CN113929757B

CN113929757B - 通过突变钙离子结合蛋白OsCIP1/2增强水稻耐冷性的方法

Info

Publication number: CN113929757B
Application number: CN202010607146.8A
Authority: CN
Inventors: 种康; 郭晓玉; 徐云远; 牛遇达
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Filing date: 2020-06-29
Publication date: 2024-06-07
Anticipated expiration: 2040-06-29

Abstract

本发明公开了通过突变钙离子结合蛋白OsCIP1/2增强水稻耐冷性的方法。本发明提供了OsCIP1蛋白和OsCIP2蛋白的组合在调控植物耐冷性中的应用。本发明实验显示敲除水稻Dongjin中OsCIP1蛋白和OsCIP2蛋白的编码基因后植株的耐冷性提高，而其他重要农艺性状没有发生显著改变。证明OsCIP1蛋白和OsCIP2蛋白及其编码基因可以调控植物的耐冷性，对于培育植物耐冷新品种具有重要意义。

Description

通过突变钙离子结合蛋白OsCIP1/2增强水稻耐冷性的方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及通过突变钙离子结合蛋白OsCIP1/2增强水稻耐冷性的方法。

背景技术

低温冷害严重影响到农业生产，尤其是喜温作物例如水稻的产量。利用基因工程手段改良作物的耐逆能力，提高农作物和经济作物对逆境胁迫的适应能力是新品种培育亟需解决的关键问题和重大问题。近年来，人们从生理、生化、代谢、生态、以及遗传、进化等角度对植物响应逆境胁迫的机制进行了大量研究，积累了丰富的资料，特别是随着分子生物学的发展，人们能够在基因组成、表达调控及信号传导等分子水平上认识植物对逆境胁迫的耐逆性机理，为利用基因工程手段改良植物的抗胁迫性能开拓了新的途径。然而，由于植物耐逆性状的复杂性，采用传统的育种方法提高植物的耐逆性也越来越困难，这要求我们必须运用新的技术和新的思路来实现高效、快速、易接受、低风险的植物耐逆基因工程新手段。

Ca²⁺作为信号转导过程中的第二信使，在生物体的生长发育过程中发挥着重要作用。胞质Ca²⁺浓度的变化会影响到细胞内各种生物学过程，包括对非生物胁迫的应答(如冷、盐、干旱、光等)(Sanders D,Brownlee C,Harper JF(1999)Communicating withcalcium.Plant Cell.11,691-706.)；钙离子还在病原菌的侵入，对激素的响应过程中发挥着重要作用。研究发现当植物体受到非生物胁迫时，会引起细胞膜渗透压变化，植物体通过细胞膜渗透压的变化将外界的刺激信号间接由膜上的受体发生感应，受体接到信号后，再通过细胞膜上一系列反应激活膜上的钙离子通道，从而引起细胞质内钙离子浓度增加。通过钙离子的变化，将外界刺激转化为植物体可以感知的刺激信号，从而介导植物细胞完成一系列生理生化反应(Chinnusamy V,Schumaker K,Zhu JK(2004)Molecular geneticperspectives on cross-talk and specificity in abiotic stress signalling inplants.Joural of Experimental Botany55,225-236.)。

细胞内存在钙离子结合蛋白，来协助完成胞内的信号转导过程。钙离子结合蛋白对细胞内Ca²⁺浓度变化很敏感，当细胞受到低温刺激时，细胞内钙离子水平升高，钙离子结合蛋白与Ca²⁺结合后使得钙离子结合蛋白的构象发生改变，激活与其相互作用的蛋白质或自身的蛋白活性，从而影响下游的靶基因的表达，以此来响应外界的低温信号刺激。完成低温信息传递后，细胞内的钙离子通过跨膜运输系统被迅速泵出细胞外或者重新贮存到钙库中，细胞内的Ca²⁺浓度又恢复到静息态的水平(Galon Y,FinklerA,Fromm H(2010)Calcium-regulated transcription in plants.Molecular Plant3,653-669.)。研究表明，在外界低温刺激下，细胞内Ca²⁺水平发生急速变化，在钙离子结合蛋白的作用下，引发一系列钙信号反应，从而来响应外界低温胁迫刺激。可以看出Ca²⁺以及钙离子结合蛋白在植物体的低温信号途径中发挥着至关重要的作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种通过突变钙离子结合蛋白OsCIP1/2增强水稻耐冷性的方法。

第一方面，本发明要求保护如下(I)和(II)的组合在调控植物耐冷性中的应用。

(I)OsCIP1蛋白或其相关生物材料；所述相关生物材料为能够表达所述OsCIP1蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

(II)OsCIP2蛋白或其相关生物材料；所述相关生物材料为能够表达所述OsCIP2蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

所述OsCIP1蛋白为如下任一所示蛋白质：

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

(A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

所述OsCIP2蛋白为如下任一所示蛋白质：

(B1)氨基酸序列为SEQ ID No.4的蛋白质；

(B2)将SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(B3)与(B1)-(B2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

(B4)在(B1)-(B3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

上述蛋白质中，所述标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

上述蛋白质中，同源性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述蛋白质中，所述95％以上的同源性可为至少96％、97％、98％的同一性。所述90％以上的同源性可为至少91％、92％、93％、94％的同一性。所述85％以上的同源性可为至少86％、87％、88％、89％的同一性。所述80％以上的同源性可为至少81％、82％、83％、84％的同一性。

在所述应用中，所述OsCIP1蛋白和所述OsCIP2蛋白在所述植物中的表达量和/或活性降低，所述植物的耐冷性提高。所述OsCIP1蛋白和/或所述OsCIP2蛋白在所述植物中的表达量和/或活性提高，所述植物的耐冷性降低。

第二方面，本发明要求保护一种培育耐冷性改变的植物品种的方法。

本发明所要求保护的培育耐冷性改变的植物品种的方法，可为如下方法A1或方法A2：

方法A1：一种培育耐冷性提高的植物品种的方法(或称为“提高植物耐冷性的方法”)，可包括使受体植物中OsCIP1蛋白和OsCIP2蛋白的表达量和/或活性降低的步骤。

方法B：一种培育耐冷性降低的植物品种的方法(或称为“降低植物耐冷性的方法”)，可包括使受体植物中OsCIP1蛋白和/或OsCIP2蛋白的表达量和/或活性提高的步骤。

其中，所述OsCIP1蛋白为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白。所述OsCIP2蛋白为前文(B1)-(B4)中任一所示蛋白。

第三方面，本发明要求保护一种培育耐冷性改变的转基因植物的方法。

本发明所要求保护的培育耐冷性改变的转基因植物的方法，可为如下方法B1或方法B2：

方法B1：一种培育耐冷性提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：对受体植物中能够表达OsCIP1蛋白的核酸分子和能够表达OsCIP2蛋白的核酸分子同时进行抑制表达，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比耐冷性提高。

方法B2：一种培育耐冷性降低的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入能够表达OsCIP1蛋白和/或OsCIP2蛋白的核酸分子，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比耐冷性降低。

在所述方法B1中，对所述受体植物中能够表达所述OsCIP1蛋白的核酸分子和能够表达所述OsCIP2蛋白的核酸分子同时进行抑制表达可通过任何能够实现这一目的的技术手段实现，如通过序列特异核酸酶(如CRISPR/Cas9核酸酶)对所述核酸分子进行特异性剪切，从而降低其在所述受体植株中的表达。

在本发明中，具体是通过CRISPER/Cas9技术实现的；以SEQ ID No.3和SEQ IDNo.6所示DNA片段同时存在的中符合5’-N_X-NGG-3’或5’-CCN-N_X-3’序列排列规则的片段为靶序列；N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30，且X为整数，N_X表示X个连续的脱氧核糖核苷酸。更加具体的，在本发明的一个具体实施例中，所述靶序列具体为SEQ ID No.7。

在上述方法B2中，所述核酸分子可通过重组载体的形式导入所述受体植物中。

在所述方法中，将携带有所述核酸分子的所述重组载体或者用于对所述受体植物中所述核酸分子进行敲除或抑制表达时采用的基因编辑工具导入所述受体植物，具体可为：通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

在上述各方面中，能够表达所述OsCIP1蛋白的核酸分子可为如下任一所述的DNA分子：

(a1)SEQ ID No.2所示的DNA分子；

(a2)SEQ ID No.3所示的DNA分子；

(a3)在严格条件下与(a1)-(a2)中任一限定的DNA分子杂交且编码所述OsCIP1蛋白的DNA分子；

(a4)与(a1)-(a3)中任一限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述OsCIP1蛋白的DNA分子。

在上述各方面中，能够表达所述OsCIP2蛋白的核酸分子可为如下任一所述的DNA分子：

(b1)SEQ ID No.5所示的DNA分子；

(b2)SEQ ID No.6所示的DNA分子；

(b3)在严格条件下与(b1)-(b2)中任一限定的DNA分子杂交且编码所述OsCIP2蛋白的DNA分子；

(b4)与(b1)-(b3)中任一限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述OsCIP2蛋白的DNA分子。

上述核酸分子中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

上述核酸分子中，同源性是指核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定核苷酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对核苷酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述核酸分子中，所述95％以上的同源性可为至少96％、97％、98％的同一性。所述90％以上的同源性可为至少91％、92％、93％、94％的同一性。所述85％以上的同源性可为至少86％、87％、88％、89％的同一性。所述80％以上的同源性可为至少81％、82％、83％、84％的同一性。

在上述各方面中，所述植物可为单子叶植物。

进一步地，所述单子叶植物可为禾本科植物。

更进一步地，所述禾本科植物可为水稻。

在本发明的具体实施方式中，所述水稻具体为水稻品种Dongjin。

实验证明，敲除了水稻Dongjin中OsCIP1蛋白和OsCIP2蛋白的编码基因后植株的耐冷性提高，而其他重要农艺性状没有发生显著改变。本发明证明OsCIP1蛋白和OsCIP2蛋白及其编码基因可以调控植物的耐冷性，对于培育植物耐冷新品种具有重要意义。

附图说明

图1为pCRISPR-OsCIP1/2载体示意图。

图2为oscip1 oscip2突变位点测序峰图及序列比对图。A-C为oscip1 oscip2-L1突变体OsCIP1基因突变序列比对结果(A)、测序峰图(B)以及编码氨基酸序列的突变情况(C)；D-E为oscip1 oscip2-L1突变体OsCIP2基因突变序列比对结果(D)及测序峰图(E)；F-H为oscip1 oscip2-L2突变体OsCIP1基因突变序列比对结果(F)、测序峰图(G)以及编码氨基酸序列的突变情况(H)；I-J为oscip1 oscip2-L2突变体OsCIP2基因突变序列比对结果(I)及测序峰图(J)。

图3为oscip1oscip2冷处理表型及统计图。A为oscip1oscip2-L1三叶期的幼苗处理前拍照；B为oscip1oscip2-L1三叶期幼苗4℃水浴处理96小时后恢复生长六周拍照；C为B中恢复生长六周后存活率统计结果；D为oscip1oscip2-L2三叶期的幼苗处理前拍照；E为oscip1oscip2-L2三叶期幼苗4℃水浴处理96小时后恢复生长六周拍照；F为E中恢复生长六周后存活率统计结果。Student’s t test用于差异显著性分析，所有数据为三次生物学重复的统计结果(n>30)，**代表p<0.01。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、通过CRISPER/Cas9技术抑制OsCIP1/2基因从而增强水稻耐冷性

本发明的实验结果证明，抑制了水稻OsCIP1/2的表达后，植物对低温耐受性增强。即与水稻品种Dongjin(公众可从中国科学院植物研究所获得)相比，OsCIP1/2基因缺失突变体oscip1 oscip2水稻的耐冷性增强，而其他重要农艺性状没有发生显著改变。因此，通过敲除OsCIP1/2的方法在培育耐低温增强的植物中具有重要的理论意义和实用价值。

一、OsCIP1/2基因的信息

根据水稻基因组数据库提供的基因信息，OsCIP1的基因号为Os12g04240，CDS长度为879bp，含有5个外显子，4个内含子，编码292个氨基酸；OsCIP2的基因号为Os11g04480，CDS长度为927bp，含有5个外显子，4个内含子，编码308个氨基酸；OsCIP1和OsCIP2的序列相似度很高，CDS序列相似度为93.3％，氨基酸序列相似性为94.16％，所以进行CRIPSR/Cas9靶点引物的设计时可以同时针对这两个基因的靶点进行敲除。

OsCIP1蛋白如SEQ ID No.1所示，cDNA中编码OsCIP1蛋白的开放阅读框如SEQ IDNo.2所示，基因组DNA中编码OsCIP1蛋白的基因组序列如SEQ ID No.3所示。OsCIP2蛋白如SEQ ID No.4所示，cDNA中编码OsCIP2蛋白的开放阅读框如SEQ ID No.5所示，基因组DNA中编码OsCIP2蛋白的基因组序列如SEQ ID No.6所示。

二、pCRISPR-Cas9载体的构建

(1)靶点设计与oligo序列合成

利用序列表中SEQ ID No.3和SEQ ID No.6所示的DNA序列在E-CRISPR网站(http://www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html)进行靶点设计。

物种选择“Orzya sativa IRGSP-1.0.31”，输入格式选择“Input is FASTAsequence”,“Start application”选择“medium”，选择“Start SgRNA search”进行SgRNA序列搜索。选择保守SgRNA序列作为OsCIP1/2基因的SgRNA序列，设计合成sgRNA。得到以下靶序列：5’-CCGGGGTTTGGCGGGTAGC-3’(SEQ ID No.7)。

并按照百格CRISPR/Cas9载体构建试剂盒(BGK03)说明书(Biogle Co.,Ltd.Cat#BGK03)合成Oligo序列，在靶序列的5’端加上TGTG做为正向引物，在靶序列的反向互补5’端加上AAAC作为反向引物：

5’端引物：5’-TGTGCCGGGGTTTGGCGGGTAGC-3’；

3’端引物：5’-AAACGCTACCCGCCAAACCCCGG-3’。

设计的靶点位置为OsCIP1/2编码区段ATG下游10bp左右的位置(图1)。

(2)pCRISPR-OsCIP1/2载体构建

将两条oligo引物用ddH₂O溶解至浓度为10μM，各取10μL混合，95℃变性3min，以0.2℃/s降温到20℃，得到oligo二聚体。

取2μL BGK03载体(记载在如下文献中：Yuming Lu et al.,Genome-wideTargeted Mutagenesis in Rice Using the CRISPR/Cas9 System.Molecular Plant,2017Sep 12；10(9):1242-1245.，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明试验使用，不得他用)，用BasI酶进行酶切，酶切体系如下：

37℃酶切2小时，酶切产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳进行分离，切下15,000bp线性化的BGK03大片段进行回收，最终产物30μL的ddH₂O溶解，得到线性化的BGK03载体。

取oligo二聚体3μL，线性化的BGK03载体1μL，T4连接酶1μL，T4连接酶缓冲液1μL，补水至总体积10μL。室温连接1h后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。经卡那霉素的抗性平板进行筛选，第二天挑取生长的阳性克隆，提取质粒后经测序验证，最终得到如图1所示载体，命名为pCRISPR-OsCIP1/2。

二、转基因水稻的获得

将上述pCRISPR-OsCIP1/2质粒用电击法转化农杆菌EHA105(Hiei Y,Ohta S,Komari T,Kumashiro T(1994)Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.Plant J 6:271–282，公众可从中国科学院植物研究所获得)。经含卡那霉素和利福平的抗性平板筛选得到阳性克隆的超表达工程菌，PCR鉴定阳性克隆。

将上述阳性克隆的农杆菌侵染水稻(Dongjin，水稻品种，公众可从中国科学院植物研究所获得；Dongjin以下简称DJ)的愈伤组织，将表达pCRISPR-OsCIP1/2的农杆菌28℃，200rpm过夜震荡培养，离心收集菌液，弃上清。随后用AAM-AS培养基重悬菌体，愈伤侵染20分钟，将愈伤组织转到继代培养基N₆D₂C，暗培养3天，再将愈伤组织用含300mg/L头孢霉素的无菌水洗涤5遍，无菌滤纸吸干后转至N₆D₂S₁培养基上，筛选一代；两周后，转移至N₆D₂S₂培养基上筛选二代(2周/代)；取出经过3代筛选生长旺盛的抗性愈伤组织，转移至分化培养基(1)，上，在分化培养箱(12小时光周期，白天28℃，夜晚25℃)中培养7天；然后转移至分化培养基(2)，上，在分化培养箱中培养至产生再生苗。再生的植株在生根壮苗培养基上生根壮苗；待小苗长至10厘米左右时，打开容器封口膜，炼苗三天，然后将小苗移入人工气候室栽培，获得T0代转pCRISPR-OsCIP1/2转基因水稻。

所用培养基配方如表1。

表1所用培养基配方

实验同时设置向根癌农杆菌EHA105中导入BGK03载体后侵染水稻Dongjin的空载对照。

三、转基因水稻的鉴定

(1)植物基因DNA的提取

选取0.5g T2代转基因水稻苗的叶片，在液氮中研磨，研碎的冻干粉中加入500μL基因组提取buffer(100mM Tris-HCl pH8.0，10mM EDTA pH8.0，1M KCl)，剧烈振荡使其全部悬浮；65℃水浴温育30分钟，每5分钟颠倒混匀一次；12,000g离心10分钟，取上清；加入与上清等体积的酚/氯仿/异戊醇(25：24：1，体积比)，抽提一次，4℃，12,000g离心10分钟，用等体积的氯仿/异戊醇(24：1，体积比)再抽提一次；收集上清并加入0.6倍体积的异丙醇沉淀DNA，-20℃放置30分钟；4℃，12,000g离心10分钟，弃去上清；沉淀用1mL的70％乙醇洗2次；干燥后，溶于20μL ddH₂O中。

(2)PCR扩增：提取的基因组稀释20倍，取1μL用作模板进行PCR反应。鉴定OsCIP1的5′端引物：5′-GCTGCGCATCGCAACCTCCGCTCTCTC-3′，3′端引物：5′-ACGTATGCCGCTGACCAGGA-3′；鉴定OsCIP2的5′端引物：5′-ACTTGATAACCCTCGTTCCCCAAATTCGCAATC-3′，3′端引物：5′-GGAGCCCCGTAGCCGCCGCCGTAGG-3′。PCR程序为：94℃预变性30秒后进入PCR循环，循环参数为98℃/10秒变性→52℃/15秒复性→72℃/1分钟延伸，35个循环后再72℃终延伸10分钟。

(3)扩增的PCR产物经过0.8％的琼脂糖凝胶电泳分离，得到分子量大约700bp(OsCIP1)和300bp(OsCIP2)的条带，用凝胶回收试剂盒回收该片段得到20μL回收产物。

(4)进行测序分析，测序结果显示，oscip1 oscip2-L1突变体中，OsCIP1基因在ATG后10bp缺失4bp，导致移码突变，并且蛋白翻译在139位氨基酸提前终止，而OsCIP2基因的起始密码子ATG前缺失16bp，导致OsCIP2基因不能正常转录和表达；oscip1 oscip2-L2突变体中，OsCIP1基因在ATG后13bp缺失一个碱基，引起移码突变并翻译提前终止，OsCIP2基因的ATG起始密码子前缺失16bp，导致OsCIP2基因不能正常转录和表达(图2)。

四、转基因水稻的表型观察

将突变体oscip1 oscip2的T2代转基因种子及DJ野生型水稻种子和空载对照种子，置于培养皿中(铺一层滤纸)，加入适量水，30℃萌发，两天后种到无底的96孔板中，于木村B培养液里培养。在人工气候室中(光强为10000μmol/m²/s，光照时间为16h/d，温度为30℃)培养至三叶期(14天)；将三叶期幼苗放于4℃低温水浴箱中进行处理96小时，然后转移至木村B培养液中，于人工气候室恢复生长六周(42天)，拍照、统计存活率。每个株系32株，实验重复3次，结果取平均值。低温水浴鉴定方法参考(刘栋峰,唐永严,雒胜韬,罗伟,李志涛,种康,徐云远，植物学报，2019,54(4):509-514)。

结果如图3所示，低温处理前，T2代转oscip1 oscip2水稻和DJ野生型无显著差异；低温处理后，与野生型DJ水稻相比，T2代oscip1 oscip2水稻的两个株系都表现出明显的低温耐受性增强的表型，且存活率显著提高。空载对照组的表型和存活率与野生型相比基本一致，无统计学差异。

上述木村B培养液组成如下(Kato-Noguchi et al.,2005)：

A液母液：1L(200х)

B液母液：1L(200х)

Ca(NO₃)_2.4H₂O 17.235g

EDTA-Fe母液：1L(1000х)

溶解5.57g FeSO₄.7H₂O于200mL蒸馏水中，溶解7.45g Na₂EDTA于200mL蒸馏水中，加热Na₂EDTA溶液，加入FeSO₄.7H₂O溶液，不断搅拌，冷却后定容至1L。

微量元素母液：1L(1000х)

硅酸钠：每L木村B培养液用量100～300mg

1mol/L HCl：8.17mL 37％HCl用蒸馏水稀释至1000mL。

用1mol/L HCl调木村B培养液pH值为5.8。

实际应用中，取5ml A液母液、5ml B液母液、1ml EDTA-Fe母液、1ml微量元素母液、100～300mg硅酸钠混合加蒸馏水稀释至1L，用1mol/L HCl调木村B培养液pH值为5.8，得到1L木村B培养液。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110> 中国科学院植物研究所

<120> 通过突变钙离子结合蛋白OsCIP1/2增强水稻耐冷性的方法

<130> GNCLN201475

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 292

<212> PRT

<213> Oryza sativa L.

<400> 1

Met Ala Gly Tyr Pro Pro Asn Pro Gly Ser Gly Tyr Pro Tyr Gly Gly

1 5 10 15

Ala Gly Gly Tyr Gly Ala Pro Pro Pro Pro Tyr Gly Ser Ser Pro Ala

20 25 30

Pro Ser Ala Pro Pro Tyr Gly Ala Lys Pro Pro Lys Glu Gly Lys Thr

35 40 45

Ser Ser Ser Ser Ala Pro Tyr Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Ala

50 55 60

Pro Pro Ser Thr Gln Pro Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Tyr Gly Ala Pro

65 70 75 80

Pro Ser Ser Gln Pro Tyr Gly Ala Pro Tyr Gly Ala Pro Pro Pro Ser

85 90 95

Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Pro Gly Gly Tyr Gly Ser Pro Phe Ala Ser

100 105 110

Leu Val Pro Ser Ala Phe Pro Pro Gly Thr Asp Pro Asn Val Val Ala

115 120 125

Cys Phe Gln Ala Ala Asp Arg Asp Gly Ser Gly Met Ile Asp Asp Lys

130 135 140

Glu Leu Gln Ser Ala Leu Ser Gly Tyr Ser Gln Ser Phe Ser Leu Arg

145 150 155 160

Thr Val His Leu Leu Met Tyr Leu Phe Thr Asn Thr Asn Val Arg Lys

165 170 175

Ile Gly Pro Lys Glu Phe Thr Ser Val Phe Tyr Ser Leu Gln Asn Trp

180 185 190

Arg Ser Ile Phe Glu Arg Phe Asp Arg Asp Arg Ser Gly Lys Ile Asp

195 200 205

Ala Thr Glu Leu Arg Asp Ala Leu Leu Ser Leu Gly Tyr Ser Val Ser

210 215 220

Pro Thr Val Leu Asp Leu Leu Val Ser Lys Phe Asp Lys Thr Gly Gly

225 230 235 240

Lys Asn Lys Ala Ile Glu Tyr Asp Asn Phe Ile Glu Cys Cys Leu Thr

245 250 255

Val Lys Gly Leu Thr Glu Lys Phe Lys Glu Lys Asp Thr Ala Phe Ser

260 265 270

Gly Ser Ala Thr Phe Thr Tyr Glu Ala Phe Met Leu Thr Val Leu Pro

275 280 285

Phe Leu Ile Ala

290

<210> 2

<211> 879

<212> DNA

<213> Oryza sativa L.

<400> 2

atggccggct acccgccaaa tcccggctcc ggctacccct acggcggcgc cggcggctac 60

ggcgccccgc caccgccgta cggctcctcc cccgccccct ccgccccgcc gtacggcgcg 120

aagcctccca aggaaggtaa gacctcctcc tcttccgccc cttactacgg cggcggaggc 180

ggctacggtg ccccgccatc cacccagccc tacggcagcg gaggcggcta cggcgccccg 240

ccctccagcc agccgtacgg cgcgccgtac ggggccccgc cgccctcgtc ggcgccctac 300

ggggcgcccg gcgggtacgg cagcccgttc gcgtcgctgg tgccgtcggc gttcccgccc 360

gggacggatc ccaacgtggt ggcgtgcttc caggcggcgg accgcgacgg cagcgggatg 420

atcgacgaca aggagctgca gtccgcgctg tccgggtaca gccagagctt cagcctccgc 480

accgtccacc tcctcatgta cctcttcacc aacaccaacg tccgcaagat tggtcccaag 540

gaatttacct ctgtgtttta cagtcttcag aattggaggt ccattttcga gaggtttgat 600

cgtgaccgaa gtggtaaaat tgatgcaaca gaattgcgtg atgctcttct cagtctggga 660

tattcagttt ctccaactgt gctagacttg cttgtgtcaa agtttgacaa gactgggggc 720

aagaacaaag ccattgaata tgataacttc attgaatgct gcctcacagt taagggtctg 780

actgagaagt tcaaggaaaa agacacagcc ttctcgggct ctgcgacttt tacttacgag 840

gctttcatgc tgactgtact cccttttctc attgcataa 879

<210> 3

<211> 3145

<212> DNA

<213> Oryza sativa L.

<400> 3

gctttcttcc attttgaatt tcgaaacaca caaaatatca gaggacgcag acagcttgac 60

tttgacaatc cccaaatttc cccaagctgc agctgcgcat cgcaacctcc gctctctcct 120

aaaccccctc tctccaatgg ccggctaccc gccaaatccc ggctccggct acccctacgg 180

cggcgccggc ggctacggcg ccccgccacc gccgtacggc tcctcccccg ccccctccgc 240

cccgccgtac ggcgcgaagc ctcccaagga aggtaagacc tcctcctctt ccgcccctta 300

ctacggcggc ggaggcggct acggtgcccc gccatccacc cagccctacg gcagcggagg 360

cggctacggc gccccgccct ccagccagcc gtacggcgcg ccgtacgggg ccccgccgcc 420

ctcgtcggcg ccctacgggg cgcccggcgg gtacggcagc ccgttcgcgt cgctggtgcc 480

gtcggcgttc ccgcccggga cggatcccaa cgtggtggcg tgcttccagg cggcggaccg 540

cgacggcagc gggatgatcg acgacaagga gctgcagtcc gcgctgtccg ggtacagcca 600

gagcttcagc ctccgcaccg tccacctcct catgtacctc ttcaccaaca ccaacgtccg 660

caagattggt aagttcatcg tttcatcctc tcacccgcga attgaatagt tctggccttg 720

gggatggtgt gcgttagtct gatcgctcca tggttgctat cgtgcgcgtt gtcctggtca 780

gcggcatacg taatggtggt tgtgctttgg gcgatgtgta gtcaaacgag tggcacgcga 840

ttggcacgtg gctctccgcg ggattatcaa gcttcccacg gtatttgcga tgccagtatg 900

cgacttttgg cttccgatgc ggagatggag tcttccagcc agggctgtag tcagtgtttg 960

catcatacgg ccaggacttg tcgtttggga ggaagacggg ggaacgtggt gggggcaacg 1020

atatagtggc aacttgttaa aagctggagt ttacttttag gtgttgggat gcgggttctt 1080

ttaattaagt ttcttaaatt gcatcaattt ctttgtggga taggattcaa tagaattgtg 1140

gaaaatccta gctcattttg ttgtggtcta ctttggtaca gcatagacac atatactggt 1200

ttatttgcac aatgaacttg taagttctcc cggcttgtga tgtagaaaga attttgggtt 1260

tactccagta aaagggcatg ctactttggc agtttataca tgttaccttg tatactaact 1320

tttgtttgtc agttctattt acaatttcaa attactgcta aactgaaaac tagatatttg 1380

caactttaat caatgccatt tgtcctattc ttttggcatc tgttttctgt gtagagaact 1440

agagattgaa tcatgagctt tgaattgctt gagcagtgta tactctgaaa ccagtgctat 1500

gtttcaggct atcagctagt gagcttgtat atggaatttt ggacttttag ttctaacctg 1560

tgaaatgcac ctgatttaac aaatactgga ttgctagata ctgtactttg aacttaagca 1620

tttcttatat tattcgtttt tatgtaaacc acattgaata tgtgtctttg atcctttcag 1680

gtcccaagga atttacctct gtgttttaca gtcttcagaa ttggagggtg agatgctaca 1740

gcttcagctt tccttttctt ctgtgcggtg gaactaatga agttactgtt gaaactgaat 1800

acgtgcattt tctgcttgta ctgtgcagtc cattttcgag aggtttgatc gtgaccgaag 1860

tggtaaaatt gatgcaacag aattgcgtga tgctcttctc agtctgggat attcagtttc 1920

tccaactgtg ctagacttgc ttgtgtcaaa gtttgacaag actgggggca agaacaaagc 1980

cattgaatat gataacttca ttgagtaaga tgactccaat tatgttttgc agattgcttt 2040

cttagtaatt gttcaagcta ttagcttatc caatcatcca atcattatct aaaaaaaatc 2100

caaaacttgg ttagcatatg tttatatggt cagctaataa taggattggt tcaaattcgt 2160

ttcagcctta tttttaacat tttctgtttg gacatttgtt gacacaaaag tagtctttgg 2220

gatcaaatgt ctggttaaag atgatatttc ctatcaaata taattgttaa attgtttctt 2280

gcacattttg aggcaataac taaaaagata atgtatgcat caactagtct ttctacttct 2340

gttttctgat gcaaaacttt gaattgatct agttgttttt tcatcgttct atttttcagc 2400

cttggatttt aaaccactta agtgtagaaa tataaaagtc ttttgttgct ttggtcacgt 2460

gtcatggctt attataagcc acagccaagc aagtcctaac ctcaaagtta aatattggat 2520

atagtttaaa atcttgatat cttctatcat tccaattcgg cctatataac agtcctaaca 2580

ctattttgtt tgcctttgca gatgctgcct cacagttaag gtaatacact aatgccttca 2640

caggcgctgt taagtcctag cacaatgttc tgttttcact cttttaacat tcatttgtaa 2700

caattttaca gggtctgact gagaagttca aggaaaaaga cacagccttc tcgggctctg 2760

cgacttttac ttacgaggct ttcatgctga ctgtactccc ttttctcatt gcataaaatg 2820

gcagtgtgct gcacagtcga cctttcagga gaccatgccc attgtgttga aacggttctg 2880

taacgtgtgt tcatcgactt gtttttaact gagtttattg tttggatttg aaatgataca 2940

agtgcttccc tgatcgggca tgttacaagt tacaacgctc atgtatgtga ggatatatag 3000

ctccgaaaat gatgtcatga ctcttccgat agacatcaca tatcgatcag ccgacaaatt 3060

caatgcattt gtgaaatgac tcagagagag gacgaagccg agtgaaatga aagtttcgaa 3120

gtgctttgat atcgcttgaa ttatc 3145

<210> 4

<211> 308

<212> PRT

<213> Oryza sativa L.

<400> 4

Met Ala Gly Tyr Pro Pro Asn Pro Gly Ser Gly Tyr Pro Tyr Gly Gly

1 5 10 15

Ala Gly Gly Tyr Gly Ala Pro Pro Pro Pro Tyr Gly Ser Ser Pro Ala

20 25 30

Pro Ser Ala Pro Pro Tyr Gly Glu Lys Pro Pro Lys Glu Gly Lys Thr

35 40 45

Ser Ser Ser Ser Ala Pro Tyr Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Ala

50 55 60

Pro Pro Ser Thr Gln Pro Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Tyr Gly Ala Pro

65 70 75 80

Pro Ser Thr Gln Arg Pro Gln Ser Tyr Gly Gly Gly Tyr Gly Ala Pro

85 90 95

Pro Ser Ser Gln Pro Tyr Gly Ala Pro Tyr Gly Ala Pro Pro Pro Ser

100 105 110

Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Pro Gly Gly Tyr Gly Ser Pro Phe Ala Ser

115 120 125

Leu Val Pro Ser Ala Phe Pro Pro Gly Thr Asp Pro Asn Val Val Ala

130 135 140

Cys Phe Gln Ala Ala Asp Arg Asp Gly Ser Gly Met Ile Asp Asp Lys

145 150 155 160

Glu Leu Gln Ser Ala Leu Ser Gly Tyr Ser Gln Ser Phe Ser Leu Arg

165 170 175

Thr Val His Leu Leu Met Tyr Leu Phe Thr Asn Thr Asn Val Arg Lys

180 185 190

Ile Gly Pro Lys Glu Phe Thr Ser Val Phe Tyr Ser Leu Gln Asn Trp

195 200 205

Arg Ser Ile Phe Glu Arg Phe Asp Arg Asp Gln Ser Gly Lys Ile Asp

210 215 220

Ala Thr Glu Leu Arg Asp Ala Leu Leu Ser Leu Gly Tyr Ser Val Ser

225 230 235 240

Pro Thr Val Leu Asp Leu Leu Val Ser Lys Phe Asp Lys Thr Gly Gly

245 250 255

Lys Asn Lys Ala Ile Glu Tyr Asp Asn Phe Ile Glu Cys Cys Leu Thr

260 265 270

Val Lys Gly Leu Thr Glu Lys Phe Lys Glu Lys Asp Thr Ala Phe Ser

275 280 285

Gly Ser Ala Thr Phe Thr Tyr Glu Ala Phe Met Leu Thr Val Leu Pro

290 295 300

Phe Leu Ile Ala

305

<210> 5

<211> 927

<212> DNA

<213> Oryza sativa L.

<400> 5

atggccggct acccgccaaa ccccggctcc ggctacccct acggcggcgc cggcggctac 60

ggtgccccgc caccgcccta cggctcctcc cccgccccct ccgccccgcc ctacggcgag 120

aagcctccca aggaaggtaa gacctcctcc tcttccgccc cttactacgg cggcggaggc 180

ggctacggcg ccccgccctc cacccagccc tacggcagcg gaggcggcta cggcgcccca 240

ccctccaccc agcggcccca gtcctacggc ggcggctacg gggctccgcc ctccagccag 300

ccgtacggcg cgccatacgg ggccccgccg ccctcgtcgg cgccgtacgg ggcgcccggc 360

gggtacggca gcccgttcgc gtcgctggtg ccatcggcgt tcccgcccgg gacggatccc 420

aacgtggtgg cgtgcttcca ggcggcggac cgcgacggca gcgggatgat cgacgacaag 480

gagctgcagt ccgcgctgtc cgggtacagc cagagcttca gcctccgcac cgtccacctc 540

ctcatgtacc tcttcaccaa caccaacgtc cgcaagattg gtcccaagga atttacctct 600

gtgttttaca gtcttcagaa ttggaggtcc attttcgaga ggtttgatcg tgaccaaagt 660

ggtaaaattg atgcaacaga attgcgtgat gctcttctca gtctgggata ttcagtttct 720

ccaactgtgc tagacttgct tgtgtcaaag tttgacaaga ctgggggcaa gaacaaagcc 780

attgaatatg ataacttcat tgaatgctgc ctcacagtta agggtctgac tgagaagttc 840

aaggagaaag acactgcctt ctcgggctct gcgactttta cttacgaggc tttcatgctg 900

actgtactcc cttttctcat tgcataa 927

<210> 6

<211> 3327

<212> DNA

<213> Oryza sativa L.

<400> 6

attttgaatt tcgaaacaca caaaatatca gaggacgcag acagacttga taaccctcgt 60

tccccaaatt cgcaatccct ctctctccca tggccggcta cccgccaaac cccggctccg 120

gctaccccta cggcggcgcc ggcggctacg gtgccccgcc accgccctac ggctcctccc 180

ccgccccctc cgccccgccc tacggcgaga agcctcccaa ggaaggtaag acctcctcct 240

cttccgcccc ttactacggc ggcggaggcg gctacggcgc cccgccctcc acccagccct 300

acggcagcgg aggcggctac ggcgccccac cctccaccca gcggccccag tcctacggcg 360

gcggctacgg ggctccgccc tccagccagc cgtacggcgc gccatacggg gccccgccgc 420

cctcgtcggc gccgtacggg gcgcccggcg ggtacggcag cccgttcgcg tcgctggtgc 480

catcggcgtt cccgcccggg acggatccca acgtggtggc gtgcttccag gcggcggacc 540

gcgacggcag cgggatgatc gacgacaagg agctgcagtc cgcgctgtcc gggtacagcc 600

agagcttcag cctccgcacc gtccacctcc tcatgtacct cttcaccaac accaacgtcc 660

gcaagattgg taagttcatc gtttcatcgt ctcactctca cccgcgaatt gagtagttct 720

ggccttgggg atggtgtgcg ttagtctgat cgcgccatgg ttgctatcgt gcgcgttgtt 780

ctggtcagcg gcatacgtaa tggtggttgt gcttcgggcg atgtgtagtc aaacgagtgg 840

cacgcgattg gcacgtggct ctccgcggga ttatcaagct tcccacggta tttgcgatgc 900

cagtatgcga cttttggctt gcgatgtgga gatggagtct tccagccagg gctgtagtca 960

gtgtttgcat catacggcta ggacttgtcg tttgggagga agacggggga acgtggtggg 1020

gcaacgatgt agtggcaact tgttaaaagc tggagtttac ttttaggtgt tgggatgcgg 1080

gttcttttaa ttaagtttct taaattgcat caatttcttt gtgggatagg attcaataga 1140

attgtggaaa atcctagctc atcttgtgtg gttatcatgg tgtggtctac tttggtacag 1200

catagacaca tatactacta gtttatttgc acaatgaact tgtaagttct cccggcttgt 1260

gatctagaaa gaattttggg tttactccag taaaagggca tgctactttg gcacatagtt 1320

tatacatgtt accttgtata cttacttttg ttagtcagtt ctatttaaaa tttcaaatta 1380

ctgctaaact gaaaactaga tatttgcaac tttaatcaat gccatttctc ctattctttt 1440

gtcatctgtt ttctgtgtag agaactagag attgaatcat gagctttgaa ttgcttgagc 1500

agtgtatact ctgaaaccag tgctatgttt caggctatca gctagtgagc ttgtatatgg 1560

aattttggac ttttagttct aacctgtgaa atgcacctga tttaacaaat actggattgc 1620

tagatactgt actttgaact taagcatttc ttatattatt cgtttttatg taaaccacat 1680

tgaatatgtg tctttgatcc tttcaggtcc caaggaattt acctctgtgt tttacagtct 1740

tcagaattgg agggtgagat gctacagctt cagctttcct tttcttctgc gcggtggaac 1800

taatgaagtt actgttgaaa ctgaatacgt gcattttctg cttgtactgt gcagtccatt 1860

ttcgagaggt ttgatcgtga ccaaagtggt aaaattgatg caacagaatt gcgtgatgct 1920

cttctcagtc tgggatattc agtttctcca actgtgctag acttgcttgt gtcaaagttt 1980

gacaagactg ggggcaagaa caaagccatt gaatatgata acttcattga gtaagatgac 2040

tccttcaatt atgttttgca gattgctttc ttagtaattg ttcaagctat tagcttatcc 2100

aatcatctac ttcctctgtt ttacaatgta agtcattcta gcatttccca cattcatatt 2160

gatgctaatg aatctagaca tatatatcta tctaaattca ttagcatcaa tatgaatgtg 2220

gaaaatgcta gaatggctta cattgtgaaa tggagggagt aatcattttc taaaaaaaaa 2280

atccaatcat ctcaaacttg gttagcatat gtttatatgg tcagctaatt ataggattgg 2340

ttcaaattcg tttcagcctt atttttaaca ttttattttt gaacatttgt tgacacaaaa 2400

gtagtctttg ggatcaaatg gctggttaaa gatgatattt cctatcaaat ataattgtta 2460

agatgtttct tgcacatttt gaggcaataa ctaaaaggat aatgtatgca tcaactagtc 2520

tttctacttc tgttttctga tgcaaaactt tgaatccatc tagttgtttt ctcatcgttc 2580

tatttttcag ccttggattt taaaccactt aattgtataa atataaaaga cttttgttgc 2640

tttgatcacg tgtcatggct tattataagc cccagccaag caagtcctaa cctcaaagtt 2700

aatattggat atagtttaaa atcttgatat cttctatcat tccaattcgg cctatattac 2760

agtcctaaca ctattttgtt tgcctttgca gatgctgcct cacagttaag gtaatgcact 2820

aattccatca cagacgctgt taagtcctag cacaatgttc tgttttcact ctgttaacat 2880

acatttgtaa caattttaca gggtctgact gagaagttca aggagaaaga cactgccttc 2940

tcgggctctg cgacttttac ttacgaggct ttcatgctga ctgtactccc ttttctcatt 3000

gcataaaatg gcagtgtgct gcacagtcga cctttcagga gaccatgccc attgtgttga 3060

aacggttctg taacgtgtgt tcatcgactt gtttttaact gagtttattg tttggatttg 3120

aaatgataca agtgcttccc tgatcgggca tgttacaatt tacaacgctc atgtatgtga 3180

ggatagctcc gaaaatgatg taatgactct tccgcctaga aatcgcatat cgatcagccc 3240

acaaattcaa tgcatttgtg aaatgactca tagaaaggac taagccgagt gaaatgaaag 3300

tttcgaagtg ctttgatatc gcttgaa 3327

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

ccggggtttg gcgggtagc 19

Claims

1.一种培育耐冷性提高的植物品种的方法，包括使受体植物中OsCIP1蛋白和OsCIP2蛋白的表达量降低的步骤；

所述OsCIP1蛋白为如下任一所示蛋白质：

（A1）氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

（A2）在（A1）所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；

所述OsCIP2蛋白为如下任一所示蛋白质：

（B1）氨基酸序列为SEQ ID No.4的蛋白质；

（B2）在（B1）所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；

所述植物为水稻。

2.一种培育耐冷性提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：对受体植物中能够表达OsCIP1蛋白的核酸分子和能够表达OsCIP2蛋白的核酸分子同时进行抑制表达，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比耐冷性提高；

所述OsCIP1蛋白为如下任一所示蛋白质：

（A1）氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

所述OsCIP2蛋白为如下任一所示蛋白质：

（B1）氨基酸序列为SEQ ID No.4的蛋白质；

所述植物为水稻。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：在所述方法中，对所述受体植物中能够表达所述OsCIP1蛋白的核酸分子和能够表达所述OsCIP2蛋白的核酸分子同时进行抑制表达通过CRISPR/Cas9技术实现。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：在所述方法中，通过CRISPR/Cas9技术实现对所述受体植物中能够表达所述OsCIP1蛋白的核酸分子和能够表达所述OsCIP2蛋白的核酸分子同时进行抑制表达时，靶序列为所述受体植物基因组中SEQ ID No.7所示的DNA分子。

5.根据权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于：能够表达所述OsCIP1蛋白的核酸分子为如下任一所述的DNA分子：

（a1）SEQ ID No.2所示的DNA分子；

（a2）SEQ ID No.3所示的DNA分子；

能够表达所述OsCIP2蛋白的核酸分子为如下任一所述的DNA分子：

（b1）SEQ ID No.5所示的DNA分子；

（b2）SEQ ID No.6所示的DNA分子。