CN115466732A - 用于制备Hispidin的重组蛋白及其应用 - Google Patents

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张小敏
江雨涵
马鹏生
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刘成
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Abstract

本发明提供一种蛋白质，所述蛋白质为A1)或A2)或A3)或A4)，A1)由SEQ ID No.2的氨基酸序列组成的蛋白质；A2)由SEQ ID No.2第13‑670位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；A3)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)或A2)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；A4)在A1)或A2)或A3所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白。上述蛋白质及其相关的生物材料可用于hispidin的生物合成。

Description

用于制备Hispidin的重组蛋白及其应用
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及用于制备Hispidin的重组蛋白及其应用。
背景技术
Hispidin是真菌中常见的具有抗氧化作用的色素类化合物，以其作为前体物质合成的色素类活性成分在各类真菌的代谢产物中不断被发现，化合物数量不断增加，大部分具有较强的抗氧化活性，并且能够有效预防由氧化应激引起的人类疾病。
且到目前为止，聚酮途径是合成hispidin及其衍生物的关键步骤，因此，若能在清楚该类成分生源合成途径的基础上，通过分子生物学手段，进行大片段基因的克隆、表达载体的构建以及异源表达，以期得到新的化合物，同时依据基因组信息来挖掘次生代谢产物，并为进一步探究沉默或低表达基因在生物合成方面的潜力奠定一定的研究基础，对全面了解和掌握其代谢途径与生物合成机制有十分重要的理论与实践意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，如何实现hispidin的生物合成。
为解决上述技术问题，本发明提供一种蛋白质，所述蛋白质为A1)或A2)或A3) 或A4)：
A1)由SEQ ID No.2的氨基酸序列组成的蛋白质；
A2)由SEQ ID No.2第13-670位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
A3)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)或A2)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
A4)在A1)或A2)或A3)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白。
上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc 标签、GST标签和/或SUMO标签等。
上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有 Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
上述蛋白质中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
本发明同时提供与上述蛋白质相关的生物材料，所述生物材料为下述B1)至B4)中的任一种：
B1)编码上述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组受体生物或含有B2)所述表达盒的重组受体生物、或含有B3)所述重组载体的重组受体生物。
进一步地，上述生物材料中，B1)所述核酸分子为如下任一种DNA分子：
b1)编码序列是SEQ ID No.1的DNA分子；
b2)核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子；
b3)编码序列是SEQ ID No.1的第37-2013位所示的DNA分子；
b4)核苷酸序列是SEQ ID No.1的第37-2013位所示的DNA分子。
本发明还提供制备上述蛋白质的方法，该方法包括使用上述蛋白质的编码基因在生物中进行表达得到所述蛋白质的步骤，所述生物为微生物、植物或非人动物。
进一步地，上述方法中所述微生物为原核微生物。
进一步地，上述原核微生物可为革兰氏阴性细菌。
进一步地，上述革兰氏阴性细菌可为埃希氏菌属细菌。
进一步地，上述埃希氏菌属细菌可为大肠杆菌。
本发明同时提供上述蛋白质在制备hispidin中的应用。
本发明还提供上述生物材料在制备hispidin中的应用。
本发明提供Hispidin生物合成的关键蛋白质及其编码基因，并在生物信息学、生化分析和异源表达研究的基础上，进一步提出了Hispidin生物合成机制。本发明的重组蛋白pheG能够以4-羟基-6-甲基-2-吡喃酮和3,4-二羟基苯甲醛为底物合成Hispidin。
附图说明
图1为重组表达载体pCzn1-GME6982完整质粒图谱。
图2为重组表达载体pCzn1-GME6982NdeI/XbaI双酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳结果。其中左起第1泳道为Marker为:250，500，750，1000，1500，2000，2500，3000， 4000，5000，6000，8000，12000bp；左起第2泳道为pCzn1-GME6982的NdeI和XbaI 双酶切产物；左起第3泳道为pCzn1-GME6982。
图3为pheG蛋白表达鉴定SDS-PAGE结果。箭头所示为pheG蛋白条带，其中：M 表示蛋白质分子质量标准(Thermo公司)；1代表未诱导重组大肠杆菌Arctic ExpressTM/pCzn1-GME6982的菌体破碎液，2代表诱导后重组大肠杆菌Arctic ExpressTM/pCzn1-GME6982的菌体破碎液；3代表诱导后重组大肠杆菌Arctic ExpressTM/pCzn1-GME6982的菌体破碎后上清液；4代表诱导后重组大肠杆菌Arctic ExpressTM/pCzn1-GME6982的菌体破碎后沉淀液。
图4为pheG蛋白纯化鉴定SDS-PAGE结果，其中：箭头所示为pheG蛋白条带，其中：M代表蛋白质分子质量标准；1代表破碎后处理样品；2代表流出样品；3-4代表洗脱后样品。
图5为pheG蛋白纯化后Western Blot鉴定。箭头所示为pheG蛋白，其中：M代表蛋白质分子质量标准；1代表纯化后样品。
图6为pheG蛋白纯化后SDS-PAGE鉴定。箭头所示为pheG蛋白，其中：M代表蛋白质分子质量标准；1代表0.5mg/ml BSA溶液；2代表纯化的pheG蛋白。
图7A为Hispidin合成反应总产物的TLC检测结果，紫外256nm下的照片。1为Hispidin标准品，2为反应后总产物。
图7B为凝胶分离得到的Hispidin的TLC检测结果，紫外256nm下的照片。1为Hispidin标准品，2为凝胶分离得到的Hispidin。
图8为Hispidin的1H-NMR图谱鉴定。
图9为Hispidin的13C-NMR图谱鉴定。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的pCzn1、大肠杆菌表达菌株Arctic-ExpressTM和大肠杆菌TOP10 菌株为钟鼎生物产品。实施例给出本发明中试剂、耗材的来源信息以及仪器设备的类型信息，应当注意的是上述信息仅是示例性说明而非对本发明试剂、耗材及所用仪器的限制。
实施例1、基因GME-6982的合成与载体构建
1.1、基因GME-6982的合成
采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法，设计全长拼接引物，在引物的两端各设计了保护性碱基合成基因GME-6982，连入载体pCzn1的NdeI和XbaI 位点之间；获得的重组表达载体pCzn1-GME6982转入TOP10克隆菌株。
1.2、pCzn1-GME-6982测序验证
采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法，设计全长拼接引物，将获得的重组表达载体pCzn1-GME6982转入TOP10克隆菌株，挑取阳性克隆子测序，测序结果表明pCzn1-GME6982是用核苷酸序列为SEQ ID No.1的第37-2013位所示的 GME-6982基因替换pCzn1的NdeI和XbaI识别位点间的片段，保持pCzn1的其它序列不变得到的重组表达载体。pCzn1-GME6982含有带His标签的重组蛋白pheG基因，重组蛋白pheG基因的核苷酸序列是SEQ ID No.1，编码氨基酸序列是SEQ ID No.2所示的重组蛋白pheG。
1.3、重组表达载体的酶切鉴定
将重组表达载体pCzn1-GME6982进行NdeI和XbaI双酶切鉴定，酶切体系如下：pCzn1-GME-6982：3μL，内切酶1：0.25μL，内切酶2：0.25μL，10×Buffer：1.0μL， DDW up to10μL。重组表达载体pCzn1-GME6982的图谱如图1所示。重组表达载体 pCzn1-GME6982酶切琼脂糖凝胶电泳分析结果如图2所示。
实施例2、目的基因的小量诱导表达
2.1、将实施例1中的pCzn1-GME6982转化至大肠杆菌Arctic ExpressTM,得到重组大肠杆菌Arctic ExpressTM/pCzn1-GME6982：
2.1.1、将pCzn1-GME69821μL加入100μL感受态重组大肠杆菌Arctic ExpressTM/pCzn1-GME6982中，置冰上20min。
2.1.2、42℃热激90sec，迅速置冰中5min，加入600μL LB培养液。
2.1.3、37℃，220r/min振摇1h，离心后全部涂布于含50μg/mL Amp或Kan 的LB平板，37℃倒置培养过夜。
2.2、IPTG诱导重组菌融合蛋白—pheG蛋白的表达2.2.1、挑取转化平板上的单克隆接种于含50μg/mL Amp的3mL LB培养液的试管中，37℃220r/min振摇过夜。
2.2.2、次日按1:100接种于50μg/mL Amp的30mL LB培养液中，37℃220r/min 振摇至菌体OD600为0.6-0.8。
2.2.3、取出1mL培养物，10000r/min室温离心2min，弃上清，用100μL 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀。
2.2.4、向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.5mM，37℃220r/min振摇 4h，诱导融合蛋白表达。
2.2.5、取出1mL培养物，10000r/min室温离心2min，弃上清，用100μL 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀。剩余培养物4000r/min，离心10min，弃上清，用PBS 重悬菌体沉淀；重悬液进行超声波破碎得到诱导后重组大肠杆菌Arctic ExpressTM/ pCzn1-GME6982的菌体破碎液(由诱导后重组大肠杆菌Arctic ExpressTM/ pCzn1-GME6982的菌体破碎后上清液和诱导后重组大肠杆菌Arctic ExpressTM/ pCzn1-GME6982的菌体破碎后沉淀液组成)，分别取上清液(诱导后重组大肠杆菌 Arctic ExpressTM/pCzn1-GME6982的菌体破碎后上清液)与沉淀液(诱导后重组大肠杆菌Arctic ExpressTM/pCzn1-GME6982的菌体破碎后沉淀液)加入上样缓冲液重悬。进行12％SDS-PAGE检测分析，考马斯亮蓝染色显带。
2.2.6、同时按照上述方法制备未诱导重组大肠杆菌Arctic ExpressTM/ pCzn1-GME6982的菌体破碎液、菌体破碎后上清液和菌体破碎后沉淀液，加入上样缓冲液重悬。进行12％SDS-PAGE检测分析，考马斯亮蓝染色显带。
pheG蛋白表达鉴定SDS-PAGE结果如图3所示。分析图3结果可知：未诱导重组大肠杆菌Arctic ExpressTM/pCzn1-GME6982不表达pheG蛋白，诱导后重组大肠杆菌 ArcticExpressTM/pCzn1-GME6982表达pheG蛋白，且诱导破碎后的上清和沉淀中都有 pheG蛋白，表明诱导后重组大肠杆菌Arctic ExpressTM/pCzn1-GME6982可稳定表达 pheG蛋白。
实施例3、目的基因的大量表达及纯化
3.1、将实施例2中的重组大肠杆菌Arctic ExpressTM/pCzn1-GME6982接种于5mL的LB+100μg/m L Amp液体培养基(LB+100μg/m L Amp液体培养基是向LB液体培养基中加入氨苄青霉素得到的液体培养基，LB+100μg/m L Amp液体培养基中氨苄青霉素的含量为100μg/m L)中，37℃，200rpm过夜培养，然后按1:100的比例转接至 300mL的LB+100μg/m L Amp液体培养基，37℃，200rpm培养至OD600nm为0.6,加入 IPTG至终浓度为0.5mM,37℃继续诱导4小时，诱导表达完成。
3.2、待诱导表达完成后，将菌液6000rpm离心5min，弃去液体培养基，再用超纯水洗2-3次，除尽培养基。
3.3、菌体称重，按照2g菌体加入10mL缓冲液的比例，将加入缓冲液后的菌体混匀后置于冰上，超声破碎。设定功率为45W，3s关，3s开，总超声时间8min。破碎完成后，4℃12000rpm离心10min，将上清液取出备用，该上清液即为诱导后重组大肠杆菌ArcticExpressTM/pCzn1-GME6982的菌体破碎后上清液。
3.4、组氨酸标签蛋白纯化
(1)利用低压层析系统(Biologic LP层析系统，美国BIO-RAD公司)，将步骤3 的诱导后重组大肠杆菌Arctic ExpressTM/pCzn1-GME6982的菌体破碎后上清液以0.5 mL/min流速上样至Ni-IDA Binding-Buffer(溶质及其浓度如下：20mM Tris、150mM NaCl，溶剂是水，pH 8.0的溶液)预平衡的Ni-IDA-Sepharose Cl-6B亲和层析柱(Ni-IDA 亲和层析胶，Novagen公司)。
(2)用Ni-IDA Binding-Buffer以0.5mL/min流速冲洗，至流出液OD 280nm 值到达基线。
(3)用Ni-IDA Washing-Buffer(溶质及其浓度如下：20mM Tris-HCl，30mM 咪唑，0.15M NaCl；溶剂是水，pH 8.0的溶液)以1mL/min流速冲洗，至流出液(流出样品)OD 280nm值到达基线。
(4)用Ni-IDA Elution-Buffer(溶质及其浓度如下：20mM Tris-HCl，250mM 咪唑，0.15M NaCl；溶剂是水，pH 8.0的溶液)以1mL/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液，该流出液为pheG蛋白溶液。
(5)上述收集的pheG蛋白溶液加入透析袋中，使用PBS进行透析过夜，得到纯化的pheG蛋白。
(6)将纯化的pheG蛋白溶液进行12％SDS-PAGE分析并采用抗His标签的羊抗鼠抗体为结合抗体DAB显色，进行Western-blot鉴定。
pheG蛋白纯化鉴定SDS-PAGE结果如图4所示，经组氨酸标签蛋白纯化得到纯化的pheG蛋白。
纯化的pheG蛋白Western Blot鉴定结果如图5所示，纯化的pheG蛋白SDS-PAGE 鉴定结果如图6所示，表明纯化的pheG蛋白的分子量为74KD。将纯化的pheG蛋白进行质谱分析其氨基酸序列，结果表明重组蛋白pheG蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2 所示。
实施例4、重组蛋白的功能验证
4.1、将实施例3得到的纯化的pheG蛋白进行酶促反应，具体方法如下：将5mg/mL的3,4-二羟基苯甲醛、5mg/mL的4-羟基-6-甲基-2-吡喃酮、5mg/mL的三磷酸腺苷和纯化的重组酶0.002mg/mL反应混合物，在50mM磷酸钾缓冲液(pH＝7.0)，终体积为100μL的体系中35℃孵育4h。
Figure RE-GDA0003226643050000071
酶促反应：4-羟基-6-甲基-2-吡喃酮+3,4-二羟基苯甲醛+ATP+pheG→Hispidin
4.2、反应产物Hispidin的分离纯化和结构鉴定
将酶促反应后的反应体系用乙酸乙酯等体积萃取3次，真空浓缩，甲醇溶解。采用Sephadex LH-20凝胶柱色谱对样品进行分离纯化，洗脱溶液为石油醚:二氯甲烷: 甲醇＝5:4:1(体积比)，分离过程中采用薄层色谱(TLC)检测(二氯甲烷:甲醇＝3:1 (体积比))，得到单一产物Hispidin，通过核磁共振(NMR)对目标化合物Hispidin 进行结构鉴定。
分离得到的Hispidin的TLC检测结果如图7A和图7B所示，图7A中1为Hispidin 标准品，2为反应后总产物；图7B中1为Hispidin标准品，2为经凝胶柱色谱纯化后的物质。该物质经由1H-NMR(图8)和13C-NMR(图9)谱图鉴定，结果显示经pheG蛋白参与的酶促反应合成产物确定为hispidin：
Figure RE-GDA0003226643050000072
1H NMR(400MHz,CD3OD),δH 11.68(1H,brs,OH-4),9.49(1H,brs,OH-12),9.10(1H,brs, OH-11),7.12(1H,d,J＝16.0Hz,H-8),7.02(1H,d,J＝2.0Hz,H-10),6.94(1H,dd,J＝8.4,2.0 Hz,H-14),6.75(1H,d,J＝8.4.0Hz,H-13),6.68(1H,d,J＝16.0Hz,H-7),6.15(1H,d,J＝2.0Hz, H-3),5.26(1H,d,J＝2.0Hz,H-5)；
13C NMR(100MHz,CD3OD),δC 170.8(C-2),163.5(C-4),160.2(C-6),147.8(C-12),146.0 (C-11),135.0(C-8),127.2(C-9),120.8(C-14),116.8(C-7),116.2(C-13),114.5(C-10),101.0 (C-5),89.7(C-3)。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 宁夏医科大学
<120> 用于制备Hispidin的重组蛋白及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2013
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaatcaca aagtgcatca tcatcatcat catatgagtg aaccggaagt gccgaaaagc 60
accaccagcg aaagttttaa tgatcatccg ctggaagaaa atctggaagc ccatgtgctg 120
agtaaagcat ttgatgaaga atgtgcagcc tttgcaaaaa cccataaaca tagcagcagt 180
agtagcgatg gtagcgatag cgatagtgat gaaaatagcc tgtggagcaa tggtgacacc 240
agcagtagcg tgagcagcgt ggaagttagc ccgcatgatg ttccgaaact ggaagcatat 300
ctgtattatg caggcctgag tggcccgagt ggccgtggtc ctaaactgat ctatcgtacc 360
agcagcgata aatttgttcc gccggatggc ccggaagcct atcgccgtct gatgaaactg 420
cgcaccgtgc cggaaaatca taaactgggc gaagatggcc tgtgggatcg tattcgtgca 480
gaagtggtga aactgctgga tcataccggc attcagctga gcagtgtgga tctggttcgt 540
tttacctggg tggaaaagaa tgatgatcag gaagatcagg aagaccagga agatcaagaa 600
gatcaggagg atcaggaagg ccaggaaggc caagaagaag atcaggaaga tgaagttaat 660
gttaattacg atgacatcgc cccgattaag ccggtggttg gtggcaccgt ttataccacc 720
ccggtgacca tttgggttgg cgtgatgccg gataccacca ccggtgaaca ggcatataat 780
agtagtcgtg atattctgga tctgctgcag cagtataata ttaccgatgt tgatgttgcc 840
tatcgcgaaa gtgaagttaa attttcagca ggtccggaac tgtttgcccc ggtgagcgat 900
ctggatccgc tgaaagatgt tattgatagc ctgagtaccc cgctgagcct gccgattgcc 960
ggcctgaaaa ccaaaatgca gggcaccctg ggtttttatt ttcgcattgg tgaagatctg 1020
tatgcagtta ccgcccgcca tgttctgttt aaagataatg aagccaatgt ggaatacaat 1080
tatgtggccg gtccgaaaaa aggcgttatt gtgatgggcc cgaatgcatt cactaatcat 1140
ctggcatttc tgcagagtac cattggcacc ctgctggata ccgccgaata tctggaaacc 1200
cgtgtgacca gtctgaccag cctggttgaa ggcggtggta gccgtgccga acagagtggt 1260
ctggaactgc cggaaaccca ggaacagctg accaaaaccc gtaccaaaat tgatgccctg 1320
aaagcacatt ttgtgaccgt gaaaaagaaa tggagtaaag caaaagatcg cgtgattggt 1380
catgtggtgt gggcaccgcc gattagcgtg gcaaccccgc cgcatcagta tacccaggat 1440
gtttgtgtga ttaagctgga taaagataaa ttccgccatt ttcgccgtaa tgtgctgagc 1500
ctgggtccgg aaattagtcc ggccaatttt aaaaaactga tgtatgatcg cttcaacgcc 1560
ccgcatgaat ttgtttatcc gccggaaggt ctgtttaaac tgcgtggtat tctgacccag 1620
gaagaaattc gtaccccgga tattaaggcc ccgcagccgc agggtgaccc gattcgtcgc 1680
gttattaagc gcggttttac caccctgacc accgtgggcg gcctgagtgg ttttctgagt 1740
tatgttcgtc gctattttgc caccggcaat attgatagtg ttgaagccgc aattctgccg 1800
cataataatg atagcggtcc gtttagccgc ggtggtgaca gtggtagtgt gattgtggat 1860
gcactgggtc gctttgtggc actgctgacc ggcggtaccg gtaaaaccga tagtagtgat 1920
attacctttg gtaccccgat gcattggctg tggctgctga ttctggccaa atttgatggt 1980
gcaaatctgt attgggatga tggcggcaat taa 2013
<210> 2
<211> 670
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Asn His Lys Val His His His His His His Met Ser Glu Pro Glu
1 5 10 15
Val Pro Lys Ser Thr Thr Ser Glu Ser Phe Asn Asp His Pro Leu Glu
20 25 30
Glu Asn Leu Glu Ala His Val Leu Ser Lys Ala Phe Asp Glu Glu Cys
35 40 45
Ala Ala Phe Ala Lys Thr His Lys His Ser Ser Ser Ser Ser Asp Gly
50 55 60
Ser Asp Ser Asp Ser Asp Glu Asn Ser Leu Trp Ser Asn Gly Asp Thr
65 70 75 80
Ser Ser Ser Val Ser Ser Val Glu Val Ser Pro His Asp Val Pro Lys
85 90 95
Leu Glu Ala Tyr Leu Tyr Tyr Ala Gly Leu Ser Gly Pro Ser Gly Arg
100 105 110
Gly Pro Lys Leu Ile Tyr Arg Thr Ser Ser Asp Lys Phe Val Pro Pro
115 120 125
Asp Gly Pro Glu Ala Tyr Arg Arg Leu Met Lys Leu Arg Thr Val Pro
130 135 140
Glu Asn His Lys Leu Gly Glu Asp Gly Leu Trp Asp Arg Ile Arg Ala
145 150 155 160
Glu Val Val Lys Leu Leu Asp His Thr Gly Ile Gln Leu Ser Ser Val
165 170 175
Asp Leu Val Arg Phe Thr Trp Val Glu Lys Asn Asp Asp Gln Glu Asp
180 185 190
Gln Glu Asp Gln Glu Asp Gln Glu Asp Gln Glu Asp Gln Glu Gly Gln
195 200 205
Glu Gly Gln Glu Glu Asp Gln Glu Asp Glu Val Asn Val Asn Tyr Asp
210 215 220
Asp Ile Ala Pro Ile Lys Pro Val Val Gly Gly Thr Val Tyr Thr Thr
225 230 235 240
Pro Val Thr Ile Trp Val Gly Val Met Pro Asp Thr Thr Thr Gly Glu
245 250 255
Gln Ala Tyr Asn Ser Ser Arg Asp Ile Leu Asp Leu Leu Gln Gln Tyr
260 265 270
Asn Ile Thr Asp Val Asp Val Ala Tyr Arg Glu Ser Glu Val Lys Phe
275 280 285
Ser Ala Gly Pro Glu Leu Phe Ala Pro Val Ser Asp Leu Asp Pro Leu
290 295 300
Lys Asp Val Ile Asp Ser Leu Ser Thr Pro Leu Ser Leu Pro Ile Ala
305 310 315 320
Gly Leu Lys Thr Lys Met Gln Gly Thr Leu Gly Phe Tyr Phe Arg Ile
325 330 335
Gly Glu Asp Leu Tyr Ala Val Thr Ala Arg His Val Leu Phe Lys Asp
340 345 350
Asn Glu Ala Asn Val Glu Tyr Asn Tyr Val Ala Gly Pro Lys Lys Gly
355 360 365
Val Ile Val Met Gly Pro Asn Ala Phe Thr Asn His Leu Ala Phe Leu
370 375 380
Gln Ser Thr Ile Gly Thr Leu Leu Asp Thr Ala Glu Tyr Leu Glu Thr
385 390 395 400
Arg Val Thr Ser Leu Thr Ser Leu Val Glu Gly Gly Gly Ser Arg Ala
405 410 415
Glu Gln Ser Gly Leu Glu Leu Pro Glu Thr Gln Glu Gln Leu Thr Lys
420 425 430
Thr Arg Thr Lys Ile Asp Ala Leu Lys Ala His Phe Val Thr Val Lys
435 440 445
Lys Lys Trp Ser Lys Ala Lys Asp Arg Val Ile Gly His Val Val Trp
450 455 460
Ala Pro Pro Ile Ser Val Ala Thr Pro Pro His Gln Tyr Thr Gln Asp
465 470 475 480
Val Cys Val Ile Lys Leu Asp Lys Asp Lys Phe Arg His Phe Arg Arg
485 490 495
Asn Val Leu Ser Leu Gly Pro Glu Ile Ser Pro Ala Asn Phe Lys Lys
500 505 510
Leu Met Tyr Asp Arg Phe Asn Ala Pro His Glu Phe Val Tyr Pro Pro
515 520 525
Glu Gly Leu Phe Lys Leu Arg Gly Ile Leu Thr Gln Glu Glu Ile Arg
530 535 540
Thr Pro Asp Ile Lys Ala Pro Gln Pro Gln Gly Asp Pro Ile Arg Arg
545 550 555 560
Val Ile Lys Arg Gly Phe Thr Thr Leu Thr Thr Val Gly Gly Leu Ser
565 570 575
Gly Phe Leu Ser Tyr Val Arg Arg Tyr Phe Ala Thr Gly Asn Ile Asp
580 585 590
Ser Val Glu Ala Ala Ile Leu Pro His Asn Asn Asp Ser Gly Pro Phe
595 600 605
Ser Arg Gly Gly Asp Ser Gly Ser Val Ile Val Asp Ala Leu Gly Arg
610 615 620
Phe Val Ala Leu Leu Thr Gly Gly Thr Gly Lys Thr Asp Ser Ser Asp
625 630 635 640
Ile Thr Phe Gly Thr Pro Met His Trp Leu Trp Leu Leu Ile Leu Ala
645 650 655
Lys Phe Asp Gly Ala Asn Leu Tyr Trp Asp Asp Gly Gly Asn
660 665 670

Claims (10)

1.一种蛋白质，其特征在于，所述蛋白质为A1)或A2)或A3)或A4)：
A1)由SEQ ID No.2的氨基酸序列组成的蛋白质；
A2)由SEQ ID No.2第13-670位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
A3)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)或A2)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
A4)在A1)或A2)或A3所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白。
2.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，其特征在于，所述生物材料为下述B1)至B4)中的任一种：
B1)编码权利要求1所述的蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组受体生物、或含有B2)所述表达盒的重组受体生物、或含有B3)所述重组载体的重组受体生物。
3.如权利2所述的生物材料，其特征在于，B1)所述核酸分子为如下任一种DNA分子：
b1)编码序列是SEQ ID No.1的DNA分子；
b2)核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子；
b3)编码序列是SEQ ID No.1的第37-2013位所示的DNA分子；
b4)核苷酸序列是SEQ ID No.1的第37-2013位所示的DNA分子。
4.制备权利要求1所述蛋白质的方法，其特征在于，该方法包括使权利要求1所述蛋白质的编码基因在生物中进行表达得到所述蛋白质的步骤，所述生物为微生物、植物或非人动物。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述微生物为原核微生物。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述原核微生物为革兰氏阴性细菌。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述革兰氏阴性细菌为埃希氏菌属细菌。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述埃希氏菌属细菌为大肠杆菌。
9.权利要求1所述蛋白质在制备hispidin中的应用。
10.权利要求2或3所述的生物材料在制备hispidin中的应用。
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