CN114231587A - 灵芝酸ltha和ltca的生物转化与提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于灵芝酸制备技术领域，公开了一种灵芝酸LTHA和LTCA的生物转化与提取方法。该生物转化方法是以二氢丹参酮Ⅰ为底物，经与无柄灵芝菌共培养，转化得到含有灵芝酸LTHA和LTCA的培养物。该生物转化方法具有工艺简单、反应条件温和、转化率高的特点；该提取方法则克服了此两种灵芝酸分离困难的缺陷，为其工业化生产提供了基础，具有很好的市场经济价值。

Description

灵芝酸LTHA和LTCA的生物转化与提取方法

技术领域

本发明属于灵芝酸制备技术领域，尤其涉及灵芝酸LTHA和LTCA的生物转化与提取方法。

背景技术

灵芝是我国著名的食药兼用大型真菌，现代科学研究已表明灵芝中三萜类成分灵芝酸具有广泛的生物学活性，包括有抗肿瘤，抗HIV-1，免疫调节，降血脂，降血糖，抗氧化等活性，因而常被认为是发现抗肿瘤，抗HIV-1，免疫调节方面药物的潜在候选者。

目前灵芝酸来源主要为灵芝子实体提取、灵芝孢子粉破壁提取和液体发酵。其中，灵芝子实体和灵芝孢子粉中灵芝酸的成分受生长环境、品种等诸多因素影响，差异较大，质量难以控制。液体发酵虽然可以通过控制发酵条件和外源诱导子提高原有灵芝酸成分的含量，但是灵芝酸增加幅度和种类有限。在植物灵芝中，lanosta-7,9(11),24-trien-15α,22β-diacetoxy-3β-hydroxy-26-oic acid(LTHA)和lanosta-7,9(11),24-trien-15α,22β-diacetoxy-3β-carbonyl-26-oic acid(LTCA)是两种稀有的灵芝酸，丰度较低，限制了上述灵芝酸在制药工业中的应用。

因此，本发明希望提供一种灵芝酸LTHA和LTCA的生物转化方法，为解决此两种稀有灵芝酸资源短缺的问题提供新的途径。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种灵芝酸LTHA和LTCA的生物转化与提取方法，该生物转化方法具有工艺简单、反应条件温和、转化率高的特点；该提取方法则克服了此两种灵芝酸分离困难的缺陷，为其工业化生产提供了基础，具有很好的市场经济价值。

本发明提供了一种灵芝酸LTHA和LTCA的生物转化方法，以二氢丹参酮Ⅰ为底物，经与无柄灵芝菌(Ganoderma sessile)共培养，转化得到含有灵芝酸LTHA和LTCA的培养物。

上述生物转化方法的反应路线如下：

经前期试验发现，当使用4种常见食药用菌(香菇菌，无柄灵芝菌，蛹虫草菌和猴头菌)分别转化7种具有灵芝酸骨架的化合物(丹参酮I，二氢丹参酮I，丹参酮IIA，丹参酮IIA磺酸钠，隐丹参酮，胆固醇和胆酸)时，只有无柄灵芝菌与二氢丹参酮I共培养的组合才能实现向灵芝酸LTHA和LTCA的转化，而其他组合均未产生相同转化。

优选的，所述生物转化方法所使用培养基的组分包括：蛋白胨2-10g/L，葡萄糖5-15g/L，磷酸二氢钾0.5-1.2g/L，硫酸镁0.1-0.8g/L，水。所述培养基中还可包含氯霉素等抗生素。

更优选的，所述生物转化方法所使用培养基的组分包括：蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，水。

更优选的，所述培养基的pH为6.2-6.6。

优选的，所述生物转化方法中将无柄灵芝菌的菌丝以5％-10％的接种量进行接种。

优选的，所述生物转化方法中加入二氢丹参酮Ⅰ后的终浓度为30-60μg/mL。

优选的，所述生物转化方法中共培养的时间为5-15天。

本发明还提供了一种灵芝酸LTHA和LTCA的提取方法，包括以下步骤：

(1)采用上述生物转化方法得到培养物，收集菌丝体，经提取、萃取和浓缩，得到提取物；

(2)利用硅胶色谱柱对所述提取物进行梯度洗脱，再采用薄层色谱法检测，待薄层展开后吹干，与5％H₂SO₄-EtOH溶液显色反应，并在254nm紫外光下合并相似组分，得到待纯化物；

(3)采用半制备高效液相色谱对所述待纯化物进行纯化，得到灵芝酸LTHA和LTCA；

所述半制备高效液相色谱的条件参数包括：

色谱柱：ZORBAX SB-C18，5μm，9.4×250mm；

流动相组成：

流动相A：乙腈；流动相B：0.03％甲酸水溶液；

梯度洗脱条件：

0-30min：流动相A 60％-90％，流动相B余量。

优选的，步骤(1)中以10000r/min，4℃离心10min收集菌丝体。

优选的，步骤(1)中所述提取的步骤为：采用80％甲醇对菌丝体进行超声提取。

更优选的，所述超声提取的次数≥3次。

优选的，步骤(1)中所述萃取的步骤为：采用等体积的二氯甲烷和水进行萃取。

更优选的，所述萃取的次数≥3次。

优选的，步骤(2)中依次采用乙酸乙酯与石油醚体积比为1:30、1:15、1:10、1:5的混合洗脱液进行所述梯度洗脱。

优选的，步骤(2)中所述薄层色谱法采用硅胶G薄层板，以乙酸乙酯与石油醚体积比为1:15的混合溶剂进行检测。

优选的，步骤(3)中所述半制备高效液相色谱的条件参数还包括：

流速：3mL/min；检测器：紫外吸收检测器；检测波长：242nm；进样量：80μL；柱温：30℃。

相对于现有技术，本发明的有益效果如下：

(1)本发明利用无柄灵芝菌与底物二氢丹参酮Ⅰ共培养的方式，可实现对目标产物灵芝酸LTHA和LTCA的生物转化，有效解决了天然灵芝中此两种灵芝酸丰度低的问题。

(2)本发明所述提取方法则克服了LTHA和LTCA此两种灵芝酸分离困难的缺陷，为其工业化生产提供了基础，具有很好的市场经济价值。

附图说明

图1为采用超高效液相色谱(UPLC)对无柄灵芝菌菌丝体(S1)、无柄灵芝菌菌丝体和二氢丹参酮Ⅰ共培养前混合物(S2)、实施例1经生物转化后得到的培养物(S3)进行检测的检测结果；

图2为LTHA的高分辨质谱图；

图3为LTHA的¹H-NMR谱图；

图4为LTHA的¹³C-NMR谱图

图5为LTHA的¹H-¹HCOSY谱图；

图6为LTHA的HMBC谱图；

图7为LTHA的HSQC谱图；

图8为LTHA的ROESY谱图；

图9为LTHA的UV谱图；

图10为LTHA的IR谱图；

图11为LTCA的高分辨质谱图；

图12为LTCA的¹H-NMR谱图；

图13为LTCA的¹³C-NMR谱图；

图14为LTCA的¹H-¹HCOSY谱图；

图15为LTCA的HMBC谱图；

图16为LTCA的HSQC谱图；

图17为LTCA的ROESY谱图；

图18为LTCA的UV谱图；

图19为LTCA的IR谱图；

图20为实施例4生物转化过程中灵芝酸LTHA、LTCA与菌丝体质量随时间变化的曲线；

图21为实施例4生物转化过程中底物二氢丹参酮Ⅰ与菌丝体质量随时间变化的曲线；

图22为采用超高效液相色谱(UPLC)对无柄灵芝菌菌丝体(S1)、无柄灵芝菌菌丝体和胆固醇共培养前混合物(S2)、对比例1经生物转化后得到的培养物(S3)进行检测的检测结果；

图23为采用超高效液相色谱(UPLC)对无柄灵芝菌菌丝体(S1)、无柄灵芝菌菌丝体和胆酸共培养前混合物(S2)、对比例2经生物转化后得到的培养物(S3)进行检测的检测结果。

具体实施方式

为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例仅为本发明的优选实施例，对本发明要求的保护范围不构成限制作用，任何未违背本发明的精神实质和原理下所做出的修改、替代、组合，均包含在本发明的保护范围内。

以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。

实施例1

本实施例提供一种灵芝酸LTHA和LTCA的生物转化与提取方法，包括以下步骤：

(1)生物转化：配置液体培养基(组成为：蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，氯霉素0.1g/L，用水进行配置；培养基pH为6.2-6.6)，将培养基装入摇瓶，使用无菌透气膜进行封口，121℃灭菌20min，冷却至室温；

取无柄灵芝菌(Ganoderma sessile)菌体接入无菌培养基中，用消毒后的电动组织匀浆器将菌丝破碎，置于28℃，200r/min的摇床中培养5天进行活化。取活化后的无柄灵芝菌菌液，用消毒的电动组织匀浆器将菌丝破碎后以10％接种量接入至摇瓶中，同时加入用乙醇溶解的二氢丹参酮Ⅰ溶液，使二氢丹参酮Ⅰ的终浓度为30μg/mL，放入摇床，在温度30℃，转速150r/min的条件下培养15天，获得培养物；

(2)产物提取：将步骤(1)获得的培养物以8000r/min，4℃离心10min，取菌丝体浸入80％甲醇溶液中，使用匀浆器将菌丝体打碎，超声20min后，离心，获得上清液，再次使用相同的步骤提取菌丝体，将所得上清液混合并浓缩至干。再加入等体积的二氯甲烷和水萃取3次，取二氯甲烷层减压浓缩至干。将所得提取物以硅胶色谱柱依次采用乙酸乙酯与石油醚体积比为1:30、1:15、1:10、1:5的混合洗脱液进行梯度洗脱。

再采用薄层色谱法(硅胶G薄层板，乙酸乙酯/石油醚＝1:15)检测，待薄层展开后吹干，与5％H₂SO₄-EtOH溶液显色反应，并在254nm紫外光下合并相似组分，得到待纯化物。

进一步采用半制备高效液相色谱仪(Agilent 1200Series)对待纯化物进行纯化，条件参数包括：色谱柱(ZORBAX SB-C18，5μm，9.4×250mm，安捷伦科技有限公司)；流动相组成：流动相A：乙腈；流动相B：0.03％甲酸水溶液；梯度洗脱条件：0-30min：流动相A 60％-90％，流动相B余量；流速：3mL/min；检测器：紫外吸收检测器；检测波长：242nm；进样量：80μL；柱温：30℃。收集目标成分，多次重复分离以收集足量的目标化合物溶液，合并溶液，并蒸发各级分以除去溶剂，即可得到灵芝酸LTHA和LTCA。

产物检测：

采用超高效液相色谱(UPLC)对无柄灵芝菌菌丝体(S1)、无柄灵芝菌菌丝体和二氢丹参酮Ⅰ共培养前混合物(S2)、本实施例经生物转化后得到的培养物(S3)进行检测，检测条件为：色谱柱：ACQUITY UPLC@BEH Shield RP18色谱柱(2.1×100mm，1.7μm)；检测器：PDA检测器(二极管阵列检测器)；检测波长：200nm-500nm；进样量:2μL；流动相A：乙腈，流动相B：0.03％甲酸溶液；梯度洗脱条件：0-2min(流动相A：27％-45％，流动相B：余量)，2-7min(流动相A：45％-70％，流动相B：余量)，7-10min(流动相A：70％-100％，流动相B：余量)；流速：0.3mL/min。

检测结果如图1所示，经判断，峰1为二氢丹参酮Ⅰ、峰2为灵芝酸LTHA、峰3为灵芝酸LTCA。继续收集峰2和峰3产物进行成分检测，图1-18的检测结果显示峰2和峰3产物分别对应灵芝酸LTHA和灵芝酸LTCA。

其中，图2为LTHA的高分辨质谱图；图3为LTHA的¹H-NMR谱图；图4为LTHA的¹³C-NMR谱图；图5为LTHA的¹H-¹HCOSY谱图；图6为LTHA的HMBC谱图；图7为LTHA的HSQC谱图；图8为LTHA的ROESY谱图；图9为LTHA的UV谱图；图10为LTHA的IR谱图；图11为LTCA的高分辨质谱图；图12为LTCA的¹H-NMR谱图；图13为LTCA的¹³C-NMR谱图；图14为LTCA的¹H-¹HCOSY谱图；图15为LTCA的HMBC谱图；图16为LTCA的HSQC谱图；图17为LTCA的ROESY谱图；图18为LTCA的UV谱图；图19为LTCA的IR谱图。

实施例2

与实施例1相比，实施例2的区别之处在于：1.生物转化的培养温度设置为26℃；2.液体培养基的组成为：蛋白胨4g/L，葡萄糖6g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.4g/L，氯霉素0.05g/L，用水进行配置。

实施例3

与实施例1相比，实施例3的区别在于在于：

生物转化：配置液体培养基(其组成为：蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，氯霉素0.1g/L，用水进行配置；培养基pH为6.2-6.6)，将培养基装入摇瓶，使用无菌透气膜进行封口，121℃灭菌20min，冷却至室温；

取无柄灵芝菌(Ganoderma sessile)菌体接入无菌的培养基中，用消毒后的电动组织匀浆器将菌丝破碎，置于28℃，200r/min的摇床中培养5天进行活化。取活化后的无柄灵芝菌菌液，用消毒的电动组织匀浆器将菌丝破碎后以5％接种量接入至摇瓶中，培养48h后，再加入用乙醇溶解的二氢丹参酮Ⅰ溶液，使二氢丹参酮Ⅰ的终浓度为60μg/mL，放入摇床，在温度30℃，转速200r/min的条件下，培养15天，获得培养物；

实施例4

与实施例1相比，实施例3的区别在于在于：

生物转化：配置液体培养基(其组成为：蛋白胨10g/L，葡萄糖10g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，用水进行配置；培养基pH为6.2-6.6)，将28L上述液体培养基装入50-L发酵罐，121℃灭菌20min，冷却至室温；

取无柄灵芝菌(Ganoderma sessile)菌体接入无菌培养基中，用消毒后的电动组织匀浆器将菌丝破碎，置于28℃，200r/min的摇床中培养5天进行活化。取活化后的无柄灵芝菌菌液，用消毒的电动组织匀浆器将菌丝破碎后以5％接种量接入至发酵罐中，设置温度28℃，pH＝5.5，转速200r/min，通气量10L/min，加入橄榄油作为消泡剂，培养40h后，每隔2h以补料的方式加入二氢丹参酮Ⅰ(用75％乙醇进行溶解)，每次10％，共加入二氢丹参酮Ⅰ共3g。生物转化期间控制pH为5.5，并每隔8h补充200mL含量为50％的葡萄糖溶液，每隔5h取样。经培养5天后，获得培养物。

对所得培养物进行测定，底物转化率为78.3％，产物得率为12.2％。

底物转化率(％)＝[C(已转化的底物)/C(加底物总量)]*100％。

产物得率(％)＝[m(灵芝酸LTHA和灵芝酸LTCA)/m(二氢丹参酮Ⅰ)]*100％。

图20所示为本实施例生物转化过程中灵芝酸LTHA、LTCA与菌丝体质量随时间变化的曲线，其中X轴表示的时间是从投完底物开始计时；图21所示为本实施例生物转化过程中底物二氢丹参酮Ⅰ和菌丝体质量随时间变化的曲线，其中X轴表示的时间是从投完底物开始计时。

对比例1

与实施例1相比，本对比例的区别之处仅在于：选用胆固醇替代二氢丹参酮Ⅰ作为底物，采用乙醇对胆固醇进行溶解并使胆固醇终浓度为0.5mg/mL。

采用超高效液相色谱(UPLC)对无柄灵芝菌菌丝体(S1)、无柄灵芝菌菌丝体和胆固醇共培养前混合物(S2)、本对比例经生物转化后得到的培养物(S3)进行检测，检测方法与实施例1相同，其检测结果如图22所示，结果表明无柄灵芝菌与胆固醇共培养并不能实现向灵芝酸LTHA和LTCA的转化。

对比例2

与实施例1相比，本对比例的区别之处仅在于：选用胆酸替代二氢丹参酮Ⅰ作为底物，采用乙醇对胆酸进行溶解并使胆酸终浓度为0.3mg/mL。

采用超高效液相色谱(UPLC)对无柄灵芝菌菌丝体(S1)、无柄灵芝菌菌丝体和胆酸共培养前混合物(S2)、本对比例经生物转化后得到的培养物(S3)进行检测，检测方法与实施例1相同，其检测结果如图23所示，结果表明无柄灵芝菌与胆酸共培养并不能实现向灵芝酸LTHA和LTCA的转化。

上面结合附图对本申请实施例作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.一种灵芝酸LTHA和LTCA的生物转化方法，其特征在于，以二氢丹参酮Ⅰ为底物，经与无柄灵芝菌共培养，转化得到含有灵芝酸LTHA和LTCA的培养物。

2.根据权利要求1所述的生物转化方法，其特征在于，所述生物转化方法所使用培养基的组分包括：蛋白胨2-10g/L，葡萄糖5-15g/L，磷酸二氢钾0.5-1.2g/L，硫酸镁0.1-0.8g/L，水。

3.根据权利要求2所述的生物转化方法，其特征在于，所述培养基的pH为6.2-6.6。

4.根据权利要求1所述的生物转化方法，其特征在于，所述生物转化方法中将无柄灵芝菌的菌丝以5％-10％的接种量进行接种。

5.根据权利要求1所述的生物转化方法，其特征在于，所述生物转化方法中加入二氢丹参酮Ⅰ后的终浓度为30-60μg/mL。

6.根据权利要求1所述的生物转化方法，其特征在于，所述生物转化方法中共培养的时间为5-15天。

7.一种灵芝酸LTHA和LTCA的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)采用权利要求1-6中任一项所述的生物转化方法得到培养物，收集菌丝体，经提取、萃取和浓缩，得到提取物；

(2)利用硅胶色谱柱对所述提取物进行梯度洗脱，再采用薄层色谱法检测，待薄层展开后吹干，与5％H₂SO₄-EtOH溶液显色反应，并在254nm紫外光下合并相似组分，得到待纯化物；

(3)采用半制备高效液相色谱对所述待纯化物进行纯化，得到灵芝酸LTHA和LTCA；

所述半制备高效液相色谱的条件参数包括：

色谱柱：ZORBAX SB-C18，5μm，9.4×250mm；

流动相组成：

流动相A：乙腈；流动相B：0.03％甲酸水溶液；

梯度洗脱条件：

0-30min：流动相A 60％-90％，流动相B余量。

8.根据权利要求7所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)中所述提取的步骤为：采用80％甲醇对菌丝体进行超声提取。

9.根据权利要求7所述的提取方法，其特征在于，步骤(2)中依次采用乙酸乙酯与石油醚体积比为1:30、1:15、1:10、1:5的混合洗脱液进行所述梯度洗脱。

10.根据权利要求7所述的提取方法，其特征在于，步骤(2)中所述薄层色谱法采用硅胶G薄层板，以乙酸乙酯与石油醚体积比为1:15的混合溶剂进行检测。

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