KR100752683B1

KR100752683B1 - 발리엔아민 생합성에 관여하는 발리오론 생합성 효소, 이의유전자, 프라이머쌍 및 이를 이용한 발리오론 생합성효소의 생산방법

Info

Publication number: KR100752683B1
Application number: KR1020060088800A
Authority: KR
Inventors: 홍순광; 정병철; 이상희; 정용훈; 최우식
Original assignee: 명지대학교 산학협력단
Priority date: 2006-09-14
Filing date: 2006-09-14
Publication date: 2007-08-29

Abstract

본 발명은 α-글루코시다제 저해제의 기능을 갖는 발리엔아민 구조물을 생합성하는 유전자들 중, 생합성 과정의 맨 처음 단계에 관여하는 효소인 발리오론 생합성 효소의 유전자 및 효소적 기능, 발현시스템 및 그 산업적 응용에 관한 것으로, 스트렙토마이세스 알버스(Streptomyces albus KCTC9015)로부터 유래한 발리오론 생합성 효소의 활성을 가지고 단백질; 상기 단백질을 암호화하는 유전자; 및 상기 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 신규한 프라이머 쌍을 사용하여 상기 효소를 대장균에서의 대량 발현할 수 있는 시스템을 제공할 수 있게 됨으로써, 발리엔아민 구조를 지니는 생리활성물질 생산 균주를 스크리닝하는 프라이머 제작 및 DNA 칩 제작에 유용하게 응용가능하며, 당뇨 및 비만효과가 뛰어난 발리엔아민 유도체 합성에도 이용할 수 있는 등, 산업적으로 많은 효과를 기대할 수 있게 되었다.

발리엔아민, 발리오론 생합성 효소

Description

발리엔아민 생합성에 관여하는 발리오론 생합성 효소, 이의 유전자, 프라이머쌍 및 이를 이용한 발리오론 생합성 효소의 생산방법{A valiolone synthase, it’s gene and primer for valienamine biosynthesis, and method for producing the same}

도 1은 본 발명의 발리오론 생합성 효소 유전자 (salQ)를 대장균에서 대량발현시키기 위해 구축한 pET-salQ 재조합 벡터의 구조를 나타내는 도면이다.

도 2는 본 발명의 발리오론 생합성 효소 유전자 (salQ)를 대장균에서 대량발현시키기 위해 구축한 pColdI-salQ 재조합 벡터의 구조를 나타내는 도면이다.

도 3은 본 발명의 발리오론 생합성 효소의 아미노산 서열과 논문으로 보고되어 있는 아카보스 및 발리다마이신 생합성에 관여하는 효소의 아미노산 서열의 상동성을 비교하여 나타낸 도면이다.

도 4는 pET-salQ 재조합 벡터로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)에서 salQ 단백질을 발현시키고, 순수 분리한 결과를 SDS-PAGE 전기영동으로 나타낸 도면이다.

도 5는 pColdI-salQ 재조합 벡터로 형질전환된 대장균 BL21 Gro7에서 SalQ 단백질을 발현시키고 순수 분리한 결과를 SDS-PAGE 전기영동으로 나타낸 도면이다.

도 6은 pET-salQ 재조합 벡터로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)pLys에서 SalQ 단백질을 발현시키고 순수 분리한 것을 SDS-PAGE 전기영동으로 나타낸 도면이다.

도 7은 본 발명의 발리오론 생합성 효소가 촉매하는 효소반응을 화학구조로 나타낸 도면이다.

도 8은 본 발명의 발리오론 생합성 효소가 기질인 세도헵툴로스 7- 포스페이트와 반응시키고, 이의 반응 산물을 TLC로 분리하여 2-에피-5-에피-발리오론의 생성하는 입증한 도면이다.

도 9는 본 발명의 본 발명의 발리오론 생합성 효소가 세도헵툴로스 7- 포스페이트를 기질로하여, 2-에피-5-에피-발리오론을 생합성할 수 있는 지를 GC/MS로 측정하여 나타낸 도면이다.

본 발명은 발리오론 합성효소의 유전자 및 기능, 대장균에서의 고발현 시스템 구축과 그 산업적 응용에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은 발리엔아민 생합성을 위한 발리오론 합성효소(valiolone synthase)의 유전자의 기능 규명, 대장균에서의 고발현 시스템 구축 및 그 산업적 응용성에 관한 것이다.

발리엔아민(Valienamine) 구조를 가지고 있는 생리활성물질로는 살보스타틴( Salbostatin), 발리다마이신(Validamycin), 아카비오신(acarviosin), 아카보스(Acarbose), 아디포신(Adiposin), 트레스타틴(Trestatin) 등이 있으며, 상기의 화합물들은 α-글루코시다제 저해제(α-glucosidase inhibitor)로 작용하여, 농업용 항생제나 인류건강 증진을 위한 비만 및 당뇨치료제로 널리 이용되거나, 개발 중인 중요한 화합물로 알려져 있다.

그러므로, 이러한 발리엔아민 구조를 생합성 하는 유전자원을 분리, 확보하는 것은 상기의 유전정보를 이용하여 PCR 프라이머나 DNA 칩의 탐침(probe)으로 응용하여, 미생물을 대상으로 발리엔아민 구조를 지니는 생리활성물질을 생산하는 미생물을 분리하고, 그 화합물의 구조를 분석하여 확보할 수 있는 기회를 제공할 수 있으므로 중요한 가치를 가질 수 있다.

이에, 본 발명자들은 발리엔아민 구조를 가지고 있으며, 농업용 살충제(pesticide)로 이용가능한 살보스타틴(Salbostatin)을 생산하는 스트렙토마이세스 알버스 균주로부터 발리오론 합성효소(valiolone synthase)를 코드하는 유전자를 분리한 다음, 이 유전자의 염기서열과 아미노산 서열을 찾아내고, 이를 대장균에서 활성형으로 발현시킬 수 있는 고발현 시스템을 성공적으로 구축하고자 하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 스트렙토마이세스 알버스 (Streptomyces albus KCTC9015) 유래의 대장균 발현 벡터의 클론 안에 삽입된 발리오론 합성효소(valiolone synthase)의 유전자와 그 기능 및 대장균에서의 최적화된 활성형 대량발현 시스템을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 발리오론 생합성 효소의 활성을 가지고 서열번호 2로 표시되는 단백질을 제공한다.

또한, 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 제공한다.

또한, 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 발리오론 생합성 효소의 발현 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열과 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 구성되는 프라이머쌍을 제공한다.

나아가, 본 발명은 (a) 서열번호 3으로 표시되는 염기서열과 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 구성되는 프라이머쌍을 사용하여 스트렙토마이세스 알버스 게놈으로부터 발리오론 생합성 효소의 유전자를 증폭하는 단계; (b) 상기 증폭된 발리오론 생합성 효소의 유전자를 벡터에 삽입하여 재조합 발현벡터를 제조하는 단계; (c) 상기 재조합 발현벡터로 대장균을 형질전환시키는 단계; 및 (d) 상기 형질전환된 대장균을 배양하여 발리오론 생합성 효소를 대량생산하는 단계; 를 포함하여 이루어지는 발리오론 생합성 효소의 생산방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.

이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가진다.

또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.

본 발명에서는 발리엔아민 화합물을 생합성하는데 있어서, 생합성 과정의 맨 처음 단계에 관여하는 효소를 발리오론 생합성 효소(valiolone synthase)라 칭한 다.

그리고, 본 발명에서 염기 서열 중, S는 구아닌(Guanine, G) 또는 시토신(Cytosine, C)를 총칭하는 염기서열을 의미한다.

본 발명은 스트렙토마이세스 알버스(S. albus KCTC9015)의 게놈(genome)을 이용하여 유전자 라이브러리(library)을 작성하고, 살보스타틴의 발리엔아민(valienamine)의 생합성을 위해 반드시 필요로 하는 발리오론 생합성 효소(valiolone synthase)를 효과적으로 증폭시킬 수 있는 프라이머 Val-F (5'-GGSGGSGTSCTSATGGACGTSGCSGG-3')과 Val-R (5'-GCCATGTCSACGCASACSGCCTCSCCGTG-3')를 작제한 후, 상기 유전자 도서관 및 프라이머쌍을 PCR 증폭하여 예상되는 크기의 밴드로 양성반응을 보이는 네 개의 코스미드(cosmid) pSH2101, pSH2102, pSH2103, pSH2104가 포함된 클론을 분리하고 이중 pSH2104의 코스미드 유전자를 1～2 kb정도로 부분 절단한 다음, 플라스미드 pBluescript KS(+)에 서브클로닝하여 샷건 라이브러리(shotgun library)를 제작하고 이중 400개의 라이브러리를 T7과 T3 프라이머를 사용하여 약 20 kb의 염기서열을 결정하는 단계: 상기 유전자 집단 중 18개의 코딩하는 지역(본 발명에서는 이를 salA 내지 salR로 명명하였음)이 존재함을 확인하는 단계; 및 상기 염기서열 결정으로부터 번역된 아미노산 서열을 종래 아미노산 서열과 비교하여 발리오론 생합성 효소(valiolone synthase)와의 상동성이 높은 것을 선별하고 확인하는 단계로 구성된다.

그리고, 상기 선별하고 확인하는 단계를 거쳐서 발리엔아민 구조물 생합성에서 가장 중요한 발리오론 생합성 효소(valiolone synthase)를 코드할 것으로 예상 되는 유전자를 PCR로 증폭하고 이를 대장균에서 활성형으로 발현시킬 수 있는 발현용벡터를 구축하는 단계; 상기 구축한 재조합 발현 벡터를 사용하여 대장균을 형질전환시키고, 상기 형질전환된 대장균 호스트를 배양시켜 발현된 예상 발리오론 생합성 효소를 정제하고 이의 효소를 세도헵툴로스-7-포스페이트(edoheptulose-7- phosphate)와 반응시키는 단계; 상기 반응 산물을 박막크로마토그래피(TLC) 및 GC/MS으로 분석하여, 발리오론 생합성 효소의 활성을 가지고 있음을 규명하는 단계로 구성된다.

본 발명은 상술한 모든 단계를 거쳐서 스트렙토마이세스 알버스 균주로부터 발리오론 생합성 효소를 암호화하는 유전자와 그의 활성형 단백질이 있음을 확인하고, 이를 salQ라 명명하고 이의 염기서열과 아미노산 서열을 서열번호 1 및 2에 나타내었다.

그리고, 발리오론 생합성 효소를 대량 생산하기 위하여, 본 발명의 salQ 유전자를 스트렙토마이세스 알버스 균주의 게놈으로부터 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 개발하고, 이의 염기서열을 서열번호 3 및 4에 나타내었다.

이하, 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 보다 더 상세히 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 사상과 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정할 수 있음은 이 분야에서 당업자에게 명백한 것이다.

[실시예]

실시예 1: 스트렙토마이세스 알버스 ( Streptomyces albus KCTC9015 )의 유전 자 라이브러리 작성

스트렙토마이세스 알버스 (Streptomyces albus KCTC9015)를 R2YE배지에서 배양하고, 홉우드(Hopwood)의 방법에 따라 염색체 DNA를 순수분리한 다음, 분리한 염색체 DNA를 제한효소 Sau3A로 부분절단하고, 부분절단한 30-40 kb 상당의 염색체 DNA를 BamHI과 HpaI으로 이중절단한 대장균과 방선균에서 복제가 가능한 유전자 도서관 제작용 코스미드 벡터에 T4 DNA 연결효소로 연결한 후 스프라타진(STRATAGENE)회사의 람다 패키징 키트 (packaging kit)를 이용하여 스트렙토마이세스 알버스 (S. albus KCTC9015) 유전자 라이브러리를 작성하였다.

실시예 2: valiolne synthase 유전자의 클로닝

상기 실시예 1에서 작성한 스트렙토마이세스 알버스 유전자 라이브러리 중 1,000개의 콜로니를 각각 0.5 ml의 LBA 액체 배지가 들어있는 1.5 ml 에펜도르프 튜브에 엘로우 팁(yellow tip)을 이용하여 접종한 후 하루 동안 배양기에서 배양한 다음 이 배양액을 30 ul씩 새로운 에펜도르프 튜브에 옮겨 플라스미드를 추출하고, 각각 PCR반응을 수행하였다. 이때 사용한 PCR 프라이머는 살보스타틴과 같이 화합물 구조에 발리엔아민 구조를 가지고 있는 아카보스(acarbose) 생합성 유전자 중 acbC(2-epi-5-epi-valiolone synthase), 그리고 상기의 유전자와 생화학적 기작이 유사할 것으로 여겨지는 3-디하이드로퀴네이트 생합성 효소(3-dehydroquinate synthase) 유전자와의 비교분석(comparative analysis)을 하기 위해 개발한 Val-F (5'-GGSGGCGTCCTCATGGACGTCGCCGG-3')과 Val-R (5'-GCCATGTCCACGCACACCGCCTCCCCGTG- 3') 프라이머를 이용하였다. PCR 반응결과 최종 4개의 재조합 코스미드 클론을 선별하였다 (pSH2101, pSH2102, pSH2103 및 pSH2104).

실시예 3: 코스미드 단편에서 valiolone synthase 유전자의 아미노산 서열결정 및 유사성 검색

4개의 코스미드 중 pSH2104를 대상으로, 1-2kb정도로 부분 절단 후, 플라스미드 pBluescript KS(+)에 서브클로닝하여 shotgun library를 제작하고, 이 중 400개의 라이브러리를 T7과 T3 프라이머를 이용하여 약 20 kb의 염기서열을 결정할 수 있었다. 이것을 FramePlot 2.3.2 프로그램(Ishikawa, J. and Hotta, K. FEMS Microbiol. Lett. 174:251-253, 1999)을 이용하여 일차적인 DNA염기서열 결과를 기초로 단백질을 코드하는 부분을 검색하였다.

이의 결과, 이 지역에 단백질을 코드하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)이 18개가 존재함을 확인하였고, 이를 순서대로 salA에서부터 salR까지 명명하였다.

이 중, salQ는 ATG로 시작하여 정지코톤 TAG로 끝나는 410개의 아미노산으로 구성되어 있음을 알 수 있었다(도 3 참조).

또한, 데이터베이스를 통하여 아미노산 상동성 검색을 한 결과, salQ는 아카보스 및 발리다마이신(validamycin) 생합성에 관여하는 2-에피-5-에피 발리오론 생합성 효소(2-epi-5-epi-valiolone synthase)와 70% 이상의 높은 상동성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 4: valiolone synthase 유전자( salQ )의 대장균에서의 발현을 위한 클로닝

salQ 유전자를 PCR로 증폭하기 위해서 이를 포함하는 5´부위의 프라이머 salQF와 3´부위의 프라이머 salQR를 합성하였다. 또한, 프라이머 salQF 및 salQR에 각각 제한효소 BamHI 절단부위 및 HindIII 절단부위 염기서열을 첨가하여 합성하였다. DNA 합성은 HYBAID사의 PCR express 증폭기를 사용하였다.

프라이머 salQF(19mer) BamHI ATGACCGGTACGAGCCTGA, 프라이머 salQR(20mer) HindIII CTAAAGGTTCCTGCCGCCGC 의 정제는 합성된 프라이머를 55℃에서 12 내지 18시간 방치한 후 1/3부피의 증류수를 첨가한 후, 동일부피의 1-부탄올을 3 또는 4회 첨가하면서 농축시키고, 이를 진공상태에서 원심분리하면서 건조시킨 다음, 증류수를 적당량 첨가하고 이를 스펙트로포토미터를 사용하여 파장 280 내지 200nm에서 스캐닝하면서 농도를 정량하였다. 이때, 최종적으로 사용할 프라이머의 농도는 100 p㏖로 맞추었다.

PCR을 이용한 salQ 유전자의 증폭은 전변성(predenaturation, 94℃, 4분)시킨 후, 변성(denaturation, 94℃, 45초), 어닐링(annealing, 65℃, 45초), 익스텐션(extension, 74℃, 90초)를 30 사이클(cycle)을 반복한 후, A-tailing (74℃ , 10분) 시켜 증폭을 하였다. 이때, PCR은 TaKaRa사 제품의 TaKaRa Taq를 사용하였고, 반응조성은 주형 DNA 0.5㎍, 프라이머 salQF, 프라이머 salQR 각각 0.2uM, dNTP 2.5 mM, 완충액(10mM 트리스 (pH8.3), 50mM 포타슘클로라이드, 1.5mM 마그네 슘클로라이드), TaKaRa Taq 2.5U로 하였다. PCR 수행 결과, 약 1.3kb의 salQ 유전자를 증폭하였다.

그리고, 증폭된 유전자는 아가로스 젤 상에서 전기영동하여 DNA의 크기를 확인한 후, 프로테이나제(proteinase K 100 ㎍/㎖, SDS 0.5%, EDTA 5 mM)를 넣고 56℃에서 30분간 반응시킨 후 페놀/클로르포름을 처리하고 원심분리하여 상등액을 취하였다. 여기에 1/10 부피의 3M 소디움아세테이트(pH 4.6)와 2배의 에탄올을 첨가하고 얼음에서 10분간 방치시킨 후 원심분리하고 이의 침전물을 70% 에탄올로 씻어준 다음, 진공상태에서 침전물을 말린 후 TE 완충액(10mM 트리스(pH 8.0), 1mM EDTA)에 녹였다.

그리고, 상기 방법으로 수득한 증폭된 salQ 유전자는 TOYOBO사 제품의 TArget Clone pTA벡터를 사용하여 salQ 유전자가 포함된 플라스미드 DNA를 제작하였다. 이에 대한 반응 조건은 증폭된 salQ 유전자 65ng, pTA 벡터 50ng, 리가제 완충액(66mM 트리스 pH(7.6), 10mM DTT, 6.6mM MgCl2, 1mM ATP), 리가제 1U를 첨가하여 16℃에서 2시간 반응하였다. 확보된 플라스미드 DNA를 E. coli DH5α에 형질전환시켜 salQ 유전자의 클론을 확보하였다. 확보된 salQ 유전자 클론에서 TaKaRa사 제품의 플라스미드 미니프렙 키트(Plasmid miniprep kit)를 사용하여 salQ가 포함된 플라스미드 DNA를 정제하고, 프라이머에 첨가된 절단부위를 TaKaRa 제한효소를 이용하여 절단하였다. 이때, 반응 조성은 플라스미드 DNA 1㎍, 제한효소 완충액(20mM 트리스 (pH8.5), 10mM 마그네슘클로라이드, 1mM DTT, 100mM 포타슘클로라이드), 제한효소( BamHI, HindIII) 각각 5U로 제조하고, 이 조성물을 30℃에서 1시 간 방치하였다.

또한, salQ의 발현을 위해 Takakra사의 pColdI 발현 벡터와 Novagen사의 pET-30a 발현벡터를 사용하였으며, 이 두 가지 발현벡터 역시 salQ가 포함된 플라스미드 DNA와 같은 제한효소 처리를 하였다. 반응 조건은 위와 같게 수행하였다(도 1 및 도 2 참조).

그리고, 상기 방법으로 절단된 유전자를 아가로스 젤 상에서 전기영동하여 DNA 크기를 확인한 후 젤에서 정제하였다. 정제조건은 위에 기술된 방법과 같다. 확보된 salQ가 포함된 플라스미드 DNA와 발현벡터와의 연결은 위에서 기술한 salQ가 포함된 플라스미드 DNA를 확보하는 방법에서 기술된 방법과 같은 방법을 사용하였으며, 같은 E. coli DH5α에 형질전환시켜 pColdI 발현 벡터 및 pET-30a에 포함된 salQ 유전자의 클론을 확보하였다.

실시예 5: valiolone synthase 유전자( salQ )를 pET30a 에 클로닝하여 E. coli BL21(DE3) 균주에서의 발현

유전자의 발현을 위하여 salQ가 포함된 pET-30a 플라스미드 DNA를 위에 기술된 방법으로 정제하고, E. coli BL21(DE3) 균주에 형질전환시켰다. 형질전환된 E. coli BL21(DE3) 균주를 흡광도 OD₆₀₀ 0.5 일 때까지 배양하고, 여기에 전체농도 1mM이 되게 IPTG를 첨가한 후 37℃에서 24시간을 더 배양하였다. 배양된 균체를 원심분리를 통해서 모은 후, 파쇄 완충액(25 mM K₂HPO₄/KH₂PO₄ pH 7.5, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole, 0.2 mM CoCl₂)으로 다시 녹여서 초음파 분쇄기를 이용하여 균체를 파쇄하였다. 분쇄된 세포의 상층액을 원심분리를 실시해 모은 후, Ni-NTA agarose 흡착 겔 크로마토그래피를 이용하여 순수분리한 후 SDS-PAGE 전기영동하여 단백질 분리 여부를 확인하였다. 하지만, 이와 같은 조건에서는 salQ 단백질은 대량 발현되지만 불용성의 침전물을 만드는 것을 확인하였다.

이 문제를 해결하기 위하여, IPTG의 농도를 0.01 mM부터 1mM, IPTG 첨가 후의 배양온도를 12, 26, 20℃로 다양한 조합으로 실시하여 최적 가용화 조건을 조사하였다. 그 결과, 도 4에 도시한 바와 같이 활성형의 salQ를 발현시키기 위한 최적 IPTG 농도는 0.4 mM, 최적배양온도는 12℃에서 3시간 이상 배양하는 것이 가장 바람직하다는 것을 알 수 있었다. 이때, 도 4에서 M은 단백질 분자량 마커; 1 래인은 0.1mM IPTG, 20℃에서 배양한 대장균 추출액; 2 래인은 0.1mM IPTG, 20℃에서 배양한 대장균 추출액; 3 래인은 0.08mM IPTG, 20℃에서 배양한 대장균 추출액; 4 래인은 0.06mM IPTG, 20℃에서 배양한 대장균 추출액; 5 래인은 0.04mM IPTG, 20℃에서 배양한 대장균 추출액; 6 래인은 0.02mM IPTG, 20℃에서 배양한 대장균 추출액; 7 래인은 0.1mM IPTG, 16℃에서 배양한 대장균 추출액; 8 래인은 0.08mM IPTG, 16℃에서 배양한 대장균 추출액; 9 래인은 0.06mM IPTG, 16℃에서 배양한 대장균 추출액; 10 래인은 0.04mM IPTG, 16℃에서 배양한 대장균 추출액; 11 래인은 0.02mM IPTG, 16℃에서 배양한 추출액; 12 래인은 0.04mM IPTG, 12℃에서 배양한 대장균 추출액; 을 나타낸 것이다.

실시예 6: valiolone synthase 유전자( salQ )를 pCold 에 클로닝하여 E. coli pGro7 균주에서의 발현

상기 실시예에서 나타났던 발현된 단백질이 불용성 침전물을 형성하는 문제점을 해결하기 위하여, 발현 벡터와 숙주대장균의 종류를 바꾸었다. salQ가 클로닝되어 있는 pCold 플라스미드 DNA를 E. coli BL21 pGro7 균주에 형질전환시켰다.

그리고, 상기 형질전환된 대장균은 배양물의 흡광도가 OD₆₀₀=0.5~0.6가 될 때까지 다양한 IPTG 농도와 온도를 적용하여 배양하여 목적 단백질의 발현을 유도한 후, 이의 배양물을 파쇄하여 SDS-PAGE 전기영동을 하였다.

이의 결과, 도 5에 도시한 바와 같이 IPTG농도 0.1mM, 발현 온도 15℃에서 pET-30a를 사용한 경우보다 현저히 목적 단백질의 발현을 얻을 수 있었다. 이때, 도 5에서 1 래인은 0.1 mM IPTG 첨가 15℃에서 배양한 대장균 추출액; 2 래인은 15℃에서 배양한 대장균 추출액; 3 래인은 0.1 mM IPTG 첨가 15℃에서 배양한 대장균 추출 침전물; 4 래인은 15℃에서 배양한 대장균 추출 침전물; 5 래인은 단백질 분자량 마커;를 나타낸 것이다.

이는 pCold 발현벡터는 pET-30a에서 사용되는 T7 promotor를 사용한 것이 아니라 저온 유도 프로모터(cold-shock promotor, cspA)를 사용하여 목적 단백질의 발현을 유도하는데 사용하는 벡터로서 낮은 온도에서 발현 효율을 높인 것으로 판 단된다.

그러나, 동시 발현되는 chaperon 단백질의 과발현 때문에 목적 단백질의 분리에는 어려움이 있었다.

이는 E. coli BL21 pGro7에서 pGro7 벡터는 열 충격 단백질 60(Heat-shock protein 60)을 암호화하는 벡터로서 단백질의 folding을 도와주는 샤페론(chaperon)의 역할을 수행하기 때문에 목적 단백질이 발현될 때 동시 발현된 것으로 추정된다.

실시예 7: valiolone synthase 유전자( salQ )를 pET30a 에 클로닝하여 E. coli BL21(DE3)pLys 균주에서의 발현

목적 단백질의 다량의 용해성 단백질의 획득을 위하여 salQ가 포함된 pET-30a 플라스미드 DNA를 상술한 바와 같이 동일한 방법으로 정제하고, E. coli BL21(DE3)pLys 균주에 형질전환시켰다.

형질전환된 E. coli BL21(DE3)pLys 균주를 실시예 5와 같이 배양하고, 균체를 파쇄하였다. 분쇄된 세포의 상층액은 원심분리를 실시해 모으고, 상기 상층액은 Ni-NTA agarose 흡착 겔 크로마토그래피를 이용하여 순수분리한 다음, SDS-PAGE 전기영동하여 단백질 분리 여부를 확인하였다.

이의 결과, 도 6에 도시한 바와 같이 목적 단백질이 다량의 용해성 단백질로 발현되었음을 확인할 수 있었다. 이때, 도 6에서 1 래인은 salQ가 도입된 정제전의 대장균 추출물; 2래인은 정제된 salQ; 3 래인은 단백질 분자량 마커를 나타낸 것이 다.

실시예 8: salQ 단백질을 이용한 발리오론 합성

실시예 7에서 순수 분리한 단백질을 발리오론 합성능을 알아보기 위하여 세도헵툴로스 7-포스페이트(sedoheptulose 7-phosphate)를 기질로 사용하여 시클라제 어세이(cyclase assay)를 실시하였다.

먼저, 효소 역가 측정을 위해서 전체 반응부피를 100㎕로 하여 포스페이트 완충액 pH 7.5(25mM)에 세도헵툴로스 7-포스페이트(5mM), KF(2mM), 정제된 salQ 단백질(50㎕, 0.5mg protein/ml)을 포함시킨 후, 30℃에서 두 시간 동안 반응을 수행하였다.

그리고 반응이 끝난 반응액을 가지고 박막크로마토그래피(thin layer chromatography)를 수행하여 발리오론 합성을 확인하였다(도 8 참조).

또한, 합성된 발리오론을 GC/MS 분석하기 위하여, 반응액을 메탄올로 추출한 후, SIGMA-SIL-A 시약을 사용하여 녹인 후 아르곤 가스를 사용하여 농축하였다. 농축된 발리오론은 Hewlett Packard 5890 series II gas chromatograph를 이용하여 GC/MS 분석을 하였으며, 그 결과, 예상 반응 산물인 2-에피-5-에피-발리오론(2-epi-5-epi-valiolone)이 형성됨을 확인하였다(도 9 참조).

이때, 도 9에서 A는 2-epi-5-epi-[6,6-²H²]valiolone 표준품의 TMS( tetra-trimethylsilyl) 유도체의 크로마토그램(chromatogram) 및 매스 스펙트럼(mass spectrum); B는 salQ 반응 산물의 tetra-TMS 유도체의 크로마토그램 및 매스 스펙트럼; v (M⁺ 448)는 2-epi-5-epi-[6,6-²H²]valiolone 분해물의 TMS 유도체; w (M⁺ 390)는 Dehydrated 2-epi-5-epi-valiolone의 tri-trimethylsilyl 유도체; x (M⁺ 480)는 2-epi-5-epi-valiolone의 tetra-TMS 유도체; y (M⁺ 449)는 미지의 화합물; z (M⁺552); 2-epi-5-epi-valiolone의 penta-TMS 유도체; 를 나타낸 것이다.

이상과 같이, 본 발명은 스트렙토마이세스 알버스 (Streptomyces albus KCTC9015)로부터 살보스타틴을 생합성에 관여하는 신규한 발리오론 생합성 효소와 이를 암호화하는 유전자를 제공함으로써, 살보스타틴뿐만 아니라 발리엔아민 구조를 가진 생리활성물질을 대량생산하는데 유용하게 사용할 수 있게 되었다.

또한, 본 발명의 발리오론 생합성 효소 유전자 정보는 발리엔아민 구조를 가진 생리활성물질을 생산하는 미생물을 스크리닝하는 신규한 DNA 칩과 프라이머의 제조를 가능하게 하는 효과가 있다.

이 외에, 본 발명은 당뇨 및 비만효과가 뛰어난 발리엔아민의 유도체 합성에 사용할 수 있어 산업적 이용 효과가 매우 크다고 할 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

발리오론 생합성 효소의 활성을 가지고 서열번호 2로 표시되는 단백질.
제 1 항의 단백질을 암호화하는 유전자.
제 2 항에 있어서,

서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 유전자.
발리오론 생합성 효소의 발현 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열과 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 구성되는 프라이머쌍.
(a) 서열번호 3으로 표시되는 염기서열과 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 구성되는 프라이머쌍을 사용하여 스트렙토마이세스 알버스 게놈으로부터 발리오론 생합성 효소의 유전자를 증폭하는 단계;

(b) 상기 증폭된 발리오론 생합성 효소의 유전자를 벡터에 삽입하여 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;

(c) 상기 재조합 발현벡터로 대장균을 형질전환시키는 단계; 및

(d) 상기 형질전환된 대장균을 배양하여 발리오론 생합성 효소를 대량생산하 는 단계;

를 포함하여 이루어지는 발리오론 생합성 효소의 생산방법.
제 5 항에 있어서,

상기 (b) 단계의 벡터는 pET-30a 또는 pColdⅠ벡터인 것을 특징으로 하는 발리오론 생합성 효소의 생산방법.
제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,

상기 (c) 단계의 대장균은 대장균 BL21(DE3) 또는 대장균 pGro7인 것을 특징으로 하는 발리오론 생합성 효소의 생산방법.