CN109554414A

CN109554414A - 金针菇基因Fvegt1、Fvegt2和Fvegt3在合成麦角硫因中的应用

Info

Publication number: CN109554414A
Application number: CN201811332635.6A
Authority: CN
Inventors: 林俊芳; 林硕欣; 杨雪琴; 郭丽琼
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2018-11-09
Filing date: 2018-11-09
Publication date: 2019-04-02
Anticipated expiration: 2038-11-09
Also published as: CN109554414B

Abstract

本发明公开一种金针菇基因Fvegt1、Fvegt2和Fvegt3在合成麦角硫因中的应用，属于生物合成领域。本发明通过同源克隆法和基因合成法从金针菇菌丝体中克隆了麦角硫因合成途径中的3个基因，进行了体外表达，实现了体外生物合成金针菇麦角硫因。FvEgt1能将His、Cys、SAM和FeSO₄等底物催化形成AdoHcy和HerSul；FvEgt2能与Cys结合，激活半胱氨酸的SH形成硫阴离子；而FvEgt3则催化PLP与HerSul形成酮亚胺复合物；前者活化的硫阴离子亲核攻击酮亚胺复合物后便可形成麦角硫因。本发明首次阐明了除细菌、子囊菌等以外的担子菌金针菇中麦角硫因的生物合成途径。

Description

金针菇基因Fvegt1、Fvegt2和Fvegt3在合成麦角硫因中的应用

技术领域

本发明属于生物合成领域，特别涉及一种金针菇基因Fvegt1、Fvegt2和Fvegt3在合成麦角硫因中的应用。

背景技术

麦角硫因(L-Ergothioneine，简称EGT)，是一种稀有的天然2-硫代咪唑氨基酸，有硫酮(thione)和硫醇(thiol)两种异构体形式。近来的研究表明，麦角硫因有很强的抗氧化性，具有抗炎、抗氧化、保护细胞免受紫外损伤，保护心血管等作用，广泛存在于动植物体内，是机体内重要的活性物质。动植物无法自身合成EGT，但可从周围环境或饮食中获取。植物主要通过根系及放射菌类共生体获得(Eungjun et al., 2010)，而人体可通过阳离子转运蛋白OCTN1从蘑菇、大蒜、小麦和豆类等多种食物种获取(Dubost et al., 2007)，且在特定的组织或细胞中富集，如肝脏、肾脏等。在我国，EGT的生产一直未能实现大规模的工业化生产。目前市场上的EGT多以化学合成的方式获得。然而，由于EGT是手性氨基酸，通过化学合成左旋EGT十分困难，其难点在于原料2-巯基咪唑的制备困难，并且α位碳的酸性会使反应易发生外消旋作用而无法达到预期产量，Oxis国际公司研制出一种新方法，通过将巯基导入咪唑环来获得2-巯基咪唑，解决了咪唑获得困难的问题(Xu.et al.,1995)。然而，由于化学合成的EGT在安全上难以达到保证，且合成原料昂贵，成本高，依然限制了EGT的应用。

从蘑菇、猪血、动物组织和麦角等天然生物中也可提取到，但通过这种方法获得的产量依然较低，研究表明猪血中提取的EGT含量较高，也仅为60mg/L，且杂质较多，药物残留，提取成本高等问题依然限制了EGT的工业化发展。Osawa等人利用耻垢分枝杆菌的egt基因在大肠杆菌中进行了EGT的异源表达，获得了24mg/L(104μM)的分泌型EGT(Osawa etal.,2017)，但由于该基因来源于耻垢分枝杆菌不容易被消费者所接受。利用蘑菇菌丝体深层发酵获得EGT是近年来获得EGT的主要手段(专利申请号 201110460029.4，姜文侠、刘琦、周涛、杨萍)，但是由于蘑菇菌丝深层发酵所得的麦角硫因含量很低，生产成本高，价格还十分昂贵。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种金针菇基因Fvegt1、Fvegt2和Fvegt3 在合成麦角硫因中的应用。

本发明的另一目的在于提供金针菇基因Fvegt1、Fvegt2和Fvegt3。

本发明的另一目的在于提供上述金针菇基因所编码的蛋白质。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供一种金针菇基因Fvegt1、Fvegt2和Fvegt3在合成麦角硫因中的应用。

优选的，金针菇基因Fvegt1、Fvegt2和Fvegt3在体外联合生物合成麦角硫因中的应用。

所述的金针菇基因Fvegt1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO： 2所示。

所述的金针菇基因Fvegt2的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

所述的金针菇基因Fvegt3的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO： 6所示。

本发明还提供一种金针菇基因Fvegt1编码的蛋白质FvEgt1，其氨基酸序列如SEQID NO：2所示。

编码上述蛋白质的金针菇基因Fvegt1的核苷酸序列，优选的，其核苷酸序列如SEQID NO：1所示。

本发明还提供一种金针菇基因Fvegt2编码的蛋白质FvEgt2，其氨基酸序列如SEQID NO：4所示。

编码上述蛋白质的金针菇基因Fvegt2的核苷酸序列，优选的，其核苷酸序列如SEQID NO：3所示。

本发明还提供一种金针菇基因Fvegt3编码的蛋白质FvEgt3，其氨基酸序列如SEQID NO：6所示。

编码上述蛋白质的金针菇基因Fvegt3的核苷酸序列，优选的，其核苷酸序列如SEQID NO：5所示。

本发明还提供了含有本发明基因的表达载体和宿主菌以及扩增该基因的任一片段的引物。

其中，FvEgt1能将组氨酸(His)、半胱氨酸(Cys)、S腺苷甲硫氨酸(SAM)和FeSO₄等底物催化形成S腺苷L高半胱氨酸(AdoHcy)和组氨酸甜菜碱半胱氨酸亚砜(HerSul)；

FvEgt2能与半胱氨酸(Cys)结合，激活半胱氨酸的SH形成硫阴离子；而FvEgt3则催化磷酸吡哆醛 (PLP)与组氨酸甜菜碱半胱氨酸亚砜(HerSul)形成酮亚胺复合物；前者活化的硫阴离子亲核攻击酮亚胺复合物后便可形成麦角硫因。

总之，FvEgt1可催化His和Cys形成HerSul，FvEgt2和FvEgt3共同将HerSul转化为EGT。

本发明的机理是：

金针菇(Flammulina velutipes)不仅营养丰富，美味可口而且含有多种活性成分，是著名的食药兼用菌和保健食品。我们研究发现金针菇的菌丝体和子实体里均含有麦角硫因，通过对金针菇的基因组和本课题金针菇冷诱导前后的转录组数据进行生物信息学分析发现金针菇含有麦角硫因生物合成的3个基因 Fvegt1、Fvegt2和Fvegt3。本发明通过同源克隆法和基因合成法从金针菇菌丝体中克隆了麦角硫因合成途径中的3个基因，进行了体外表达，实现了体外生物合成金针菇麦角硫因。本发明专利为麦角硫因的生产提供了一条全新的生物合成途径。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)Fvegt1基因的表达及功能鉴定。本发明利用Blast p同源比对获得了金针菇麦角硫因生物合成基因Fvegt1，重叠衍生PCR克隆了该基因并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达后获得了重组酶FvEgt1。HPLC 和LC-MS分析结果表明：重组酶FvEgt1能将组氨酸、半胱氨酸和S腺苷甲硫氨酸等底物催化形成S腺苷 L高半胱氨酸和组氨酸甜菜碱半胱氨酸亚砜。本发明首次定义了金针菇中Fvegt1基因的功能，该基因表达的重组酶FvEgt1不仅具有甲基转移酶的功能，还具有亚砜合酶的功能。

(2)Fvegt2和Fvegt3基因的表达及功能鉴定。本发明利用Blast p同源比对获得了金针菇麦角硫因生物合成基因Fvegt2和Fvegt3，采用全基因合成克隆后在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达，获得了重组酶 FvEgt2和FvEgt3。HPLC和ESI-MS分析结果表明，重组酶FvEgt2和FvEgt2能共同催化组氨酸甜菜碱半胱氨酸亚砜形成麦角硫因。本发明首次阐明了除细菌、子囊菌等以外的担子菌金针菇中麦角硫因的生物合成途径。

(3)FvEgt2和FvEgt3作用机制的研究。本发明首次发现了金针菇中存在的两种半胱氨酸脱硫酶，即 FvEgt2，半胱氨酸-半胱氨酸脱硫酶和FvEgt3，磷酸吡哆醛-半胱氨酸脱硫酶。这两种酶共同参与着麦角硫因的生成。其中，FvEgt2能与半胱氨酸结合，激活半胱氨酸的SH形成硫阴离子。而FvEgt3则催化磷酸吡哆醛与组氨酸甜菜碱半胱氨酸亚砜形成酮亚胺复合物。前者活化的硫阴离子亲核攻击酮亚胺复合物后便可形成麦角硫因。

附图说明

图1是金针菇基因组DNA电泳图。

图2是Fvegt1外显子片段扩增结果图，其中，1：Fvegt1-1；2：Fvegt1-2；3：Fvegt1-3。

图3是Fvegt1外显子片段加尾扩增结果图，其中，1+:Fvegt1-1⁺扩增结果；2+:Fvegt1-2⁺扩增结果； 3+:Fvegt1-3⁺扩增结果。

图4是Fvegt1重叠延伸扩增结果图。

图5是PCR扩增Fvegt1鉴定图。

图6是克隆的Fvegt1编码序列与chr02_AA_00171编码序列的比对结果。

图7是pET32a-Fvegt双酶切鉴定图，其中，1：pET32a-Fvegt1；2：pET32a-Fvegt2；3：pET32a-Fvegt3。

图8是不同温度下FvEgt1、FvEgt2和FvEgt3蛋白表达情况，其中，左：FvEgt1不同温度下的表达情况；右：FvEgt2和FvEgt3不同温度下的表达情况；注：箭头所指为目标蛋白大小。

图9是不同IPTG浓度下FvEgt1、FvEgt2和FvEgt3蛋白表达情况，其中，左：FvEgt1蛋白；右：FvEgt2 和FvEgt3蛋白；注：箭头所指为目标蛋白大小。

图10是不同诱导时间下FvEgt1、FvEgt2和FvEgt3蛋白的表达(左)及纯化情况(右)；注：箭头所指即为目标蛋白大小。

图11是HPLC检测结果，其中，A：SAM标准品；B：AdoHcy标准品；E:EGT标准品；C、D：FvEgt1 催化的反应液；F：反应体系(三)产物。

图12是反应液LC-MS检测结果；c：AdoHcy；d：HerSul；f：EGT。

图13是金针菇中麦角硫因生物合成通路。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

1材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1菌株和质粒

金针菇YX(商品名玉雪，购自北京吉蕈科技有限公司)，大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21(DE3)均购自天根生物科技有限公司。质粒pMD18-T购自TAKARA，用于基因的克隆；质粒pET-32a(+)购自Promega 公司，用于基因的表达。

1.1.2培养基及试剂配制

PDA培养基：用于金针菇菌丝的培养。土豆(去皮)200.0g，葡萄糖20.0g，MgSO₄·7H₂O 1.5g，KH₂PO₄ 3.0g，蒸馏水1000mL，自然pH，琼脂20g(固体培养基添加)，121℃灭菌30min。

LB培养基：用于DH5α、BL21的培养。胰化蛋白胨10.0g，酵母提取为5.0g，NaCl10.0g，蒸馏水 1000mL，pH 7.4，121℃灭菌30min。

1×TAE Buffer：将50×TAE Buffer使用时稀释50倍，即1×TAE Buffer。

0.1M CaCl₂：称取1.11g CaCl₂溶于足量的蒸馏水中，容量瓶定容至100mL，121℃灭菌30min，冷却后置于4℃备用。

1％琼脂糖凝胶：称取0.2g琼脂粉于20mL的1×TAE Buffer，于微波炉中加热溶解，待温度降至50℃ 左右，加入1μL的溴化乙锭(EB)，轻轻摇匀。

氨苄青霉素(Amp)(100mg/mL)：1000mg氨苄青霉素钠盐溶于足量水中，定容至10mL，0.22μm 滤膜抽滤除菌，分装后于-20℃保存。

10％SDS：称取5g电泳级SDS，加入适量ddH₂O充分溶解，加热至68℃助溶，用37％的浓HCl调节pH至7.2，定容至50mL，121℃灭菌30min。

75％乙醇：无核糖核酸酶(RNase)去离子水配制

5×Tris-Glycine Buffer(SDS-PAGE电泳缓冲液)：称取15.1g Tris，94gGlycine，5g SDS，加超纯水溶解，定容至1L，室温保存；

Tris缓冲液(pH 8.8)：36.3g Tris碱，48mL 1N HCl，加ddH₂O至100mL；

Tris缓冲液(pH 6.8)：5.98g Tris碱，48mL 1N HCl，加ddH₂O至100mL；

10％(W/V)过硫酸铵：称取0.1g过硫酸铵，加入超纯水1mL并充分溶解，4℃保存(有效期约为两周)；

上样缓冲液(5×)：1mol/L Tirs-HCl(pH 8.8)0.6mL，10％SDS 2mL，50％甘油5mL，2-巯基乙醇0.5 mL，1％溴酚兰1mL，超纯水0.9mL；

30％丙烯酰胺母液：称取29g Acrylamide，1g BIS，加超纯水溶解，定容至100mL，用0.45μm滤膜滤去杂质，4℃避光保存。

TBST(TBS-Tween20)：量取50mL 20×TBS，0.5mL Tween 20，加超纯水定容至1L，混匀，室温保存；

考马斯亮蓝染色液：45％甲醇，45％水，10％冰乙酸，在100mL混合液中充分溶解0.25g考马斯亮蓝 R250；

脱色液：80％蒸馏水，10％甲醇，10％冰乙酸。

裂解液Buffer A：100mM Tris-HCl(pH 9.5)，1M KCl，10mM EDTA；

1×Ni-NTA Bind Buffer：50mM NaH₂PO₄pH 8.0，300mM NaCl，10mM咪唑，10mMβ-巯基乙醇。

1×Ni-NTA Washing Buffer：50mM NaH₂PO₄pH 8.0，300mM NaCl，20mM咪唑；

1×Ni-NTA Elution Buffer：50mM NaH₂PO₄pH 8.0，300mM NaCl，30mM咪唑。

1.1.3酶与试剂盒

(1)限制性内切酶购自Thermo Fisher Scientific。

(2)DNA聚合酶用于基因克隆的DNA聚合酶采用高保真的Pfu DNA聚合酶，购自东盛生物。用于基因检测的DNA聚合酶采用Kodaq 2×PCR MasterMix(基因组作为模板)和KODFX(菌体作为模板)，分别购自abm公司和东洋纺。

(3)其他核酸酶T4 DNA连接酶(T4 DNA Ligase)购自TAKARA；RNases购自东盛生物。

(4)试剂盒质粒DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA小量回收试剂盒、琼脂糖凝胶DNA微量回收试剂盒均购自广州美基生物科技有限公司。HP Fungal DNA Kit、E.Z.N.AFungal RNA Protocol均购自 OMEGA。RevertAid First Strand cDNA Synthesis购自Thermo Scientific

(5)其他生化试剂：

组氨酸、S腺苷甲硫氨酸、S腺苷L高半胱氨酸标准品、磷酸吡哆醛(PLP)、半胱氨酸盐酸盐、麦角硫因标准品。

1.2麦角硫因生物合成基因的功能研究

1.2.1引物的设计与合成

从金针菇基因组数据库(http://112.220.192.2/fve/)中找出与灰盖鬼伞(Coprinopsis cinerea)S腺苷甲硫氨酸依赖型甲基转移酶基因(GenBank,CC1G02949T0)(Jones et al.,2014)和粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)半胱氨酸脱硫酶基因(NCU11365)(Galagan et al.,2003)同源性较高的序列。结合本课题组金针菇YX冷诱导前后菌丝阶段和原基阶段转录组数据进行生物信息学分析，得到金针菇YX中的麦角硫因编码序列Fvegt1、Fvegt2和Fvegt3。利用Primer premier 5.0分别对其进行引物设计，见表1，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1麦角硫因相关基因引物序列信息表

1.2.2麦角硫因生物合成基因的克隆

1.2.2.1 Fvegt1-1⁺/Fvegt1-2⁺/Fvegt1-3⁺的获得

采用HP Fungal DNA Kit试剂盒提取金针菇基因组DNA，具体操作步骤详见使用说明书。以基因组 DNA为模板，采用引物Fvegt1-1S/Fvegt1-1AS，Fvegt1-2S/Fvegt1-2AS，Fvegt1-3S/Fvegt1-3AS扩增Fvegt1 三个外显子，扩增体系及反应条件如下(30个循环)。PCR反应参数：94℃预变性3min；94℃变性30s； Fvegt1-1 51℃退火15s，Fvegt1-2 60℃退火25s，Fvegt1-3 62℃退火5s；Fvegt1-1 72℃延伸27s，Fvegt1-2 72℃延伸39s，Fvegt1-372℃延伸27s；共30个循环，最后72℃末端延伸10min。PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定后，用DNA回收试剂盒回收，具体操作步骤详见使用说明书。

分别以Fvegt1-1/Fvegt1-2/Fvegt1-3为模板，用引物Fvegt1-1(+)S/Fvegt1-1(+)AS、Fvegt1-2(+) S/Fvegt1-2(+)AS、Fvegt1-3(+)S/Fvegt1-3(+)AS扩增Fvegt1-1⁺/Fvegt1-2⁺/Fvegt1-3⁺，使得Fvegt1 第一外显子含有15bp与第二外显子重叠的区域，第二外显子含有15bp与第三外显子重叠的区域，第三外显子含有15bp与Fvegt1第二外显子重叠的区域。扩增体系及反应条件如下：

Fvegt1-1/Fvegt1-2/Fvegt1-3	1.5μL
		pfu	3μL
10×pfu-buffer	15μL
		dNTP(10μM)	12μL
Fvegt1-1(+)S/Fvegt1-2(+)S/Fvegt1-3(+)S(10μM)	6μL
		Fvegt1-1(+)AS/Fvegt1-2(+)A S/Fvegt1-3(+)A S(10μM)	6μL
ddH<sub>2</sub>O	106.5μL
		Total volum	150μL

PCR反应参数：94℃预变性3min；94℃变性30s；Fvegt1-1 60℃退火15s，Fvegt1-262℃退火30s， Fvegt1-3 67℃退火5s；Fvegt1-1 72℃延伸1min，Fvegt1-2 72℃延伸1min20s，Fvegt1-3 72℃延伸30s；共30个循环，最后72℃末端延伸10min，PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定后，用DNA回收试剂盒回收。

1.2.2.2重叠延伸PCR

将Fvegt1-1⁺/Fvegt1-2⁺/Fvegt1-3⁺按照相同的摩尔比(a/437＝b/636＝c/181)，计算各个片段最终添加的物质的量，并确保三个片段总模板的物质的量总和接近400mg(a+b+c<400)。PCR反应过程选用第一个外显子的上游引物Fvegt1-1S和第三个外显子的下游引物Fvegt1-3AS为引物。

PCR反应参数：94℃预变性5min；94℃变性15s；65℃退火30s，循环10次，每次温度降低0.5℃， 68℃延伸2min 39s后，94℃变性15s；60℃退火30s，68℃延伸2min 39s，循环10次，最后72℃末端延伸8min。

程序反应完成后，补加引物Fvegt1-1S，Fvegt1-3AS各1μL，pfu 0.5μL继续反应，94℃预变性5min； 94℃变性25s；65℃退火30s，循环10次，每次温度降低0.5℃，72℃延伸2min39s后，94℃变性25s； 60℃退火30s，72℃延伸2min 39s，循环10次，最后72℃末端延伸8min。PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定后，用DNA回收试剂盒回收。

1.2.2.3克隆载体pMD18-Fvegt1的构建

通过Pfu DNA聚合酶扩增出来的末端为平末端，为了能进一步进行TA克隆，需在重组产物两端分别加A。采用Ex-Taq酶进行加A，加A体系如下：

PCR产物	5μL
		Ex-Taq	1μL
10×ET-buffer	1μL
		dNTP(10μM)	0.8μL
ddH<sub>2</sub>O	2.2μL
		Total volum	10μL

混匀后，70℃恒温加热30min。按照琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收后进行TA克隆。取上述得到的重组片段4μL与pMD18-T 1μL混合，加入5μL的Solution Ⅰ4℃过夜连接。连接产物转入大肠杆菌 DH5α中。挑取阳性单菌落继续培养后，提取质粒做PCR鉴定。PCR反应体系及反应条件如下所示(30 个循环)：

pMD18-Fvegt1	1μL
		Ex-Taq	0.25μL
10×ET-buffer	5μL
		dNTP(10μM)	0.8μL
Fvegt1-S(10μM)	1μL
		Fvegt1-AS(10μM)	1μL
ddH<sub>2</sub>O	2.2μL
		Total volum	10μL

PCR反应参数：94℃预变性5min；94℃变性30s；50℃退火30s；72℃延伸1min 16s；共30个循环，最后72℃末端延伸5min，PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定后，菌液送至测序。

1.2.2.4 Fvegt2、Fvegt3基因的合成

Fvegt2、Fvegt3的全基因合成交由苏州金唯智生物科技有限公司完成，Fvegt2合成时引入Xho Ⅰ和 BamH Ⅰ两个酶切位点，Fvegt3合成时引入EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ两个酶切位点。

1.2.3麦角硫因生物合成基因的表达

1.2.3.1 Fvegt1片段的扩增

设计引物时分别在上下游引物5’端增加Xho Ⅰ和BamH Ⅰ两个限制性内切酶酶切位点，扩增含有Xho Ⅰ和BamH Ⅰ的Fvegt1片段。PCR反应体系及反应条件如下所示，PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测后，按照DNA回收试剂盒回收，-20℃保存备用。

PCR反应参数：94℃预变性3min；94℃变性30s；60℃退火30s；72℃延伸1min16s；共30个循环，最后72℃末端延伸5min。PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测后，按照DNA回收试剂盒回收，-20℃ 保存备用。

pMD18-Fvegt1	2μL
		2×PCR Mix	25μL
Fvegt1-S(XB)(10μM)	2μL
		Fvegt1-AS(XB)(10μM)	2μL
ddH<sub>2</sub>O	19μL
		Total volum	50μL

1.2.3.2双酶切

将含有质粒pET-32a(+)、pUC57-Fvegt2和pUC57-Fvegt3(pUC57-Fvegt2：双酶切质粒pUC57和Fvegt2 后T4连接得到，质粒pUC57购自苏州金唯智生物科技有限公司；pUC57-Fvegt3同理)的菌液加入含有 Amp的LB液体培养基中，37℃，200rpm过夜培养活化。经活化后的菌液参照美基生物小量质粒提取试剂盒提取质粒，具体操作详见使用说明书。质粒和扩增后的Fvegt1片段分别按照如下体系进行双酶切，37℃ 温浴25min，酶切产物经1％的琼脂糖凝胶进行鉴定后，按照琼脂糖凝胶回收试剂盒回收后，-20℃保存备用。

pET-32a(+)	23μL	pET-32a(+)	23μL
				EcoR Ⅰ(10U/μL)	1μL	BamH Ⅰ(10U/μL)	1μL
Xho Ⅰ(10U/μL)	1μL	Xho Ⅰ(10U/μL)	1μL
				Q buffer	5μL	Q buffer	5μL
ddH<sub>2</sub>O	20μL	ddH<sub>2</sub>O	20μL
				Total volum	50μL	Total volum	50μL

含双酶切位点的Fvegt1	23μL	pUC57-Fvegt2	23μL	pUC57-Fvegt3	23μL
						BamH Ⅰ(10U/μL)	1μL	BamH Ⅰ(10U/μL)	1μL	EcoR Ⅰ(10U/μL)	1μL
Xho Ⅰ(10U/μL)	1μL	Xho Ⅰ(10U/μL)	1μL	Xho Ⅰ(10U/μL)	1μL
						Q buffer	5μL	Q buffer	5μL	Q buffer	5μL
ddH<sub>2</sub>O	20μL	ddH<sub>2</sub>O	20μL	ddH<sub>2</sub>O	20μL
						Total volum	50μL	Total volum	50μL	Total volum	50μL

1.2.3.3连接及转化大肠杆菌BL21(DE3)

经双酶切后的pET32a、Fvegt1、Fvegt2和Fvegt3分别通过T4 DNA Ligase，连接体系如下，pET32a 片段与Fvegt2的连接体系参照Fvegt1进行。16℃连接18h后，连接产物转入大肠杆菌DH5α。挑取阳性单菌落继续培养，提取质粒用于PCR和双酶切鉴定，鉴定成功的菌株送至测序。将测序成功的质粒 pET32a-Fvegt1、pET32a-Fvegt2、pET32a-Fvegt3转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。大肠杆菌 BL21(DE3)感受态细胞的制备及转化方法参照转化DH5α的方法进行。挑取阳性单菌落于含相应抗生素的 LB液体培养基中过夜培养，提取质粒，用于PCR和双酶切鉴定，鉴定成功的菌株送至测序。鉴定成功地菌液即为重组酶表达工程菌液。

T4 DNA Ligase	0.5μL	T4 DNA Ligase	0.5μL
				T4 DNA Ligase buffer	1μL	T4 DNA Ligase buffer	1μL
pET32a片段	5μL	pET32a片段	6μL
				Fvegt1	3.5μL	Fvegt3	2.5μL
Total volum	10μL	Total volum	10μL

1.2.3.4重组酶表达条件的优化

分别取含有重组质粒pET32a-Fvegt1、pET32a-Fvegt2、pET32a-Fvegt3的BL21工程菌液于10mL含有 Amp抗生素的LB液体培养基中过夜培养，以活化菌株。为了探究各个重组酶的最优表达条件，本实验分别对诱导温度，IPTG浓度、诱导时间等因素进行了优化，以期得到更优的表达量。

1.2.3.4.1诱导温度的优化

按照1％的接种量将活化后的菌液接种到50mL LB液体培养基中，37℃，220rpm培养至OD_600nm＝0.6-0.8左右，加入终浓度为0.4mM的IPTG，分别在20℃、25℃、30℃、37℃下诱导表达16h。利用 SDS-PAGE检测各温度条件下重组蛋白的表达量，从而得到最优的诱导温度。

1.2.3.4.2 IPTG浓度的优化

按照1％的接种量将活化后的菌液接种到50mL LB液体培养基中，37℃，220rpm培养至OD_600nm＝0.6-0.8左右，加入终浓度分别为0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM的IPTG，最适温度下诱导表达16 h。利用SDS-PAGE检测各IPTG下重组蛋白的表达量,从而得到最优的IPTG浓度。

1.2.3.4.3诱导时间的优化

按照1％的接种量将活化后的菌液接种到50mL LB液体培养基中，37℃，220rpm培养至OD_600nm＝0.6-0.8左右，加入最适IPTG浓度，在最适温度下分别诱导表达3h、10h、16h。利用SDS-PAGE检测不同诱导时间下重组蛋白的表达量,从而得到最优的诱导时间。

1.2.3.5重组酶的纯化

按照1％的接种量将活化后的菌液接种到100mL LB液体培养基中，37℃，220rpm培养至OD_600nm＝0.6-0.8左右，加入最适IPTG浓度，在最适温度下诱导表达最佳时间。诱导表达完成后，4℃，8,000g 离心10min收集菌体，每100mL菌液加入20mL磷酸缓冲液(PBS，pH 7.4)进行重悬。利用超声破碎仪对重悬菌体进行破碎(菌体全程冰浴)，总超声时间为12min，工作时间5s，间歇时间3s，功率400W。破碎后按4℃，8,000g离心10min，收集上清，并用Ni柱对重组蛋白进行纯化。具体操作如下：放掉20％乙醇柱保护液，用4mL灭菌的超纯水清洗镍柱四次，加入4mL的Binding Buffer结合清洗两次。加入4mL 粗酶液，充分混匀后，4℃挂柱1h，期间混匀2次，放掉粗酶液并收集起来，用4mL的Washing Buffer 冲洗镍柱两次，最后分别用500μL的Elution Buffer洗脱四次，收集每次洗脱液。洗脱完后用20％乙醇清洗并保存镍柱。

1.2.3.6 SDS-PAGE检测

(1)分离胶的制备：取分离胶贮存液1.25mL，Tris-HCl缓冲液(pH 8.8)0.625mL，10％SDS 0.05mL， 10％过硫酸铵mL，1％TEMED 0.5mL，去离子水2.55mL。充分混匀后，用1mL枪头加至两块玻璃板之间，高度为距样品模梳齿下缘约1cm，并赶尽胶表面气泡，继续加入800μL蒸馏水使胶面平整，并隔绝空气。45分钟后，待胶块凝固后倒掉蒸馏水，并用吸水纸吸去多余的水。

(2)浓缩胶的制备：取浓缩胶贮存液0.6mL，Tris-HCl缓冲液(pH 6.8)0.25mL，10％SDS 0.02mL， 10％过硫酸铵0.01mL，1％TEMED 0.4mL，去离子水0.92mL。充分混匀。用1mL枪头加至两块玻璃板之间分离胶上层，轻轻插入样品模梳齿，待胶凝固后，拔出梳齿。

(3)样品处理：将待测蛋白与蛋白上样Buffer以4：1比例混匀后，经沸水浴加热5min，使蛋白变性后冷却至室温备用。

(4)上样电泳：取10μL经沸水浴加热的变性蛋白，透过电泳缓冲液加至浓缩胶上样孔，上样完后，开始电泳。将电压调至50V，待样品全部进入分离胶以后，将电压调至100V，将蓝色染料到达制胶器1cm 时，结束电泳，关闭电源。

(5)染色及脱色：电泳结束后，取出玻璃板，轻轻将蛋白胶从玻璃板上切割下来，同时切去浓缩胶，将蛋白胶放入培养皿中，加入考马斯亮蓝染色液染色1h后，加入脱色液过夜脱色，期间换脱色液2次。

1.2.3.7重组酶功能的鉴定

1.2.3.7.1 FvEgt1重组酶功能的鉴定

通过NCBI-Conserved Domains Search database对FvEgt1氨基酸序列保守结构域分析发现，重组酶 FvEgt1不仅具有SAM依赖性甲基转移酶的结构域，还有组氨酰半胱氨酸亚砜合酶的结构域。因此，本发明假定在FvEgt1酶的催化下，His能一步转化为HerSul。反应体系如下所示：

1mM Tris-HCl(pH7.0)	230μL
		5mM His	80μL
5mM SAM	80μL
		5mM FeSO<sub>4</sub>	80μL
5mM Cys	80μL
		FvEgt1	50μL
Total volum	600μL

反应液混匀后，于35℃反应1h后，通过高效液相色谱(HPLC)和液相质谱联用仪(LC-MS)检测产物AdoHcy和HerSul的生成。由于缺乏Her(组氨酸甜菜碱)及HerSul的标准品，为了检测重组蛋白是否具有SAM依赖型甲基转移酶活性，本实验通过检测SAM脱甲基后的产物AdoHcy的生成来检测重组蛋白的活性。

1.2.3.7.2 FvEgt2、FvEgt3重组酶功能的鉴定

通过NCBI-Conserved Domains Search database对FvEgt2和FvEgt3氨基酸序列保守结构域分析发现， FvEgt2和FvEgt3均属于半胱氨酸脱硫酶。为了探究FvEgt2和FvEgt3的作用机制，本文设计了三个实验策略，反应体系如下：

各反应液混匀后，于35℃反应2h。经过旋转蒸发浓缩后，采用HPLC和LC-MS测定麦角硫因的生成及产量，色谱条件参照Liu等人(Liu et al.,2016)的方法： HILICAmphion Ⅱ色谱柱(5μm，4.6×250 mm)；检测波长为254nm，流速为1mL/min，柱温为40℃，进样量20μL，流动相乙腈：乙酸铵(85：15， pH 6.5)。麦角硫因标准品制备浓度分别为0mg/L、5mg/L、10mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L、200 mg/L。麦角硫因标准品均溶解于无菌水中，用相同的条件制作工作标准曲线并对样品进行测定。

采用离子淌度-Q-TOF高分辨液质谱联用仪检测目标产物麦角硫因的生成。洗脱条件如下： HILIC Amphion Ⅱ色谱柱(5μm，4.6×250mm)，乙腈：水＝75：25。检测条件如下：PDA检测波长为210-400 nm，+ESI电离，毛细管电压为2.3kV；源温度为120℃，气帘气30L/h，雾化器为6.0Bar，采用Resolution 分析模式，锥孔电压为35V，脱溶剂气温度为350℃，脱溶剂气为950L/h。

2结果与分析

2.1麦角硫因生物合成基因的功能鉴定

2.1.1麦角硫因生物合成基因的克隆

由于Fvegt1基因结构较为简单，由三个外显子和两个内含子组成。因此本文采用重叠延伸PCR的方法将Fvegt1基因的三个外显子进行连接，从而得到完整的Fvegt1编码序列。Fvegt2和Fvegt3基因的结构相对复杂，采用全基因合成的方式获得，全基因合成交由金维智公司完成。

2.1.1.1金针菇基因组DNA的提取

本文采用HP Fungal DNAKit试剂盒提取基因组DNA，经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，目标条带清晰且单一，说明基因组DNA较为完整，可作为下一步PCR模板。

2.1.1.2 Fvegt1外显子的扩增

按上述步骤以金针菇基因组DNA为模板扩增后的产物如图2所示。

Fvegt1-1大小为438bp，Fvegt1-2大小为637bp，Fvegt1-3大小为182bp。从图中可看到，在500bp 附近，500bp-800bp附近以及在200bp附近均出现了相应的条带，且亮度较好。由此可初步判定Fvegt1-1， Fvegt1-2，Fvegt1-3扩增成功，可继续加尾扩增。

2.1.1.3加尾

按上述步骤以Fvegt1-1，Fvegt1-2，Fvegt1-3为模板加尾扩增后，结果如图3所示，Fvegt1-1⁺，大小为 453bp，从图中可看到，在400bp附近出现了相应的条带，且亮度较好；Fvegt1-2⁺，大小为667bp，从图中可看到，在500bp-800bp之间出现了相应的条带，且亮度较好；Fvegt1-3⁺，大小为197bp，从图中可看到，在200bp附近出现了相应的条带。由此可初步判定Fvegt1-1⁺，Fvegt1-2⁺，Fvegt1-3⁺扩增成功。PCR 产物经回收后由Nano Drop测定浓度后，用于后续重叠延伸反应。

2.1.1.4重叠延伸PCR

将Fvegt1-1⁺，Fvegt1-2⁺，Fvegt1-3⁺三个片段重叠延伸PCR扩增后，结果如图4所示，Fvegt1大小为 1257bp，从图中可看到，在1200-2000bp之间出现了相应的条带，且亮度较好，由此可初步判定Fvegt1-1， Fvegt1-2，Fvegt1-3成功连接成为一段完整的编码序列Fvegt1，回收PCR产物进行后续克隆。在重叠衍生 PCR的过程中，为了保证各片段能顺利地连接起来，在使用DNA聚合酶扩增模板片段时，尽量选择扩增产物为平末端的DNA聚合酶。

2.1.1.5转化及鉴定

将Fvegt1完整片段经TA克隆测序后，结果如图5所示，在1200-2000bp之间出现了相应大小的条带，说明PCR鉴定成功。目标片段测序结果与chr02_AA_00171的CDS序列稍有差异(图6)，这可能是因为金针菇的品种不同，其基因序列有所差异。

2.1.2生物信息学分析

2.1.2.1一级结构分析

通过ExPAS-ProtParam tool分别对Fvegt1、Fvegt2和Fvegt3所编码蛋白质进行理化分析，得到FvEgt1 蛋白大小为46.2kDa，由418个氨基酸组成，等电点pI 4.78；FvEgt2蛋白大小为49.4kDa，由437个氨基酸组成，等电点pI 6.98；FvEgt3蛋白大小为51.7kDa，由458个氨基酸组成，等电点pI 7.29。利用在线分析工具Predict Protein预测其氨基酸序列功能位点。结果显示，Fvegt1的氨基酸序列具有与粟酒裂殖酵母和粗糙脉孢菌麦角硫因生物合成基因egt1同源性较高的区域，N端区域为甲基转移酶超级家族中的EgtD 家族，C端区域属于EgtB家族。FvEgt2和FvEgt3均属于第五类磷酸吡哆醛依赖型的氨基转移酶家族，可能具有半胱氨酸脱硫酶活性和结合磷酸吡哆醛位点。利用NCBI-Conserved DomainsSearch database对三种氨基酸序列进行保守结构域分析，结果显示，FvEgt1既含有SAM依赖性甲基转移酶的结构域，又含有组氨酰半胱氨酸亚砜合酶的结构域，结构域序列号为cl26572，结构域匹配E值为9.31e^-23。FvEgt2和FvEgt3 均属于氨基转移酶家族，结构域序列号为pfam00266，结构域匹配E值为1.79e^-08。利用Signal P 3.0预测得到三种蛋白均无信号肽特征。

2.1.2.2二级结构分析

用PSIPRED分析FvEgt1，FvEgt2，FvEgt3氨基酸序列，结果可以看出三个氨基酸序列二级结构均主要由螺旋，无规则卷曲和延伸链组成。

2.1.2.3三级结构分析

利用Swiss-Model对蛋白三级结构预测发现，三种蛋白均具有明显的空间结构且主要由螺旋和无规则卷曲构成，这与PSIPRED的分析预测结果是一致的。同时分别对FvEgt1、FvEgt2和FvEgt3的结合位点进行预测。结果表明，FvEgt1和EgtD的相似性为33.33％。FvEgt1有两个结合位点，其中包括乙酸根离子和咪唑，其中乙酸根离子结合被证明是无效的(Jeong et al.,2014)。FvEgt2和FvEgt3均为半胱氨酸脱硫酶，但两者存在着一定的差异。FvEgt2具有两个半胱氨酸和异丙醇的结合位点，其中，与异丙醇结合被证明是无效的(Ho et al.,2017)。而FvEgt3主要与磷酸吡哆醛结合。

2.1.3麦角硫因生物合成基因的表达

2.1.3.1表达载体的构建

按上述方法将经双酶切后的Fvegt1(1257bp)、Fvegt2(1320bp)、Fvegt3(1389bp)片段pET32a相连接，连接产物转化至大肠杆菌DH5α。提取阳性转化子质粒进行PCR和双酶切鉴定。PCR结果显示，三条泳道在1200-2000bp之间分别出现一条相应大小的条带。双酶切鉴定结果显示(图7)，每条泳道分别出现了两条明显的条带，一条出现在1200-2000bp之间(即为目标条带)，另一条出现在5000bp附近，即为 pET32a大小。目标片段经测序后，无任何碱基突变，三个表达载体均成功构建，可用于后续蛋白表达。

2.1.3.2表达条件的优化

2.1.3.2.1诱导温度的优化

按上述方法将pET32a-Fvegt1、pET32a-Fvegt2、pET32a-Fvegt3三个表达载体转入BL21(DE3)中，加入IPTG进行诱导表达。IPTG浓度控制在0.5mM，分别在温度为20℃、25℃、30℃、37℃，诱导时间为16h。SDS-PAGE凝胶电泳分析结果如图8所示，组氨酸标签蛋白为18kDa，在65kDa处出现了相应条带FvEgt1，在68kDa附近出现了相应条带FvEgt2，在69kDa处出现了相应条带FvEgt3，其中FvEgt1 的表达量最高，说明三种蛋白的最适诱导表达温度均为20℃，此时上清中的蛋白浓度最高。

2.1.3.2.2 IPTG浓度的优化

按照上述方法，不同IPTG浓度(0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM)，温度控制在20℃，时间为16 h的条件下诱导。SDS-PAGE凝胶电泳分析结果如图9所示，不同酶诱导时最适的IPTG浓度不同，IPTG 的浓度对FvEgt1和FvEgt3的影响不大，0.2mM足够，而FvEgt2对IPTG浓度要求较高，达到0.8mM。

2.1.3.2.3诱导时间的优化

按照上述方法，不同诱导时间(3h、10h、16h)，温度控制在20℃，最优IPTG浓度的条件下诱导。 SDS-PAGE凝胶电泳分析结果如图10所示，三种蛋白表达所需的诱导时间各有不同，其中FvEgt1只需诱导3h便能达到足量的蛋白浓度，而FvEgt2，FvEgt3则需诱导16h才能达到较高酶浓度。

2.1.4重组酶的纯化

重组酶经上述最优条件诱导表达后，经Ni柱纯化，如图10(右)所示，在FvEgt1，FvEgt2和FvEgt3 相对应的位置均出现了目标条带，且经过His标签纯化后大部分的杂蛋白都已被去除掉，余下较单一的目标蛋白，可用于后续的体外催化反应。

2.1.5重组酶功能的鉴定

2.1.5.1 FvEgt1重组酶功能鉴定

按上述体系加入底物和重组酶FvEgt1后，用HPLC法和LC-MS进行检测。如图11所示，SAM标准品的出峰时间在3.897min，AdoHcy的标准品出峰时间在2.940min，反应液在2.972min出现了相应的峰，而此时，反应液中已检测不到SAM的存在，表明FvEgt1具有高转化率，其将底物最大限度地转化为产物，对底物的耐受性较好，反应的平衡趋于从SAM转移到AdoHcy。

LC-MS结果显示(图12)，AdoHcy的[M+H]⁺分子量为385.1284，HerSul的[M+H]⁺分子量为333.1250。根据分子量预测得到的分子式分别为C₁₄H₂₀N₆O₅S和C₁₂H₂₀N₄O₅S。由此，可初步判定在FvEgt1酶的催化作用下生成了产物AdoHcy和HerSul。前人通过生物信息学预测得到NcEgt1可能一步催化His、Cys转化为Her(Bello et al.,2012)，而在近期的研究中，NcEgt1被认为只能在以Her和Cys为底物的情况下，获得麦角硫因中间产物HerSul(Hu etal.,2014)。

2.1.5.2 FvEgt2和FvEgt3重组酶功能的鉴定

按上述三个反应体系加入底物和重组酶后，用HPLC法检测麦角硫因的产生。如图11所示，EGT标准品的出峰时间在33.032min，反应体系(一)和体系(二)中未能检测到相应的产物存在，而在反应体系(三)中，在33.602min出现了与EGT标准品相近的峰，该峰被初步认定为目标产物麦角硫因。反应体系(三)和麦角硫因标准品在出峰时间上存在细微的差异，这可能是由于麦角硫因存在两种同分异构体的原因。据此，则认为，在FvEgt1，FvEgt2和FvEgt3三个酶的共同作用下，以His、Cys、SAM、FeSO₄和PLP为底物，体外合成了EGT。根据所绘制的EGT标准曲线，得出麦角硫因最终浓度为0.584mg/L。

2.1.6金针菇麦角硫因生物合成途径的推测

以上结果表明，金针菇麦角硫因生物合成途径如图13所示：FvEgt1可催化His和Cys形成HerSul， FvEgt2和FvEgt3共同将HerSul转化为EGT。这大大简化了EGT的生物合成。而分枝杆菌和粗糙脉孢菌 EGT的生物合成却有所不同。分枝杆菌HerSul的形成需要EgtD、EgtB、EgtA和EgtC的共同参与，最终在EgtE的作用下，转化为麦角硫因(Seebeck,2010)。而粗糙脉孢菌虽然相对分枝杆菌较为简单，但目前的研究表明，NcEgt1只能将Her催化形成HerSul，而不能使His转化为Her，且关于这一步的功能基因目前还未知(Hu et al.,2014)。此外，许多大肠杆菌中本身便含有半胱氨酸脱硫酶，这意味着提高生物产量只需向含有半胱氨酸脱硫酶的大肠杆菌工程菌中转入Fvegt1，便有可能获得大量的麦角硫因(彭加平等， 2011)。

参考文献

姜文侠，刘琦，周涛，杨萍..麦角硫因的生物合成制备方法，专利申请号201110460029.4,2011

彭加平,韦平和,周锡樑.半胱氨酸脱硫酶的生化特性及其脱硫作用机制[J].药物生物技术, 2011(6):548-552.

Asahi T,Wu X,Shimoda H,et al..A mushroom-derived amino acid,ergothioneine,is a potential inhibitor of inflammation-related DNAhalogenation.[J].Journal of the Agricultural Chemical Society of Japan, 2015,80(2):313-317.

Cheah I K,Halliwell B.Ergothioneine；antioxidant potential,physiological function and role in disease[J]. Biochimica Et Biophysica Acta,2012,1822(5):784-793.

Dubost N J,Ou B,Beelman R B.Quantification of polyphenols andergothioneine in cultivated mushrooms and correlation to total antioxidantcapacity[J].Food Chemistry,2007,105(2):727-735.

Eungjun P,Wiyoung L,Seungtaek K,et al..Ergothioneine accumulation ina medicinal plant Gastrodia elata.[J]. Journal of Medicinal Plant Research,2010,4(12):1141-1147.

Ho T H,Huynh K H,Nguyen D Q,et al..Catalytic Intermediate CrystalStructures of Cysteine Desulfurase from the Archaeon Thermococcus onnurineusNA1[J].Archaea-an International Microbiological Journal, 2017,2017(15):1-11.

Hu W,Song H,Her A S,et al..Bioinformatic and BiochemicalCharacterizations of C–S Bond Formation and Cleavage Enzymes in the FungusNeurospora crassa Ergothioneine Biosynthetic Pathway[J].Organic Letters,2014,16(20):5382.

XU J,Yadan J C.ChemInform Abstract:A New and Convenient Synthesis ofImidazole-2-thiones from Imidazoles[J].Cheminform,1995,26(32):239-241.

Jeong J H,Cha H J,Ha S C,et al..Structural insights into thehistidine trimethylation activity of EgtD from Mycobacterium smegmatis[J].Biochemical&Biophysical Research Communications, 2014,452(4):1098-1103.

Liu Q,Zhang W,Wang H,et al..Validation of a HILIC Method for theAnalysis of Ergothioneine in Fermentation Broth.[J].Journal ofChromatographic Science,2016,54(6):934-938.

Seebeck F P.In vitro reconstitution of Mycobacterial ergothioneinebiosynthesis.[J].Journal of the American Chemical Society,2010,132(19):6632-6633.

Tanret,C.Surune base nouvelle retirée du seigle ergoté,l’ergothioneine.CR Biol..,1909,49,222–224.

mushroom Flammulina velutipes[J].Biochemistry&Cell Biology-biochimieEt Biologie Cellulaire, 2000,78(6):699-702.

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 金针菇基因Fvegt1、Fvegt2和Fvegt3在合成麦角硫因中的应用

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<211> 1257

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Fvegt1 CDS序列

<400> 1

atgttgctgt acgacgaaca gggacttcgg ctctatgatg ctattacgac cgaggcgcca 60

gaatattatt tgttcggggc tgaagaggag atcctgaaga caagggcgga cgacatcgtt 120

cgcgttatgc acgcaggcgc tggcctctct gctggtgaag ttgtgttgga gttaggttcc 180

ggtttggcag gtcttgtggc gaattcaaac ttgtccggat cttcgcctat cacgtactat 240

gccctagacc ttgaataccg tgaactggaa cgcactctcg gtgatatagc ctcgtcggat 300

ttaggcccta ttttaaaaga caaggtatca acacggggca tgtggggtac ttacgaagac 360

ggcctcaagt tcctccagtc gggcggtctg cattctccgt ctcccagctc tcaaatggct 420

gccatgggtc gacacctctc cagagaattt gactctgccg atcgtgacaa ctccccagac 480

tcacgttcgt ccgcaagcag tacggatgca ggatcgtctc ccccttctac tccaggagaa 540

actcagcagc cgctccatct tctcttccta ggttcttcgc tgggtaactt tacacgcgcc 600

gagggagcgg aatttcttcg atcgctgcca ctccgaccgg gcatgggtga tactctgctg 660

ctgggcttgg atcatgacaa tgaccaacgt gtcattgaag aggcgtataa tgatcctagg 720

ggtcatacag aagcattcat tgtgaatggc ctcaaagccg caggacgtgt acttggcgac 780

gacaaactat tcgacggtgg gaaatgggaa tacgtcaact tttccgataa cgacgcttat 840

gcgcttttct ctgatagcgg ccttcgtccg attcaacgct ggacggattc cgcatcacgt 900

tattctcttt ggctactcga acgtccgccg ttcttgttcc ccttactctc ctcacctgtc 960

gcttgcaatg cgcaggggca aatcacgccc aagaaaatct attcaacaac gccgtttgga 1020

ataccatcgc cacaagattg ggaaaatctc tgggcatttt gggacttcat cactaggagc 1080

atgatccctc cctccatgct gttccagaaa cctattgact tgcgccacat ctgtctattc 1140

tatctaggtc acattcccac attccttgac atacacttgt cgagacttct caaggaacct 1200

cactcggagc ctgaggaatt caagaatatc ttcgaggtaa gttctcaatc tgagtaa 1257

<211> 418

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Fvegt1 氨基酸序列

<400> 2

Met Leu Leu Tyr Asp Glu Gln Gly Leu Arg Leu Tyr Asp Ala Ile Thr

1 5 10 15

Thr Glu Ala Pro Glu Tyr Tyr Leu Phe Gly Ala Glu Glu Glu Ile Leu

20 25 30

Lys Thr Arg Ala Asp Asp Ile Val Arg Val Met His Ala Gly Ala Gly

35 40 45

Leu Ser Ala Gly Glu Val Val Leu Glu Leu Gly Ser Gly Leu Ala Gly

50 55 60

Leu Val Ala Asn Ser Asn Leu Ser Gly Ser Ser Pro Ile Thr Tyr Tyr

65 70 75 80

Ala Leu Asp Leu Glu Tyr Arg Glu Leu Glu Arg Thr Leu Gly Asp Ile

85 90 95

Ala Ser Ser Asp Leu Gly Pro Ile Leu Lys Asp Lys Val Ser Thr Arg

100 105 110

Gly Met Trp Gly Thr Tyr Glu Asp Gly Leu Lys Phe Leu Gln Ser Gly

115 120 125

Gly Leu His Ser Pro Ser Pro Ser Ser Gln Met Ala Ala Met Gly Arg

130 135 140

His Leu Ser Arg Glu Phe Asp Ser Ala Asp Arg Asp Asn Ser Pro Asp

145 150 155 160

Ser Arg Ser Ser Ala Ser Ser Thr Asp Ala Gly Ser Ser Pro Pro Ser

165 170 175

Thr Pro Gly Glu Thr Gln Gln Pro Leu His Leu Leu Phe Leu Gly Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Asn Phe Thr Arg Ala Glu Gly Ala Glu Phe Leu Arg Ser

195 200 205

Leu Pro Leu Arg Pro Gly Met Gly Asp Thr Leu Leu Leu Gly Leu Asp

210 215 220

His Asp Asn Asp Gln Arg Val Ile Glu Glu Ala Tyr Asn Asp Pro Arg

225 230 235 240

Gly His Thr Glu Ala Phe Ile Val Asn Gly Leu Lys Ala Ala Gly Arg

245 250 255

Val Leu Gly Asp Asp Lys Leu Phe Asp Gly Gly Lys Trp Glu Tyr Val

260 265 270

Asn Phe Ser Asp Asn Asp Ala Tyr Ala Leu Phe Ser Asp Ser Gly Leu

275 280 285

Arg Pro Ile Gln Arg Trp Thr Asp Ser Ala Ser Arg Tyr Ser Leu Trp

290 295 300

Leu Leu Glu Arg Pro Pro Phe Leu Phe Pro Leu Leu Ser Ser Pro Val

305 310 315 320

Ala Cys Asn Ala Gln Gly Gln Ile Thr Pro Lys Lys Ile Tyr Ser Thr

325 330 335

Thr Pro Phe Gly Ile Pro Ser Pro Gln Asp Trp Glu Asn Leu Trp Ala

340 345 350

Phe Trp Asp Phe Ile Thr Arg Ser Met Ile Pro Pro Ser Met Leu Phe

355 360 365

Gln Lys Pro Ile Asp Leu Arg His Ile Cys Leu Phe Tyr Leu Gly His

370 375 380

Ile Pro Thr Phe Leu Asp Ile His Leu Ser Arg Leu Leu Lys Glu Pro

385 390 395 400

His Ser Glu Pro Glu Glu Phe Lys Asn Ile Phe Glu Val Ser Ser Gln

405 410 415

Ser Glu

<211> 1308

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Fvegt2 CDS序列

<400> 3

atgaccgatt accattggca taaggcctgg agcatggact atcgtatcgc ccaagaaggt 60

ttttacgata gcaccagccg tccgccgcct tttggtcatc cgatcctgaa gtatttcagc 120

ctggaagccg gctacgtgaa cctgaataac ggcagctatg gttgcgttcc gaacccggtg 180

acccgtttct gcagcgagct gaccaacaaa gtggaggcaa acccggaccg ctaccatcgc 240

tttagcttca agccgctgtt agtggacgcc cgtaaggcca ttgccaaact ggttggtgcc 300

gacgttgatg aatgtgtgtt tgtgagcaat gccaccgccg ccgtgaatac cgttgttcgc 360

aacctggaat ggagcagcga cgacatcatc attcagacca ccaccagttg gcacagcaca 420

agccgtaccc tgcattatat cagcgatacc cgcccgtatc cgaccctgac caccttccag 480

ctgaccttcc cgaacaccca tgccgcaatc ctgaaaagct tccgcgcctt cattaaaggc 540

ctgaaagcca acatggccac cgtggacccg aagaagaaac cgaaaattct ggccgtgatt 600

gatagcgtgg ttgccaaccc ggcagcatac atgccgtgga aggaaatggt tgccatctgt 660

cgcgatgaag gcgttctgag cctggtggat gccgcacata gcctgggcca ggagattaac 720

ctgaatctga gcgagattaa gccggacttc tggatcacca catgccacaa atggctgttt 780

gcacgccgcg gtagtgccgt tttatacgtg ccgttccgca accaacacct gattcgtagc 840

agcctgatta ccagcaccca ctatatcagc ccgaaagaca aactgccgac ccctaccggc 900

agcaattttg tgctgcagca tgaatggccg ggcgcaattg atttcgtgag ctacctgtgt 960

atccctgcct gcgtggagtt tcgtgaatgg ctgggcggcg aagtggcaat taacgagtat 1020

tgccgtggcc tggcaattga cggtggtcgc aagctggcca aactgttcgg cacccgcgtg 1080

atggatgaga ccccggatgc acagctgacc ctgaacatga ccaacgtgga gttaccgctg 1140

ccgcgcaacg tggttccgga aaagcgtacc gaggtgaatg agttcctgga aattagcctg 1200

ctgcgcgagt ataacgtgtt cgcagtgacc ttttaccatg gtggcgcctg gtgggttcgt 1260

tgtagcgccc agatcttcaa cgatgtgagc gccattagca acgattaa 1308

<211> 435

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Fvegt2 氨基酸序列

<400> 4

Met Thr Asp Tyr His Trp His Lys Ala Trp Ser Met Asp Tyr Arg Ile

1 5 10 15

Ala Gln Glu Gly Phe Tyr Asp Ser Thr Ser Arg Pro Pro Pro Phe Gly

20 25 30

His Pro Ile Leu Lys Tyr Phe Ser Leu Glu Ala Gly Tyr Val Asn Leu

35 40 45

Asn Asn Gly Ser Tyr Gly Cys Val Pro Asn Pro Val Thr Arg Phe Cys

50 55 60

Ser Glu Leu Thr Asn Lys Val Glu Ala Asn Pro Asp Arg Tyr His Arg

65 70 75 80

Phe Ser Phe Lys Pro Leu Leu Val Asp Ala Arg Lys Ala Ile Ala Lys

85 90 95

Leu Val Gly Ala Asp Val Asp Glu Cys Val Phe Val Ser Asn Ala Thr

100 105 110

Ala Ala Val Asn Thr Val Val Arg Asn Leu Glu Trp Ser Ser Asp Asp

115 120 125

Ile Ile Ile Gln Thr Thr Thr Ser Trp His Ser Thr Ser Arg Thr Leu

130 135 140

His Tyr Ile Ser Asp Thr Arg Pro Tyr Pro Thr Leu Thr Thr Phe Gln

145 150 155 160

Leu Thr Phe Pro Asn Thr His Ala Ala Ile Leu Lys Ser Phe Arg Ala

165 170 175

Phe Ile Lys Gly Leu Lys Ala Asn Met Ala Thr Val Asp Pro Lys Lys

180 185 190

Lys Pro Lys Ile Leu Ala Val Ile Asp Ser Val Val Ala Asn Pro Ala

195 200 205

Ala Tyr Met Pro Trp Lys Glu Met Val Ala Ile Cys Arg Asp Glu Gly

210 215 220

Val Leu Ser Leu Val Asp Ala Ala His Ser Leu Gly Gln Glu Ile Asn

225 230 235 240

Leu Asn Leu Ser Glu Ile Lys Pro Asp Phe Trp Ile Thr Thr Cys His

245 250 255

Lys Trp Leu Phe Ala Arg Arg Gly Ser Ala Val Leu Tyr Val Pro Phe

260 265 270

Arg Asn Gln His Leu Ile Arg Ser Ser Leu Ile Thr Ser Thr His Tyr

275 280 285

Ile Ser Pro Lys Asp Lys Leu Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asn Phe Val

290 295 300

Leu Gln His Glu Trp Pro Gly Ala Ile Asp Phe Val Ser Tyr Leu Cys

305 310 315 320

Ile Pro Ala Cys Val Glu Phe Arg Glu Trp Leu Gly Gly Glu Val Ala

325 330 335

Ile Asn Glu Tyr Cys Arg Gly Leu Ala Ile Asp Gly Gly Arg Lys Leu

340 345 350

Ala Lys Leu Phe Gly Thr Arg Val Met Asp Glu Thr Pro Asp Ala Gln

355 360 365

Leu Thr Leu Asn Met Thr Asn Val Glu Leu Pro Leu Pro Arg Asn Val

370 375 380

Val Pro Glu Lys Arg Thr Glu Val Asn Glu Phe Leu Glu Ile Ser Leu

385 390 395 400

Leu Arg Glu Tyr Asn Val Phe Ala Val Thr Phe Tyr His Gly Gly Ala

405 410 415

Trp Trp Val Arg Cys Ser Ala Gln Ile Phe Asn Asp Val Ser Ala Ile

420 425 430

Ser Asn Asp

435

<211> 1377

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Fvegt3 CDS序列

<400> 5

atggtgcatc atagctggag catggattat cgcgccggct tttacgatag cacccatccg 60

ccgccggaat ttggtcacgc catgctgaag tattttagcc tggagccggg ctacgtgaat 120

ctgaacaacg gtagttttgg caccgttccg cgcccggtga cccgtttctg caatgaactg 180

accaataaag tggaggcaaa cccggaccgc tatcatcgct tcagcttcaa accgttactg 240

gccgatagtc gtgagcgcgt tgcccagtta gtgggtgccc acaccgatga atgcgttttt 300

gtgagcaacg caaccgccgc aatcaacacc attatgcgca acctggagtg gaatgccgag 360

gacatcatca ttcagaccac caccacctgg cgtagcacca gccgcgtgat gcattacatt 420

gccgataccc gcccgtatcc gatgttaagc acctttaaac tgacctttcc gaccacccac 480

aaggccatcc tggaagcatt ccacgcacac atcaaaggcc tgaaaaacaa tatgctgacc 540

gttagtgaga atggccgtca ggtgcgcaag ggcaagattg tggccgttat tgacgccatt 600

gtggcaaacc cggcaagcta tatgccgtgg aaagatatgg ttgccatctg ccgtgaagaa 660

ggcgtggtga gcttagtgga tggtgcacat tgcctgggtc aggaagtggg tatcaacctg 720

agcgagatcc gccctgactt ttggattagc aactgtcata aatggctgta tagccgtcgt 780

ggcagcgccg tgctgtatgt gccgtttcgc aatcagcacc tgattcgcag cagcgttcct 840

accagcaccc attatgttag ccctcgtgac ggcctgggcg gtccgaaagc accgaatttc 900

gttatgcagc atgagtggcc gggcgccatt gattttagta gttacctgtg catcccgacc 960

agcttagagt ttcgtgcctg gctgggcggc gaagaggtga tcaacaccta ttgccgcaat 1020

ctgagcatca aaggcagcaa gcgtttagca gccatgctgg gcaccaatgt gatggatgaa 1080

accccggata gccagctgac cctgaacatg agtaatgtga agctgcctct gccggccaac 1140

gtgagcaacg acaagaaaac cgaagttaac gatttcctgg agctgagcct gctgcgtgaa 1200

tataacgtgt ttgcagttac cttctatcac aacaacgcct ggtgggttcg ctgtagcagt 1260

caggtgttta atgatattag cgatttcgag aagctgggta cagccctgat tgcactgtgc 1320

cgtgaggtga aaatgagcgt tctgaatagt cacggtgaag atgccaccca cgcctaa 1377

<211> 458

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Fvegt3 氨基酸序列

<400> 6

Met Val His His Ser Trp Ser Met Asp Tyr Arg Ala Gly Phe Tyr Asp

1 5 10 15

Ser Thr His Pro Pro Pro Glu Phe Gly His Ala Met Leu Lys Tyr Phe

20 25 30

Ser Leu Glu Pro Gly Tyr Val Asn Leu Asn Asn Gly Ser Phe Gly Thr

35 40 45

Val Pro Arg Pro Val Thr Arg Phe Cys Asn Glu Leu Thr Asn Lys Val

50 55 60

Glu Ala Asn Pro Asp Arg Tyr His Arg Phe Ser Phe Lys Pro Leu Leu

65 70 75 80

Ala Asp Ser Arg Glu Arg Val Ala Gln Leu Val Gly Ala His Thr Asp

85 90 95

Glu Cys Val Phe Val Ser Asn Ala Thr Ala Ala Ile Asn Thr Ile Met

100 105 110

Arg Asn Leu Glu Trp Asn Ala Glu Asp Ile Ile Ile Gln Thr Thr Thr

115 120 125

Thr Trp Arg Ser Thr Ser Arg Val Met His Tyr Ile Ala Asp Thr Arg

130 135 140

Pro Tyr Pro Met Leu Ser Thr Phe Lys Leu Thr Phe Pro Thr Thr His

145 150 155 160

Lys Ala Ile Leu Glu Ala Phe His Ala His Ile Lys Gly Leu Lys Asn

165 170 175

Asn Met Leu Thr Val Ser Glu Asn Gly Arg Gln Val Arg Lys Gly Lys

180 185 190

Ile Val Ala Val Ile Asp Ala Ile Val Ala Asn Pro Ala Ser Tyr Met

195 200 205

Pro Trp Lys Asp Met Val Ala Ile Cys Arg Glu Glu Gly Val Val Ser

210 215 220

Leu Val Asp Gly Ala His Cys Leu Gly Gln Glu Val Gly Ile Asn Leu

225 230 235 240

Ser Glu Ile Arg Pro Asp Phe Trp Ile Ser Asn Cys His Lys Trp Leu

245 250 255

Tyr Ser Arg Arg Gly Ser Ala Val Leu Tyr Val Pro Phe Arg Asn Gln

260 265 270

His Leu Ile Arg Ser Ser Val Pro Thr Ser Thr His Tyr Val Ser Pro

275 280 285

Arg Asp Gly Leu Gly Gly Pro Lys Ala Pro Asn Phe Val Met Gln His

290 295 300

Glu Trp Pro Gly Ala Ile Asp Phe Ser Ser Tyr Leu Cys Ile Pro Thr

305 310 315 320

Ser Leu Glu Phe Arg Ala Trp Leu Gly Gly Glu Glu Val Ile Asn Thr

325 330 335

Tyr Cys Arg Asn Leu Ser Ile Lys Gly Ser Lys Arg Leu Ala Ala Met

340 345 350

Leu Gly Thr Asn Val Met Asp Glu Thr Pro Asp Ser Gln Leu Thr Leu

355 360 365

Asn Met Ser Asn Val Lys Leu Pro Leu Pro Ala Asn Val Ser Asn Asp

370 375 380

Lys Lys Thr Glu Val Asn Asp Phe Leu Glu Leu Ser Leu Leu Arg Glu

385 390 395 400

Tyr Asn Val Phe Ala Val Thr Phe Tyr His Asn Asn Ala Trp Trp Val

405 410 415

Arg Cys Ser Ser Gln Val Phe Asn Asp Ile Ser Asp Phe Glu Lys Leu

420 425 430

Gly Thr Ala Leu Ile Ala Leu Cys Arg Glu Val Lys Met Ser Val Leu

435 440 445

Asn Ser His Gly Glu Asp Ala Thr His Ala

450 455

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Fvegt1-1S

<400> 7

ttactcagat tgagaactta cctcgaagat 30

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Fvegt1-1AS

<400> 8

ttttccgata acgacgctta tgc 23

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Fvegt1-2S

<400> 9

gttgacgtat tcccatttcc caccgtcgaa tag 33

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Fvegt1-2AS

<400> 10

tttggcaggt cttgtggcga attcaaactt g 31

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Fvegt1-3S

<400> 11

atgttgctgt acgacgaaca gggacttcgg 30

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Fvegt1-3AS

<400> 12

ccggaaccta actccaacac aacttcacca gc 32

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Fvegt1-1（+）S

<400> 13

ttactcagat tgagaactta cctcgaagat attcttgaat tcc 43

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Fvegt1-1（+）AS

<400> 14

ggaaatggga atacgtcaac ttttccgata acgac 35

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Fvegt1-2（+）S

<400> 15

gttgacgtat tcccatttcc caccgtcgaa tagtttg 37

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Fvegt1-2（+）AS

<400> 16

gtgttggagt taggttccgg tttggcaggt cttgt 35

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Fvegt1-3（+）S

<400> 17

tcgccacaag acctgccaaa ccggaaccta actcc 35

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Fvegt1-3（+）AS

<400> 18

atgttgctgt acgacgaaca gggacttcgg ctctatgatg c 41

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Fvegt1-S

<400> 19

atgttgctgt acgacgaaca gg 22

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Fvegt1-AS

<400> 20

ttactcagat tgagaactta cctcg 25

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Fvegt1-S（XB）

<400> 21

cgcggatcca tgttgctgta cgacgaacag g 31

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Fvegt1-AS（XB）

<400> 22

cgcggatcct tactcagatt gagaacttac ctcg 34

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Fvegt2-S

<400> 23

ggatccatgg tgcatcatag ctggagcatg 30

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Fvegt2-AS

<400> 24

ctcgagttag gcgtgggtgg catcttcac 29

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Fvegt3-S

<400> 25

gaattcatga ccgattacca ttggc 25

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Fvegt3-AS

<400> 26

ctcgagttaa tcgttgctaa tggcg 25

Claims

1.金针菇基因Fvegt1、Fvegt2和Fvegt3在合成麦角硫因中的应用，其特征在于：

所述的金针菇基因Fvegt1编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述的金针菇基因Fvegt2编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；

所述的金针菇基因Fvegt3编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述的金针菇基因Fvegt1、Fvegt2和Fvegt3在体外联合生物合成麦角硫因中的应用。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

FvEgt1催化组氨酸和半胱氨酸形成组氨酸甜菜碱半胱氨酸亚砜，FvEgt2和FvEgt3共同将组氨酸甜菜碱半胱氨酸亚砜转化为麦角硫因。

4.根据权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于：

所述的金针菇基因Fvegt1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

所述的金针菇基因Fvegt2的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

所述的金针菇基因Fvegt3的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

5.一种金针菇基因Fvegt1编码的蛋白质FvEgt1，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示。

6.编码权利要求5所述的蛋白质的金针菇基因Fvegt1的核苷酸序列，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

7.一种金针菇基因Fvegt2编码的蛋白质FvEgt2，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ IDNO：4所示。

8.编码权利要求7所述的蛋白质的金针菇基因Fvegt2的核苷酸序列，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

9.一种金针菇基因Fvegt3编码的蛋白质FvEgt3，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ IDNO：6所示。

10.编码权利要求9所述的蛋白质的金针菇基因Fvegt3的核苷酸序列，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。