，所述品质综合评分的计算方法为：
F＝Si/Smax；
其中，F为品质综合评分，Si为三角形面积，Smax为步骤(3)中计算得到的所述所有品种的灵芝菌株的三角形面积的最大值。
本研究在灵芝新品种系统选育过程中，改变了灵芝菌株比较试验使用单一指标比较的方式，而是以较少数量的指标为依据(菌盖体积、产量和化学成分含量)，采用三角形面积法将试验基础数据结果综合纳入分析，最后快速地、高效地和全面地筛选出综合品质较好的灵芝育种新菌株。即保证了对灵芝菌株评价的全面、系统和准确，又最大程度上减少了工作量，适宜于大批量的灵芝菌株筛选工作。后续以此为基础筛选灵芝新材料，能更全面、更有效的评价控制和保证灵芝的品质，有较好的参考价值。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为实施例1中灵芝菌株的品质综合评分结果。
具体实施方式
实施例1
本实施例对69株不同品种的灵芝菌株进行筛选，具体步骤如下：
1、菌盖外观考察
灵芝子实体的菌盖直径和厚度能直观的描述灵芝的外观性状是否优异，因此本次选取菌盖直径与和厚度为外观性状的指标。
指标测定方法：菌盖直径(Di)：用直尺测量灵芝菌盖的最大直径长度，单位cm；菌盖厚度(Ti)：用游标卡尺测量菌盖横径与纵径焦点处的厚度，单位cm；以上指标均是对多个部位进行测量后取平均值的结果。
外观性状计算：69株灵芝菌株的菌盖直径和菌盖厚度结果见表1。由结果可知不同菌株存在不同的差异，将灵芝菌盖看做一个近似的圆柱体，其外观性状Ei的计算公式(1)如下：
Figure BDA0003066938120000041
2、产量考察
绝对生物转化率是指培养产出子实体的总重量(干重)与培养料的干重之间的比值，比值越高，产量就越高，因此本次选取绝对生物转化率作为产量考察的指标。
产量测定方法：记录灵芝第一潮子实体的总重量(干重)和菌袋的干料重。
产量计算：绝对生物转化率Yi＝子实体干重kg/干料的重量kg。69株灵芝菌株的绝对生物转化率结果见表1。
3、化学成分考察
研究表明灵芝含有多种生物活性成分，如多糖类、三萜及甾醇类、多肽类和核苷类等，其中灵芝多糖和三萜及甾醇类化合物是灵芝中含量丰富且最重要的有效成分，其含量越高，灵芝药效越好，因此本次选取多糖含量和三萜及甾醇含量为化学成分考察的指标。
测定方法：灵芝子实体中三萜及甾醇和多糖含量的测定，参照《中国药典》(2015年版)中灵芝项下的测定方法测定。
化学成分含量计算：69株灵芝菌株的三萜及甾醇含量和多糖含量结果见表1。本发明可将测得的三萜及甾醇含量和多糖含量中的一种或两种的总含量作为化学成分含量Ci，本实施例以两种成分的总含量作为Ci。结果如表1所示。
表1 69株灵芝菌株相关指标测定结果
Figure BDA0003066938120000042
Figure BDA0003066938120000051
Figure BDA0003066938120000061
4、数据归一化处理及品质综合评分的计算
计算方法：由于菌盖外观、产量、化学成分含量的性质各不相同，通常有不同的量纲和数量级，为了避免此类影响，对指标数据进行归一化处理，将各指标数据用比值法转化成零到一之间的无量纲的纯数值，将消除量纲后不同灵芝菌株的性状、化学、产量评价结果数据进行集成处理转化为3个层面的数据，采用三角形面积法得到不同灵芝菌株样品的品质内涵(三角形面积数值)。当三个层面数据均为1时，该三角形面积最大，利用各样本得的三角形面积除以最大三角形面积，即得品质综合得分。
所述三角形面积的计算公式为：
Figure BDA0003066938120000071
其中，S为三角形面积，a,b,c分别为三角形的三条边长，R为三条边长的平均数；
所述三条边长通过如下公式计算得到：
Figure BDA0003066938120000072
Figure BDA0003066938120000073
Figure BDA0003066938120000074
其中，E为归一化后的菌盖体积，Y为归一化后的产量，C为归一化后的化学成分含量；
E的计算方法为：E＝Ei/Emax，其中，Ei为菌盖体积，Emax为所有品种的灵芝菌株的菌盖体积的最大值；
Y的计算方法为：Y＝Yi/Ymax，其中，Yi为产量，Ymax为所有品种的灵芝菌株的产量的最大值；
C的计算方法为：C＝Ci/Cmax，其中，Ci为化学成分含量，Cmax为所有品种的灵芝菌株的化学成分含量的最大值。
优选的，步骤(4)中，所述品质综合评分的计算方法为：
F＝Si/Smax；
其中，F为品质综合评分，Si为三角形面积，Smax为计算得到的所述所有品种的灵芝菌株的三角形面积的最大值。
本实施例中69株菌株的品质综合评分的指标和结果如图1和表2所示：
表2 灵芝菌株品质综合评分结果
Figure BDA0003066938120000075
Figure BDA0003066938120000081
Figure BDA0003066938120000091
从上述品质综合评分结果可见，三角形面积法计算结果可以看出GL23最大，其次依次是GL103、GL124、GL136、GL105，其综合得分依次为1.000、0.913、0.913、0.896、0.890，即这五株灵芝新菌株的综合品质较高，可以进入下一步综合品质优异的灵芝新材料筛选试验。
由这五株灵芝新菌株的相关指标测定结果可以看出其外观大小、产量和化学成分与其他菌株作单一指标比较时，其各项指标都处于比较靠前的位置，这也从侧面说明通过三角形面积法得出的综合评定结果是比较可靠的。
对比例1
选择产量、菌株生长周期、有效成分(多糖)进行三角形面积法的高多糖灵芝菌株筛选。
所述三角形面积的计算公式为：
Figure BDA0003066938120000101
其中，S为三角形面积，a,b,c分别为三角形的三条边长，R为三条边长的平均数；
所述三条边长通过如下公式计算得到：
Figure BDA0003066938120000102
Figure BDA0003066938120000103
Figure BDA0003066938120000104
其中，E为归一化后的生长周期，Y为归一化后的产量，C为归一化后的化学成分含量；
E的计算方法为：E＝1-Ei/Emax，其中，Ei为菌株生长周期，Emax为所有品种的灵芝菌株的生长周期的最大值；注：生长周期应该越短越好，所以归一化的方法与其他参数指标有所差别。
Y的计算方法为：Y＝Yi/Ymax，其中，Yi为产量，Ymax为所有品种的灵芝菌株的产量的最大值；
C的计算方法为：C＝Ci/Cmax，其中，Ci为多糖成分含量，Cmax为所有品种的灵芝菌株的多糖成分含量的最大值。
优选的，步骤(4)中，所述品质综合评分的计算方法为：
F＝Si/Smax；
其中，F为综合评分，Si为三角形面积，Smax为计算得到的所述所有品种的灵芝菌株的三角形面积的最大值。
表3 高多糖灵芝菌株评分结果
Figure BDA0003066938120000111
Figure BDA0003066938120000121
Figure BDA0003066938120000131
从上述品质综合评分结果可见，三角形面积法计算结果可以看出GL1最大，其次依次是GL44、GL165、GL184、GL23，其综合得分依次为1.000、0.840、0.744、0.733、0.723，即这五株灵芝新菌株的综合评分较高，可以进入下一步高多糖灵芝新材料筛选试验。
对比例2
选择产量、菌株生长周期、有效成分(三萜及甾醇)进行三角形面积法的高三萜灵芝菌株筛选。
所述三角形面积的计算公式为：
Figure BDA0003066938120000132
其中，S为三角形面积，a,b,c分别为三角形的三条边长，R为三条边长的平均数；
所述三条边长通过如下公式计算得到：
Figure BDA0003066938120000133
Figure BDA0003066938120000134
Figure BDA0003066938120000135
其中，E为归一化后的生长周期，Y为归一化后的产量，C为归一化后的化学成分含量；
E的计算方法为：E＝1-Ei/Emax，其中，Ei为菌株生长周期，Emax为所有品种的灵芝菌株的生长周期的最大值；注：生长周期应该越短越好，所以归一化的方法稍微有点差别。
Y的计算方法为：Y＝Yi/Ymax，其中，Yi为产量，Ymax为所有品种的灵芝菌株的产量的最大值；
C的计算方法为：C＝Ci/Cmax，其中，Ci为三萜及甾醇成分含量，Cmax为所有品种的灵芝菌株的三萜及甾醇成分含量的最大值。
优选的，步骤(4)中，所述品质综合评分的计算方法为：
F＝Si/Smax；
其中，F为综合评分，Si为三角形面积，Smax为计算得到的所述所有品种的灵芝菌株的三角形面积的最大值。
表4 高三萜灵芝菌株评分结果
Figure BDA0003066938120000141
Figure BDA0003066938120000151
Figure BDA0003066938120000161
从上述品质综合评分结果可见，三角形面积法计算结果可以看出GL126最大，其次依次是GL130、GL136、GL23、GL134，其综合得分依次为1.000、0.886、0.867、0.813、0.804，即这五株灵芝新菌株的综合评分较高，可以进入下一步高三萜灵芝新材料筛选试验。
对比实施例1、对比例1和对比例2筛选出来的较优的几株灵芝的所有指标：
表5 实施例1筛选综合品质优的灵芝菌株
Figure BDA0003066938120000162
表6 对比例1筛选出的高多糖灵芝菌株
Figure BDA0003066938120000163
表7 对比例2筛选出的高三萜灵芝菌株
Figure BDA0003066938120000164
Figure BDA0003066938120000171
从表5-表7可以看出,实施例1选择菌盖外观、产量和化学成分含量三种指标进行筛选后，筛选出来的较优菌株的菌盖直径、菌盖厚度、绝对生物转化率、多糖含量、三萜及甾醇含量和生长周期等指标都较为优异，这说明本申请选择的三种指标能够从整体上反映菌株的品质。而对比例1和对比例2中选择另外三种指标，筛选出来的菌株可能出现部分指标较差的情况，例如：对比例1中评分最高的GL1的菌盖直径、菌盖厚度、绝对生物转化率和三萜及甾醇含量的指标较差，对比例2中评分最高的GL126的菌盖厚度、多糖含量和生长周期的指标较差。这说明对比例1和对比例2中选择的三种指标不能够从整体上反映出菌株的品质。
综上所述，本发明即保证了对灵芝菌株评价的全面、系统和准确，又最大程度上减少了工作量，适宜于大批量的灵芝菌株筛选工作，具有很好的应用前景。

Claims (10)

1.一种灵芝新菌株的高效筛选方法，其特征在于：以灵芝的菌盖外观、产量和化学成分含量为指标筛选灵芝新菌株，所述化学成分为多糖和三萜及甾醇。
2.按照权利要求1所述的筛选方法，其特征在于：所述灵芝为Ganodermalucidum(Curbs:Fr.)P.Karst。
3.按照权利要求1所述的筛选方法，其特征在于：所述菌盖外观通过菌盖体积评价。
4.按照权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)取需要筛选的所有品种的灵芝菌株，计算每一种灵芝菌株的菌盖体积、产量和化学成分含量三种指标；
(2)以计算结果中三种指标的最大值作为基准，对三种指标进行归一化处理；
(3)利用三角面积法，将步骤(2)得到的每一种灵芝菌株的三种指标转化为三角形面积；
(4)以计算结果中三角形面积的最大值为基准，对三角形面积进行归一化处理，得到灵芝菌株的品质综合评分。
5.按照权利要求4所述的筛选方法，其特征在于：步骤(1)中，所述菌盖体积的计算方法为：测试灵芝菌盖的直径和厚度，将所述菌盖视为圆柱体计算其体积。
6.按照权利要求5所述的筛选方法，其特征在于：步骤(1)中，所述菌盖体积Ei的计算公式如下：
Figure FDA0003066938110000011
其中，Di为菌盖的直径，Ti为菌盖的厚度。
7.按照权利要求4所述的筛选方法，其特征在于：步骤(1)中，所述产量的计算方法为：计算培养产出子实体的干重与培养料的干重之间的比值。
8.按照权利要求4所述的筛选方法，其特征在于：步骤(1)中，化学成分含量的计算方法为：测定灵芝中多糖和/或三萜及甾醇的含量。
9.按照权利要求4所述的筛选方法，其特征在于：步骤(3)中，所述三角形面积的计算公式为：
Figure FDA0003066938110000012
其中，S为三角形面积，a,b,c分别为三角形的三条边长，R为三条边长的平均数；
所述三条边长通过如下公式计算得到：
Figure FDA0003066938110000021
Figure FDA0003066938110000022
Figure FDA0003066938110000023
其中，E为归一化后的菌盖体积，Y为归一化后的产量，C为归一化后的化学成分含量；
E的计算方法为：E＝Ei/Emax，其中，Ei为菌盖体积，Emax为步骤(1)所述的所有品种的灵芝菌株的菌盖体积的最大值；
Y的计算方法为：Y＝Yi/Ymax，其中，Yi为产量，Ymax为步骤(1)所述的所有品种的灵芝菌株的产量的最大值；
C的计算方法为：C＝Ci/Cmax，其中，Ci为化学成分含量，Cmax为步骤(1)所述的所有品种的灵芝菌株的化学成分含量的最大值。
10.按照权利要求9所述的筛选方法，其特征在于：步骤(4)中，所述品质综合评分的计算方法为：
F＝Si/Smax；
其中，F为品质综合评分，Si为三角形面积，Smax为步骤(3)中计算得到的所述所有品种的灵芝菌株的三角形面积的最大值。
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