CN114854660A - 一种高产麦角硫因的基因工程菌 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高产麦角硫因的基因工程菌，属于基因工程领域。本发明提供的重组菌BWEGT‑12的麦角硫因合成产量在72h达到最高，产量为110mg/L。本发明首先筛选了来源不同的麦角硫因合成基因簇，筛选了来源于黑根霉菌和耐辐射红色杆菌的麦角硫因合成基因，初步实现了65mg/L和77mg/L麦角硫因产量。进一步的，本发明对底盘细胞进行改进，分别针对组氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸的代谢途径中的相关基因进行增强表达或敲除，实现了81mg/L麦角硫因产量。为了达到更高的产量，本发明有针对性蛋氨酸循环和叶酸循环全途径中的基因进行调整，最终实现了110mg/L的麦角硫因产量。本发明在大肠杆菌中实现了麦角硫因的高效合成，有助于拓展麦角硫因的市场供应量。

Description

一种高产麦角硫因的基因工程菌

技术领域

本发明涉及一种高产麦角硫因的基因工程菌，属于基因工程领域。

背景技术

麦角硫因(ergothioneine)是一种含有硫的氨基酸衍生物，它是一种独特的细胞生理保护剂，广泛存在于人体血液、精液、肝肾等组织中，具很强的抗氧化、抗衰老、抗辐射活性，具有维持DNA合成和细胞正常的生长代谢及多种生理功能，被视为一种维持人体健康所必须的功能活性物质。但人体自身并不能合成麦角硫因，需要从其他合成麦角硫因的食物如蘑菇中获取，并通过一种新型的阳离子转运体(OCTN1)聚集于人体多数细胞和组织。随着年龄的增加，人体内血液中麦角硫因浓度会随之下降，有研究结果表明机体中麦角硫的缺乏会造成与年龄相关的疾病，如虚弱疲劳、心脑血管疾病、神经退行性疾病和慢性炎症性疾病等。同时动物及人体实验表明高剂量的麦角硫因对机体无毒副作用，麦角硫因性能稳定，在生理PH值下和强碱溶液中不会自身氧化。

麦角硫因因其出色的抗氧化能力被广泛应用于化妆品领域。2017年7月13日，欧盟委员会授权将L-麦角硫因(L-ergothioneine)作为新食品成分投放市场。

同年冬，欧洲食品安全局(EFSA)发布文件，认可合成L-麦角硫因作为一种用于婴幼儿、孕妇和哺乳期妇女膳食的新资源食品是安全的。目前为止麦角硫因的主要生产方式仍为植物提取，其产能偏低导致麦角硫因价格居高不下，严重阻碍了麦角硫因的市场开发推广。在本研究中，整合真菌来源的麦角硫因合成途径到大肠杆菌中实现了麦角硫因的高效合成，有助于拓展麦角硫因的市场供应量。

发明内容

麦角硫因在细菌，真菌和厌氧菌内分别具有不同的合成途径，目前解析最清晰为原核生物中五基因合成途径及真核生物中二基因合成途径，而厌氧合成途径报道较少；本项目选取了合成途径更为简短的真菌来源麦角硫因合成基因簇在大肠杆菌中重构了麦角硫因合成途径。

本发明第一个目的是提供一种重组菌，所述重组菌游离表达麦角硫因合成基因组合(a)或(b)；其中，(a)为RsEGT1和RsEGT2，(b)为RrEgtB和RrEgtC。

在本发明的一种实施方式中，所述RsEGT1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示和RsEGT2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2。

在本发明的一种实施方式中，所述RrEgtB的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述RrEgtC的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌以大肠杆菌BW25113为出发菌株，增强基因组上HisA，HisF，cysE，NrdH，cysP，metH，mtn，lux，metK，metF的表达，抑制或降低基因组上YhaM，tnaA，TolC，metJ，mgl，YjeH，YeaS的表达。

在本发明的一种实施方式中，所述增强为将HisA，HisF，cysE，NrdH，cysP，metH，mtn，lux，metK，metF的启动子替换为强启动子。

在本发明的一种实施方式中，所述强启动子包括J23100启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

在本发明的一种实施方式中，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除基因组上YhaM，tnaA，TolC，metJ，mgl，YjeH，YeaS。

在本发明的一种实施方式中，所述HisA，HisF，cysE，NrdH，cysP，metH，mtn，lux，metK，metF的核苷酸序列的GeneBank号依次为：946521，946516，948126，947161，946883，948522，948542，947168，945389，948432。

在本发明的一种实施方式中，所述YhaM，tnaA，TolC，metJ，mgl，YjeH，YeaS的核苷酸序列的GeneBank号依次为：916164，948221，947521，94843，949036，948656，946157。

本发明第二个目的是提供一种提高大肠杆菌中麦角硫因产能的方法，所述方法为游离表达外源麦角硫因合成基因，抑制或降低宿主菌基因组上YhaM，tnaA，TolC，metJ，mgl，YjeH，YeaS的表达，增强宿主菌基因组上HisA，HisF，cysE，NrdH，cysP，metH，mtn，lux，metK，metF的表达。

在本发明的一种实施方式中，所述外源麦角硫因合成基因为RsEGT1和RsEGT2，或RrEgtB和RrEgtC。

在本发明的一种实施方式中，所述增强为将HisA，HisF，cysE，NrdH，cysP，metH，mtn，lux，metK，metF的启动子替换为强启动子。

在本发明的一种实施方式中，所述强启动子包括J23100启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

在本发明的一种实施方式中，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除宿主菌基因组上YhaM，tnaA，TolC，metJ，mgl，YjeH，YeaS的表达。

在本发明的一种实施方式中，所述HisA，HisF，cysE，NrdH，cysP，metH，mtn，lux，metK，metF的核苷酸序列的GeneBank号依次为：946521，946516，948126，947161，946883，948522，948542，947168，945389，948432。

在本发明的一种实施方式中，所述YhaM，tnaA，TolC，metJ，mgl，YjeH，YeaS的核苷酸序列的GeneBank号依次为：916164，948221，947521，94843，949036，948656，946157。

本发明第三个目的是提供一种全细胞催化剂，所述全细胞催化剂含有所述重组菌。

本发明第四个目的是提供一种生产麦角硫因的方法，所述方法为将所述重组菌或所述全细胞催化剂接种于含有组氨酸、甲硫氨酸和半胱氨酸的培养基中进行发酵生产。

在本发明的一种实施方式中，所述培养基包括5g/L葡萄糖，6g/L Na₂HPO₄，0.5NaCl，3g/L KH₂PO₄，1g/L NH₄Cl，246.5mg/L MgSO₄·7H₂O，14.7mg/L CaCl₂·2H₂O，27.8mg/L FeSO₄·7H₂O，2g/L柠檬酸。

在本发明的一种实施方式中，所述培养基中还含有1g/L组氨酸、1g/L甲硫氨酸、1g/L半胱氨酸。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵的条件为35～38℃、180～220rpm培养1.5-2h，待菌株OD₆₀₀达到0.6-0.8后，加入4～6mL 20％阿拉伯糖，28～30℃、180～220rpm培养10～15h。

本发明还提供了所述重组菌，或所述提高大肠杆菌中麦角硫因产能的方法，或所述全细胞催化剂，或所述生产麦角硫因的方法在食品、化妆品或医药领域的应用。

本发明还提供了所述重组菌，或所述提高大肠杆菌中麦角硫因产能的方法，或所述全细胞催化剂，或所述生产麦角硫因的方法在制备含有麦角硫因的产品中的应用。

有益效果：

本发明提供的重组菌BWEGT-12的麦角硫因合成产量在72h达到最高，产量为110mg/L。本发明首先筛选了来源不同的麦角硫因合成基因簇，筛选了来源于黑根霉菌和耐辐射红色杆菌的麦角硫因合成基因，初步实现了65mg/L和77mg/L麦角硫因产量。进一步的，本发明对底盘细胞进行改进，分别针对组氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸的代谢途径中的相关基因进行增强表达或敲除，实现了81mg/L麦角硫因产量。为了达到更高的产量，本发明有针对性蛋氨酸循环和叶酸循环全途径中的基因进行调整，最终实现了110mg/L的麦角硫因产量。本发明在大肠杆菌中实现了麦角硫因的高效合成，有助于拓展麦角硫因的市场供应量。

附图说明

图1：麦角硫因HPLC检测结果，(a)100mg/L麦角硫因标品检测结果；(b)BWRsEGT菌株转化36h，转化也上清检测结果。

图2：WT菌株和BWRsEGT菌株的全细胞催化结果。

图3：WT菌株、BWRsEGT菌株和BWRsEGTRrBC菌株的全细胞催化结果。

图4：BWRsEGTRrBC菌株和BWEGT-11菌株的全细胞催化结果。

图5：BWEGT-11菌株和BWEGT-12菌株的全细胞催化结果。

具体实施方式

下述实施例中，如没有明确说明，所使用的试剂、材料、基因合成和基因测序均是可以通过商业途径获得的。

下述实施例中涉及到的培养基均使用ddH₂O配制，配制完成后121℃灭菌15～20min，灭菌后按需添加100mg/L氨苄青霉素。

LB液体培养基：酵母粉5.0g/L、胰蛋白胨10.0g/L、NaCl 10.0g/L。

LB固体培养基：酵母粉5.0g/L、胰蛋白胨10.0g/L、NaCl 10.0g/L、琼脂粉15g/L。

M9培养基：5g/L葡萄糖，6g/L Na₂HPO₄，0.5NaCl，3g/L KH₂PO₄，1g/L NH₄Cl，246.5mg/L MgSO₄·7H₂O，14.7mg/L CaCl₂·2H₂O，27.8mg/L FeSO₄·7H₂O，2g/L柠檬酸。

实施例1：构建含有麦角硫因合成基因簇的重组大肠杆菌

(1)选取黑根霉菌(Rhizopus stolonifer)来源的麦角硫因合成基因RsEGT1(genebank：RCH97401.1)和RsEGT2(genebank：RCI05990.1)，进行针对大肠杆菌密码子优化后，获得核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的基因片段，进行DNA合成获得候选基因。

(2)设计相关引物(表1)，以步骤(1)中核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的RsEGT1基因片段为模板，利用引物F1和R1，PCR扩增获得片段RsEGT1；以核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的RsEGT2基因片段为模板，利用引物F2和R2，PCR扩增获得片段RsEGT2。以pBAD/HisA载体(北京江晨生物)为模板，利用引物pBAD-F和pBAD-R进行PCR扩增出线性pBAD载体。使用无缝拼接试剂盒(南京诺维赞)将RsEGT1和RsEGT2连接到线性pBAD载体上，并转化大肠杆菌Trans-T1，涂布于LB平板37℃过夜培养，挑取质粒进行测序，获得正确的质粒命名为：pBAD-RsEGT1-RsEGT2。

表1相关引物

(3)构建麦角硫因基因簇的基因工程菌，将步骤(2)中获得正确质粒pBAD-RsEGT1-RsEGT2转化大肠杆菌BW25113菌株(北京江晨生物)，获得的菌株命名为BWRsEGT。

将菌株BWRsEGT以1g/L组氨酸、1g/L甲硫氨酸、1g/L半胱氨酸为底物进行全细胞催化实验，HPLC分析转化液上清中菌株麦角硫因合成产量。全细胞催化实验步骤如下：

A，挑取BWRsEGT单菌落接种于5mL LB培养基试管中，37℃、200rpm，培养过夜，获得种子液；

B，将种子液按照1％(v/v)的接种量接种于装有100mL LB培养基的500mL摇瓶中，37℃、200rpm培养1.5-2h，待菌株OD₆₀₀达到0.6-0.8，加入5mL 20％阿拉伯糖(阿拉伯糖：水质量比1：5)，将菌株移至30℃、200rpm培养12h，5000rpm、15min收集菌体。

C，用含有1g/L组氨酸、1g/L甲硫氨酸、1g/L半胱氨酸的M9培养基重悬菌体至10OD/mL，取30mL菌液置于250mL摇瓶中30℃，200rpm转化48h，间隔12h取样采用HPLC方法(具体方法见Toward more efcient ergothioneine production using the fungalergothioneine biosynthetic pathway)检测转化液上清中麦角硫因含量。

HPLC检测结果以36h检测结果为例，如图1-a为麦角硫因检测结果，图1-b为BWRsEGT菌株36h转化液上清检测结果。如图2所示，对比野生型大肠杆菌BW25113，BWRsEGT菌株可以产生麦角硫因，并在36h达到最高值，产量为65mg/L。

实施例2：麦角硫因合成途径的优化

(1)选取耐辐射红色杆菌(Rubrobacter radiotolerans)来源的基因RrEgtB(NCBIReference Sequence为：WP_038682659.1)和基因RrEgtC(NCBI Reference Sequence：WP_003419806.1)两个麦角硫因合成酶做针对大肠杆菌密码子优化后，获得核苷酸序列如SEQID NO.3和SEQ ID NO.4所示的基因片段，进行DNA合成获得候选基因。

(2)设计相关引物(表1)，以核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的RrEgtB基因片段为模板，利用引物F4和R4，PCR扩增获得片段RrEgtB；以核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的RrEgtC基因片段为模板，利用引物F5和R5，PCR扩增获得片段RrEgtC。以R3和pBAD-F为引物，以pBAD-RsEGT1-RsEGT2质粒为模板，进行PCR获得载体片段。片段RrEgtB、片段RrEgtC和载体片段使用无缝拼接试剂盒组装质粒，转化大肠杆菌Trans-T1，涂布于LB平板37℃过夜培养，挑取质粒进行测序，获得正确的质粒命名为：pBAD-RsEGT1-RsEGT2-RrBC。

(3)将正确的pBAD-RsEGT1-RsEGT2-RrBC转化大肠杆菌BW25113菌株，获得的菌株命名为：BWRsEGTRrBC。采用实施例1步骤(3)中全细胞催化实验的方法比较BWRsEGTRrBC菌株和BWRsEGT菌株麦角硫因的合成能力。结果如图3所示，加入耐辐射红色杆菌来源的RrEgtB和RrEgtC基因获得的菌株BWRsEGTRrBC展现出更强的麦角硫因合成能力，全细胞催化结果显示，BWRsEGTRrBC菌株麦角硫因合成能力在48h达到了最高，产量为77mg/L，高于BWRsEGT菌株，证明BWRsEGTRrBC具有更强的麦角硫因合成能力。

实施例3：构建底盘细胞

利用CRISPR/CAS9基因编辑技术对大肠杆菌BW25113进行染色体编辑增强三项前体氨基酸和腺苷甲硫氨酸(SAM)的供给，本发明采用的基因编辑方法参照文献“MultigeneEditing in the Escherichia coli Genome viathe CRISPR-Cas9 System”进行。

(一)CRISPR/CAS9基因编辑技术：

(1)DNA片段的制备：利用CRISPR/CAS9基因编辑技术进行基因敲除，设计引物对分别扩增目的基因的上下游同源臂各100-500bp，通过融合PCR将上下游片段融合获得DNA片段，经DNA胶回收或PCR产物纯化试剂盒回收。利用CRISPR/CAS9基因编辑技术进行基因插入则在扩增插入位点上下游同源臂的同时，扩增出目的基因，并用融合PCR的方片段融合获得DNA片段。

(2)sgRNA的设计：利用CRISPR-ERA网站(crispr-era.stanford.edu)设计目标位点的sgRNA的靶向序列(20bp)，并设计引物利用无缝拼接将其整合到sgRNA表达质粒pTarget上。

表2sgRNA

(3)CRISPR电转化感受态的制备

1)从-80℃中取出目标菌种的热激感受态细胞，转化pCas质粒并涂布Kan抗性LB固体平板培养基，在30℃恒温培养箱中静置培养16-24h。

2)挑取单菌落，接种5ml LB液体培养基(Kan)，30℃，220rpm培养过夜。

3)挑取1ml培养液接种100ml LB液体培养基(Kan)，30℃，220rpm培养至OD₆₀₀：0.3，加入1ml 20％阿拉伯糖诱导，继续培养至OD₆₀₀为1。

4)将菌液置于冰上30min，冰浴过后的菌液4000rpm，4℃，离心5min。

5)弃掉上清，每管细胞用50mL冰冷的10％甘油溶液轻柔重悬，4000rpm，4℃，离心5min.重复步骤5两次。

6)倒掉上清，加入0.4ml冰冷的10％甘油溶液轻柔重悬，分装入1mL ep管中，0.1mL/管，由于Cas9蛋白质特性，感受态要求即做即用。

(4)CRISPR电击转化

1)在100μl电转化感受态中加入1000ng总量的DNA片段和200-400ng的pTarget质粒，用移液枪轻轻吹打混匀。

2)2mm电转杯冰上放置30min，混合物加入电转杯中，轻柔震击将其混匀，利用伯乐预设的大肠杆菌电转条件(2mm电转杯)直接电转。

3)在电击杯中加入0.5mL预热30℃LB液体无抗培养基，用移液枪轻轻吹打混匀，并转移到1.5mL灭菌的ep管中，30℃，200rpm培育2h。离心后收集全部菌体，培养液涂布于Kan与Spec双抗LB固体平板培养基。

4)正置30min待培养基干燥后，在30℃恒温培养中倒置培养16-24h。

(5)CRISPR转化子验证与质粒丢失

1)挑取若干平板单菌落于5mL LB试管中(kan单抗)，30℃，220rpm培养5-12h。

2)使用PCR验证引物验证打靶结果.

3)转接菌体到新的LB液体无抗培养基，30℃，220rpm培养3小时至OD₆₀₀为0.3时加入IPTG诱导培养8h，pTarget质粒会在pCas质粒产生的sgRNA介导下消失。

4)转接菌体到新的LB液体无抗培养基，37℃，220rpm培养16-24h，pCas质粒属于温度敏感型质粒，在37℃下菌体会丢失该质粒。

5)取培养液稀释涂布无抗LB培养基上，在30℃恒温培养箱中静置培养16-24小时后，挑取平板上的单菌落分别点板Kan、Spec、无抗LB固体平板培养基各一块，在30℃恒温培养箱中静置培养24小时。在Spec和Kan抗性的平板上无法生长，只在无抗平板正常生长的菌落即是基因插入或敲除成功，并丢失了pCas和pTarget质粒的阳性克隆。

(二)目的基因的成功编辑

(1)三项前体氨基酸的供给改造：

A,组氨酸代谢途径：针对组氨酸代谢途径，通过染色体定点交换，将组氨酸合成基因簇HisA，HisF的启动子替换为J23100启动子，序列为ttgacggctagctcagtcctaggtacagtgctagc(SEQ ID NO.5)；

B,半胱氨酸代谢途径：将半胱氨酸合成关键酶cysE和NrdH的启动子替换为J23100启动子，将cysP转运蛋白的启动子替换为J23100启动子来提高大肠杆菌对硫元素的摄入能力，同时敲除半胱氨酸的胞内降解基因YhaM，tnaA及敲除外泌蛋白TolC；

C,甲硫氨酸代谢途径：首先对甲硫氨酸合成途径中的反馈抑制因子metJ做敲除，解除其反馈抑制，敲除大肠杆菌胞内主要的甲硫氨酸消耗蛋白：mgl，外泌蛋白YjeH和YeaS，将metH蛋白的启动子替换为J23100启动子增强表达；

底盘改造完成后，获得底盘细胞1并制备成感受态细胞，将实施例2中构建的pBAD-RsEGT1-RsEGT2-RrBC质粒化转法转入完成菌株改造的底盘细胞1，获得菌株命名为BWEGT-11，采用实施例1步骤(3)的全细胞催化方法比较菌株BWRsEGTRrBC和菌株BWEGT-11的麦角硫因合成能力，结果如图4所示，BWEGT-11的麦角硫因合成产量在48h达到最高量81mg/L。

(2)蛋氨酸循环和叶酸循环全途径：甲硫氨酸再胞内被转化为SAM从而为麦角硫因合成提供其必须的甲基供体，在上述增强甲硫氨酸自身供给基础上，将SAM循环涉及的mtn，lux，metK，叶酸循环中的metF的启动子替换为J23100启动子。

继续底盘改造完成后，获得底盘细胞2并制备成感受态细胞，将实施例2中构建的pBAD-RsEGT1-RsEGT2-RrBC质粒化转法转入完成最终改造的底盘细胞2中，获得菌株命名为BWEGT-12，采用全细胞催化方法比较菌株BWEGT-12和菌株BWEGT-11的麦角硫因合成能力，结果如图5所示，BWEGT-12的麦角硫因合成产量在72h达到最高量110mg/L。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳中科欣扬生物科技有限公司

<120> 一种高产麦角硫因的基因工程菌

<130> BAA220710A

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2631

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgagcttcc gtgcaccttc cccgccgtcg actggttact ctatcgtgga tattcgtact 60

gcatccagcc tgtctactaa agaagacaac ggtattgata tcaaccgtcc gccaagccct 120

ccgcgttctt ccgacatctc cgaagacgca ttcaacgcgt ccgacctggc agacactatc 180

ctggactcgc tggataaacc gatcaaccag aaatctatcc caacgtacat cctgtacgac 240

aaacgcggtc tgcagctctt cgaccaaatc acgtatctcg acaatgaata ctatctgact 300

aacgcggaac tggatattct ggaacgtaag tctgatgagt ttgcggaccg tctgcaggac 360

ggcagcgtta tcttcgagct gggtgcgggt gcgctgcgca aaactcaggt aattctgcac 420

gcaatcgaaa aaaaaggcat tcacgtcacg tactatgcgc tggacctgga ccagcacgag 480

ctggaacgta gcctggctag cctgggtgaa ttccagtatg tacagctcta cggcctgctg 540

ggcacgtatg atcagggcat tccatggatc tctcaggaat tcacgtccaa aggcatccag 600

aaaaacttcc tgtggctggg ctcttctatc ggcaacgaca cgcgctgtca gagcgctgtc 660

ttcctggcgc gtctgcagcg tatgtgcgtt gagccaggcg atctgtgtgt tattggtttc 720

gataaacgta acgacccggc gaaaattgaa cgcgcatacg acgatagccg tggtgttact 780

cgtgaattca tcatgaacgg cctggatcat gtcaacctga tcatgggtca gaaagatttc 840

atcaaccgta accagtttgt gtacgactct acgtaccagg aaaagcaagg ccgtcacgta 900

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agcatcctgt ctgccgccgg cctggacatg gtagactgct ggactgatac taaagaccag 1080

taccgcctcg tgctggccga aagccgtccg ttcaagttcg aacgtaacgt tgcgcgtgtt 1140

ctggaaactc tgtttgcgtc caaagaaacg attgactctg aaccgattaa ctgcagccat 1200

tgttctacaa acgaggacgt cgtgtcctcg gaactggaag ttgaagcact gaacctgatg 1260

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ctgtgggcta gctgggatct ggttacgcag cacatgctga accacccgga tatgctcttc 1380

gaacgcccga ttgcactgcg tcacccgttt attttctacc tgggccacat cccgggtttc 1440

ctggacatcc agctgagccg tcaccaggta gataaggaac tgggtgaatc tagcctgacg 1500

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tctatcatga cttaccagac taaaatccgt ggtcgtctgc tgcgtctgct gaaccactgg 1680

gaatcggaga gcctggccgc gcagaacatt tcttggatct ctctcaaacc ggaacgcaaa 1740

cgtcacgcac gtattatctg gatgtgcttt gaacacgaag cgatgcacct ggaaacgctg 1800

ctgtacatgc tgatgcagtc tccaaacaca ctgccgccta aaggcgtttc cattccgtcg 1860

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gacccatctt ccaaggaagt tcaggttttc ggctgggata acgaatcccc tcaacgcatc 2040

atcgacaacg tttctagctt cgatatccag actcgcccag taactaacgg cgaatatctg 2100

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ctcggcggtt cgtgggcaac tcacccgcgt attgcagaac gtacgacttt ccgtaactgg 2580

tatcagtctg gttatcctta tgttttctct ggttttcgtc tgtgtttcta a 2631

<210> 2

<211> 1227

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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atccctatga actccggtgc tttcggttcg tttccgaaga aatttgttcc gctcattgag 120

aattacaacg aacagactga aaaacaaccg gatcgttggc tgcgcttcca agcgccggag 180

aaactgctga agtcgctgga aagcgcagct ccaattctcg gttgcgactc ctccgacatc 240

gttttcgcga acaactccac tacgggtgtc aataacattc tgcgctcttt tccgttccag 300

gaaggcgaca aaattctgtg ctatcagact gtttattcta attgcggcaa aactctggaa 360

ttcctggaga cttacaaaaa agtcaaactg gtgcgtgttc acctgaatta cccgatcgaa 420

gatgatgacg tggttcgtct gactcgtgaa gctattgaac gcgaacaggc aaaagatggt 480

actcacaaaa tcaaactgtg tctgctggat gcgatctcct ctctcccggg cgtttgtaag 540

ccgtatcagc gcctggtcaa gctgctgaaa gagtatgaca tcaaatccct ggtggacggt 600

gctcacgcta tcggtcagat tgagctgaac ctgcgtgaat gtgatccgga tttctttgtt 660

actaattgtc acaaatggct gttcacgccg cgcggctgcg ccattatgta cgtagcaaag 720

cgtaaccagg gcattgtgca cccgacttct attaattacg ctttccagta ccatgaagat 780

gcagctgatg gttcctcgtt ccgtgaagag cactacccgg gcgttatgta catgaacagc 840

tttctgatcc tggatgaatc catcaagtat cgtgaaagcc tgggcggtga aaaggcgatc 900

cgcgaatata ctcataagct ggcagtggaa ggcggtgagc tggtagcaaa aatgctcggc 960

acgcaggtta tggaaaattc tactaaaact ctgactgcgt ctatggtcaa cgtcgaactg 1020

ccgattccgt ccccggtctc cctgccggat tcccagattc cgaacttctt tatgaaaaag 1080

gctgtgtttg aacacaacac tgctctgact gtctacaaaa ataacgacaa atggtgggtc 1140

cgcctctgcg cacagatcta cctggacctg gacgatttca aggctactgg cgaagttctg 1200

ctgaaactga tcaaagaact ggaataa 1227

<210> 3

<211> 1314

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggatacta aacgccgtga aactgagcac ctgaaacgtg aaatcgtagc ccagctgaaa 60

gagggtcgtg aacgcactcg cctcctgctg gaaaacgtta gcgacgccga cctggcggcg 120

cagcacgacg agatcatgtc tcctctgatc tgggactacg gtcacatcgg caactacgaa 180

gagctgtggc tgctgaacga agcgtttggt aaaactctct ctgaccgtgc actgttcgac 240

gtctacgatg cgagcctgca cccgcgctct gaacgtccga gcctgaatac actggaccgc 300

ccagatgccg atcgttacct ggacgcagtt cgtgaggcag ctatctgtag cctggaagca 360

gccgatctgg acagcggcga actgctgcgt gacggtttcg tctataacat ggtactgctg 420

cacgaagccc aacataacga aacgatgctg cagactctgc agctgatgcc gtctggctac 480

cgccctgaag cgcgtgttga actgccggaa ggcaacccgc caggcggcgg tgaagagatg 540

aagcgtatcc cggccggcac gttcatcatg ggtactgacg acactgtctg ggcgctggac 600

aacgaacgtt ctgcacacga ggtttacgtc gaggaatttg aaattgacac tgtgccggtc 660

acgaaccgtg ctttcatgga atttgtggaa gacggcggtt atgaaaaacg cgaactgtgg 720

gacccagacg gctgggaatg gaaagtagat gagcatatcc acggtccgaa acactggtat 780

cagccagaac gccacacttg gtggacacag cgtttcggct tcgatgagcc ggttgacccg 840

gacgctccgg ttatgcatgt gtctttctac gaggctgagg catatgccca gtgggccggc 900

aaacgtctgc cgacggaagc agagtgggaa aaagctgcat cttgggaccc ggtgactgag 960

actaaacgtc tgttcccgtg gggcgatgaa gcgtggaatg gcacgcaagc aaatctggac 1020

caactggcat tccgtcctgc tcgcgtcggt gcttatccgg aaggcgcatc tgcatacggc 1080

gtcctgggca tgctgggtga cgtttgggaa tggacggata ctgacttcta cgcgtatcca 1140

ggtttccgtg cttttccgta tcgtgaatac tctgaggtat tcttcgatga cggttatgtt 1200

gtcctgcgtg gtggctcctt cgcgactcgc ccgcgcgcgg tgacgaacac gttccgcaac 1260

tgggattttc caatccgtcg ccagctgttc gtgggcttcc gttgcgcgcg ctaa 1314

<210> 4

<211> 780

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgtgccgtc tgctggccta tctgggtact gcgccagccg cactgtctcg ttacgttttt 60

gaaccggacc atagcctgga agttcaggct tttgcaccgc gtgaaatgct gtctggcgtt 120

gttaatgctg atggtttcgg cgtaggttgg tatgccgaag acgatccgga accggcgctg 180

taccgctcgc tgtttccact gtggtctgat gcgacattcc gttctatcgc gccgcgtatt 240

aagtcccgcg cctacttcgc tgcactgcgt aacgcgactc ctccgctgcc gtctgaactg 300

agcgcggttc cgccgttcgc ttctggccgc tacctgttta tgcacaacgg cgcaatcgat 360

cgctttcgcg agactgcgat gcgcccgctg cgcgactctc tgtcggaggc tggttaccgt 420

gaagttactg gcgcatctga ctccgaaacg atctgtgcgt gtgtgatgga tcgtctgcgc 480

tccggtatgc cgccgaaggt cgctctgctg gacgcaactg ccttcgtcgc ggaagtgtgt 540

cagggccgtg gcgtccgcgc agccctcaat ctgggcctga gcgacggtga acgcctggtg 600

ttttctcgtt attccactga aggcccggct aacagcctgt attacctggc tgaagaaggc 660

gcagttatcg tatccagcga acgcctggat gcagatgagc gttggcgtga agtgccggaa 720

ggctccgtgc tgacagttga acgtgatctg actgtcatgg ttgaaggtat gccgctgtaa 780

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ttgacggcta gctcagtcct aggtacagtg ctagc 35

Claims (10)

1.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌游离表达麦角硫因合成基因组合(a)或(b)；其中，(a)为RsEGT1和RsEGT2，(b)为RrEgtB和RrEgtC；所述RsEGT1的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示和RsEGT2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2；所述RrEgtB的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述RrEgtC的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌以大肠杆菌BW25113为出发菌株，增强基因组上HisA，HisF，cysE，NrdH，cysP，metH，mtn，lux，metK，metF的表达，抑制或降低基因组上YhaM，tnaA，TolC，metJ，mgl，YjeH，YeaS的表达。

3.根据权利要求2所述的重组菌，其特征在于，所述增强为将HisA，HisF，cysE，NrdH，cysP，metH，mtn，lux，metK，metF的启动子替换为强启动子。

4.根据权利要求3所述的重组菌，其特征在于，所述强启动子包括J23100启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

5.根据权利要求2所述的重组菌，其特征在于，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除基因组上YhaM，tnaA，TolC，metJ，mgl，YjeH，YeaS。

6.根据权利要求2所述的重组菌，其特征在于，所述HisA，HisF，cysE，NrdH，cysP，metH，mtn，lux，metK，metF的核苷酸序列的GeneBank号依次为：946521，946516，948126，947161，946883，948522，948542，947168，945389，948432；

所述YhaM，tnaA，TolC，metJ，mgl，YjeH，YeaS的核苷酸序列的GeneBank号依次为：916164，948221，947521，94843，949036，948656，946157。

7.一种提高大肠杆菌中麦角硫因产能的方法，其特征在于，所述方法为游离表达外源麦角硫因合成基因，抑制或降低宿主菌基因组上YhaM，tnaA，TolC，metJ，mgl，YjeH，YeaS的表达，增强宿主菌基因组上HisA/HisF，cysE，NrdH，cysP，metH，mtn，lux，metK，metF的表达。

8.一种全细胞催化剂，其特征在于，所述全细胞催化剂含有权利要求1～6任一所述重组菌。

9.一种生产麦角硫因的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求1～6任一所述重组菌或权利要求8所述全细胞催化剂接种于含有组氨酸、甲硫氨酸和半胱氨酸的培养基中进行发酵生产。

10.权利要求1～6任一所述重组菌，或权利要求7所述方法，或权利要求8所述全细胞催化剂，或权利要求9所述方法在食品、化妆品或医药领域的应用。

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