CN109439718B - 一种制备人参稀有皂苷Rk3的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，公开了一种制备人参稀有皂苷Rk₃的方法。本发明所述方法先制备冬虫夏草种子液，然后接种至灭菌后的原人参药材上培养至长满菌丝，将长满菌丝的原人参药材取出，干燥，获得含有人参稀有皂苷Rk₃的初级产物，分离纯化初级产物获得人参稀有皂苷Rk₃。本发明将药用真菌冬虫夏草与原人参药材联合发酵生产人参皂苷Rk₃，由此确定了能够制备高含量人参皂苷Rk₃的简便工艺，相比原人参药材中人参皂苷Rk₃含量提高了22倍。本发明方法能有效直接利用原人参药材，减少前期提取纯化步骤，反应条件温和可控，Rk₃产量大，纯度高。

Description

一种制备人参稀有皂苷Rk3的方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种制备人参稀有皂苷Rk₃的方法。

背景技术

人参(Panax ginseng C.A.Meyer)为五加科多年生草本植物人参的根，自古有“百草之王”之称。人参的化学成分主要为人参皂苷、人参多糖等，成分复杂，生物活性广泛，药理作用独特，具有抗癌和抗肿瘤，调节中枢神经系统及心脑血管，改善消化系统促进代谢，提高免疫力，抗衰老以及益智等功效。

现今药理研究表明，人参稀有皂苷Rk₃对肝癌细胞有明显抑制作用，也可用于防治血管新生疾病，并对毛细血管扩张症也有较好疗效，然而原人参中人参稀有皂苷Rk₃含量很低，且因其结构比较复杂，利用现有的科学技术无法实现化学上的全合成，目前制备人参稀有皂苷Rk₃的方法多为化学高温高压裂解法、普通分离纯化法和人参三醇型皂苷生物转化法。但是，化学高温高压裂解法反应复杂、副反应多、反应条件难以控制；普通分离纯化法，提取效率低，无法得到大量人参稀有皂苷Rk₃；人参三醇型皂苷生物转化法，底物成本高，对人参总皂苷利用率低。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种制备人参稀有皂苷Rk₃的方法，使得所述方法能够以原人参药材为原料，获得高含量的人参稀有皂苷Rk₃。

为了实现上述发明目的，本发明提供了如下技术方案：

一种制备人参稀有皂苷Rk₃的方法，制备冬虫夏草种子液，然后接种至灭菌后的原人参药材上培养至长满菌丝(培养瓶瓶底长满菌丝)，将长满菌丝的原人参药材取出，干燥，获得含有人参稀有皂苷Rk₃的初级产物，分离纯化初级产物获得人参稀有皂苷Rk₃。

作为优选，所述制备冬虫夏草种子液为：

在菌种培养基中接种冬虫夏草菌种，恒温振荡培养至种子液浑浊黏稠呈淡黄色。其中，所述菌种培养基配方为：

葡萄糖1.9-2.1％，KH₂PO₄0.09-0.11％，MgSO₄0.09-0.11％，蛋白胨 0.45-0.55％，酵母粉0.18-0.22％，维生素B₁ 0.09-0.11％，余量水，pH自然(％为质量百分比)；

在本发明具体实施方式中，所述菌种培养基配方为：

葡萄糖2％，KH₂PO₄ 0.1％，MgSO₄ 0.1％，蛋白胨0.5％，酵母粉0.2％，维生素B₁0.1％，pH自然；

所述恒温振荡培养的条件优选为：150r/min，26±1℃，湿度60±1％。

作为优选，所述种子液与原人参药材的体积质量比为(0.5-1)mL：1g，即每1g原人参药材对应0.5-1mL的冬虫夏草种子液；在本发明具体实施方式中，所述种子液与原人参药材的体积质量比为0.5mL：1g、0.8mL：1g或1mL： 1g。

作为优选，所述冬虫夏草菌种在原人参药材上培养的温度为24-26℃，更具体地为24℃、25℃或26℃。

作为优选，所述原人参药材在接种冬虫夏草菌种前进行70℃烘干，粉碎，粉末过10目筛不过60目筛，高压蒸汽灭菌，待冷却后，获得待接种的原人参药材。

为了能够获得单体化合物，本发明将初级产物分离纯化，具体的分离纯化方法为：

将初级产物用乙醇加热回流提取，回收溶剂并挥干至无醇味后用水混悬，再依次经石油醚、乙酸乙酯顺序萃取，保留乙酸乙酯层，回收溶剂，得乙酸乙酯层浸膏；

取乙酸乙酯层浸膏加入甲醇使其溶解，然后与硅胶拌匀并烘干，利用硅胶色谱柱用梯度浓度的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，洗脱液经检识得到富含人参皂苷Rk₃的部分；

再将富含人参皂苷Rk₃的部分通过开放式ODS柱用梯度浓度甲醇进行梯度洗脱，洗脱液经检识再次得到富含人参皂苷Rk₃的部分，将此部分通过半制备液相，制备得到高纯度人参皂苷Rk₃单体化合物。

其中，初级产物用乙醇加热回流提取具体为初级产物用7-8倍量70％-75％乙醇加热回流提取3-4次，每次2-2.5小时；

作为优选，所述加入甲醇溶解的乙酸乙酯层浸膏与硅胶的体积比为1:1。所述硅胶粒度为100-200目，色谱柱口径8厘米，柱高75厘米；所述梯度浓度的二氯甲烷-甲醇包括体积比为100:0的二氯甲烷-甲醇、100:2的二氯甲烷- 甲醇、100:5的二氯甲烷-甲醇、100:10的二氯甲烷-甲醇、100:20的二氯甲烷- 甲醇和100:50的二氯甲烷-甲醇。

作为优选，所述开放式ODS柱选用40-60μmODS填料，色谱柱口径3厘米，柱高40厘米；所述梯度浓度甲醇包括纯水、30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇和纯甲醇。

作为优选，所述半制备液相以甲醇(优选浓度77％)为流动相，流速 1.2mL/min，检测波长203nm，收集65min物质为人参皂苷Rk₃。

本发明采用包括冬虫夏草在内的十三种药用真菌进行初级产物Rk₃含量对比试验，结果显示，牛肝菌、大青菇、树鸡、香菇1500、灰树花和白树花未发出；木耳、树舌生长状态欠佳；对生长状态良好的平菇、杏鲍菇、白灵菇、冬虫夏草、云芝的初级发酵产物中Rk₃含量进行测定，发现冬虫夏草的人参发酵产物Rk₃含量明显高于原人参以及其他菌种发酵产物。

由以上技术方案可知，本发明将药用真菌冬虫夏草与原人参药材联合发酵生产人参皂苷Rk₃，由此确定了能够制备高含量人参皂苷Rk₃的简便工艺，相比原人参药材中人参皂苷Rk₃含量提高了22倍。本发明方法能有效直接利用原人参药材，减少前期提取纯化步骤，反应条件温和可控，Rk₃产量大，纯度高。

附图说明

图1所示为人参皂苷Rk₃半制备液相图谱。

具体实施方式

本发明公开了一种制备人参稀有皂苷Rk₃的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在本发明各项对比试验中，各组除去应有的差别外，其余试验环境和材料保持一致。为了与原人参药材相比，本发明对原人参药材中的Rk₃含量进行测定，结果为0.0429％，具体实施方式中所采用的原人参药材均为此原人参药材。

以下就本发明所提供的一种制备人参稀有皂苷Rk₃的方法做进一步说明。

实施例1：不同药用真菌对工艺的影响

利用十三种药用真菌(牛肝菌、木耳、香菇1500、平菇、杏鲍菇、大青菇、白灵菇、树鸡、树舌、云芝、冬虫夏草、灰树花、白树花)与人参按照本发明工艺(各菌种工艺条件相同)进行发酵制备初级产物，对各药用真菌的生长状态和初级产物中Rk₃含量进行测定，结果见表1和表2；

表1

表2

菌种	RK<sub>3</sub>含量％
		原人参药材	0.0429
平菇	0.1309
		杏鲍菇	0
白灵菇	0
		冬虫夏草	0.7221
云芝	0.2075

由表1和表2可以看出，牛肝菌、大青菇、树鸡、香菇1500、灰树花和白树花未发出，木耳、树舌生长状态欠佳，这些菌种并不适合本发明工艺，也无法提高RK₃含量；

平菇、杏鲍菇、白灵菇、冬虫夏草、云芝虽都发展良好，但发现冬虫夏草的人参发酵产物Rk₃含量明显高于原人参以及其他菌种发酵初级产物。

实施例2：本发明最佳工艺条件的优化

以原人参药材的初始含水量、种子液和原人参药材的体积质量比以及培养温度为影响因素进行优化，其他条件相同，结果见表3-5；

表3因素水平表

表4正交实验及结果

表5综合评分方差分析表

F_1-0.10(2,2)＝9.00F_1-0.05(2,2)＝19.00F_1-0.01(2,2)＝99.00

由表3-5的结果可以看出，在本发明工艺条件下，相对于原人参药材均能够显著提高RK₃含量；从工艺条件的影响因素上看，影响制备工艺的因素的主次顺序为：种子液V(ml)︰原人参药材m(g)>原人参药材初始含水量％>培养温度(℃)，种子液V(ml)︰原人参药材m(g)对产物RK₃含量有显著影响，综合考虑，确定最佳发酵条件为：A₂B₃C₃，即含水量60％，种子液V(ml)︰原人参药材m(g)＝1:1，培养温度26℃。

实施例3：在本发明最佳工艺条件制备人参皂苷Rk₃

种子液的配置：培养基配方为葡萄糖2％，KH₂PO₄0.1％，MgSO₄0.1％，蛋白胨0.5％，酵母粉0.2％，维生素B₁0.1％，pH自然。以上物质置于大烧杯中，加入适量的水制成种子液，待种子液冷却后，分装于250ml广口瓶中，包扎后置于压力蒸汽灭菌器中，于121℃灭菌30分钟。待冷却后，在无菌操作台中接入保存好的斜面3-4块冬虫夏草菌种。将接有斜面菌种的液体培养基放入恒温振荡培养箱中，以150r/min，26℃，湿度60％的条件下避光培养4-5天，待种子液浑浊黏稠呈淡黄色时，取出备用。

原人参药材前处理：取原人参药材，烘干，粉碎，粉末过10目筛不过60 目筛，加入1.5倍水至原人参药材初始含水量为60％，混合均匀后置于三角瓶内，121℃高压蒸汽灭菌两次，每次30分钟；

在无菌操作台接入摇瓶种子液，在恒温培养箱内26℃，湿度60％避光培养，至菌丝布满容器底部为止，将其取出并干燥，得到初级产物。

提取人参皂苷Rk₃：将发酵初级产物用7-8倍量70％-75％乙醇加热回流提取3-4次，每次2-2.5小时，回收溶剂并挥干至无醇味后用适量水混悬，再经 1-1.2倍体积石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇顺序萃取，各萃取层Rk₃含量如下表(根据下表实际中只需进行到乙酸乙酯萃取即可)；

表6

人参皂苷Rk₃分离纯化：保留乙酸乙酯层，回收溶剂，得到相对密度 1.21-1.25(80℃-85℃)浸膏，取乙酸乙酯层浸膏加入甲醇使其溶解，浸膏：硅胶＝1:1拌匀烘干，再利用硅胶色谱柱(硅胶粒度为100-200目，色谱柱口径8 厘米，柱高75厘米)进行梯度洗脱(二氯甲烷-甲醇100:0、100:2、100:5、 100:10、100:20、100:50)，洗脱液经硅胶GF254薄层检识得到富含人参皂苷 Rk₃部分。再将此部分通过开放式ODS柱(40-60μmODS填料，色谱柱口径3 厘米，柱高40厘米)用不同浓度甲醇进行梯度洗脱(纯水→30％甲醇→50％甲醇→70％甲醇→纯甲醇)，洗脱液经硅胶GF254薄层检识再次得到富含人参皂苷Rk₃部分，将此部分通过半制备液相，以77％甲醇为流动相，流速 1.2mL/min，检测波长203nm，收集65min物质制备得到高纯度人参皂苷Rk₃单体化合物(半制备液相图谱见图1)。

人参皂苷Rk₃结构确认：白色粉末(甲醇)，易溶于甲醇，乙醇，水，不溶于乙醚，苯，10％硫酸乙醇溶液显紫红色，Molish反应呈阳性， Liebermann-Burchard反应呈阳性，推测其可能为三萜皂苷类化合物。

核磁数据如下表：

表7 ¹H-NMR(C₅D₅N,500MHz)与¹³C-NMR(C₅D₅N,150MHz)数据

¹H-NMR(C₅D₅N，500MHz)谱中高场区给出7个角甲基质子信号δ_H0.82 (3H,s,H-30)，1.03(3H,s,H-19)，1.22(3H,s,H-18)，1.57(3H,s,H-29)，1.59(3H, s,H-27)，1.65(3H,s,H-26,)，2.07(3H,s,H-28)；3个连氧碳上的质子信号δ_H 3.58 (1H,m)，4.51(1H,m)，3.94(1H,m)；两对碳碳双键，3个烯烃质子信号δ_H5.10 (1H,s)，4.88(1H,s)，5.27(1H,t,J＝5.0Hz)；1个糖的端基质子信号δ_H5.02(1H,d, J＝8.0Hz,H-1')。

¹³C-NMR(C₅D₅N，150MHz)谱中给出36个碳信号，高场区给出7个角甲基碳信号δ_C18.1(C-18)，18.1(C-19)，26.1(C-26)，17.7(C-27)，32.1(C-28)， 16.7(C-29)，17.1(C-30)；3个连氧碳信号δ_C79.0(C-3)，80.4(C-6)，72.8(C-12)； 4个烯碳信号δ_C155.8(C-20)，108.5(C-21)，125.7(C-24)，131.6(C-25)；其中δ_C61.9(C-5)为三醇型皂苷的特征信号，化合物为达玛烷三醇型三萜类化合物。结合¹H-NMR中相应的糖端基信号表明化合物中存在1组葡萄糖，信号为δ_C106.4(C-1')，75.9(C-2')，80.1(C-3')，72.2(C-4')，78.5(C-5')，63.5(C-6')。以上波谱数据与人参皂苷Rk₃基本一致，结合理化性质，确定化合物为人参皂苷Rk₃，分子式为C₃₆H₆₀O₈。

实施例4：最佳工艺条件下与原人参药材的初级产物对比

按照实施例3中的工艺制备初级产物，并检测人参皂苷Rk₃，结果见表8。

表8

样品	人参皂苷RK<sub>3</sub>含量(％)
		原人参药材	0.0429
初级产物	0.9508

由表8可以看出，在最佳的工艺条件下，本发明方法制备的初级产物中人参皂苷Rk₃高达0.9508％，相对于原人参药材提高了22倍之多。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种制备人参稀有皂苷Rk₃的方法，其特征在于，在菌种培养基中接种冬虫夏草菌种，150 r/min、26±1 ℃、湿度60±1%恒温振荡培养至种子液浑浊黏稠呈淡黄色，获得冬虫夏草种子液，然后接种至灭菌后的原人参药材上培养至长满菌丝，将长满菌丝的原人参药材取出，干燥，获得含有人参稀有皂苷Rk₃的初级产物，分离纯化初级产物获得人参稀有皂苷Rk₃；

所述种子液与原人参药材的体积质量比为（0.8-1）mL：1g；所述培养的温度为24-26℃；

所述原人参药材在接种冬虫夏草菌种前进行前处理：取原人参药材，烘干，粉碎，加水至原人参药材初始含水量为50-70%。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述菌种培养基配方为：

葡萄糖1.9-2.1%，KH₂PO₄ 0.09-0.11%，MgSO₄ 0.09-0.11%，蛋白胨0.45-0.55%，酵母粉0.18-0.22%，维生素B₁ 0.09-0.11%，pH自然。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述分离纯化初级产物为：

将初级产物用乙醇加热回流提取，回收溶剂并挥干至无醇味后用水混悬，再依次经石油醚、乙酸乙酯顺序萃取，保留乙酸乙酯层，回收溶剂，得乙酸乙酯层浸膏；

取乙酸乙酯层浸膏加入甲醇使其溶解，然后与硅胶拌匀并烘干，利用硅胶色谱柱用梯度浓度的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，洗脱液经检识得到富含人参皂苷Rk₃的部分；

再将富含人参皂苷Rk₃的部分通过开放式ODS柱用梯度浓度甲醇进行梯度洗脱，洗脱液经检识再次得到富含人参皂苷Rk₃的部分，将此部分通过半制备液相，制备得到高纯度人参皂苷Rk₃单体化合物。

4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述加入甲醇溶解的乙酸乙酯层浸膏与硅胶的体积比为1:1。

5.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述梯度浓度的二氯甲烷-甲醇包括体积比为100:0的二氯甲烷-甲醇、100:2的二氯甲烷-甲醇、100:5的二氯甲烷-甲醇、100:10的二氯甲烷-甲醇、100:20的二氯甲烷-甲醇和100:50的二氯甲烷-甲醇。

6.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述梯度浓度甲醇包括纯水、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇和纯甲醇。

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