CN109022512A - 一种生物合成Hispidin的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生物合成Hispidin的方法。本发明提供了一种生物合成Hispidin的方法,包括如下步骤:以火木层孔菌培养液的上清液作为生物合成体系,在所述生物合成体系中加入4‑羟基‑6‑甲基‑2‑吡喃酮或4‑羟基‑6‑甲基‑2‑吡喃酮和3,4‑二羟基苯甲醛进行反应,即得到Hispidin。本发明提供的hispidin的生物合成方法,污染少,得率高,得到最大产量的hispidin,浓度为25.86mg/L。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,尤其涉及一种生物合成Hispidin的方法。
背景技术
Hispidin(6-[(E)-2-(3,4-dihydroxyphenyl)ethenyl]-4-hydroxypyran-2-one)(化合物结构见式1)是真菌中常见的具有抗氧化作用的多酚类化合物,于1961年首次从粗毛黄褐孔菌(Polyporus hispidus Bull.:Fr)分离得到。研究表明,hispidin广泛存在于药食两用菌中,具有抗糖尿病、抗病毒以及抗A549,SCL-1,Bel7402和Capan-1等肿瘤细胞活性,并有大量研究集中在抗肿瘤和抗氧化作用机制方面。以hispidin为关键前体物质合成的衍生物在大型药用真菌中普遍存在,大部分具有较强的抗氧化、抗炎以及抗肿瘤等活性。鉴于hispidin衍生物结构独特及较强的抗氧化活性,这类成分一直吸引众多研究者们的关注,并有学者认为hispidin衍生物是药用真菌中抗氧化作用最重要的药效物质基础。
火木层孔菌(Phellinus igniarius)属担子菌亚门、多孔菌科、木层孔菌属,又称鲍氏层孔菌。其子实体——桑黄是我国传统药用真菌,味甘、辛、无毒,寄生于桑、柳、桦及杨等树的树干上,为多年生。桑黄除了具有传统的治疗淋病、崩漏、带下、排毒、和胃止泻等功效外,还具有抗癌、抗脂质过氧化、免疫调节、保肝、抗肝硬化和抗诱变等药用功能。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种生物合成Hispidin的方法。
本发明提供的方法,包括如下步骤:用火木层孔菌或其培养液或其发酵液催化底物4-羟基-6-甲基-2-吡喃酮,得到Hispidin;
或用火木层孔菌或其培养液或其发酵液催化底物4-羟基-6-甲基-2-吡喃酮和3,4-二羟基苯甲醛,得到Hispidin。
上述方法包括如下步骤:向火木层孔菌的培养液或其培养液的上清液中加入4-羟基-6-甲基-2-吡喃酮或4-羟基-6-甲基-2-吡喃酮和3,4-二羟基苯甲醛进行反应,得到Hispidin。
上述方法中,所述4-羟基-6-甲基-2-吡喃酮在其所在体系中的浓度为0.02-0.5mg/mL;
或,所述4-羟基-6-甲基-2-吡喃酮在其所在体系中的浓度为0.5mg/mL或0.1mg/mL。
上述方法中,所述3,4-二羟基苯甲醛在其所在体系中的浓度为0.1mg/mL。
上述方法中,所述火木层孔菌的培养液为培养火木层孔菌得到的培养液;
所述培养时间为15-25天。
上述方法中,所述火木层孔菌的培养液为培养火木层孔菌得到的培养液;
所述培养时间为15天到20天。
上述方法中,所述反应的时间为20小时-10天。
上述方法中,所述反应的时间为60小时。
上述方法还包括如下步骤:
若采用火木层孔菌的培养液的上清液,则将所述反应的产物用乙酸乙酯萃取,得到Hispidin;
若采用火木层孔菌的培养液,则先将所述反应的产物过滤菌丝体,再用乙酸乙酯萃取,得到Hispidin。
由上述方法制备的Hispidin也是本发明保护的范围。
本发明提供hispidin的生物合成方法,该方法污染少,得率高。
附图说明
图1为培养后的TLC分析结果。
图2为hispidin的HPLC图谱。
图3为hispidin的NMR图谱。
图4为Hispidin标准曲线。
图5为4-羟基-6-甲基吡喃酮标准曲线。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
下述实施例中Hispidin的生物合成过程如下:
实施例1、生物合成Hispidin
采用培养火木层孔菌20天的液体培养液作为生物催化体系,加入4-羟基-6-甲基-2-吡喃酮和3,4-二羟基苯甲醛继续培养24h,经分离纯化和NMR鉴定后,得到活性化合物hispidin,且从1H NMR谱中质子积分可知trans/cis hispidin各占50%;具体见下面描述。
一、生物合成方法
1、生物合成体系的制备
采用液体马丁培养基【葡萄糖(20g/L)、蛋白胨+酵母粉(7g/L)、磷酸氢二钾(1g/L)、无水硫酸镁(0.5g/L),pH自然】30℃摇床震荡培养火木层孔菌(中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC NO.5.95)20天,培养液离心(常温4000rpm离心15分钟)后,取培养液上清20mL分装到50mL锥形瓶中作为生物合成体系。
2、生物合成
实验分为如下几组:
实验组:含有上述1得到的20mL生物合成体系内投入2mL原始溶液浓度为1mg/mL的前体化合物:4-羟基-6-甲基-吡喃酮和3,4-二羟基苯甲醛,使4-羟基-6-甲基-吡喃酮和3,4-二羟基苯甲醛在培养液中的终浓度均达到约0.1mg/mL;
菌液对照组:含有上述1得到的20mL生物合成体系培养液;
菌液加4-羟基-6-甲基-吡喃酮对照组:向含有上述1得到的20mL生物合成体系内投入2mL原始溶液浓度为1mg/mL的前体化合物4-羟基-6-甲基-吡喃酮,使4-羟基-6-甲基-吡喃酮在培养液中的终浓度达到约0.1mg/mL;
菌液加3,4-二羟基苯甲醛对照组:向含有上述1得到的20mL生物合成体系内投入4mL原始溶液浓度为1mg/mL的前体化合物3,4-二羟基苯甲醛,使3,4-二羟基苯甲醛在培养液中的终浓度达到约0.1mg/mL;
将上述各组在摇床培养继续反应10天,收集培养液。
乙酸乙酯常温萃取培养液(体积比1:1)三次,收集乙酸乙酯萃取产物,浓缩后检测。
3、检测
1)TCL检测
TCL检测上述2得到的乙酸乙酯萃取产物,结果如图1(展开剂石油醚:丙酮=5:3)所示,图1A提示实验组除去原始菌液里面主要成分和投入的底物,实验组内有明显的hispidin斑点;图1B提示菌液+4-羟基-6-甲基-吡喃酮对照组中也有hispidin产生,说明火木层孔菌培养体系中能够提供3,4-二羟基苯甲醛;图1C说明仅向菌液中投入3,4-二羟基苯甲醛时,没有hispidin产生。
2)HPLC-DAD检测
取2mL甲醇溶解上述2得到的乙酸乙酯萃取物,再用1mL注射器吸取0.1mL的样品,并甲醇稀释至1mL,0.22μm的滤膜过滤样品。安捷伦1220,Agilengt XDB-C18分析柱,流动相:20%-70%甲醇(0.2%甲酸水)梯度洗脱25min,254nm检测。
结果如图2所示,A为4-羟基-6-甲基-吡喃酮(8.2min)和hispidin(18.5min)标准品的HPLC图谱;B为3,4-二羟基苯甲醛的HPLC图谱(8.0min);C为菌液对照组的HPLC图谱;D为菌液加3,4-二羟基苯甲醛对照组的HPLC图谱;E为菌液加4-羟基-6-甲基-吡喃酮对照组;F为实验组HPLC图谱;G为实验组HPLC图谱与4-羟基-6-甲基-吡喃酮和hispidin标准品色谱峰对照图谱。
检测结果表明:当投入化合物为4-羟基-6-甲基-吡喃酮和3,4-二羟基苯甲醛时,有hispidin产生(图2E),仅投入4-羟基-6-甲基-吡喃酮时也有hispidin产生,且产量和实验组相似(图2F)。其他对照组中未检测到hispidin。
3)NMR鉴定
采用Sephadex LH-20柱层析(凝胶柱柱子高度30cm,直径1.5cm)对上述2得到的实验组的乙酸乙酯萃取物进行分离,洗脱剂为纯甲醇。
实验组的结果的NMR鉴定结果如图3所示,trans/cis-hispidin的NMR图谱;(a)1HNMR(b)13C NMR;,在4-羟基-6-甲基-吡喃酮和3,4-二羟基苯甲醛的生物合成脱水的过程中分别形成了顺式和反式双键,因此产生trans-Hispidin(6-[(E)-2-(3,4-dihydroxyphenyl)ethenyl]-4-hydroxypyran-2-one)及cis-Hispidin(6-[(Z)-2-(3,4-dihydroxyphenyl)ethenyl]-4-hydroxypyran-2-one)两个化合物。且从1H NMR中质子积分来看,两个化合物各占50%。
二、生物合成条件优化
由于上述实验证实,在火木层孔菌培养体系中仅加入4-羟基-6-甲基-吡喃酮,也会有hispidin产生,且不影响产率,说明火木层孔菌培养体系中能够提供3,4-二羟基苯甲醛。因此,以火木层孔菌培养时间(A)、4-羟基-6-甲基-吡喃酮投入量(B)和投入之后反应时间(C)三个影响因素,各设三个水平优化培养条件。
1、优化
采用马丁液体培养基、30℃摇床震荡培养火木层孔菌不同时间(A),收集培养液,取含有菌丝体的培养液作为生物合成体系。向含有培养不同时间的生物合成体系内投入不同终浓度(B)的前体化合物4-羟基-6-甲基-吡喃酮,继续摇床震荡培养进行反应不同时间(C),收集反应产物。八层纱布过滤反应产物的菌丝体,1:1乙酸乙酯萃取培养液三次,收集乙酸乙酯萃取物,合并萃取液浓缩成浸膏状,用于后期检测。
通过L9(34)正交表设计实验。
表1三个因素和三个水平
表2 L9(34)正交表
表3实验设置分组
2、HPLC检测
①标准曲线的绘制
分别取浓度0.015625,0.03125,0.0625,0.125,0.25,0.5,1mg/mL的Hispidin和浓度分别为0.125,0.3125,0.5,2,8mg/mL的4-羟基-6-甲基吡喃酮进行标准曲线的绘制。
③液相分析
分别采用2mL甲醇溶解样品,从中吸取0.1mL用甲醇稀释至1mL,0.22μm的滤膜过滤样品至液相小瓶。安捷伦1220,Agilengt XDB-C18分析柱,液相条件:20%-70%甲醇(0.2%甲酸水)梯度洗脱25min,254nm。
通过HPLC测定,Hispidin和4-羟基-6-甲基吡喃酮的标准曲线见图4和图5。根据标准曲线,计算得出9组实验中hispidin的含量见表4。
表4各组中hispidin的含量(单位:mg/L)
因此,由hispidin产量可知,最佳组合条件是A1,B3,C3(组3),即在火木层孔菌培养15天时的培养液作为生物合成的酶体系、投入4-羟基-6-甲基吡喃酮的终浓度为0.5mg/mL、继续反应时间为60h时,得到最大产量的hispidin,浓度为25.86mg/L。
通过极差计算可知,影响hispidin产量的的因素最重要的是底物浓度,其次是投入培养周期,最后是反应时间。
Claims (10)
1.一种生物合成Hispidin的方法,包括如下步骤:用火木层孔菌或其培养液或其发酵液催化底物4-羟基-6-甲基-2-吡喃酮,得到Hispidin;
或用火木层孔菌或其培养液或其发酵液催化底物4-羟基-6-甲基-2-吡喃酮和3,4-二羟基苯甲醛,得到Hispidin。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:
所述方法包括如下步骤:向火木层孔菌的培养液或其培养液的上清液中加入4-羟基-6-甲基-2-吡喃酮或4-羟基-6-甲基-2-吡喃酮和3,4-二羟基苯甲醛进行反应,得到Hispidin。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:所述4-羟基-6-甲基-2-吡喃酮在其所在体系中的浓度为0.02-0.5mg/mL;
或,所述4-羟基-6-甲基-2-吡喃酮在其所在体系中的浓度为0.5mg/mL或0.1mg/mL。
4.根据权利要求2或3所述的方法,其特征在于:所述3,4-二羟基苯甲醛在其所在体系中的浓度为0.1mg/mL。
5.根据权利要求2-4中任一所述的方法,其特征在于:
所述火木层孔菌的培养液为培养火木层孔菌得到的培养液;
所述培养时间为15-25天。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于:所述培养时间为15天到20天。
7.根据权利要求2-6中任一所述的方法,其特征在于:所述反应的时间为20小时-10天。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于:所述反应的时间为60小时。
9.根据权利要求2-8中任一所述的方法,其特征在于:
所述方法还包括如下步骤:
若采用火木层孔菌的培养液的上清液,则将所述反应的产物用乙酸乙酯萃取,得到Hispidin;
若采用火木层孔菌的培养液,则先将所述反应的产物过滤菌丝体,再用乙酸乙酯萃取,得到Hispidin。
10.由权利要求1-9任一所述方法制备的Hispidin。
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