CN104854245A

CN104854245A - 通过代谢工程生产麦角硫因

Info

Publication number: CN104854245A
Application number: CN201380065016.4A
Authority: CN
Inventors: 刘平华; 宋恒; 胡文
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2012-12-21
Filing date: 2013-12-20
Publication date: 2015-08-19
Anticipated expiration: 2033-12-20
Also published as: KR20150127034A; KR102116734B1; WO2014100752A1; CN104854245B; US20150225755A1; JP2016502859A; EP2935603A1; JP6494522B2; EP2935603A4; US10167490B2

Abstract

本公开的内容有关于通过体外酶促转化或使用通过代谢工程制造的微生物发酵生产麦角硫因(ergothioneine)。并揭露对此方法有用的经转化细胞(transformed cell)和以此方法生产的麦角硫因。本公开的经转化细胞比起未经转化的野生型细胞，能够以较好的效率将组氨酸和半胱氨酸或组氨酸甜菜碱(hercynine)和半胱氨酸转变成为麦角硫因。

Description

通过代谢工程生产麦角硫因

相关申请

本申请主张于2012年12月21日所提交第61/740,829号美国专利临时申请案的优先权及利益。该申请的全部内容以整体引用形式并入本文。

政府资助

本发明在国家卫生研究院所给予的政府资助GM093903和国家科学基金给予的国家资助CHE-0748504下进行。美国政府对本发明具有一定权利。

技术领域

本公开的内容通常关于通过无细胞(cell-free)酶促转化或使用由代谢工程所制造的微生物发酵生产麦角硫因。

背景技术

麦角硫因是由Tanret在1909年自麦角(ergot)中分离出的包含硫醇基(thiol)的氨基酸。其独特的氧化还原特性使它成为最好的天然抗氧化剂之一。此外，由于它被许多人类组织(如，肝、肾、中枢神经系统、和红血球)从食物中特异性富集，麦角硫因被认为是在人类生理中具有许多好处的角色。近来，麦角硫因被广泛使用作为具有数十亿美元市场的抗老化产品的关键成分。

麦角硫因是由两种氨基酸(组氨酸和半胱氨酸)经五个酶促步骤生产。然而，阻碍使用目前已知通过发酵生产的麦角硫因生物合成途径的主要障碍有三个：(1)EgtE酶不能被过度表达；(2)EgtB的活性低；(3)麦角硫因和谷胱甘肽之间对y-Glu-Cys的潜在竞争，将限制产量。因此，目前麦角硫因是使用化学手段生产，因此该领域中仍有麦角硫因的重组生物合成的需要。

发明内容

本文提供一种新颖的酶促方法以及一种代谢工程方法用以在无细胞酶促系统或细胞培养系统中提高、增加或最大化麦角硫因的生产。该无细胞系统和使用通过本文所揭露代谢工程所制造的基因工程微生物(engineered microbial)的细胞培养系统可用于生产较高层次的麦角硫因。本文中所述的这些过程是基于发明人的发现：1)在大肠杆菌(E.coli)中成功生产EgtE和确认改善EgtB活性的条件，其使通过无细胞转化或通过发酵以使用目前已知的麦角硫因生物合成途径来生产麦角硫因变得可能。2)一种来自该ovothiol生物合成途径的酶(OvoA)可用于催化Cys和三甲基-组氨酸的直接氧化耦合以生产在麦角硫因生物合成中所需的关键中间产物。这样的发现是令人惊讶且意想不到的，因为OvoA亦催化Cys和His的氧化耦合生产结构上完全不同的化合物。不希望被任何理论所束缚，新发现的OvoA活性可以两个步骤缩短麦角硫因的生物合成途径且可排除麦角硫因和glutathioneine生物合成的间的竞争。基于该新发现的OvoA化学，麦角硫因可通过无细胞酶促系统或细胞培养系统而生产。3)另一种酶NcEgtl亦能够催化Cys和三甲基-组氨酸的直接耦合。基于该新发现的NcEgtl化学，麦角硫因可通过无细胞酶促系统或细胞培养系统而生产。

因此，提供于本文的某些方面是关于包括重组地表达一或多个该麦角硫因生物合成途径的基因和一或多个ovothiol生物合成途径的基因或通过生物信息学手段识别的其同源物(homolog)(如NcEgtl)的体外无细胞系统。另一方面涉及代谢工程生产的微生物品系使用这些酶通过发酵以生产麦角硫因。

一些具体实施例中，该细胞重组地表达：(i)egtA基因；(ii)egtB基因；(iii)egtC基因；(iv)egtD；以及(iv)egtE基因和有FAD合成酶编码的基因。一些具体实施例中，该细胞进一步表达有SAM合成酶编码的基因。

一些具体实施例中，该细胞重组地表达：(i)ovoA基因或ncEgt-1基因或其通过生物信息学识别的同源物；以及(ii)egtE基因和有FAD合成酶编码的基因。

一些具体实施例中，该细胞重组地表达：(i)egtD基因；(ii)ovoA基因或ncEgt-1基因；以及(iii)egtE基因和有FAD合成酶编码的基因。一些具体实施例中，该细胞重组地表达：(i)egtD基因；(ii)ovoA基因或ncEgt-1基因：以及(iii)egtE基因和有FAD合成酶编码的基因；以及(iv)有SAM合成酶编码的基因。

本文提供的一些方面有关于细胞培养基、无细胞酶促混合物、或将自本文中所述的任一方面或具体实施例的发酵中收集的细胞溶解后的上清液。

本文提供的其它方面有关于一种方法，包括于本文中所述的任一方面或具体实施例的细胞培养基中培养。

本文提供的其它方面是有关于一种方法，包括培育(incubating)自本文中所述的细胞溶解所获得的细胞萃取物。

本文所述的各方面有关于一种方法，其包括在细胞中重组地表达该麦角硫因生物合成途径的一或多个基因和该ovothiol生物合成途径的一或多个基因或通过生物信息学识别的其它同源物(如NcEgtl)。

提供于本文的一些方面有关于制备麦角硫因的方法。

一些具体实施例中，该方法包括在细胞中重组地表达：(i)EgtA蛋白质或保留酶活性的其功能性片段；(ii)EgtB蛋白质或保留酶活性的其功能性片段；(iii)EgtC蛋白质或保留酶活性的其功能性片段；(iv)EgtD蛋白质或保留酶活性的其功能性片段；(v)EgtE蛋白质或保留酶活性的其功能性片段；以及(vi)有FAD合成酶编码的基因或保留酶活性的其功能性片段。

一些具体实施例中，该方法包括在细胞中重组地表达：(i)ovoA或ncEgt-1基因或通过生物信息学识别的其它同源物；以及(ii)egtE基因和有FAD合成酶编码的基因。

一些具体实施例中，该方法包括在细胞中重组地表达：(i)egtD基因；(ii)ovoA基因或ncEgt-1基因或通过生物信息学识别的其它同源物；以及(iii)egtE基因和有FAD合成酶编码的基因。

一些具体实施例中，本文所述的方法进一步包括在细胞培养基中培养本文所述的细胞。

一些具体实施例中，本文所述的方法包括在细胞培养基中培养本文所述的细胞，其中该培养基以半胱氨酸、组氨酸或组氨酸甜菜碱补充。

一些具体实施例中，该细胞培养基中进一步添加一或多种铁盐。

一些具体实施例中，本文所述的方法进一步包括在溶解本文所述的细胞后，收集细胞培养基或添加物。

一些具体实施例中，本文所述的方法进一步包括自该细胞或自该细胞生长的培养基中回收麦角硫因。

附图说明

本专利或申请档案中包含至少一个以彩色呈现的图式。含彩色图式的此专利或专利申请公布的复本将在提出申请且支付必要费用后由美国专利商标局提供。

图1为针对麦角硫因和ovothiol建议的生物合成途径的示意图示。

图2为根据本文所述的具体实施方法生产麦角硫因的示意图示。途径A凭借EgtE的成功生产和EgtB活性的改善；途径B凭借该些酶(如，OvoA和NcEgtl)具有2至4转变的能力的发现和EgtE的成功生产。

图3显示两种不同的针对EgtB和OvoA催化作用的试验。

图4显示EgtE的纯化样品的SDS-PAGE和UV-VIS数据；图4A显示分子量标记(M道)、上清液(SN道)、细胞沉淀(cell pellet)(CP道)、流通(flow through)(FT道)、洗脱级分(elution fractions)1和2(分别为E1和E2道)、和洗涤级分(washfractions)1、2、和3(分别为W1，1、W2，1、和W3，1道)的SDS-PAGE数据；图4B显示经纯化的EgtE的UV-VIS数据与PLP辅因子的存在一致。

图5显示(A)经EgtB催化由2转变成为3的相对应NMR数据(catalyzedconversion of 2to 3with corresponding NMR data)，(B)经OvoA催化由1转变成为6的相对应NMR数据，以及(C)经OvoA催化由2转变成为4的相对应NMR数据。

图6为用于在细胞(例如，E.coli细胞)中生产麦角硫因的表达载体(Ego-1构建)的示意图示。

图7为用于进一步增加麦角硫因生产的表达载体(Ego-2构建)示意图。

图8显示由NcEgtl和EgtE催化的组氨酸甜菜碱转变成为麦角硫因。

图9A和9B显示来自经如图6和图7所述的Ego-1和Ego-2载体转化的大肠杆菌细胞的经部分纯化的麦角硫因和纯麦角硫因的1H-NMR图谱。图9A经部分纯化的麦角硫因；图9B加入纯麦角硫因后以确认该自发酵生成的产物的特性。

具体实施方式

就以下讨论和/或例示来自特定微生物的基因、其它核酸序列、以及氨基酸序列方面而言，应会了解其它微生物具有相似的代谢途径，此外也有具有相似结构和功能的基因和蛋白质于此途径中。因此，以下讨论关于任何特定微生物的原理，无论是基因材料的来源或被修饰的宿主细胞，皆可应用于至其它微生物并且明确包含于本发明中。

某种程度上，本发明是基于本发明人发现取自该ovothiol生物合成途径的酶OvoA可被用于生产麦角硫因生物合成的中间产物。此外，本发明人亦发现该酶OvoA(或NcEgtl)可催化组氨酸甜菜碱和半胱氨酸之间的氧化耦合以生产化合物其为麦角硫因生物合成中的中间产物。这是令人惊讶且意想不到的，因为OvoA通常催化组氨酸和半胱氨酸的耦合以生产化合物可以看出，在这两种产物中半胱氨酸链接至该咪唑环的位置并不相同，这是意想不到且令人惊讶的结果。

某种程度上，本发明的不同部分是基于EgtE的生产，之前其表达是无法实行的。此外，本发明人亦发现EgtE可在具有FAD合成酶的基因背景下被重组地生产。

因此，于本文所揭露为重组地表达一或多个于本文所述基因的细胞，以及这种细胞用于生产麦角硫因的用途。该细胞可以重组地表达一或多个该麦角硫因生物合成途径中的基因以及一或多个该ovothiol生物合成途径中的基因。

一些具体实施例中，该细胞被转化以重组地表达：(i)EgtA蛋白质或保留酶活性的其功能性片段；(ii)EgtB蛋白质或保留酶活性的其功能性片段；(iii)EgtC蛋白质或保留酶活性的其功能性片段；(iv)EgtD蛋白质或保留酶活性的其功能性片段；以及(v)EgtE蛋白质或保留酶活性的其功能性片段和有FAD合成酶编码的基因或保留酶活性的其功能性片段中至少一种。

一些具体实施例中，该细胞进一步被转化以重组地表达SAM合成酶或保留酶活性的其功能性片段。

于一些具体实施例中，该细胞被转化以重组地表达：(i)ovoA或ncEgt-1基因；以及(ii)egtE基因和有FAD合成酶编码的基因中至少一种。

于一些其它的具体实施例中，该细胞被转化以重组地表达除了(i)ovoA基因或ncEgt-1基因；以及(ii)egtE基因和有FAD合成酶编码的基因的一外，至少重组地表达egtD基因。这些当中的一些进一步的具体实施例，该细胞还进一步被转化以重组地表达有SAM合成酶编码的基因。

一些具体实施例中，该细胞重组地表达：(i)ovoA或ncEgt-1基因；以及(ii)egtE基因或有FAD合成酶编码的基因。

一些具体实施例中，该细胞重组地表达：(i)ovoA或ncEgt-1基因；(ii)egtE基因；以及(iii)有FAD合成酶编码的基因。

一些具体实施例中，该细胞重组地表达：(i)egtD基因；(ii)ovoA基因或ncEgt-1基因；以及(iii)egtE基因和有FAD合成酶编码的基因。

一些其它具体实施例中，该细胞重组地表达：(i)egtD基因；(ii)ovoA基因或ncEgt-1基因；(iii)egtE基因和有FAD合成酶编码的基因；以及(iv)有SAM合成酶编码的基因。

又一些其它具体实施例中，该细胞重组地表达：(i)egtD基因；(ii)ovoA基因或ncEgt-1基因；(iii)egtE基因和有FAD合成酶编码的基因；(iv)有SAM合成酶编码的基因。

于本文所述的任何方面或具体实施例中，该细胞可内源地表达下列一或多个：(i)egtD基因；(ii)ovoA基因或ncEgt-1基因；(iii)egtE基因和有FAD合成酶编码的基因；(iv)有SAM合成酶编码的基因。

一些具体实施例中，于本文所述的经转化的细胞重组地表达密码子优化型基因(a codon optimized gene)。例如，该细胞在密码子重组地表达最优化的egtD基因、ovoA基因、ncEgt-1基因、egtE基因、该有SAM合成酶编码的基因、或有FAD合成酶编码的基因。

如本文中所用，术语“细胞”、“宿主细胞”或“细胞系”意指良好特性化的(well characterized)一致性的、生物学上单纯的细胞群。这些细胞可为新生性的(neoplastic)真核细胞或以本技术领域中已知方法在体外已被“无限增殖化”(immortalized)的真核细胞，以及初代细胞(primary cell)，或原核细胞。无限制地，该宿主细胞或该细胞系是来源可为哺乳动物、植物、昆虫、真菌(包括酵母菌)、或细菌。

一些具体实施例中，该细胞为细菌细胞。这些当中的一些进一步的具体实施例，该细胞为E.coli或S.pyogenes。于本文所述能适用于各种方面的E.coli的例示性菌系包括但不限于，BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、BL21(DE3)pLysE、BL21(DE3)pLacl、BL21trxB(DE3)、BL21trxB(DE3)pLysS、BLR(DE3)、BLR(DE3)pLysS、AD494(DE3)、AD494(DE3)pLysS、HMS174(DE3)、HMS174(DE3)pLysS、HMS174(DE3)pLysE、Origami(DE3)、Origami(DE3)pLysS、Origami(DE3)pLysE、Origami(DE3)pLacl、OrigamiB(DE3)、OrigamiB(DE3)pLysS、OrigamiB(DE3)pLysE、OrigamiB(DE3)pLacl、Rosetta(DE3)、Rosetta(DE3)pLysS、Rosetta(DE3)pLysE、Rosetta(DE3)pLacl、Tuner(DE3)、Tuner(DE3)pLysS和Tuner(DE3)pLacl。

一些其它的具体实施例中，该细胞可来自昆虫(如，Sf9、high five和Sf21细胞)、酵母菌(如，P.pastoris、P.methanolica、S.pombe和S.cerevisiae)、哺乳动物(如，中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、Cos-1、CV-1、HeLa、NIH3T3、PER-C6和NSO)或植物。其它适合的细胞亦为该领域技术人员所知。

如于本文所用，该术语“转染的”(transfected)或“转化的”(transformed)包括任何细胞或细胞系，其基因体已通过至少一个多核苷酸如DNA序列的存在而被改变或增加，在基因工程领域中其亦被称为“异源性DNA”、“重组DNA”、“外源性DNA”、“基因工程的”、“非原生的”、或“外来DNA”，其中所述DNA是通过基因操纵过程被分离并引入(introduce)宿主细胞或细胞系中。该转染DNA能够被维持为染色体外(extrachromosomal)组件或为被稳定融入(integrate)该宿主细胞的宿主染色体的组件。带有转染DNA的宿主细胞，被维持染色体外组件或被稳定融入宿主染色体的组件者，本文中称为“重组宿主细胞”或“转化细胞”。

应理解，一些能和本发明兼容的细胞能够表达一或多个本文所述的基因的内生性拷贝以及其重组拷贝。一些具体实施例中，若细胞具有一或多个本文所述基因的内生性拷贝，则该本文中所述的细胞和方法将不一定需要加入该一或多个有内生性表达的基因的重组拷贝。一些具体实施例中，该细胞能够内生性表达来自本文中所述途径中的一或多个酶以及能够重组地表达来自本文中所述途径中的一或多个酶以用于麦角硫因的有效生产。

一些具体实施例中，未经转化的细胞，如野生型细胞，不生产麦角硫因。

一些具体实施例中，该转化细胞能够生产麦角硫因的量为至少(如，至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少1倍、至少1.25倍、至少1.5倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍、至少75倍、至少100倍或更高)相对于由未转化宿主细胞在相同条件下生产的麦角硫因的量。

该由ovoA基因编码的多肽(OvoA酶)为5-组氨酰基半胱氨酸亚砜合成酶(5-histidylcysteine sulfoxide synthase)。OvoA为单核的非血红素(non-heme)酶，并催化一个四电子氧化过程。OvoA为第一个ovothiol生物合成酶作为来自欧文氏杆菌(Erwinia tasmaniensis)和克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)所具有的特征。同源酵素同源OvoA被编码于多于80个范围自变形菌(proteobacteria)至真菌的基因体中。

被ncEgt-1基因编码的多肽(来自粗糙链孢霉(Neurospora crassa)的NcEgt-1酶)催化自组氨酸甜菜碱和半胱氨酸形成

由egtE基因编码的多肽(EgtE酶)在组氨酸甜菜碱和半胱氨酸之间的氧化耦合的产物中，催化C-S键结的断裂。

由egtD基因编码者的多肽(EgtD酶)催化组氨酸的N-甲基化以生产组氨酸甜菜碱。

因为EgtD是一个SAM依赖型甲基转化酶(SAM dependentmethyltransferase)，SAM合成酶可与EgtD被共表达以增加EgtD的活性。因此，一些具体实施例中，该细胞可进一步被转化以重组地表达有SAM合成酶编码的基因。该酶SAM合成酶(EC 2.5.1.6)催化甲硫氨酸和三磷酸腺苷(ATP)转化为S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine)(AdoMet或SAM)。催化甲硫氨酸转化为SAM的SAM合成酶的基因，已经自E.coli中复制出来。

由于SAM合成酶的底物为甲硫氨酸和ATP，除了组氨酸和组氨酸甜菜碱外，可进一步以甲硫氨酸补充该用于生产麦角硫因的细胞培养基。

本发明人亦发现，在具有FAD合成酶的条件下，能够增加细胞中EgtE的表达。FAD合成酶催化从核黄素和ATP形成黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adeninedinucleotide)。

因此，一些具体实施例中，该细胞可进一步被转化以重组地表达有FAD合成酶或其维持酶活性的功能片段编码的基因。

由于金属酶(metallo-enzyme)(EgtB or OvoA)的摄取和成熟是为了最大效率所必需的，该用于生产麦角硫因的转化细胞中可包括Fe摄取系统。例如，该宿主细胞可进一步转化以表达铁载体(siderophore)，如有铁载体或其功能片段编码的多肽，以及以一或多种铁盐补充该培养基。

该领域技术人员应理解，本文中所述的基因可自各种来源获得。

一些具体实施例中，该ovoA基因是氧化酶且包括SEQ ID NO：1的核苷酸序列(ETA_00030[Erwinia tasmaniensis Et1/99]，ACCESSION YP_001905965：

ATGGCAAAATGGGAGCACGACGTGACCGCGCAACAACACCAGACAGGATTACCCGC

CCCAACCCGCATGCTGACGCTCAGCGGTGGCGATCCACAACAAAAACGACTGCAGA

TACTGAGCGACTTCAGCAAGACCTGGGAACTCTATGAAAGCCTGTTTGACTGCCTTA

CCGATGAGCGCGCCTGGTACACCAAGGCCATTTCACTGCGTCACCCGCTGATCTTCT

ATTACGGCCATACCGCCACCTTCTATATCAACAAGTTGATGGCGGGGGGGCTTATCG

ACGCGCGCGTTGACGACAGGATCGAAGCGACAATGGCGATTGGCGTCGACGAAATG

AGCTGGGACGACCTGGATAACAGCCACTACAGCTGGCCGTCGCTGGCAGAACTGCG

CGACTATCGTGGAAAAGTTCGCCACCTCGTTGAGCAGTTTATTCAGCAGATGCCGTT

GACGTTGCCGATCGGCTGGGATAGCCCGGCATGGGTTATCCTGATGGGGATCGAGC

ATGAGCGCATCCATCTGGAAACCTCAAGCGTGCTGATCCGCCAGCTGCCGCTGGCGT

GGGTCAGCGCCCAGCCGCACTGGCCTGCCTGTCCCGATGCGCGTCACGATCGTATGG

CGGTGCCGGCCAACAGCCTGGTACAGGTCGCCGGTCGCCGCGTGACGCAGGGGAAA

ACGGATGATACCTACGGCTGGGATAATGAGTACGGCAGCCTGGTCACCGAAGTGAA

GCCATTTCAGGCCAGCCGCATGCTGGTCAGTCATGCCGAATTTITTGCTTTCGTTGCC

GCGGGAGGCTATCAGAACCAACGCTGGTGGGATGACGAAGGCTGGGGCTGGCGTGA

ATITTCCGCGGCGGAGATGCCGACCrITTGGCGAGGTTCACCACAGCAGCCGGAAG

AATTAAGGCTGCGCCTGCTGGCAGAAGAAGTGGCGATGCCGTGGGACTGGCCGGCC

GAGGTCAATCAGCTGGAGGCTGCCGCATTCTGCCGCTGGAAAGCGGAGGAGACCGG

CCTGTCGATCCAGCTGCCGGCGGAGAGTGAATGGA’TGAGCCTGCGCGAGCAGGTTG

AGGGCGACCAGCCGGACTGGAATGATGCACCGGGCAATATTAATCTGGCCTGCTGG

GCATCTTCTTGCCCAATAGACCGCTTTGCCCAGGGCGAATTCTTCGACCTGGTIGGC

AATGTCTGGCAGTGGACCACGACGCCAATCAACGGTTTTCCGGGCTTTCGCGTCCAC

CCTTTATACGATGATTTCTCC ACCCCGACCTTTG ATGGCA A ACACACGCTGATTAAG

GGCGGCAGCTGGATATCTACCGGCAATGAGGCCCTGAAATCTGCTCGCTATGCCTTC

CGACGCCATTTCTTCCAGCATGCGGGATTCCGCTATGTGGTTTCGCAACATCAGGAG

AGCCTGCACTCCAACCCGTATGAAACGGACAGCATGGTGTCACAGTATCTCGATTIC

CAGTACGGCCCAGAGTACTTCGCCGTGGAAAATTACGCCAAGGCGCTGGCGAAGAT

CGCCTGCGGTATCAGTCAGCACCACCAGCGCGCGCTGGATATCGGCTGTGCTACCGG

ACGTGCCAGCTTTGAGCTGGCGCGTCATITTGAGCAGGTGGTCGGAATGGACTACTC

GGCGCGITTTATCGACGTGGCTCTGC AACTGACCCGCGGCGAAG ATTTCCGCTATGT

CACCCAGGAAGAAGGCGACCTGGTCGAATACCGTCAGGTGCATTTGCCGGACTTCG

ATCTCGGCCCGGAGCAGGCCAGCCGCATCCGGTTTGTACAGGGGGATGCCTGCAAC

CTGAAACCCCAGCAGGAAGCCTGGGATCTGGTGCTGGCCGCTAACCTGATTGACCG

CCTGCGCCAGCCGGCGCGCTICCTTGCGGACATCGCGCCCATGATCCGCCCCGGCGG

CGTACTGATGCTCTCATCCCCCTATACTTGGCTTGAAGAGTTCACGCCGAAAGAGAA

CTGGCTGGGCGGCATTCGTGAAAACGGCGAAGCGCTCTCGACTTATCAGGCGCTGC

AACGTCTGCTGGCCGCCGACTTTGAGGAGCTGGCCCCGCCTCAGGACGTGCCGTTTG

TCATTCGTGAAACGGCGCGCAAATATCAGCACAGCGTGGCGCAGTTAACCCTGTGG

CGTAAACGTTAG)。

一些具体实施例中，该ncEgt-1基因是氧化酶，且包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列(Neurospora crassa OR74A合成蛋白质NCU04343部分mRNA，ACCESSIONXM_951231，VERSION XM_951231.2GI：164429491：

ATGCCGAGTGCCGAATCCATGACCCCAAGCAGTGCCCTCGGACAGCTCAAAGCAAC

TGGACAACATGTGCTATCCAAGCTTCAGCAGCAGACATCAAACGCCGATATCATCG

ACATCCGCCGCGTTGCTGTAGAGATCAACCTCAAGACCGAGATAACCTCCATGTTCC

GACCTAAAGATGGCCCTAGACAGCTACCCACCIIGCTTCTCTACAACGAGAGAGGC

CTGCAGCTGTTCGAGCGTATCACATACCTTGAAGAGTACTATCTTACCAATGACGAG

ATCAAAATCCTCACCAAACATGCGACCGAAATGGCTAGCTTCATCCCGTCAGGTGCC

ATGATCATTGAGCTCGGAAGCGGAAATCTGCGCAAAGTAAACCTTCTATTGGAAGC

CCTAGACAACGCCGGCAAGGCAATFGACTATTATGCCCTTGACCTGTCTCGGGAGGA

GCTGGAGCGCACTCTCGCTCAGGTACCATCCTACAAGCACGTCAAGTGCCACGGTCT

TCTGGGTACATATGACGATGGACGTGACTGGCTCAAGGCCCCAGAGAACATCAATA

AACAGAAATGCATCTTGCACCTCGGGTCAAGCATTGACAAGGTTGGTATTACTCACG

AGTTCATCTTGAATGGTCTTCGCAACGCCAATGAAATTATCGGAGAGACGGCCTTCA

TCGAGGGCGATTGGAGAGTCATTGGCGAATATGTGTATGACGAAGAGGGCGGCAGA

CACCAGGCCTTTTACGCCCCCACTCGCGACACCATGGTTATGGGGGAGTTGATTAGG

TCACACGACAGGATCCAGATCGAACAGAGCCTAAAGTACTCGAAAGAGGAGTCAGA

GAGGCTCTGGAGCACGGCGGGATTGGAACAAGTCTCGGAATGGACGTACGGCAACG

AATATGGACTCCATCTGCTTGCCAAGTCAAGGATGTCTTTCAGTCTCATCCCTTCGGT

GTACGCTCGCAGCGCACTCCCAACTCTGGACGACTGGGAGGCCCTTTGGGCGACAT

GGGATGTCGTCACACGTCAGATGCTTCCCCAGGAAGAGCTTCTGGAGAAGCCCATC

AAGCTCCGAAACGCCTGCATCTTTTACCTCGGTCACATCCCGACCTTCCTCGACATC

CAGCTCACAAAGACCACCAAGCAGGCTCCGTCAGAGCCCGCTCACTTTTGCAAGAT

CTTCGAGCGAGGCATTGATCCTGATGTCGACAACCCGGAGCTGTGTCATGCGCACTC

GGAGATTCCTGATGAATGGCCGCCGGTGGAAGAAATCCTGACCTACCAGGAGACGG

TACGGTCCCGGTTACGCGGCCTCTATGCGCATGGCATCGCGAATATTCCGCGGAATG

TGGGTCGGGCCATTTGGGTTGGGTTTGAGCACGAGCTTATGCATATCGAGACGCTGT

TGTACATGATGCTACAGAGCGACAAGACGCTGATCCCAACCCATATTCCACGGCCC

GACTTTGACAAGCTCGCGAGGAAGGCAGAGTCCGAGAGGGT’TCCCAATCAGTGGTT

TAAGATTCCGGCACAGGAGATCACCATCGGTTTGGATGATCCTGAGGATGGATCTGA

TATCAACAAGCATTATGGCTGGGACAACGAGAAGCCTCCAAGGCGCG 11 CAAGTTG

CTGCCTTTCAGGCTCAAGGGAGGCCGATCACCAACGAAGAGTACGCGCAATATCTG

CTTGAAAAGAACATCGACAAGCTCCCTGCCTCTTGGGCCCGCCTGGACAACGAGAA

CATTAGCAATGGAACAACAAACAGCGTGAGCGGTCACCACAGCAACAGAACCTCCA

AGCAGCAGCTCCCTTCATCTTTCCTCGAGAAGACAGCAGTCCGCACAGTCTACGGTC

TCGTGCCTCTCAAGCACGCTCTCGACTGGCCCGTGTTTGCCTCTTACGACGAACTTGC

CGGTTGCGCAGCTTACATGGGCGGCCGTATTCCCACCTTCGAAGAGACCCGGAGCAT

TTACGCTTACGCCGATGCTCTCAAGAAGAAGAAGGAAGCTGAGAGACAATTGGGAA

GGACGGTTCCGGCTGTTAATGCCCACCTAACCAACAACGGCGTGGAAATCACTCCCC

CATCCTCTCCCTCTTCCGAGACCCCCGCCGAGTCTTCCTCCCCCTCCGACAGCAACAC

CACCCTCATCACCACCGAAGACCTCTTCTCTGACCTAGACGGTGCCAATGTCGGTTT

TCACAACTGGCACCCTATGCCCATCACCTCCAAAGGCAACACCCTTGTCGGGCAAGG

CGAGCTCGGCGGCGTGTGGGAATGGACTTCATCGGTCCTCCGCAAGTGGGAGGGGT

TCGAGCCGATGGAGCTGTACCCCGGCTATACGGCGGAT’TTMCGATGAGAAGCACA

ACATTGTGCTGGGAGGGAGCTGGGCTACGCATCCGAGGATTGCGGGGAGGAAGAGC

TTTGTGAATTGGTACCAGAGGAATTATCCTTATGCTTGGGTGGGGGCGAGAGTTGYT

AGGGAITTGTGA)

一些具体实施例中，该egtD基因为甲基转移酶并包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列(合成蛋白质MSMEG_6247[Mycobacterium smegmatis str.MC2 155]，

ACCESSION YP_890466，VERSION YP_890466.1GI：118473274：

ATGACGCTCTCACTGGCCAACTACCTGGCAGCCGACTCGGCCGCCGAAGCACTGCG

CCGTGACGTCCGCGCGGGCCTCACCGCGGCACCGAAGAGTCTGCCGCCCAAGTGGT

TCTACGACGCCGTCGGCAGTGATCTGTTCGACCAGATCACCCGGCTCCCCGAGTATT

ACCCCACCCGCACCGAGGCGCAGATCCTGCGGACCCGGTCGGCGGAGATCATCGCG

GCCGCGGGTGCCGACACCCTGGTGGAACTGGGCAGTGGTACGTCGGAGAAAACCCG

CATGCTGCTCGACGCCATGCGCGACGCCGAGITGCTGCGCCGCTTCATCCCGTTCGA

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GTATCGAGATCGACGCGGTATGTGGCGATTTCGAGGAACATCTGGGCAAGATCCCG

CATGTCGGACGGCGGCTCGTGGTGTTCCTGGGGTCGACCATCGGCAACCTGACACCC

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CCTGCTGCTGGGCACCGATCTGGTGAAGGACACCGGCCGGTTGGTGCGCGCGTACG

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AGGTGTCCTGCAAGTTCCGTCCCGAGAACGTCGTCGCCGAGCTGGCGGAAGCCGGT

CTGCGGCAGACGCATTGGTGGACCGATCCGGCCGGGGAT’11 CGGGTTGTCGCTGGCG

GTGCGGTGA)

一些具体实施例中，该egtE基因为C-S裂解酶并包含SEQ ID NO：4的核苷酸序列(磷酸吡哆醛依赖型转移酶(pyridoxal-phosphate-dependent transferase)[Mycobacterium smegmatis str.MC2 155]，ACCESSION ABK70212，VERSIONABK70212.1GI：118169316：

GTGATGCTCGCGCAGCAGTGGCGTGACGCCCGTCCCAAGGTTGCCGGGTTGCACCTG

GACAGCGGGGCATGTTCGCGGCAGAGCTTCGCGGTGATCGACGCGACCACCGCACA

CGCACGCCACGAGGCCGAGGTGGGTGGTTATGTGGCGGCCGAGGCTGCGACGCCGG

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GGTCGACGAGGCGTCGCACGAACTGTCGGCCCATCCCGTCGCGCTCGTACACCTCAC

CGCATTGGCAAGCCATCGCGGGATCGCGCAACCCGCGGCAGAACTCGTCGAGGCCT

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CCGTTCGAGATGCGCACGCCGGTGCTGCGAATCTCGCCGCACGTCGACGTGACGGTC

GACGAACTGGAGCAGTTCGCCGCAGCG F1 GCGTGAGGCGCCCTGA。

一些具体实施例中，该有FAD合成酶编码的基因包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列(Corynebacterium ammoniagenes gene for FAD synthetase，complete cds，ACCESSION D37967，VERSION D37967.1 GI：840670：

GTGGATATTTGGTACGGAACAGCAGCAGTCCCAAAAGACTTAGACAACAGTGCAGT

CACCATTGGTGTCTTCGACGGCGTGCATCGCGGGCATCAGAAATTGA flAATGCCAC

TGTTGAAAAAGCACGCGAGGTGGGCGCGAAAGCCATCATGGTTACTTTTGACCCGC

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CCCGCGAACTCTCTGGTACTTCGCCGGAGAAGTACGTGGAATTTCTTCTAGAAGACA

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GCAAGCACATAAGATGGCGCCTGAGACCTACTTICTACAAGCAGAAAGCTAA

一些具体实施例中，该有SAM合成酶编码的基因包含SEQ ID NO：6的基因(E.colt metK gene coding for S-adenosylmethionine synthetase.ACCESSIONK02129REGION：86..1240，VERSION K02129.1GI：146838：

ATGGCAAAACACCTTTTTACGTCCGAGTCCGTCTCTGAGGGCCATCCTGACAAAATT

GCTGACCAAATTTCTGATGCCGTTTTAGACGCGATCCTCGAACAGGATCCGAAAGCA

CGCGTTGCTTGCGAAACCTACGTAAAAACCGGCATTGGTTTTAGTTGGCGGCGAAAT

CACCACCAGCGACCTTGGGTAGACATCGAAGAGATCACCCGTAACACCGTTCGCGA

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GGAACAGGGCGCGGGTGACCAGGGTC ITGATGTTTCGGCTACGCAACTAATGAAAC

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CCGACCGOTCGTTTCGTTATCGGTGGCCCAATGGGTGACTGCGGTCTTACTGGTCGT

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AATCGGCCTGGCTGAACCGACCTCCATCATGGTAGAAACTTTCGGTACTGAGAAAGT

GCCTTCTGAACAACTGACCCTGCTGGTACGTGAGTTCTTCGACCTGCCAATCGGTCT

GATTCAGATGCTGGATCTGCTGCACCCGATCTACAAAGAAACCGCAGCATACGGTC

ACTT’TGGTCGTGAACATTTCCCGTGGGAAAAAACCGACAAAGCGCAGCTGCTGCGC

GATGCTGCCGGTCTGAAGTAA)。

如本领域技术人员所知，这些酶的同源性基因能够自其它物种取得且能够通过同源性检索识别，例如通过蛋白质BLAST检索，可在美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)网站(www.ncbi.nlm.nih.gov)找到。和本发明有关的基因可从DNA进行PCR扩增，该DNA来自任何来源的包含有该指定基因的DNA。某些具体实施例中，基因通过聚合酶链锁反应(PCR)使用基因体DNA(genomic DNA，gDNA)模板而获得。一些具体实施例中，和本发明有关的基因是合成的。为了获得和本发明有关的酶编码的基因的任何手段可以和本发明共存。

如本文所用，表达基因意指该细胞生产由该基因编码的全长多肽或该全长多肽的功能性片段。术语“功能性”当与“片段”结合使用时指的是拥有生物活性与该整体的生物活性本质上相同的多肽或其中分子是其片段。此内容所用“本质上相同”意指保持该相对应的野生型肽相关或所欲生物活性的至少25％、至少35％、至少50％。例如，多肽的功能性片段保持的酶活性与该由基因编码于细胞中表达的全长多肽的酶活性本质上相同。

于本情况下，由egtE基因编码的多肽的功能性片段将会是能够催化组氨酸甜菜碱和半胱氨酸之间氧化耦合产物中的C-S键的裂解的肽，即中间产物转变成为麦角硫因。由该ovoA基因或ncEgt-1基因编码的多肽的功能性片段将会是能够催化从组氨酸甜菜碱和半胱氨酸形成的肽。由该egtD基因编码的多肽的功能性片段将会是能够催化组氨酸的N-甲基化以生产组氨酸甜菜碱的肽。由该SAM基因编码的多肽的功能性片段将会是能够催化甲硫氨酸和ATP转变成为S-腺苷甲硫氨酸的肽。由该FAD合成酶基因编码的多肽的功能性片段将会是能够催化FAD形成的肽。这类功能性片段能够被通过如于本文的实例中所揭露的方法来评估。

一些具体实施例中，一或多个于本文中所述的基因被表达在重组的表达载体或质粒中。如本文所用，术语“载体”(vector)指的是适用于将转基因转移进入宿主细胞的聚核苷酸序列。术语“载体”包括质粒、迷你染色体(mini-chromosomes)、噬菌体、裸露DNA和类似物。参见，例如第4,980,285号；第5,631,150号；第5,707,828号；第5,759,828号；第5,888,783号和第5,919,670号美国专利，以及Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2ndEd.，Cold Spring Harbor Press(1989)。其中一种载体为“质粒”，指在其中连接额外DNA节段的环状双股DNA环。另一种载体为病毒载体，其中额外的DNA节段被黏合到该病毒基因体中。某些载体有在其被送入的宿主细胞中自主复制的能力(如，具有细菌复制起点的细菌载体以及游离型(episomal)哺乳动物载体)。再者，某些载体有指示其被操作连结的基因表达的能力。这类载体于本文中被称为“表达载体”。一般而言，效用表达载体在重组DNA技术中经常是质粒的形式。在本说明书中，由于质粒为最常被使用的载体形式，“质粒”和“载体”可交替地使用。然而，本发明意图包括这类表达载体的其它形式，如提供相等的功能的病毒载体(如，复制缺陷逆转录病毒、腺病毒以及腺病毒相关病毒)。

克隆载体是能够在宿主细胞中自主地复制或融入该基因体的载体，且进一步特征为，具有一或多个内核酸酶限制位置，在该位置，载体可能以可确定的方式被剪切且所欲DNA序列能够被粘合，从而新的重组载体维持其在该宿主细胞中复制的能力。至于质粒，随着质粒于该宿主细胞如宿主细菌中的拷贝数的增加，所欲序列的复制能发生许多次，或者在宿主通过有丝分裂复制前，每一宿主中仅发生一次。至于噬菌体，则复制能够在溶解期(lytic phase)期间主动地发生或在溶原期(lysogenic phase)被动地发生。

表达载体是所欲的DNA序列能够通过限制和粘合而插入其中的载体，藉此可操作地加入至调控序列且能够被表达为RNA转录本。载体能进一步包含一或多个适用于识别已经或未经转化或由该载体转化或转染的细胞的标记序列。标记包括，例如，有增加或减少对抗体或其它化合物的抗性或感性的蛋白质编码的基因、有其酶活性可由本领域已知的标准试验测得的酶编码的基因(该酶如，β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)、荧光素酶或碱性磷酸酶)以及其可见地影响经转化或转染细胞表达型、宿主、菌群或菌斑的基因(如，绿色荧光蛋白)。某些具体实施例中，本文所用的载体能自主复制和表达存在于其可操作地加入DNA节段中的结构基因产物的能力。

如本文所用，所述编码序列和调控序列被“可操作地”(operably)加入，当它们在该调控序列的影响或控制下，以这样的方法共价连结至该编码序列表达或转录的位置。若期望该编码序列被转译为功能性蛋白质，二个所述DNA序列被可操作地加入，若启动子在该5’调控序列的诱导导致该编码序列的转录且若该二个DNA序列间的连结的性质并未(1)导致移码突变(frame-shift mutation)的引入；(2)干扰该启动子区域指示该编码序列转录的能力；或(3)干扰该相对应RNA转录本被转译为蛋白质的能力。因此，若该启动子区域能够影响DNA序列转录以致所得转录本能转译为所欲的蛋白质或多肽，则启动子区域将会被可操作地加入编码序列。

当在细胞中表达编码本文所述任何酶的核酸分子时，多种转录本控制序列(如，启动子/增强子序列)可用以指示其表达。该启动子可为天然启动子，即于该基因其内源性内容(endogenous context)中的启动子，其提供该基因表达的正常调控。一些具体实施例中，该启动子可为持续表达(constitutive)，即该启动子不被调控而允许其相关基因不间断的表达。也可使用各种条件式启动子(conditional promoter)，例如由分子的存在或不存在控制的启动子。

用于基因表达所需的调控序列的明确特性能够因物种或细胞种类而有所不同，但一般而言可以依照所需包括，分别参与转录和转译起始的5’非转录和5’非转译序列，如TATA序列(TATA box)、加帽序列(capping sequence)、CAAT序列、以及类似序列。尤其，这类5’非转绿调控序列将会包括启动子区域，其中包括用于该可操作地加入的基因的转录控制的启动子序列。调控序列亦可如所期望地包括增强子序列或上游活化子序列。本发明的载体可选择地包括5’前导或信号序列。适当载体的选择和设计处于本领域技术人员的能力和斟酌决定范围内。

包含全部用于表达所需组件的表达载体为商业上可得且为本领域技术人员所知悉。参见，如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989。细胞为基因工程的，通过把异源性RNA(RNA)送入该细胞。该异源性DNA(RNA)处在转录组件的可操作的控制下以允许该异源性DNA在该宿主细胞中表达。

一些具体实施例中，该载体为pETDuet载体。

一些其它的具体实施例中，该载体为pACYDuet载体。

一些其它的具体实施例中，该载体为pASK-IBA载体。

无限制地，本文所述的基因可包括在一个载体中或不同的载体中。例如，ovoA基因或ncEgt-1基因和egtE基因可包括在同一个载体中；或egtE基因和有FAD合成酶编码的基因可包括在同一个载体中；或ovoA基因或ncEgt-1基因、egtE基因、和有FAD合成酶编码的基因可包括在同一个基因中；或egtD基因和有SAM合成酶编码的基因可包括在同一个载体中。

一些具体实施例中，ovoA基因或ncEgt-1基因、egtE基因、和有FAD合成酶编码的基因可包括在第一载体中；以及egtD基因、ovoA基因或ncEgt-1基因、和egtE基因可包括在第二载体中。

一些具体实施例中，该重组地表达基因中的一或多个可融入该细胞的基因体中。

可使用本领域中标准的方法和技术将编码本发明的酶的核酸分子引入一或多个细胞中。例如核酸分子可通过标准协议步骤，如包括化学转化和电穿孔、转导(transduction)、粒子轰击(particle bombardment)等转化作用而引入。表达该编码本发明的这些酶的核酸分子亦可通过将该核酸分子融入该基因体而实现。

本文所提供的一些方面是有关于细胞培养基或收集自本文所述的培养细胞的上清液。

本文所提供的其它方面是有关于一种方法，包括于细胞培养基中培养本文所述的细胞。

本文所述的各式方面有关于一种方法，其包括于细胞中重组地表达一或多个麦角硫因生物合成途径的基因和一或多个ovothiol生物合成途径的基因。

本文所提供的一些方面有关于用于制备麦角硫因的方法。

一些具体实施例中，该方法包括于细胞中重组地表达：(i)EgtA蛋白质或保留酶活性的其功能性片段；(ii)EgtB蛋白质或保留酶活性的其功能性片段；(iii)EgtC蛋白质或保留酶活性的其功能性片段；(iv)EgtD蛋白质或保留酶活性的其功能性片段；(v)EgtE蛋白质或保留酶活性的其功能性片段；以及(vi)有FAD合成酶编码的基因或保留酶活性的其功能性片段。

一些具体实施例中，该方法包括于细胞中重组地表达：(i)OvoA蛋白质、NcEgtl蛋白质或保留酶活性的其功能性片段；(ii)EgtE蛋白质或保留酶活性的其功能性片段；和(iii)FAD合成酶或保留酶活性的其功能性片段。

一些具体实施例中，该方法包括于细胞中重组地表达：(i)EgtD蛋白质或保留酶活性的其功能性片段；(ii)OvoA蛋白质、NcEgtl蛋白质或保留酶活性的其功能性片段；(iii)EgtE蛋白质或保留酶活性的其功能性片段；以及(iv)FAD合成酶或保留酶活性的其功能性片段。本申请的一些进一步的具体实施例中该细胞进一步表达SAM合成酶或保留酶活性的其功能性片段。

一些具体实施例中，该方法包括于细胞中重组地表达：(i)ovoA或ncEgt-1基因；以及(ii)egtE基因和FAD合成酶基因。

如本文所述，本发明人亦发现麦角硫因的合成可通过于该转化细胞中从组氨酸甜菜碱开始并生产麦角硫因而进一步简化。因此，一些具体实施例中，该方法包括于细胞中重组地表达：(i)egtD基因；(ii)ovoA基因或ncEgt-1基因；以及(iii)egtE基因和FAD合成酶基因。一些具体实施例中，该方法进一步包括从细胞重组地表达有S-腺苷甲硫氨酸(SAM)合成酶编码的基因。

于一些具体实施例中，本文中所述进一步方法包括于细胞培养基中培养本文所述的细胞。

一些具体实施例中，出现于本文中本发明任何方面或具体实施例中所述的方法包括以组氨酸甜菜碱或组氨酸喂养该细胞。例如，若该细胞未表达(重组地或其它)egtD基因，可以组氨酸甜菜碱喂养该细胞，即，该培养基中可以补充组氨酸甜菜碱。于其它实例中，若该细胞表达(重组地或其它)egtD基因，则可以组氨酸喂养该细胞，即该培养基中可以补充组氨酸。egtD基因的表达使该细胞能够将组氨酸转变成为组氨酸甜菜碱，其可接着被由ovoA基因或ncEgt-1基因表达的多肽使用。

一些具体实施例中，本文所述的方法进一步包括在培养本文所述的细胞后，收集细胞培养基或上清液。

一些具体实施例中，本文所述的方法包括使用单纯的酶或来自表达这些酶的细胞的溶解产物(lysate)，如自本文所述的细胞所获得的溶解产物行体外反应。因此，一些具体实施例中，该用于生产麦角硫因的方法包括：(i)以反应混合物培育组氨酸或组氨酸甜菜碱，该反应混合物包括重组地表达的EgtA蛋白质或保留酶活性的其功能性片段、EgtB蛋白质或保留酶活性的其功能性片段、EgtC蛋白质或保留酶活性的其功能性片段、EgtD蛋白质或保留酶活性的其功能性片段、和EgtE蛋白质或保留酶活性的其功能性片段；以及(ii)自该酶混合物中分离麦角硫因。

一些具体实施例中，该用于生产麦角硫因的方法包括：(i)以反应混合物培育甜菜碱，该反应混合物包括重组地表达的：(a)OvoA蛋白质、NcEgt 1蛋白质或保留酶活性的其功能性片段和(b)EgtE蛋白质或保留酶活性的其功能性片段；以及(ii)自该酶混合物中分离麦角硫因。

一些具体实施例中，该用于生产麦角硫因的方法包括：(i)以反应混合物培育组氨酸，该反应混合物包括重组地表达的：(a)EgtD蛋白质或保留酶活性的其功能性片段、(b)OvoA蛋白质、NcEgtl蛋白质或保留酶活性的其功能性片段、和(c)EgtE蛋白质蛋白质或保留酶活性的其功能性片段；以及(ii)自该酶混合物中分离麦角硫因。

一些具体实施例中，该反应混合物包括来自本文所述细胞的溶解产物。因此，一些具体实施例中，该反应混合物包括来自本文所述细胞的细胞溶解产物(如，无细胞溶解产物)。

一些具体实施例中，该反应混合物进一步包括甲硫氨酸或半胱氨酸。

一些具体实施例中，该反应混合物以铁盐补充。

一些具体实施例中，本文所述的方法进一步包括自该细胞、自该细胞生长于其中的细胞培养基、或该反应混合物中回收麦角硫因。

可自可被于惯常的细胞培养基中或发酵生物反应器中培养该细胞，如转化细胞。该细胞可以任何培养或发酵过程培养，包括但不限于批次、馈料批次式(fed-batch)、细胞循环(cell recycle)、和连续发酵。根据本发明的细胞可培养于任何形式的培养基(丰富的或基础的)以及任何组合物中。如本领域技术人员所能理解的，一些具体实施例中，常规的优化将使各种培养基能够使用。所选择的培养基可补充各种添加成分。一些补充添加成分的非限制性实例包括组氨酸甜菜碱、组氨酸、抗体、IPTG或其它用于基因诱导的诱导剂、和ATCC微量矿物补充剂。同理，本发明的该细胞的培养基和生长条件的其它方面可通过常规的实验得以优化。例如，pH和温度为可优化因子的非限制性实例。一些具体实施例中，因子如培养基择、培养基补充剂、和温度的选能影响麦角硫因的生产水平。一些具体实施例中，可优化该补充成分的浓度和含量。一些具体实施例中，优化该培养基补充一或多种补充成分的频次，以及在收获麦角硫因前该培养基被培养所需要的时间。

根据本文所述方面，麦角硫因的高效价是通过该与本发明相关的基因在细胞中或无细胞溶解产物重组地表达而生产。如本文所用“高效价”指的是在毫克每升(mg L^-1)规模的效价或更高。生产指定产物的效价会被多重因子，包括培养基的选择所影响。一些具体实施例中，该生产麦角硫因的效价为至少1000mg L-^-1。

某些方面中，是将用来使本文所述具体实施例相关的细胞生长的液体培养封装于本领域已知并使用的任何培养皿中。一些具体实施例中，在曝气反应器，如搅拌槽反应器的大规模生产是用来生产大量的麦角硫因。

在该转化细胞生产该麦角硫因后，麦角硫因可累积于培养基中并可从中收集或回收。“收集”产物如麦角硫因可简单地指自该发酵生物反应器中收集该生质粒而无需隐含额外的分离、回收、或纯化步骤。例如，该收集步骤可以指从该生物反应器中移除整个培养(即，该转化细胞和该发酵培养基)，和/或从该生物反应器中移除包含麦角硫因的转化细胞。术语“回收”(recovering或recover)，如本文中关于回收麦角硫因所用的，指执行额外处理步骤以获得任何纯度水平的麦角硫因。这些步骤可接续进一步的纯化步骤。例如，麦角硫因可以下述技术自生物质粒中回收，该技术包括但不限于下列步骤：溶解细胞溶液；收集并清洗包含麦角硫因的剩余固体；将经清洗的固体重新悬浮于适当缓冲液或溶液中；以及以色谱法进行对来自该溶液中的麦角硫因的浓缩以及纯化。

一些具体实施例中，麦角硫因以本质上纯物质形式回收。如本文所使用“本质上纯物质”指允许该麦角硫因的有效利用如用于商业贩卖的化合物的纯度。

一些具体实施例中，该麦角硫因产物优选自该生产微生物和其它培养基成分或该反应混合物中分离出来。实现这类分离的方法为本领域技术人员所知悉。例如，分离技术包括但不限于，离子交换色谱法和HPLC纯化的结合。

本发明的方面包括自细胞中优化生产麦角硫因的策略。优化生产麦角硫因指随着优化策略的追求而生产的比不存在这类策略时所实现的更高量的麦角硫因。一些具体实施例中，优化包括通过适当启动子和核糖体结合位置的选择以增加一或多个本文所述基因的表达量。一些具体实施例中，这包括高拷贝数质粒、或低或中拷贝数质粒的选择。一些具体实施例中，该质粒为中拷贝数质粒，如pETDuet。可被用于本文所述细胞和方法中的其它质粒包括pCDFDuet-l、pACYCDuet-1、pASK-IBA、和pCOLADuet-1。于一些具体实施例中，转录终止的步骤亦可作为目标以用于对基因表达的调控，通过结构，如茎环(stem-loop)的引入或排除。

一些具体实施例中，使用已被优化用于生产麦角硫因的细胞。一些具体实施例中，通过随机突变筛选(random mutagenesis screen)或通过已知突变的筛选执行导致麦角硫因的生产增加的突变的筛选。于其它具体实施例中，通过筛选具有这些使麦角硫因的生产增加的片段的细胞或生物，基因片段的散弹枪克隆(shotgun cloning)被用来确认导致麦角硫因的生产增加的基因区域。一些情况，一或多个突变被结合于同一个细胞或生物中。

有酶编码的基因被在送入细胞前被修饰的一些具体实施例中，也可能需要蛋白质表达的优化，如通过密码子优化而用于在细菌细胞中表达。对多种生物的密码子使用可在密码子使用数据库Codon Usage Database(网址：kazusa.or.jp/codon/)中找到。

一些具体实施例中，使用蛋白质工程来优化一或多个与本发明相关的酶的表达或活性。某些具体实施例中，工程手段可包括确定酶的三维结构或基于有关蛋白质的结构建构该酶的三维同源模型。基于三维模型，酶中的突变可被建构并纳入细胞或生物中，可接着筛选该细胞或生物以用于增加麦角硫因的生产。一些具体实施例中，通过操控以其作用途径与本文所述途径相关酶相同的酶，增加麦角硫因在细胞中的生产。例如，一些具体实施例中，增加酶或其它在目标酶上游作用的因子的表达是有利的，该因子为如与本文所述一种或多种途径相关的酶。一些具体实施例中，这通过使用任何标准方法过度表达该上游因子以实现。

一些选用的定义

方便起见，将某些在本文说明书、实例和权利要求书中使用的术语收集于此。除非另有声明，或自内文中可无疑义确定者，下列术语和词句包括以下所提供的意义。除非另有明确地声明，或自内文中显而易见者，以下的术语和词句不排除于其所属技术领域中所得该术语或词句的意义。该定义是提供以帮助描述特定具体实施例，且不意图限定本发明，因为本发明的范畴仅由权利要求书所限定。而且，除非内文中要求，否则单数形式的术语应包括复数且复数形式的术语应包括其单数。

除非另有定义，本文使用的全部技术和科学术语具有如其通常被本发明所属技术领域的技术人员所理解的相同的意义。虽然任何已知方法、装置、和材料可被用于本发明的实施或测试，在这方面，该方法、装置、和材料被描述于本文中。

如本文所用的术语“包括”或“包含”(comprising或comprises)用于有关于本发明不可或缺的组合物、方法、和其分别的一或多种成分，但仍开放包括未特别指定的组件，无论其是否为必需。

单数术语“一”或“一个”(a或an)和“该”(the)，包括复数的指示物，除非内文有另外清楚地表明。同理，“或”意图包括“和”，除非内文有另外清楚地表明。

除了该操作实例，或其中有其它表明，本文所使用全部代表原料或反应条件的量的数字应被理解如全部实例中以术语“约”所修饰。术语“约”当连同百分比使用时可能意指该被提及值的±5％。例如，约100意指自95至105。

虽然与那些本文所述者相似或等效的方法和材料可被使用于本公开的实施或测试，适合的方法和材料描述于下。术语“包括”(comprises)意指”包括”(includes)。缩写“如”(e.g.)源自于拉丁文exempli gratia，且于本文中用于指非限定的例子。因此，该缩写“如”(e.g.)与“例如”(for example)同义。

于本文中使用时，该术语“减少”(decrease)、“变少”(reduced)、“降低”(reduction)、“减少”(decrease)或“抑制”(inhibit)全部通常意指减少了统计上显著的量。然而，为了免除疑义，“变少”、“降低”或“减少”或“抑制”意指与参考量相比减少至少10％，例如减少至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或达到且包括100％减少(如，与参考样品相比不存在的量)，或与参考量相比任何介于10至100％的减少。

于本文中使用时，术语“增加的”(increased)、“增加”(increase)或“增强”(enhance)或“活化”(activate)全部通常意指增加了统计上显著的量；为了免除疑义，该语“增加的”、“增加”或“增强”或“活化”意指与参考量相比增加至少10％，例如增加至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或达到且包括100％增佳、或与参考量相比，任何介于10至100％的增加、或至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍或至少约10倍增加、或与参考量相比，任何介于2倍至10倍或更大的增加。

术语“统计上显著”或“显著”指的是统计显著性且通常意指与参考量相距至少两个标准偏差(2SD)。该术语指的是存在差异的统计证据。其被定义为当虚假设实际上真实时，做出拒绝虚假设决定的概率。

如于本文所用，“基因组件”(genetic elements)指的是经定义的核酸(通常为DNA或RNA)，其具有可表达其产物如蛋白质、缺辅基蛋白、或反义核酸构建的编码序列，可执行或控制途径酶促功能(pathway enzymatic functions)。被表达的蛋白质可负起如酶、抑制(repress)、或压抑或抑制酶活性、或控制酶表达的功能。有这些可表达序列编码的核酸可为染色体的，如通过同源重组、转位作用、或一些其它方法融入非人类生物的染色体；或染色体外的(游离型)，如以质粒、粘粒(cosmid)等携带。基因组件包括控制组件。许多其它基因组件为本技术领域已知。参见，例如第4,980,285号；第5,631,150号；第5,759,828号；第5,888,783号和第5,919,670号美国专利。

如本文所用，术语“基因操控”(genetic manipulation)指的是多核苷酸序列的有目的的改变，无论是通过体外技术、体内技术、或体外和体内技术的结合。“基因操控”包括将异源性多核苷酸序列送至非人类生物中，无论是至该染色体中或如染色体外复制组件；该染色体的多核苷酸序列的改变；转译和/或转录调控信号添加和/或取代至染色体或质粒编码基因；以及导入各种插入、缺失、和取代突变于感兴趣的基因中。用于体外或体内基因操控的方法广为熟悉本技术领域技艺者所知。参见，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Press(1989)和第4,980,285号；第5,631,150号；第5,759,828号；第5,888,783and，5,919,670美国专利。

如本文所用，“可操作地连结”(operably linked)指并置以能够执行该成份的正常功能。因此，将编码序列“可操作地连结”到控制序列指，在这些序列的控制下，该编码序列能够被表达的构型。这类控制可能是直接的，即与单一启动子有关的单一基因，或间接的，如其中从单一启动子中表达多顺反子(polycistronic)转录本的情况。参见，例如，第4,980,285号；第5,631,150号；第5,707,828号；第5,759,828号；第5,888,783号和第5,919,670号美国专利，以及Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，ColdSpring Harbor Press(1989)。

如本文所用，“过度表达”(over-expression)指基因表达。基因和基因产物可以被过度表达。这类基因产物包括RNAs、蛋白质和酶。另一方面，“过度生产”(overproduce)指的是细胞的产物累积，特别是为了一些特定用途要收获的细胞产物。因此，蛋白质、材料(如聚合物)、和代谢产物(如氨基酸)被过度生产。蛋白质可被过度表达(若指的是基因表达的控制)或过度生产(若指的是蛋白质的累积)。由麦角硫因的“过度生产”，其意为在给定组合的生长条件下，“过度生产”麦角硫因的细胞比起相似的非“过度生产”麦角硫因细胞，每一个细胞生产了更多分子的麦角硫因。

如本文所用，术语“启动子”具有本领域公认的意义，意思是包含DNA序列的基因的一部分，其提供RNA聚合酶结合以及转录的起始。启动子通常但非总是，在基因的5’非编码区域被找到。其作用于转录的起始的启动子中的序列组件经常具有一致性核苷酸序列的特色。有用的启动子包括构造性的和诱导的启动子。许多这类的启动子序列为本技术领域中已知。参见，例如第4,980,285号；第5,631,150号；第5,707,828号；第5,759,828号；第5,888,783号；第5,919,670号美国专利，以及Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Press(1989)。其它有用的启动子包括非构造性亦非响应特定(或已知)诱导剂分子的启动子。这类启动子可包括那些对发育讯号(developmental cue)(如该培养的生长期或细胞分化的阶段)、或环境讯号(如pH、渗压剂(osmoticum)、热、或细胞密度)反应者。异源性启动子为非天然地连结至该基因的启动子。异源性启动子可能来自相同或不同物种。例如，异源性启动子可能为启动子和该基因来自相同的生物但天然地被找到连结在不同基因上。

如本文所用，当术语“转基因”(transgene)用于多核苷酸序列时，指多核苷酸序列非天然地存在于细胞中。因此术语“转基因”包括，例如，当A和B基因来自相同生物时，以及在其中一物种的多核苷酸序列被转移至不同物种(或不同品系)的细胞中的情况下，基因A的启动子可操作地加入结构基因B。术语“转基因”亦包括已被如此修饰的转基因的克隆。参见第4,980,285号；第5,631,150号；第5,707,828号；第5,759,828号；第5,888,783号和第5,919,670号美国专利。

如本文所用，术语“培养基”和“细胞培养基”指适合支持该细胞在体外生长(即，细胞培养)的培养基。并非有意将该术语限定于任何特定细胞培养基。例如，该定义意图包括生长以及维持培养基(maintenance media)。实际上，该术语意图包括任何适合用于该令人感兴趣的细胞培养生长的培养基。

如本文所用，术语“细胞型”(cell type)，指的是任何细胞，不论其来源或性质。

如本文所用，术语“转化细胞系”指已经过转化为具有本文所述性质的连续细胞系的细胞培养。

如本文所用，术语“转化非人类生物”包括初代转化受试细胞(primarytransformed subject cell)和其转化子代(progeny)。该非人类生物可为原核或真核。因此“转化突变型”(transformants)或“转化细胞”包括该初代受试细胞，以该转基因转化，且从中衍生培养，而不考虑转殖次数。亦应了解，因为故意的或无心的突变和/或修饰，全部子代在DNA含量上可能并非精确地相同。包括具有如筛选该原始转化细胞相同功能性的突变子代。其中有区别指定处，将在内文中清楚说明。参见，例如第4,980,285号；第5,631,150号；第5,707,828号；第5,759,828号；第5,888,783号；第5,919,670号美国专利，和Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，60Cold Spring Harbor Press(1989)。

如本文所用，术语“分离的”(isolated)意指通过“人的手”自该天然状态被改变。“分离的”组成物或底物是已经从其原始环境中改变或移除，或改变或移除皆有。例如，作为本文所使用的术语，天然地存在细胞中或有生命的动物中的多核苷酸或多肽不是“分离的”，但自其天然状态的共存物质中分开的相同多核苷酸或多肽是“分离的”。

如本文所用，术语“衍生物”(derivative)指结构上与另一者有关的化学物质，该另一者为“原本的”物质，也可被称为“母体”(parent)化合物。“衍生物”可自结构上相关的母体化合物经一或多个步骤制造出来。该词句“密切相关衍生物”意指其分子量不超过该母体化合物的量多于50％的衍生物。密切相关衍生物的一般物理和化学性质亦和该母体化合物相似。

在仍未说明的范围内，本领域技术人员将了解本文所描述和说明的各种具体实施例中任一个可被进一步修饰，以包含本文所揭露的其它具体实施例中所示的特征。

下列实例说明本发明的一些具体实施例和方面。对本领域技术人员将显而易见在不改变本发明的精神和范畴下，可执行各种修饰、添加、取代、和类似调整，并且这类修饰和变化被包含于如权利要求书所定义的本发明的范畴内。以下实例不以任何方式限制本发明。

实例

实例1：通过代谢工程生产麦角硫因(体外酶促手段)

麦角硫因生物合成基因群集的识别。麦角硫因和ovothiol(5&7，图1)为Tanret在1909年自麦角分离的两种含硫醇基-咪唑(thiol-imidazole)的代谢产物[1]。在人体中麦角硫因专一性转运蛋白的存在[2]使我们能够从饮食中富集麦角硫因，在一些器官(如肝、肾、中枢神经系统和红血球)中到达毫摩尔的浓度[3]。不像其它硫醇类，麦角硫因和ovothiol中的硫醇基-咪唑侧链的硫醇盐(thiolate)和硫酮(thione)形式间的平衡优势地偏向硫酮形式(如图1中的5)[3f，4]，这使它们在氧化中比其它硫醇模拟(如，谷胱甘肽)更加稳定[4a]。该独特的麦角硫因氧化还原性质[4a，5]使它能够保护血红蛋白在红血球中不被氧化，避免玻璃体中形成白内障[6]。此外，它可作为金属螯合剂具有对细胞金属解毒的功能。最近，麦角硫因广泛应用作为许多商业产品(抗老化化妆品、防腐剂、饮食补充物、促进毛发和指甲生长的产品等等)的关键成分之一，其具有数十亿美元市场规模。

使用全基因组分析(genome-wide analysis)的生物信息工具和生化特性的结合，Seebeck在2010年提出了麦角硫因的生物合成途径(图1)[7]。当分析麦角硫因(5)的结构时，很清楚它是一种有甲基化和硫酮(thiolketone)官能团的组氨酸衍生物。Seebeck分析三种生物合成麦角硫因的生物，禽结核分枝杆菌(Mycobacterium avium)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)、和粗糙链孢霉(Neurospora crassa)的基因体。在M.avium的基因体中，有78个基因批注为甲基转化酶[8]。在那78个甲基转化酶当中，只有29个在N.crassa中具有同源体。因为E.coli和枯草杆菌(Bacillus subtilis)不生产麦角硫因，在那29个剩余的甲基转化酶中，进一步删去那些在E.coli或B.subtilis具有同源体的。通过使用生物信息工具应用全基因组分析中的正向和负向选择(positive andnegative selection)规则，Seebeck将甲基转化酶的数量缩小至10个。因为细菌中用于二次代谢产物的生物合成的基因偏重群集成操纵子结构(cluster intooperon structures)，通过进一步分析该剩余10个甲基转化酶的邻域，他将其缩小至M.smegmatis中的一个可能适合者(MSMEG_6247，现于图1中定名为EgtD)。除了该基因群集中的甲基转化酶(EgtD)外，EgtA(MSMEG_6250)编码γ-谷氨酰基半胱氨酸连接酶(γ-glutamylcysteine ligase)；EgtB具有未知功能；EgtC为酰胺基转酰胺基酶(amidotransamidase)；EgtE似乎为PLP依赖型酶。此外，Seebeck通过体外证实活性，确认了EgtA、EgtB、EgtC、和EgtD的功能。因为，根据Seebeck，虽然他们作出大量的努力，但EgtE仍不能被表达，故所提出的C-S裂解酶活性(EgtE)未被确认[9]。

因为麦角硫因和ovothiol显著的相似性，假设在生产ovothiol品系中的EgtB同源体可能对ovothiol生物合成中C-S键的形成负责。实际上，在生产ovothiol品系，Erwinia tasmanietzsis中，这类同源体(图1B的OvoA)，被通过在E.tasmaniensis基因体中检索EgtB同源体所识别。当OvoA在E.coli中被表达并纯化后，该经纯化的酶确实催化组氨酸和半胱氨酸之间的耦合以形成亚砜(图1B的6)[10]。该ovothiol生物合成途径的剩余部份仍然要被确认。

因为麦角硫因作为许多商业产品中的关键成分而广泛应用，故对其有高需求。然而，目前的化学合成方案效率不高[11]，且由于其天然丰度低，自天然来源(如蘑菇)中分离并不实际。麦角硫因和ovothiol生物合成基因群集的识别，为更详细的麦角硫因和ovothiol生物合成机制的研究和通过代谢工程生产麦角硫因和ovothiol打好基础。采用图1的方案通过代谢工程生产麦角硫因方面，有三个重要问题：

(i)EgtB活性低。EgtB被提出为单核非血红素铁酶。其目前的活性低。我们若非需要增加其活性，就要找到一个具有更佳活性的酶。

(ii)EgtE蛋白不能被过度表达。至今，仍无文献报导有成功的EgtE过度表达。为了重新构建(reconstitute)麦角硫因生物合成途径，此重要问题必须被解决。

(iii)目前的麦角硫因生物合成途径需要被优化。天然麦角硫因生物合成途径，尤其是氧化C-S键形成步骤(EgtB催化)必须被优化。此外，采用图1中的途径时，麦角硫因和谷胱甘肽生物合成之间存在竞争。

图1中的天然麦角硫因生物合成途径方面，EgtB氧化地耦合组氨酸甜菜碱(2)和γ-Glu-Cys以形成3。3中的谷氨酸盐接着被另一个酶EgtC水解以形成EgtE底物4。若一个能够催化该组氨酸甜菜碱(2)和Cys的直接氧化耦合(图1中的红色箭头)的酶被识别出来，其将提供至少两个好处：1)其将以两个步骤缩短该麦角硫因生物合成途径；2)其将可排除麦角硫因和谷胱甘肽生物合成之间的竞争，因为γ-Glu-Cys亦为谷胱甘肽生物合成途径中的底物。因为谷胱甘肽是用于调控该胞内还原电位的关键分子之一且以mM浓度存在，排除这种竞争将缓解细胞在麦角硫因高量生产条件下的压力并对通过代谢工程高量生产麦角硫因提供显著的好处。

本发明设法处理全部上述问题，其导致新的麦角硫因生物合成途径，具体实施例显示于图2。

增加单核非血红素铁酶的活性。作为改善那些单核非血红素铁酶(如，EgtB、OvoA)的必要步骤，我们建立至少两种不同活性试验，接着使用该试验引导我们往增加这些酶的活性方向努力。

活性试验。为了EgtB和OvoA的催化作用建立两种不同试验(图3)。EgtB和OvoA都被认为是氧化酶[9-10]，其催化His和Cys间的氧化耦合以形成C-S键。同时，硫被氧化为亚砜。全部过程是四电子氧化过程(图1)，类似异青霉素N(isopenicillin N)合成酶的情况[12]。在Seebeck最初的报告中，他们通过监控在260纳米的吸光度变化以监控该反应，盖因该氧化产物(图1的3或6)在这个范围具有吸收。然而，它并非十分灵敏。因为在厌氧条件下没有可被侦测的产物形成，氧气为必需的。基于这个特征，我们建立了EgtB和OvoA活性试验，通过使用NeoFoxy氧电极(图3-I-A)以监控该氧气消耗率(Figure 3-I-B)。这个试验(图3-I-B)被用作优化EgtB和OvoA活性的条件的例行试验。

对加氧酶或氧化酶-催化反应而言，电位问题包括副反应的存在、非生产的氧气消耗、或酶本身的氧化不活化作用。多种活性试验将提供有用的信息以分析这些情况。为了达到此目标，除了氧气的消耗外，我们亦建立了¹H-NMR试验以直接监控产物的形成(图3-11)。在¹H-NMR中，这两种产物(图3-11的3和6)和底物(1和2)中咪唑的H原子的化学位移与剩余的反应混合物清楚分离。因此，能够例行分析该反应混合物而无需产物分离。在图3-II-B(OvoA催化)中，在6.93ppm和7.70ppm的化学位移的讯号被归于二个组氨酸咪唑H原子。在7.83ppm的讯号是来自该氧化耦合产物6的咪唑H原子。而对氧化产物3(EgtB催化)，其咪唑H原子具有7.10ppm的化学位移(图3-II-B)。因此，氧气消耗试验和¹H-NMR试验的结合使我们能够获得很多机制特征：1)氧气消耗和产物形成之间的比例；2)产物C-S键区域选择性；3)除了该提及的氧化C-S键的形成以外其它反应的存在。

改良的OvoA活性。因为EgtB和OvoA被认为是单核非血红质铁酶，若其为含铁酶，在催化转换过程(catalytic turnover process)期间，其可能失活。使用氧气消耗试验，我们改善了OvoA活性(k_cat为572±20min^-1)，为相对Seebeck所报告的300倍[10]，这是许多因子结合所致的结果：1)我们以厌氧纯化OvoA取代好氧纯化，以最小化OvoA在纯化过程期间失活的机会；2)经纯化OvoA和Fe²⁺厌氧的重新构建；3)若在该酶促转化过程期间，一些OvoA实际上通过将Fe²⁺氧化为Fe³⁺而失活，则在反应缓冲液中包括抗坏血酸盐以减少Fe³⁺回到Fe²⁺。不期望被理论所束缚，这些策略亦能够被应用于EgtB和NcEgtl蛋白质。

这些初步结果指引未来于改善EgtB和OvoA体内活性要致力的方向，包括1)以Fe补充该培养基。2)因为该金属酶(EgtB或OvoA)的摄取和成熟是最大化活体活性所必需的，Fe摄取系统可被用于生产麦角硫因生产品系(如，铁载体生物合成基因群集)。

改善单核非血红质铁酶的活性。Seebeck通过证实其体外活性而确认了EgtA、EgtB、EgtC、和EgtD的功能。然而，虽然他们大量努力在测试各种生产EgtE的方法，EgtE蛋白质不能被过量表达或纯化[9]。因此，通过合成生物学(syntheticbiology)生产麦角硫因是不可能的。在我们的初步研究中，我们已经成功过量表达和纯化EgtE(图4A)。经纯化的EgtE的UV-可见光谱图显示于图4B中，且约400纳米处的吸收特征与PLP辅因子的存在一致。来自这些努力中最重要的发现之一为EgtE可能需要与其它基因，如所谓的FAD-合成酶共表达。

优化生产麦角硫因的生物合成途径。于上述章节中，我们已经成功解决该EgtE的问题，其使得通过代谢工程生产麦角硫因成为可能。然而，原始的麦角硫因生物合成途径(图1A)是没有效率的。为了解决这个问题，我们开始寻找能够直接地氧化地耦合组氨酸甜菜碱(2)和Cys的酶，如图2中所概述。通过生物信息学的分析和使用氧气和¹H-NMR试验的活性分析的结合，此类酶中的二者(图1B中的OvoA和来自Neurospora crassa的NcEgt-1[13])被识别。

根据来自Seebeck的初步报告[9-10]，EgtB和OvoA是通过他们的底物偏好和他们产物C-S键结的区域选择性(regioselectivity)彼此区别(图1)。麦角硫因(5)中C-S键是在组氨酸的e-碳上，而对ovothiol而言，该C-S键是在组氨酸的8-碳上(8)。它们的底物偏好亦不同。EgtB催化组氨酸甜菜碱(2)和γ-Glu-Cys之间的氧化耦合。OvoA优先地耦合His和Cys(图1B)。如图2中所概述，为了实现该目标的第一步骤，我们使用组氨酸甜菜碱(2)和Cys作为底物测试EgtB活性。如Seebeck初步所报告，EgtB无法识别Cys作为底物。因此使用EgtB作为催化剂不可能达到组氨酸甜菜碱(2)和Cys的直接耦合。这类所欲的酶可通过无论是EgtB的定向进化(directed evolution)以改变其底物特异性或通过寻找对Cys具有偏好性的酶而获得。这类被识别的酶之一为OvoA。所提及的OvoA的生物活性为His和Cys氧化的耦合，而实际上OvoA具有此所提及的活性(图1B)。令人惊讶的是，当使用组氨酸甜菜碱(2)替代His作为底物时，我们发现OvoA亦能够利用组氨酸甜菜碱(2)作为底物。OvoA在空气饱和HEPES缓冲液的动力学分析中揭示了以下Cys和组氨酸甜菜碱(2)之间的氧化耦合的动力学参数：k_cat为270±5min^-1和组氨酸甜菜碱的K_m为395±30μM、Cys的K_m为3.19±0.41mM。该k_cat仅二倍小于使用His作为该底物的反应者。

更重要的是，当以¹H-NMR试验分析该产物时，该产物为化合物4(图5C)而不是有其原生OvoA反应的C-S键的化合物(图1B和图5A)。在OvoA-催化的组氨酸甜菜碱(2)和Cys之间耦合反应的¹H-NMR光谱图中，7.45ppm处看到一个新的讯号。根据图3所讨论的信息，此讯号最有可能来自耦合产物的EgtB型的咪唑H原子，其暗示了Cys和组氨酸甜菜碱(2)被氧化地耦合于组氨酸的e-碳而不是8-碳，其引导至我们的初始分配4，作为Cys和组氨酸甜菜碱之间的OvoA-催化的氧化耦合产物(图5C)。为了提供明确的解答，分离组氨酸甜菜碱(2)和Cys的氧化耦合产物，且以质谱法和多种NMR-光谱法(¹H-NMR、¹³C-NMR、和包括COSY、HMBC和HMQC的二维NMR，第一原稿中相关资料)以检测其特性。这些数据全部提供有力的证据支持从组氨酸甜菜碱(2)和Cys的直接氧化耦合，经OvoA-催化生产4，其使我们能够达到图2中所概述的目标，2→4的一步转变。

基于这令人兴奋的发现，我们亦检测了来自Neurospora crassa的其它蛋白质[13]。实际上，NcEgt-l亦能够以如OvoA催化2→4转变的同一数量级的活性，催化组氨酸甜菜碱(2)和Cys的氧化耦合以形成4。

总结而言，在我们的研究中，我们克服了全部的三个通过代谢工程生产麦角硫因的挑战：1)识别操纵该金属酶活性的因子(OvoA、EgtB金属-辅因子装置和避免酶失活)；2)成功的直接2→4转变以简化该生物合成途径以及排除麦角硫因和谷胱甘肽生物合成之间的竞争；3)想出过量表达EgtE蛋白质的条件。通过这些成就，我们成功地建立图2中所概述的二种不同麦角硫因生物合成途径：1)在EgtE成功地生产的后，通过该原始麦角硫因途径(图2A)生产麦角硫因；2)通过较短途径(图2B)生产麦角硫因，在具有直接2→4转变能力的酶被发现和EgtE成功生产的后。随后章节中，我们将描述通过发酵在活体中生产麦角硫因。

通过代谢工程生产麦角硫因

方法I：根据图2中所概述的新的麦角硫因生物合成途径，仅需要二步骤：通过OvoA或NcEgt-1催化组氨酸甜菜碱(2)和Cys之间的氧化耦合为化合物4(2→4转变)和EgtE-催化的C-S溶解步骤(图2的4→5转变)。因为，只要当EgtE与其它基因(如，FAD合成酶基因)共表达，生产EgtE是可实现的，因此使用三个基因(OvoA或NcAEgt-1、EgtE、和FAD合成酶)，可集合最小的麦角硫因生物合成基因群集。我们已经克隆EgtE和FAD进入pETDuet载体的多克隆位点I以及NcEgt-l基因进入该多克隆位点II，以制作出一个建构并将其命名为(Ego-1)如图6中所示。

为了使用Ego-1载体生产麦角硫因，其可被转化入E.coli BL(21)DE3细胞中，其以Ego-1载体转化且所欲的细胞在以100pg/mL的Amp.补充的LB培养基上被选择。为了生产麦角硫因，上述细胞的隔夜培养被用于在37℃接种至新鲜LB或TB培养基(以100μg/mL的Amp.、1mM的组氨酸甜菜碱、1mM的Cys和1mM的Met补充)。当OD600达0.6时，将该培养基的温度降低至25℃，且通过添加0.4^-1mM的IPTG以诱导NcEgt-1、EgtE、和FAD合成酶生产而启动麦角硫因的生产。麦角硫因的生产可通过随时取出1mL培养基和直接以¹H-NMR分析该组氨酸甜菜碱浓度而监控。一旦当全部组氨酸甜菜碱被消耗或麦角硫因的生产停止进一步增加时，该发酵过程被终止。上清液和细胞通过离心以分离。取自上清液和该细胞沉淀的麦角硫因以离子交换色谱法分离。

方法II：使用方法I，我们需要以组氨酸甜菜碱(2)补充该培养基，其已在我们实验室被化学地合成。为了进一步减少发酵成本，我们通过克隆EgtD基因进入pACYCDuet质粒的多克隆位点II和SAM合成酶基因进入多克隆位点I以制作出第二质粒(Ego-2)。通过EgtD基因的送入，该基因负责将组氨酸甲基化成为组氨酸甜菜碱(2)，我们能够以His取代组氨酸甜菜碱(2)补充该培养基，其将可进一步减少发酵成本。因为这一甲基化过程需要其它底物，S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，S-腺苷甲硫氨酸的送入将确保EgtD的His→组氨酸甜菜碱(2)转变的最大活性。因为SAM合成酶底物为甲硫氨酸和ATP，除了His外，将包括Met作为其它培养基补充剂。

为了在优化条件下生产麦角硫因，BL21(DE3)E.coli细胞以Ego-1和Ego-2转化，且在以100μg/mL的Amp和20μg/mL的氯霉素(chlorophenicol)补充的LB培养基上选择。该BL21(DE3)-Egol-Ego2隔夜培养接着被用于在37℃接种至以100μg/mL的Amp和20μg/mL的氯霉素、1mM的His、1mM的Met补充的新鲜LB或TB培养基。当OD600达0.6时，该温度降低至25℃且麦角硫因的生产由0.4^-1mM的IPTG而诱导。麦角硫因的生产可通过随时取出1mL培养基和直接以¹H-NMR分析该His浓度而监控。一旦当全部His被消耗或麦角硫因的生产停止进一步增加时，发酵过程将被终止。上清液和细胞通过离心以分离。取自上清液和细胞沉淀的麦角硫因以离子交换色谱法分离。

在麦角硫因的无细胞酶促转化合成中，该反应混合物包含OvoA、EgtE、组氨酸甜菜碱和半胱氨酸在TCEP缓冲液中。该反应在25℃好氧条件下执行。该反应通过¹H-NMR监控且一旦当该反应完全，使用离子交换色谱法纯化麦角硫因。

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在本说明书和实例中所参与的全部专利和其它发表皆特别地并入本文以作为全方面的参考。这些发表仅为了提供其在本申请提交日期前的揭露内容。没有地方在这点上应被解释为承认借助这些先前发明，发明人无权先于这些公开或为任何其它原因。全部关于该日期的声明或关于这些文件的内容的陈述是基于申请人可得的信息而不构成任何承认有关于该日期或这些文件的内容的正确性。

虽然本文中描述并详细说明较佳实施例，对本领域技术人员显而易见的是，能够进行各式修饰、添加、取代、和类似而不偏离本发明的精神，且这些因此被认为在本发明如以下权利要求书所定义的范畴内。而且，在仍未说明的范围内，本领域技术人员将了解本文所描述和说明的各种具体实施例中任一个可被进一步修饰以包含本文所揭露的其它具体实施例中所示的特征。

Claims

1.一种用于制备麦角硫因的过程，该过程包括：(i)以包括重组地表达：(a)EgtA蛋白质或保留酶活性的其功能性片段、(b)EgtB蛋白质或保留酶活性的其功能性片段、(c)EgtC蛋白质或保留酶活性的其功能性片段、(d)EgtD蛋白质或保留酶活性的其功能性片段、和(e)EgtE蛋白质或保留酶活性的其功能性片段的反应混合物培育组氨酸或组氨酸甜菜碱；以及(ii)自该酶混合物中分离麦角硫因。

2.一种用于制备麦角硫因的过程，该过程包括：(i)以包括重组地表达：(a)OvoA蛋白质、NcEgtl蛋白质或保留酶活性的其功能性片段、和(b)EgtE蛋白质或保留酶活性的其功能性片段的反应混合物培育组氨酸甜菜碱；以及(ii)自该酶混合物中分离麦角硫因。

3.一种用于制备麦角硫因的过程，该过程包括培育：(i)组氨酸和包含重组地表达：(a)EgtD蛋白质蛋白质或保留酶活性的其功能性片段、(b)OvoA蛋白质、NcEgal蛋白质或保留酶活性的其功能性片段、和(c)EgtE蛋白质或保留酶活性的其功能性片段的反应混合物；以及(ii)自该酶混合物中分离麦角硫因。

4.如权利要求1或3所述的过程，其中该EgtD蛋白质是和有SAM合成酶编码的基因重组地共表达。

5.如权利要求1至4任一项所述的过程，其中该EgtE蛋白质是和有FAD合成酶编码的基因重组地共表达以为了促进EgtE生产。

6.如权利要求1至5任一项所述的过程，其中该酶混合物进一步包括甲硫氨酸或半胱氨酸。

7.如权利要求1至6任一项所述的过程，其中该酶混合物进一步包括铁盐。

8.如权利要求1至7任一项所述的过程，其中该反应混合物包括细胞溶解产物。

9.一种制备麦角硫因的过程，该过程包括：

(i)在适当的培养基中，适当的代谢条件下培养细胞，其中该细胞重组地表达：EgtA、EgtB、EgtC、EgtD、EgtE基因；以及

(ii)在该培养基或细胞团块中累积麦角硫因且此后自其中回收麦角硫因。

10.一种制备麦角硫因的过程，该过程包括：

(i)在适当的培养基中，适当的代谢条件下培养细胞，其中该细胞重组地表达：(a)ovoA基因或NcEgt-1；和(b)egtE基因；以及

11.一种制备麦角硫因的过程，该过程包括：

(i)在适当的培养基中，适当的代谢条件下培养细胞，其中该细胞重组地表达：(a)egtD基因；(b)ovoA基因或ncEgt-1基因；和(c)egtE基因；以及

12.如权利要求11所述的过程，其中该细胞重组地表达有S-腺苷甲硫氨酸(SAM)合成酶编码的基因。

13.如权利要求9至12任一项所述的过程，其中该细胞重组地表达有FAD合成酶编码的基因以为了促进EgtE生产。

14.如权利要求9至13任一项所述的过程，其中该细胞重组地表达一或多个有铁载体编码的基因。

15.如权利要求9至14任一项所述的过程，其中该细胞正常生产麦角硫因。

16.如权利要求9至15任一项所述的过程，其中该细胞为细菌细胞、真菌细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞、或植物细胞。

17.如权利要求16所述的过程，其中该细菌细胞为大肠杆菌细胞。

18.如权利要求9至17任一项所述的过程，其中该培养基进一步以铁盐补充。

19.如权利要求9至18任一项所述的过程，其中该培养基进一步以其它甲硫氨酸、组氨酸甜菜碱、组氨酸、或半胱氨酸中的一或多种补充。

20.如权利要求9至19任一项所述的过程，其中该重组地表达的基因中的一或多个是由一或多个表达载体或质粒所表达。

21.如权利要求9至20任一项所述的过程，其中该egtD基因、该ovoA基因或ncEgt-1基因、该egtE基因、该有FAD合成酶编码的基因、和该有SAM合成酶编码的基因被不同载体表达。

22.如权利要求9至20任一项所述的过程，其中该ovoA基因或ncEgt-1基因、该egtE基因、和该有FAD合成酶编码的基因被一个载体表达。

23.如权利要求9至20任一项所述的过程，其中该egtD基因和该有该SAM合成酶编码的基因被一个载体表达。

24.如权利要求9至20、22或23任一项所述的过程，其中该ovoA基因或ncEgt-1基因、该egtE基因、和该有FAD合成酶编码的基因被一个第一载体表达以及该egtD基因和该有SAM合成酶编码的基因被一个第二载体表达。

25.如权利要求9至20、22或23任一项所述的过程，其中该egtD基因、该ovoA基因或ncEgt-1基因、该egtE基因、该有FAD合成酶编码的基因和该有SAM合成酶编码的基因全部被相同载体表达。

26.如权利要求9至20任一项所述的过程，其中该重组地表达的基因中的一或多个被融入细胞的该基因体中。

27.如权利要求11至26任一项所述的过程，其中该egtD基因的产物催化组氨酸至组氨酸甜菜碱的转换。

28.如权利要求11至27任一项所述的过程，其中该ovoA基因或该ncEgt-1基因的产物催化组氨酸甜菜碱和半胱氨酸之间的氧化耦合。

29.如权利要求9至28任一项所述的过程，其中该egtE基因的产物催化该组氨酸甜菜碱和半胱氨酸之间的氧化耦合产物中C-S键结的裂解。

30.通过如权利要求1至29任一项所述的过程所生产的麦角硫因。