CN105385745A - 一种灵芝酸提取及分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种灵芝酸提取及分析方法，包括：将灵芝菌株通过活化培养和两次恒温摇瓶制成发酵液；取发酵液进行两次离心收集，并将收集好的菌丝进行烘干至恒重；将菌丝制成菌丝灵芝酸提取液，将灵芝子实体切片制成灵芝子实体灵芝酸提取液；将菌丝灵芝酸提取液、标准品灵芝酸A、标准品灵芝酸C、标准品灵芝酸C2、标准品灵芝酸E、标准品赤芝酸A、百里酚标准溶液以及灵芝子实体灵芝酸提取液进行紫外可见光谱扫描；用紫外吸收法计算菌丝灵芝酸提取液和灵芝子实体灵芝酸提取液中灵芝酸的含量。本发明使灵芝酸提取工艺更简单、快速和准确，有效优化和改变灵芝酸分析方法。
Description
技术领域
本发明及灵芝酸分析方法技术领域，特别涉及一种灵芝酸提取及分析方法。
背景技术
灵芝(Ganodermalucidum)又称为仙草、瑞草、神芝、不老草，属担子菌纲、伞菌目、多孔菌科、灵芝属真菌，在中国主要指包括赤芝、紫芝以及松杉灵芝等在内的芝类，是一种深受中国人民喜爱的中药材，也是韩国、日本、泰国等东方国家的传统珍贵中药，具有2000多年的药用历史，主要用于肝炎、高血压、高血脂和胃癌等疾病的治疗。灵芝性温、味甘、微苦，有益心气、生血、助心安神、益肺气、坚筋骨、利关节、安神补肝等多种功能。食用灵芝可延年益寿、增强体格。
灵芝含有丰富的活性成分，以多糖和属三萜类的灵芝酸为主要活性成分。药理研究显示灵芝多糖具有抗癌、抗肿瘤、免疫调节、抗衰老、抗氧化等作用；灵芝酸可抑制肿瘤细胞、艾滋病毒以及细菌。当前灵芝多糖等灵芝活性物质生产主要依赖人工栽培子实体为原料以提取的方法获取，具有产率低、难以规模化生产以及不同批次间活性成分组成及含量有较大差异等缺点。
灵芝液体深层发酵具有周期短以及可工业化生产等优点，另外研究表明发酵产物灵芝多糖和三萜具有与子实体相近的抗肿瘤活性，因此，以灵芝多糖、灵芝酸和三萜为目标产物的液体深层发酵成为灵芝研究热点。余素萍等研究发现先摇床培养后静置培养的方法有利于菌丝总三萜合成，有效抗肿瘤三萜生产则以摇床培养为最佳方式。高兴喜等发现真菌激发子可诱导灵芝三萜和多糖大量合成。Liu等发现药用昆虫提取物可促进灵芝多糖生物合成。Fang等采用先摇床培养后静置培养的发酵工艺可显著提高灵芝酸产量。
灵芝酸是一类高度氧化的羊毛甾烷衍生物，主要有高效液相色谱法、香草醛-高氯酸比色法和紫外吸收法等3种分析方法。高效液相色谱法的优点在于其可同时分析不同单体灵芝酸含量以及样品制备过程相对简单，但仪器昂贵、不易操作以及试剂要求高；紫外吸收法和香草醛-高氯酸比色法由于所需仪器设备简单成为灵芝酸分析的主要方法。紫外吸收法通常以灵芝酸A和百里酚为灵芝酸对照品以定量分析；香草醛-高氯酸比色法主要以熊果酸和齐墩果酸作为参比物进行分析。但是利用紫外可见光谱分析不同灵芝酸及对照品差异，以不同对照品利用紫外吸收法和香草醛-高氯酸比色法分析灵芝发酵菌丝及子实体灵芝酸含量，是没有的。
发明内容
本发明为解决上述技术问题为提供一种分析简单、快速、准确的灵芝酸提取及分析方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种灵芝酸提取及分析方法，包括以下步骤：
步骤一、将灵芝菌株接种至PDA斜面25℃活化培养7天作为琼脂培养基菌种；取5粒黄豆粒大小的琼脂培养基菌种加入至80mL发酵培养基中进行30℃、160r/min恒温摇瓶培养5天作为种子；取8mL种子加入至80mL发酵培养基中进行30℃、160r/min恒温摇瓶培养7天作为发酵液；
步骤二、取发酵液40mL装于50mL离心管进行4500r/min离心10min，除去上清，将沉淀的菌丝用去离子水洗去培养基，将菌丝进行离心收集，重复一次菌丝用去离子水洗及离心收集的过程；将收集好的菌丝放置在恒重的称量纸上，用60℃烘至恒重；
步骤三、将烘干后的菌丝于研钵中研为粉末，将粉末进行灵芝酸的提取制成菌丝灵芝酸提取液；取灵芝子实体切片用中药粉碎机进行粉碎，将粉碎后的灵芝子实体切片制成灵芝子实体灵芝酸提取液；
步骤四、将菌丝灵芝酸提取液稀释1倍，和标准品灵芝酸A、标准品灵芝酸C、标准品灵芝酸C2、标准品灵芝酸E、标准品赤芝酸A、百里酚标准溶液以及灵芝子实体灵芝酸提取液分别进行紫外可见光谱扫描，得到紫外可见光谱曲线图；
步骤五、根据紫外可见光谱曲线图，标准品灵芝酸A和百里酚标准溶液为对照品，用紫外吸收法分别计算菌丝灵芝酸提取液和灵芝子实体灵芝酸提取液中灵芝酸的含量。
本发明有益效果是：通过改进灵芝酸提取工艺提高其纯度提高对灵芝酸含量分析方法的准确性，为优化灵芝酸含量分析提供有效方法，提供更好的指导生产以及提高监管水平，使灵芝酸提取工艺更简单、快速和准确，有效优化和改变灵芝酸分析方法。
作为本发明的一种优选结构，在所述步骤一之前还包括：
将葡萄糖35g、蛋白胨3.5g、KH2PO41g、MgSO40.5g以及维生素B10.01g加入1000mL去离子水中，用121℃灭菌20min制成发酵培养基。
作为本发明的一种优选结构，所述恒温摇瓶所用的摇瓶均为250mL摇瓶。
作为本发明的一种优选结构，所述紫外可见光谱扫描的光程为1cm石英比色皿，紫外可见光谱扫描的扫描范围为200~700nm，紫外可见光谱扫描的采样间隔2nm。
为解决上述技术问题，本发明采用的另一种技术方案为：
一种灵芝酸提取及分析方法，包括以下步骤：
步骤一、将灵芝菌株接种至PDA斜面25℃活化培养7天作为琼脂培养基菌种；取5粒黄豆粒大小的琼脂培养基菌种加入至80mL发酵培养基中进行30℃、160r/min恒温摇瓶培养5天作为种子；取8mL种子加入至80mL发酵培养基中进行30℃、160r/min恒温摇瓶培养7天作为发酵液；
步骤二、取发酵液40mL装于50mL离心管进行4500r/min离心10min，除去上清，将沉淀的菌丝用去离子水洗去培养基，将菌丝进行离心收集，重复一次菌丝用去离子水洗及离心收集的过程；将收集好的菌丝放置在恒重的称量纸上，用60℃烘至恒重；
步骤三、将烘干后的灵芝于研钵中研为粉末，将粉末进行灵芝酸的提取制成灵芝酸提取液；取灵芝子实体切片用中药粉碎机进行粉碎，将粉碎后的灵芝子实体切片制成灵芝子实体灵芝酸提取液；
步骤四、将灵芝酸提取液和标准品灵芝酸A、熊果酸标准溶液、齐墩果酸标准溶液以及稀释1倍的灵芝子实体灵芝酸提取液分别进行紫外可见光谱扫描，得到紫外可见光谱曲线图；
步骤五、根据紫外可见光谱曲线图，取熊果酸标准溶液和齐墩果酸标准溶液为对照品，用香草醛-高氯酸比色法分别计算菌丝灵芝酸提取液和灵芝子实体灵芝酸提取液中灵芝酸的含量。
作为本发明的一种优选结构，在所述步骤一之前还包括：
将葡萄糖35g、蛋白胨3.5g、KH2PO41g、MgSO40.5g以及维生素B10.01g加入1000mL去离子水中，用121℃灭菌20min制成发酵培养基。
作为本发明的一种优选结构，所述恒温摇瓶所用的摇瓶均为250mL摇瓶。
作为本发明的一种优选结构，所述紫外可见光谱扫描的光程为1cm石英比色皿，紫外可见光谱扫描的扫描范围为200~700nm，紫外可见光谱扫描的采样间隔2nm。
附图说明
图1为本发明实施方式一得到的不同灵芝酸、赤芝酸A、百里酚以及样品紫外可见光谱曲线图；
图2为本发明灵芝酸A、熊果酸、齐墩果酸及灵芝菌丝及子实体提取液香草醛-高氯酸显色反应紫外可见光谱曲线图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详予说明。
定义：
灵芝酸是一种三萜类物质，已分离到100多种，如灵芝酸A、B、C、D、E、F、G、I、L、ma、md、mg等。有些灵芝味甚苦，根源是灵芝酸A、赤芝酸A。赤芝酸有A、B、C、D、E、F等。
所谓标准品灵芝酸A的行业配制方法：精密称定灵芝酸A标准品适量，置于25mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度制成质量浓度为0.5mg/mL标准溶液母液，分别量取1mL灵芝酸A标准溶液母液于5、10、25、50和100mL容量瓶中，加入甲醇混合并定容至刻度，配制成质量浓度为0.01、0.02、0.05、0.1、0.5mg/mL的灵芝酸A标准品溶液。
标准品灵芝酸C、标准品灵芝酸C2、标准品灵芝酸E、标准品赤芝酸A、百里酚标准溶液、熊果酸标准溶液以及齐墩果酸标准溶液同上述“标准品灵芝酸A”配制方法。
实施方式一
（1）将灵芝菌株接种至PDA斜面25℃活化培养7天作为琼脂培养基菌种；取5粒黄豆粒大小的琼脂培养基菌种加入至80mL发酵培养基中进行30℃、160r/min恒温摇瓶培养5天作为种子；取8mL种子加入至80mL发酵培养基中进行30℃、160r/min恒温摇瓶培养7天作为发酵液；
PDA斜面，为PDA培养基制成的一种常用的培养基斜面，宜培养酵母菌、霉菌、蘑菇等真菌。
（2）取发酵液40mL装于50mL离心管进行4500r/min离心10min，除去上清，将沉淀的菌丝用去离子水洗去培养基，将菌丝进行离心收集，重复一次菌丝用去离子水洗及离心收集的过程；将收集好的菌丝放置在恒重的称量纸上，用60℃烘至恒重；
（3）将烘干后的菌丝于研钵中研为粉末，将粉末进行灵芝酸的提取制成菌丝灵芝酸提取液；取灵芝子实体切片用中药粉碎机进行粉碎，将粉碎后的灵芝子实体切片制成灵芝子实体灵芝酸提取液；
菌丝灵芝酸提取液或灵芝子实体灵芝酸提取液的制作步骤如下：
称取100mg菌丝或子实体粉末于3mL95%乙醇，室温浸提3天，期间经常振荡，过滤收集浸提液，滤渣再一次于3mL95%乙醇室温浸提4天，期间经常振荡，过滤收集浸提液，将浸提液合并。浸提液于旋转蒸发仪50℃旋蒸，移入5mL去离子水充分洗涤收集，加入10mL氯仿充分混和抽提三萜成分；收集氯仿层，加入10mL5%NaHCO3进一步抽提三萜；收集NaHCO3层用2mol/L盐酸调pH至3.0以下，加入10mL氯仿抽提灵芝酸；收集氯仿层40℃旋蒸去氯仿，最后加入10mL无水乙醇制成菌丝灵芝酸提取液或灵芝子实体灵芝酸提取液。
（4）将菌丝灵芝酸提取液稀释1倍，和标准品灵芝酸A、标准品灵芝酸C、标准品灵芝酸C2、标准品灵芝酸E、标准品赤芝酸A、百里酚标准溶液以及灵芝子实体灵芝酸提取液分别进行紫外可见光谱扫描，得到紫外可见光谱曲线图；
请参考图1，如图1所示，A表示标准品灵芝酸A；C表示标准品灵芝酸C；C2表示标准品灵芝酸C2；E表示标准品灵芝酸E；LA表示标准品赤芝酸A；Th表示百里酚标准溶液；MY表示菌丝灵芝酸提取液；FB表示灵芝子实体灵芝酸提取液。灵芝酸A、灵芝酸C、灵芝酸C2、灵芝酸E以及赤芝酸A紫外可见光谱峰形、峰强相似，形成1个波峰，254nm附近有最大吸收波长；不同与前者，百里酚作为不同于灵芝酸的一类化学物质，其形成2个尖峰，212nm和276nm具有最大吸收波长，两峰之间246nm为波谷，该波长常作为灵芝酸紫外吸收法检测波长。
灵芝子实体灵芝酸提取液紫外可见光谱形成一宽峰，与对照品灵芝酸峰形较为相似，显示其主要成分为灵芝酸；不同于前者，灵芝发酵菌丝灵芝酸提取液紫外可见光谱与不同灵芝酸以及子实体灵芝酸提取液紫外可见光谱具有明显差异，其在灵芝酸弱吸收区(200~254nm)有强烈吸收，可见该提取液中含有较高含量的非灵芝酸类成分。灵芝酸紫外吸收法常以246nm作为检测波长，此比较不同灵芝酸对照品该波长处的吸光度值。显示灵芝酸A、C、C2、E、赤芝酸A及百里酚吸光度值分别为0.26、0.44、0.36、0.31、0.49和0.15，以百里酚最小，赤芝酸A最大，基于此，样品灵芝酸紫外吸收法分析以灵芝酸A和百里酚作为对照品，246nm为检测波长。
（5）根据紫外可见光谱曲线图，取标准品灵芝酸A和百里酚标准溶液为对照品，用紫外吸收法分别计算菌丝灵芝酸提取液和灵芝子实体灵芝酸提取液中灵芝酸的含量。
表1为不同样品吸光度值以及根据灵芝酸A和百里酚标准曲线所计算灵芝酸含量值，经比较可知百里酚标准曲线计算值比灵芝酸A标准曲线计算值高85.7％。
表1样品灵芝酸紫外吸收法分析结果
在本实施方式中，在所述步骤（1）之前还包括：
将葡萄糖35g、蛋白胨3.5g、KH2PO41g、MgSO40.5g以及维生素B10.01g加入1000mL去离子水中，用121℃灭菌20min制成发酵培养基。
在本实施方式中，步骤（2）中所述恒温摇瓶所用的摇瓶均为250mL摇瓶。
在本实施方式中，步骤（4）中所述紫外可见光谱扫描的光程为1cm石英比色皿，紫外可见光谱扫描的扫描范围为200~700nm，紫外可见光谱扫描的采样间隔2nm。
在本实施方式中，以标准品灵芝酸A和百里酚标准溶液为对照品，紫外吸收法显示灵芝发酵菌丝灵芝酸含量分别为0.7mg/100mg和1.3mg/100mg，子实体分别为2.1mg/100mg和4.0mg/100mg。以百里酚标准溶液为紫外吸收法对照品，灵芝酸含量分析值显著高于以灵芝酸A作为对照品的分析值。
实施方式二
（1）将灵芝菌株接种至PDA斜面25℃活化培养7天作为琼脂培养基菌种；取5粒黄豆粒大小的琼脂培养基菌种加入至80mL发酵培养基中进行30℃、160r/min恒温摇瓶培养5天作为种子；取8mL种子加入至80mL发酵培养基中进行30℃、160r/min恒温摇瓶培养7天作为发酵液；
PDA斜面，为PDA培养基制成的一种常用的培养基斜面，宜培养酵母菌、霉菌、蘑菇等真菌。
（2）取发酵液40mL装于50mL离心管进行4500r/min离心10min，除去上清，将沉淀的菌丝用去离子水洗去培养基，将菌丝进行离心收集，重复一次菌丝用去离子水洗及离心收集的过程；将收集好的菌丝放置在恒重的称量纸上，用60℃烘至恒重；
（3）将烘干后的菌丝于研钵中研为粉末，将粉末进行灵芝酸的提取制成菌丝灵芝酸提取液；取灵芝子实体切片用中药粉碎机进行粉碎，将粉碎后的灵芝子实体切片制成灵芝子实体灵芝酸提取液；
菌丝灵芝酸提取液或灵芝子实体灵芝酸提取液的制作步骤如下：
称取100mg菌丝或子实体粉末于3mL95%乙醇，室温浸提3天，期间经常振荡，过滤收集浸提液，滤渣再一次于3mL95%乙醇室温浸提4天，期间经常振荡，过滤收集浸提液，将浸提液合并。浸提液于旋转蒸发仪50℃旋蒸，移入5mL去离子水充分洗涤收集，加入10mL氯仿充分混和抽提三萜成分；收集氯仿层，加入10mL5%NaHCO3进一步抽提三萜；收集NaHCO3层用2mol/L盐酸调pH至3.0以下，加入10mL氯仿抽提灵芝酸；收集氯仿层40℃旋蒸去氯仿，最后加入10mL无水乙醇制成菌丝灵芝酸提取液或灵芝子实体灵芝酸提取液。
（4）将灵芝酸提取液和标准品灵芝酸A、熊果酸标准溶液、齐墩果酸标准溶液以及稀释1倍的灵芝子实体灵芝酸提取液分别进行紫外可见光谱扫描，得到紫外可见光谱曲线图；
请参考图1，如图2所示，UA：表示熊果酸标准溶液；OA表示齐墩果酸标准溶液；A表示标准品灵芝酸A；MY表示菌丝灵芝酸提取液；FB表示灵芝子实体灵芝酸提取液。熊果酸和齐墩果酸显色反应紫外可见光谱峰形相似，峰强相近，544nm及552nm分别为其最大吸收波长；灵芝酸A对照品香草醛-高氯酸显色反应弱，无吸收峰，显然灵芝酸A不可作为香草醛-高氯酸比色法灵芝酸分析参比物。
灵芝发酵菌丝灵芝酸提取液香草醛-高氯酸显色反应450~700nm间形成2个吸收峰，524nm和590nm分别为波峰；灵芝子实体灵芝酸提取液香草醛-高氯酸显色反应紫外可见光谱与熊果酸及齐墩果酸对照品相似，546nm有最大吸光度值。灵芝发酵菌丝及子实体作为2种不同的灵芝产品，两提取液显色反应紫外可见光谱的差异显示灵芝酸成分的不同，反映生产方式影响灵芝酸合成。
（5）根据紫外可见光谱曲线图，取熊果酸标准溶液和齐墩果酸标准溶液为对照品，用香草醛-高氯酸比色法分别计算菌丝灵芝酸提取液和灵芝子实体灵芝酸提取液中灵芝酸的含量。
表2为灵芝发酵菌丝和子实体灵芝酸提取液香草醛-高氯酸显色反应吸光度值以及依据熊果酸和齐墩果酸标准曲线所计算灵芝酸含量值，可以看出分析结果相近。
在本实施方式中，在所述步骤（1）之前还包括：
将葡萄糖35g、蛋白胨3.5g、KH2PO41g、MgSO40.5g以及维生素B10.01g加入1000mL去离子水中，用121℃灭菌20min制成发酵培养基。
在本实施方式中，步骤（2）中所述恒温摇瓶所用的摇瓶均为250mL摇瓶。
在本实施方式中，步骤（4）中所述紫外可见光谱扫描的光程为1cm石英比色皿，紫外可见光谱扫描的扫描范围为200~700nm，紫外可见光谱扫描的采样间隔2nm。
在本实施方式中，以熊果酸和齐墩果酸为对照品，香草醛-高氯酸比色法显示灵芝发酵菌丝灵芝酸含量分别为0.45mg/100mg和0.49mg/100mg，子实体分别为1.55mg/100mg和1.71mg/100mg。熊果酸和齐墩果酸香草醛-高氯酸显色反应紫外可见光谱相似，两者作为灵芝酸对照品分析结果相近。
终上所述，灵芝酸分析紫外吸收法以及香草醛-高氯酸比色法均有不足之处，本发明使灵芝酸提取工艺更简单、快速和准确，有效优化和改变灵芝酸分析方法。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (8)
1.一种灵芝酸提取及分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、将灵芝菌株接种至PDA斜面25℃活化培养7天作为琼脂培养基菌种；取5粒黄豆粒大小的琼脂培养基菌种加入至80mL发酵培养基中进行30℃、160r/min恒温摇瓶培养5天作为种子；取8mL种子加入至80mL发酵培养基中进行30℃、160r/min恒温摇瓶培养7天作为发酵液；
步骤二、取发酵液40mL装于50mL离心管进行4500r/min离心10min，除去上清，将沉淀的菌丝用去离子水洗去培养基，将菌丝进行离心收集，重复一次菌丝用去离子水洗及离心收集的过程；将收集好的菌丝放置在恒重的称量纸上，用60℃烘至恒重；
步骤三、将烘干后的菌丝于研钵中研为粉末，将粉末进行灵芝酸的提取制成菌丝灵芝酸提取液；取灵芝子实体切片用中药粉碎机进行粉碎，将粉碎后的灵芝子实体切片制成灵芝子实体灵芝酸提取液；
步骤四、将菌丝灵芝酸提取液稀释1倍，和标准品灵芝酸A、标准品灵芝酸C、标准品灵芝酸C2、标准品灵芝酸E、标准品赤芝酸A、百里酚标准溶液以及灵芝子实体灵芝酸提取液分别进行紫外可见光谱扫描，得到紫外可见光谱曲线图；
步骤五、根据紫外可见光谱曲线图，取标准品灵芝酸A和百里酚标准溶液为对照品，用紫外吸收法分别计算菌丝灵芝酸提取液和灵芝子实体灵芝酸提取液中灵芝酸的含量。
2.根据权利要求1所述的灵芝酸提取及分析方法，其特征在于，在所述步骤一之前还包括：
将葡萄糖35g、蛋白胨3.5g、KH2PO41g、MgSO40.5g以及维生素B10.01g加入1000mL去离子水中，用121℃灭菌20min制成发酵培养基。
3.根据权利要求1所述的灵芝酸提取及分析方法，其特征在于：所述恒温摇瓶所用的摇瓶均为250mL摇瓶。
4.根据权利要求1所述的灵芝酸提取及分析方法，其特征在于：所述紫外可见光谱扫描的光程为1cm石英比色皿，紫外可见光谱扫描的扫描范围为200~700nm，紫外可见光谱扫描的采样间隔2nm。
5.一种灵芝酸提取及分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、将灵芝菌株接种至PDA斜面25℃活化培养7天作为琼脂培养基菌种；取5粒黄豆粒大小的琼脂培养基菌种加入至80mL发酵培养基中进行30℃、160r/min恒温摇瓶培养5天作为种子；取8mL种子加入至80mL发酵培养基中进行30℃、160r/min恒温摇瓶培养7天作为发酵液；
步骤二、取发酵液40mL装于50mL离心管进行4500r/min离心10min，除去上清，将沉淀的菌丝用去离子水洗去培养基，将菌丝进行离心收集，重复一次菌丝用去离子水洗及离心收集的过程；将收集好的菌丝放置在恒重的称量纸上，用60℃烘至恒重；
步骤三、将烘干后的菌丝于研钵中研为粉末，将粉末进行灵芝酸的提取制成灵芝酸提取液；取灵芝子实体切片用中药粉碎机进行粉碎，将粉碎后的灵芝子实体切片制成灵芝子实体灵芝酸提取液；
步骤四、将灵芝酸提取液和标准品灵芝酸A、熊果酸标准溶液、齐墩果酸标准溶液以及稀释1倍的灵芝子实体灵芝酸提取液分别进行紫外可见光谱扫描，得到紫外可见光谱曲线图；
步骤五、根据紫外可见光谱曲线图，取熊果酸标准溶液和齐墩果酸标准溶液为对照品，用香草醛-高氯酸比色法分别计算菌丝灵芝酸提取液和灵芝子实体灵芝酸提取液中灵芝酸的含量。
6.根据权利要求1所述的灵芝酸提取及分析方法，其特征在于，在所述步骤一之前还包括：
将葡萄糖35g、蛋白胨3.5g、KH2PO41g、MgSO40.5g以及维生素B10.01g加入1000mL去离子水中，用121℃灭菌20min制成发酵培养基。
7.根据权利要求1所述的灵芝酸提取及分析方法，其特征在于：所述恒温摇瓶所用的摇瓶均为250mL摇瓶。
8.根据权利要求1所述的灵芝酸提取及分析方法，其特征在于：所述紫外可见光谱扫描的光程为1cm石英比色皿，紫外可见光谱扫描的扫描范围为200~700nm，紫外可见光谱扫描的采样间隔2nm。
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| CN201510949610.0A CN105385745A (zh) | 2015-12-18 | 2015-12-18 | 一种灵芝酸提取及分析方法 |
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-
2015
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Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| WEI Z H 等: "Screening of Ganoderma strains with high polysaccharides and ganoderic acid contents and optimization of the fermentation medium by statistical methods", 《BIOPROCESS AND BIOSYSTEMS AND ENGINEERING》 * |
| 刘海良等: "树舌灵芝发酵液中灵芝酸的提取及测定", 《食用菌学报》 * |
| 刘盛荣等: "基于不同对照品的灵芝酸紫外及比色法分析", 《中国农学通报》 * |
| 江绍琳等: "分光光度法快速测定灵芝中总三萜含量", 《江西农业大学学报》 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106501439A (zh) * | 2016-09-13 | 2017-03-15 | 广州神农生物技术有限公司 | 一种赤灵芝提取物对照品及其制备方法和应用 |
| CN106501439B (zh) * | 2016-09-13 | 2019-03-12 | 广州神农生物技术有限公司 | 一种赤灵芝提取物对照品及其制备方法和应用 |
| CN111562251A (zh) * | 2020-05-26 | 2020-08-21 | 河北省食品检验研究院 | 一种灵芝孢子粉中灵芝酸b的快速检测方法 |
| CN111562250A (zh) * | 2020-05-26 | 2020-08-21 | 河北省食品检验研究院 | 一种灵芝孢子油中灵芝酸g的快速检测方法 |
| CN114231587A (zh) * | 2021-11-17 | 2022-03-25 | 遵义医科大学珠海校区 | 灵芝酸ltha和ltca的生物转化与提取方法 |
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